CN1371289B - 使用TGF-β的基因治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员的细胞介导的基因治疗，治疗矫形外科疾病。证实了TGF-β基因治疗可作为变性关节炎的新疗法。在将TGF-β cDNA表达载体转染入成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β1)后，将该细胞注射入家兔跟腱和具有人为造成的软骨缺损的膝关节中。进行腱内注射来确定其体内表达的最佳浓度。制造了部分缺损软骨模型来模仿膝关节的变性关节炎。新形成的透明软骨覆盖了用细胞-介导的基因治疗方法治疗的部分软骨缺损，表明细胞存活并在该区域内刺激基质形成。完全除去软骨的区域被纤维状胶原覆盖。

Description

使用TGF-β的基因治疗

背景技术

1.发明领域

本发明涉及将编码转化生长因子β超家族成员的至少一种基因引入至少一种哺乳动物结缔组织中，用于哺乳动物宿主中结缔组织再生的方法。本发明还涉及一种结缔组织细胞系，它携带一种DNA载体分子，该载体含有编码转化生长因子β超家族成员的基因。

2.相关领域的简述

在矫形外科领域，变性关节炎或骨关节炎是最常见的伴有软骨损伤的疾病。几乎机体的每个关节，如膝、髋、肩、甚至是腕都会患。该疾病的发病机理是透明关节软骨的变性(Mankin等，J.Bone Joint Surg，52A：460-466，1982)。关节的透明软骨变形、形成原纤维，最终凹陷。如果变性的软骨能以某种方式再生，大多数病人将能重新享受生活，而没有令人虚弱的疼痛。迄今尚未报道过能再生损伤透明软骨的方法。

药物递送的传统途径(如口服、静脉内或肌肉内给药)对于将药物携带到关节是无效的。关节内注射药物的半衰期通常较短。关节内注射药物的另一个缺点是需要频繁重复注射，以在关节腔获得可接受的药物水平，用于治疗慢性病如关节炎。因为迄今的治疗药物不能选择性的靶向关节，必需使哺乳动物宿主接触全身性高浓度的药物，来实现持续的、关节内治疗剂量。而非靶器官接触高浓度的药物加重了抗关节炎药物产生严重副作用(如哺乳动物宿主的胃肠道不适、和血液学、心血管、肝肾系统的变化)的倾向。

在矫形外科领域，已考虑将一些细胞因子作为治疗矫形外科疾病的候选药物。认为骨形态发生蛋白质是骨形成的有效刺激剂(Ozkaynak等，EMBO J，9：2085-2093，1990；Sampath和Rueger，Complication in Ortho，101-107，1994)，并已报道TGF-β可作为骨发生和软骨形成的刺激剂(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990)。

认为转化生长因子-β(TGF-β)是一种多功能细胞因子(Sporn和Roberts，Nature(London)，332：217-219，1988)，并在细胞生长、分化和胞外基质蛋白合成中起调节作用(Madri等，J Cell Biology，106：1375-1384，1988)。TGF-β在体外抑制表皮细胞和成骨样细胞的生长(Chenu等，Proc.Natl.Acad.Sci，85：5683-5687，1988)，但它在体内刺激软骨内骨化和最终形成骨(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand 64(5)：553-556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8：215-220，1994)。TGF-β诱导的骨形成是通过它对骨膜下多能细胞的刺激所介导的，这些细胞最终分化成软骨细胞(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-6：2021-2036，1994)。

已报道了TGF-β在矫形外科中的生物学作用(Andrew等，Calcif Tissue In.52：74-78，1993；Borque等，Int J Dev Biol，37：573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology，107：1969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)：553-556，1993；Matsumoto等，In vivo 8：215-220，1994)。在小鼠胚胎中，染色显示TGF-β与衍生自间充质的组织(如结缔组织、软骨和骨)紧密相关。除了胚胎学的发现外，TGF-β还存在于骨形成和软骨形成部位。它还能增强家兔胫骨骨折愈合。近来，报道了TGF-β的治疗价值(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A OrthopScand 64(5)：553-556，1993)，但其短期作用和高成本限制了广泛的临床应用。

TGF-β关节内注射用于治疗关节炎不理想，因为注射的TGF-β作用持续时间短，因为TGF在体内降解成无活性形式。因此，需要一种长期释放TGF-β的新方法，用于透明软骨再生。

报道了自身移植软骨细胞再生关节软骨(Brittberg等，New Engl J Med 331：889-895，1994)，但该方法包括两次广泛切除软组织的手术。如果关节内注射足以治疗变性关节炎，这将对病人经济上和生理上有极大的好处。

基因治疗是一种将特定蛋白转移到特定部位的方法，它可以解决这个问题(Wolff和Lederberg，Gene Therapeutics，Jon A.Wolff编，3-25，1994；和Jerk，JNatl Cancer Inst，89(16)：1182-1184，1997)。

美国专利5,858,355和5,766,585公开了制造一种IRAP(白细胞介素-1受体拮抗蛋白)基因的病毒或质粒构建物；用该构建物转染滑膜细胞(5,858,355)和骨髓细胞(5,766,585)；和将转染细胞注射到家兔关节中，但未公开用属于TGF-β超家族的基因再生结缔组织。

美国专利号5,846,931和5,700,774公开了注射含有骨形态发生蛋白(BMP)(属于TGFβ“超家族”)和截短的甲状旁腺激素相关肽的组合物，来影响软骨组织形成的维持并诱导软骨组织。然而，未公开使用BMP基因作基因治疗的方法。

