JP6628832B2 - 骨粗鬆症を予防または治療するためのネディレーション阻害剤の使用 - Google Patents

骨粗鬆症を予防または治療するためのネディレーション阻害剤の使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２１日に出願された台湾非仮出願第１０６１１３４８４号に関連し、その利益を主張し、その出願の内容は全体が参照により本明細書に援用される。
本開示は概して骨粗鬆症治療の分野に関する。より特には、本開示はネディレーション（ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ）阻害剤の使用によって骨粗鬆症を治療する方法に関する。
骨粗鬆症は、高齢者における骨折についての重要な危険因子である低い骨密度を特徴とする障害である。骨粗鬆症は男性より女性に多く見られる。先進国において、約２〜８％の男性および９〜３８％の女性が骨粗鬆症と診断される。骨粗鬆症は、骨折の高いリスクを除いて、それ自体で対象に症状を引き起こすものではない。骨粗鬆症による骨折は、通常、健康な人々が普通は骨折しない状況において発生する。典型的な骨粗鬆症による骨折としては、股関節、脊椎、手首および肋骨の骨折が挙げられる。
単球／マクロファージ造血系由来の破骨細胞の分化および活性化は、主に、正常な骨基質再形成における核因子κ−Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）シグナル伝達の受容体活性化因子によって媒介される。破骨細胞の過活性化は酸を分泌し、骨基質を分解する溶解酵素が溶骨性骨疾患および骨粗鬆症をもたらし得る。したがって、破骨細胞の分化および機能活性を標的化することが、骨粗鬆症および他の骨量減少の疾患を治療する際の見込みのある療法を開発するための破骨細胞形成手段および骨吸収の活性化への洞察を与える。
閉経後の骨量損失の増加はエストロゲンの低レベルに起因することが報告されている。さらに、アルコール依存症、カフェイン、喫煙、ビタミンＤ欠乏、栄養不良、重金属（例えば、カドミウムおよび鉛）、甲状腺機能亢進症、腎疾患、および薬剤（例えば、アロマターゼ阻害剤、メトトレキサート、プロトンポンプ阻害剤、およびステロイドなど）を含む、いくつかの要因もまた、骨粗鬆症の発生の原因となる。
禁煙、アルコールの控えめな摂取および特定のサプリメント（カルシウムおよびビタミンＤなど）は骨粗鬆症の予防に有用であることが報告されている。医薬に関しては、ビスフォスフォネート（骨量の低下を予防するための薬物のクラス）、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）（エストロゲン（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）としても知られている、骨沈着に関連する主な女性ホルモン）、テリパラチド（新たな骨の形成を刺激し、減少した骨量を回復させる効果がある組換え副甲状腺ホルモン）、ラロキシフェン（骨代謝のレベルを低減させるのに効果があるエストロゲン受容体モジュレーター）、デノスマブ（破骨細胞の発生を抑制する際の核因子κ−Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体活性化因子のモノクローナル抗体阻害剤）、カルシトニン（破骨細胞の骨吸収活性を強力に阻害するカルシウム調節ホルモン）、およびラネル酸ストロンチウム（新たな骨組織の形成を刺激し、骨吸収を減少させるラネル酸のストロンチウム（ＩＩ）塩）が、骨粗鬆症および／または溶骨性疾患を治療する可能性のある手段を提供する。しかしながら、上記の治療手法の各々は欠点がある。例えば、ビスフォスフォネートは、通常、腹痛、吐き気、嘔吐、消化不良、筋骨格痛および顎骨壊死を引き起こす。エストロゲンは、心臓発作、血栓形成、脳卒中、子宮内膜増殖症ならびに乳がんおよび子宮内膜がんのリスクを増加させ得る。テリパラチドと関連する最も一般的な副作用としては、注射部位の痛み、吐き気、頭痛、こむら返りおよび目眩が挙げられる。ラロキシフェンは血栓形成および脳卒中のリスクを増加させ得る。デノスマブは低カルシウム血症および顎骨壊死をもたらす可能性があり、それはまた、微生物感染に対する免疫反応を損なう。カルシトニンはアレルギーおよび異なるがんの発生と関連する。ラネル酸ストロンチウムに関して、それは、吐き気、下痢、頭痛、発作、記憶喪失および意識障害を引き起こす可能性がある。
前述を考慮して、関連分野において、必要とする対象の生活の質および寿命を改善するように異常骨吸収および／または骨粗鬆症を安全で効果的に予防および／または治療する新規方法についての必要性が存在する。
以下は、読者に基本的な理解を提供するために本開示の簡略化した概要を示す。この概要は本開示の広範な概説ではなく、それは本発明の重要な／必須の要素を特定するものではなく、または本発明の範囲を記述するものではない。その唯一の目的は、後で示す、より詳細な説明の前置きとして簡略化した形態で本明細書に開示されるいくつかの概念を示すことである。
本開示は、必要とする対象における骨粗鬆症を予防および／または治療する方法に関する。その方法は、有効量のネディレーション（ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ）阻害剤を対象に投与するステップを含む。
本開示のいくつかの実施形態によれば、ネディレーション阻害剤はＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害剤である。好ましい実施形態によれば、ＮＡＥ阻害剤は化合物または合成核酸であってもよい。ＮＡＥ阻害剤の非限定的な例としては、ＭＬＮ４９２４ならびにその類似体および誘導体、ＴＡＳ４４６４、６，６’’−ビアピゲニン、シクロメタル化（ｃｙｃｌｏｍｅｔａｌｌａｔｅｄ）ロジウム（ＩＩＩ）錯体［Ｒｈ（ｐｐｙ）２（ｄｐｐｚ）］＋、およびフラボカワインＡが挙げられる。１つの特定の作業実施例によれば、ＮＡＥ阻害剤はＭＬＮ４９２４である。本開示の別の実施例によれば、ＮＡＥ阻害剤は、配列番号４もしくは６の配列、またはそれらに対応するＤＮＡ配列を含む合成核酸であり、この実施例において、合成核酸は、ＵＢＡ３、ＮＡＥの触媒サブユニットの発現を下方制御するのに有用である。
合成核酸は、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。本開示の一つの作業実施例によれば、合成核酸はｓｉＲＮＡである。
本開示の特定の実施形態によれば、対象はマウスであってもよく、ネディレーション阻害剤は、０．１２５〜１，２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日；好ましくは１．２５〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重／日；より好ましくは１．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で投与される。１つの特定の実施例によれば、ネディレーション阻害剤は、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で対象に投与される。
対象がヒトである場合、ヒト対象に投与されるネディレーション阻害剤のヒト等価用量（ＨＥＤ）は、動物研究から決定された用量に基づいて算出され得る。したがって、ヒト対象で使用するためのネディレーション阻害剤の有効量は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日；好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日；より好ましくは約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
