KR20210040992A

KR20210040992A - 검증된 표적에 대한 2차 귀소 활성화를 갖는 케모카인 반응성 활성화된 자연 살해 세포

Info

Publication number: KR20210040992A
Application number: KR1020217005507A
Authority: KR
Inventors: 네이션 쇼머; 로렌트 보이셀; 한스 클링게만
Original assignee: 난트케이웨스트, 인크.
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2021-04-14
Also published as: EP3830113A1; JP2021531808A; IL279964A; CA3107101A1; CN112513069A; WO2020027832A1; AU2018434924A1; US20210324042A1

Abstract

본원에서는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7)을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 제공한다. 임의적으로, 상기 세포는 C-C 모티프 리간드 21 (CCL21)을 코딩하는 핵산, C-C 모티프 리간드 19 (CCL19)를 코딩하는 핵산, 또는 그의 조합을 추가로 포함한다. 변형된 NK-92 세포를 포함하는 조성물 및 키트를 또한 제공한다. 변형된 세포를 제조하는 방법 및 상기 세포를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

검증된 표적에 대한 2차 귀소 활성화를 갖는 케모카인 반응성 활성화된 자연 살해 세포

입양 전달된 종양-특이적 세포독성 림프구 기반의 암 면역요법은 종양 악성 종양을 앓는 환자 치료에 대한 유망성을 제공한다. 특정 암에서의 이러한 초기 성공에도 불구하고, 대개는 종양 미세환경의 면역억제 성질에 기인하여, 종양 치료는 여전히 도전과제로 남아 있다. 변형된 T 세포 이외에도, NK 세포에 기반한 면역요법이 사용되고 있다. NK-92는 비-호지킨 림프종을 앓는 대상체의 혈액에서 발견되었고, 이어서 생체외에서 불멸화된 세포용해 암 세포주이다. NK-92 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 제시되는 주요 억제 수용체가 결여되어 있는 반면에, 대부분의 활성화 수용체는 보유한다. 그러나, NK-92 세포는 정상 세포를 공격하지 않으며, 또한 그들은 인간에서 허용되지 않는 면역 거부 반응을 유도하지도 않는다.

림프절 전이의 공통 유발자는, 주로 나이브 T 세포 및 수지상 세포에서 발견되는 케모카인 수용체인 CCR7의 저산소 구동 상향조절이다. 앞서 혈중 NK 세포 상의 CCR7 수용체 상향조절은 전이성 확산의 공통 경로인 림프절 구획으로의 경로와 동일한 경로를 따라 진행할 수 있도록 하면서, NK 세포의 림프절로의 귀소를 개선시키는 것으로 입증되었지만, 임상적으로 관련된 세포주에서는 입증된 바 없다.

하나 이상의 실시양태에 관한 상세한 설명은 첨부된 도면 및 하기 설명에서 기재된다. 다른 특색, 목적 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

도 1은 NK-92 세포에서의 AAVS1 로커스에의 삽입을 위한 CCR7 수용체를 함유하는 플라스미드 pNKAT-CCR7-LP3을 제시하는 개략도이다.
도 2는 도 1로부터의 플라스미드의 NK-92 세포 내로의 제1 삽입으로부터 퓨로마이신 선택 카세트를 대체함으로써 NFAT-반응성 CCL21 유전자의 순차적 통합을 위해 사용되는 플라스미드 pCRENFAT-CCL21을 제시하는 개략도이다.
도 3은 CCR7을 발현하는 야생형 NK-92 세포 및 변형된 NK-92 세포에서의 NK-92 세포와 연관된 표현형 마커의 발현을 제시하는 그래프이다. (레인 1: aNK (야생형); 레인 2: 변형된 NK-92 세포 (MA3); 레인 3: 변형된 NK-92 세포 (MB4); 레인 4: 변형된 NK-92 세포 (MB6); 레인 5: 변형된 NK-92 세포 (ME6); 레인 6: 변형된 NK-92 세포 (MH3); A: 이소타입 (APC); B: CD54(ICAM-1); C: NKp30; D: NKG2D).
도 4는 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 K562 세포에 대한 세포독성 활성을 제시하는 그래프이다.
도 5는 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 HL-60 세포에 대한 세포독성 활성을 제시하는 그래프이다.
도 6a 및 6b는 (세포가 CD19-CAR에 대한 mRNA로 전기영동되었을 때) K562 및 Sup-B15에의 표적 결합과 관련하여 입증된 NFAT 활성화를 제시하는 그래프이다.
도 7은 케모카인 CCL19 및 CCL21 방향으로 이동하는 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포를 제시하는 그래프이다.
도 8은 CCR7을 발현하는 세포가 CCL19를 발현하는 K-19 세포 방향으로 이동한다는 것을 제시하는 그래프이다.
도 9a 및 9b는 CCR7 이동의 생체내 분석을 제시하는 그래프이다. 도 9a는 CCR7을 발현하는 NK-92 세포 투약 후 3시간째의 CCL19에 의한 종양으로의 귀소의 유의적인 개선을 제시한다. 도 9b는 24시간째 마우스 4마리 중 3마리에서의 CCR7 발현 NK-92 세포의 CCL19를 분비하는 종양으로의 증가된 동원을 제시한다.
도 10은 CCR7 (2행), CCR7 및 CD16 (3행) 또는 CCR7, CD16 및 CD19 (4행)를 발현하도록 변형된 NK-92 세포에서의 CCR7, CD16 또는 CD19의 검출을 제시하는 그래프이다. 야생형 NK-92 세포는 1행에서의 대조군이다.

본원에서는 발현 시 림프구를 림프절로 지시하는 것으로 공지된 케모카인 수용체 (CCR7)를 도입함으로써 림프절로의 귀소, 및 림프절에서의 거동을 개선시키는 것을 기반으로서 세포독성 활성화된 자연 살해 세포주 (NK-92)를 이용하는 조작된 세포를 제공한다. 조작된 세포는 또한 임의적으로, 결국에는 CCR7 수용체에 대한 리간드인 CCL21 및/또는 CCL19를 분비하는 NFAT 전사 인자의 활성화에 기반한 반응 요소를 포함한다. 어느 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 상기 두 증진의 조합을 통해 현존 CCL21 및/또는 CCL19 구배를 이용하여 변형된 세포 상의 CCR7을 환자 체내의 림프절로 표적화할 수 있을 것이다. 전이성 병변이 제거되고, 변형된 세포에 의한 CCL21 및/또는 CCL19 분비가 중단될 때까지 계속 진행되는 피드백 루프를 형성하는 림프절에 전이가 발생하게 되었을 때, NFAT 전사 인자의 활성화 및 변형된 세포에 의한 CCL21 및/또는 CCL19의 발현 및 분비에 의해 CCL21 및/또는 CCL19 구배는 증폭된다.