尽管这些现有技术公开的内容，对于将编码产物的至少一种基因在体外或体内引入哺乳动物宿主结缔组织的至少一种细胞，用于治疗哺乳动物宿主的方法仍然有非常现实和基本的需要。另外，还需要一种方法，即采用编码转化生长因子β超家族成员的一种基因在哺乳动物宿主中再生结缔组织。更具体说，需要一种方法，在体内宿主结缔组织细胞中表达编码蛋白质TGF-β超家族的基因。

发明简述

本发明满足了本文上述需要。本发明提供了一种将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物结缔组织的至少一种细胞中，用于治疗哺乳动物宿主的方法。该方法包括用重组技术产生含有编码该产物的基因的DNA载体分子，并将含有编码该产物的基因的DNA载体分子引入结缔组织细胞中。该DNA载体分子可以是任何能被传递并在靶细胞或组织中维持的DNA分子，从而编码该感兴趣产物的基因能稳定表达。优选用于本发明的DNA载体分子是病毒或质粒DNA载体分子。该方法优选包括将编码该产物的基因引入哺乳动物结缔组织的细胞，用于治疗。

本发明涉及一种治疗关节炎的方法，包括：

a)产生一种重组病毒或质粒载体，该载体包含编码蛋白质转化生长因子超家族成员的DNA序列，该序列与一启动子可操纵性连接；

b)用所述重组载体体外转染培养的结缔组织细胞群，得到一群转染的结缔组织细胞；和

c)将转染的结缔组织细胞通过关节内注射移植到哺乳动物宿主的关节腔中，从而该DNA序列在关节腔内的表达导致结缔组织再生。

该重组载体可以是但不限于逆转录病毒载体，优选逆转录病毒载体，载体还可以是质粒载体。

本发明的方法包括在移植前储藏一群转染的结缔组织细胞。细胞可在移植前液氮下储藏在10％DMSO中。

结缔组织细胞包括但不限于成纤维细胞、间充质细胞、成骨细胞或软骨细胞。成纤维细胞可以是NIH 3T3细胞或人包皮成纤维细胞。

结缔组织包括但不限于软骨、韧带或腱。软骨可以是透明软骨。

本发明的方法使用转化生长因子超家族的成员，包括转化生长因子β(TGF-β)。转化生长因子超家族的成员可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。优选，TGF-β是人或猪的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

本发明还涉及一种透明软骨再生的方法，包括：

a)产生一种重组病毒或质粒载体，该载体中包含编码蛋白质转化生长因子超家族成员的DNA序列，该序列与启动子可操纵性连接；

b)用该重组载体体外转染一群培养的结缔组织细胞，得到一群转染的结缔组织细胞；和

c)通过关节内注射将转染的结缔组织细胞移植到哺乳动物宿主的关节腔中，从而该DNA序列在关节腔内的表达导致透明软骨再生。

转染的方法可通过脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电穿孔和DEAE-葡聚糖介导等方法进行。

本发明的方法包括使用优选的质粒pmTβ1。

本发明还涉及一种结缔组织细胞系，它含有一种重组病毒或质粒载体，该载体含有编码转化生长因子超家族成员的DNA序列。该结缔组织细胞系可包括但不限于，成纤维细胞系、间充质细胞系、软骨细胞系、成骨细胞系或骨细胞系。成纤维细胞系可以是人包皮成纤维细胞系或NIH 3T3细胞系。

本发明的结缔组织细胞系包含转化生长因子超家族的成员。优选的，转化生长因子超家族的成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。更优选的，该成员是人或猪的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

本发明的结缔组织细胞系还可以含有携带重组载体pmTβ1的细胞。

本发明的这些和其他目的将从本发明下面的描述、附图和权利要求中获得更全面的了解。

附图简述

图1-TGF-β1mRNA的表达。从NIH 3T3细胞或用pmTβ1(一种TGF-β1表达载体)稳定转染的NIH 3T3细胞分离得到总RNA。这些细胞在锌存在或不存在情况下生长。用TGF-β1cDNA或β肌动蛋白cDNA作为对照探测总RNA(15毫克)。

图2A-2B-再生软骨的大体观察

2A.在股骨踝上制造矩形部分软骨缺损，用未经TGF-β1转染的NIH 3T3细胞注射膝关节。该缺损没能被覆盖。

2B.注射NIH 3T3-TGF-β1细胞6周后缺损被新形成的组织覆盖。再生组织的颜色几乎与周围软骨相同。

图3A-3D-再生软骨的显微镜观察(X 200)

3A和3B.用对照细胞注射4和6周后缺损部分的苏木精-伊红(H&E)分析。无组织覆盖最初的缺损区域。

3C和3D.注射TGF-β1-转染细胞4和6周后缺损区域的苏木精-伊红(H&E)分析。在4周时，注射TGF-β1转染的细胞后，部分缺损区域已被透明软骨覆盖。注射4周和6周后，再生组织变厚，6周时其高度几乎与正常软骨相同。在组织学上，再生的软骨(箭头)与周围的透明软骨相同。

图4A-4B-家兔关节中/TGF-β1表达的免疫组织化学分析(x200)。

棕色(Brown)免疫过氧化物酶反应产物表明在NIH 3T3 TGF-β1细胞中有高水平的重组TGF-β1表达(4B)。

4A显示了注射对照细胞的家兔关节中的透明软骨。

图5A-5B-用H&E染色(A)和safranin-O染色(B)的再生组织的显微镜观察(X200)。

5A.在部分损伤区域，H&E染色(黑色箭头)显示了再生的透明软骨。

5B.在完全的剥离软骨的区域，再生组织(白色箭头)是纤维状胶原。

图6-pmTβ1的质粒图。

图7A-7D-注射TGF-β1转染细胞的家兔跟腱的总体形态学。

7A.注射对照细胞的腱。

7B.注射TGF-β1转染细胞的腱，注射后6周。

7C.7A中的腱的横切面图。

7D.7B中的腱的横切面图。

图8A-8F-H&E染色家兔跟腱中的再生组织的显微镜观察。

8A、8B和8C显示了注射对照细胞6周的腱。8A.放大50倍。8B.放大200倍。8C.放大600倍。

8D、8E和8F显示了注射TGF-β1转染细胞后6周的腱。8D.放大50倍。8E.放大200倍。8F.放大600倍。注射入该腱的TGF-β1转染细胞看来比内源性腱细胞更圆。通过作用的自分泌和旁分泌模式产生纤维状胶原，腱增大。注射TGF-β1转染细胞后腱增大。