本開示のいくつかの実施形態によれば、ネディレーション阻害剤は、骨粗鬆症の発生を抑制するように、少なくとも７連続日の間、好ましくは少なくとも１４連続日の間、毎日対象に投与される。
このネディレーション阻害剤は、経口、経腸、経鼻、局所、経粘膜および非経口投与からなる群から選択される経路によって投与されてもよく、非経口投与は、皮下、皮内、筋肉内、動脈内（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒａｌ）、静脈内、髄腔内、くも膜下内または腹腔内注射のいずれかである。
配列番号４もしくは６の配列、またはそれらに対応するＤＮＡ配列を含む合成核酸もまた、本明細書に開示され、その合成核酸は、ＵＢＡ３、ＮＡＥの触媒サブユニットの発現を下方制御する。合成核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡであってもよい。
任意に、合成核酸の５’末端および／または３’末端は、フルオロ、メトキシ、またはメトキシエチル基により修飾される。
本開示の付随する特徴および利点の多くは、添付の図面と関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してより良く理解される。
本特許または出願ファイルは少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラーの図面の本特許または特許出願公報のコピーは、要求し、必要な手数料を支払うことによって台湾特許庁により提供される。
本説明は、添付の図面を考慮して以下の詳細な説明を読むことにより、良く理解される。
図１Ａ〜１Ｄは、本開示の実施例１．１に従って７日間、可溶性組換えＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ、５０ｎｇ／ｍｌ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、４０ｎｇ／ｍｌ）および特定の濃度のＭＬＮ４９２４を含有する培地中でそれぞれインキュベートした一次マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）から収集されたデータである。図１Ａは、ＢＭＭ由来の破骨細胞の分化を示すＴＲＡＰ染色の写真である。 Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｏｓｔｅｏ Ｓｕｒｆａｃｅ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨細胞アッセイのためのｉｎ ｖｉｖｏ骨を模倣する合成３次元構造）における破骨細胞の分化後、細胞を除去し、破骨細胞活性を確認するための吸収領域を、１％のトルイジンブルー染色によって分析した。 培養培地を、カテプシンＫ活性の分析のためにＢｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに供する。 ＢＭＭの生存率に対するＭＬＮ４９２４の有効用量の効果をＭＴＴアッセイによって評価する。スケールバーは１００μｍを表す。データは平均±ＳＤを表し、ここで＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。 図２Ａ〜２Ｄは、本開示の実施例１．２に従って７日間、ｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）および特定の濃度のＭＬＮ４９２４を含有する培地中でそれぞれインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞から収集されたデータである。図２Ａは、ＲＡＷ２６４．７細胞由来の破骨細胞の分化を示すＴＲＡＰ染色の写真である。 Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｏｓｔｅｏ Ｓｕｒｆａｃｅにおける破骨細胞の分化後、細胞を除去し、破骨細胞活性を確認するための吸収領域を、１％のトルイジンブルー染色によって分析した。 培養培地を、カテプシンＫ活性の分析のためにＢｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに供する。 ＲＡＷ２６４．７細胞の生存率に対するＭＬＮ４９２４の有効用量の効果をＭＴＴアッセイによって評価する。スケールバーは１００μｍを表す。データは平均±ＳＤを表し、ここで＊ｐ＜０．０５である。 図３Ａ〜３Ｄは、本開示の実施例２に従って３０分間、特定の濃度のＭＬＮ４９２４で前処理し、続いてｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した、ＲＡＷ２６４．７細胞から抽出した特定のタンパク質の発現をそれぞれ示すウェスタンブロット分析から収集されたデータである。図３Ａは、ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、Ｐ３８（ｐＰ３８）およびＪＮＫ（ｐＪＮＫ）のリン酸化に対するＭＬＮ４９２４の経時的な効果である。 ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、Ｐ３８（ｐＰ３８）およびＪＮＫ（ｐＪＮＫ）のリン酸化に対するＭＬＮ４９２４の用量効果である。 ＮＦＡＴｃ−１の発現に対するＭＬＮ４９２４の経時的な効果である。 ＮＦＡＴｃ−１の発現に対するＭＬＮ４９２４の用量効果である。偽：未処理の対照；Ｒ：ｓＲＡＮＫＬ；Ｍ：ＭＬＮ４９２４。 図４Ａ〜４Ｂは、本開示の実施例３に従って２１日間、特定の濃度のＭＬＮ４９２４を含有する分化培地中でインキュベートしたマウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の骨形成をそれぞれ示す。図４Ａ：骨形成の間のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を、クリスタルバイオレット染色によって分析する。 ２１日目のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の骨形成を、アリザリンレッドＳ株を測定することによって分析する。Ｄｉｆｆ：骨芽細胞分化培地。ＭＬＮ：ＭＬＮ４９２４。 図５Ａ〜５Ｄは、本開示の実施例４に従うネディレーション経路に対するｓＲＡＮＫＬの効果および破骨細胞分化の間のマクロファージに対するＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果をそれぞれ示すデータである。図５Ａ：ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージをウェルに播種し、種々の濃度のｓＲＡＮＫＬ（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ネディレーション経路における特異的抗体を使用してウェスタンブロッティング分析に供した。 ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージをウェルに播種し、ＵＢＡ３またはスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。培養後、トランスフェクト細胞を採取し、溶解し、ＮＥＤＤ８、ＵＢＡ３およびＡＰＰＢＰ１発現を調べるためにウェスタンブロットによってさらに分析した。 ＵＢＡ３またはスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクトＲＡＷ２６４．７細胞をｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）でさらに処理し、３日の誘導後、ＴＲＡＰ染色陽性巨大破骨細胞へのマクロファージの形態変化を写真に撮った。 