RU2817218C2 - Лечение дегенерации межпозвоночного диска - Google Patents
Лечение дегенерации межпозвоночного диска Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817218C2 RU2817218C2 RU2021131390A RU2021131390A RU2817218C2 RU 2817218 C2 RU2817218 C2 RU 2817218C2 RU 2021131390 A RU2021131390 A RU 2021131390A RU 2021131390 A RU2021131390 A RU 2021131390A RU 2817218 C2 RU2817218 C2 RU 2817218C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- disc
- intervertebral disc
- tgf
- rabbit
- Prior art date
Links
- 206010061246 Intervertebral disc degeneration Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 208000018180 degenerative disc disease Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 208000021600 intervertebral disc degenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 163
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 114
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 48
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 17
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 103
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 49
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 48
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 44
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 31
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 29
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 28
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 20
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 20
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000001796 anti-degenerative effect Effects 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 11
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 11
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 11
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 4
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 4
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108700003483 Drosophila dpp Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000003618 Intervertebral Disc Displacement Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000007453 TGF-beta Superfamily Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010085004 TGF-beta Superfamily Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 2
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 208000003580 polydactyly Diseases 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000037716 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000819 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Proteins 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 108090001069 Chymopapain Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108700005865 Drosophila gbb Proteins 0.000 description 1
- 102100040897 Embryonic growth/differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010090296 Growth Differentiation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100035379 Growth/differentiation factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001023988 Homo sapiens Growth/differentiation factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 206010021118 Hypotonia Diseases 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 208000018650 Intervertebral disc disease Diseases 0.000 description 1
- 206010050296 Intervertebral disc protrusion Diseases 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100165556 Mus musculus Bmp6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100096242 Mus musculus Sox9 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101000851110 Periplaneta americana Vitellogenin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059604 Radicular pain Diseases 0.000 description 1
- 206010037779 Radiculopathy Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L Tiron Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C1O ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150004676 VGF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002976 chymopapain Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000009786 epithelial differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000003885 eye ointment Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 108010019691 inhibin beta A subunit Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036640 muscle relaxation Effects 0.000 description 1
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940069265 ophthalmic ointment Drugs 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000000264 spin echo pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108010042974 transforming growth factor beta4 Proteins 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способы предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска, которые включают введение клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. Изобретения направлены на эффективное лечение дегенерации межпозвоночного диска у субъекта. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 44 ил., 1 табл., 10 пр.
Description
Уровень техники
[0001] Область изобретения:
[0002] Настоящее изобретение относится к предотвращению или задержке дегенерации межпозвоночного диска. Настоящая заявка также относится к лечению дегенерации диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Настоящее изобретение также относится к способам использования хондроцитов для введения в поврежденную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Настоящее изобретение также относится к способу введения по меньшей мере одного гена, кодирующего члена суперсемейства трансформирующего фактора роста β, по меньшей мере в одну клетку млекопитающего для использования в предотвращении или задержке дегенерации межпозвоночного диска у млекопитающего-хозяина. Настоящее изобретение также относится к способу применения смеси хондроцитов и клеток млекопитающих, содержащих ген, кодирующий члена суперсемейства трансформирующего фактора роста β, в травмированную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска, который включает введение клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. Предпочтительно используется нетрансфицированный хондроцит или фибробласт, а субъектом предпочтительно является человек. Если используется хондроцит, то предпочтительно использовать недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит, то есть когда клетки выделены от ребенка, которому менее двух лет. В других аспектах хондроциты могут быть примированными хондроцитами. В частности, клетка соединительной ткани может быть аллогенной по отношению к субъекту-млекопитающему, которого предполагается лечить.
[0004] Трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0005] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам использования аллогенных ювенильных хондроцитов или аллогенных недисковых хондроцитов для введения в поврежденную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска.
[0006] В одном аспекте настоящее изобретение используется для предотвращения или задержки дальнейшей дегенерации области межпозвоночного диска после ее травмы, разрыва или выпячивания.
[0007] В другом аспекте изобретение направлено на способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, который включает: а) вставку гена, кодирующего белок с функцией регенерации межпозвоночного диска, в клетку млекопитающего и b) трансплантацию клетки млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. В этом способе ген может принадлежать к суперсемейству TGF-β, например, TGF-β, и предпочтительно TGF-β1.
[0008] Трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0009] Еще в одном аспекте изобретение направлено на способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, который включает: а) вставку гена, кодирующего белок с функцией регенерации межпозвоночного диска, в первую клетку млекопитающего и b) трансплантацию смеси клетки млекопитающего из пункта а) и немодифицированной второй клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. В этом способе ген может принадлежать к суперсемейству TGF-β, например, TGF-β, и предпочтительно TGF-β1.
[0010] Первые трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0011] Второй клеткой соединительной ткани млекопитающих может быть хондроцит или фибробласт. В случае хондроцита, хондроцит может быть недисковым хондроцитом или ювенильным хондроцитом. В частности, хондроцит второй клетки соединительной ткани млекопитающего может быть примированным хондроцитом. В другом аспекте первая или вторая клетка соединительной ткани или обе могут быть аллогенными по отношению к субъекту-млекопитающему или друг к другу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] На ФИГ. 1A-1F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0013] На ФИГ. 2A-2F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0014] На ФИГ. 3A-3D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0015] На ФИГ. 4A-4D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. В частности, TGF-β1-продуцирующие клетки 293 оказывают антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0016] На ФИГ. 5A-5D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 и, в частности, лечение смесью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0017] На ФИГ. 6A-6D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0018] На ФИГ. 7A-7F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) был травмирован диск в L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) был травмирован диск в L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0019] На ФИГ. 8A-8F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был поврежден путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L1/2 позвоночника, и (iii) диск в L2/3 был поврежден и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был травмирован путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в позвоночном локусе L1/2, и (iii) диск в L2/3 был травмирован и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0020] На ФИГ. 9A-9D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 8 (восемь) недель после операции, в которой (i) диск в L2/3 был травмирован и в него была введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L3/4 позвоночника, и (iii) диск в L4/5 был травмирован и в него были введены примированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L2/3 и L4/5. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение примированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0021] Как используется в настоящем документе, термин "биологически активный" в отношении нуклеиновой кислоты, белка, фрагмента белка или их производного определяется как способность нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности имитировать известную биологическую функцию, вызываемую формой нуклеиновой кислоты или белка дикого типа.