본원에 기재된 바와 같이, 선택가능한 마커를 포함하는 제거가능한 선택 카세트와 함께 CCR7 발현 카세트를 함유하는 선형화된 유전자 구축물로의 전기천공 후, 신장 인자 1a (EF1a) 프로모터에 의해 구동되는 CCR7 림프절 귀소 수용체의 안정적인 장기간 발현을 보이는 변형된 NK-92 세포를 생성하였다. 퓨로마이신 선택 1주 후, 이어서, 연속 희석 클로닝하고, 고수준으로 CCR7 발현을 유지하는 모노클로날 세포주를 확립하였다. 이들 CCR7을 과다발현하는 NK 세포는 이동/침습 검정법에서 림프절 연관 케모카인 CCL21 및 CCL19에 대해 기능적으로 반응한다.

감수성 세포주의 표적 결속은 NK-92 세포에서 NFAT 전사 인자의 활성화 및 그의 핵 전위에 의해 인식되는 것으로 제시된다. CD16 또는 CD3 경로 (ADCC 또는 CAR 매개 표적 인식 포함)를 포함하는 표적 결합은 NK-92 세포에서 NFAT 활성화를 유도하는데 충분하다. 이는 NFAT 결합 도메인 플랭킹된 3개의 정지 영역 및 반딧불이 루시페라제를 구동시키는 최소 프로모터를 함유하는 리포터 카세트를 삽입함으로써 입증되었다. CD19 CAR mRNA를 상기 리포터 세포주 내로 전기천공시키고, 이어서, Sup-B15 (CD19+, 단, 비-특이적 세포독성에 대해서 내성)와 함께 공동-배양하여 CD3 수용체에 의한 NFAT 활성화는 루시페라제 발현을 초래하였다. 표적 인식 시 CCL21 및/또는 CCL19 발현을 구동시키는 최소 프로모터와 쌍을 형성한, 동일한 NFAT 결합 도메인을 이용하여 조건부 CCL21 및/또는 CCL19 발현 벡터를 구축할 것이다.

NK-92 세포주는 비-호지킨 림프종 진단을 받은 50세 남성의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 확립된 인간, IL-2-의존성 NK 세포주이다 (Gong, et al., Leukemia. 8:652-8 (1994)). NK-92 세포는 CD3, CD8, 및 CD16의 부재 하에서의 CD56^bright 및 CD2의 발현을 특징으로 한다. CD56^bright/CD16^neg/낮은 표현형은 말초 혈액 중 소량의 NK 세포 서브세트에 전형적인 것으로서, 이는 시토카인 생산자로서의 면역조정 기능을 갖는다. 정상 NK 세포와 달리, NK-92는 대부분의 살해 세포 억제 수용체 (KIR)의 발현이 결여되어 있다 (Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)). 모든 NK 세포에 의해 발현되는, 활성화 기능 및 억제 잠재능을 갖는 KIR 수용체인 KIR2DL4만이 NK-92 세포의 표면 상에서 검출되었다. KIR2DL4는 HLA 대립유전자 G에의 결합을 통해 억제 효과를 매개하는 것으로 간주된다 (Suck, Cancer Immunol. Immunother. 65(4):485-92 (2015)). NK-92 세포의 세포독성 사멸의 우세한 경로는 퍼포린/에스테라제 경로를 통해 진행되고; NK-92는 고수준의 퍼포린 및 그랜자임 B를 발현한다 (Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)).

NK-92 세포는 세포독성 범위가 매우 광범위하며, 혈액 악성 종양 및 고형 종양으로부터 유래된 세포주에 대하여 활성이다 (Klingemann, Blood, 87(11):4913-4 (1996); Swift, Haematologica. 97(7):1020-8 (2012)]; [Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)). 중증 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스에서의 안전성 평가는 NK-92 치료와 관련된 효과, 예컨대, 급성 독성 또는 장기간 발암성은 없는 것으로 제시하였다 (Tam, et al., J Hematother. 8:281-90 (1999), Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)). 인간 백혈병 세포로 챌린지된 마우스 또는 인간 흑색종의 마우스 모델에 NK-92 세포를 투여한 결과, 일부 마우스 종양에서의 완전 관해를 포함하여, 생존 및 종양 성장 억제가 개선되었다 (Tam, et al., J Hematother. 8:281-90 (1999), Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)). I상 임상 시험은 그의 안전성 프로파일을 확증하였다. NK-92 세포주의 특징화는 WO 1998/49268 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002-0068044 (이들은 그의 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.

임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 또한 Fc 수용체 CD16을 발현할 수 있다. "Fc 수용체"라는 용어는 Fc 영역으로 공지되어 있는 항체의 부분에 결합함으로써 면역 세포의 보호 기능에 기여하는 특정 세포 (예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 세포의 Fc 수용체 (FcR)에 대한 항체의 Fc 영역의 결합은 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포의 식세포작용 또는 세포독성 활성을 자극한다. FcR은 그가 인식하는 항체의 유형에 의해 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FCγR)는 항체의 IgG 부류에 결합한다. FCγRIII-A (또한 CD16으로도 명명됨)는 IgG 항체에 결합하여 ADCC를 활성화시키는 저친화도 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다. CD16을 코딩하는 대표적인 아미노산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 12에 제시되어 있다. CD16을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 13에 제시되어 있다. CD16의 완전한 서열은 엔트리 P08637로서 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 살펴볼 수 있다.

