TWI651087B - 類泛素化抑制劑於預防或治療骨質疏鬆症的用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於類泛素化抑制劑的用途，其係用以製備一藥物，以預防一個體罹患骨質疏鬆症，或是治療一罹患或疑似罹患骨質疏鬆症的個體。該類泛素化抑制劑可抑制蝕骨細胞的分化及功效，進而增加骨骼的生物力學特性。依據本揭示內容某些實施方式，該類泛素化抑制劑是MLN4924。

Description

類泛素化抑制劑於預防或治療骨質疏鬆症的用途
本發明是關於一種類泛素化(neddylation)抑制劑的新穎用途。更具體來說，本發明是關於利用類泛素化抑制劑來預防一個體罹患骨質疏鬆症或治療一罹患骨質疏鬆症的個體。
骨質疏鬆症(osteoporosis)是一種好發於老年人的骨骼代謝異常疾病，女性的發生率約為男性的3-5倍。臨床上，罹患骨質疏鬆症的病患會因骨質流失導致骨質減少，輕微的壓力即有可能使其發生骨折(常見包含髖骨骨折、脊椎骨折、腕骨骨折及肋骨骨折等)及骨疼痛等症狀。已知停經中年婦女會因體內雌性素(estrogen)的減少而促使骨質快速流失。此外，包含酒精、咖啡因、吸煙、維生素D攝取不足、營養不良、重金屬(例如鎘或鉛)接觸、甲狀腺功能亢進、腎臟疾病及特定治療(例如某些抗癌藥物、質子泵抑制劑及類固醇)等因素皆有可能影響個體的骨質含量。
除了傳統射線攝影術(radiography)外，目前亦可利用雙能X光吸收檢測(Dual-energy X-ray absorptiometry, DXA)及生物標誌分析來診斷骨質疏鬆症。在雙能X光吸收檢測中，若個體之骨質密度(T分數, T-score)大於等於-1.0，代表其具有正常骨質含量；當個體之骨質密度介於-1.0及-2.5之間時，代表其骨質不足(osteopenia)；而當個體之骨密度低於或等於-2.5時，則代表其罹患骨質疏鬆症。生物標誌分析則是藉由檢測諸如細胞自溶酶K (cathepsin K，可分解骨質中第I型膠原蛋白的酵素)、新表位(neoepitope，骨質疏鬆所導致的骨碎片)及C-端肽(C-telopeptide，第I型膠原蛋白分解產物)等標的分子於個體體內的含量來得知個體之骨質分解的狀況。
已知戒煙及減少酒精的攝取皆有助於減少骨質的流失。除此之外，亦有報導指出增加維生素D或鈣質的攝取量可降低個體罹患骨質不足及/或骨質疏鬆症的機率。在藥物方面，目前包含雙膦酸酯類 (bisphosphonate，一種可抑制骨質流失的藥物)、雌激素(estrogen，一種女性荷爾蒙，可降低骨質流失)、特立帕肽(Teriparatide，重組副甲狀腺素，可刺激骨質合成)、雷洛昔芬(Raloxifene，雌性素受器調節劑，可抑制骨骼的分解代謝)、狄諾塞麥(Denosumab，核因子κ-B 配體之受體活化劑(Receptor activator of nuclear factor κ-B ligand (RANKL))的抑制劑)、降鈣素(Calcitonin，可抑制蝕骨細胞(osteoclast)作用)及雷奈酸鍶(strontium ranelate，可同時抑制骨質疏鬆及促進骨質生成的雙效藥物)等藥物皆可藉由減少骨流失失來達到預防/治療骨質疏鬆症的療效。然而，該些藥物皆有其臨床限制，而無法提供個體安全且有效預防/治療功效。舉例來說，雙膦酸酯類會產生腹痛、噁心、消化不良、骨痛、關節痛、肌肉疼痛及顎骨壞死等副作用；雌激素會造成靜脈栓塞、心肌梗塞、中風、乳癌、子宮內膜增生及子宮內膜癌等問題；特立帕肽除了注射劑量高且價格昂貴之外，亦會引發痙攣、頭暈及惡性骨瘤等病狀；雷洛昔芬會增加個體血栓及中風的機率；狄諾塞麥除了會造成低血鈣及顎骨壞死之外，亦會影響個體免疫調節，使其易於遭受微生物感染；降鈣素會導致過敏及癌症的產生；至於雷奈酸鍶，短期服用會造成個體腸胃道不適及頭痛等症狀，長期服用則會引發個體意識障礙、甚至記憶喪失等嚴重副作用。