[0022] Как используется в настоящем документе, термин "клетки млекопитающих" в отношении трансфицированных или трансдуцированных клеток включает все типы клеток млекопитающих, в частности клетки человека, включая, но не ограничиваясь этим, клетки соединительной ткани, такие как фибробласты или хондроциты, или стволовые клетки, в частности клетки эмбриональной почки человека, и далее, в частности, клетки 293 эмбриональной почки человека, или эпителиальные клетки.
[0023] Как используется в настоящем документе, термин "соединительная ткань" представляет собой любую ткань, которая соединяет и поддерживает другие ткани или органы, и включает, но не ограничивается этим, связку, хрящ, сухожилие, кость и синовиальную оболочку млекопитающего-хозяина.
[0024] Как используется в настоящем документе, термин "соединительно-тканная клетка" или "клетка соединительной ткани" включает клетки, которые находятся в соединительной ткани, такие как фибробласты, клетки хряща (хондроциты) и костные клетки (остеобласты/остеоциты), которые выделяют коллагеновый внеклеточный матрикс, а также жировые клетки (адипоциты) и гладкомышечные клетки. Предпочтительно, клетки соединительной ткани представляют собой фибробласты, хондроциты или костные клетки. Предпочтительно, клетки соединительной ткани представляют собой клетки хондроцитов. Следует понимать, что изобретение может быть реализовано как со смешанной культурой клеток соединительной ткани, так и с клетками одного типа. Предпочтительно, клетка соединительной ткани не вызывает негативной иммунной реакции при введении в организм хозяина. Понятно, что в этом отношении могут быть использованы аллогенные клетки, а также аутологичные клетки для клеточно-опосредованной генной терапии или терапии соматическими клетками.
[0025] Как используется в настоящем документе, "линия клеток соединительной ткани" включает в себя множество клеток соединительной ткани, происходящих от общей родительской клетки.
[0026] Как используется в настоящем документе, "гиалиновый хрящ" относится к соединительной ткани, покрывающей поверхность сустава. Только в качестве примера, гиалиновый хрящ включает, но не ограничивается этим, суставной хрящ, реберный хрящ и носовой хрящ.
[0027] В частности, известно, что гиалиновый хрящ самообновляется, реагирует на изменения и обеспечивает стабильное движение с меньшим трением. Гиалиновый хрящ, встречающийся даже в пределах одного сустава или между суставами, различается по толщине, плотности клеток, составу матрикса и механическим свойствам, но при этом сохраняет одну и ту же общую структуру и функцию. Некоторые из функций гиалинового хряща включают удивительную способность противостоять сжатию, упругость и исключительную способность распределять весовые нагрузки, способность минимизировать пиковую нагрузку на субхондральную кость и большую долговечность.
[0028] Визуально и гистологически гиалиновый хрящ выглядит как гладкая, твердая поверхность, которая сопротивляется деформации. Внеклеточный матрикс хряща состоит из хондроцитов, но в нем отсутствуют кровеносные, лимфатические сосуды и нервы. Сложная, высокоупорядоченная структура, поддерживающая взаимодействие между хондроцитами и матриксом, служит для поддержания структуры и функции гиалинового хряща, сохраняя при этом низкий уровень метаболической активности. Ссылка O’Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998 подробно описывает структуру и функцию гиалинового хряща, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0029] Как используется в настоящем документе, "инъецируемая" композиция относится к композиции, которая исключает различные трехмерные подложки, каркасы, сетки или волокнистые структуры, которые могут быть изготовлены из любого материала или формы, которые позволяют клеткам прикрепляться к ним и позволяют клеткам расти более чем в одном слое, и которые обычно имплантируются, а не вводятся путем инъекции. В одном варианте реализации изобретения способ введения обычно осуществляется с помощью шприца. Однако может быть использован любой способ введения интересующей композиции. Например, могут быть использованы катетеры, распылители или термозависимые полимерные гели.
[0030] Как используется в настоящем документе, "ювенильный хондроцит" относится к хондроциту, полученному от человека, которому менее двух лет. Как правило, хондроцит получают предпочтительно из области гиалинового хряща конечности тела, например, пальца, носа, мочки уха и так далее. Ювенильные хондроциты могут быть использованы в качестве донорских хондроцитов для аллогенного лечения дефектного или поврежденного межпозвоночного диска.
[0031] Как используется в настоящем документе, термин "млекопитающее-хозяин" включает представителей животного царства, включая человека, но не ограничиваясь этим.
[0032] Как используется в настоящем документе, "смесь клеток" или "смешанные клетки" относится к комбинации множества клеток, включающих первую популяцию клеток, которые трансфицированы или трансдуцированы представляющим интерес геном, и вторую популяцию клеток, которые не трансдуцированы.
[0033] В одном варианте реализации изобретения смесь клеток может относиться к комбинации множества клеток, включающих клетки, которые были трансфицированы или трансдуцированы геном или ДНК, кодирующей члена суперсемейства β трансформирующих факторов роста, и клетки, которые не были трансфицированы или трансдуцированы геном, кодирующим члена суперсемейства β трансформирующих факторов роста. Обычно соотношение клеток, которые не были трансфицированы или трансдуцированы геном, кодирующим члена суперсемейства β трансформирующего фактора роста, к клеткам, которые были трансфицированы или трансдуцированы геном суперсемейства TGF, может находиться в диапазоне от 3-20 к 1. Диапазон может включать соотношение от 3-10 к 1, в частности, диапазон может составлять от 10 к 1 в пересчете на количество клеток. Однако понятно, что соотношение этих клеток не обязательно должно быть фиксированным в каком-либо определенном диапазоне до тех пор, пока комбинация этих клеток является эффективной для лечения поврежденного межпозвоночного диска путем замедления или задержки дегенерации поврежденного межпозвоночного диска.