임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 13과 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 13과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 12와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 12와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

NK-92 세포의 세포독성은 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-2 (IL-2))의 존재에 의존한다. 따라서, 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 적어도 하나의 시토카인을 발현하도록 추가로 변형된다. 임의적으로, 적어도 하나의 시토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 그의 변이체이다. 임의적으로, 적어도 하나의 시토카인은 IL-2, IL-15 또는 그의 조합이다. 임의적으로, IL-2는 IL-2를 소포체로 지시하는 신호 서열과 함께 발현된다. IL-2를 소포체로 지시함에 따라, 상당량의 IL-2가 세포외로 방출되지 않으면서 IL-2는 자기분비 활성화에 충분한 수준으로 발현될 수 있다. 문헌 [Konstantinidis et al. "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조한다. IL-2를 코딩하는 대표적인 핵산은 서열식별번호: 14에 제시되어 있고, IL-2의 대표적인 폴리펩티드는 서열식별번호: 15에 제시되어 있다.

임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 14와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 14와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 15와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 15와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 제공된 변형된 NK-92 세포는 유리하게는 임상적 부작용을 유발하는 양으로 IL-2를 분비하지 않으면서 IL-2 부재 하에서 유지될 수 있다.

임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 추가로 조작된다. 임의적으로, CAR은 종양-특이적 항원에 대해 특이적이다. 종양 특이적 항원은 비-제한적인 예로서, US 2013/0189268; WO 1999024566 A1; US 7098008; 및 WO 2000020460 A1 (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 종양-특이적 항원은, 제한 없이, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 및 CD33을 포함한다. CAR은 예를 들어, 특허 공개 번호 WO 2014039523; US 20140242701; US 20140274909; US 20130280285; 및 WO 2014099671 (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 바와 같이 조작될 수 있다. 임의적으로, CAR은 CD19 CAR, CD33 CAR 또는 CSPG-4 CAR이다.

본원에서는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7)을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 제공한다. 임의적으로, CCR7을 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, CCR7은 변형된 NK-92 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 모티프 리간드 21 (CCL21)을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 임의적으로, CCL21을 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 모티프 리간드 19 (CCL19)를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 임의적으로, CCL19를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 16과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 프로모터는 하나 이상의 NFAT 결합 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 임의적으로, 프로모터는 서열식별번호: 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 변형된 세포는 CCL19 및 CCL21을 코딩하는 핵산을 포함한다. 임의적으로, CCL21을 코딩하는 핵산은 2A 펩티드 링커에 의해 CCL19를 코딩하는 핵산에 연결된다. 임의적으로, 2A 펩티드 링커는 서열식별번호: 17 또는 18을 포함한다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 CAR을 추가로 포함한다. 임의적으로, CAR은 CD19이다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 Fc 수용체를 추가로 포함한다. 임의적으로, Fc 수용체는 CD16이다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 시토카인을 추가로 포함한다. 임의적으로, 시토카인은 IL-2이다.

본원에서는 CCR7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 임의적으로, 발현 벡터는 CCL21을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함한다. 임의적으로, 발현 벡터는 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함한다. 임의적으로, 발현 벡터는 임의적으로, 각각의 것이 동일하거나, 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된 CCR7, CCL21 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함한다. 임의적으로, CCR7 및 CCL21을 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 임의적으로, 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 임의적으로, CCR7을 코딩하는 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, CCL21을 코딩하는 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 임의적으로, 제2 프로모터는 CCL21 및 CCL19의 발현을 구동시킨다. 임의적으로, CCL21 및 CCL19를 코딩하는 핵산은 2A 펩티드 링커에 의해 연결되어 있다. 예시적인 프로모터는 CMV 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, PGK 프로모터, 및 또한 EF1 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의적으로, 본원에서는 서열식별번호: 1을 갖는 핵산, 또는 서열식별번호: 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 임의적으로, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 임의적으로, 프로모터는 서열식별번호: 3, 9, 10 또는 11, 또는 서열식별번호: 3, 9, 10 또는 11과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 서열식별번호: 2를 갖는 핵산, 또는 서열식별번호: 2와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 또한 제공한다. 임의적으로, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 임의적으로, 프로모터는 서열식별번호: 4 및/또는 서열식별번호: 5를 포함한다. 임의적으로, 프로모터는 서열식별번호: 6, 또는 서열식별번호: 6과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 임의적으로, 제공되는 발현 벡터는 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산, 및 서열식별번호: 2, 또는 서열식별번호: 2와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 둘 다를 포함한다. 적합한 발현 벡터는 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 임의적으로, 발현 벡터는 플라스미드이다.

본원에서는 CCR7, 및 임의적으로, CCL21 및/또는 CCL19을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 NK-92 세포를 프로모터에 작동가능하게 연결된 CCR7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 포함한다. 임의적으로, 본 방법은 CCR7을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 프로모터에 작동가능하게 연결된 CCL21을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 추가로 포함한다. 제2 발현 벡터는 CCL21과 동일하거나 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된 CCL19를 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 본 방법은 CCR7 및 CCL21을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 추가로 포함한다. 임의적으로, 본 방법은 NK-92 세포를 CCR7을 코딩하는 핵산, CCL21을 코딩하는 핵산, CCL19를 코딩하는 핵산 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 포함한다. 발현 벡터는 CCL21 및/또는 CCL19를 발현하는데 사용될 수 있는 것으로서, CCR7을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로, 발현 벡터는 CCL21 및/또는 CCL19에 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, CCL21 및/또는 CCL19에 작동가능하게 연결된 프로모터는 NFAT 전사인자 활성화에 반응성이다.

본원에 사용된 바와 같이, 프로모터, 프로모터 요소, 및 조절 서열이라는 용어는 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하고, 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 영향을 주는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 트라우스트키트리움(Thraustochytrium) 프로모터라는 용어는 트라우스트키트리움 세포에서 작용하는 프로모터를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 코딩 서열의 위치 5'에 있는 비번역 영역 (UTR)이거나, 또는 그를 포함한다. 5' UTR은 mRNA 전사체의 일부를 형성하는 바, 이는 진핵 유기체의 단백질 발현의 필수 부분이 된다. 전사 후, 5'UTR은 전사 및 번역 수준 둘 다에서 단백질 발현을 조절할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 제어하는 프로모터는 다양한 공급원, 바이러스 예컨대 폴리오마, 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시토메갈로바이러스 (예를 들어, 서열식별번호: 11)의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터, 진핵성 번역 신장 인자 1 알파 1 (EF1α) 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 3), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 10) 및 유비퀴틴 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 9)로부터 수득될 수 있다. 본원에서는 서열식별번호: 3, 9, 10 또는 11과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 프로모터를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 선택가능한 마커라는 어구는 선택을 허용하는 산물 (폴리펩티드)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 유전자, 또는 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드) 그 자체를 지칭한다. 선택가능한 마커라는 용어는 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이 본원에서 사용되고, 이는 세포 또는 유기체 내의 그의 존재가 특정의 정의된 배양 조건 (선택 조건) 하에서 세포 또는 유기체에 유의적인 성장 또는 성장 이점 또는 단점을 부여하는 것인 마커를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 선택제라는 어구는 선택가능한 마커를 보유하는 세포 또는 세포 집단에 대하여 유리하게, 또는 그에 불리하게 세포 또는 세포 집단에 선택압을 도입하는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 선택제는 항생제이고, 선택가능한 마커는 항생제 내성 유전자이다. 포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히드로마이신, 및 퓨로마이신이다.

