CN1837235A - 一种p53负调控分子及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种p53负调控分子及其编码基因。本发明所提供的p53负调控分子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制p53转录功能的蛋白质。本发明的p53负调控分子对p53的转录抑制作用受ATM的负调控，提示在ATM的调控网络中存在一条新的将信号从ATM向p53传递的支路。本发明不仅扩充了KRAB型锌指蛋白家族的成员，增加了对此类分子作用机制的了解；还为白血病及放射病的防治提供新的靶标和思路。

Description

一种p53负调控分子及其编码基因

技术领域

本发明涉及生物技术及医学领域中一种p53负调控分子及其编码基因。

背景技术

真核细胞在受到诸如电离辐射、肿瘤化疗药物等基因毒应激(genotoxin stress)损伤时，细胞作出最重要的细胞学反应有：一是起始DNA损伤检查点机制使细胞阻滞在G1/S期，赢得时间修复损伤，避免损伤的DNA进行复制；或/和阻滞在G2/M期，避免缺陷的染色体进一步分裂；二是启动细胞死亡的程序，清除带有病变倾向的细胞，避免危害机体。ATM(ataxia telangiectasia mutant，毛细血管扩张与共济失调综合征突变致病基因蛋白)是一种丝/苏氨酸激酶，可以感受DNA损伤等应激(stress)信号而激活，启动DNA损伤修复机制，通过细胞周期阻滞、细胞凋亡等过程维护机体基因组的稳定性，降低疾病及肿瘤的风险。ATM位于这种基因毒应激损伤反应网络的起始位置，能够对G1/S、G2/M检查点和Intra-S期进行调控，并参与DNA损伤引起的修复过程和凋亡过程。在过去几年中，许多实验室对ATM在DNA损伤与修复中的功能进行了深入而广泛的研究，已鉴定了近20个ATM的磷酸化底物，如参与G1/S期检查点调控的p53、MDM2、CHK2、RAD9、RAD17；参与G2/M期检查点调控的BRCA1、CHK2、CtIP；参与Intra-S期调控的NBS1、SMC1、FANCD2、CHK1和CHK2；参与DNA修复的ABL以及参与凋亡过程的TRF1等。ATM的这些磷酸化底物均在细胞周期的调控与DNA损伤修复中发挥了必不可少的作用，几乎每个成员的发现都在肿瘤和放射病的研究领域引发了研究热潮，并随后成为肿瘤和放射病治疗的靶点。

p53作为转录因子和抑癌基因，具有极其重要的生理、病理功能，同时，p53又是ATM的重要底物分子。当ATM激活以后，一方面它可以通过对p53的直接磷酸化激活p53，同时又可以通过对p53的一种抑制分子HDM2磷酸化使其解除对p53的抑制功能，增强p53的转录活性，从而促进下游的一些重要基因，如Gadd45、p21及PML等重要的周期调控分子和凋亡调控分子的表达，从而发挥周期抑制及促凋亡的功能。ATM和p53共同介导了DNA损伤修复网络的一条重要途径。

含KRAB(Krueppel-associated box)结构域的锌指蛋白也称KRAB型锌指蛋白，占人类基因组中所有锌指蛋白(799种)的三分之一(290种)，是最大的转录因子家族，其中超过220种在胚胎发育、细胞分化、细胞转化及细胞周期的调控中发挥重要功能，并随时间和空间的不同进行特异表达。其结构特征是N端含有一个KRAB结构域，C端含有多个C2H2型锌指结构。KRAB结构域由75个氨基酸组成，为一蛋白质-蛋白质相互作用区，即可以与多种协同转录抑制因子，如：KAP-1、HP1α，MOD1和MOD2等结合，也可以与多种转录因子如c-myc和BRCA1结合，作为转录因子和/或转录调控因子发挥依赖于DNA结合的转录抑制功能。C端锌指的数目不一，一般在3到40之间，参与特定DNA序列的识别，使KRAB结构域具有靶向性地发挥功能。KRAB型锌指蛋白尤其是功能相近的一些成员在基因组上成簇分布，且主要分布在3号、19号及X染色体上。近年来，随着对KRAB结构域转录抑制功能的阐明，此类蛋白引起了研究者越来越多的关注，多种具有重要功能的成员相继被克隆并进行了功能鉴定，如与BRCA1相互作用通过调节GADD45的表达调控细胞周期的ZBRK1；能够抑制c-myc活性的KRIM-1；通过与ZAK相互作用促进细胞增殖的ZZaPK等。但是，目前，对KRAB型锌指蛋白家族成员如何调控它们参与的多种生理功能了解的并不深入，因此对新型KRAB型锌指蛋白的研究不仅能丰富已有的KRAB型锌指蛋白家族，更有助于深入了解它们参与的各种重要功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种p53负调控分子及其编码基因。

本发明所提供的p53负调控分子，名称为KRANA(含KRAB结构域和19个锌指的ATM结合蛋白，Krab domain and nineteen zinc fingers-containing ATM-associatedprotein)，来源于人，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制p53转录功能的蛋白质。

序列表中的序列1由688个氨基酸残基组成。

KRANA为一新型的KRAB型锌指蛋白，含有典型的位于N端的KRAB结构域(自序列1的氨基端第4位至67位氨基酸残基)和19个C2H2型的锌指结构(自序列1的氨基端第138位至665位氨基酸残基)，18个SQ和12个TQ基序。自序列1的氨基端第16位丝氨酸残基、第68位丝氨酸残基和第264位丝氨酸残基为潜在的ATM底物位点。

KRANA的编码基因也属于本发明的保护范围。

KRANA的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列2由2999个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第225位-2291位碱基。

KRANA的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列3由51280个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第10641位-50587位碱基，含有5个外显子，4个内含子。KRANA的基因组基因染色体定位于19q13.12。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有KRANA编码基因的表达载体和细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

上述p53负调控分子的活性片段，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)自序列1的氨基端第1位至70位氨基酸残基(N1)；

2)自序列1的氨基端第1位至244氨基酸残基(N2)；

3)自序列1的氨基端第1位至514位氨基酸残基(N3)；

4)自序列1的氨基端第240位至688位氨基酸残基组成(C2)；

5)自序列1的氨基端第72位至688位氨基酸残基组成(C3)。

上述p53负调控分子活性片段的编码基因也属于本发明的保护范围。

含有上述p53负调控分子活性片段的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CO-IP)实验显示，在人胚肾HEK293细胞中内源的ATM可以共沉淀外源表达的KRANA，表明二者在体内能够结合；N端的三种截短体均能与ATM结合，而C端三种截短体均不能与ATM结合，表明N端的KRAB区是KRANA与ATM结合所必须的，而锌指区不介导二者的结合。Western blot和CO-IP结果表明，随着ATM活性的增加，其与KRANA的结合程度降低。这提示KRANA很可能特异地与低活性状态的ATM结合。

报告基因实验结果表明KRANA可以显著地抑制p53、雌激素受体(ER)、CREB和ELK1的转录活性，且这种抑制功能具有量效关系，但对c-jun和NF-κB的活性没有显著影响。表明KRANA可以作为转录调控因子选择性的抑制某些重要转录因子的功能。KRANA对带有p21调控区的报告质粒具有明显的抑制功能。HEK293细胞中KRANA的过表达能够降低p21的蛋白表达量；在p53缺陷的肺小细胞癌细胞系H1299细胞中过表达KRANA对p21的表达水平没有影响，而再次过表达p53后，KRANA对p21表达的抑制作用恢复，表明KRANA不是作为转录因子直接调控p21的表达，而是通过影响p53的转录功能而调控p21。这些结果再次证实KRANA具有对p53的转录抑制功能。

为了揭示KRANA分子中发挥抑制p53活性的功能区，将KRANA的六个截短体分别与p53的报告基因质粒共转染HEK293细胞，结果表明N端的三个截短体和C端较长的两个截短体C2和C3均具有转录抑制功能，提示KRANA的N端和C端有独立的转录抑制功能区域。

KRANA作为ATM潜在的磷酸化底物，并且与ATM的结合程度与ATM的活性成反比，这提示ATM的磷酸化可能影响KRANA的转录抑制活性。ATM激活后能够部分抑制KRANA对p53的转录抑制功能，因此激活p53的功能。

RT-PCR和Northern-blot分析显示KRANA只有一个转录本，且在多种血液病来源的细胞系中(如Jurkat，MOLT4，SKO-007)特异表达。

本发明提供了一种新的p53负调控分子，它对p53的转录抑制作用受ATM的负调控，提示在ATM的调控网络中存在一条新的将信号从ATM向p53传递的支路。此支路的存在不仅是对ATM调控网络的补充和完善，而且可能在KRANA特异表达的细胞和组织中对造血调控和DNA损伤信号的传导发挥重要的功能。本发明不仅扩充了KRAB型锌指蛋白家族的成员，增加了对此类分子作用机制的了解；更为重要的是通过对ATM底物知识的扩展，对p53调控机制的完善，增进了对ATM参与的多种生理功能与疾病如白血病、放射病等机制的了解。同时通过揭示KRANA在调控细胞周期自稳状态与DNA损伤修复过程中发挥的功能，为白血病及放射病的防治提供新的靶标和思路。

附图说明

图1为KRANA的19个锌指的对比图

图2为KRANA分子中DNA损伤激酶磷酸化位点的示意图

图3为免疫共沉淀的方法检测KRANA与内源ATM的结合

图4a-图4b为免疫共沉淀的方法确定KRANA与ATM结合的区域

图5为HS、MMS、IR及wortmannin处理后KRANA与ATM结合的变化

图6A为KRANA对转录因子p53转录活性的影响

图6B为KRANA对转录因子ER转录活性的影响

图6C为KRANA对转录因子ELK1转录活性的影响

图6D为KRANA对转录因子CREB转录活性的影响

图6E为KRANA对转录因子c-jun转录活性的影响

图6F为KRANA对转录因子NF-κ转录活性的影响

图7为KRANA对p21表达的抑制功能

图8为在p53缺陷的细胞系肺小细胞肺癌细胞H1299中，KRANA依赖p53对p21表达水平的影响

图9为KRANA具有对p53转录抑制功能区域的确定

图10为HS、MMS、IR及wortmannin处理后KRANA对p53转录抑制功能的变化

图11为RT-PCR技术对KRANA细胞和组织表达谱的确定

图12KRANA的亚细胞定位

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

pCMV-Myc真核表达质粒购自Clontech公司。RNA提取试剂TRIZOL、SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase及转染试剂LipofecamineTM 2000为Invitrogen产品；T₄ DNA连接酶购自Promega公司；限制性内切酶Not I，Sal I，KpnI及PyrobestTM DNA聚合酶购自TaKaRa公司。寡核苷酸由北京奥科生物技术公司合成，DNA序列测定由上海博亚公司完成。c-Myc单克隆抗体购自Clontech公司，ATM多克隆抗体抗体购自CALBIOCHEM公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中山公司。western发光试剂盒购自PIERCE公司，双报告基因荧光素酶检测试剂盒、pRL-CMV水木荧光素酶报告基因质粒购自Promega公司。p21、β-actin抗体购自Santa Cruze公司。随机引物标记试剂盒购自Promega公司。α-32P-dCTP购自亚辉公司。

实施例1、KRANA及其编码基因的获得

(1)将1086种转录因子中各特征性的domain、motif或sequence pattern进行归纳，获得其调和序列。在EST数据库中搜索调和序列的特定程序，在已拼接的HFL22w EST数据库的未知基因序列中搜索新基因对应的EST序列。其中搜索到的一条拼接号为4553的序列，全长2999bp(序列2)。利用NCBI的ORF finder程序进行开放阅读框(ORF)分析，为自序列1的5′端第225位-2291位碱基。

(2)RT-PCR扩增

使用TRIZOL一步法提取Jurkat细胞总RNA，取2μg总RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system来制备cDNA。整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。

5’端正向引物为引物1：5’-t ct g tcg acc atg gct cgg aaa tta gtg-3’；3’端反向引物为引物2：5’-aat gcggccgctcacatgtaaacttgtgagc-3’(其中带下划线部分的碱基为两端的Sal I与Not I识别位点)。

以上述引物1和引物2为引物，按照常规方法进行PCR扩增，扩增条件为先94℃5min，1个循环；接着94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，5个循环；然后94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，25个循环；最后72℃ 7min，1个循环。将PCR产物与pCMV-Myc(均经Sal I与Not I酶切)连接后，转入E.coli JM109感受态细胞中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆(即pCMV-Myc-KRANA质粒)，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆测序鉴定，结果表明插入的cDNA片段由2999bp组成，具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为KRANA。它的开放阅读框架(ORF)为自序列2的5′端第225位-2291位碱基，编码含688个氨基酸的蛋白(KRANA，序列1)。KRANA定位于19q13.12，其基因组序列含有5个外显子，4个内含子，其外显子和内含子的剪接形式如表1所示，具有序列表中序列3的核苷酸序列。表1中，交界区的小写字母表示外显子，大写字母表示内含子。

                表1.KRANA的基因组基因中外显子-内含子的交界区

内含子	大小(bp)	5′-交界区	3′-交界区
				1	1774	tctgtcaagGTAGGAGTG	TGAGAGTAGagcccagag
2	8650	atgtccaagGTGAGTATT	CCTCCGTAGctctgcatt
				3	1866	atggctcggGTAAATTGG	TGTTGTTAGaaattagtg
4	36006	tatcactagGTAAGGAAT	ATCTTTCAGacttgcctt

生物信息学分析显示，KRANA为一新型的KRAB型锌指蛋白，含有典型的位于N端的KRAB结构域(自序列1的氨基端第4位至67位氨基酸残基)和19个C2H2型的锌指结构(自序列1的氨基端第138位至161位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第166位至189位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第194位至217位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第222位至245位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第250位至273位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第278位至301位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第306位至329位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第334位至357位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第362位至385位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第390位至413位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第418位至441位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第446位至469位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第474位至497位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第502位至525位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第530位至553位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第558位至581位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第586位至609位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第614位至637位氨基酸残基序列；自序列1的氨基端第642位至665位氨基酸残基序列)(图1)。19个锌指之间极为保守，其一致序列是PYECKECGKAFXRGSQLS/TQHQRIH。与其它KRAB型锌指蛋白不同的是，KRANA含有18个SQ和12个TQ基序，SQ/TQ是ATM与Rad3相关蛋白(ATM-and Rad3-relatedprotein，ATR)/DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)的磷酸化位点。经MotifScanner数据库进行严谨性分析，其中的S16、S68和S264为潜在的DNA损伤激酶底物位点(图2中，DNA dam kin为DNA损伤激酶)。

实施例2、KRANA与ATM的结合

(1)KRANA与ATM在体内结合的确证

通过免疫共沉淀(IP)实验检测KRANA与ATM的体内结合，具体方法如下：

将pCMV-Myc-KRANA利用转染试剂LipofecamineTM 2000(Invitrogen)转染人胚肾HEK293细胞24h后，25cm²培养瓶以400ul ATM裂解缓冲液(100mM Tris-Cl(pH 7.5)，300mM NaCl，2％(V/V)Tween 20，0.4％ NP-40，20％甘油；补加1mM Na₃VO₄(1∶100)，1mM DTT(1∶100)和蛋白酶抑制剂(1∶20))裂解，冰浴中超声破碎细胞。12000rpm，离心10min，去沉淀，收集上清(总蛋白提取液)。取出50ul总蛋白提取液备western(IB)分析用。其余总蛋白提取液加入5ul ATM多克隆抗体抗体(购自CALBIOCHEM公司)，4℃ 3h混合器上混匀。加protein A/G-agarose 40ul，4℃放置8h，3000rpm离心5min，弃上清液，沉淀再加ATM裂解缓冲液洗涤，3000rpm离心5min，弃上清，重复三次，得到免疫沉淀(IP)。免疫沉淀悬于50ul 1×SDS-PAGE上样缓冲液中，100℃水浴5min，3000rmp离心5min，吸上清上样，进行10％SDS-PAGE电泳。同时取备western分析(IB)用的总蛋白提取液在同一张胶上的其它泳道进行10％SDS-PAGE电泳。电泳完毕，经电转移(Bio-Rad，80mA，3h)至硝酸纤维素膜上，用3％BSA封闭2小时后，按1∶1000稀释的c-Myc单克隆抗体(购自Clontech公司)室温孵育2小时，TBST洗3次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(购自北京中山公司)，室温50min，加入western发光试剂盒(购自PIERCE公司)中的发光底物进行显色。结果如图3所示，表明人胚肾HEK293细胞内源的ATM可以共沉淀外源表达的KRANA，表明二者在体内能够结合。图3中，泳道1为未转染pCMV-Myc-KRANA的细胞总蛋白提取液，泳道2为转染pCMV-Myc-KRANA的细胞总蛋白提取液，泳道3为未转染pCMV-Myc-KRANA的细胞的ATM的免疫沉淀，泳道4为转染pCMV-Myc-KRANA的细胞的ATM的免疫沉淀，泳道2中的箭头示pCMV-Myc-KRANA表达的融合蛋白Myc-KRANA，泳道4中的箭头示pCMV-Myc-KRANA表达的融合蛋白Myc-KRANA和ATM的免疫沉淀。