ＵＢＡ３またはスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクトＲＡＷ２６４．７細胞をｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）でさらに処理し、３日の誘導後、ＴＲＡＰ染色陽性巨大破骨細胞へのマクロファージの形態変化をさらに計数した。データは平均±ＳＤとして表し、ここで＊ｐ＜０．０５である。 図６Ａ〜６Ｅは、卵巣摘出により誘導された骨粗鬆症のマウスモデルを示すデータであり、卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスを、本開示の実施例５．１に従ってＭＬＮ４９２４（１０ｍｇ／Ｋｇ）の不在下または存在下でｓＲＡＮＫＬ（１ｍｇ／Ｋｇ）を用いてそれぞれ処置する。図６Ａ：示した処置でそれぞれ処置したマウスの大腿遠位のマイクロコンピュータートモグラフィー（マイクロＣＴ）３次元画像であり、左のパネルは横断面を表し、右のパネルは前頭面を表す。 骨体積／全体積を含む柱骨パラメーターのマイクロＣＴ測定である。 小柱数を含む柱骨パラメーターのマイクロＣＴ測定である。 小柱空間を含む柱骨パラメーターのマイクロＣＴ測定である。 対照、ＯＶＸ、ＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ、およびＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ４９２４群における１型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ−１）の血清中濃度である。値は平均±ＳＤとして表し、Ｎ＝６／群である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 モジュラスを含む本開示の実施例５．２に従う対照、ＯＶＸ、ＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ、およびＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ４９２４群における大腿骨の機械的特性を示すヒストグラムである。値は平均±ＳＤとして表し、Ｎ＝６／群である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 破断点引っ張りを含む本開示の実施例５．２に従う対照、ＯＶＸ、ＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ、およびＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ４９２４群における大腿骨の機械的特性を示すヒストグラムである。値は平均±ＳＤとして表し、Ｎ＝６／群である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 降伏応力を含む本開示の実施例５．２に従う対照、ＯＶＸ、ＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ、およびＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ４９２４群における大腿骨の機械的特性を示すヒストグラムである。値は平均±ＳＤとして表し、Ｎ＝６／群である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 破断点荷重を含む本開示の実施例５．２に従う対照、ＯＶＸ、ＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ、およびＯＶＸ＋ＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ４９２４群における大腿骨の機械的特性を示すヒストグラムである。値は平均±ＳＤとして表し、Ｎ＝６／群である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
添付の図面と関連して以下に提供される詳細な説明は本実施例の説明として意図され、本実施例が構成または利用され得る唯一の形態を表すことを意図するものではない。本説明は、実施例の機能および実施例を構成し、操作するステップの順序を示す。しかしながら、同じまたは等価の機能および順序が異なる実施例によって達成されてもよい。
簡便性のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において利用される特定の用語はここでまとめられる。本明細書において他に定義されない限り、本開示において利用される科学的および技術的専門用語は、一般的に理解され、当業者によって使用される意味を有するものとする。また、文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語はその同じものの複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むことが理解される。特に、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「一つの（ａ、ａｎ）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の参照を含む。また、本明細書および特許請求の範囲に使用される場合、「少なくとも１つ」および「１つ以上」という用語は、同じ意味を有し、１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含む。
本発明の広範囲を示している数値範囲およびパラメーターは概算であるにも関わらず、特定の例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。また、本明細書に使用される場合、「約」という用語は概して、所与の値または範囲の１０％、５％、１％または０．５％以内を意味する。あるいは、「約」という用語は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差の範囲内を意味する。操作／作業実施例以外において、または他に明確に特定されない限り、本明細書に開示される材料の量、持続時間、温度、操作条件、量の割合、およびそれらの同種のものなどの数値範囲、量、値およびパーセンテージは、全ての場合、「約」という用語によって修飾されることは理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、所望の場合、変化し得る概算である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告される有効数字の数を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
他に特定されない限り、本明細書に使用されるポリヌクレオチドの表記は、標準的用法に従って左側末端が５’末端であり、右側末端が３’末端である。
本明細書に使用される場合、「ＭＬＮ４９２４の類似体」という用語は、ＭＬＮ４９２４のそれらの化合物、エナンチオマー、および誘導体を指し、それらは、ＭＬＮ４９２４から誘導され、ＭＬＮ４９２４の生物学的機能の全てまたは一部を保持する。
「ＭＬＮ４９２４の誘導体」という用語は、ＭＬＮ４９２４のそれらの化合物、エナンチオマーおよび類似体を指し、それらは、ＭＬＮ４９２４から誘導され、ＭＬＮ４９２４の生物学的機能の全てまたは一部を保持する。