[0034] Как используется в настоящем документе, "недисковый хондроцит" относится к хондроцитам, выделенным из любой части тела, кроме хрящевой ткани межпозвоночного диска. Недисковые хондроциты по настоящему изобретению могут быть использованы для аллогенной трансплантации или инъекции пациенту для лечения дефекта или повреждения межпозвоночного диска.
[0035] Как используется в настоящем документе, термин "пациент" включает представителей животного царства, включая человека, но не ограничиваясь этим.
[0036] Как используется в настоящем документе, термин "примированные" клетки относится к клеткам, которые были активированы или изменены для экспрессии определенных генов.
[0037] Как используется в настоящем документе, "замедление" или "предотвращение" дегенерации межпозвоночного диска относится к сохранению объема межпозвоночного диска или высоты диска с течением времени по сравнению с объемом или уровнем высоты, которые обычно наблюдаются в месте повреждения, обычно приводящего к дегенерации в течение определенного времени. Это может означать увеличение в процентах объема или высоты, например, около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с нормальным ожидаемым уровнем дегенерации в определенное время, или может означать уменьшение повреждения или уменьшение объема или высоты межпозвоночного диска в данном месте.
[0038] Как используется в настоящем документе, "суперсемейство трансформирующих факторов роста β (TGF-β)" охватывает группу структурно родственных белков, которые влияют на широкий спектр процессов дифференцировки во время эмбрионального развития. Семейство включает в себя: ингибирующее вещество Мюллера (MIS), которое необходимо для нормального развития мужского пола (Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), продукт гена Drosophila decapentaplegic (DPP), который необходим для формирования дорсально-вентральной оси и морфогенеза имагинальных дисков (Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), продукт гена Xenopus Vg-1, который локализуется на вегетативном полюсе яйца (Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), активины (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986), которые могут индуцировать формирование мезодермы и передних структур у эмбрионов Xenopus (Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990), и костные морфогенетические белки (BMP, такие как BMP-2, 3, 4, 5, 6 и 7, остеогенин, OP-1), которые могут индуцировать образование хряща и кости de novo (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990). Продукты гена TGF-β могут влиять на различные процессы дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кроветворение и дифференцировку эпителиальных клеток (обзор см. в статье Massague, Cell 49:437, 1987), которая включена в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.
[0039] Белки семейства TGF-β изначально синтезируются в виде большого белка-предшественника, который впоследствии подвергается протеолитическому расщеплению в кластер основных остатков около 110-140 аминокислот от С-конца. С-концевые области всех белков структурно родственны, и различные члены семейства могут быть классифицированы в отдельные подгруппы на основе степени их гомологии. Хотя гомологии внутри конкретных подгрупп составляют от 70% до 90% идентичности аминокислотной последовательности, гомологии между подгруппами значительно ниже, обычно от 20% до 50%. В каждом случае активный вид представляет собой димер С-концевых фрагментов, связанных дисульфидной связью. Для большинства изученных членов семейства биологически активными оказались гомодимерные виды, но для других членов семейства, таких как ингибины (Ung, et al., Nature, 321:779, 1986) и TGF-β(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987), также были обнаружены гетеродимеры, которые, по-видимому, обладают иными биологическими свойствами, чем соответствующие гомодимеры.
[0040] Члены суперсемейства генов TGF-β включают TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4 (куры), TGF-β1, TGF-β5 (Xenopus), BMP-2, BMP-4, Drosophila DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, Drosophila 60A, GDF-1, Xenopus Vgf, BMP-3, Inhibin-βA, Inhibin-βB, Inhibin-α и MIS. Эти гены обсуждаются в Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998, который полностью включен сюда посредством ссылки во всей своей полноте.
[0041] Предпочтительно, члены генов суперсемейства TGF-β представляют собой TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 или BMP-7.
[0042] Межпозвоночный диск
[0043] Межпозвоночные диски составляют одну четвертую часть длины позвоночного столба. Между атлантом (C1), шейным позвонком (C2) и копчиком нет дисков. Диски не имеют сосудов и поэтому зависят от концевых пластинок для диффузии необходимых питательных веществ. Хрящевые слои концевых пластин закрепляют диски на месте.
[0044] Межпозвоночные диски - это фиброхрящевые подушки, служащие амортизационной системой позвоночника, которые защищают позвонки, мозг и другие структуры (например, нервы). Диски обеспечивают некоторое движение позвонков: разгибание и сгибание. Движение отдельных дисков очень ограничено - однако значительное движение возможно, когда несколько дисков объединяют усилия.
[0045] Межпозвоночные диски состоят из фиброзного кольца (annulus fibrosus) и пульпозного ядра (nucleus pulposus). Фиброзное кольцо представляет собой прочную радиальную шиноподобную структуру, состоящую из ламелей; концентрических листов коллагеновых волокон, соединенных с концевыми пластинами позвонков. Листы ориентированы под разными углами. Фиброзное кольцо окружает пульпозное ядро.
[0046] Хотя и фиброзное кольцо, и пульпозное ядро состоят из воды, коллагена и протеогликанов (ПГ), больше всего количества жидкости (воды и ПГ) находится в пульпозном ядре. Молекулы ПГ важны, поскольку они притягивают и удерживают воду. Пульпозное ядро содержит гидратированное гелеобразное вещество, которое сопротивляется сжатию. Количество воды в ядре меняется в течение дня в зависимости от активности. С возрастом пульпозное ядро начинает обезвоживаться, что ограничивает его способность поглощать удар. С возрастом фиброзное кольцо ослабевает и начинает рваться. Хотя у некоторых людей это может не вызывать боли, у других один или оба этих признака могут стать причиной хронической боли.
[0047] Боль, вызванная неспособностью обезвоживающегося пульпозного ядра поглощать удар, называется осевой болью или болью в дисковом пространстве. Постепенное обезвоживание пульпозного ядра обычно называют дегенеративным заболеванием диска. Когда фиброзное кольцо разрывается из-за травмы или процесса старения, пульпозное ядро может начать выдавливаться через разрыв. Это называется выпячиванием диска. Рядом с задней стороной каждого диска, вдоль всего позвоночника, проходят основные спинномозговые нервы, идущие к различным органам, тканям, конечностям и т.д. Очень часто выпяченный диск давит на эти нервы (защемление нерва), вызывая иррадиирующую боль, онемение, покалывание, снижение силы и/или амплитуды движений. Кроме того, контакт внутреннего ядерного геля, который содержит воспалительные белки, с нервом также может вызвать сильную боль. Боль, связанная с нервами, называется корешковой болью.