(2)KRANA与ATM结合区域的确定

为了确定KRANA与ATM结合的区域，根据KRAB结合域的有无及锌指数目的多少构建了KRANA的六种截短体N1(由自序列1的氨基端第1位至70位氨基酸残基组成，只含有KRAB结构域)、N2(由自序列1的氨基端第1位至244位氨基酸残基组成，含KRAB结构域与N端3个锌指)、N3(由自序列1的氨基端第1位至514位氨基酸残基组成，含KRAB结构域与N端13个锌指)、C1(由自序列1的氨基端第507位至688位氨基酸残基组成，只保留C端5个锌指)、C2(由自序列1的氨基端第240位至688位氨基酸残基组成，只保留C端15个锌指)和C3(由自序列1的氨基端第72位至688位氨基酸残基组成，含有全部19个锌指)。将六种截短体的编码基因分别单转染HEK293细胞，利用CO-IP的方法检测其与ATM的结合。具体方法如下：

以pCMV-Myc-KRANA为模板，在如下引物的引导下，扩增N1，N2，N3，C1，C2和C3的编码基因。

引物1：5’-cgc gtcgaccatggctcggaaattagt-3’(带下划线碱基为Sal I识别位点)

引物2：5’-ctc ggtaccggatccatgtaaacttgtga-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)

引物3：5’-ctc ggtaccggatccattgggataattctgt-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)

引物4：5’-ctc ggtaccggatcctgaactttttgatgtcg-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)

引物5：5’-ctc ggtaccggatcctgagtaaaggccattct-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)

引物6：5’-cgc gtcgaccatgagtgacagactt-3’(带下划线碱基为Sal I识别位点)

引物7：5’-cgc gtcgaccatgcatcaaaaagtttcatac-3’(带下划线碱基为Sal I识别位点)

引物8：5’-cgc gtcgaccatggaatgtagaatggcc-3’(带下划线碱基为Sal I识别位点)

其中引物1和3为N1编码基因的上下游引物；引物1和4为N2编码基因的上下游引物；引物1和5为N3编码基因的上下游引物；引物8和2为C1编码基因的上下游引物；引物7和2为C2编码基因的上下游引物；引物6和2为C3编码基因的上下游引物。

将PCR产物与pCMV-Myc(均经Sal I与KpnI酶切后)连接后，转入E.coli JM109感受态细胞中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆，经测序鉴定，得到六种KRANA截短体的阳性克隆pCMV-Myc-N1，pCMV-Myc-N2，pCMV-Myc-N3，pCMV-Myc-C1，pCMV-Myc-C2和pCMV-Myc-C3。

将pCMV-Myc-N1，pCMV-Myc-N2，pCMV-Myc-N3，pCMV-Myc-C1，pCMV-Myc-C2和pCMV-Myc-C3分别转染HEK 293细胞，参照步骤(1)的方法进行免疫共沉淀结合Western分析，结果如图4a和图4b所示，表明N端的三种截短体均能与ATM结合，而C端三种截短体均不能与ATM结合，说明了N端的KRAB区决定了KRANA与ATM的结合，N端的KRAB区是KRANA与ATM结合所必需的，而锌指区不介导二者的结合。图4a和图4b中，泳道Ly表示细胞总蛋白提取液，泳道IP表示免疫沉淀，箭头示Myc与六种KRANA截短体和ATM的免疫沉淀；图4a中，Lsectin为一种膜蛋白，作为不与ATM结合的阴性对照；图4b中，FL表示KRANA的全长氨基酸序列。

(3)检测HS、MMS、IR及wortmannin处理后KRANA与ATM结合的变化

为分析KRANA与ATM的结合是否与其激活状态相关，选择了影响ATM活性的因素：作为ATM激活条件的电离辐射(ionizing radiation，IR)(20Gy)、热休克(heat shcok，HS)(42℃孵育2h)和DNA烷化剂MMS(0.05％孵育2h)以及作为ATM激酶抑制剂的wortmannin(100nmol/L预先处理1h)。将KRANA转染HEK293细胞后，分别给予如上处理，再进行免疫共沉淀。通过ATM底物p53的Ser15位点的磷酸化水平反映ATM的激活程度。具体方法如下：

A.IR、HS、MMS、IR及wortmannin处理的条件：

IR处理为细胞经20Gy照射2h收细胞；HS处理为将细胞42℃孵育2h后再在37℃孵育3h后收细胞；MMS处理为含0.05％(质量百分含量)MMS的培养基处理细胞2h后收细胞；W处理条件为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后收细胞；HW处理为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后再将细胞42℃孵育2h后再在37℃孵育3h后收细胞，IW处理为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后再经20Gy照射2h收细胞，MW处理为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后再经含0.05％ MMS的培养基处理细胞2h后收细胞。

B.检测HS、MMS、IR及wortmannin处理后KRANA与ATM结合的变化

将pCMV-Myc-KRANA转染HEK293细胞24h后，分别使用HS、MMS、IR及联合wortmannin处理细胞，参照步骤(1)的方法进行免疫共沉淀结合Western分析。Western blot结果显示HS和MMS处理后可以导致p53S15位磷酸化水平的显著上升，wortmannin可以降低p53S15位的本底磷酸化水平，而HEK293细胞对于IR不敏感，ATM没有明显的激活。几种处理没有影响p53的蛋白水平。免疫共沉淀结果如图5所示，表明Wortmannin处理细胞，增强ATM与KRANA的结合；HS和MMS处理细胞后ATM与KRANA相互作用消失；加入Wortmannin逆转HS对ATM的激活，与KRANA的相互作用恢复，但对MMS的逆转失败；而由于HEK293细胞对IR不敏感，所以IR对HEK 293细胞中ATM与KRANA的作用不变。图5中，泳道Ly表示细胞总蛋白提取液，泳道IP表示免疫沉淀；C表示空白对照，未经处理的转染pCMV-Myc-KRANA的HEK293细胞。这些结果清楚地表明，随着ATM活性的增加，其与KRANA的结合程度降低。这提示KRANA很可能特异地与低活性状态的ATM结合。

实施例3、KRANA的转录抑制功能

已有研究表明，KRAB型锌指蛋白既可以与转录抑制因子如KAP-1、HP1α、MOD1和MOD2等结合，也可以与转录因子如c-myc和BRCA1结合，其本身作为转录因子和/或转录调控因子发挥依赖于DNA的转录抑制功能。为了研究KRANA的转录抑制功能，选择了几种在周期调控、生长及代谢方面比较具有重要功能的转录因子，检测KRANA是否对其活性有调控作用。具体方法如下：

(1)KRANA对多种转录因子p53、ER、ELK1、CREB、c-jun和NF-κB转录活性的影响

将不同浓度的pCMV-Myc-KRANA(实施例1)与含各种反应元件的荧光素酶表达质粒p21-luc(含有p21启动子区，见Cell，1993；75：817-25)，p53的报告基因质粒pG13L(具有13个串连排布的p53的反应元件，见Nature Genetics，1992；

1：45-49)，AP-1-luc、CREB-luc、ELK1-luc(购自Stratagene公司)，pERE-Luc(见MolEndocrinol.1997；11：353-65)或NF-KB-luc(见EMBO J.1990；9(12)：3933-44.)共转染HEK293细胞，36h后，收细胞，按照双报告基因荧光素酶检测试剂盒(Promega)推荐的方法检测荧光素酶的活性。HEK293细胞中无雌激素受体的表达，同时转染ER的表达质粒，pER(见Mol Endocrinol.1997；11：353-65)。一般情况下，每组做3复孔，每次数据重复3次，以测定的萤火虫荧光素酶对水母荧光素酶(RL，pRL-CMV水母荧光素酶报告基因质粒购自Promega公司)的比值为准。

p53、ELK1、CREB、c-jun和NF-κB转录因子组的转染量如表2和表3。

表2.KRANA对p53-Luc转录抑制功能的实验的反应体系：

pRL-CMV	pG13L	pCMV-Myc	pCMV-KRANA
				10ng	5ng	0.4μg	-
10ng	5ng	0.35μg	0.05μg
				10ng	5ng	0.3μg	0.1μg
10ng	5ng	0.2μg	0.2μg
				10ng	5ng	-	0.4μg

表3.KRANA对ELK1、CREB、c-jun和NF-κB转录抑制功能的实验反应体系：

pRL-CMV	报告基因的转染量	pCMV-Myc	pCMV-KRANA
				10ng	0.1μg	0.4μg	-
10ng	0.1μg	0.35μg	0.05μg
				10ng	0.1μg	0.3μg	0.1μg
10ng	0.1μg	0.2μg	0.2μg
				10ng	0.1μg	-	0.4μg

ER转录因子组的反应体系为在表3的反应体系中再加入0.05μg pER。

结果如图6A-图6F所示，表明KRANA可以明显的抑制p53、雌激素受体(ER)、CREB和ELK1的转录活性，且具有剂量效应，但对c-jun和NF-κB的活性无影响。说明KRANA作为转录调控因子具有选择性的转录抑制功能。

(2)KRANA对含有p21启动区报告质粒及p21表达的抑制功能

A.将不同浓度的pCMV-Myc-KRANA与p21-luc(含有p21启动子区，见Cell，1993；75：817-25)共转染HEK293细胞，36h后，收细胞，按照双报告基因荧光素酶检测试剂盒(Promega)推荐的方法检测荧光素酶的活性。质粒转染量如表4：

表4、质粒转染量

pRL-CMV	p21-Luc	pCMV-Myc	pCMV-KRANA
				10ng	0.1μg	0.4μg	-
10ng	0.1μg	0.35μg	0.05μg
				10ng	0.1μg	0.3μg	0.1μg
10ng	0.1μg	0.2μg	0.2μg
				10ng	0.1μg	-	0.4μg

结果表明KRANA能抑制p21-luc中荧光素酶的表达，且具有剂量效应。

B.KRANA对HEK293细胞(HEK293细胞具有p21、p53的内源表达)中p21表达水平的影响

将不同浓度的pCMV-Myc-KRANA转染HEK293细胞，24h后收细胞，利用Western分析p21、p53、KRANA自身及β-actin的表达量。结果如图7所示，表明随KRANA转染量的增加，p53与β-actin的量无变化，但p21的表达量逐渐降低，从转录水平间接反映KRANA对p21活性的影响。

(3)在H1299细胞中KRANA依赖p53对p21表达水平的影响

在H1299细胞(p53缺陷的肺小细胞肺癌细胞)中分别转染pCMV-Myc-KRANA、含有p53的表达质粒pCMV-p53(见Science，1990；249：912-5))及将两种质粒同时转染，36h后，收集细胞检测p21、p53、KRANA以及β-actin的表达量。结果如图8所示，表明KRANA依赖p53发挥对p21的抑制功能，说明KRANA不是作为转录因子直接调控p21的表达，而是通过影响p53的转录功能而调控p21。图8中，泳道1为未转染质粒的H1299细胞，泳道2为转染pCMV-Myc-KRANA的H1299细胞，泳道3为转染pCMV-p53的H1299细胞，泳道4为转染pCMV-p53和pCMV-Myc-KRANA的H1299细胞。

(4)KRANA具有对p53转录抑制功能区域的确定

将KRANA的六种截短体pCMV-Myc-N1，pCMV-Myc-N2，pCMV-Myc-N3，pCMV-Myc-C1，pCMV-Myc-C2和pCMV-Myc-C3分别与pG13L(见Nature Genetics，1992；1：45-49)共同转染HEK293细胞，按照双报告基因荧光素酶检测试剂盒(Promega)推荐的方法检测荧光素酶的活性，检测它们对p53-luc的抑制功能，确定KRANA的转录抑制功能区域。结果如图9所示，表明N端的三个截短体和C端较长的两个截短体C2和C3均具有转录抑制功能，说明KRANA的N端和C端有独立的转录抑制功能区域。

(5)HS、MMS、IR及wortmannin处理后KRANA对p53转录抑制功能的变化

将pCMV-Myc-KRANA转染HEK293细胞，收集细胞前，分别使用HS、MMS、wortmannin及联合wortmannin处理细胞，按照双报告基因荧光素酶检测试剂盒(Promega)推荐的方法检测荧光素酶的活性，检测它们对p53-luc的抑制功能，确定KRANA的转录抑制功能的变化。其中，HS处理(H)为将细胞42℃孵育2h后再在37℃孵育3h后收细胞；W处理条件为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后收细胞；HW处理为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后再将细胞42℃孵育2h后再在37℃孵育3h后收细胞，MW处理为含100nmol/L wortmannin的培养基处理细胞1h后再经0.05％的MMS的培养基处理细胞2h后收细胞。结果如图10所示，表明HS处理后，KRANA的转录抑制活性降低了约20％，wortmannin的预先处理阻断了这种作用；MMS处理后p53的活性几乎完全丧失，而wortmannin部分逆转MMS的活性后使得KRANA的转录抑制活性降低了近30％。说明ATM激活后能够部分抑制KRANA对p53的转录抑制功能，因此激活p53的功能。图10中，C表示空白对照，未经处理的转染pCMV-Myc-KRANA的HEK293细胞。

实施例4、KRANA在细胞和组织中的表达谱

(1)RNA的提取：

使用TRIZOL一步法分别提取Jurkat，MOLT4，HL-60，U-937，AHH-1，K-562，Daudi，Raji，Mo7-e(原巨核细胞来源的肿瘤细胞系，购自协和细胞库)，sko-007，SMMC-7721，HEK-293，HeLa，HepG2，MCF-7这15种细胞系和均取自22周孕龄的胎儿的胎儿心脏，胎儿肺脏，胎儿脾，胎儿肾脏，胎儿肠，胎儿胃的总RNA。

(2)RT-PCR对KRANA在多种细胞系及组织中的鉴定

A.cDNA的制备：取2μg RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system来制备cDNA。整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。

B.PCR使用引物与条件同实施例1。

结果如图11所示，表明KRANA在Jurkat，MOLT4，SKO-007这三种血液病来源的细胞系中特异表达。图11中，1：Jurkat；2：MOLT4；3：HL-60；4：U-937；5：AHH-1；6：K-562；7：Daudi；8：Raji；9：Mo7-e；10：sko-007；11：SMMC-7721；12：HEK-293；13：HeLa；14：HepG2；15：MCF-7；16：胎儿心脏；17：胎儿肺脏；18：胎儿脾；19：胎儿肾脏；20：胎儿肠；21：胎儿胃；22为Marker(DL2000，从100bp到2000bp)。

实施例5、KRANA的亚细胞定位

(1)带有绿色荧光标签的KRANA表达质粒的构建：

以5’-t ct g tcg acc atg gct cgg aaa tta gtg-3’(带下划线的碱基为Sal I识别位点)和5’-ca g gg atc cca cat gta aac ttg tga gc-3(带下划线的碱基为BamHI识别位点)为上下游引物，以pCMV-Myc-KRANA为模板，按照常规PCR方法进行扩增、回收。回收后经Sal I和BamH I酶切与经同样酶切后的pEGFP-C3质粒(购自Clontech公司)连接，转入E.coli JM109感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆，经测序鉴定，得到含有KRANA编码基因的阳性克隆pEGFP-C3-KRANA。

(2)KRANA亚细胞定位的观察：

利用LipofecamineTM 2000(Invitrogen)将pEGFP-C3-KRANA转染MCF-7细胞，24h后，在激光共聚焦显微镜下观察KRANA的定位，并拍照。同时使用DAPI(购自Roche公司)染核，以明确定位。结果如图13所示，表明KRANA多以均匀的形式分布在细胞核内，偶见点状的大颗粒分布。左侧图片为GFP-KRANA融合蛋白的绿色荧光，中间图片为DAPI染核的结果，右侧图片为二者叠加的结果。

序列表

<160>3

<210>1

<211>688

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

Met Ala Arg Lys Leu Val Met Phe Arg Asp Val Ala Ile Asp Phe Ser

1               5                   10                  15

Gln Glu Glu Trp Glu Cys Leu Asp Ser Ala Gln Arg Asp Leu Tyr Arg

            20                  25                  30

Asp Val Met Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Leu Val Ser Leu Asp Leu Pro

        35                  40                  45

Ser Arg Cys Ala Ser Lys Asp Leu Ser Pro Glu Lys Asn Thr Tyr Glu

    50                  55                  60

Thr Glu Leu Ser Gln Trp Glu Met Ser Asp Arg Leu Glu Asn Cys Asp

65                  70                  75                  80

Leu Glu Glu Ser Asn Ser Arg Asp Tyr Leu Glu Ala Lys Gly Lys Met

                85                  90                  95

Glu Lys Gln Gln Glu Asn Gln Lys Glu Tyr Phe Arg Gln Gly Met Ile

            100                 105                 110

Ile Tyr Asp Lys Met Ser Ile Phe Asn Gln His Thr Tyr Leu Ser Gln

        115                 120                 125

His Ser Arg Cys His Ser Thr Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Lys Glu Cys