「適用」および「投与」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本発明のネディレーション阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４）を対象（例えば、異常骨吸収および／もしくは骨粗鬆症を発症するリスクのある対象、または異常骨吸収および／もしくは骨粗鬆症を有するか、もしくは有する疑いのある対象）に投与し、それによって異常骨吸収および骨粗鬆症を発症するリスクを減少させるか、または骨粗鬆症もしくはＲＡＮＫＬ媒介性異常骨吸収と関連する症状を軽減もしくは改善することを意図するものとする。本開示の種々の実施形態によれば、本ネディレーション阻害剤は、骨粗鬆症および／または骨量喪失を予防および／または治療するように、適切な経路（例えば、静脈内注射、腹腔内注射、または経口投与）により対象に投与されてもよい。
本明細書に使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収、骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収の症状、または骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収になりやすい傾向を予防、治癒、治療、軽減、緩和、変更、矯正、改善、改良、または影響を与えるという目的で、骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収、骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収の症状、または骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収になりやすい傾向を有する対象への本ネディレーション阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４）の適用または投与を指す。骨粗鬆症および／または異常骨吸収と関連する症状の非限定的な例としては、骨折（股関節骨折、脊椎骨折、手首骨折および肋骨骨折など）、背痛、後彎症（猫背）および溶骨性疾患が挙げられる。
本明細書において称される「有効量」という用語は、所望の反応を生じるのに十分である成分の量を指定する。治療目的のために、有効量はまた、治療的に有益な効果が成分のあらゆる毒性または有害作用を上回る量である。特定の有効または十分な量は、治療される特定の条件、患者の健康状態（例えば、患者の体重、年齢または性別）、治療される哺乳動物または動物の種類、治療期間、併用療法の性質（もしあれば）、ならびに利用される特定の製剤および化合物またはその誘導体の構造などの要因に応じて変化する。有効量は、例えば、グラム、ミリグラムもしくはマイクログラムで、またはミリグラム／キログラム体重（ｍｇ／Ｋｇ）として表すことができる。あるいは、有効量は、活性成分（例えば、本ネディレーション阻害剤）の濃度、例えば、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率および混合比で表すことができる。特に、本明細書に記載されるネディレーション阻害剤と関連して使用される「治療有効量」という用語は、対象における骨粗鬆症および／または異常骨吸収と関連する症状を軽減または改善するのに十分である、ネディレーション阻害剤の量を指す。当業者は、動物モデルから決定された用量に基づいて医薬（本ネディレーション阻害剤など）のためのヒト等価用量（ＨＥＤ）を算出することができる。例えば、当業者は、ヒト対象に使用するための最大の安全な投薬量を見積もる際に「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」という題名の米国食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって公開された産業用の指針に従うことができる。
「対象」という用語は、本発明の方法によって治療可能なヒト種を含む哺乳動物を指す。「対象」という用語は、一方の性別が具体的に示されない限り、男性（雄性）および女性（雌性）の両方を指すものとする。本開示の好ましい実施形態によれば、対象は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウサギであってもよい。
本開示は、少なくとも部分的に、ネディレーション阻害剤が、破骨細胞の分化および／または機能を抑制でき、それによって異常骨吸収および骨量喪失を予防または減少させるという発見に基づく。したがって、本開示の第１の態様は、対象における骨粗鬆症および／または異常骨吸収を予防および／または治療する方法に関する。
本開示の実施形態によれば、方法は、有効量のネディレーション阻害剤を対象に投与するステップを含む。一般に、ネディレーション阻害剤は、ネディレーション経路を阻害する任意のアンタゴニスト、例えばネディレーション経路のアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニスト化合物であってもよい。本開示の特定の実施形態によれば、ネディレーション阻害剤はＮＡＥの活性を特異的に阻害し得る。ＮＡＥ阻害剤は化合物または合成核酸であってもよい。本方法における使用に適した例示的な化合物としては、限定されないが、ＭＬＮ４９２４ならびにその類似体および誘導体、ＴＡＳ４４６４、６，６’’−ビアピゲニン、シクロメタル化ロジウム（ＩＩＩ）錯体（例えば、［Ｒｈ（ｐｐｙ）２（ｄｐｐｚ）］＋）、およびフラボカワインＡが挙げられる。
本開示の好ましい実施形態によれば、ネディレーション阻害剤は、ＭＬＮ４９２４、またはその類似体もしくは誘導体であり、ＭＬＮ４９２４は、（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−（（１Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル）−２−ヒドロキシシクロペンチル）メチルスルファメートの省略名である。
合成核酸に関して、それは、ＮＡＥの触媒サブユニットＵＢＡ３を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡであってもよい。本開示のいくつかの実施形態によれば、合成核酸はｓｉＲＮＡである。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、センス鎖（パッセンジャー鎖として機能する）およびアンチセンス鎖（遺伝子発現をサイレンシングするためのガイド鎖とて機能する）を有し、センス鎖は配列番号３のヌクレオチド配列を有し、アンチセンス鎖は配列番号４の配列を有する。代替の実施例によれば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は配列番号５のヌクレオチド配列を有し、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は配列番号６のヌクレオチド配列を有する。
当業者によって理解され得るように、ｍＲＮＡ翻訳のサイレンシングまたは阻害はｓｉＲＮＡ以外のヌクレオチド分子によって達成され得、それらのヌクレオチド分子もまた、本発明の実施形態により意図される。例えば、ｓｈＲＮＡは、分子がループ構造を形成できるようにヌクレオチドの短いスペーサーによって連結されるセンスおよびアンチセンス配列を含有するＲＮＡ分子であり、本開示の実施形態によれば、合成核酸はｓｈＲＮＡであってもよく、ｓｈＲＮＡのセンス配列は配列番号３または５の配列と同一であり、ｓｈＲＮＡのアンチセンス配列は配列番号４または６の配列と同一である。あるいは、合成核酸は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体（例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の形態で提供され、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体は配列番号４または６の配列を含む配列を有する。さらに代替として、合成核酸は、配列番号４もしく６の配列、またはそれらに対応するＤＮＡ配列（すなわち、配列番号４または６のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列）を含む任意の二本または一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