본원에 사용된 바와 같이, 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체 및 보체를 지칭한다. 상기 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 합성, 자연 발생, 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산 서열의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열은 본원에서 인용된 특정 핵산 서열 대신 사용될 수 있다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환가능하게 사용된다.

핵산은 그가 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계 내로 놓이는 경우에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비성 리더를 코딩하는 DNA는 그가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서는 그가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위는 그가 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된이란, 연결되는 DNA 서열이 서로 가까이 있으며, 분비성 리더의 경우, 인접해 있고, 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들어, 비록 임의의 효과적인 3-차원 회합은 허용가능하기는 하지만, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 상기 제2 서열에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결된다. 단일 핵산 서열은 다수의 다른 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로모터는 다중의 RNA 종의 전사를 지시할 수 있다. 연결은 적합한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 동일한 또는 퍼센트 동일성이라는 용어는 하기 기재된 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, NCBI 웹 사이트 등 참조)에 의해 측정된 바와 같이, 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정된 백분율로 갖는 (즉, 비교 창 또는 지정된 영역에 대해 비교되고, 최대로 일치하도록 정렬될 때, 특정된 영역에 대해 약 60%의 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그보다 높은 동일성을 갖는) 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 이어서, 상기 서열은 실질적으로 동일한 것으로 언급된다. 상기 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 지칭하거나, 또는 그에 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열 뿐만 아니라, 치환을 갖는 것도 포함한다. 하기 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 약 25개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고; 필요할 경우, 서브서열 좌표를 지정하고; 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열 대비의 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본원에 사용된 바와 같이, 비교 창은 서열이, 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 인접한 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600개, 일반적으로, 약 50 내지 약 200개, 더욱 일반적으로, 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 위치의 수 중 어느 하나의 세그먼트를 지칭한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해; 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA); 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조) 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)], 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기재된 파라미터와 함께 핵산 또는 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하는데 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 중에서 길이가 동일한 워드와 정렬되었을 때, 일부 양의 값 역치 점수 (T)와 매칭되거나, 또는 그를 만족하는 질의 서열 중 선택된 길이 (W)의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수화 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 점수 역치로서 지칭된다 (Altschul et al., 상기 문헌 동일). 이들 초기 이웃 워드 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾도록 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향 모두로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0임) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0임)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수화 매트릭스가 누적 점수를 계산하는데 사용된다. 각 방향으로 워드 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 획득 값으로부터 정량 X만큼 하락하였을 때; 누적 점수가 하나 이상의 음수 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하가 되거나; 또는 어느 하나의 서열의 끝에 도달하였을 때 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X가 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 기대값 (E)은 우연히 데이터베이스 검색에서 발생할 것으로 예상되는 것과 등가이거나, 또는 더 양호한 점수를 갖는 상이한 정렬의 수를 나타낸다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열인 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대치 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열인 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 기대치 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조), 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 형질전환이라는 용어는 외인성 또는 이종성 핵산 분자 (예를 들어, 벡터 또는 재조합 핵산 분자)가 수용자 세포 내로 도입되는 프로세스를 지칭한다. 외인성 또는 이종성 핵산 분자는 염색체 DNA 내로 통합 (즉, 그에 공유적으로 연결)되어 숙주 세포의 게놈을 구성할 수 있다. 예를 들어, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 에피솜 요소, 예컨대 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 그가 염색체 복제를 통해 딸 세포에 의해 유전되도록 염색체 내로 통합될 수 있다. 형질전환 방법은 인산칼슘 침전; 재조합 핵산을 함유하는 박테리아 원형질체와의 수용자 세포의 융합; 재조합 핵산을 함유하는 리포솜으로의 수용자 세포의 처리; DEAE 덱스트란; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용한 융합; 전기천공; 자기천공; 바이오리스틱 전달; 레트로바이러스 감염; 리포펙션; 및 세포 내로의 직접적인 DNA 미세-주사를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

세포와 관련하여 사용되는 형질전환된이라는 용어는 세포가 외인성 또는 이종성 유전 물질 (예를 들어, 재조합 핵산)을 운반하도록 본원에 기재된 바와 같은 형질전환이 이루어진 세포를 지칭한다. 형질전환된이라는 용어는 또한 또는 대안적으로 외인성 또는 이종성 유전 물질을 함유하는 세포, 세포 유형, 조직, 유기체 등을 지칭하는데 사용될 수 있다.

핵산을 세포 또는 유기체 내로 도입하는 것과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 도입하다라는 용어는 가장 광범위한 의미를 갖고, 예를 들어, 형질전환 방법 (예를 들어, 염화칼슘 매개 형질전환, 전기천공, 입자 충격)에 의한 도입, 및 또한 형질도입, 접합, 및 메이팅을 비롯한 다른 방법에 의한 도입을 포함하는 것으로 의도된다. 임의적으로, 핵산을 세포 또는 유기체 내로 도입시키는데 구축물이 사용된다.