有鑑於此，相關領域亟需一種新穎的方法，可有效且安全地預防/治療罹患骨質疏鬆症，藉以提升有罹患骨質疏鬆症風險之個體及骨質疏鬆症病患的生活品質及壽命。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容是關於一種類泛素化抑制劑的用途，其係用於製備一藥物以預防一個體罹患骨質疏鬆症，或是治療一罹患骨質疏鬆症的個體。
因此，本揭示內容的第一態樣是關於一種用以預防一個體罹患骨質疏鬆症或治療一罹患骨質疏鬆症之個體的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之類泛素化抑制劑。
依據本揭示內容某些實施方式，該類泛素化抑制劑是MLN4924、TAS4464、6,6’’-聯芹菜甙元(6,6’’-biapigenin)、環金屬化之銠(III)複合物(cyclometallated rhodium (III) complex, [Rh(ppy)2 (dppz)]+ )或卡瓦胡椒素A (flavokawain A, FKA)。依據本揭示內容一特定實施方式，該類泛素化抑制劑是MLN4924。
依據本揭示內容某些實施方式，該個體為一小鼠，其中類泛素化抑制劑的投予有效量約為每日每公斤個體體重1-100毫克；較佳的，投予有效量約為每日每公斤個體體重5-20毫克。依據一操作實施方式，投予至小鼠之類泛素化抑制劑的有效量為每公斤體重10毫克。
本所屬領域具有通常知識者可依據動物模式的使用劑量來計算本發明類泛素化抑制劑的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。據此，人類的有效量約為每公斤體重0.08-8.1毫克；較佳約為0.4-1.6毫克；最佳約為0.81毫克。
依據本揭示內容實施方式，該類泛素化抑制劑的投予次數為每日一次，且連續投予至少一週；較佳為每日投予一次，且連續投予至少二週，以達抑制骨質疏鬆之效果。
本發明類泛素化抑制劑可經由口服、腸內、鼻腔、局部、黏膜及非口服方式投予至個體體內，其中非口服方式可以是皮下、真皮內、肌肉內、動脈內、靜脈內、脊椎內或腹腔內注射。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「應用」(application)或「投予」(administration)在此為可互換的詞彙，皆是用以闡述將本發明之類泛素化抑制劑(例如MLN4924)提供至一個體(例如有罹患骨質疏鬆症之風險的個體，或是罹患/疑似罹患骨質疏鬆症之個體)，以降低該個體罹患骨質疏鬆症之風險，或是治療、改善個體骨質疏鬆症的症狀。依據本揭示內容不同的實施方式，可藉由不同路徑(例如靜脈內注射或腹腔內注射)將本發明之類泛素化抑制劑傳送至個體體內，據以達到預防/治療骨質疏鬆症的目的。
在本揭示內容中，「治療」(treat, treating or treatment)一詞是指部份或完全預防、改善、減輕及/或處理罹患骨質疏鬆症之個體的相關病徵，其中是藉由抑制蝕骨細胞的生成及/或作用來使罹患骨質疏鬆症之個體的相關病徵獲得改善。例示性之與骨質疏鬆症相關的病徵包含，但不限於，骨折(例如髖骨骨折、脊椎骨折、腕骨骨折及肋骨骨折)、骨疼痛、駝背、腸胃不適、便秘、呼吸困難、血鈣增加及腎結石。「治療」(treat, treating or treatment)一詞於此說明書中亦指應用或施予本揭示內容之類泛素化抑制劑(例如MLN4924)至一患有骨質疏鬆症的個體身上，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及／或降低骨質疏鬆症的發生。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥物的用量足以產生欲求的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之類泛素化抑制劑)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。依據本揭示內容較佳實施方式，所述個體為一哺乳動物，包括但不限於，人類、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、羊、牛及兔子等。在一特定實施例中，該個體為人類。