合成核酸は、合成核酸の安定性を保護するか、合成核酸の寿命を延ばすか、合成核酸の機能を増強するか、または合成核酸を特定の組織／細胞へ標的化する種々の修飾を有してもよい。例えば、合成核酸の５’末端および／または３’末端は、フルオロ（−Ｆ）、メトキシ（−ＯＣＨ３；Ｏ−Ｍｅ）、またはメトキシエチル（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；Ｏ−ＭＯＥ）基で修飾されてもよい。特に、合成核酸の安定性を増加させる目的のために、合成核酸のリボース２’−ＯＨ基は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）により置換されてもよい。さらにまたは代替として、合成核酸の５’末端または３’末端は、コレステロールまたはチオール基により修飾されてもよく、それによって送達および細胞透過に対する合成核酸の有効性を増加させる。理解され得るように、合成核酸の５’末端または３’末端は、分子、例えば蛍光分子とコンジュゲートされてもよい。
一実施形態によれば、本方法によって治療可能な対象は、骨減少症、骨粗鬆症および／または異常骨吸収を発症するリスクがある。別の実施形態によれば、本方法によって治療可能な対象は、骨粗鬆症および／または異常骨吸収を有するか、または有する疑いがある。さらに別の実施形態によれば、本方法によって治療可能な対象は、骨減少症を有するか、または有する疑いがある。
本開示のいくつかの実施形態によれば、対象はマウスである。これらの実施形態において、ネディレーション阻害剤は、０．１２５〜１，２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日；好ましくは１．２５〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重／日；より好ましくは１．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で対象に投与される。１つの特定の例によれば、ネディレーション阻害剤は、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で投与される。
当業者は、本出願の作業実施例に提供された動物研究から決定された用量に基づいて、本ネディレーション阻害剤のヒト等価用量（ＨＥＤ）を容易に決定することができる。いくつかの実施形態によれば、ヒト対象における使用に適した本ネディレーション阻害剤の量は、ヒトに対して、約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ／日の範囲、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｍｇ／ｋｇ体重／日；好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日；より好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重／日であってもよい。
理解されるように、投与レジメンは、年齢、性別、骨量、生理的条件、および他の治療（もしあれば）などの特定の要因により変化させてもよい。例えば、本ネディレーション阻害剤は、１、２、３、４またはそれ以上の連続した週にわたって、１週間につき１〜７回（例えば、１週間につき１、２、３、４、５、６または７回）対象に投与されてもよい。あるいは、ネディレーション阻害剤は、２週毎、４週毎、５週毎、６週毎、７週毎、８週毎、９週毎、もしくは１０週毎；または毎月、２ヶ月毎、もしくは３ヶ月毎、もしくはそれより長い間にわたって、１〜１０回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回）対象に投与されてもよい。本開示の１つの作業実施例によれば、ネディレーション阻害剤は、予防的／治療的効果を生じるように少なくとも２週（２、３または４連続週）にわたって毎日対象に投与される。
本開示の一実施形態によれば、ネディレーション阻害剤は、ＲＡＮＫＬ媒介性ネディレーション経路を調節することによって破骨細胞の分化および／または機能を抑制でき、それによって異常骨吸収および骨量喪失を予防または減少する。本開示の別の実施形態によれば、破骨細胞の分化および／または機能を阻害する際のネディレーション阻害剤の有効量は、骨芽細胞の生存および骨形成プロセスに影響を及ぼさない。
理解されるように、本方法は、単独で、または骨粗鬆症および／もしくは異常骨吸収の予防および／もしくは治療に関して対象にいくらかの有益な効果を与えるさらなる療法と組み合わせて対象に適用され得る。意図される目的に応じて、本方法は、さらなる療法の投与の前、間または後に対象に適用され得る。
任意選択に、ネディレーション阻害剤は、以下の経路のいずれかにより対象に投与されてもよく、その経路は、限定されないが、経口、経腸、経鼻、局所、経粘膜、および非経口投与を含み、その非経口投与は、皮下、皮内、筋肉内、動脈内、静脈内、髄腔内、くも膜下腔または腹腔内注射のいずれかである。
本方法によって治療可能な対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウサギである。好ましくは、対象はヒトである。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明し、本発明を実施する際に当業者に役立つように提供される。これらの実施例は、いかなる様式においても本発明の範囲を限定すると決して解釈されない。さらなる労作なしに、当業者は、本明細書の説明に基づいて本発明をその完全な程度まで利用することができる。本明細書に引用される全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
材料および方法
試薬
ＭＬＮ４９２４はＡｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ａｃｔｉｖｅｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＮＪ）から得た。組換えマウスＲＡＮＫＬ（ＧＦＭ４）および組換えマウスＭ−ＣＳＦ（４１６−ＭＬ）のそれぞれは、Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＲ＆Ｄ（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ＮＦＡＴｃ１（７Ａ６）、ＡＰＰＢＰ１（ｓｃ３６００４８）、ＵＢＡ３（ｓｃ３７７２７２）抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から得た。ｐＥＲＫ（４３７０）、ｐＪＮＫ（４６６８）、ｐＰ３８−ＭＡＰＫ（４６３１）、およびＮＥＤＤ８（２７４５）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、およびα−チューブリン抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘ（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から購入した。