세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등과 관련하여 사용되는 경우에 변형된 및 재조합이라는 용어는 세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등이 실험실 방법에 의해 변형되었거나, 그의 결과이고, 비-자연적으로 발생된 것임을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 변형된 세포는 실험실 방법, 예를 들어, 핵산을 세포 내로 도입하는 형질전환 방법에 의해 생산되거나, 그에 의해 변형된 세포를 포함한다. 변형된 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 변경된, 예를 들어, 비-천연 프로모터에 연결된 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 외인성이라는 용어는 물질, 예컨대 핵산 (예를 들어, 조절 서열 및/또는 유전자를 포함하는 핵산) 또는 폴리펩티드가 세포 또는 유기체 내로 인공적으로 도입되고/거나, 그가 존재하는 세포 내에서 자연적으로 발생하지는 않는 것임을 지칭한다. 다시 말해, 물질, 예컨대 핵산 또는 폴리펩티드는 그가 그 내부로 도입된 세포 또는 유기체 밖에서부터 기원한 것이다. 외인성 핵산은 천연적으로 세포에 존재하는 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, NK-92 세포는, 예를 들어, 헤파라나제와 같은 NK-92 서열을 갖는 핵산을 포함하도록 조작될 수 있다. 임의적으로, 내인성 NK-92 헤파라나제 서열은 천연 조건 하에서는 조절 서열을 포함하지 않는 유전자에 작동가능하게 연결된다. 비록 NK-92 헤파라나제 서열이 천연적으로 숙주 세포에 존재할 수는 있지만, 본 개시내용에 따르면 도입된 핵산은 외인성이다. 외인성 핵산은 천연적으로 세포에 존재하는 임의의 핵산의 것과 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 이종성 핵산, 즉, 상이한 종 또는 유기체로부터의 핵산일 수 있다. 따라서, 외인성 핵산은 천연적으로 공급원 유기체에서 발견되는 핵산의 것과 동일하지만, 외인성 핵산이 도입되는 세포와는 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 내인성이라는 용어는 세포에 천연적인 것인 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이종성이라는 용어는 세포에 대하여 천연적인 것이 아닌, 즉, 세포와는 상이한 유기체로부터의 것인 핵산 서열을 지칭한다. 외인성 및 내인성 또는 이종성이라는 용어는 상호 배타적이지 않다. 따라서, 핵산 서열은 외인성 및 내인성일 수 있고, 이는 핵산 서열이 세포 내로 도입될 수 있지만, 천연적으로 세포에 존재하는 핵산의 서열과 동일하거나, 또는 유사한 사열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 유사하게, 핵산 서열은 외인성 및 이종성일 수 있고, 이는 핵산 서열이 세포 내로 도입될 수 있지만, 세포에 대하여 천연적인 것이 아닌 서열, 예를 들어, 상이한 유기체로부터의 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다.

본원에 기재된 바와 같이, 대조군 또는 표준 대조군이란, 시험 샘플, 측정값, 또는 값에 대한 비교를 위해 참조, 일반적으로 공지된 참조로서 작용하는 샘플, 측정값, 또는 값을 지칭한다. 예를 들어, 시험 세포, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 유전자를 코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 세포는 공지된 정상 (야생형) 세포 (예를 들어, 표준 대조군 세포)와 비교될 수 있다. 표준 대조군은 또한 Fc 수용체를 발현하지 않거나, Fc 수용체 활성을 갖지 않거나, 또는 그를 최소 수준으로 갖는 세포의 집단 (예를 들어, 표준 대조군 세포)으로부터 수집한 평균 측정값 또는 값을 나타낼 수 있다. 통상의 기술자는 표준 대조군이 임의의 개수의 파라미터 (예를 들어, RNA 수준, 폴리펩티드 수준, 특정한 세포 유형 등)의 평가를 위해 디자인될 수 있음을 인식할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "암"이라는 용어는, 백혈병, 암종 및 육종을 비롯한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두부경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가 예로는 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "전이," "전이성," 및 "전이성 암"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 한 기관 또는 또 다른 비-인접 기관 또는 신체 일부로부터의 증식성 질환 또는 장애, 예를 들어, 암의 확산을 지칭한다. 암은, 예를 들어, 유방과 같은 발생 부위에서 발생하고, 상기 부위는, 예를 들어, 원발성 유방암과 같이, 원발성 종양으로 지칭된다. 원발성 종양 또는 발생 부위에서의 일부 암 세포는 국소 부위의 주변의 정상 조직에 투과 및 침윤할 수 있는 능력 및/또는 림프계 또는 혈관계 벽을 투과하여 상기 시스템을 통해 순환함으로써 체내 다른 부위 및 조직으로 이동할 수 있는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암 세포로부터 형성된 제2 임상적으로 검출가능한 종양은 전이성 또는 속발성 종양으로 지칭한다. 암 세포가 전이되었을 때, 전이성 종양 및 그의 세포는 원 종양의 것과 유사한 것으로 가정된다. 따라서, 폐암이 유방으로 전이되었다면, 유방 부위의 속발성 종양은 비정상적인 유방 세포가 아니고, 비정상적인 폐 세포로 이루어진다. 유방에서의 속발성 종양은 전이성 폐암으로 지칭된다. 따라서, 전이성 암이라는 어구는 대상체가 원발성 종양을 앓고 있거나, 또는 앓았었고, 하나 이상의 속발성 종양을 앓고 있는 질환을 지칭한다. 비-전이성 암, 또는 전이성이 아닌 암을 앓는 대상체라는 어구는 대상체가 하나 이상의 속발성 종양이 아닌, 원발성 종양을 앓고 있는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 전이성 폐암은 원발성 폐 종양을 앓거나, 또는 원발성 폐 종양의 병력을 갖고, 제2 위치 또는 다중 위치에서, 예를 들어, 유방에서 하나 이상의 속발성 종양을 앓는 대상체에서의 질환을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 병태, 질환 또는 장애, 또는 병태, 질환 또는 장애와 연관된 증상을 "치료하는" 또는 "그의 치료"란, 임상 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 부분적이든, 완전하든, 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전, 병태, 장애 또는 질환 정도의 감소, 병태, 장애 또는 질환 상태의 안정화, 병태, 장애 또는 질환 발생 예방, 병태, 장애 또는 질환 확산 예방, 병태, 장애 또는 질환 진행 지연 또는 저속화, 병태, 장애 또는 질환 발병 지연 또는 저속화, 병태, 장애 또는 질환 상태 호전 또는 완화, 및 관해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. "치료하는"이라는 것은 또한 대상체의 생존이 치료 부재 시 예상되는 것을 초과하는 정도로 연장되는 것을 의미할 수 있다. "치료하는"이라는 것은 또한 병태, 장애 또는 질환의 진행을 억제시키는 것, 비록 일부 경우에서는 병태, 장애 또는 질환의 진행을 영구적으로 중지시키는 것을 포함하기도 하지만, 병태, 장애 또는 질환의 진행을 일시적으로 저속화시키는 것을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 치료, 치료하다 또는 치료하는이라는 용어는 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 효과, 또는 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 증상을 감소시키는 방법을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법에서, 치료란, 확립된 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 중증도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 질환을 치료하는 방법은, 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상이 대조군과 비교하여 10% 감소하였다면, 치료인 것으로 간주된다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 퍼센트 감소일 수 있다. 치료가 반드시 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상을 치유 또는 완전히 절제해야 하는 것을 지칭하는 것은 아님을 이해한다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, 저하, 감소 또는 억제시키는 것이라고 언급하는 것은 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과의 변화를 포함하고, 상기 용어는 완전환 제거를 포함할 수 있지만, 반드시 그를 포함하여야 하는 것은 아니다.