本揭示內容部分是基於發明人首度發現類泛素化抑制劑具有抑制蝕骨細胞生成及/或作用的新穎用途，據以提供一種用以預防或治療骨質疏鬆症的方法。
依據本揭示內容實施方式，本發明方法包含對一有需要的個體投予一有效量之類泛素化抑制劑。該類泛素化抑制劑可以是任何可抑制類泛素化反應的拮抗劑(例如類泛素化反應的拮抗性胜肽或化合物)。依據本揭示內容某些實施方式，該類泛素化抑制劑係可專一地抑制NEDD8活化酶(NEDD8-activating enzyme)。適合用於本發明方法的該NEDD8活化酶抑制劑可以是MLN4924、TAS4464、6,6’’-聯芹菜甙元、環金屬化之銠(III)複合物或卡瓦胡椒素A。
依據本揭示內容較佳實施方式，類泛素化抑制劑是MLN4924或是氨基磺酸(1S,2S,4R)-4-(4-((1S)-2,3-二氫-1H-茚-1-基氨)-7H-吡咯(2,3-d)嘧啶-7-基)-2-羥環戊基)甲酯((1S,2S,4R)-4-(4-((1S)-2,3-Dihydro-1H- inden-1-ylamino)-7H-pyrrolo(2,3-d)pyrimidin-7-yl)-2-hydroxycyclopentyl)methyl sulphamate)及其衍生之功能相似物。
利用本發明方法預防或治療的個體可以是一有罹患骨質不足或骨質疏鬆症之風險的個體、一罹患或疑似罹患骨質疏鬆症的個體，或是一罹患或疑似罹患骨質不足的個體。
依據本揭示內容某些實施方式，接受本發明方法預防或治療的個體是一小鼠。在該些實施方式中，類泛素化抑制劑的投予有效量約為每日每公斤個體體重1-100毫克；較佳約為每日每公斤個體體重5-20毫克。依據本揭示內容一操作實施例，投予至個體之類泛素化抑制劑的有效量約為每日每公斤個體體重10毫克。
本所屬領域具有通常知識者可依據動物模式的使用劑量來計算本發明類泛素化抑制劑的人體等效劑量。據此，人類的有效量約為每公斤體重0.08-8.1毫克；較佳約為0.4-1.6毫克；最佳約為0.81毫克。
臨床操作人員可依據使用需求的不同來調整投予劑量、投予頻率及投予次數；舉例來說，依據個體年齡、骨質疏鬆的程度、生理狀況、其他治療(若有)及性別每週投予1-7次類泛素化抑制劑(例如每週投予1、2、3、4、5、6或7次類泛素化抑制劑)；且連續投予1、2、3、4或更多週。依據本揭示內容一實施例，是對個體每日投予類泛素化抑制劑，且連續投予至少2週，以達到預防/治療效果；舉例來說，連續投予2、3、4或更多週。
依據本揭示內容一實施方式，本發明方法可藉由抑制類泛素化路徑來抑制蝕骨細胞的生成及/或作用，進而達到預防或治療骨質疏鬆症的功效。依據本揭示內容另一實施方式，本發明方法不會顯著影響成骨細胞(osteoblast)的存活及骨質生成作用。
當可想見，本發明類泛素化抑制劑可單獨投予至個體體內來預防或治療骨質疏鬆症。或者是，本發明類泛素化抑制劑可與另一對骨質疏鬆症具有預防/治療功效的藥劑共同投予至個體體內，據以增加預防/治療功效。依據使用需求不同，本發明類泛素化抑制劑可於另一種藥劑投予前、期間或之後投予至個體體內。
可任選地，本發明類泛素化抑制劑可經由腸內注射、口服、非口服或黏膜穿透方式投予至個體體內，其中非口服方式可以是皮下注射、靜脈注射、動脈注射、脊椎注射或腹腔注射。
本揭示內容所述之個體為一哺乳動物，舉例來說，人類、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、羊、牛及兔子等。在一特定實施例中，該個體為人類。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
材料及方法
試劑