图9A-9B-对用H&E染色(A)和用TGF-β1抗体免疫组织化学染色(B)的家兔跟腱中的再生组织的显微镜观察。棕色免疫过氧化物酶反应产物表明，在NIH 3T3-TGF-β1细胞中高水平的重组TGF-β1表达。

发明详述

本文所用的术语“病人”指动物王国的成员，包括但不限于人类。

本文所用的术语“哺乳动物宿主”包括动物王国的成员，包括但不限于人类。

本文所用的术语“结缔组织”是连接或支持其他组织或器官的组织，包括但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、腱、骨和滑膜。

本文所用的术语“结缔组织细胞”或“结缔组织的细胞”包括在结缔组织中发现的细胞，如成纤维细胞、软骨细胞(chondrocyte)、和骨细胞(成骨细胞和骨细胞)，它们像脂肪细胞(adipocyte)和平滑肌细胞一样分泌胶原性胞外基质。优选的结缔组织细胞是成纤维细胞、软骨细胞和骨细胞。更优选的结缔组织细胞是成纤维细胞。结缔组织细胞还包括间充质细胞，它们也称为未成熟成纤维细胞。应认识到本发明可采用结缔组织细胞的混合培养物和单种类型细胞来实施。

本文所用的术语“结缔组织细胞系”包括起源于共同亲本细胞的多种结缔组织细胞。

本文所用的术语“透明软骨”指覆盖关节表面的结缔组织。仅作为举例，透明软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。

具体的，已知透明软骨是自我更新的，对变化起反应的，并使运动减少摩擦而稳定。发现甚至在同一关节内或关节之间厚度、细胞密度、基质组成和机械性质都不同，但保持着相同的总体结构和功能。透明软骨的某些功能包括对压缩惊人的刚性、弹性，和突出的分散重量负荷的能力、最大程度减小软骨下骨的高峰应力的能力，以及强大的耐久性。

总体从组织学上说，透明软骨看起来是能抵抗变形的一种光滑坚固表面。软骨的胞外基质含有软骨细胞，但缺少血管、淋巴管和神经。维持软骨细胞和基质之间的相互作用的精巧而高度有序的结构起到了维持透明软骨结构和功能的作用，同时保持着低水平的代谢活动。O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A：1795-1812，1998详细描述了透明软骨的结构和功能，在此引入以供参考。

本文所用的术语“转化生长因子-β(TGF-β)超家族”包含了一组结构相关的蛋白质，在胚胎发育过程中影响各式各样的分化过程。该家族包括Müllerian抑制物质(MIS)，它是正常雄性发育必需的(Behringer等，Nature，345：167，1990)，果蝇十五褶(DPP)基因产物，它是背腹轴线形成和器官芽形态发生所必需的(Padgett等，Nature，325：81-84，1987)，非洲爪蟾Vg-1基因产物，它位于卵子的植物极(Weeks等，Cell，51：861-867，1987)，肌动蛋白(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135：957-964，1986)，它能诱导非洲爪蟾胚胎的中胚层和前结构的形成(Thomsen等，Cell，63：485，1990)，和骨形态发生蛋白(BMP’s，如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素，OP-1)，它能诱导软骨和骨从头形成(Sampath等，J.Biol.Chem.，265：13198，1990)。TGF-β基因产物可影响各种分化过程，包括脂肪形成、肌生成、软骨生成、血细胞生成和表皮细胞分化(对于综述，见Massague，Cell 49：437，1987)，在此引入以供参考。

最初合成了作为大前体蛋白质的TGF-β家族蛋白质，然后经过在离C-端约110-140个氨基酸的一簇碱性残基处进行蛋白水解切割。这些蛋白质的C-端区域都是结构相关的，不同家族成员可根据其同源性程度分成不同亚组。虽然具体亚组内的同源性范围氨基酸序列相同性在70％-90％之间，但亚组之间的同源性明显低得多，通常仅20％-50％。在各种情况下，活性种类看来是C-末端片段二硫键连接的二聚体。对于该家族大多数已研究过的成员，发现同二聚体具有生物活性，但对于其他家族成员，如抑制素(Ung等，Nature，321：779，1986)和TGF-β(Cheifetz等，Cell，48：409，1987)，也已检测到异二聚体，这些异二聚体似乎与各个同二聚体具有不同的生物学性质。

TGF-β基因超家族的成员包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(鸡)、TGF-β1、TGF-β5(非洲爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蝇60A、GDF-1、非洲爪蟾Vgf、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。在Massague，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1988中描述了这些基因，在此引入以供参考。

优选TGF-β超家族的成员是TGF-β。更优选的成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。甚至更优选的成员是人或猪的TGF-β。更优选的成员是人或猪TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。最优选的成员是人或猪TGF-β1。