    130                 135                 140

Gly Lys Ala Phe Arg Arg Ala Ser His Leu Thr Gln His Gln Ser Ile

145                 150                 155                 160

His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe

                165                 170                 175

Ser Arg Asp Ser Gln Leu Ser Leu His Gln Arg Leu His Thr Gly Glu

            180                 185                 190

Lys Pro Tyr Ala Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser

        195                 200                 205

Gln Leu Ile Leu His His Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Arg Ser Ser Gln Leu Thr Arg

225                 230                 235                 240

His Gln Lys Val His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys

                245                 250                 255

Gly Lys Ala Phe Thr Gln Asn Ser Gln Leu Thr Leu His Gln Arg Leu

            260                 265                 270

His Thr Gly Glu Lys Leu Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Arg Lys Val Phe

        275                 280                 285

Thr Gln Leu Ser Gln Leu Ile Leu His Lys Arg Ile His Thr Gly Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Cys Gly Ser

305                 310                 315                 320

Gln Leu Ser Gln His Gln Lys Ile His Asn Gly Glu Lys Pro Tyr Glu

                325                 330                 335

Cys Lys Glu Cys Gly Arg Ala Phe Ile Arg Gly Ser Leu Leu Met Gin

            340                 345                 350

His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Glu Glu Cys

        355                 360                 365

Gly Lys Ala Phe Ile Arg Gly Ser Gln Leu Thr Gln His Gln Arg Ile

    370                 375                 380

His Thr Asn Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Met Phe

385                 390                 395                 400

Ser His Gly Ser Gln Leu Thr Gln His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu

                405                 410                 415

Lys Pro Tyr Gln Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Gly Ser

            420                 425                 430

Leu Leu Thr Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu

        435                 440                 445

Cys Lys Glu Cys Gly Lys Thr Phe Ser Arg Gly Ser Glu Leu Thr Gln

    450                 455                 460

His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys

465                 470                 475                 480

Gly Lys Ser Phe Ile Arg Gly Ser Gln Leu Thr Gln His Gln Arg Ile

                485                 490                 495

His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Arg Met Ala Phe

            500                 505                 510

Thr Gln Ser Ser His Leu Ser Gln His Gln Arg Leu His Thr Gly Glu

        515                 520                 525

Lys Pro Tyr Val Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ala Arg Gly Leu

    530                 535                 540

Leu Leu Ile Gln His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln

545                 550                 555                 560

Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Arg Gly Ser Gln Leu Thr Gln

                565                 570                 575

His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys

            580                 585                 590

Gly Lys Ala Phe Ser His Gly Ser Gln Leu Thr Leu His Gln Arg Ile

        595                 600                 605

His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Arg Glu Cys Arg Lys Ala Phe

    610                 615                 620

Thr Gln Ser Ser His Leu Ser Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu

625                 630                 635                 640

Lys Pro Tyr Gln Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Arg Gly Ser

                645                 650                 655

Gln Leu Thr Gln His Gln Arg Ile His Ile Ser Glu Lys Ser Phe Glu

            660                 665                 670

Tyr Lys Glu Cys Gly Ile Asp Phe Ser His Gly Ser Gln Val Tyr Met

        675                 680                 685

<210>2

<211>2999

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

ggcacgaggc ttggctccgc acctgctggg ctggcgaacc cgaaattggg cttggaaccc    60

gggagccaga tcttggaccc tgaactgcac ctctgtcaag agcccagagg agaaagaatg    120

gctgtttcag tagcaatgtc caagctctgc attctccaga ctctgtgctt tcctaagata    180

ggaacccaga agaggactga tcatttcttg cagctctaaa aaccatggct cggaaattag    240

tgatgttcag ggatgttgcc attgacttct ctcaggaaga gtgggaatgc ctggactctg    300

ctcagagaga tttgtataga gatgtgatgt tggagaacta tagcaacttg gtatcactag    360

acttgccttc aaggtgtgca agtaaggact tatctccaga aaagaacact tatgaaacag    420

aattatccca atgggaaatg agtgacagac ttgaaaactg tgatcttgaa gagtccaatt    480

ccagggatta tttggaagcc aaaggcaaga tggagaagca acaagaaaat cagaaggaat    540

atttcaggca agggatgatc atatatgaca aaatgtccat tttcaaccag catacttact    600

tatctcaaca ttcaagatgt cattctactg agaaacccta taaatgtaag gaatgtggga    660

aagccttcag acgagcctca cacctaacac aacatcaaag tattcatact ggtgaaaaac    720

cctatgaatg taagcaatgc gggaaggcct ttagtcgtga ttcacaactc agtcttcatc    780

agagacttca tactggtgag aaaccctatg catgtaagga atgtgggaag gcctttactc    840

aaagctcaca acttatttta catcatagaa ttcatactgg tgaaaaacca tataaatgtg    900

aagaatgtgg gaaagccttt attcgtagct cacaacttac ccgacatcaa aaagttcata    960

ctggtgagaa accttatgaa tgtaaagaat gtgggaaggc ctttactcag aattcacaac    1020

ttacactaca ccagagactt catactggtg aaaagctcta tgaatgtaaa gaatgtagga    1080

aggtctttac tcagctctca caacttattc tgcataagag aattcatacc ggtgagaaac    1140

cctatgaatg taaggaatgt ggaaaagctt ttatttgtgg ctcacagctt tctcaacatc    1200

agaaaattca taatggggaa aaaccatatg aatgtaagga atgtggaagg gcctttattc    1260

ggggctcact actgatgcaa catcagagga ttcatactgg tgaaaaaccc tataaatgtg    1320

aagaatgtgg gaaggccttt atccgtggct cacaacttac tcaacaccag agaattcaca    1380

ccaatgaaaa gccctatgaa tgtaaggaat gtggaaagat gtttagtcat ggctcacaac    1440

ttactcaaca tcagagaata cacactggtg agaaacccta tcaatgtaag gaatgtggaa    1500

aagcgtttaa tcgtggctca ctccttacac gacaccagag gattcatact ggtgagaaac    1560

cctatgaatg taaagaatgt ggaaaaacct ttagtcgtgg ctcagaactt actcaacatg    1620

agcgaattca cacaggtgag aaaccctatg aatgtaagga atgtgggaaa tcttttattc    1680

gtggttccca gcttactcaa catcagagaa tccatactgg tgagaaacct tatgaatgta    1740

aagaatgtag aatggccttt actcagagtt cacatctttc ccaacatcaa agacttcaca    1800

ctggtgagaa accctatgtg tgtaatgaat gtggaaaggc ctttgcgcgt ggcttactac    1860

ttatacaaca tcagagaatt catactggtg agaaaccata tcaatgtaag gaatgtggga    1920

aagcctttat tcgtggttca cagttgactc aacatcagcg aattcacact ggagaaaaac    1980

cctatgaatg caaggagtgt ggcaaggcct ttagtcatgg ctctcagctt actctacatc    2040

agagaatcca tactggtgag aagccctatg aatgcagaga atgtagaaag gcctttactc    2100

agagttcaca tctttctcgg catcagagaa ttcatactgg tgagaaacca tatcaatgta    2160

aggaatgtgg gaaggccttt actcgtggtt cacagctaac tcaacatcag agaattcata    2220

tcagtgagaa atcttttgaa tataaggaat gtgggattga ctttagtcat ggctcacaag    2280

tttacatgtg aattgtctga ttatttgaga tcactatgaa gaggttctct ggttgttagc    2340

agcaaagaat tctcacaaat gtgaatatgg gcgcacattt gcctcataaa gcacagcatc    2400

agataattta tgtgagagaa aatggtagtg tcattcatat agaaaaacat cattactgga    2460

aacctattaa acattagcaa attggagaat agttttaata tagtaaatgt aggaagccct    2520

ttagccatat tgaaaacaaa tatctttttc aacgttatct tagctctact agttgatctt    2580

tttgttatat gtatcatgat acttaacctc taccttggtt taatcatttt aagatagacc    2640

taagtatatt acctttattg taagattctt ggaagtatta tgtaagttat tacatgtaaa    2700

agctcttaga atggtgcctt gaacgtagca taccacaaat attagctacc attttcacta    2760

gtgttatttt agagaatttg catgagagga gagtacttat gagtataatg aatattgaga    2820

aatcttttat caacacatcc aagatgactt ggttgggggg cactgtatgc cataatgaat    2880

gtgagaaagc tgtcatttaa atctcatcca ttattgctat aagaggaaat tcatactgtt    2940

aaaaaaaaaa aaacccagtg gatataatca gtgtattatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa     2999

<210>3

<211>51280

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

gcttggctcc gcacctgctg ggctggcgaa cccgaaattg ggcttggaac ccgggagcca    60

gatcttggac cctgaactgc acctctgtca aggtaggagt gtccgggatg ccggagcgga    120

cacgcgcgga gaaagcgtcg ctggggttac tcgtgtggcc gtgtctccgg ttttgtgtgc    180

aggctacagc ctgcctggta ttggcgactg cctgtgcata cacgactgga cgtgtgtggc    240

tgtggttttg tgtatgagca tttgtatgag tgtgagttgt gactctgagg gtgtttgtga    300

ctgtttgctt acctggctgg gatatactta tgtgactgtg attttatgtg tgccgcgtgt    360

ataattgggg tttgcctgtg actatgaagt gtgtgacagt tgtgacaaga gtgtttggat    420

gttcttgtgt cactttgagg ttgtgtgtaa acctgatatc gtgggatgga tttgccagta    480

aatttaaggt gtgtgacagt gttgctgtga cacggtgttt attaccgcgt gtttccctga    540

tttcgtactg ggttgggtga ctgtctgatt gtgtgtgact gtggggttgt gtgtgctgtt    600

ttcatgactg tgtaaagaga ctaaaattgc agctttgaaa gggtgttttt ggcggtatgt    660

gtctctgaca aggtgcttgg atgtaattat atgccttgta cttaatggga ttttgtttga    720

gacaaggtgg tctaacaatg tagcataatt gggtgattgt gcctctagct gtgtaactgt    780

ggaaatgtga ttatgtgtga ctttatgtgg ccatttgtat attctgtgac cttatggggg    840

tttagtccag tacagaagta aatttctttt tggtatttct ggggttcatt tggggctgag    900

gtctgcctat ggattgtgag tcccatgtgg ctctgtgctc ctcccatgtg gctctgagga    960

cttaaggact ttttgatttg accacagtgg ctgccctttc atccatggcc tgtattgctt    1020

catttctgta tccatcctcg gttcaccttg ggaaatgtag ttacttacga gttcacgact    1080

tcttccctgc gtcctcttgc cttatagcct taaggggatt gggtgcaggg aagtggcaag    1140

aagtaaggaa gtcagacatt tggacacctg agtgatgaat aggagttatt tgcaagttac    1200

agacctggtc ttaggatgag aattttaggg ctgataatac cttcaagaca gccactggat    1260

gctgtgcgcg gtggctcaca tctgtaatcc cagcgctttg ggaggcagag gcgggtggat    1320

tacctgaggt catggtttca ccatgacctc tactaaaaat acaaaattag ctgggcgtgg    1380

tggcgcatgc ctgtaatccc agctacttag gaggctgagg caggagaatt gcttgaaccc    1440

gggaggcgga ggttgcagtg agccaagatc aagccactgc actccagcct gggcaacaag    1500

agtgaaactc attctctaaa tagataaata aataggccac tggaaatata atgggactcc    1560

aggagtggga atagtttcag agggagtgct ttaggagaca gccacccagt tctgaacctg    1620

aagcacccca ctgcaggact gtctccagtg tacagctttg aatacagaaa taaattcaag    1680

cccaagacag ctgtgacctg gcccttcttt ctgatacaga aggtagaaga cttattctag    1740

tctcctcctg acttttcttt atgttaaatg agattaagag gatggaggaa gagggtatgt    1800

tataatttag catattcccc aagaaaggcc taatatctca ttccattttt ctttttctga    1860

gagtagagcc cagaggagaa agaatggctg tttcagtagc aatgtccaag gtgagtattt    1920

cctctttgtt tcctgaaata cctttgttat tacaggacat agacattttt gttttctttt    1980

tgaaatttct tgccttctca aatgatagag gggcaaggca atttttggta gattgagagc    2040

aaagaaaatg tgccattaat cgggatagat gcttccccaa tagtggttaa atttacgaag    2100

aatggatttg agactcatgg atttaaaaag gggaagagag aaatagctct attgtgttat    2160

ttaaaaaggg aaagagctct attgtgttat ttctgataca gcaccatttt gattttttaa    2220

ctttttttag cttgttatgg aaagtttcaa atgtacacaa aagtataatg aatatgccta    2280

gcttaaaaac gatcacggcc aggtgtggtg gctcatgcct ataatcccag cactttggga    2340

ggccgaggcg gatggaacga ggttaggaga tcgaaaccat cctggaaaaa ggtgaaaccc    2400

cgtctgtact aaaaattaaa aaaaaaaaat tagttgggcg tggtggtgga tgcacatagt    2460

cccagctact cgggagactg aggcaggaga atggcgtgaa cctgggaggc agagcttgca    2520

gtgagccgag attgcgccac tgcactccag cctgggcaac agagcgagac tctgtctcaa    2580

aaaaaaaaaa aaaaaagcga ttactttcca atcttgtttc atttattcta ccttcagttc    2640

aaaatccttt ctaatttgcc cctttgattt cttgacttat aggttatttt gatgtgtcat    2700

gttttcaaat attttgagga tcttccagag atcttttgtt actgatttct aatttcatta    2760

cattgtgttc acagaatata cttcatatga ttttaatcct tttaaattta ttaagatttg    2820

ttttatgacc cagaatttga tgcatcttag taaatgttcc atgtgcactt gaaaagacta    2880

tattctgtgg ttgttgggtg gagtgttcta taaatgtcaa ctaggtcagg taggttgata    2940

gtatttttta aatcttccat atctttactg agtttttatt tgttggattt ttctccttgt    3000

agtttctttc agtttctgct tcatgtattt tttttttttt tgaggcagag tcttgctttg    3060

tcacccaggc tggagtgcag tggcccaatc ttggctcact gcaacctcca cctcccaggt    3120

tcaagcaacc tccacctccc aggttcaagt gattctccta ccttagcctc ccgagtagct    3180

gggaatacag gcgggcacga ccatgcccag ctaatttttg tatttttttt tttttttttt    3240

tttttttagc agagatgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctcaaa cttctgacct    3300

caggtgatct gcccacctcg gcctcccaaa gtgcagggat tacaggtgtg agccactgtg    3360

cctggcctgc ttcatgtatt ttgatgctct gttattaggt atagaaaggt tttagatttt    3420

tacatcctac tggtgaattg acccctttat cattaggaaa tggtcttcct tgtccctcat    3480

aatattcttt gctccaaaca tctactttgc ttgatattta atgtagccat tccagctttc    3540

ttttcattaa tattagcatt gtgtgtcttt ttctatcctt tttcttttaa cctgtttgtg    3600

tttggtattt caagtgcatt tcttacaggc agcatgtaat tgggtttgtg tttttattca    3660

atttggcaat ctccattttt tgttgttgtt gttactgttg ttgagacaga gtctcactct    3720

gtcacccagg ctggagtgca gtggtgtgat ctcagctcac tgcaacctct gcctcctgtg    3780

ttcaagtgat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg attacaggca cacaccacca    3840

cacccaccta atgtttttgt acttttagta gagacggggt tttgccatgt tggccaggct    3900

ggtctcaaac tcctgaactc aggtgatctg cctgcctcgg cctcccaaat ttctgggatt    3960

acaggtgtga acaaccacac ccaaccagca atctctatct tttaattgga gtatttagtc    4020

catttatatt tagtgtgatt attgatatgg tttggttcaa atccatcatt ttgccatttg    4080

ttttatattt atcccatctg ttctttattt cctgttctcc cttttctgcc ttcttttgga    4140

ttgagacaga gtttcaaaat aacaatacca atattttaac caaccatatg aatatagaaa    4200

aacaacataa agtcctgttg gagtttgaca ggatatagcc cactagggat ctataatcaa    4260

attactgtgt ttaaaagtcg tctacaataa cacttctcgt atggttaagc tgccagctgg    4320

aaatgcagtt atgctcattt gttttatatt gcttttcatg tttagggatt gcttttctcc    4380

cactatgatt taattttgtt ttaaaattac ataacatata tctaaaatca aaagtacaga    4440

ataagatgaa tttgaagaag tctagtgtcc atttctgtcc cctctacctg ctcctttctt    4500

ccctctatag tagctggggc tacaggcacg cgccaccatg cccagctaat tttttgtatt    4560

ttagtagaga cagggtttca ccatgttggc caggatggtc tcgatctcct gaccttgtga    4620

tccgcccacc tctgcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc atgcctggcc    4680