대상체, 환자, 개체라는 용어 등은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 일반적으로는 상호교환될 수 있다. 즉, 환자라고 기재된 개체는 반드시 주어진 질환을 앓아야 하는 것은 아니지만, 단지 의사의 진찰을 받을 수 있다. 전역에 걸쳐 사용되는 바, 대상체는 척추동물, 더욱 구체적으로, 포유동물 (예를 들어, 인간, 말, 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 토끼, 래트, 및 기니 피그), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 임의의 다른 동물일 수 있다. 본 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지는 않는다. 따라서, 수컷이든 또는 암컷이든, 상관없이, 성체 및 신생 대상체가 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 환자, 개체 및 대상체는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이들 용어는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 즉, 환자라고 기재된 개체는 반드시 주어진 질환을 앓아야 하는 것은 아니지만, 단지 의사의 진찰을 받을 수 있다. 환자 또는 대상체라는 용어는 인간 및 수의과적 대상체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "투여" 또는 "투여하는"이란, 원하는 효과를 달성하기 위해 임의의 적절한 경로에 의해 화합물 또는 화합물들을 제공, 접촉 및/또는 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 경막내, 병변내, 또는 두개내 주사), 경피, 국소, 협측, 직장, 질, 비강, 안구 투여, 흡입을 통한 투여, 및 임플란트 투여를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 임의적으로, NK-92 세포는 비경구적으로 투여된다. 임의적으로, NK-92 세포는 정맥내로 투여된다. 임의적으로, NK-92 세포는 종양주위로 투여된다.

따라서, 본원에서는, 그의 세포 표면 상에 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 치료 유효량을 대상체에게 투여하여, 이로써 대상체에서 암 전이를 감소시키는 것을 포함하는, 대상체에서 암 전이를 감소시키는 방법을 제공한다. 암을 앓는 대상체를 선택하는 단계, 및 그의 세포 표면 상에 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 치료 유효량을 대상체에게 투여하며, 여기서 투여가 대상체에서 암을 치료하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 임의적으로, 세포가 CCL21을 추가로 발현한다. 임의적으로, 본 방법은 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

NK-92 세포는 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, NK-92 세포는 소정의 기간에 걸쳐 주입 (예를 들어, 정맥내 주입)에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, NK-92 세포의 단일 용량의 경우에, 기간은 5 내지 130분이다. 임의적으로, 기간은 90 내지 120분이다. 임의적으로, 기간은 15 내지 30분이다.

NK-92 세포, 및 임의적으로 다른 항암제는 암 환자에게 요법 동안 또는 상기 수치의 기간들 중 임의의 둘 사이 (종점 포함) 범위의 기간 동안 1회 투여될 수 있거나, 다회에 걸쳐, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 초과의 주마다 1회 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, NK-92 세포는 대상체에게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 초과의 일 동안 매일 1회 투여될 수 있다. 임의적으로, NK-92 세포는 2일 동안 매일 1회 투여된다. 이어서, 1시간 이상, 1일 이상, 또는 1주 이상 NK-92 세포로 치료하지 않는 사이클이 진행된다. 본원에 사용된 바와 같이, "사이클"이라는 용어는 그 사이에 휴지기 (예를 들어, 치료하지 않거나, 또는 다른 작용제를 이용하여 치료)를 포함하는, 정기적으로 반복되는 치료를 지칭한다. 예를 들어, 1주 동안 치료가 제공되고, 이어서, 2주의 휴지기가 진행되는 것인 한 치료 사이클이다. 상기 치료 사이클은 1회 이상 반복될 수 있다. 따라서, NK-92 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과의 사이클로 투여될 수 있다.

NK-92 세포는 대상체에게 절대적인 세포 개수로 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 대상체는 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억개의 세포/주사로, 예컨대, 주사 1회당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1×10¹⁰, 1×10⁹, 1×10⁸, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10³, 5×10³개의 NK-92 세포 (등), 또는 상기 수치들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여받을 수 있다. 임의적으로, 1×10⁸ 내지 1×10¹⁰개의 세포가 대상체에게 투여된다. 임의적으로, 세포는 1주 이상 동안 매주 1회 이상 투여된다. 임의적으로, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 초과의 주 동안 매주 1회 또는 2회 투여된다.

임의적으로, 대상체는 약 1000개의 세포/주사/㎡ 내지 최대 약 100억개의 세포/주사/㎡로, 예컨대, 주사 1회당 약, 적어도 약, 또는 최대 1×10¹⁰개/㎡, 1×10⁹개/㎡, 1×10⁸개/㎡, 1×10⁷개/㎡, 5×10⁷개/㎡, 1×10⁶개/㎡, 5×10⁶개/㎡, 1×10⁵개/㎡, 5×10⁵개/㎡, 1×10⁴개/㎡, 5×10⁴개/㎡, 1×10³개/㎡, 5×10³개/㎡의 NK-92 세포 (등), 또는 상기 수치들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여받는다. 임의적으로, 1×10³ 내지 1×10¹⁰개/㎡의 NK-92 세포가 대상체에게 투여된다. 임의적으로, 2×10⁹개/㎡의 NK-92 세포가 대상체에게 투여된다.

임의적으로, NK-92 세포는 상기 개체에게 상대적인 세포 개수로 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 개체는 개체 1 kg당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억개의 세포, 예컨대, 개체 1 kg당 약, 적어도 약, 또는 최대 1×10¹⁰, 1×10⁹, 1×10⁸, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10³, 5×10³개의 NK-92 세포 (등), 또는 상기 수치들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여받을 수 있다.