本文所用的术语“可选择标记”包括细胞表达的基因产物，该细胞能稳定维持引入的DNA，该DNA导致细胞表达改变的表型如形态学的转化或酶活性。分离表达某转染基因的细胞可通过将第二种编码可选择标记的基因引入同一细胞来实现，例如引入具有能赋予对抗生素或其他药物抗性的酶活性的标记。选择性标记的例子包括但不限于：胸腺嘧啶激酶、二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶，它赋予对氨基糖苷抗生素(如卡那霉素、新霉素和遗传霉素)的抗性、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、CAD(一种蛋白质，具有尿嘧啶从头生物合成的前三种酶活性-氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨基甲酰酶和二氢乳清酸酶(dihydroorotase))、腺嘌呤脱氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等，Molecular Cloning，16章，1989)，在此引入以供参考。

本文所用的术语“启动子”可以是能控制真核生物中转录的有活性的任何DNA序列。启动子可以在真核细胞或原核细胞中具有活性。优选启动子在哺乳动物细胞中具有活性。启动子可以是组成型表达或可诱导的。优选的启动子是可诱导的。优选的启动子是可被外源刺激诱导的。更优选的启动子是被激素或金属诱导的。最优选的启动子是金属硫蛋白基因启动子。类似的，可以将也能控制转录的“增强子元件”插入该DNA载体构建物中，用于本发明的构建物来增强感兴趣基因的表达。

本文所用的术语“DC-chol”意味着一种含有阳离子胆固醇衍生物的阳离子脂质体。“DC-chol”分子包括叔氨基，中等长度的空间臂(两个原子)和氨基甲酰基接头键(Gao等，Biochem.Biophys.Res，Commun.，179：280-285，1991)。

本文所用的术语“SF-chol”定义为一类阳离子脂质体。

本文所用的与脂质体相关的术语“生物学活性”指在靶细胞中引入功能性DNA和/或蛋白质的能力。

本文所用的与核酸、蛋白质、蛋白质片段或其衍生物有关的术语“生物学活性”指核酸或氨基酸序列模仿野生型的核酸或蛋白质引起的已知生物学功能的能力。

本文所用的术语“维持”当和脂质体传递一起使用时，指引入的DNA保持在细胞内的能力。当用于其他情况时，它指靶向DNA保持在靶细胞或组织中，从而赋予治疗效果的能力。

本发明公开了在体外和体内将感兴趣的DNA序列传递到哺乳动物宿主的结缔组织细胞的技术。活体外技术涉及培养靶结缔组织细胞，在体外将DNA序列、DNA载体或其他感兴趣的传递载体转染入结缔组织细胞，然后将修饰的结缔组织细胞移植到该哺乳动物宿主的靶关节中，从而影响该感兴趣基因产物的体内表达。

作为体外成纤维细胞操纵的另选方法，将编码感兴趣的产物的基因引入脂质体，直接注射到关节区域，其中脂质体与结缔组织细胞融合，导致体内基因表达属于TGF-β超家族的基因产物。

作为体外结缔组织细胞操纵的另选方法，将编码感兴趣产物的基因作为裸露DNA引入关节区域。裸露DNA进入结缔组织细胞，导致体内基因表达属于TGF-β超家族的基因产物。

本说明书公开的一种治疗结缔组织疾病的活体外方法包括：首先产生一种重组病毒或质粒载体，它含有编码蛋白质或其生物活性片段的DNA序列。然后用该重组载体感染或转染一群体外培养的结缔组织细胞，得到一群含有该载体的结缔组织细胞。然后将这些结缔组织细胞移植在哺乳动物宿主的靶关节腔中，影响该蛋白或蛋白片段在关节腔内的随后表达。该感兴趣的DNA序列的表达对于减轻与结缔组织疾病相关的有害关节病理变化是有用的。

本领域普通技术人员应理解，治疗人类患者的细胞的优选来源是病人自己的结缔组织细胞，如自身的成纤维细胞。

更具体的，作为基因，本方法包括使用一种能编码转化生长因子β超家族成员，或其生物活性衍生物或其片段，和一可选择标记或其生物活性衍生物或片段的基因。

作为基因，本发明的另一个实施例包括使用能编码至少一个转化生长因子β超家族的成员，或其生物活性衍生物或片段的基因，和作为DNA质粒载体，使用本领域普通技术人员已知的、能在靶细胞或组织内，不论使用什么传递方法，都能在传递后稳定维持的任何DNA质粒载体。

一种方法是直接传递DNA载体分子到靶细胞或组织，不论它是病毒或质粒DNA载体分子。作为基因，该方法还包括使用能编码转化生长因子β超家族成员或生物活性衍生物或其片段的基因。

本发明的另一个实施例提供了一种方法，将至少一种编码产物的基因引入至少一种结缔组织细胞，用于治疗哺乳动物宿主。本发明方法包括使用非病毒物质，将编码该产物的基因引入结缔组织细胞。更具体的，该方法包括脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电穿孔或DEAE-葡聚糖介导，以及作为基因，包括使用能编码转化生长因子超家族成员或生物活性衍生物或其片段，和一可选择标记或生物活性衍生物或其片段的基因。

本发明的另一个实施例提供了另一种方法，来将至少一个编码产物的基因引入至少一种结缔组织细胞，用于治疗哺乳动物宿主。该另一种方法包括使用能利用病毒将DNA载体分子传递给靶细胞或组织的生物学方法。优选的，该病毒是一种拟病毒，其基因组已经改变，使该拟病毒仅能传递并在靶细胞内稳定维持，但没有在靶细胞或组织中复制的能力。用重组DNA技术进一步操纵改变的病毒基因组，使病毒基因组起到DNA载体分子的作用，它含有要在靶细胞或组织中表达的感兴趣的异源基因。