ccgtttttgc tttttttttt tttttatttt agtaatccat catacatagt gatgtgcact    4740

tctctgaagt agggcatagt atctggttgt tttcctttat gtgatgttaa cagccagcta    4800

ctgacatctt tatgtgaata tgttatttta tcagtggtta cagaattata ttctaattct    4860

tctgcattta ttagctggac tatatctata aagggagcca tcctttctca atgtcttggt    4920

tacctgaaga atagtttatg caaaaagaaa aactggaatg aaagattggt ttttctctta    4980

ttatttttca gcatctttca aagcttattc tgtgtttttc ttttaaacta ttattattaa    5040

cttgtgtatt aaaacatatc tgttatgttt cgatctgtga caataactgt tcttattaat    5100

gctcacattg ttccatgtat ggcaagtgga aggtttaccc tctctgattt gtctgctttt    5160

ggattccttt ttattctttt tgacatgacc ccagtagtct ttggcagatt ccagactttc    5220

cgtgctgaca gagtattcca ggctcatttt gtacaatttc ctgtcccaaa cataaaatca    5280

gccacttctt tatggagccc tggttccttt tataagaagt gcttttaaga agtcacaaca    5340

aggatagtag gaactctcat tgctcctagt tgtcattgct tatagcctta acagagctgg    5400

tgaaatacaa attttttaga aggagaaaaa aaatcctgag tgtatactga tatttccaat    5460

tgaaataaaa gattatagag tttttcttac tatctttgat tttatatttg tgttttataa    5520

tctgaaaaaa tcttaattcg taatgattaa tgatattaag attctcactg atatatgtgt    5580

gtgtataatc atttcaggtt atatacatat attactttta gactaacaat gccaatatta    5640

ttaataacag tataactact gaaaaactct aagacataac ttcataaagt tataaactct    5700

taagacaact ttgaaaaaca gtttatagtt attttgtttg taggttatat tgggtctaat    5760

gtcaaatgac tgtattttaa agttcccgaa aataatcact tcctttatat gtttaacctt    5820

ccagctttat gcacagataa gtttgtttca ttttgctttt atttcttaga gatttttttt    5880

cattttgatt taattttgtg attatagtta tagaaaacat acttgtggtt ccaaagtcaa    5940

atagatttga ttggtaatac tttataactt tgttgtatgt ctgtcttcct agaagctatt    6000

gagctgtaac ttttttcatg taatatcttt gtgaggtttt agtattatgg ttatttggcc    6060

tcaaaatgta gaacagactg ctgtctcctt tttctgtttt ctgaaaacgt ttgtgaaaga    6120

acagtattat atctgcctta aatattggta gaatttacca gtaaagccat ctgggccttc    6180

tctgtggaca gtttatttgt ttgtttctca cattcaattt ctttaatatc catgggatga    6240

tttgtatttc tgttttttct tgtgtgaatt ttggcaattt ttgttttaag gaatttgtct    6300

atattgttga aattgccaaa attattggca tagaattgta ttatcttttt aattaaagcc    6360

ttaaaaaatc tgtggtccag tctccacttt ggtaatattt ttttttgaaa acttgatagg    6420

ggtttgtaaa ctgtattaat cttttgaaag aattgatttt tgagtttgtt gatattctct    6480

attgtaatct actttatatt gtggattttg tgcttatttt tattctttct tttcttctta    6540

ctttcagctt cacttgctct tctttttcca gcttcctaag gtgggagcct aaatcatttt    6600

tctaacataa gcatttaaca ctattaattt tcctctaaat actgcttttg ttgcagctca    6660

cagaatctga taagtgtgtt tccattgtca ctcagttcgg catatttttc aatgtctttt    6720

tgcatgggtt atttagaagt atgtttaatt tccaaatatt tggagattct tgttactagt    6780

ttgtaattta ataatatgtg gacactgacc acagtatatt ctctgtataa ttcagttttt    6840

aaaatattta ctgttacttg ttttatgacc cagcatctgg tttattttga tgacctttcc    6900

atacgcagtt gttaatgaag agtctgactc ttgctaaaat cctatgtgtg ggttctcagg    6960

ctccaccagg tcattcctgg caggccacac aggggaaagg tggcctcccc gcagcagact    7020

tggtgcactt ctagtgcatt acagtctcta aagggagttg cagtgcagga ctcaggcctc    7080

ccagaccagc catgctgtta tgcgtgttta cattcctaac ccaggcacct ccattaggag    7140

gcctctttat caggtgcctc tgccaagagg acatcctaat ctaggggaga ggggaaactt    7200

tgaagacact ttctttcccc actcttagta tccggtagtt ttaatttttt tctttatttc    7260

ttttttcttt cttctctttt cttttttttt aacatatttt tggagacagg atattgctct    7320

gtcgcccaga ctggagtgta gtggcatgat catagctcat tgcagccttg aactcctgga    7380

cagttcaagc aatcctcctg cctcagcctc ccaagtagct aggactacag gtttgcatca    7440

caatgcctgg ctgatgtttt attattatta ttattattat tattattatt attattatta    7500

ttttgtagag acagattctt gctatgttgc ccaggctggt ctcaaacttc tggcctcaag    7560

taatcttcct gcctcggcct ccccaagtgc tggggttgct tacaggcatg agccaccgtg    7620

cccagccagg cctcactact ttttcactct tagcccttcc cttgtcttct tgtcccctgg    7680

tcccagtcca taaaatgaat gataggagct ttttgttctg cattccctta gcagtgagat    7740

gactcacttc tgcactgatc cacatttgca ctgatctgcc tgaccctctc tgaccctctc    7800

caggtgctat ttcatggttg gggttggggg agtgaaacag tggagtactc agcgctttct    7860

ctgggttagc ctcttaaatt aagtgactac taagtgatta aaggctggtt gtgttaatca    7920

cttattccaa caccttgcag ctcagttctc ttcagcccag cttggctttt ggtaagtggg    7980

tgtggtattc tattaatata tatttatcat cttggccaag gtacttgata tagtggtatg    8040

taaatcctct atattgttat cgattttatt gtctacttgt tctgtcagtt actgagcaaa    8100

agattttaca attcccaact ctgtgggttt gtctctttct tcctttagta ctgtcaattt    8160

ttgcttcaca cattttgaag ctttgttgtt aaatctctac atttggattg ctgtcttctt    8220

gatgagttga tcctccttat tgttagtatt tctctttatc ttgaagtcta ttttgtctta    8280

tactaatata ggcatacaag ctttcttgtg attagagttt gatggtgtat cttcccattt    8340

tacttttagc ccatctttat atttaaaatg tgcttcttgt aaagagcatg tagttggaac    8400

atgcattttt atcttgtctt gttaccattt ttttattgga atggttgaac tattattaat    8460

acaatttagt ttaagctctg ccatagatgg gagcatccat atgtggctct taagaagagc    8520

ttagggccac atgtggtggc ttatacctat aatcccatca ctttgggagg ctgaggcagg    8580

aggattgctt gaggccagga gttcaagacc agcctgggca atgtagcaaa acctcatccc    8640

aacaaaaaaa gtaaaaatta ggtgagtatg atggcacatg cctgcagtcc tagctacttc    8700

gaaggctgag gagggaggat tacttgagcc taggagttca aggttacagt aagctatgat    8760

cataccactg cactccagct tggttgagag tgagaccctg tctcaaaaaa aaaaataaat    8820

aaataaataa ataaataaat aaataaataa ataaataaaa attaagagct tggcactttt    8880

ttggagttta ggtcttttaa atttgtgccc tcagctctct gatgaattta aaagaaatta    8940

tgacttttca tcttatctga attattttta ggttgttagg atgggcccaa gtatctcttg    9000

cagaaatcta tatgttgaag aagtcaaatt ttcagttaaa aatgtattga gcacctgtat    9060

caatgattct ctgcaggggc agttattctc cctagagggt gttttggaaa tatatctagg    9120

tactgttgaa tgttaaagta agtgggttga gggtaaagac ttctagcttt tttgtttgtt    9180

tgtttgagac agagtctcac tctgtcgccc aggctggagt gcagtggcgc gatctcggct    9240

cgctgcaagc tccgcctccc gggttcacac cattctcctg cctcagcctc ctgagtagct    9300

gggactacag gcgctcgcca ccacacccgg ctaatttttt ttatttttag tagagacggg    9360

gtttcaccat gttagccagg atggtctaga tctcctgacc tcgtgatccg cccgcttcgg    9420

cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccactgcac ccggccgatt tctagctttt    9480

gaaggagtga ggtctcggat ctaggttaga gattacccaa ctttttctgt aaagggctag    9540

acatttcata tggctttgcg ggccacatgg tctctgctgc aactcttcag ctctgctgct    9600

gtagtgtgaa agtagccaaa ggcactatat aactgaatga gtatggacgt attccaataa    9660

aaccttattt acaaaattag ttggtagaca gtagtttgcc aagttatgat ttagttgtcc    9720

atcagtgcat aacaaaaaat tgtctgtgat ttgcaaaatt gagaaccata cctggaaaaa    9780

atgtgtttat gattttccag gtctggaatc tcttacataa tgcattttgt gcatgacttt    9840

ttcaatttgc tgaatttatc tactttccta ttattggatg gttttactat tagctgtatc    9900

ttccaggaat gcaaccatga tttgattgag aaaaaggctc tacttcgctt aagaaattta    9960

ctgagttttt tttaaccatt tcaaaaagtt atagtattga tggcaatgct aattgtgtta    10020

tttgtcttgc ctatagcaaa tatgtataga aacctccatt tatagataat gcatttctat    10080

ttattctata cgtacacatg aacacacata tatttagcct ttatttcaaa atgtcaaata    10140

taaaaggtgt caacaatact tagttacata ttgtcatttt ataagtctaa atttcttcat    10200

tataagtaat tgtaggcata agcatttaat tatttgtgcc ttctaatgta gttgtgtatg    10260

atcataaata tattgaaata ttaagttgtt cattatctcc atttttgaca tctatagatg    10320

tgtcgttatt acctatgagt ttcatttcag aagtagtaga gacattgtta tattttcttt    10380

ttgtatatag aaagcattga gtttgatcaa gttaagaacc acaacatatg tctgtccccc    10440

ttagtgtgtg ttttgggggt gggagaaaca ggaagaaaag aacaacaaag ataattccaa    10500

ctgaatcatt tgttactttg caaaacacct ggtctcatgg ttctgctttc tcctccgtag    10560

ctctgcattc tccagactct gtgctttcct aagataggaa cccagaagag gactgatcat    10620

ttcttgcagc tctaaaaacc atggctcggg taaattggag tttccttgtg ctcttttcac    10680

ttactttttt acagagcatg tgtgtgtttg tattccttac tcctgaaact tcattcctaa    10740

ctgacctcac tcaggaatgt gctcctcagt ttgtcccatt ctgataagtg atagtgtctt    10800

ccctaagtgt gtctttcgaa tctaaccttt agtcacatac ttactcaaca atatgtatat    10860

tgttcagtaa tctttgacta ggaacactga tctaacaaaa gtagagttcc ctgatttcat    10920

aaggtagagg aggatgttaa atggcaccac acatgaaaac cttttgaact tctctttaga    10980

tctaagttcc caggtagaca agacaggagt tggtcttgac tgggctcact ctcagtatgt    11040

ggcaagcgct catgctttat gagtttttaa gattaggaag atgattaggg actgaataca    11100

gagagatcag ggatcttccc caggaacata taatttaata tggatcaatt tgaaattcga    11160

cattatgtgc tggtcttgaa tgtataaatt tggattatgt ttttcacctt tctattgttt    11220

agaatgatga aaagttacat ttacggatga atggtaaata tgatcatagt gaagatgatc    11280

attcaccagc agaagttgtt gagaattata aactctgaga accaagaaat acttacaaga    11340

tttttacaac ctaaaatgtt caaatatgag cacttattaa gtcagacata ttcattatat    11400

ggagctattc tgtagcctat aaaatattta ctaaattatt gatgacaagg aaaatgttta    11460

tgatatagta ctctgatcta atggtgaatc tggagcttca ataaattctt taattttata    11520

caaatcttat tttataaggt tttacagaaa aattttacca ttttgtttat tccttaaata    11580

atgaagagag aaacttacat ttattgagaa tgtatgatac acaatataca tattgtataa    11640

aatgcttgtg tatgctactt cttttaattg ggacattgca tttattttat tcccagactt    11700

atctgtaaag taagatgttc tgtatgcaga aaatatgtgt agcaggccag gtgcagtggc    11760

tcacacctat aatcccagca ctttgggagg cctaagcctt aaggccagga attcaagact    11820

agcctgggca acataacaag acccctgtct ctacaaaaaa attggaaaat tatcagggca    11880

cagtggcatg tactgtgagt ggcacgtact gtggtctcaa ctactcagga gaatgagaca    11940

ggatcactta agcctaggag ttggaggctg cagtgagcta tgatggtgcc actgcactcc    12000

agcctggatg acagagcaag accctgtctc caaaacaaca acaacaaaac tatagcaata    12060

ggaataatca ggaacatatt tgtacttttc agcccatgtg ctctgttgct tcctttgtgg    12120

agggatcttc atctccctct ccattgaaaa agtatttttt tggccgggca cagtggctca    12180

cacctgtaat cccagcactt tgggaggcct agtcgggtga atcacaaggt caggagttcg    12240

agactagcct ggccaagatg atgaaacctt atctctacta aaaatacaaa aattaactgg    12300

gcgcagtggc aggtgcctgt aatcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaattgctt    12360

gaacctagga ggcggaggtt gcagcgtgcc gagatcgcgc cactgcactc cagcctgagc    12420

gacagagcaa gactccatct caaaaaaaaa aaaagaaaga aaaaaagaaa agcatttttt    12480

aaatttccaa aattaacatt ttgtttgttg ttagaaatta gtgatgttca gggatgttgc    12540

cattgacttc tctcaggaag agtgggaatg cctggactct gctcagagag atttgtatag    12600

agatgtgatg ttggagaact atagcaactt ggtatcacta ggtaaggaat ctagccttca    12660

tatttcagga tctacctttg gattggctgc tttctctgct gttatttcaa atttcctttt    12720

taagtaatta actgaatttc ttattctttt caaaggagga gtttgaaatt actggaagta    12780

gacatggttt ctcagggcac ctttatcttt tccatccttc aaaaagcctt accactgcct    12840

tctaatacca tcttccctga tgaacaaagg gctagatttg aagtttggga tacttggaat    12900

attggcagat aaaacagcct atacattgtt acactttaga tctgctaaag gagctctaaa    12960

taattcacac gcccagtcac agatttaaaa aatagatgca gagatgtatg ttttttctga    13020

taaaagagtt tacatcattt gtatagtgat agagtagatc aatgcatttc accaacaact    13080

caaatgaaga caacccatta attagaacaa acacattgtc ttatatgtgc ttggtagttg    13140

aatattacat attaagaact ttgggctggg ctcggtggct cacgcctata atcccggcac    13200

gttgggaggc caaggtgggt agatcacctg aggtcaggag ttcaagacta gcctggccaa    13260

catggcgaaa ccccatctcc actaaaaata caaaaattga gctgggcatg gtggtgtgtg    13320

cctgtaatcc cagttactca ggagattgag ggaggagaat tgcttgaacc catgaggtgg    13380

aggttgcagt gagctgagat cacatcactg tactcctcca gcctggatga cagagcgaga    13440

ctccatctca aaaaacaaaa aaaaaagaac ttgcattgga cattgaatga atatgctaga    13500

atcatctttt attgtaaaat agttgagggg gaacctgtga ttgtctaaga aactttattg    13560

ttttcttctg tagtattttt atatgaaaca aaatccgtat caattacaac tttaataagt    13620

gattttccaa cctacatgat aactttattc cttgtgctgg aataaactgt ctcttgcctc    13680

ttccttcctt tctcctctga agcctttagg aagtcagtga ttaacacatg tccctagagg    13740

acccaagtgg tgtggaaaaa aacctatgac ttgaggagaa aagcaagggt ttttcaccat    13800

gatcttccta aagactctta cctaatttct actgcgtcct ttccctgttg gtttttatta    13860

tcattcttcc cactttcaaa agagggaatg gttggccggg cgcggtcttg tatgtgcttg    13920

gtagttgaat attacatatt aagaactttg ggctcggctc ggtggctcac acctgtaatc    13980

ccaacacttt gggaggccga ggagggcgga tcacctgagg tcgggagttc gagaccagcc    14040

tgaccaacat ggagaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaaattagcc gagcatggtg    14100