임의적으로, 총 용량은 체표면적 (㎡)으로 계산될 수 있으며, 이는 약 1×10¹¹, 1×10¹⁰, 1×10⁹, 1×10⁸, 1×10⁷개/㎡, 또는 상기 수치들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위 (종점 포함)를 포함한다. 임의적으로, 약 10억개 내지 약 30억개의 NK-92 세포가 환자에게 투여된다. 임의적으로, 1회 용량당 NK-92 세포의 양은 체표면적 (㎡)으로 계산될 수 있으며, 이는 1×10¹¹, 1×10¹⁰, 1×10⁹, 1×10⁸, 1×10⁷, 1×10⁶, 1×10⁵, 1×10⁴, 1×10³개/㎡를 포함한다.

임의적으로, NK-92 세포는 NK-92 세포 및 배지, 예컨대 인간 혈청 또는 그의 등가물을 포함하는 조성물로 투여된다. 임의적으로, 배지는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 임의적으로, 배지는 인간 혈장을 포함한다. 임의적으로, 배지는 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의적으로, 배지는 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의적으로, 배지는 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의적으로, 배지는 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의적으로, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 임의적으로, 인간 치료제에서의 사용에 대해 허용되는 혈청 대용물이 인간 혈청 대신 사용된다. 상기 혈청 대용물은 관련 기술분야에 공지되어 있을 수 있다. 임의적으로, NK-92 세포는 NK-92 세포 및 세포 생존능을 지원하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물로 투여된다. 임의적으로, NK-92 세포는 동결보존된 샘플로부터 재구성된 조성물로 투여된다.

본원에 제공된 방법에 따라, 대상체는 본원에 제공된 작용제들 중 하나 이상의 유효량을 투여받는다. 유효량 및 유효 투여량이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 유효량이라는 용어는 바람직한 생리학적 반응 (예를 들어, 염증 감소)을 일으키는데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 작용제를 투여하기 위한 유효량 및 스케줄은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는 (예를 들어, 감소 또는 지연되는) 바람직한 효과를 일으키는데 충분히 큰 것들이다. 투여량은 실질적인 유해 부작용, 예컨대, 원치 않는 교차 반응, 아나필락시스 반응 등을 유발할 정도로는 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별, 질환 유형, 질환 또는 장애 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 금기사항이 있는 경우, 개인 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 달라질 수 있고, 1일 또는 수 일 동안 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 가이던스는 주어진 제약 제품 부류에 대한 적절한 투여량에 관한 문헌에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 대해, 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 저하를 제시할 것이다. 효능은 또한 "-배" 증가 또는 저하로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 대조군에 대비 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 또는 그 초과의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제제는 치료의 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인가능할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor (2012)], 및 [Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조).

제약상 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충처리된 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 적합한 담체 및 그의 제제는 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press (2012)]에 기재되어 있다. 제약상 허용되는 담체란, 생물학적으로 또는 다르게는, 비바람직하지 않은 물질을 의미하며, 즉, 물질은 비바람직한 생물학적 효과를 유발하거나, 그가 함유된 제약 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하거나 하지 않고, 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우, 담체는 임의적으로 활성 성분의 분해를 최소화하고, 대상체에서 유해 부작용을 최소화하도록 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 제약상 허용되는이라는 용어는 생리학적으로 허용되는 및 약리학적으로 허용되는이라는 것과 동의어로 사용된다. 제약 조성물은 일반적으로 완충화제 및 저장 시 보존제를 포함할 것이며, 투여 경로에 따라 적절한 전달을 위해 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.

조성물은 생리학적 조건에 가깝도록 하기 위해 필요에 따라 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 조정제 및 완충화제, 독성조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제제 및/또는 다른 작용제에서의 세포의 농도는 달라질 수 있으며, 이는 주로 선택된 특정 투여 모드 및 대상체의 필요에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 기반하여 선택될 것이다.

임의적으로, NK-92 세포는 치료되는 암을 위한 1종 이상의 다른 치료와 함께 대상체에게 투여된다. 이론에 의해 제한하지 않으면서, NK-92 세포 및 또 다른 암 요법을 이용하는 대상체의 공동-치료가 NK-92 세포 및 대안적 요법이 종전에는 내인성 면역계 작용을 압도하였던 암을 제거하는 기회를 상기 내인성 면역계에 제공할 수 있게 허용하는 것으로 여겨진다. 임의적으로, 치료되는 암을 위한 2종 이상의 다른 치료는, 예를 들어, 항체, 방사선, 화학요법제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.

임의적으로, 항체는 NK-92 세포와 함께 환자에게 투여된다. 임의적으로, NK-92 세포 및 항체는 대상체에게 함께, 예를 들어, 동일한 제제로; 별개로, 예를 들어, 별개의 제제로, 공동으로 투여되거나; 또는 별개로, 예를 들어, 상이한 투약 스케줄로 또는 하루의 상이한 시간에 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 항체는 임의의 적합한 경로, 예컨대 정맥내 또는 경구 투여로 투여될 수 있다.

임의적으로, 항체는 암성 세포 또는 암 연관된 마커를 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 다수의 항체는 단독으로 암 치료용으로 승인받았다.

제공된 방법은 다른 종양 요법 예컨대 방사선요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 면역요법과 함께 조합될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 하나 이상의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 추가 치료제는 진통제, 마취제, 중추신경자극제, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 항신생물제, 알로스테릭 억제제, 아나볼릭 스테로이드, 항류마티스제, 정신요법제, 신경 차단제, 항염증제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항원충제, 항바이러스제, 도파민제, 혈액학적 제제, 면역학적 제제, 무스카린제, 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제제 및 투여량 선택은 치료되는 주어진 질환에 기반하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 임의적으로, 추가 치료제는 옥트레오티드 아세테이트, 인터페론, 펨브롤리주맙, 글루코피라노실 리피드 A, 카르보플라틴, 에토포시드, 또는 그의 임의의 조합이다.

임의적으로, 추가 치료제는 화학요법제이다. 화학요법 치료 요법은 한 화학요법제 또는 화학요법제들의 조합을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 화학요법제는 알킬화제, 안트라시클린, 탁산, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 키나제 억제제, 모노클로날 항체, 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체, 펩티드 항생제, 백금계 화합물, 레티노이드, 및 빈카 알카로이드 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의적으로, 화학요법제는 카르보플라틴이다.