由Active Biochem (Activebiochem, Maplewood, NJ)購買MLN4924。分別由Cell Guidance Systems LLC (Carlsbad, CA)及R&D (R&D, Minneapolis, MN)購買重組小鼠RANKL (sRANKL, GFM4)及重組小鼠M-CSF (416-ML)。由Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Santa Cruz, CA)購買TRAF6 (H274)、NFATc1 (7A6)、抗體。由Cell Signaling technology (CST, Beverly, MA)購買pERK (4370)、ERK (4695)、pJNK (4668)、JNK (9252)、p-p38-MAPK (4631)、p38-MAPK (9212)抗體。由GeneTex (GeneTex, Irvine, CA)購買GAPDH抗體。
細胞培養及製備初級蝕骨細胞
將RAW264.7 (小鼠單核球/巨噬細胞株)培養於包含10%胎牛血清(Gibco)及1倍GlutaMax (Gibco)的高葡萄糖DMEM細胞培養液(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)中，並置於包含 5% CO2 的環境中。分離源自小鼠骨髓的巨噬細胞(marrow-derived macrophage, BMM)以製備蝕骨前趨細胞(pre-osteoclast cell, pre-OC)。由6-12週大的C57BL/6J小鼠取其股骨及脛骨後，分離骨髓，據以製備蝕骨細胞。簡單來說，將BMM細胞培養於每毫升10奈克的M-CSF (R&D Systems) 3天，以製備單核球/巨噬細胞系的蝕骨前趨細胞。
形成蝕骨細胞
為於活體外形成蝕骨細胞，分別將蝕骨前趨細胞及RAW 264.7培養於每毫升100奈克之RANKL或不同濃度之MLN4924中7天，每兩天換新的RANKL與MLN4924。接著，固定細胞，再依據使用者操作說明，以TRAP染色套組(KAMIYA Biomedical Company, Seattle, WA)染色分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)的表現。之後，利用Nikon TE300顯微鏡系統(Nikon Instruments Inc., Melville, NY)觀察及拍攝照片。
細胞自溶酶 K 活性試驗及凹陷試驗 (pit assay)
將蝕骨前趨細胞及RAW 264.7種植於Corning Osteo表面試驗96-孔盤(Corning, Kennebunk, Maine)。24小時後，投予RANKL (每毫升100奈克)及不同濃度的MLN4924；每兩天換新的RANKL與MLN4924，培養7天後，收集細胞，並以Biovision細胞自溶酶K活性螢光分析試驗套組(Biovision, Milpitas, CA)來分析細胞自溶酶K的活性。之後，以1%甲苯胺藍(toluidine blue)染孔盤底部骨盤，染色24小時，再以去離子水洗滌2次。利用Nikon TE300顯微鏡系統，以100倍放大倍率(Nikon, Melville, NY)來拍攝照片。
免疫沉澱及西方墨點分析
將RAW264.7細胞以正常培養液種植在6-孔盤，隔天將培養液換成無血清的細胞培養液中，培養6小時後投予特定處理。在特定時間點時，以冰的磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline. PBS)洗滌細胞後，利用包含完全蛋白酶抑制混合劑(Roche)的RIPA緩衝液溶解細胞。以30微升之蛋白G 瓊脂糖磁珠(EMD Millipore, Bedford, MA)處理細胞溶解產物後，去除蛋白G 瓊脂糖磁珠，留下剩下的溶解產物。再將剩下的溶解產物與TRAF-6抗體於4°C作用18小時後，加入蛋白G瓊脂糖磁珠，置於4°C旋轉2小時。以溶解緩衝液洗滌磁珠3次，以SDS-PAGE分離結合的蛋白，之後以特定抗體進行西方墨點分析。