gcgcatgcca gtaatcccag ctactctgga ggttgaggca ggagaatcgc ttgaacctag    14160

gaggcagagg ttgcagtgag ccgagattgt gccactgcac tccagcctgg gcgacagagg    14220

gagactctgt ctcaaaaaaa aaaaaaaagt gcaaattaaa accacaatga tatagttatt    14280

tcacatgcta taaattggca gcttgacagt accaggcatt ctcaagattt gaaggcagaa    14340

gtgcactata tcttgatatt cacaatagcc aaaaagtggg aacaacccaa atgtccatca    14400

actaatgaat ggataaaatt tggtattttc ttaaaacgaa atattattca gcaataaaaa    14460

ggaatgaagt tctgatacat gctttaacat ggatgaacct tggaaacatg ctataaagaa    14520

atacccgagg ctgggtaatt tataataaaa agagatttac ttagctcatg cttctggagg    14580

ctgtacgagc atagcactag tgtctgcttg gcttctggtg aggtccagga agcttttagt    14640

catggtggaa gggaggggga gtcggtgtgt cactggcaag agagggggca agagagagag    14700

gaggaaattc aggctctttt aaacaaccac atctcgcgtg aactcatagc gtaagaactc    14760

acgacagagt cttgctctgt cgcccaggct agagtgcaat ggcccaatct tggctcactg    14820

caacctcctt ctcctgggct caagcgattc tccttcctca gcctccccag cagctgggat    14880

tacaggcacc tgccaccaca cccagctaat ttttgtattt ttagtagaga tggtatttca    14940

ccttgttggc cagactggtc tcaaactcct gacctcgtga tccgcccacc tccctcccaa    15000

agtgctgaga ctacaggcgt gagccagtgc acccggccaa gaactcactc tttaccacaa    15060

agatggcacg aagctattca tgagggatcc acccccatga tccaaacacc tcccaccaag    15120

ccccacctct gacactggag attacattca atgttagatt acatcaacat gagatttgga    15180

agggacaaac atccaaacta tatcccatgc caagtgaaag aagccaaata caaacactgc    15240

atattatatg attgcattta tatgaaacgt cctcaatagg gaaatctata ctgacagaaa    15300

gtaggttact ggttacccag cactggggat ggggaagagg tagaacagat ggagaatggg    15360

gagtggggag atgagaagtg actgctaatg aacacagaca gcatttctct tgggggtgaa    15420

aaaatgttta aaaattagat tgttgtgatt gttgcacatc tcagtgggta tactaaaagc    15480

cactgaattg tgcagaaata atatggaaat ggttgccaaa cttgtgtgta ctttagaaat    15540

agctacggtc ttttaaaaaa ttccacagcc caggccacac cccagaccaa ttaaataata    15600

atttctaggc atggtacatg agtatcatat tttttgaaat tctctaggtt tttcaaatgt    15660

ttagccatgt ttgataacca ctgcactgtg gtattatctg agaatttttt ttaattgaat    15720

gttcactcca tttaatttat taccaatata cttggattta tttatcccct attttatgct    15780

ttttgtttcc tctttttatc ttacgggctt aaaaaacttt ctccctcctt aatgagggtg    15840

gatacaatcg tgttttattt tttgcaactc cattttcccc cttgttttgt ttggaaaacg    15900

tacagtattt atttattttt aaaagttatc tttaaatttt tatcatgtgt acctaattcc    15960

ttttaatgtc aatggtattt tatagttttt attgattgta attgtgtctg aaaattatat    16020

atttaatgga cattatatat tttgatggat actaaaacat atttattcag tccacataca    16080

atatttggtt tgcatattgc tttgcaataa acttgctcta tctccacccc taggatttca    16140

aggccagcaa gttgaaaaac agacatataa ataatagtat ctactgtgaa ataaattggt    16200

aacctttgtg gcaattagtt gaggttctaa ggagagataa gaaattgaca tctctatgtc    16260

aaatatatat tttattgtca cagaattctt atcagaagta taccagcaat gtatatctat    16320

tatatacttt atcaacagtg gctattagca cgtagaaata tctttgttaa ggccaggcgc    16380

ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcgggcaga tcacgaggtc    16440

aagagatcaa gaccatcctg gccaacatga tgaaatccca tctctactaa atatacaaaa    16500

attcggtagg tgtggtggca catgcctgta atcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga    16560

gaatcgcttg aacctgggag gcggaggttg cagtgagcta agatcgcgcc acagcactcc    16620

agcctagtga tagagagaga ctctgtctca aaaaaaaaaa aaaaaaagaa atatctttgt    16680

tgatttgtag atgaaaaaca gaagaacatt tctgccattg ccggtgaatt taaatacttt    16740

gggggtattt ctgcctgttt tggtacttta gtaattatca ttattgtttg tgtcacttga    16800

caaatacatg cttaatttag tgaagtctaa aattcatgtc taactttcct taagataatt    16860

aaaggatatt gaaatgcttt aactttgatc tgtttctcca atctggtatt gttgtctggt    16920

attttagttc tgttcttttt ttaacctaca aaatgggcat tatttttgtt tcataatggc    16980

aatgtttgct tgtggatttg ttgatgtaat tatcttttat ttgtatgcta ttcctctttc    17040

attatacctt ccttctggga tattttattt atcatgaaat acattaggga aggcttattg    17100

gttttatttt tttcttttct tttcttttct tttttgagat ggggtctcat tcttgttgcc    17160

caggctgtag tgcagtggcg caatttcggc tcactgcaac ctccgcttcc caggttcaag    17220

cgattctcct acttcagcct ccccagtagc tgggattaca ggcgcccgca gccaagccca    17280

gcttattttt taatttttag tagagacggg gtttcgccat gttggccagg ctggtctcga    17340

actcctgacc tcaggtgatc cacccacctc cacctcccag agtgctggga ttacaagtgt    17400

gagctaccac ccccggcctg tcttattgtt aataaatgct ctaagtgttt gtttttgtca    17460

ttgttgcaaa ataaccttgt ttcactgtca ttcttgcctg atgatttaac taggtataaa    17520

attctatact gacaattatt tttttctcag cactctgaag atattattcc actgtcctct    17580

ggcttctatt gttgctcttg agaagtctgc catctgtttc attgttattc cttttgtaag    17640

taatctgtat tttctctggc tgcttttaag atttttttct ttaagattta aatgtaattg    17700

attatattgt ttcacttcta gatgtttgat gttctccccc tctcccagat cttttttttt    17760

taagctcatc cctttctcat ggtttttatc ttatactttc atatatttcc agcacttatg    17820

tgtcatacaa tcccaatttc tgggaaacag gtctaatttt gctgtttctt gtatccatgg    17880

ggactcttgt gtaatgatga attatccata gcactttttt tctccttttc tttgagagtc    17940

caggccaaga ctgaaaagtc ccttgtcatt ttcctttaag gtttgctgga tttgtttttc    18000

tttctctgaa ctttatgtct tgaatatttc caattttgta aagaggtttg tttgtaatcc    18060

ctgctctttt gttgaggaaa ggtcttgtct gttcagtttt ttcagaccat taatatacaa    18120

acatctaggt aattaaaatc aacaaatatc ccaagggtaa ctgtaacttc agagcatatt    18180

tactccatct actttctggt tcctacttca ttgtagcacc cctggatctt gtttactttc    18240

ttttatgctt cacatacttt taaaaggaca tctgtcatat ttttccagta tttgttagtg    18300

ttttttaaga aatcggatgc accatttaca tattaacaat attgaatcct tttattgttc    18360

agcatgctaa atctgctttt ctttttatgt tctctgtaaa gtttcatggt tttttcttat    18420

tctttttttt ttttttgaga cagagtctcg ctgtgtcacc caggctggag tgcagtggcg    18480

tgatctcggc tcactgcaac ctccgactcc ccagttcaag ggattctcct gcctcagcct    18540

cccaagtagc tgggactaca ggcacctgcc accacaccca gataattctt gtatttttag    18600

tagagacagg gtttcactat gttggccagg ctggtcttga attcttgacc ttgtgatctg    18660

cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt agtttcatgg ttttttctta aaagatcttg    18720

cacatttctt aagcaatttc tcagtacatt ttgtttataa tatgaatagg aatattttgt    18780

tctgtaacat tttctaaatg gctaatactg atatatatta tatatgagaa agtattgatt    18840

tctataaatt gaaaatctta tggaaatata gtttttcagt ggattatagt ggatttctag    18900

gtggacagtt ttgctctcta catacaatat gtggtctctt ccttttctgt ttgtaccttt    18960

aaaaaaaggc aactaaattc agtaggaccc tgtagcggaa tttgaaaaca aatcattctt    19020

atcttttctc aaactttatt ggcagtgttt ctaatgttta actattaaat gtatttctat    19080

agacatctgg tagatactct taactaggtt tttacctaat tccagtttta gagaactttt    19140

aataaaaggt cttagaatat attaaaaatt tttttgcatt tcttgaaatc atgctatttt    19200

attctttaag ttctttatgt gggaaaatgg actctgatgt tgaattattc ctgcatttgt    19260

gggataaagt ttatatgatc atgatgtgtt atgccttaaa tacacagcta gattctatgt    19320

tcctaatatt ttcttttaaa attttacctt tgttcacgag attggcttcg ttttcctaag    19380

gtcatttttc aatgctgtta tactagttaa tttaactttg taaaatgact agggtagatt    19440

acaatatttt tatatgttca acaacagtta tgtacgattg gaattatata tccttttttc    19500

ttttttttga gacagggtct ccctctgtca cttaggctgg agtgcagtgg cctgatcaca    19560

gctcactgca gcctccacct ccctgagccc aggtgatcct agttgagact acaggcatgt    19620

gccaccatgc ctggctaatt tttgtagttt ttgtagagat gaggttttgc cacattgccc    19680

agactagtct cgaactcctg ggctcaggca atctacctgc cttggcctct caaagtgctg    19740

ggattacagg tataagccac cacacccggc ctatatattc tttaatgttt ggataatatt    19800

gccagtaaac ctaccagtca ctggaatcta ttgccttgaa tattagatat aataggtact    19860

atgaccagca gatacaaatg atcatcagtc ataggtatct attgcctttt aggagcacag    19920

acactgagct caaatttaaa ttttttatgt ggttattgct gtatatcagt tattatatct    19980

tcatgggtta tttttcatgt ttttcatctg tttcatccag ttctaattta ctgttgcgtt    20040

aataggtttt ttcataaaca cttttaaaag ttttgtttta ttttagttga aacataatgc    20100

acatatttat gggctaccat gtgatgtttt atacatatgt gtattgtgta attatcaaat    20160

caggataatt agcatatctg tcacctcaaa cacttgtcat ttctttgtgg ttaggacatt    20220

caagatgctc tcttctagct atctgcaggc attcaggaca tttttgttga ctatatagtc    20280

accttattgt gcaatagtac atcagaactt atttctccta tctaactata actttgtacc    20340

catagaccaa tctcttccca gccaccccct cagcatctgg taaccactgt tctactctct    20400

acttatatga gatcaacttt tttaggttcc acatatgagt gagatcatgt gatatttgtc    20460

ctgttcttgg cgtatttcac ttaatataat gtcctctagc ttcatccaag ttgtcaaaaa    20520

taacaggatt ttattcattt ttataggtta atagtattct attctgcata tataccacat    20580

ttttgaaaat ccatttatct tttgatggac actgagttcg agtccatgtt attgctattg    20640

tggatagtgc tgcagtaaac atgggaatgc agatgcctct ttgacatact gatttccttt    20700

cctttggatg tatacccagt agttagattg ttggatcata tggtagttct atgtttactt    20760

ttttgagaaa cctccatact attttccata atggctgtgc taatttacat tcccaccaag    20820

agtgtgtaag agttccccct ttttccacat ttttaccagc atttgttatc ttttgtcttt    20880

ttaatagcca ttctaacagc agtgaggtga tatctgattg tagcttcgat ttgcatttcc    20940

ctataattag tgatattgag cattttttca tttacctgtt tgccatttgt atgtcttgag    21000

aaatgcctat tcaaatcttt tgactatttt ttaatcagat tatttgtttt tttgctgttg    21060

agttgacttt cttatatatt cttggtatta acaccttatt agatgcatag tttgtgaata    21120

ttttcttcca ttctgtaggt tgtctctttt ttgtttgctt tgagatggag tctcgctctg    21180

tcacccaggc tggagtgcag tggtgcaatc tcggctcact acaacctccg cctgccaggt    21240

tcaagtgatt ctcttgcctc agcctccaga gtagctggga ctacaggcac atgccaccac    21300

gcccggctaa ttttttgtat ttttagtaga gacggtgttt cactgtgtta gccaggatgg    21360

tctcagtctc ctgaccttgt gatctgcccg cctgggcccc ccaaagagct gggattatag    21420

atgtgagcca ccatgcccag gctgtaggtt gtctctttac tctcatttcc tttgctgtac    21480

agaagctttt tactttgatg tagtatgttt atctgttttt gcatttgtca gtgcttttga    21540

ggtattatta aaaaatcctt gcccagatca gtgtctgttt ccctgtgttt tcttctactg    21600

gtttcatagt ttccagtctt acatttaagt ctttaatcca ttttgagttg agtggtgaga    21660

caggggtcta gtttcattct tttgcaggtg gatattcagt tttcccagca acatttactg    21720

aagaaagtat ccttttccca atgtgtgttc ttggccttct tgttgaaaat cagttggctg    21780

caaatacttg gatttttttt ttcctgggtt ctctatcctg ttccatttgt ctatgtgtct    21840

gttttcatgc caataccata ctgtttggtt actattgttt tgtagtatat tttcaagtca    21900

tggagtttga tgcctccagc ttggttcttt ttgtacaaga ttgctttggc ggcctggcgc    21960

agtggctcac acctgtaatc ctaacacttt gggaggctga ggcaggtgga tcacctgagg    22020

ccaggagttt gagaccagcc tggccaacat ggcgaaaccc catctctact aaaaatacaa    22080

aaaattgctg ggtgtggtgg caggcgtctg tcatcccagc tactcaggag gctgaggcag    22140

gagaatcacg tgaacctggg aggtggaggt tgcagtgagc caagagtgtg ccattgcact    22200

ccagcctggg cgacaagagc aaaactccat ctcaaaaaaa aaaaattgct ttggctgttt    22260

ggggactttt gtggttccat atgaatttta ggattcttct ttgtatttct gtgcagtgtc    22320

attggtggta ttttgatagg gattgcatag catttgtaga ttgttttggg tagtatggac    22380

attttaacaa tgttaattct tctgatccat gaacatggaa aatatttcca cttattagtt    22440

tcctctttaa tttcttttgt caatgtttat agttctcatt gtaaaactct tgcctctttg    22500

gttaaattta ttcctttttt tttttttttt gctatctatt ataaatggga ttgatttcct    22560

tttcacagtt tcctgttggc ctatggaaat gctacttatt tttgtacatt gattttgtca    22620

gtcattagca ccttattttg ttcatttgtt gagctcatat tttcctgaat gttcttgatg    22680

tttatggaca cgtgatgtct gtgcactgag caatttattc aagagtttgc aggccggaac    22740

ctggtatctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaagct gaggcgggtg gatcacctga    22800