[0048] Выпяченные диски имеют много названий, и для разных медицинских специалистов они могут означать разные вещи. Скользящий диск, разрыв диска или выпячивание диска могут относиться к одному и тому же медицинскому состоянию. Протрузии диска в соседний позвонок известны как узлы Шморля.
[0049] Лечение примированными клетками
[0050] Настоящее изобретение охватывает введение примированных клеток в область межпозвоночного диска млекопитающего для лечения поврежденного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Примированные клетки обычно являются клетками соединительной ткани и включают хондроциты или фибробласты.
[0051] В качестве примера, когда популяцию первичных хондроцитов пассируют около 3 или 4 раз, их морфология обычно меняется на фибробластные хондроциты. По мере пассирования первичных хондроцитов они начинают терять некоторые из своих хондроцитарных характеристик и начинают приобретать характеристики фибробластных хондроцитов. Когда эти фибробластные хондроциты инкубируются или "примируются" с цитокином, таким как белок из суперсемейства TGF-β, клетки восстанавливают свои хондроцитарные характеристики, которые включают производство коллагена.
[0052] К таким примированным клеткам относятся фибробластные хондроциты, которые были инкубированы с TGFβ1 и в результате превратились в хондроциты, продуцирующие коллаген. Преимуществом использования примированных клеток для задержки дегенерации межпозвоночного диска является простота создания хондроцитов, пригодных для введения в межпозвоночный диск для производства коллагена и поддержания хрящевого матрикса.
[0053] Клетки могут включать, без ограничения, первичные клетки или клетки, прошедшие от одного до двадцати пассажей. Клетки могут быть клетками соединительной ткани. Клетки могут включать клетки, подвергшиеся морфогенному изменению, при этом примирование вызывает возврат к характеристикам исходной клетки. Клетки могут включать, без ограничения, хондроциты, фибробласты или фибробластные хондроциты. Примирование может происходить путем инкубации клеток в течение по меньшей мере 40 часов или от 1 до 40 часов, от 2 до 30 часов, от 3 до 25 часов, от 4 до 20 часов, от 5 до 20, от 6 до 18 часов, от 7 до 17 часов, от 8 до 15 часов или от 9 до 14 часов с цитокином, а затем, необязательно, отделения цитокина от клеток и введения примированных клеток в интересующий участок хрящевого дефекта для регенерации хряща, предпочтительно гиалинового хряща. В одном аспекте цитокин может быть членом суперсемейства TGF-β. В частности, цитокином может быть TGF-β, и, в частности, TGF-β1.
[0054] Цитокин может присутствовать в инкубационной смеси для примирования в количестве, достаточном для "примирования" хондроцитов, чтобы быть полезным в способе лечения межпозвоночных дисков. В этом аспекте примирующая инкубационная смесь может содержать по меньшей мере около 1 нг/мл цитокина. В частности, смесь может содержать от около 1 до 1000 нг/мл, от около 1 до 750 нг/мл, от около 1 до 500 нг/мл, от около 1 до 400 нг/мл, от около 1 до 300 нг/мл, от около 1 до 250 нг/мл, от около 1 до 200 нг/мл, от около 1 до 150 нг/мл, от около 1 до 100 нг/мл, от около 1 до 75 нг/мл, от около 1 до 50 нг/мл, от около 10 до 500 нг/мл, от около 10 до 400 нг/мл, от около 10 до 300 нг/мл, от около 10 до 250 нг/мл, от около 10 до 200 нг/мл, от около 10 до 150 нг/мл, от около 10 до 100 нг/мл, от около 10 до 75 нг/мл, от около 10 до 50 нг/мл, от около 15 до 500 нг/мл, от около 15 до 400 нг/мл, от около 15 до 300 нг/мл, от около 15 до 250 нг/мл, от около 15 до 200 нг/мл, от около 15 до 150 нг/мл, от около 15 до 100 нг/мл, от около 15 до 75 нг/мл, от около 15 до 50 нг/мл, от около 20 до 500 нг/мл, от около 20 до 400 нг/мл, от около 20 до 300 нг/мл, от около 20 до 250 нг/мл, от около 20 до 200 нг/мл, от около 20 до 150 нг/мл, от около 20 до 100 нг/мл, от около 20 до 75 нг/мл, от около 20 до 50 нг/мл, от около 25 до 500 нг/мл, от около 25 до 400 нг/мл, от около 25 до 300 нг/мл, от около 25 до 250 нг/мл, от около 25 до 200 нг/мл, от около 25 до 150 нг/мл, от около 25 до 100 нг/мл, от около 25 до 75 нг/мл, от около 25 до 50 нг/мл, от около 30 до 500 нг/мл, от около 30 до 400 нг/мл, от около 30 до 300 нг/мл, от около 30 до 250 нг/мл, от около 30 до 200 нг/мл, от около 30 до 150 нг/мл, от около 30 до 100 нг/мл, от около 30 до 75 нг/мл, от около 30 до 50 нг/мл, от около 35 до 500 нг/мл, от около 35 до 400 нг/мл, от около 35 до 300 нг/мл, от около 35 до 250 нг/мл, от около 35 до 200 нг/мл, от около 35 до 150 нг/мл, от около 35 до 100 нг/мл, от около 35 до 75 нг/мл, от около 35 до 50 нг/мл, от около 40 до 500 нг/мл, от около 40 до 400 нг/мл, от около 40 до 300 нг/мл, от около 40 до 250 нг/мл, от около 40 до 200 нг/мл, от около 40 до 150 нг/мл, от около 40 до 100 нг/мл, от около 40 до 75 нг/мл или от около 40 до 50 нг/мл.