細胞培養および原発性破骨細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ネズミ単球／マクロファージ細胞系）を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地高グルコース（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で培養した。
前破骨細胞を、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）によって調製した。簡潔に述べると、大腿骨および脛骨を、６〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスから得た。ＢＭＭ細胞を大腿骨および脛骨から単離し、次いで、単球／マクロファージ系統の前破骨細胞を生じるように３日間、Ｍ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）と培養した。
全ての細胞を、５％ＣＯ２および加湿空気を含有する３７℃インキュベーター内で培養した。
破骨細胞形成
インビトロでの破骨細胞形成のために、前破骨細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＮＫＬまたは特定の濃度のＭＬＮ４９２４を含有する培地中で７日間培養した。続いて、細胞を固定し、製造業者のプロトコルに従ってＴＲＡＰ染色キット（ＫＡＭＩＹＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）について染色した。写真を可視化し、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いてスナップ写真に撮った。
カテプシンＫ活性アッセイおよびピット（ｐｉｔ）アッセイ
前破骨細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｏｓｔｅｏ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｓｓａｙ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、Ｍａｉｎｅ）に播種した。２４時間後、細胞をｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）および特定の濃度のＭＬＮ４９２４で７日間処理した。次いで細胞を、ＢｉｏｖｉｓｉｏｎカテプシンＫ活性蛍光アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）の使用によってカテプシンＫ活性を評価するために収集した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｏｓｔｅｏ表面を、１％トルイジンブルーで２４時間染色し、脱イオン水で２回洗浄した。ピットの写真を、１００倍の倍率でＮｉｋｏｎ ＴＥ３００顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いてスナップ写真に撮った。
ウェスタンブロット分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を６時間無血清培地で飢餓させ、次いで規定の処理により処理した。示した時点において、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液中に溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてＮＥＤＤ８、ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＡ３を含む、示した抗体でウェスタンブロットした。
破骨細胞分化でのＵＢＡ３ノックダウン
ＲＡＷ２６４．７細胞をウェルに播種し、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ １（Ｕｂａ３−ＭＵＳ−１１０）、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ ２（Ｕｂａ３−ＭＵＳ−５７４）、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ ３（Ｕｂａ３−ＭＵＳ−６２７）およびスクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照として）を含む、３つの特異的ＵＢＡ３またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ）でトランスフェクトし、そのヌクレオチド配列を表１にまとめた。
６時間のトランスフェクション後、細胞をｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。３日後、ウェル上での成熟巨大破骨細胞形成に対するＵＢＡ３ノックダウンの効果を写真に撮り、カウントした。
動物モデル
全ての実験手順は、ＣｈｉａｙｉにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈａｎｇ Ｇｕｎｇ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌによって承認され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＩＡＣＵＣ番号：２０１３１００１０２および２０１５１０３００１）によって入手可能なＣａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓについてのガイドラインに従った。全ての試みは動物の苦痛を最小化するために行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス（６〜８週齢；台湾のＢｉｏＬａｓｃｏから得た）に卵巣摘出手術（ＯＶＸ）の操作をした。ＯＶＸ操作の４８時間後、ｓＲＡＮＫＬ（１ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を、２日間にわたって毎日１回腹腔内注射し、続いてＭＬＮ４９２４（１０ｍｇ／ｋｇ）を、２週間にわたって毎日１回腹腔内注射した。マウスをＣＯ２窒息により屠殺し、脛骨および大腿骨をそれから単離した。脛骨を組織化学アッセイに供し、大腿骨を曲げ試験ならびにＭＴＳ（Ｔｅｓｔｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｓｈａｋｏｐｅｅ、ＭＮ）およびＳｋｙｓｃａｎ １２７２（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｋｏｎｔｉｃｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるトモグラフィー解析にそれぞれ供した。Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ−１）（ＣＥＡ６６５Ｍｕ）の血中濃度を、特定のＥＬＩＳＡキット（ＵＳＣＮ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｕｈａｎ、Ｈｕｂｅｉ、中国）によって測定した。
生体力学的試験
大腿骨を、ＭＴＳ Ｓｙｎｅｒｇｉｅ ２００（Ｔｅｓｔｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｓｈａｋｏｐｅｅ、ＭＮ）での３点曲げによる機能停止によって試験した。荷重負荷速度を、１Ｎの前負荷、５００Ｎのロードセル、３０秒の設定時間および１０ｍｍの点間距離で１ｍｍ／ｍｉｎとして設定した。力変位データを、モジュラス、破断点荷重、降伏応力および降伏点引っ張りを含む、構造特性からプロットした。
統計的解析
データを平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として提示する。群間の相違の有意性を対応のないスチューデントｔ検定により評価し、０．０５のＰ値を有意とみなした。