動物模式
所有的實驗流程皆於嘉義長庚紀念醫院的實驗動物照顧及使用委員會許可下進行，且符合國家科學院的實驗動物照顧及使用規範(IACUC號：2013100102及2015103001)。盡可能減少動物承受的痛苦。建立骨質疏鬆症的小鼠模式。簡單來說，對C57BL/6J母鼠(6-8週大；購買自台灣國家實驗動物中心)進行卵巢切除術。 手術48小時後，將sRANKL (每公斤體重1毫克)或生理食鹽水腹腔注射至小鼠體內，每天注射一次，連續注射二天；之後以腹腔注射方式每天投予MLN4924 (每公斤10毫克)，共投予二週。以過量二氧化碳犠牲小鼠後，分離其脛骨及股骨。利用免疫組織化學試驗(immunohistochemistry assay, IHC)分析脛骨；利用 MTS對股骨進行彎曲試驗，及利用Skyscan 1272 (Bruker, Kontich, Belgium)進行斷層掃描分析。以特定ELISA套組(USCN life science incorporation, Wuhan, Hubei, China)來檢測血清中，第I型膠原的交聯C-端肽(CTX-1) (CEA665Mu)含量及骨鈣素(Osteocalcin, SEA471Mu)含量。
生物力學試驗
以MTS Synergie 200 (Testresources, Shakopee, MN)進行三點彎曲試驗來檢測股骨的力學特性。負載速度為每分鐘1毫米，將預負載設定為1N，將負載細胞設定為500N，將時間設定為30秒，且將二點之間的距離設定為10毫米。由包含模數、斷裂負載、降伏壓力及斷裂應變等結構特性來繪製力-位移數據。
以免疫組織化學試驗來分析未脫鈣骨
將分離的脛骨進行未脫鈣冷凍切片。依據川本法(Kawamoto's film method)所述步驟進行包埋及切片後，利用蘇木精(hematoxylin)及TRAP染色冷凍切片組織，並以 Olympus BX51顯微鏡系統(Olympus)拍攝照片。
統計分析
將實驗結果以平均值±平均標準偏差(Mean ± Standard deviation)來表示。以Student’s t test來評估二組之間的差異性；當P值小於0.05時，即視為二組間具有顯著差異。
實施例 1 MLN4924 會抑制蝕骨細胞分化
實施例1將探討MLN4924對由BMM及RAW264.7細胞所分化之蝕骨細胞的影響。結果分別闡述於第1-2圖。
1.1 BMM
將由小鼠之股骨及脛骨取出的初代BMM細胞培養於包含sRANKL、M-CSF及特定濃度之MLN4924的細胞培養液中，以檢測MLN4924對蝕骨細胞生成的影響。經TRAP染色後，具有較大且多核的細胞為成熟的蝕骨細胞。第1A圖之TRAP染色結果顯示，相較於未投予MLN4924處理的細胞，MLN4924可明顯抑制蝕骨細胞的形成，且該抑制作用是與MLN4924的濃度相關。
為進一步確認MLN4924對蝕骨細胞活性的影響，接著以凹陷試驗來分析蝕骨細胞的骨質再吸收活性。同樣將小鼠的初代BMM細胞培養於包含sRANKL、M-CSF及特定濃度之MLN4924的細胞培養液中，7天後利用1%甲苯胺藍染色細胞，以觀察再吸收區域。由第1B圖結果可知，MLN4924會以濃度相關的方式顯著抑制蝕骨細胞的骨質再吸收活性。
已知在骨骼再吸收過程中，蝕骨細胞會分泌細胞自溶酶K來分解膠原蛋白及其他基質蛋白。因此本研究亦探討MLN4924對細胞自溶酶K的影響。分析結果顯示，相較於僅投予sRANKL的對照組，投予MLN4924可顯著降低細胞自溶酶K的活性，且該抑制功效會隨著MLN4924投予濃度的增加而增加(第1C圖)。
接著，利用WST試驗來分析上述觀察到之抑制反應是否是因MLN4924對BMM細胞產生毒殺反應所造成的結果。第1D圖顯示，在可產生抑制反應的濃度下，MLN4924不會對細胞產生毒殺反應。
1.2 RAW264.7
除了小鼠的初代BMM外，本研究亦利用RAW264.7細胞株來確認MLN4924對蝕骨細胞的影響。