本发明的优选例是一种将TGF-β传递给靶关节腔的方法，该方法通过将TGF-β基因用逆转录病毒载体和本说明书中公开的活体外技术传递给哺乳动物宿主的结缔组织。换言之，将编码功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的感兴趣的DNA序列亚克隆入所选的逆转录病毒载体中，然后使重组的病毒载体长到足够的滴度，用于体外感染培养的结缔组织细胞，并优选通过关节内注射将转导的结缔组织细胞移植到感兴趣的关节中，优选自身移植的细胞。

本发明的另一种优选方法涉及将TGF-β超家族基因通过使用腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体直接体内传递给哺乳动物结缔组织。换言之，将感兴趣的编码功能性TGF-β蛋白质或蛋白片段的DNA序列亚克隆入各病毒载体。然后使含TGF-β的病毒载体生长到足够的滴度，优选通过关节内注射直接进入关节腔。

直接在关节内注射含有感兴趣基因的DNA分子导致受者结缔组织细胞转染，从而绕过了回收、体外培养、转染、选择和移植含该DNA载体的成纤维细胞，以促进感兴趣的异源基因稳定表达的要求。

将DNA分子递呈给靶关节结缔组织的方法包括但不限于：将DNA分子包裹在阳离子脂质体中，将感兴趣的DNA序列亚克隆入逆转录病毒或质粒载体，或将DNA分子本身直接注射入关节。不论DNA分子递呈给膝关节的形式，DNA分子优选以DNA载体分子(重组病毒DNA载体分子或重组DNA质粒载体分子)的形式递呈。将在真核细胞中有活性的启动子片段插入到异源基因编码区的直接上游，来确保感兴趣的异源基因的表达。本领域普通技术人员可利用载体构建的已知方法和技术来确保在DNA分子进入结缔组织后的合适的表达水平。

在优选例中，将从膝关节回收的成纤维细胞在体外培养，然后用作基因治疗的传递系统。显然申请人不限于使用已公开的特定结缔组织。可能使用其他组织来源，用于体外培养技术。使用本发明基因的方法可用于关节炎的预防或治疗。应明白申请人不限于仅治疗膝关节的预防和治疗用途。可能利用本发明预防性或治疗性治疗任何易感关节中的关节炎。

在本发明的另一个实施例中，提供了以治疗有效量胃肠外给药的一种化合物，它含有编码TGF-超家族蛋白的基因和合适的药物载体。

本发明的另一个实施例提供了胃肠外施给病人预防有效量的化合物，它含有编码TGF-超家族蛋白的基因和合适的药物载体。

本发明的另一个实施例包括本文前述的方法，包括体外将基因引入细胞。该方法还包括然后将感染的细胞移植入哺乳动物宿主。该方法包括在有效转染结缔组织细胞后，但在将感染细胞移植入哺乳动物宿主前，储藏转染的结缔组织细胞。本领域技术人员应理解感染的结缔组织细胞可在液氮下冻存于10％DMSO中。本方法包括使用基本上能防止高度易感关节炎的哺乳动物宿主中发生关节炎的方法。

本发明的另一个实施例包括一种方法，将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物宿主的至少一种结缔组织细胞中，用于治疗如前所述哺乳动物宿主，包括通过将含有编码该产物基因的病毒载体直接引入哺乳动物宿主，实现体内细胞的感染。优选该方法包括通过关节内注射实现直接引入哺乳动物宿主。该方法包括使用基本上能防止在高度易感关节炎的哺乳动物宿主发生关节炎的方法。该方法还包括将该方法用于治疗患关节炎的哺乳动物宿主。另外该方法还包括如本文前述的使用该方法修复和再生结缔组织。

本领域技术人员应理解，使用脂质体的病毒载体不限于如逆转录病毒所需的细胞分裂的限制，来实现结缔组织细胞的感染和整合。作为基因，使用如本文前述的非病毒物质的方法，包括使用编码属于TGF-β超家族成员的基因和可选择标记基因(如抗生素抗性基因)。

本发明的另一个实施例是将编码TGF-β超家族的成员的DNA序列通过本说明书公开的任一方法传递给哺乳动物宿主的结缔组织，从而实现胶原的体内表达，使结缔组织(如软骨)再生。

在作为例子公开的，而不是对本发明限制的具体方法中，将含有TGF-β编码序列的DNA质粒载体连接到金属硫蛋白启动子的下游。

结缔组织是治疗上难于靶向的器官。本领域已知的静脉内和口腔途径的药物传递很难到达这些结缔组织，并有使哺乳动物宿主全身性接触治疗药物的缺点。更具体的说，已知在关节内注射蛋白质能直接到达关节。然而，以包裹蛋白质形式注射的药物大部分在关节内半衰期短。本发明通过将编码可用于治疗哺乳动物宿主的蛋白质的基因引入哺乳动物宿主的结缔组织解决了这些问题。更具体说，本发明提供了一种方法，将编码具有抗-关节炎性质的蛋白质的哺乳动物宿主基因引入结缔组织。

在本发明中，应用基因治疗解决了与TGF-β给药相关的作用持续时间短和成本高的问题。转染细胞可在组织培养物中存活6周以上而没有形态变化。为了确定作用的耐久性和持续时间，将细胞注射到家兔跟腱中。如果对于体内细胞营养供应充足，该细胞可存活足够长的时间，并产生TGF-β，来刺激周围的细胞。该细胞在腱内和关节内两种环境中都具有功能。