実施例１ ＭＬＮ４９２４は破骨細胞の分化を阻害する
ＢＭＭまたはＲＡＷ２６４．７細胞に対するＭＬＮ４９２４の効果をこの実施例において調べた。結果をそれぞれ図１〜２に示す。
１．１ ＢＭＭ
マウス脛骨および大腿骨から単離した初代ＢＭＭを、Ｍ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬおよび特定の濃度のＭＬＮ４９２４を含有する培地中で培養し、続いてＴＲＡＰ染色をした。概して、大きな多核赤色ＴＲＡＰ陽性細胞は成熟破骨細胞を表した。図１Ａは、ＢＭＭ由来の破骨細胞の分化を示すＴＲＡＰ染色の写真である。対象群と比較して、ｓＲＡＮＫＬは顕著にＢＭＭの破骨細胞分化を刺激した。さらに、ＭＬＮ４９２４は用量依存的にｓＲＡＮＫＬ媒介性破骨細胞形成を明白に抑制した。
次いで破骨細胞の活性に対するＭＬＮ４９２４の効果をピットアッセイによって確認した。同様に、初代ＢＭＭを、特定の用量のＭ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬおよびＭＬＮ４９２４を含有する培地中で７日間培養した。破骨細胞による骨基質上の吸収領域を１％トルイジンブルー染色によって可視化し、画像ソフトウェアによって定量した。示した図１Ｂのデータのように、ＭＬＮ４９２４は用量依存的に破骨細胞の吸収活性を抑制した。
破骨細胞は、骨吸収の間にコラーゲンおよび他の基質タンパク質を分解するためにカテプシンＫを分泌することが知られている。したがって、本発明はカテプシンＫの活性／機能に対するＭＬＮ４９２４の効果をさらに調べた。ｓＲＡＮＫＬはカテプシンＫの活性を顕著に上方制御するが、ｓＲＡＮＫＬ群と比較して、ＭＬＮ４９２４による処理はカテプシンＫの活性をかなり低下させることが見出される。さらに、ＭＬＮ４９２４による処理はマクロファージにおいてカテプシンＫの基礎活性に影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。
図１Ｂおよび１Ｃは、ＭＬＮ４９２４が、破骨細胞の分化および骨吸収活性を抑制することにより異常骨吸収を減少させることができることを示す。
次に、ＭＬＮ４９２４により抑制した破骨細胞形成が細胞毒性によって引き起こされたかどうかを決定するためにＷＳＴアッセイを使用した。そのデータにより、ＭＬＮ４９２４は、破骨細胞分化を効果的に阻害した用量で細胞傷害性効果を有さなかったことが示された（図１Ｄ）。
１．２ ＲＡＷ２６４．７
ＢＭＭに加えて、マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７細胞に対するＭＬＮ４９２４の効果もまた、調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞を、ｓＲＡＮＫＬおよびＭＬＮ４９２４を含有する培地中で７日間培養し、次いでＴＲＡＰ染色による破骨細胞形成評価に供した。ＭＬＮ４９２４は、ｓＲＡＮＫＬ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞に由来する破骨細胞の分化（図２Ａ）、骨基質吸収（図２Ｂ）および溶骨性酵素カテプシンＫ活性（図２Ｃ）を顕著に阻害したことが見出された。さらに、ＭＬＮ４９２４はＲＡＷ２６４．７細胞の細胞生存に影響を与えず、ＭＬＮ４９２４は破骨細胞分化を効果的に阻害した用量で細胞傷害性効果を有さなかったことが示された（図２Ｄ）。
図２Ａ〜２Ｄのこれらのデータにより、マクロファージの生存に影響を与えずに、ＭＬＮ４９２４は、骨吸収を予防するために破骨細胞の分化および溶骨活性を顕著に抑制できることが確認された。
実施例２ 阻害機構
ウェスタンブロット分析のデータにより、ｓＲＡＮＫＬ活性化破骨細胞分化シグナルに対するＭＬＮ４９２４の時間および用量効果が明らかになった。その結果により、ビヒクル対照（偽）と比較して、ｓＲＡＮＫＬは、ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、Ｐ３８（ｐＰ３８）およびＪＮＫ（ｐＪＮＫ）のリン酸化を明白に増加させたことが示された（図３Ａ）。ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、Ｐ３８（ｐＰ３８）およびＪＮＫ（ｐＪＮＫ）のｓＲＡＮＫＬにより上方制御されるリン酸化を、ＭＬＮ４９２４の処理によって阻害した（図３Ａ）。特に、阻害効果はＭＬＮ４９２４濃度の増加と共に増加した（図３Ｂ）。
以前の研究により、ＲＡＮＫＬは、転写因子ＮＦＡＴｃ−１の発現を誘導し、ＮＦＡＴｃ−１欠損胚から単離された幹細胞は破骨細胞へ分化できないことが報告されている。さらに、前破骨細胞におけるＮＦＡＴｃ−１の異所性発現は、ＲＡＮＫＬの不在下で前破骨細胞を破骨細胞に分化させた。ＮＦＡＴｃ−１は破骨細胞分化についての重要な転写因子とみなされるので、ＮＦＡＴｃ−１のレベルに対するＭＬＮ４９２４の効果を調べた。示した図３Ｃのデータのように、ｓＲＡＮＫＬはＮＦＡＴｃ−１（「Ｒ」群）の発現を増加させ、ｓＲＡＮＫＬによって誘導されるＮＦＡＴｃ−１の発現はＭＬＮ４９２４（「Ｒ＋Ｍ」群）によって顕著に抑制した。図３Ｄのデータにより、ＮＦＡＴｃ−１発現に対するＭＬＮ４９２４の阻害効果は、ＭＬＮ４９２４濃度の増加と共に増加することが確認された。
上述のデータにより、ＭＬＮ４９２４は、時間および用量依存的にＲＡＮＫＬシグナリング経路を下方制御することによって破骨細胞の分化および活性を阻害することが示された。
実施例３ 骨芽細胞に対するＭＬＮ４９２４の効果
次に、ＭＬＮ４９２４による処理が骨芽細胞および骨形成プロセスに影響を与えるか（すなわち、増加または減少させるか）どうかを調べた。結果を図４Ａ〜４Ｂにそれぞれ示す。
マウス前骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ＭＬＮ４９２４を有するか、または有さない骨芽細胞分化培地中で２１日間培養した。骨芽細胞の生存も（図４Ａ）、骨芽細胞の分化も（図４Ｂ）、ＭＬＮ４９２４による影響を受けなかったことが見出された。
このデータにより、ＭＬＮ４９２４は、破骨細胞分化を効果的に阻害した用量で骨芽細胞の生存および分化に対して細胞傷害性効果を有さなかったことが示された。
実施例４ ＵＢＡ３に特異的なｓｉＲＮＡは破骨細胞の分化を阻害する
ＲＡＮＫは、破骨細胞およびそれらの前駆体によって発現される腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである。その可溶性リガンド（すなわちｓＲＡＮＫＬ）とのＲＡＮＫの相互作用は、骨吸収を制御するための重要な経路として特定されている。しかしながら、ｓＲＡＮＫＬ活性化破骨細胞分化を調節する際のネディレーション経路の機能は、ほとんど知られていない。骨粗鬆症におけるネディレーション経路の重要性および治療的有意性を調べるために、ｓＲＡＮＫＬ刺激性破骨細胞分化に影響を及ぼす際のＮＡＥ媒介性ネディレーション活性を減少させるネディレーション経路の発現パターンおよびＵＢＡ３のノックダウンを調べた。
ネディレーション経路活性化の刺激および破骨細胞の分化に対するｓＲＡＮＫＬの用量効果を調べた。図５Ａは、ｓＲＡＮＫＬが、３日のインキュベーション後、タンパク質に対するＮＥＤＤ８変化を用量依存的に向上させたことを示した。さらに、ネディレーションにおける酵素の開始剤（Ｅ１）は、ＡＰＰＢＰ１およびＵＢＡ３サブユニットから構成されるヘテロ二量体であるＮＡＥである。このデータにより、ｓＲＡＮＫＬが、ｓＲＡＮＫＬ刺激の間、調節サブユニットＡＰＰＢＰ１ではなく、触媒サブユニットＵＢＡ３の発現を顕著に増加させたことが示され、このことは、ｓＲＡＮＫＬ媒介性破骨細胞分化におけるＮＡＥのＵＢＡ３サブユニットの重要な関与を示す。