將RAW264.7細胞培養於包含sRANKL及特定濃度之MLN4924的細胞培養液中。7天後，利用TRAP染色來觀察蝕骨細胞的分化結果。與第1A圖結果相似，相較於未投予MLN4924處理的細胞，不同濃度之MLN4924皆可明顯抑制蝕骨細胞的形成(第2A圖)。
第2B-2D圖分別揭示MLN4924可抑制由RAW264.7細胞分化之蝕骨細胞的骨質再吸收活性(第2B圖)及細胞自溶酶K活性(第2C圖)，而不會對細胞產生毒殺反應(第2D圖)。
該些結果指出，MLN4924可抑制蝕骨細胞的分化及其相關活性。
實施例 2 MLN4924 的作用機制
如第3A圖所示，在投予sRANKL後，TRAF-6蛋白、磷酸化ERK (p-ERK)、磷酸化p38 (p-p38)及磷酸化JNK (p-JNK)的表現量會隨著時間的增加而增加。相較於對照組(R組)，投予MLN4924 (R+M組)可明顯抑制TRAF-6蛋白的增加，以及ERK、p38與JNK的磷酸化程度(第3A圖)。第3B圖進一步證實，上述抑制效果會隨著MLN4924濃度的增加而增加。
先前研究指出，RANKL會引發轉錄因子NFATc-1的表現，且由缺乏NFATc-1之胚胎所分離的幹細胞無法成功分化為蝕骨細胞。此外，於蝕骨前趨細胞異源表現NFATc-1，可使其在無RANKL存在的情況下，分化為蝕骨細胞。有鑑於NFATc-1於蝕骨細胞分化過程中扮演著重要的角色，本研究亦探討MLN4924是否會改變NFATc-1於細胞中的表現量。如第3C圖所示，sRANKL會引發NFATc-1表現(R組)，而投予MLN4924 (R+M組)則會明顯抑制NFATc-1的表現量。第3D圖則進一步證實該抑制效果會隨著MLN4924濃度的增加而增加。
上述結果指出，MLN4924會以濃度相關的方式抑制RANKL的下游反應來有效抑制蝕骨細胞分化及其活性。
實施例 3 MLN4924 對成骨細胞的影響
除了蝕骨細胞外，本實施例將檢測MLN4924是否亦會影響成骨細胞的生成反應。
將小鼠的成骨前趨細胞株MC3T3-E1培養於包含不同濃度之MLN4924的成骨細胞分化培養液中，分別培養14及21天。如第4A圖之結晶紫染色結果，相較於未投予MLN4924的組別(於4A僅標示「成骨作用」之組別)，加入MLN4924並不會影響成骨細胞的存活反應。第4B圖(培養14天)及第4C圖(培養21天)的茜素紅S定量結果呈現，加入MLN4924並不會影響成骨細胞的分化反應。
由上述結果可知，MLN4924不會影響成骨細胞的存活及分化反應。
實施例 4 MLN4924 於活體內的作用
4.1 骨質流失
本實施例利用骨質疏鬆小鼠動物模式來分析MLN4924對活體骨質的影響。
對小鼠投予特定處理後，利用微電腦斷層掃瞄來分析其股骨的骨質狀態。如第5A圖所示，相較於對照組，在投予卵巢切除術之小鼠(OVX組)及進行卵巢切除術後給予sRANKL之小鼠(OVX/RANKL組)的股骨皆可觀察到嚴重的骨質流失；而投予MLN4924 (OVX/RANKL/MLN組)則可明顯減少骨質流失的情況。
此外，本研究亦分析小鼠脛骨的各種骨質參數，包含相對於總組織體積的骨體積(bone volume/total tissue volune，BV/TV，第5B圖)、小梁骨數目(Tb.N，第5C圖) 及小梁骨間隙(Tb.Sp，第5D圖)。結果與第5A圖相似，投予個體MLN4924可減少其脛骨因卵巢切除合併sRANKL所造成的骨質流失反應。
基於CTX-1及骨鈣素分別可作為骨質再吸收及形成的生物性指標，接著利用ELISA套組來分析血清中的CTX-1及骨鈣素含量。由第5E圖可知，在對小鼠投予卵巢切除術(OVX)及進行卵巢切除術後給予sRANKL (OVX/sRANKL)皆會增加其血清中CTX-1的含量；而投予MLN4924 (OVX/sRANKL/MLN)則可回復血清中CTX-1的含量。至於骨鈣素，不論投予何種處理皆不會改變其血清含量(結果未顯示)。
該些結果證實MLN4924可抑制活體的骨質流失反應。