ggtcaggagt tcaagaccag cctgaccaat atggtgaaac cccatttcta ctaaaaatac    22860

aaaaattagc tggccatggt ggtgtgtgcc tgtagtccca gctactcagg aggctgagac    22920

aggagaattg cttgaaccct ggaggcagag gttgcagtga gctgagatca tgccactgca    22980

ctccagcctg ggcagcagag caagactcca tctcaatcaa tcaatcagtc aatcaatcaa    23040

gttcacagtc tagctttgtt tgtgcccatc cttcttccaa aggccttcca gacattctaa    23100

gcagactatc tatctgttgt attcccttga gcctgtaacc actgcatcca tctcagcatt    23160

aaagggcatt aagcccaggc ttcctgctag ccttgcaagg gctccaaggt tgttgtggct    23220

ctccacctgg gtggacctag agaaaaccca agaaggatac tggtgctgta tgggagtcca    23280

gacagggacc tgagcccaga agactgtcct ggtggcccag atgggtgtgc cttcagcagg    23340

tccttgcaca ggcaagatag gtctctaatt acagtgagag ggctggagct gagactgggc    23400

cccctcagga tttgctgtcc tacaggacag aggctggcaa gcctatcttg ttggcttaga    23460

caggtgtaca tctcccagca tgtctctgca cagatggggt agttctatga ctgcaacagg    23520

aggggctaga gcttagactg ggccctctcg ggatctgctg tgggacagag gcttccatgc    23580

acagatggaa tagttccctg actgcagtgg gaggtgctgg agctgagcct ggaccccctg    23640

aggatgtgct atgggatggc agctgatgag cccatctcag cccacatggg tgtgtctccc    23700

accgtgtcta cacggagggg atagttctcc agttattgca ggagggccca aggcaaagac    23760

tgggcttcct caaggtctgc tgtgggacag aggttggtga gcccatcgtg aagactccaa    23820

ctcccaaacc atgagatacg gatgaatctt actctggatc cttgtatgag cggttctgag    23880

ctggcacccc cagctgagga ggctggagct aagccacaga gcaactgtga ggttcactac    23940

caggactgtt gtcagcaggc ataagagact ctccacctag acactagtgt gcatgattcc    24000

tcctggacct ttaggcagat ggttttgatt gcacgcccaa ggccaaatgg ggctgtagcc    24060

aagccctctg gggaatgggg ccattttcaa gctttgaaca tgggatcagc atgggagatc    24120

agccacctgc gtgccagtct gcactctcaa aatgactttc ctaggtcttg ggctttactc    24180

aagttttaca acctcctacc tgaattccaa agcttctgca aagagacttt tatctgtgga    24240

tgggtgcaga attctcgtga ggggatatga gtgggttacc tcctatttct gccatcttgc    24300

tgacgtcact cccataatct ctcataaaca ctttttaact cctcaattta tggttacctt    24360

tttctctcca gtgctttgga tttgtgctaa atctaatttt tttctacacg tcactttttt    24420

tgtattattt atggatattt tcaaataatt ttggtatttt gattttgcta attatttctg    24480

ctgtttctac gtttctaatt tactcatttt ctgatttttt atctcactta tattttggtt    24540

tttagttatg ctttttgctc acttcttctt gaggtgaaat cttaattctc ttaactatag    24600

tatttcttgt tttttaataa atgcacttaa gactgtaaat ttccctgggt acaattttag    24660

ctgatttctt gggatttcac acaaagtttc ttttgctatt tggctctaaa ttgttttaaa    24720

attttatttt tatttccttc tataacaaac atcatataga attgtcttag taacttaatt    24780

ctaggattat atgttttttc tatgttttta taatttttag ttttatgcta atgtgataat    24840

taaaaacatt ttatgtcagt tttatctatc ttcctatatt actaattatg ttatagtctt    24900

ccttgttttt atttctggtc tgtttatatt ctattctcta ctatgacggt gattaatttc    24960

tctatatgtc tgctagtttt tgtttattta ggagctaagt tgttggttac ataatggtca    25020

tgactattca tcctcttgcc tggctcttag atgatgtccc tgagctgatc tcactgagaa    25080

aactgaagct agcagaagag aagagagatt cttgcttcct tgtctgttta cctaccttca    25140

tctatactaa ttcaacctct tttcctatta acatgtaacc tttttgtgcc tttacttaag    25200

cccagtaccc tcacttgtat actgaattcc attccttctc atatttttaa ggacactgtt    25260

gaagcaattg ccctttgtct cttctaacat gaacttgtcc atatctttta caataatttt    25320

catcagcata caaacatgcc ttaatttctt ctatcttaaa aggaaaaaaa acaaaaccaa    25380

atattttgac acacattttc ctcttgatat agctccattt ctttgctact ttttacagaa    25440

aaatacaaaa gaattttcca tattccctaa ctccagctct tctctcattt tttttttgtc    25500

tttttttttt tttattatac tttaagttct agggtacatg tgcacaacgt gcaggtttgt    25560

tacatatgta tacatgtgcc atgttggtgt actgcaccca ttaactcgtc atttacatta    25620

ggtatatctc ctaatgctat tcctcccccc ttccccctcc cccgacccca caacaggctc    25680

cattgtgtga tgttcccctt cctgtgtcca agtgttctca ttgttcaatt cccacctatg    25740

agtgagaaca tgtggtgttt gtttttttgt ccttgagata gtttgctaag aatgggtttc    25800

cggcgtcatc catgtcccta cgaaggacat gaactcatcc ttttttatgg ctgcatagta    25860

ttccatggtg tatatatgcc acattttctt aatccagtct atcattgatg gacatttggg    25920

ttggttccaa gtctttgcta ttgtgaatag tgctgcaata aacatacgtg tgcatgtgtc    25980

tttatagcag catgatttat aatcctttgg gtatatacca ggtaatggga tagctgggtc    26040

aaatggtatt tctagttctg gatccttgcg gaattgccac attgtcttcc acaatggttg    26100

aactagttta cagtcccacc aacagtgtaa aagtgttcct gtttctccac atcctctcca    26160

gcacctgttg tttcctgact ttttaatgat tgccattcta agtggtgtga gatggtatct    26220

cattgtggtt ttgatttgca tttctctgat ggccagttga tgatgagcat ttttccatgt    26280

gtctgttggc tgcatatgtg tctgttggct acataaatgt cttcttttga gaagtgtctg    26340

ttcatatcct ttgccgactt tttgatgggg ttgttttctt cttataaatt tgagttcttt    26400

gtagattctg gatattagcc ctttgtcaga tgggtagatt gcaaacattt tctcccattc    26460

tttaggttgc ctgttcactc tgttggtagt ttcttttgct gtgcagaagc tctttagttt    26520

aattagatcc catttgtcaa ttttggcttt tgttgccatt gcttttggtg ttttagacat    26580

gaagtccttg cccatgccta tgtcctgaat ggtattgcct aggttttctt ctagggtttt    26640

tatggtttta ggtctaacat ttaagtcttt aatccatctt gaattaattt ttatataagg    26700

tgtaagggag ggatccagtt tcagctttct acatatggct agccagtttt cccagcacca    26760

tttattaaat agggaatcct ttccccattt cttgtttttg tcaggtttgt caaagatcag    26820

atggttgtag atgggtggta ttatttctga gggctctgtt ctgttccatt gatctatatc    26880

tctgttttgg taccagtacc atgctgtttt ggttactgta gccttgtagt atagtttgag    26940

gtcaggtagc atgatgcctc cagctttgtt cttttggctt aggattggct tggcaatgcg    27000

ggttcttttt tggttccata ttgaacttta gtttttttcc aattctgtga agaaagtcat    27060

tggtagcttg atggggatgg cattgaatct ataaattacc ttgggcagta tggccatttt    27120

attgattctt gattcatcat tgattcagta tggccatttt acgatattga ttcttcctat    27180

ccatgagcat ggaatgttct tccatttgtt tgtgttctct tttatttcac tgagcagtgg    27240

tttgtagttc tccttgaaga ggtccttcac atcccttgta agttggattc ctaggtattt    27300

tattgtcttt gaagtaattg tgaatgggag ttcactcatg atttggctgt ttgtctgtta    27360

ttggtgtata agaatgcttg tgatttttgc acattgattt tgtatcctga gactttgctg    27420

aagttgctta tcagcttaag gagatttcgg gcagagacta tggggttttc taaatataca    27480

gtcatgtcat ctgcaaacag ggacaatttg acttcctctt ttcctaattg aatacccttt    27540

ctttctttct cctgtctgat tgccctggcc agaacttcca acactatgtt gaataggagt    27600

gatgagagag ggcatccctg tcttgtaatg cttccagttt ttgtccattc agtatgatat    27660

tggctgtggg tttgtcataa atagctctta ttattttgag atacatccca tcaataccta    27720

atttattggg agtttttagc atgaagggct gttgaatttt gtcaaaggcc ttttctgcat    27780

ctattgagat aatcatgtgg ttttgtcttt ggttctgttt atatgctgga ttacatttat    27840

tgatttgcat atgttgaacc agccttgcat cccagggatg aagcccactt gatcatgggt    27900

agataaactt tttgatgtgc tgctggattc ggtttgccag tattttatct tctctcattc    27960

ttttgaatct ggttcagtca gaacttgctc ccattattct gccaaaacta ttattgtgaa    28020

gattaccagt aatctccatt ttgctaataa tgccattttt aacttaggaa gcacgattta    28080

ggccgaacac ggtggctcac acctgtaatc ccaccacttt gggaggccaa ggcagggaga    28140

tcacctgagg gcagaagttc aagatctgaa ggggtggcct gcccctccat acctgtgggt    28200

gtttctcgtc aggtggaacg agagactgag aaaagaaaga gacagagaca aagtgtggag    28260

aaagaaaagt gggcccaggg gaccggtgct tactggtctc tgagttccct cagtatttat    28320

tgatcattat ctctaccatc tcggagaggg ggatgtggca ggacaatagg gtaatagtgg    28380

ggagagggtc agcgggaaaa catgtaaaca aaagtctctg tgtcgtaaac aaggttaaga    28440

aaaggtgctg tgccttgatg tgcacgtgta caaacatctc ggtgcattaa agagcagtat    28500

taccactagc atgtctctcc tccagcccta aggtggtttt ctcctatctc agtaaataga    28560

acatacaatt gggttttaca ctgagacatt ctattgccca gggacgagca ggagacagat    28620

gacttcctct tatctgaact gcaaagaggc cttcctcttt tactaatcct cctcagcaca    28680

gacccttttc gggtgtcggg ctgggggatg tcgggctggg ggacagtcag gtcttaccct    28740

tcccatgagg ccatatctca ggctatcaca tggggagaaa tcttgggcaa tacctggctt    28800

tcccaggcag aggtccctgt ggccttccac agtgtattgt gtcctgggta cttgagatta    28860

gagaatggtg atgactttta acaagcatac tgccttcaag cacttttttt taacaaagta    28920

catcctgcat agccctttgg taaatccatt aaaccttgag tcaacacagc acatgtctct    28980

gtgagcacag ggttggggct agggttacag attaacagca tctcaaggca gaagaatttt    29040

cttggtacag aacaaaacgg agtctcttat gtctacttat ttctgcatag acacggtaac    29100

agtctgatct ctcttttccc atttccccct tttcttttgg acaaaaccgc catcgtcatc    29160

atggcccgtt ctcgatggtc gctgtctctt tggagctgtt gggtacacct gcagactaac    29220

aacagacaga acaggcacac aaggattaat aggaaattta caatagtaga acttccgatg    29280

gtcttaaccc aagtgacagg gttaagattt gtgagaccat cagcaactcc atgattgcct    29340

cagttcctgg taccaaattt aatgggcttt gatccttcaa aaatttgttc ttttaatttg    29400

gaaatgtcta aagtgagatt atcttttctt ccctgtagac ggcatctaac catgtcccag    29460

tgatgctcag actcattata aactccaggt gtaatacaaa aatctgacgt attccagtca    29520

cactgtaact ggaaatgatg ttctaagctc atgagcctat ctcccatcca aatgacagtc    29580

taagatcatt aatttgattt gccaattttt gatcaatacc agattgtgaa ttccaccatc    29640

ttgtagaatt cttttgccaa tcattaacaa agtttactgt ccgaacagaa gagtgcaatg    29700

caactcctgc cacagcggct gtagttgtga ctgcgattaa tcccataatc actgcaatta    29760

aagtaaaaat gaatcttttg gatctattta aaatgacttt taatacttca gtcaaaatat    29820

ggatggatgg cgaggcctcc cactgtcggt ccatggacac agggatccac acgccttccc    29880

ttgctctcac tagcagaata cggtgctgcc aattgaaagt tgaatcaatg caagtaaaca    29940

atctgcaatt ttcacaggtt atatagtttg ggagtctggt ttaataacta tatttcctac    30000

aactagcata taagggcgct ttatacaact ttgtaaagaa accgttagac ttgaatttag    30060

gtcgatagta taaaatggct tatgatctcc tgtttctata gcttgatttc cagatcaaat    30120

tctaatgcgg tatgaggcca cagtaagcct ccataattct ggatgttcag gaccagaaac    30180

aggacttatt atttttggtc ttggagtaga gattcctttt tctccccatt cccaagggta    30240

gaaagactgt aattttttgt gcttatgttt gtctaaactt tctgttaagt cactatcaac    30300

agttggactc acttgtgcac tgggacatga ctgagtttgt cctgtgcaat tgtggtagaa    30360