ｓＲＡＮＫＬ活性化破骨細胞分化におけるＵＢＡ３の機能的効果を決定するために、ＵＢＡ３ ｍＲＮＡをターゲティングすることによって３つの特定のＲＮＡｉ分子を、ＵＢＡ３発現をノックダウンするためにＲＡＷ２６４．７にトランスフェクトした。培養後、トランスフェクトＲＡＷ２６４．７細胞を、ＵＢＡ３発現をチェックするために収集し、破骨細胞分化を誘導するためにｓＲＡＮＫＬでさらに処理した。ウェスタンブロット分析によって、図５Ｂは、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ１およびスクランブル対照ｓｉＲＮＡではなく、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ２および３が、ＵＢＡ３の発現をノックダウンし得ることを示した。さらに、続いてＵＢＡ３発現のノックダウンはＮＥＤＤ８変化を下方制御したが、ＡＰＰＢＰ１の発現に影響を及ぼさなかった。図５Ｃおよび５Ｄは、スクランブル対照ｓｉＲＮＡが、ｓＲＡＮＫＬ刺激性破骨細胞分化の阻害に対して効果を有さなかったことを示した。一方で、ＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ２および３の両方は巨大破骨細胞の分化数を顕著に減少させた。これらのデータは、ＵＢＡ３の発現および活性が、ｓＲＡＮＫＬ刺激性破骨細胞分化の間、ＮＡＥ媒介性タンパク質ネディレーションにおいて重要であることを示す。
図５Ａ〜５Ｄのデータにより、ＵＢＡ３に特異的なｓｉＲＮＡは破骨細胞の分化に対して阻害効果を示すことが実証された。
実施例５ ＭＬＮ４９２４のｉｎ ｖｉｖｏでの効果
５．１ 骨量減少
骨粗鬆症マウスモデルを、ＭＬＮ４９２４が、ｉｎ ｖｉｖｏで骨粗鬆症を治療するために異常骨吸収を減少させることによって破骨細胞の分化および溶骨機能を阻害できるかどうかを調べるためにこの実施例において使用した。
マウスを、マイクロコンピュータートモグラフィー（μＣＴ）に供する前に特定の処置により最初に処置した。対照群と比較して、遠位大腿骨幹端における重度の骨梁減少がＯＶＸ群およびＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ群のそれぞれにおいて見出されたのに対して、ＭＬＮ４９２４（ＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ＋ＭＬＮ）群の処置は、ＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ処置によって引き起こされる骨梁減少を救うことができた（図６Ａ）。
次いで骨量減少マウスにおいて骨量／全組織体積、骨梁数および骨梁空間を含む、骨梁パラメーターに対するＭＬＮ４９２４の効果を調べ、結果を図６Ｂ〜６Ｄに示す。図６Ａの結果と同様に、ＭＬＮ４９２４は、ＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ群と比較してＯＶＸマウスにおいてｓＲＡＮＫＬ媒介性骨梁減少を顕著に救った。
ＣＴＸ−１は骨吸収のためのバイオマーカーとして役立つので、次いで特定の処置を受けたマウスの血清中のＣＴＸ−１のレベルを決定した。ＥＬＩＳＡ分析の結果により、ＯＶＸおよびＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ処置の両方は血清ＣＴＸ−１レベルを増加させたのに対して、ＭＬＮ４９２４の投与はＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ刺激性血清ＣＴＸ−１レベル上方制御を顕著に救ったことが示された（図６Ｅ）。
この実施例におけるデータにより、ＭＬＮ４９２４は、ｉｎ ｖｉｖｏで骨粗鬆症において骨量減少を予防するために異常骨吸収を顕著に阻害できることが実証された。
５．２ 生体力学特性
骨量減少は骨がもろくなるので、骨折しやすくなる。この実施例において、マウスをＯＶＸまたはＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬにより最初に処置して、骨量減少を引き起こし、次いでＭＬＮ４９２４を投与した。次いでマウスの大腿骨を、その生体力学特性を評価するために３点曲げによる骨幹部骨折試験に供した。
図７Ａ〜７Ｄのデータにより、対照群と比較して、モジュラス（図７Ａ）、破断点引っ張り（図７Ｂ）、降伏応力（図７Ｃ）および破断点荷重（図７Ｄ）などの関連する骨量減少パラメーターのレベルは、ＯＶＸおよびＯＶＸ＋ｓＲＡＮＫＬ群において顕著に減少したのに対して、ＭＬＮ４９２４処置は、これらのパラメーターのレベルが低下するのを防いだことが示された。これらのデータにより、ＭＬＮ４９２４は、ｉｎ ｖｉｖｏで骨粗鬆症における骨強度低減を防ぐために異常な骨量減少を顕著に抑制できることが示された。
まとめると、本開示の発明者らは、破骨細胞の形成および溶骨機能の阻害により異常骨吸収および／または骨粗鬆症を予防および／または治療する際に有用である、ネディレーション阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４またはＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ）によるネディレーション阻害の新規使用を特定した。したがって、本開示は、異常骨吸収および／または骨粗鬆症を予防および／または治療する方法であって、異常骨吸収および／もしくは骨粗鬆症の発症を予防するため、ならびに／または異常骨吸収および／もしくは骨粗鬆症に関連する症状を軽減／改善するために、有効量のネディレーション阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４またはＵＢＡ３ ｓｉＲＮＡ）が、それを必要とする対象に投与され得る、方法を提供する。
実施形態の上記の説明は例示のみとして与えられ、種々の修飾が当業者によってなされてもよいことは理解される。上記の明細書、実施例およびデータは、本発明の構造の完全な説明および例示的な実施形態の使用を提供する。本発明の種々の実施形態は、ある程度詳細に、または１つ以上の個々の実施形態を参照して上記されているが、当業者は、本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに開示された実施形態に対して多くの変更を行うことができる。

Claims (7)

  1. 有効量のＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害剤を含む、骨粗鬆症の予防および／または治療用医薬組成物。
  2. 前記ＮＡＥ阻害剤が、
    ＭＬＮ４９２４、ＴＡＳ４４６４、６，６’’−ビアピゲニン、シクロメタル化ロジウム（ＩＩＩ）錯体およびフラボカワインＡからなる群から選択される化合物、あるいは
    配列番号４もしくは６に記載のＲＮＡ配列、またはそれらに対応するＤＮＡ配列を含む核酸
    である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記核酸が、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 有効量が、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記ＮＡＥ阻害剤が、少なくとも７連続日の間、毎日投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 配列番号４もしくは６に記載のＲＮＡ配列、またはそれらに対応するＤＮＡ配列を含む合成核酸。
  7. 前記合成核酸が、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）である、請求項６に記載の合成核酸。
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