转染细胞的浓度是局部作用的重要因素。在先前的实验(Joyce等，见上，1990)中，TGF-β的剂量确定了形成的组织类型。特别是，软骨形成与膜内骨形成的比例随着剂量的降低而下降。TGF-β在刺激原代成骨细胞和MC3T3细胞中还有二相性(Centrella等，Endicrinology，119：2306-2312，1986)。即，根据浓度，它可以是刺激性的也可以是抑制性的(Chenu等，Proc.Natl.Acad.Sci，85：5683-5687，1988)。在本文提供的实施例中，NIH 3T3-TGF-β1细胞以10⁴、10⁵和10⁶细胞/毫升的不同浓度刺激胶原合成。腱在10⁶细胞/毫升的浓度下增大最多。

在实施例中，用0.3毫升10⁶细胞/毫升浓度注射关节。收集注射后2-6周的标本。关节的环境与跟腱的不同。细胞可在关节内自由移动。它们可移动到对该细胞具有特定亲和力的区域。滑膜、半月板和软骨缺损区域是细胞粘着的可能部位。注射6周后，在部分或完全损伤的软骨缺损区域观察到再生组织，但在滑膜和半月板处未观察到。对于损伤区域的特异亲和力是临床应用的另一个优点。如果变性关节炎可仅用关节内注射细胞而可治愈，那么可方便的治疗病人，不用大手术。

注射细胞分泌的TGF-β可能以两种方式刺激透明软骨再生。一种是留在受伤区域的软骨细胞在其细胞表面产生TGF-β受体(Brand等，J Biol Chem，270：8274-8284，1995；Cheifetz等，Cell，48：409-415，1987；Dumont等，M CellEndo，111：57-66，1995；Lopez-Casillas等，Cell，67：785-795，1991；Miettinen等，J Cell Biology，127：6，2021-2036，1994；和Wrana等，Nature，370：341-347，1994)。这些受体可能受到粘着在损伤区域的注射细胞分泌的TGF-β刺激。因为TGF-β在体内以潜在形式分泌(Wakwfield等，J Biol Chem，263，7646-7654，1988)，潜在的TGF-β需要激活过程。另一种方式是潜在的TGF-β或转染细胞分泌的TGF-β可能与TGF-β结合蛋白(LTBT)在部分损伤的软骨层的胞外基质上结合(Dallas等，J Cell Biol，131：539-549，1995)。

不论作用机制如何，透明软骨合成的发现表明长时期的高TGF-β能刺激透明软骨再生。局部高浓度的该载体可能不是局部刺激的关键因素，但是理论上软骨细胞可能是最合适的将TGF-β传递给软骨受损区域的载体(Brittberg等，New EnglJ Med 331：889-895，1994)。胶原双层基质是局部分布转染细胞的另一种可能的载体(Frenkel等，J Bone J Surg(Br)79-B：831-836，1997)。

用组织学方法确定了新形成的组织性质。在H&E染色中，新形成的组织与周围的透明软骨相同(图4)。为了评估新形成组织的性质，用Safranin-O染色组织(Rosenburg，J Bone Joint Surg，53A：69-82，1971)。与白色的纤维状胶原相反，新形成的组织染成红色，提示它是透明软骨(图5)。

完全损伤区域中的细胞产生了纤维状胶原。由于存在对TGF-β刺激的骨样基质屏障，周围成骨细胞可能未被刺激。NIH 3T3-TGF-β1细胞不刺激周围细胞，而是通过自分泌刺激产生纤维状胶原。自分泌和旁分泌激活刺激细胞的事实增加了用TGF-β1表达构建物稳定转染的软骨细胞治疗变性关节炎的可能性。

用TGF-β1表达构建物稳定转染的细胞系能在腱和膝关节内存活。该细胞系在腱和完全损伤软骨区域内产生纤维状胶原。然而，该细胞系在部分损伤的关节软骨中产生透明软骨。该作用的自分泌和旁分泌模式的刺激机制表明，用TGF-β超家族基因的成员进行基因治疗是一种新的治疗透明软骨损伤的方法。

本发明通过转染TGF-β1表达构建物制备了稳定的成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β1，和人包皮成纤维细胞TGF-β1)细胞系。这些产生TGF-β的细胞在体内长时间的维持了高浓度的活性TGF-β。

要回答的关于基因治疗，特别是细胞介导的基因治疗的可能性的第一个问题是细胞在体内的存活率。尽管TGF-β在体外能抑制免疫细胞，但细胞在具有高效免疫监视系统的其他物种组织中可能不能存活。第二，应评估基因在体内表达的最佳浓度。我们将细胞以三种不同浓度注射到家兔的跟腱中，来回答这个问题。从腱内注射的最佳浓度确定了要用的关节内注射的浓度。第三个问题是细胞如何在关节内刺激软骨再生。

注射的细胞有两种作用模式。一种是通过分泌TGF-β激活周围细胞(旁分泌激活)(Snyder，Sci Am，253(4)：132-140，1985)，另一种是自身激活(自分泌激活)。细胞浓度可影响这些途径，但周围环境可能是决定作用模式的最重要因素。关节内关节液和韧带内部是两种不同的环境，它们的血液供应、营养供应和围绕的细胞都不同。将转染的细胞注射到两种不同环境中，以寻找出细胞的作用模式。该研究的整个目的是评估对矫形外科疾病的TGF-β-介导的基因治疗，并明确体内作用的模式。

提供下列实施例说明本发明，而不是限制。

实施例

实施例I-材料和方法

质粒构建

为了产生金属硫蛋白表达构建物(pM)，用基因组DNA通过聚合酶链式扩增在用于扩增的寡核苷酸中构建了XbaI和Bam HI限制性位点，产生了金属硫蛋白I启动子(-660/+63)。将扩增片段亚克隆入pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)的Xba I-Bam HI位点。通过将含有TGF-β1编码序列和3’末端含生长激素聚腺苷酸化位点的1.2kb Bgl II片段亚克隆入pM的Bam HI-Sal I位点，产生了质粒pmTβ1。