[0055] Один из способов осуществления изобретения может включать инкубацию клеток с цитокином в течение определенного времени для создания примированных клеток и, необязательно, отделение цитокина от клеток, и введение примированных клеток в межпозвоночный диск или интересующий участок рядом с ним. В качестве альтернативы, клетки можно инкубировать с интересующим цитокином в течение определенного времени и вводить комбинацию в место дефекта без отделения цитокина.
[0056] Следует понимать, что хотя возможно, что такие вещества, как подложка или каркас, а также различные посторонние ткани могут быть имплантированы вместе в протоколе примированной клеточной терапии настоящего изобретения, также возможно, что такие подложки или ткани не будут включены в инъекционную систему изобретения. В предпочтительном варианте реализации изобретения в соматической клеточной терапии изобретение направлено на простой способ введения популяции примированных клеток соединительной ткани в пространство межпозвоночного диска.
[0057] Обычному специалисту в данной области будет понятно, что источником клеток для лечения пациента могут быть собственные клетки пациента, но также могут быть использованы аллогенные и ксеногенные клетки без учета гистосовместимости клеток. Альтернативно, в одном варианте реализации изобретения могут быть использованы аллогенные клетки, имеющие соответствующую гистосовместимость с млекопитающим-хозяином. Более подробное описание: гистосовместимость донора и пациента определяется таким образом, чтобы гистосовместимые клетки вводились млекопитающему-хозяину. Также ювенильные хондроциты могут быть использованы аллогенно без обязательного определения гистосовместимости донора и пациента.
[0058] Доставка генов
[0059] В одном аспекте настоящее изобретение раскрывает способы ex vivo и in vivo для доставки представляющей интерес последовательности ДНК в клетки соединительной ткани млекопитающего хозяина. Методика ex vivo включает культивирование целевых клеток млекопитающих, трансфекцию in vitro последовательности ДНК, вектора ДНК или другого средства доставки, представляющего интерес, в клетки млекопитающих с последующей трансплантацией модифицированных клеток млекопитающих в целевую область млекопитающего-хозяина для реализации экспрессии in vivo интересующего генного продукта.
[0060] Следует понимать, что хотя возможно, что такие вещества, как подложка или каркас, а также различные посторонние ткани могут быть имплантированы вместе в протоколе примированной клеточной терапии настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы такие подложки или ткани не были включены в инъекционную систему изобретения. В одном варианте реализации изобретение направлено на простой способ введения белка суперсемейства TGF или популяции культивированных, нетрансфицированных/нетрансфицированных клеток соединительной ткани или трансфицированных/трансфицированных клеток млекопитающих или их смеси в пространство межпозвоночного диска таким образом, чтобы экзогенный белок суперсемейства TGF экспрессировался или был активен в пространстве.
[0061] Обычному специалисту в данной области будет понятно, что одним из источников клеток для лечения пациента являются собственные клетки пациента. Другой источник клеток включает аллогенные клетки без учета гистосовместимости клеток с пациентом, которого предполагается лечить.
[0062] Более конкретно, данный способ включает использование генного продукта, который является членом суперсемейства β трансформирующего фактора роста, или его биологически активного производного или фрагмента, или его биологически активного производного или фрагмента.
[0063] В другом варианте реализации настоящего изобретения для парентерального введения пациенту в терапевтически эффективном количестве предлагается соединение, содержащее белок суперсемейства TGF-β и подходящий фармацевтический носитель.
[0064] В другом варианте реализации настоящего изобретения для парентерального введения пациенту в профилактически эффективном количестве предлагается соединение, содержащее белок суперсемейства TGF-β и подходящий фармацевтический носитель.
[0065] При терапевтическом применении белок TGF-β может быть создан в виде рецептуры для местного введения. Методики и рецептуры в целом можно найти в "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание. Активный ингредиент, которым является белок TGF, обычно сочетается с носителем, таким как разбавитель или вспомогательное вещество, которое может включать наполнители, экстендеры, связывающие, смачивающие агенты, дезинтегранты, поверхностно-активные агенты, разрушаемые полимеры или смазки, в зависимости от характера способа применения и лекарственных форм. Типичные лекарственные формы включают порошки, жидкие препараты, включая суспензии, эмульсии и растворы, гранулы и капсулы.
[0066] TGF белок по настоящему изобретению также может быть объединен с фармацевтически приемлемым носителем для введения субъекту. Примерами подходящих фармацевтических носителей являются различные катионные липиды, включая, но не ограничиваясь этим, N-(1-2,3-диолеилокси)пропил)-n,n,n-триметиламмоний хлорид (DOTMA) и диолеоилфотидилэтаноламин (DOPE). Липосомы также являются подходящими носителями для молекул белка TGF по изобретению. Другим подходящим носителем является гель или полимер с замедленным высвобождением, содержащий молекулы белка TGF.
[0067] Белок TGF бета может быть смешан с количеством физиологически приемлемого носителя или разбавителя, такого как физиологический раствор или другая подходящая жидкость. Молекула белка TGF также может быть объединена с другими носителями для защиты белка TGF и его биологически активных форм от деградации до достижения ими своих мишеней и/или облегчения перемещения белка TGF или его биологически активной формы через тканевые барьеры.
[0068] Еще один вариант реализации настоящего изобретения включает хранение клеток перед их переносом. Специалисты в данной области оценят, что клетки можно хранить замороженными в 10% ДМСО в жидком азоте.
[0069] В настоящей заявке предлагается способ регенерации или предотвращения дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки млекопитающего, трансфицированной или трансдуцированной геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), включая, но не ограничиваясь,этим, BMP-2 и TGF-β 1, 2 и 3.
[0070] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки соединительной ткани, которая не трансфицирована или не трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β) или которая не трансфицирована или не трансдуцирована любым другим геном. В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0071] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки млекопитающего, которая трансфицирована или трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β). В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0072] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем инъекции комбинации или смеси введения соответствующей клетки млекопитающего, которая трансфицирована или трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), и соответствующей клетки соединительной ткани, которая не трансфицирована или не трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β) или не трансфицирована или не трансдуцирована любым другим геном. В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0073] В одном из вариантов реализации изобретения подразумевается, что клетки могут быть введены в область, в которой необходимо предотвратить или замедлить дегенерацию межпозвоночного диска, с помощью вышеописанной композиции клеток с или без материала подложки или любого другого вспомогательного материала, такого как посторонние клетки или другие биосовместимые носители. То есть, только модифицированные клетки, только немодифицированные клетки, или их смесь или комбинация могут быть введены в область, в которой необходимо предотвратить или замедлить дегенерацию межпозвоночного диска.