ttgacctcga ggtgcccaat ctataatagt tccaaattca tcattttgta atatcaccac    30420

actattggcc acacattctt cctaaactaa aacttctgtg tcttttgata ccttgggaat    30480

ttccgtgggg caaggtttcc ctttaggcct acattttaat gatctttgat aagaaaagtc    30540

ctgtaaataa tttacctgtg gcctgagtga cattccgctt accatgtgat aagtgaatct    30600

actggtggta cagtaagtaa gtacttctac caaccaattt tggattgtag gcattaaaca    30660

tcctggtgtt ctccctagac aaataggagg ataacgatac ccagtagaaa tatttatcgt    30720

cattccttct tcctcaggtt tggcagggca gtgatcatct gtggggccag gtacccatac    30780

actgttatta acatatactt caataggatt atccatccat gcgactgccc gaattaaggg    30840

caggaaaggc acacaggccc agtaggtata attagctgca gctgctccta caggcatggg    30900

gagacttacc accattgata caatcatcaa agctgcaagc agcatactct ctggagtttg    30960

tgtcaccttt gtgttctcaa ggcctttttt agctaactgt gtcagcttct ttaattgtgc    31020

ccaagtcggc ggctctgcct tcttggtgaa tggcaacttc atctattctt ctgacatcac    31080

cattttatct tgtgagttga tggtgcttga ttgcagtgtt tctgtctccg tggaggtgct    31140

tttctttgca tctccgacag gttcattgta gaacttcaaa tgtctagttg gtatccaaac    31200

aggaagctga ttttctcctg gtgaaacaca agcaaaacct ctcctccacg ttaccacctt    31260

ccctatttcc catgtcttat tgttgttgtc tttccaccaa atcagttttc cttcatgtgg    31320

gctattcttt tttttaccag taagatgttg ttctgcagga gtagtagtct gatttctata    31380

aatgtttaaa aaatttaaag tatagagtgc tagattaagt tgcatctgag gagtggtaca    31440

ctccttactg tctccccctt ctttttgttt aactaattga gttttgtgtg ttctattagt    31500

tctttcaact atggcctgtc cttgggaatt atagggaatt cctgttgtat gtgtaatttt    31560

cttggaaagc tttactacag tatcctggtc cattgttagt tttaattttt tctggaactc    31620

ccattacagc aaaataagat aataaatgtt ttttaacatg ggaagtactt tctcctgtct    31680

ggcaggttgt ccatatgaaa tgtgagtaag tatcaactgt tacatgaaca catgataatc    31740

ttccaaatga aggtacatgc gtgacatcca tttgccataa cgcattagga cacagacctc    31800

tgggattaac ttctgcctct tgagtgggca ggtgtaggac ttgacactgg gtgcaatgtt    31860

gtacaatatt ttttgcctgt ttctatgtga catcaaattt gttttttaat cctgctgcat    31920

ttgcatgagc caaagcatga agttcttgtg cttttatgaa tgcagatgat accagtaagt    31980

cagcttgttc atttgcttta gtcaaaggcc ctggtaaatt agtgtgtgct cgaatatgag    32040

taatataaaa tgggaaattt ctttttctta cagtttgttg taataaattg aatagctggt    32100

ttaactgatc atccatgcta tatttgatta gagctgtctc aacatccctt gtagcctgta    32160

ctacatatgc agaatctgat acaatattga tagattgatc aaaatcttat aacactgtaa    32220

tgactgcaac caactctgct ctttgagcca attgatactg agttttgatt acttgctctt    32280

ttggctctgt gtaagctgct tttccattgt tggaaccatc agtatatact gtcagagcat    32340

tttctaaagg tccgtgactg gtaattttag gtaaaatcca agtagtcaat tttaaaaact    32400

ggaggatttt tgtttttggg taatgattat cagtaattcc cacaaaatca gcaagaccaa    32460

tctgccatgc accagaattg ataaaggctt gtctaacttg ttccttggtt aaagggacaa    32520

ctattttgtc tgggtcattt ccacacaatt ttattattcg taatcttgcc tgaccaatta    32580

atgtagctat ttgagccaag tataatgtaa aagtcttaat tgtactgtga ggaaggaatg    32640

accactccac aagatcagta ttttgaacaa tgatgcctgt tggaaaatgt gcagtagcaa    32700

aaatcaaaag ttggagtggg gctaagggat ctattctatt tattgcactg actgaatttt    32760

ttcttccact aatttaattt cttttgttgc ctctcgggtt aatattcttt tactatttaa    32820

gtctgggtct cctcttaaga tagagaacaa atttgacatg gcataagtag gaatacctag    32880

agttggccaa atccaattaa tgtctcctag caatttttga aaatcattta atgtttttaa    32940

tgtgcctttt cttatttcta ttttttgtgg cttaattttt ttattttcta tctgcatccc    33000

taaataatga aaaggagtag aggtttgaat cttaccagat gctattgcca gtcctgcgtt    33060

ggcaacctct gcttgcagaa atgtgtaaca gtcaattaat ttgtctctcg tttctgcagc    33120

acatcaaata tcaacgtaat gaataacagt ctgaaaactt atctctaact ggttgaagag    33180

cttgacctac gaaagtctga caaatagttg gactattaag cattccctga ggtaacactt    33240

tccactgaaa cctggtggct ggttctttat tatttatggc tggtatagta aaggcaaatt    33300

tttcacaatc ctgctccacc agaggaatgg taaaaaagca atccttcaga tcaattataa    33360

ttaaaggcca gtcttttggg atcatggccg gagagggcaa ccctggttgg agatgcccca    33420

tgggttgaat tatggcattt acggccctta agtcagttaa cattcgccat ctgctggatt    33480

ttttctgaat tacaaacaca ggagaattcc aaggcgagaa tgaaggctca gtatgtccgt    33540

tttctgattg ttactttgct aataaatgta aagcctccag ttttcgtttt ggtagcagcc    33600

actgatttac ccatacaggt ttttctgttt tccaagttaa tggagtgggt ttaggaggat    33660

ctacagtggc cgcccctaaa aaggataccc tattgctgct gtttcttgat ttccctcaat    33720

ctcaattggg actttaatgc cattttcatt ttttcctagt ccctttcctg gtatatatcc    33780

catcttagtc gtgatttttt gatttgtggg gctatataat ggggcaggca tagtgatttc    33840

ctcaccccat tgttgtaata aatctcgacc ccacagatta acgggaattg aagtaatcat    33900

tggctgaaca gtactttctt gattatctgg ccctaagcaa tgtaaaatct cagcactttg    33960

atacacttct gaggcagtgc ctacgccgac aagtcctgta acagcctttt gtttaggcca    34020

attttttggc caccgattga aagcaatgat agagacatct gctgcagtgt ctaccaaccc    34080

ctcaaactgt tttccttgaa taatggcctt acacacaggt ctgctctctg agacctgact    34140

tgcccaatat gcagcctagc tggatcagtg cttccaaacc ctcctgttct ttttatctca    34200

ctgttttcaa ccttaatata aggcaggaat aattaagcaa tcctgtctcc tggactggca    34260

ctccaaggaa ctgaggagct aataaccaat tgaatttcga ctttgtagtc tgaatcaacc    34320

acaccagtat gaatttgaac tccctttaga tttagactcg atcttcctga gattagtcct    34380

acagtcccct caggccgtgg gccatatatc cctgtgggga tttttttgtg ggggctccct    34440

ggaagcagag agactgcttg tatagtacac aaatctactg ctgcactgcc gcttgtggcc    34500

ggggacagtt gctgtattgt ggtaactggc ccattccctg aagcacttgt gacagtgggg    34560

gttgttgtcc ctgaaaaccc tgaggaacaa agggctaaat tgggaatgcc ccagtttgtt    34620

gcggggcctg aggctggccc ctcttctcgt ttcccgacaa tggttgccca tttttatcaa    34680

atttagaatg acattgacta gcccaatgtt ttcctttttt acctcttgga cataagtcag    34740

gtggctcttt atctgttctt gtagtagttt gaatagttat attttgttta tttgaggctg    34800

ggcaattctt tttttgatga ccaatttgtc cacaattata acattttccc ctaaatgttc    34860

taacttgtcc tcctaaagca agtcccgtta ttgcttgagc gataagcata gctttatgca    34920

tagctcctcc aattccatca caggctttta cgtactcttg agattacatc tgatcccact    34980

gggacctttc cttttaatgg tttaatggct gattgacact caggattggc attttcgtat    35040

gccatcaact ccactatgac cttacgggca ttctcattgg taattgactt ttgagcagca    35100

tcttggaggc ttgccgcaaa atcagggtag ggctccttta gcgccttgtc ttattgtatt    35160

gaatgagggg caggcggttc ctgggtcttg gcttttttcc caggctctaa ggcagatagg    35220

tctaacttgc tcagtggcct cattttacat tattgcttgt taattagtag tgctccaatt    35280

ttgacctgtt cctaatagtt gatctgcatc tatgttaact ggaggattgg cagccctatt    35340

tttttggacc tgttcttgtg ccccatcaat ccaccaagtc ttcaccaagt cttaaattgt    35400

aaacattgag agggtgagag cgatcatttg gccaaaatct cccaatcata aagaatgagt    35460

ctatgtccat gagcaatgga atctaataat gtcctcatat aaggggagtt gggtccatac    35520

tgttttactc cctctttcat atcttttagc atttttatgg aaaaggactc atatctggcc    35580

tcagctaggg gaggcgctcc ctcttgggcc tcttcttcag gtggtatcgg ttctaatatt    35640

actgggaatt gccatgcctc ggtatctcct tgttttcttg ccttatcaat aattttatgt    35700

aatgcactac cctgtccact aggtggtggt gtaggattaa atctcatagt gggctgctga    35760

ggatatagcg ccctgccctg tggtgctgga aacattcctg gctgtccata ctgattttct    35820

gggggcggct gatcctgaag ttcggctggc ggccagtatt gataggttac tggcggttgg    35880

gtcttatttt ccaccggctg atattgtgga tactgtattt ggattggcat tgccgtgaca    35940

gagactctat ctttccctat ttgatattct tttggggttt gtacttgtct aacctgcatt    36000

tgaggttgta atgttacagg catctgaact gctgggagag gagttggcca tcgtggttta    36060

gactctgatg gccccactaa ttctggacct ttttcttcta attttaacat ttcaggatat    36120

atcacttcct gtaattgatt atagtcaaca ttttgcattg accgaaccat taccggctct    36180

gctacatatt tacaatgtga actttccgtt cctttcccag attctatccc tgcctcttct    36240

tcacaatcta ttacacattt tccagggcat cagaaactga aatgctatct tctcctgttt    36300

gaaacagttc taaagctact ttaataatgg cccaatcatt ccatactgta agtgggatga    36360

ttttaccctc cctacttgct tgttttaatt ctttgccaat tttttcccaa tcttttagat    36420

ctaaagttcc ccgttctaga aaccatgggc agaattgttc tattgtttga aatagagtga    36480

ttagattttt tttgtagaga ctctgactcc ccctcttttt aaaagaattt taatggagct    36540

aagaggcata tttactttta gtttgtccca ttgttaccct ggcttcttct gagcgcacaa    36600

gtttaccgca aagggtgacc atagacgtac tcaggaatct ctcgttgact tgtcctcatt    36660

gaccacgctc gagcgtacct tcaccctaga gaaaagcacc tacgttggac acccgatgaa    36720

ggagtggcct gcccctccac acctgtgggt gtttctcgtc aggtggaatg agagacttga    36780

gaaaagaaag agacacagaa acaaagtata gagaaagaaa agtgggccca ggggaccggc    36840

gctcaccata cggaggaccc gcgccagcac tggtctctga gttctctcag tgtttatgga    36900

tcattatctc taccatcttg gagaggggga tgtggcagga ccgtagggta atagtgggga    36960

gagggtcagc aggaaaacat gtgaacagag gtctttgtgt cataaataag tttaaggaaa    37020

ggtgctgtgc cttgatgtac atgtatacaa acatctcggt gcattaaata gcagtattgc    37080

tgctagcacg tctcacctcc agccctaagg cagttttctt ctatctcagt aaatagaaca    37140

tacaattggg ttttacactg agacattcta ttgcccaggg acaagcagga gacaggtgcc    37200

ttcctcttat ctcaactgca gagaggcctt cctcttttac taatcctcct cagcacagac    37260

cctttacggg tgttgggctg gggggcggtc aggttttccc ttcccacgag gccatatctc    37320

aggctatcac atggagagaa accttggaca atacctggct ttcctaggca gaggttcctg    37380

tggccttcca cagtgtattg tgtccctggg tacttgagat tagagaatgg tgatgacttt    37440

taacaagcac gctgccttca agcacttttt taacaaagca catcctgcat agccctaaat    37500

ccattaaacc ttgagtcaac acagcacatg tttcagggag cacaaggttg ggggtagggt    37560

tacagattaa tagcatctca aggcagagga atttttctta gtacagaaca aaatggagtc    37620

tcttatgtct acttctttct acatagacac agtaagaggc tgatctctct ttcttttccc    37680

cacaaagacc agcttggcca acatggtgaa accctgtctc tactaaaaat acaaaaaaat    37740

ttagccaggc atgatggcac acgcagggat tcccagctac cttggagctg aggcaagaga    37800

attgcttgaa tccaggaggt ggaggttgca gtgaaccgag atcacaccac tgcacttcag    37860

cctgggcaac agagcaggac tccacctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaatgcacca    37920