细胞培养和转染-将TGF-βcDNA转染入成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β1)或人包皮成纤维细胞/TGF-β1，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(GIBCO-BRL，Rockville，MD)中培养。将TGF-β1cDNA序列加入具有金属硫蛋白基因启动子的pmTβ1载体中。还将新霉素抗性基因序列插入该载体。

用磷酸钙沉淀法将该载体插入所用的细胞。为了选择具有转染的基因序列的细胞，将新霉素(300微克/毫升)加到培养基中。然后，选择存活的菌落并通过Northern分析和TGF-β1 ELISA(R&D系统)试验确认TGF-β1 mRNA的表达。将具有TGF-β1表达的细胞储藏在液氮中，注射前进行培养。

Northern印迹分析-用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿从细胞中分离出总RNA。在含有0.66M甲醛的1.0％琼脂糖凝胶上电泳10微克RNA，转移到DURALON-UV膜上，并与UV STRATALINKER(STRATAGENE)交联。预杂交印迹，并在1％牛血清清蛋白、7％(w/v)SDS、0.5M磷酸钠和1mM EDTA的溶液中65℃杂交。用0.1％SDS、1XSSC 50℃洗涤杂交印迹20分钟，然后曝光底片。使RNA印迹与用于人TGF-β1的³²P-标记的cDNA探针杂交。用β-肌动蛋白探针作样品负荷的对照。

将细胞注射入家兔-选择重2.0-2.5公斤的新西兰白兔作为动物模型。用开他敏和roumpon麻醉后，用消毒巾覆盖白兔。暴露跟腱，将0.2-0.3毫升浓度为10⁴、10⁵和10⁶细胞/毫升的细胞注射到腱的正中部位。将硫酸锌加到家兔饮用水中，用于表达转染的DNA。用跟腱实验确定最佳浓度后，进行关节内注射。暴露膝关节，用手术刀制造部分和完全软骨缺损。在透明软骨层上制造部分缺损，注意不暴露软骨下骨。除去所有透明软骨后暴露软骨下骨制造完全缺损。缝合手术伤口后，关节内注射10⁶细胞/毫升浓度的细胞，在饮用水中加入硫酸锌。

组织学检测-收集跟腱和膝关节后，用福尔马林固定标本，用硝酸脱钙。将它们包埋在石蜡块中，切成0.8微米厚的切片。用苏木精-伊红和Safranin-O染色显微镜观察再生的组织。

实施例II-结果

稳定的细胞系-用磷酸钙共沉淀法(图1)进行了转染。大约80％存活的细胞集落表达转基因mRNA。将这些选出的产生TGF-β1的细胞在硫酸锌溶液中培育。当细胞在100μM硫酸锌溶液中培育时，它们产生mRNA。TGF-β分泌率是约32纳克/10⁶细胞/24小时。

家兔关节软骨缺损的再生-观察了家兔跟腱以核查NIH 3T3-TGF-β1细胞的存活率。在10⁶细胞/毫升浓度，跟腱比其他10⁴和10⁵两种浓度都要厚。造成部分和完全软骨缺损后，将0.3毫升10⁶细胞/毫升的NIH 3T3-TGF-β1细胞注射到膝关节中。注射后2-6周检查关节。在部分损伤的软骨中，我们发现新形成的透明软骨；注射后两周，透明软骨出现，注射后6周，软骨缺损被透明软骨覆盖(图2)。再生软骨的厚度随着时间过去而增厚(图3)。注射细胞分泌的TGF-β1，可通过用TGF-β1抗体免疫组织化学染色观察到(图3)。用未经TGF-β1转染的正常成纤维细胞注射的对侧关节未观察到透明软骨覆盖。在部分损伤的区域，在Safrain-O染色中再生透明软骨呈红色(图4)。(新形成的软骨深度几乎与缺损的深度相同)。该发现提示注射的细胞通过旁分泌作用模式激活周围正常软骨细胞。

完全损伤的软骨中再生组织不是透明软骨而是纤维状胶原。它们的颜色在Safrain-O染色中呈白色，而不是透明软骨获得的红色(图5)。软骨被纤维状组织覆盖，意味着仅通过自分泌模式激活这些细胞。可被TGF-β激活的周围骨细胞看来由于存在厚的钙化骨基质而阻挡了TGF-β对其的刺激。注射的细胞可能由于该屏障不能刺激骨细胞。

将TGF-β1转染的细胞注射到家兔跟腱中。这样操作的腱显示比对照腱总体更厚的形态学(图7)。对该跟腱的切片作H&E染色，在显微镜下检查，注入的NIH3T3-TGF-β1细胞存活并在家兔的跟腱中产生纤维状胶原(图8)。显微镜检查用TGF-β1抗体作免疫组织化学染色的再生的腱组织，显示TGF-β1在腱中的表达(图9)。

为了说明虽然已描述了本发明的具体实施例，对于本领域技术人员来说本发明的细节显然可作许多变化，然而这些变化不违背本发明权利要求所确定的范围。

本文引用的所有参考文献在此引入以供参考。

参考文献

Andrew JG，Hoyland J，Andrew SM，Freemont AJ和Marsh D：在正常骨折愈合中通过原位杂交显示TGF-β1 mRNA。Calcif Tissue Int，52：74-78，1993。

Bourque WT，Gross M和Hall BK：在骨折修复过程中四种生长因子的表达。Int J Dev Biol，37：573-579，1993。

Brand T和Schneider MD：无活性II型和I型受体：TGF-β是TGF-β依赖转录的优势抑制剂。J Biol Chem，270：8274-8284，1995。

Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，Ohlsson C，Isaksson O和PetersonL：用自身软骨细胞移植治疗膝关节中的深度软骨缺损。New Engl J Med 331：889-895，1994。

Carringtong JL，Roberts AB，Flankers KC，Roche NS和Reddi AH：在软骨内骨发育中TGF-β的积聚、定位和区室化J Cell Biology，107：1969-1975，1988。

Centrella M，Massague J和Canalis E：人血小板衍生的转化生长因子-β刺激胎鼠颅骨中的骨生长。Endocrinology，119：2306-2312，1986。

Cheifetz S，Weatherbee JA，Tsang MLS，Anderson JK，Lucas R，MassagueJ：转化生长因子β系统，交叉反应配体和受体的复杂模式。Cell，48：409-415，1987。

Chenu C，Pfeilschifter J，Mundy GR和Roodman GD：TGF-β抑制长期人骨髓培养物中的成骨样细胞形成。Proc.Natl.Acad.Sci，85：5683-5687，1988。

Critchlow MA，Bland YS和Ashhurst DE：外源转化生长因子-β2对家兔骨折愈合上的效果。Bone，521-527，1995。

Dallas SL，Miyazono K，Skerry TM，Mundy GR和Bonewald LF：潜在的转化生长因子β结合蛋白(LTBP)在潜在的TGF-β储藏于胞外基质中和作为结构基质蛋白质的双重作用。J Cell Biol，131：539-549，1995。

Dumont N，O’Connor M和Philip A：人子宫内膜细胞上的转化生长因子受体：I型和II型受体以及糖基化-磷酯酰肌醇锚定的TGF-β结合蛋白质的鉴定。MCell Endo，111：57-66，1995。

Frenkel SR，Toolan B，Menche D，Pitman MI和Pachence JM：用于软骨修复的胶原双层基质软骨细胞移植。J Bone J Surg[Br]79-B：831-836，1997。

Heine UI，Munoz EF，Flanders KC，Ellingsworth LR，Peter Lam H-Y，ThompsonNL，Roberts AB和Sporn MB：转化生长因子-β在小鼠胚胎发育中的作用J CellBiology，105：2861-2876，1987。

Jenks S：基因治疗：掌握基础，限定细节[新闻]J Natl Cancer Inst，89(16)：1182-1184，1997。

Joyce Me，Roberts AB，Sporn MB和Bolander ME：转化生长因子-β和大鼠股骨中软骨生成和骨生成的引发。J Cell Biology，110：2195-2207，1990。

Lind M，Schumacker B，Soballe K，Keller J，Melsen F和Bunger：转化生长因子β增强家兔胫骨的骨折愈合。A Orthop Scand，64(5)：553-556，1993。

Lopez-Casillas F，Chifetz S，Doody J，Andres JL，Lane WSMAssague J：TGF-β受体系统膜蛋白多糖成分的结构和表达。Cell，67：785-795，1991。

Madri JA，Pratt BM和Tucker AM：转化生长因子β对子宫内膜细胞的表型调节依赖于胞外基质的组成和结构。J Cell Biology，106：1375-1384，1988。

Mankin HJ：关节软骨对机械损伤的反应。J Bone Joint Surg，52A：460-466，1982。

Massague，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1998。

Matsumoto K，Matsunaga S，Imamura T，Ishidou Y，Yosida H Sakou T：骨折愈合过程中转化生长因子β的表达和分布，In vivo，8：215-220，1994。

Miettinen PJ，Ebner R，Lopez AR和Derynck R：TGF-β诱导哺乳动物表皮细胞转分化成间充质细胞：涉及I型受体。J Cell Biology，127-6：2021-2036，1994。

O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A：1795-1812，1998。

Rueger DC，Drier EA，Corbett C和Ridge RJ：OP-1cDNA编码TGF-β家族的成骨蛋白。EMBO J，9：2085-2093，1990。

Rosenburg L：关节软骨研究中Safranin-O组织学用途的化学基础。J BoneJoint Surg，53A：69-82，1971。

Sampath TK，Rueger DC：骨生成蛋白-1(OP-1)的结构、功能和矫形手术应用。Complications in Ortho，101-107，1994。

Snyder SH：细胞之间通讯的分子基础。Sci Am，253(4)：132-140，1985。

Sporn MB和Roberts AB：肽生长因子是多功能的。Nature(London)，332：217-219，1988。

Wakefield LM，Smith DM，Flanders KC和Sporn MB：来自人血小板的潜在转化生长因子-β。J Biol chem，263，7646-7654，1988。

Wolff JA和Lederberg J：基因转移和治疗的历史。John A.Wolff编。GeneTherapeutics，3-25-1994.Birkhauser，Boston。

Wrana JL，Attisano L，Wieser R，Ventura F和Massague J：TGF-β受体激活的机制。Nature，370：341-347，1994。

Claims (12)

1.一种成纤维细胞系的用途，所述细胞系在体外被与启动子可操纵性连接的，编码转化生长因子β1的DNA序列转染，其特征在于，所述细胞系用于制备治疗关节炎或再生透明软骨的药物，所述细胞通过关节内注射实现直接引入哺乳动物宿主。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA序列在病毒载体中。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒载体是腺关联病毒载体。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒载体是腺病毒载体。

6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒载体是单纯疱疹病毒载体。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA序列是质粒载体。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在制备前先储藏所述成纤维细胞系。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞系在液氮下储藏在10％DMSO中。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在所述成纤维细胞中，成纤维细胞是NIH 3T3细胞或人包皮成纤维细胞。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转染是通过脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电穿孔和DEAE-葡聚糖介导完成的。

12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述启动子是金属硫蛋白I启动子。

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