[0074] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации настоящего изобретения, а не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
[0075] ПРИМЕР 1 - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ
[0076] Конструкция плазмиды
[0077] Плазмиду pMTMLVβ1 генерировали путем клонирования фрагмента 1,2 т.п.н. Bgl II, содержащего кодирующую последовательность TGF-β1 и сайт poly A гормона роста на 3’-конце в сайт Bam HI pMTMLV. Вектор pMTMLV получали из ретровирусного вектора MFG путем делеции полных последовательностей gag и env, а также части последовательности упаковки ψ .
[0078] Культура клеток и трансдукция - Кодирующую ДНК - TGF-β, клонированную в ретровирусных векторах индивидуально трансдуцировали в клетки 293 (293-TGF-β1). Их культивировали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (GIBCO-BRL, Rockville, MD) с 10% концентрацией фетальной бычьей сыворотки.
[0079] Для отбора клеток с трансдуцированной генной последовательностью в среду добавляли неомицин (300 мкг/мл). Клетки с экспрессией TGF-β1 иногда хранили в жидком азоте и культивировали непосредственно перед инъекцией.
[0080] Рентгенографический анализ высоты диска
[0081] Рентгенограммы выполняли после введения кетамина гидрохлорида (25 мг/кг) и ромпуна (1 мг/кг) через различные недельные интервалы после пункции. Предпринимали крайнюю осторожность для поддержания постоянного уровня анестезии во время рентгенографии каждого животного и в каждый момент времени для получения одинаковой степени расслабления мышц, что могло повлиять на высоту диска. Поэтому в качестве измерения исходного уровня всегда использовали предоперационную рентгенограмму. Также прилагали усилия для поддержания позвоночника в слегка согнутом положении. Для уменьшения погрешности от осевого вращения позвоночника и расхождения луча рентгенограммы повторяли не менее двух раз на каждом животном в положении лежа на боку с центром луча на расстоянии 4 см от подвздошного гребня кролика. Рентгенограммы сканировали в цифровом формате и сохраняли в цифровом виде с помощью программного обеспечения Image Capture.
[0082] Анализ изображений
[0083] Используя оцифрованные рентгенограммы, измерения, включая высоту тела позвонка и высоту межпозвоночного диска (МПД), анализировали с помощью анализа изображений, находящемся в открытом доступе. Данные переносили в программу Excel, и высоту МПД выражали как индекс высоты диска (ИВД) по методике Lu et al. "Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics. An in vivo biomechanical, radiologic, and histologic canine study", Spine 1997;22:1828-34. Среднюю высоту МПД (ИВД) рассчитывали путем усреднения измерений, полученных в передней, средней и задней частях МПД, и деления этого значения на среднее значение высоты тел соседних позвонков. Изменения в ИВД инъецированных дисков выражали в процентах ИВД и нормализовали к измеренной до операции высоте МПД (процент ИВД - послеоперационный ИВД/предоперационный ИВД × 100). Внутрисубъектное стандартное отклонение (СО) рассчитывали с применением уравнения:
√(∑(x1 - x2)2/2n)
[0084] Где X1 - это первое измеренное значение, X2 - второе измеренное значение, и n = 450. Процентный коэффициент дисперсии (процент CV) рассчитывали как (СО/средние всех измерений × 100). Ошибку измерения ИВД у одного исследователя оценивали как минимальную (СО: 0,001800316; процент CV: 3,13). Сообщалось также, что ошибка у разных исследователей была небольшой (СО: 0,003227; процент CV: 9,6)
[0085] Оценки МРТ
[0086] МРТ-исследования проводили всем кроликам в исследовании на 0.3-Т томографе (Airis II, версия 4.0 A; Hitachi Medical System America, Inc.) с квадратурным приемником катушки для конечностей. После умерщвления позвоночные столбы с окружающими мягкими тканями изолировали и проводили МРТ-анализ. Т2-взвешенные срезы в сагиттальной плоскости получали при следующих настройках: последовательность быстрого спинового эха с TR (время повторения) 4000 миллисекунд и TE (время появления эхо-сигнала) 120 миллисекунд; матрица 256(в) × 128 (о); поле зрения 260; и 4 возбуждения. Толщина среза составляла 2 мм с зазором 0 мм. МРТ оценивал "слепой" исследователь, использующий модифицированную классификацию Томпсона, основанную на изменениях в степени и площади интенсивности сигнала от 1 до 4 баллов (1 = норма, 2 = минимальное снижение интенсивности сигнала, но очевидное сужение области высокого сигнала, 3 = умеренное снижение интенсивности сигнала и 4 = сильное снижение интенсивности сигнала). Коэффициенты корреляции надежности градации МРТ у одного исследователя и между исследователями на основе 2 оценок были отличными (K = 0,98, 0,90, соответственно), что определяется коэффициентом корреляции Коэна каппа.
[0087] ПРИМЕР II - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ
[0088] Предотвращение дегенерации поврежденного межпозвоночного диска
[0089] Использовали новозеландских белых кроликов-самцов. Применяли технику открытой хирургии. Три уровня межпозвоночных дисков в поясничном отделе позвоночника: L2-3, L3-4, L4-5 подвергали экспериментальному лечению или наблюдали в качестве контроля у каждого животного. Лечения сбалансированным образом распределяли по уровням с несколькими участками/дисками на одного кролика. Внутригрупповой дизайн, в качестве контролей использовали сравнение изменения на разных уровнях диска до и после операции.