4.2 生物力學特性
骨質流失會造成骨骼脆弱而易於斷裂。本實施例進一步利用三點彎曲試驗來分析投予不同處理之小鼠股骨的生物力學特性。
如第6A-6D圖所述，相較於對照組，經卵巢切除術及sRANKL處理後，小鼠的包含模數(第6A圖)、斷裂應變(第6B圖)、降伏壓力(第6C圖)及斷裂負載(第6D圖)等力學參數皆會下降；而投予MLN4924則可回復該些力學參數。換言之，MLN4924可防止因骨質流失所造成的骨骼強度/支持力度下降。
一般來說，蝕骨細胞多分佈於骨骼的生長板(growth plate)及幹骺端區域(metaphyseal region)。sRANKL會引發蝕骨細胞聚集於小梁骨及冠狀結構的表面，吸收骨基質並形成凹陷。利用蘇木精及TRAP對脛骨進行染色可發現，相較於對照組，小鼠經卵巢切除術及RANKL處理(OVX+sRANKL)後，生長板的TRAP染色會減少，而幹骺端區域的TRAP染色則會增加。於幹骺端區域觀察到明顯增加的TRAP染色強度指出，該些處理會增加蝕骨細胞生成量，且蝕骨細胞會由生長板移動至幹骺端區域(第7A圖)。然而，投予MLN4924 (OVX+sRANKL+MLN)可減少幹骺端區域的TRAP染色強度，並將生長板的TRAP染色強度回復至與對照組相當的程度(第7A圖)。
第7B圖進一步統計證實相較於對照組，投予卵巢切除術處理(OVX)或同時投予卵巢切除術及sRANKL處理(OVX+sRANKL)皆會顯著增加單位骨骼長度中蝕骨細胞的數量；而投予MLN4924 (OVX+sRANKL+MLN)則可減少因卵巢切除合併sRANKL處理所引發的蝕骨細胞數量。
由上述結果可知，MLN4924可於個體體內抑制蝕骨細胞的生成及作用，進而增加個體骨骼的強度。
總結上述，本研究發現類泛素化抑制劑(例如MLN4924)的新穎用途，其可藉由抑制蝕骨細胞的生成及作用來預防或治療骨質疏鬆症。據此，本揭示內容提供了一種用以預防或治療骨質疏鬆症的方法；該方法包含對有需要之個體投予有效量之類泛素化抑制劑(例如MLN4924)，以達到預防或治療骨質疏鬆症的目的。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A-1D圖為依據實施例1.1所闡述之數據，其中是將源自小鼠骨髓的巨噬細胞(marrow-derived macrophage, BMM)培養於包含sRANKL (soluble RANKL，一種重組RANKL；濃度為每毫升100奈克)、巨噬細胞群落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)；每毫升40奈克)及特定濃度之MLN4924的細胞培養液，7天後進行後續分析；第1A圖：利用TRAP染色來評估巨噬細胞分化成巨大多核蝕骨細胞的結果；第1B圖：於人工骨質基質上進行蝕骨細胞分化後，移除細胞，再利用1%甲苯胺藍分析再吸收區域，藉以確認蝕骨細胞吸收骨質之活性；第1C圖：收集細胞培養液以分析細胞自溶酶K的活性；第1D圖：利用MTT試驗來確定特定濃度之MLN4924對BMM細胞所產生的細胞毒性；比例尺為100微米；將數據表示為平均值±標準差；*表示p ＜ 0.05，**表示p ＜ 0.01； 第2A-2D圖為依據實施例1.2所闡述之數據，其中是將RAW264.7細胞培養於包含sRANKL (每毫升100奈克)及特定濃度之MLN4924的細胞培養液，7天後進行後續分析；第2A圖：利用TRAP染色來評估蝕骨細胞的分化結果；第2B圖：於人工骨質基質上進行蝕骨細胞分化後，移除細胞，再利用1%甲苯胺藍分析再吸收區域，藉以確認蝕骨細胞吸收骨質之活性；第2C圖：收集細胞培養液以分析細胞自溶酶K的活性；第2D圖：利用MTT試驗來確定特定濃度之MLN4924對RAW264.7巨噬細胞所產生的細胞毒性；比例尺為100微米；將數據表示為平均值±標準差；*表示p ＜ 0.05； 第3A-3D圖為依據實施例2所闡述之數據，其中是對巨噬細胞投予特定濃度之MLN4924處理30分鐘後，以sRANKL (每毫升100奈克)刺激細胞，並於特定時間點收集細胞進行西方墨點分析；第3A圖：(A) MLN4924於特定時間點對TRAF-6表現量及ERK、P38與JNK磷酸化的影響；第3B圖：不同濃度之MLN4924對TRAF-6表現量及ERK、P38與JNK磷酸化的影響；第3C圖：MLN4924於特定時間點對NFATc-1表現量的影響；第3D圖：不同濃度之MLN4924對NFATc-1表現量的影響；對照組：未處理；R：sRANKL；M：MLN4924； 第4A-4C圖為依據實施例3所闡述之數據，其中是將小鼠的成骨前趨細胞株(pre-osteoblast) MC3T3-E1培養於包含不同濃度之MLN4924的細胞培養液，21天後進行後續分析；第4A圖：利用結晶紫染色來分析MC3T3-E1的細胞生長情況；第4B及4C圖：以茜素紅S(Alizarin Red S)於OD405 奈米的吸光度來定量分析MC3T3-E1細胞於第14天(第4B圖)及21天(第4C圖)的成骨作用(osteogenesis)；diff：成骨細胞分化培養液； 第5A-5E圖為依據實施例4.1所闡述之數據，其中是對小鼠進行卵巢切除術後，投予sRANKL (每公斤體重1毫克)，以產生骨質疏鬆症的動物模式；第5A圖：經特定處理之小鼠遠端股骨的微電腦斷層掃瞄二維照片，左圖為軸向平面，右圖為冠狀結構平面；第5B-5D圖：利用微電腦斷層掃瞄來測量小鼠脛骨之小梁骨(trabecular bone)的骨質參數，包含BV/TV百分比(第5B圖)、小梁骨數量(第5C圖)及小梁骨間隙(第5D圖)；第5E圖：對照組、OVX、OVX+sRANKL及OVX+sRANKL+MLN4924組小鼠血清中CTX-1的表現量；將數據表示為平均值±標準差；每組隻數為6；*代表p ＜ 0.05，**代表p ＜ 0.01； 第6A-6D圖為依據實施例4.2所闡述之數據，其係關於對照組、OVX、OVX+RANKL及OVX+RANKL+MLN4924組小鼠之股骨的力學特性；第6A圖：包含模數(modulus)；第6B圖：斷裂應變(Strain at Break)；第6C圖：降伏壓力(Stress at Yield)；第6D圖：斷裂負載(Load at Break)；將數據表示為平均值±標準差；每組隻數為6；*代表p ＜ 0.05，**代表p ＜ 0.01；以及 第7A-7B圖為依據實施例4.2所闡述之數據，其中第7A圖是關於對照組、OVX、OVX+sRANKL及OVX+sRANKL+MLN4924組小鼠的蘇木精(hematoxylin)及TRAP切片染色結果；第7B圖是藉由計算TRAP的染色細胞數量來分析對照組、OVX、OVX+sRANKL及OVX+sRANKL+MLN4924組小鼠之脛骨幹骺端區域中骨骼的再吸收參數(表示為每單位骨骼長度之蝕骨細胞數量)；將數據表示為平均值±標準差；*代表p ＜ 0.05，**代表p ＜ 0.01。

Claims (5)

  1. 一種類泛素化(neddylation)抑制劑的用途，其係用於製備一藥物以預防一個體罹患骨質疏鬆症或治療一罹患骨質疏鬆症的個體，其中該類泛素化抑制劑是MLN4924。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該個體為人類，且該類泛素化抑制劑的投予劑量約為每日每公斤個體體重0.08-8.1毫克。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該類泛素化抑制劑的投予劑量約為每日每公斤個體體重0.4-1.6毫克。
  4. 如請求項3所述之用途，其中該類泛素化抑制劑的投予劑量約為每日每公斤個體體重0.81毫克。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該類泛素化抑制劑的投予次數為每日一次，且連續投予至少二週。
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