tttcgcctca tctctcagca tttgacataa ccgatcattc cttcttaaaa cacttttttt    37980

ggaaaatatg ggtggagcca agatggccaa ataggaacag ctctggtcta cagctcccag    38040

catgaacgac gcagaagacg ggtgatttct gcatttccat ctgaggtacc gggttcatct    38100

cactagggag tgccagacag tgggtgcagg acagtgggtg cagcacactg tgtgcgagcc    38160

gaagcagggc gaggcattac ctcactcagt aagtgcaagg ggtcagggag ttccctttcc    38220

tagtcaaaga aaggggtgac agacggcacc tggaaaattg ggtcactccc accctaatac    38280

tgcgcttttc caacgggctt aaaaaacagc acaccaggag attatatccc acacctagct    38340

cagagggtcc tatgcccatg gagtctcact gattgatctc agactgctgt gctagcaaac    38400

tgcaaggcag cagcgaggct gggggagggg tgcctgccat tgcccaggct tgcttaggta    38460

aacaaagcag cctggaagct tgaactgggt ggagcccacc acagctaaag gaggccttcc    38520

tgcctctata ggctccacct ctgggggcag ggcacagaca aacaaaaaga cagcagtaac    38580

ctgtgcagac ttaaacgtcc ctgtctgaca gctttgaaga gagtagtggt tctcccagca    38640

cgcagctgga gatctgagaa cggacagact gcctcctcaa gtgggtccct gacccccgag    38700

cagcctaact gggaggcacc ccccagtagg ggcagactga cacctcacat ggccgggtac    38760

tcctctgaga caaaacttcc agaggaacga tcaggcagca gcatttgcgg ttcacgaaaa    38820

tcggctgttc tacagccacc gctgttctgc agccactgct gctgataccc aggcaaacag    38880

ggtctggagt ggacctctag caaactccaa cagacctgca ggcgaggctc ctgtctgtta    38940

gaaggaaaac taacaaacag aaaggacatc cacaccaaaa acccatctgt acgtcaccat    39000

catcaaagac caaaagtaga taaaaccaca aagatgggga aaaaacagag cagaaaaact    39060

ggaaactcta aaaagcagag cacctctcct cctccaaagg aatgcagttc ctcaccagca    39120

acagaacaaa gctggatgga gaatgacttt gatgagttga gagaagaagg cttcagacga    39180

tcaaactact cccgagctac aggaggaaat tcaaaccaat ggcaaagaag ttaaaaactt    39240

tgaaataaaa attatacgta tgtataacta gaataaccaa tgcagagaag tacttaaagg    39300

agctgatgga gctgaaagcc aaggctcaag aactatgtga agaatgcaga agcctcagga    39360

gccgacacga tcaactggaa gaaagggtat cagtgatgga agatcaaatg aatgaaatga    39420

agcaagaaga gaagtttaga gaaaaaagaa taaaaagaaa caaacaaagt ctccaagaaa    39480

tatgggacta tgtgaaaaga ccaaatctat gtctgattgg tgtacctcaa agtgacaggg    39540

agaatggaac caagttggaa aacactctgc aggatattat ccaggagaac ttccccaatc    39600

tagcaaggca ggccaccatt cagattcagg aaatacagag aacgccacaa agatacttct    39660

cgagaagagc aactccaaga cacataattg tcagattcac caaagttgaa atgaaggaaa    39720

aaatgttaag ggcagccaga gagaaaggtc aggttaccca caaagggaag cccatcagac    39780

taacagctga tctctcagca gaaactctac aagccagaag agaagggggg ccaatattca    39840

acattcttaa aagaatttcc aacccagaat ttcatatcca gccaaactaa gcttcataag    39900

tgaaggagaa gtaaaatcct ttacagacaa gcaaatgctg agagattttg tcaccagcag    39960

gcctgcccta aaagagctcc tgaaggaaac actaaacata gaaaggaaca acctgtacca    40020

gccactgcaa aaacatgcca aattgtaaag accatcaagg ctgggaagaa actgcatcaa    40080

ctaatgagca aaataaccag ctaacatcat aatgacagga tcaaattcac acataacaat    40140

attaacttta aatgtaaatg ggctaaatgc tccaattaaa agacacagac tggcaaattg    40200

gataaagagt caagacccat cagtgtgctg tattcaggaa acccatctca cgtgcagaga    40260

cacacatagg ctcaaaataa agggatggag gaagatctac caagcaaatg gaaaacaaaa    40320

aaaggcaggg gttgcaatcc tagtctctga taaaacagac tttaaaccaa caaagatcaa    40380

aagagacaaa gaaggccatt acataatgtt aaagggatca attcaccaag aagagctaac    40440

tatcctaaat atatatgcat ccgatacagg agcacccaga ttcataaagc aagtcctgag    40500

tgacctacaa agagacttag actcccacac aataataatg ggagacttta acaccccact    40560

gtcaacatta cacagatcag caagacagaa agttaacaag gatacccagg aattgaactc    40620

agctctgcac caagcggacc taatagacat ctacagaact ctccacccca aatcaacaga    40680

atatacattt tttttcagca ccacaccaca cctattccaa aactgaccac atagttcgaa    40740

gtaaagctct cctcagcaaa tgtaaaagaa cagaaattat aacaaactgt ctctcagacc    40800

acagtgcaat caaactagaa ctcaggatta agaaactcac tcaaaaccac tccactacat    40860

ggaaactgaa caacctgctc ctgaatgact actgggtaca taatgaaatg aaggcagaaa    40920

tcaagatgtt ctttgaaacc aatgagaaca aagacacaac ataccagaat ctctgggaca    40980

cattcaaagc agtgtgtaga gggaaatata tagcactaag tgtccacaag agaaagcagg    41040

aaagattcaa aatggacacc ctaacaccac aattaaaaga actagaaaag caagagcaaa    41100

cacattcaaa agctagcaga aggcaagaaa taactaaaat cagagcagaa ctgaaggaaa    41160

tagagacaca aaaaaaaacc ttcaaaaaat taatgaatcc aggagctggt tttttgaaaa    41220

gatcaacaaa attgatagac tgctagcaag actaataaag aagaaaagag agaagaatca    41280

aatagatgca ataaaaaatg ataaagggga tatcaccacc aatcccacag aaatacaaac    41340

taccatcaga atactacaaa cacctctatg caaataaact agaaaatcta gaagaaatgg    41400

ataaattcct tgacacatac accctcccaa gactaaacca ggaagaagtt gaatctctga    41460

atagaccaat aacaggatct gaaattgtgg caataatcaa tagcttacca accaaaaaga    41520

gtccaggacc agatggattc acagccaaat tctaccagag gtacaaggag gagctggtac    41580

cattccttct gaaactattc caatcaatag aaaaagaggg aatcctgcct aactcatttt    41640

atgaggccag catcatcctg ataccaaagc ctggcagaga cacagccaaa aaagagaatt    41700

ttagaccaat attcctgatg aacattgatg caaaaatcct caataaaata ctggcaaacc    41760

gaatccagca gcacatcaaa aagcttatcc caccatgatc aagtgggctt catccctggg    41820

atgcaaggct ggttcaacat acacaaatca ataaatgtaa tccagcatat aaacagaacc    41880

aaagacaaaa accacatgat tatctcaata gatgcagaaa aggcctttga caaaattcaa    41940

caacccttca tgctaaaaac tctcaataaa ttaggtattg atgggatgta tctcaaaata    42000

ataagagcta tctatgacaa acccacagcc aatatcatac tgaatgggca aaaactggaa    42060

gcactcactt tgaaaactgg cacaagacag agatgccctc tctcaccact cctattcaac    42120

atagtgttgg aatttctggc cagggcaatt aggcaggaga aggaaataaa ggttattcaa    42180

ttaggaaaag aggaagtcaa attgtccctg tttgcagatg acatgattgt gtatctagaa    42240

aaccccattg tctcagccca aaatctcctt aagctgataa gcaactacag caaagtctca    42300

ggatacaaaa tcagtgtaca aaaatcagca gcattcttat acatgaataa cagacaaaca    42360

gagagccaaa tcatgagtga actcccattc acaattgctt caaagagaat aaaatatcta    42420

ggaatccaac ttacaaggga cgtgaaggac ctcttcaagg agaactacaa accactgctc    42480

aatgaaataa aagaggatac aaacaaatgg aagaacatta catgctcatg ggttggaaga    42540

atcaatatca tgaaaatggc catactgccc aaggtaattt atagattcaa tgccatcccc    42600

atcaagctac caatgacttt cttcacagaa ttggaaaaaa ctactttaaa gttcatatgg    42660

aaccaaaaaa gagcccgcat tgccaagtca atcctaagcc aaaagaacaa agctggaggc    42720

atcatgctac ctgacctcaa actatactac aaggctacag taaccaaaac agcatggtac    42780

tggtaccaaa acagagatat agatcaatgg aacagaacag agccctcaga aataatgccg    42840

catatctaca actatctgat ctttgacaaa cctgacaaaa acaagcaatg gggaaaggat    42900

tccctattta ataaatggtg ctgggaaaac tggctagcca tatgtagaaa gctgaaactg    42960

gatcccttcc ttacacctta tacaaaaatt aattcaagat ggattaaaga cttaaacgtt    43020

agacctaaaa ccataaaaac cctagaagaa aacctaggca ataccattca ggacataggc    43080

atgggcaagg acttcatgtc tcaaacacca aaagcaatgg caacaaaagc caaaactgac    43140

aaatgggatc taattaaact aaagagcttc tgcacagcaa aagaaactac catcagagtg    43200

aacaggcaac caacaaaatg gtagaaaatt ttcgcaacct actcctctga caaagggcta    43260

atatccagaa tctacaatga actcaaattt acaagaaaaa aacaacccca tcaaaaagtg    43320

ggtgaaggat atgaacagac acttctcaaa agaagacatt tatgcagcca aaaaacacat    43380

gaaaaaatgc tcatcatcac tggccatcag agaaatgcaa atcaaaacca caataccatc    43440

tcacaccatt tagaatggca atcattaaaa agtcaggaaa caacaggtgc tggagaggat    43500

gtggagaaat aggaacactt ctacactgtt ggtgggactg taaactagtt caaccattgt    43560

ggaagtcagt gtggtgcttc ctcagggatc tagaactaga aataccattt gacccagcca    43620

tcccattact gggtatatac ccaaaggact atatatcatg ctgctataaa gacacatgca    43680

cacgtatgtt tattgtggca ctattcacaa tagcaaagac ttggaaccaa cccaaatgtc    43740

caacaatgat agactggatt aagaaaatgt ggcacatata taccatggaa tagtatgcag    43800

ccataaaaaa tgatgagttc atgtccttta tagggacatg gatgaaactg gaaatcatca    43860

ttctcagcaa actatctcaa ggacagaaaa ccaaacaccg catgttctca ctcataggtg    43920

ggaattgaac agtgagaaca cagggacaca ggaaggggaa catcacactc cagggactgt    43980

tgtggggtgg ggggaggcgg gagggatagc attaggagat atacctaatg ctaaatgacg    44040

agttaatggg tgcagtacac caacatggca catgtataca tatgtaacaa acctgcacat    44100

tgtgcatatg taccctaaaa cttaaagtat aatttaaaaa aacaacaaca catttttcac    44160

atggcttctg gggttccgtg ctctcttaat ttttctcctt cctcaatggc tattccttct    44220

tagtctccat tgctgtttcc ttctcatcta cctgaagtga cccagggttc aatcctcaaa    44280

cttccctttt tcatccttcc ccttctgttt tgtatataaa ggtacgccct gggtgacctc    44340

atcaaatctt gtagctttaa atgttatttc gtgatgactt tcaaacttat atttgtaatc    44400

cagatacctc cccagagtca catacttaca catttgtgtc tattgaacat cttcatttga    44460

tatctaatag ttcaaaacca gacttttcac aatccctccc aggtctgccc catcacagtg    44520

aggagttctc agtaagtagc acttccattg ttccaacctt tcaggcaaaa cctgcatagt    44580

cttccttgtc ttctcttttc atgttacatg tccattccac caacaaatcc tctgtagtat    44640

accttcaaaa tatatccact atctaatgat acctcacttc ctccaccctt acctccacca    44700

tcatctggtc tgagtcaggt ggattattgt tgtagccgcc taatttctat ccatctagct    44760

tctgtacttt cccattaact atctttgtat ttactaattt tggctcccca actcagagta    44820

aaagtcgatt ttttaaagat ggctgagact gaggtcagat ggattttttc ctgtctctga    44880

actttaggcc ttgaataggt tccaattttg taaaatggtt tatttctaat ccctgccctt    44940

ttgtgggtga aggccttgtc tcttgaattt tttcagaaca ctaagataca accttaggct    45000

attgaagcca gcaaatgtcc caagggtagc tctaacttca gagcatgttc acctctccag    45060

tttctggctc tcagctctca cttcattgct tgacttcttt attttctttt actcttgtct    45120

tttttttttt tttttttttt ttgagcggag tctcgctctg tcacccaggc tggagtgcag    45180

tggtgcaatc ttggctcact gcaacctcca cctcctggtt caagtgattc tcctgcctca    45240

gcctcccgag tagctgggac tacaggcgtg tgccaccatg cccagctaat ttgtgtgtgt    45300

gtatttttag tagagagggg gtttcacgag tgttagccaa gatggtctca atctcctgac    45360

ctcgtaatcc gcccgcctca gcctcccaaa gtgctggtat tacaggcatg agccactgcg    45420

cccagcctta atcttgtcta tatttttaaa aggatgtttg tcatatttta cccaccattt    45480

attggtgttt gttaagaaat ctgatatacc attcagatac caactgtatc cacctactgt    45540

cacagtcata atatacaaca gttctattaa ccatccctaa attccctcat gctttcttct    45600

ttcattgtca acctctcccc tttaaccatt cccagcctat gaaaaactac tcaccaaatt    45660

ccatccatat agttttgctt tgtcaagaat gtcatataaa tagaatcaaa atatggcttt    45720

tctcacttag caaaatatat ttaagattta tccatattgt tgcatggatc aatttgtttc    45780

tgttattgtt gagtaatgtt gcatgaatca atactttgtt tctgttattg ctgagtaatg    45840

ttccagtacc tggaatggcc aaagtttgct gattcattcg ccttttgagg gacatctggt    45900

agttccagtt tggagcactt ctgaataaag ctgttataat ctttgacata tagatgtttg    45960

tgtgagcata agtgtaaata ctaatgtgac tgctgtatca tatgctaaat gtatgtttaa    46020

cattataaga aactaccaca ctctttttta ccatagttac agtgttttgc actctcagca    46080

acagtatttg agaatttttg tgttctgttt cttgatctgt atttctaact gaaatattct    46140

ttatcactat agactccttc ccttatattg gataattgtt ttttttttct ttttcttttt    46200

ttatgagcca gagtctcgct ctgttgccca ggctggcttg ctagtggtga gatcttggct    46260

cactgtaacc tctgcctccc tggttcaagt gattctcctg cctcagcctc ccaagtaatt    46320

gggattacag gcacctgcca ccacacccag ctgattttgt attttgtttt ttttgagatg    46380

aagtcttgca ctgtcaccca ggctggtgtg cagtggcatg atctcggctc actgcaacct    46440

ccgcctccca ggttcaagcg attctcctgc cttagcctcc cgagtagctg ggattacagg    46500

cacccgccac catgcctggc taattttttg tatttttagt agagacgggt tttcaccatg    46560

ttggccaggt tggtctcgaa ctcctgacct caaatgatcc acctgccttg gcctcccaaa    46620

gtgctgggat tacaggcatg agccactgcg cctggcatga ataattgcct tttttctctc    46680

caacattcca tgagattata gaaccctttc attacgttat agacctgtag tagtgcctgg    46740

gaactctagg atgtgttctt cccagaacac acagaattgt ccttgaatag acaagtaaat    46800

aagagaagac atgaggcaag gcatgaagaa acaaaggaaa ctgtgaagta aggataagta    46860

aaagcaactt agtatcctat ttgaaaggga tagagagagc taaagagcaa ttggagaggc    46920

atataggatc atagatttag tatggaggtg cttttgtttc tatgtgtaag gaagttatag    46980

ggaaaccaca gatcactggt ttctaggcat gtaccactag ggtggtatga agggttgatt    47040

acagagaaac aggacaaggg tatttaggag tgacagaagt atgacggtgg gtggatacat    47100

gatttgtgtc cttataagtc aaagtttctt ttgttttttc tcctgttttt cattcacctg    47160

gtttttattg agtgctttca ttacctagtt tttattgagt gctagacatc acaaagaaaa    47220

gttataaggt ttcagtcctt ggataacatt atacaaaatc caataaagat ttaagtttgc    47280

tatggcaagc agtcttgaat caccataatc caaatttttg aaatttgagc tgattcaaag    47340

atgattcaga cttcagactc tgtccagatt ggtctactgt ttctccttta ttcctcagta    47400

tagctctcag ggttcccaac ccaaagtata aagaattcat ggcaggccct atcctccagt    47460

tattgttgcc cagccctgtg acacagtcca aaacactgtt tagtttctcc ccctcttagc    47520

tttttctaga atcataagac ttctctaagt ggaaatgtgg acccagatgt tgggcttatc    47580

tctttgattt tcatattttt caatttttag ccacccactc tttattatgt aaacgctcca    47640

gtggcttcac tcaggtgcct tttataattt gcttaatttg tataattgct atcatctaga    47700

aggttggtct aaattaccta aattaccaga aattaatgtt taagatttag gggctgataa    47760

ttaaattaag acctgaagaa tgaggaagag tgtttgtata gtctcatcca gagcagtcca    47820

aagaaatgga ataggctctg gctagctttt aattgaaaaa ggtctgtgac tttttcagag    47880

ttgaaaggaa gctagttttt ctggcaaata aggagcgaag ctgagaaggc tcaacagata    47940

cataagcaag gagaagacca tggaagggga aataagtcaa agtcattgaa gagtttggat    48000

tttatattaa tatggaagct actaaaaagt attaagcaga taaagaaaat cattatctga    48060

atctgaatca gttgatagga aggattaaaa ttacagatct ccaggatctt tttctgattc    48120

actagcagtt agtctggtgt aatgttggac agctataatt ttaacatgct ccccaggtga    48180

ttttgatccc caccaaggct tgagaactac tcactttaaa attgttctta atctcttccc    48240

ttatcttctc aagtgagttt tcattattct ctaatctctc agatgcccct ttcatatatt    48300

aatatatgag atccttctta gctaattttt tttaaaattc tagataggaa cattactgta    48360

ccatgaaatc agtgtagtgg ggtttgtctg catgtgtatg agacagagaa attgaaaaaa    48420

gtagaaatat tgcagaatag aatagaaagc agggaagata ctgttttatg aaactgtata    48480

tatatagtag gttgtgatgt gaaaggtagg tattatatgt cataataatc aatatttgaa    48540

acaaactcat gtatgtctgt tatttcttat gggcattatt ttcctattat ttgtcttttc    48600

tatagaagtt atatttctca atttttttat tctctcttat ctttcagact tgccttcaag    48660

gtgtgcaagt aaggacttat ctccagaaaa gaacacttat gaaacagaat tatcccaatg    48720

ggaaatgagt gacagacttg aaaactgtga tcttgaagag tccaattcca gggattattt    48780

ggaagccaaa ggcaagatgg agaagcaaca agaaaatcag aaggaatatt tcaggcaagg    48840

gatgatcata tatgacaaaa tgtccatttt caaccagcat acttacttat ctcaacattc    48900

aagatgtcat tctactgaga aaccctataa atgtaaggaa tgtgggaaag ccttcagacg    48960

agcctcacac ctaacacaac atcaaagtat tcatactggt gaaaaaccct atgaatgtaa    49020

gcaatgcggg aaggccttta gtcgtgattc acaactcagt cttcatcaga gacttcatac    49080

tggtgagaaa ccctatgcat gtaaggaatg tgggaaggcc tttactcaaa gctcacaact    49140

tattttacat catagaattc atactggtga aaaaccatat aaatgtgaag aatgtgggaa    49200

agcctttatt cgtagctcac aacttacccg acatcaaaaa gttcatactg gtgagaaacc    49260

ttatgaatgt aaagaatgtg ggaaggcctt tactcagaat tcacaactta cactacacca    49320

gagacttcat actggtgaaa agctctatga atgtaaagaa tgtaggaagg tctttactca    49380

gctctcacaa cttattctgc ataagagaat tcataccggt gagaaaccct atgaatgtaa    49440

ggaatgtgga aaagctttta tttgtggctc acagctttct caacatcaga aaattcataa    49500

tggggaaaaa ccatatgaat gtaaggaatg tggaagggcc tttattcggg gctcactact    49560

gatgcaacat cagaggattc atactggtga aaaaccctat aaatgtgaag aatgtgggaa    49620

ggcctttatc cgtggctcac aacttactca acaccagaga attcacacca atgaaaagcc    49680

ctatgaatgt aaggaatgtg gaaagatgtt tagtcatggc tcacaactta ctcaacatca    49740

gagaatacac actggtgaga aaccctatca atgtaaggaa tgtggaaaag cgtttaatcg    49800

tggctcactc cttacacgac accagaggat tcatactggt gagaaaccct atgaatgtaa    49860

agaatgtgga aaaaccttta gtcgtggctc agaacttact caacatgagc gaattcacac    49920

aggtgagaaa ccctatgaat gtaaggaatg tgggaaatct tttattcgtg gttcccagct    49980

tactcaacat cagagaatcc atactggtga gaaaccttat gaatgtaaag aatgtagaat    50040

ggcctttact cagagttcac atctttccca acatcaaaga cttcacactg gtgagaaacc    50100

ctatgtgtgt aatgaatgtg gaaaggcctt tgcgcgtggc ttactactta tacaacatca    50160

gagaattcat actggtgaga aaccatatca atgtaaggaa tgtgggaaag cctttattcg    50220

tggttcacag ttgactcaac atcagcgaat tcacactgga gaaaaaccct atgaatgcaa    50280

ggagtgtggc aaggccttta gtcatggctc tcagcttact ctacatcaga gaatccatac    50340

tggtgagaag ccctatgaat gcagagaatg tagaaaggcc tttactcaga gttcacatct    50400

ttctcggcat cagagaattc atactggtga gaaaccatat caatgtaagg aatgtgggaa    50460

ggcctttact cgtggttcac agctaactca acatcagaga attcatatca gtgagaaatc    50520

ttttgaatat aaggaatgtg ggattgactt tagtcatggc tcacaagttt acatgtgaat    50580

tgtctgatta tttgagatca ctatgaagag gttctctggt tgttagcagc aaagaattct    50640

cacaaatgtg aatatgggcg cacatttgcc tcataaagca cagcatcaga taatttatgt    50700

gagagaaaat ggtagtgtca ttcatataga aaaacatcat tactggaaac ctattaaaca    50760

ttagcaaatt ggagaatagt tttaatatag taaatgtagg aagcccttta gccatattga    50820

aaacaaatat ctttttcaac gttatcttag ctctactagt tgatcttttt gttatatgta    50880

tcatgatact taacctctac cttggtttaa tcattttaag atagacctaa gtatattacc    50940

tttattgtaa gattcttgga agtattatgt aagttattac atgtaaaagc tcttagaatg    51000

gtgccttgaa cgtagcatac cacaaatatt agctaccatt ttcactagtg ttattttaga    51060

gaatttgcat gagaggagag tacttatgag tataatgaat attgagaaat cttttatcaa    51120

cacatccaag atgacttggt tggggggcac tgtatgccat aatgaatgtg agaaagctgt    51180

catttaaatc tcatccatta ttgctataag aggaaattca tactgttaaa aaaaaaaaaa    51240

cccagtggat ataatcagtg tattattaaa aaaaaaaaaa                          51280

Claims (10)

1、p53负调控分子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制p53转录功能的蛋白质。

2、权利要求1所述的p53负调控分子的编码基因。

3、根据权利要求2.所述的基因，其特征在于：所述p53负调控分子的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述p53负调控分子的cDNA基因的开放阅读框架为自序列表中SEQ ID №：2的5′端第225位-2291位碱基。

5、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述p53负调控分子的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述p53负调控分子的基因组基因的开放阅读框架为自序列表中SEQ ID №：3的5′端第10641位-50587位碱基。

7、含有权利要求3、4、5或6所述基因的表达载体，细胞系和宿主菌。

8、权利要求1所述的p53负调控分子的活性片段，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)自序列1的氨基端第1位至70位氨基酸残基；

2)自序列1的氨基端第1位至244氨基酸残基；

3)自序列1的氨基端第1位至514位氨基酸残基；

4)自序列1的氨基端第240位至688位氨基酸残基组成；

5)自序列1的氨基端第72位至688位氨基酸残基组成。

9、权利要求1所述的p53负调控分子活性片段的编码基因。

10、含有权利要求9所述p53负调控分子活性片段的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。

Images