[0090] ПРИМЕР III
[0091] Предотвращение дегенерации поврежденного межпозвоночного диска с помощью только инъекции кроликам неиндуцированных хондроцитов, только TGF-B1-продуцирующих клеток 293 или смеси клеток (хондроциты человека и TGF-B1-продуцирующие клетки 293)
[0092] Все хондроциты, использованные в примерах I-V, не являются дисковыми хондроцитами и представляют собой ювенильные хондроциты, полученные из части гиалинового хряща пальца ребенка в возрасте менее двух лет.
[0093] Пункцию иглой производили в межпозвоночные диски поясничного отдела позвоночника. После пункции иглой вводили TGF-β1-продуцирующие клетки 293, первичные нетрансдуцированные хондроциты человека, смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и первичных нетрансдуцированных хондроцитов человека, примированные нетрансдуцированные хондроциты человека или носитель/среду. Использовали несколько контролей. Условия эксперимента представлены в таблице 1.
Таблица 1 | |
Хирургическая подготовка | Инъекционное лечение |
Пункция иглой | TGF-β1-продуцирующие клетки 293 (~5 × 106клеток) |
Пункция иглой | Смесь: TGF-β1-продуцирующие клетки 293 Первичные нетрансдуцированные хондроциты человека (отношение ~3 к 1, 5 × 106) |
Пункция иглой | Первичные нетрансдуцированные хондроциты человека (~5 × 106) |
Пункция иглой | Первичные нетрансдуцированные хондроциты человека (~5 × 106) |
Пункция иглой | DMEM |
Пункция иглой | Только пункция иглой - без инъекции |
Без пункции | Контроль без пункции, без лечения |
[0094] Вкратце, в межпозвоночных дисках поясничного отдела позвоночника кролика или свиньи производили пункцию иглой. После этого прокола кроликов оставляли на 4 недели для заживления. Затем во время второй хирургической процедуры вводили экспериментальную лечебную композицию, включающую TGF-β1-продуцирующие клетки 293 и/или первичные нетрансдуцированные хондроциты человека (~5 × 105) или соблюдали условия контроля (Таблица I).
[0095] После эндотрахеальной интубации и достижения общей анестезии, например, путем введения кетамина гидрохлорида и Rompun®, животное помещали в положение лежа. Раствор Рингера с лактатом использовали в объеме около (5 мл/кг/час). Область разреза выбривали, подготавливали и обкладывали салфетками обычным стерильным способом с чередованием бетадиновых и спиртовых салфеток (больше трех раз). В глаза закладывали успокоительную офтальмологическую мазь. Для обнажения правой передней стороны диска от L2-L5 (у кролика имеется 6-7 поясничных позвонков) использовали левый забрюшинный подход. Использовали различные схемы подготовки, а схему лечения применяли для каждого уровня диска. Для подготовки диска к "пункции иглой" использовали иглу 18 калибра чтобы сделать пункцию в диске на глубину 5 мм (Aoki et al., "Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model: effects of depth of puncture". Spine. 2006;31(21):E774-80). После пункции вводили исследуемые материалы, перечисленные в таблице I. Лечебную композицию наносили на любую из областей L1-2, L2-3, L3-4, L4-5 каждого кролика.
[0096] Для контроля любых изменений диска использовали ежемесячные рентгенограммы. Животных умерщвляли через 2, 8 и 24 недели после операции.
[0097] Рентгенограммы/МРТ О заживлении свидетельствовало обнаруживаемое рентгенографическое изменение увеличенной высоты диска по сравнению с тем же диском на исходном уровне (до операции) по сравнению с диском на других уровнях диска. Другие диски сравнивали до и после только пункции иглой, а также до и после без пункции иглой, что позволяет получить индекс нормальной дегенерации с течением времени.
[0098] ПЦР с обратной транскрипцией Для определения относительного количества выживших трансфицированных хондроцитов проводили ПЦР с обратной транскрипцией.
[0099] Гистология. Также применяли гистологию для подтверждения характеристики коллагена I и II типа, общего внешнего вида и оценки de novo хондроцитов.
[00100] Вестерн-блоттинг и /или ИФА. Количественная экспрессия коллагена I и II типа, а также концентрация протеогликанов, Smads 2/3, Sox-9. Кроме того, применяли ИФА для оценки TGFβ-1, BMP2, BMP7, GDF5 и других родственных факторов роста при наличии антител.
[00101] Апоптоз исследовали в других тканевых структурах межпозвоночного диска путем наблюдения за экспрессией Caspase-3.
[00102] ПРИМЕР IV
[00103] Результаты
[00104] Результаты показаны на Фигурах и в описании Фигур настоящего изобретения. Пунктированный межпозвоночный диск, обработанный нетрансдуцированными хондроцитами, трансдуцированными клетками 293, примированными хондроцитами или смесью трансдуцированных клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов, демонстрирует положительный эффект в предотвращении или задержке дегенерации диска по сравнению с контролем с помощью носителя.
[00105] Пример IV-1 - Лечение смесью клеток (трансдуцированные клетки 293 и нетрансдуцированные хондроциты) пунктированного межпозвоночного диска у кролика
[00106] Лечение смесью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски при тестировании на кроликах. Этот эффект виден в различных экспериментах на ФИГ. 1-4. На ФИГ. 1A-1F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00107] На ФИГ. 2A-2F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00108] На ФИГ. 3A-3D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00109] Пример IV-2 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика смесью клеток (трансдуцированные клетки 293 и нетрансдуцированные хондроциты)
[00110] Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 оказывают антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 4A-4D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00111] Пример IV-3 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика трансдуцированными клетками 293 и смесью клеток
[00112] Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 и, лечение смеcью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 5A-5D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00113] Пример IV-4 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика нетрансдуцированными хондроцитами
[00114] Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден в различных экспериментах на ФИГ. 6-8. На ФИГ. 6A-6D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00115] На ФИГ. 7A-7F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) был травмирован диск в L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) был травмирован диск в L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00116] На ФИГ. 8A-8F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был поврежден путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L1/2 позвоночника, и (iii) диск в L2/3 был поврежден и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был травмирован путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в позвоночном локусе L1/2, и (iii) диск в L2/3 был травмирован и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00117] Пример IV-5 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика нетрансдуцированными примированными хондроцитами
[00118] Лечение примированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 9A-9D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 8 (восемь) недель после операции, в которой (i) диск в L2/3 был травмирован и в него была введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L3/4 позвоночника, и (iii) диск в L4/5 был травмирован и в него были введены примированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L2/3 и L4/5. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00119] ПРИМЕР V
[00120] Источник хондроцитов человека
Первичные хондроциты человека выращивали из хрящевой ткани, полученной при хирургическом иссечении полидактилии пальца у годовалой девочки-донора. Ткань полидактилии получали в хирургическом кабинете. Следующую процедуру выделения хондроцитов проводили в боксе для биологически опасных материалов. Пластиковый флакон, содержащий хрящевую ткань, протирали спиртом, а хрящевую ткань промывали стерильным PBS (1X) с помощью пипетки. Раствор коллагеназы готовили путем растворения 7 мг коллагеназы (Gibco BRL) в 10 мл DMEM (содержащей 10% FBS) и фильтрования через шприцевой фильтр 0,2 мкм (Corning). Промытую хрящевую ткань обрабатывали раствором коллагеназы в течение 17-18 часов в инкубаторе при встряхивании при 37°C. На следующий день бутылку дезинфицировали спиртом. Обработанный коллагеназой материал пипетировали вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить свободные клетки от тканевой массы. После пипетирования супернатант фильтровали через 70 мкм нейлоновое клеточное сито (Falcon). Обработанные коллагеназой ткани,утратившие свою целостность (например, свободные клетки), могли пройти через фильтр. Клеточный фильтрат собирали в пробирку объемом 50 мл (Falcon) и затем центрифугирован при 1500 об/мин в течение 5 минут. Две трети супернатанта отбрасывали, а осадок промывали 10 мл стерильного PBS (1X). Ресуспендированные клетки снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут и, после удаления двух третей супернатанта, промывали 10 мл стерильного PBS (1X). Клетки снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, а затем ресуспендировали в DMEM (содержащей 10% FBS). Затем ресуспендированные клетки переносили в четыре флакона без покрытия площадью 25 см2 и культивировали в течение четырех дней при 37°C с 5% CO2. Затем клетки переносили в два флакона без покрытия площадью 185 см2 . Клетки культивировали в течение двух недель, затем собирали, промывали и ресуспендировали в криоконсервирующей среде DMEM, эмбриональной бычьей сыворотке и ДМСО в соотношении 5:4:1. Клетки распределяли на аликвоты в криопробирки, содержащие 1 мл клеточной суспензии при концентрации 4×105 клеток/мл. Клетки хранили в парофазной среде жидкого азота.
Claims (26)
1. Способ предотвращения дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию клетки эмбриональной почки человека в место дефекта межпозвоночного диска.
2. Способ по п. 1, в котором указанная клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором млекопитающее представляет собой человека.
4. Способ задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию клетки эмбриональной почки человека в место дефекта межпозвоночного диска.
5. Способ по п. 4, в котором указанная клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором млекопитающее представляет собой человека.
7. Способ предотвращения дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию смеси клетки эмбриональной почки человека из a) и второй, немодифицированной клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска, причем указанная вторая клетка соединительной ткани млекопитающего представляет собой хондроцит.
8. Способ по п. 7, в котором хондроцит представляет собой недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит.
9. Способ по п. 7, в котором хондроцит, являющийся указанной второй клеткой соединительной ткани млекопитающего, представляет собой примированный хондроцит.
10. Способ по любому из пп. 7-9, в котором клетка эмбриональной почки человека или указанная вторая клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
11. Способ задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию смеси клетки эмбриональной почки человека из a) и второй, немодифицированной клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска, причем указанная вторая клетка соединительной ткани млекопитающего представляет собой хондроцит.
12. Способ по п. 11, в котором хондроцит представляет собой недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит.
13. Способ по п. 11, в котором хондроцит, являющийся указанной второй клеткой соединительной ткани млекопитающего, представляет собой примированный хондроцит.
14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором клетка эмбриональной почки человека или указанная вторая клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
15. Способ лечения дегенерации межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 1-6 к нуждающемуся в нем субъекту.
16. Способ лечения дегенерации межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 7-14 к нуждающемуся в нем субъекту.
17. Способ лечения повреждения межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 1-6 к нуждающемуся в нем субъекту.
18. Способ лечения повреждения межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 7-14 к нуждающемуся в нем субъекту.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/826,676 | 2019-03-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021131390A RU2021131390A (ru) | 2023-05-02 |
RU2817218C2 true RU2817218C2 (ru) | 2024-04-11 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090238806A1 (en) * | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Moon Jong Noh | Treatment of intervertebral disc degeneration |
US20140099709A1 (en) * | 2012-06-19 | 2014-04-10 | Organovo, Inc. | Engineered three-dimensional connective tissue constructs and methods of making the same |
RU2576447C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2016-03-10 | Владимир Петрович Смирнов | Способ лечения внутридисковой гипертензии при дегенеративно-дистрофических изменениях позвоночника |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090238806A1 (en) * | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Moon Jong Noh | Treatment of intervertebral disc degeneration |
US20140099709A1 (en) * | 2012-06-19 | 2014-04-10 | Organovo, Inc. | Engineered three-dimensional connective tissue constructs and methods of making the same |
RU2576447C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2016-03-10 | Владимир Петрович Смирнов | Способ лечения внутридисковой гипертензии при дегенеративно-дистрофических изменениях позвоночника |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210177939A1 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration | |
JP5362554B2 (ja) | 軟骨の欠損を処置するための可溶性形態形成タンパク質の使用 | |
JP2017008053A (ja) | プライミング細胞療法 | |
US20210052664A1 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration | |
RU2817218C2 (ru) | Лечение дегенерации межпозвоночного диска | |
US20030223965A1 (en) | Bone generation by gene therapy | |
AU2017204202B2 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration | |
US20230256025A1 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration and discogenic back pain | |
US20230256055A1 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration and discogenic back pain | |
CN101601858B (zh) | 中期因子蛋白的用途及含该蛋白的医用装置 |