작용제 또는 조성물의 조합은 병용하여 (예를 들어, 혼합물로서), 별개로, 그러나, 동시에 (예를 들어, 별개의 정맥내 라인을 통해) 또는 순차적으로 (예를 들어, 1종의 작용제가 먼저 투여된 후, 이어서, 제2 작용제가 투여된다) 투여될 수 있다. 따라서, 조합이라는 용어는 2종 이상의 작용제 또는 조성물의 병용, 동시, 또는 순차적 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 치료 과정은 대상체의 특정 특징 및 선택된 치료의 유형에 의존하여 개별적으로 가장 잘 결정된다. 치료, 예컨대 본원에 개시된 것들은 매일, 1일 2회, 격주로, 매월, 또는 치료학적으로 유효한 임의의 적용가능한 것에 기반하여 대상체에게 투여될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 치료와의 조합으로 투여될 수 있다. 추가 치료는 제1 치료와 동시에, 상이한 시간에, 또는 전체적으로 상이한 치료 스케줄로 (예를 들어, 제1 치료는 매일 진행될 수 있는 반면, 추가 치료는 매주 진행) 투여될 수 있다.

본원에서는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7)을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92 세포를 포함하는 키트를 제공한다. 임의적으로, CCR7을 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, CCR7은 변형된 NK-92 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 모티프 리간드 21 (CCL21)을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 임의적으로, CCL21을 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 모티프 리간드 19 (CCL19)를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 임의적으로, CCL19를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 16과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 프로모터는 하나 이상의 NFAT 결합 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 임의적으로, 프로모터는 서열식별번호: 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 임의적으로, 프로모터는 CCL21 및 CCL19 둘 다의 발현을 구동시킨다. 임의적으로, CCL19 및 CCL21을 코딩하는 핵산은 2A 펩티드 링커, 예를 들어, 서열식별번호: 17 또는 18에 의해 연결된다. 임의적으로, 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물 중의 변형된 NK-92 세포를 제공한다. 임의적으로, 키트는 변형된 NK-92 세포의 투여 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 투여되는 추가 화합물 예컨대 치료학적 활성 화합물 또는 약물을 함유할 수 있다. 임의적으로, 키트의 사용에 대한 설명서는 암 치료에서 키트 성분 사용에 대한 지침을 포함할 것이다. 설명서는 항체 및 NK-92 세포를 제조하는 (예를 들어, 동결 건조된 단백질의 경우, 희석하거나 재구성하는) 방법에 관한 정보 (예를 들어, 해동 및/또는 배양)를 추가로 함유할 수 있다. 설명서는 투여량 및 투여의 빈도에 관한 가이던스를 추가로 포함할 수 있다.

개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그를 위한 제조에 사용될 수 있거나, 또는 그의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분을 개시한다. 이들 및 다른 물질도 본원에 개시되어 있으며, 이들 물질의 조합, 서브세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 반면, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 구체적 언급이 명확하게 개시되지 않을 수 있는 경우, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고, 기재된다는 것을 이해한다. 예를 들어, 방법이 개시되고, 논의되고, 방법을 포함하는 다수의 분자에 대해 진행될 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 반대로 구체적으로 명시되지 않는 한, 방법 및 가능한 변형의 각각의 및 모든 조합 및 순열이 구체적으로 고려된다. 유사하게, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고, 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 본 개시내용의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이들 추가 단계들은 각각 개시된 방법의 임의의 구체적인 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 상기 조합 또는 조합의 서브세트가 각각 구체적으로 고려되고, 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해한다.

본원에 인용된 공개문헌 및 그들이 인용된 자료는 그 전문이 본원에서 구체적으로 참조로 포함된다.

하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 측면을 추가로 예시하는 것으로 의도되며, 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1. CCR7을 발현하는 변형된 NK 세포주.

pNKAT-CCR7-LP3 플라스미드 (도 1)를 PflFI 효소로 선형화한 후, 이어서, 선형화된 플라스미드를 겔 정제하고, 이어서, 선형화된 플라스미드를 NK-92 세포 상에서 NEON 형질감염 시스템 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬))을 이용하여 전기천공하여 변형된 NK-92 세포를 제조하였다. 퓨로마이신 선택 1주 후, 생성된 폴리클로날 집단을 CCR7 발현에 대해 시험하고, 5% 인간 혈청 및 IL-2로 보충된 X-비보(X-Vivo)™ 배지 (론자(Lonza: 스위스 바젤)) 중에서 연속 희석하여 모노클로날 세포주를 유도하였다. 25% 조절 배지 (폴리클로날 집단으로부터의 멸균 여과된 상청액) 첨가 시 선택이 개선된 것으로 관찰되었다. 변형된 NK-92 세포는, 모두가 AAVS1 로커스를 표적화하는 상동성 아암에 인케이싱된, EF1α 프로모터, 폴리-A 테일을 포함하는 CCR7 유전자, 및 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 LoxP 플랭킹된 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하였다 (서열식별번호: 7). 본 실시예에서 사용되고, 본 명세서 전역에 걸쳐 논의된 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다.

CCR7의 발현이 NK-92 세포에 영향을 주지 않는다는 것을 검증하기 위해, NK-92 세포의 마커의 두 발현을 측정하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. 도 3의 데이터는 모두 인텔리사이트 아이큐 스크리너 플러스(Intellicyt iQue screener plus)를 이용하여 생성하였다. 세포를 기재된 표현형 마커에 대한 APC 접합된 항체, 또는 음성 대조군으로서 적절한 이소타입과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 PBS +1%BSA 중에서 세정하고, 펠릿화하고, 30 uL PBS + 1%BSA 중에 재현탁시켰다. 이어서, 좌측 상단 사분면에 제시된 바와 같이 판독을 게이팅하여 판독치로부터 세포 잔해를 제거하고, 이어서, 우측 상단 사분면에 제시된 형광 임계값을 초과하는 세포의 백분율을, 각각 좌측 하단 및 우측 하단 사분면에서 "양성" 임계값을 초과하는 것의 백분율, 및 "극양성" 임계값을 초과하는 것의 백분율을 보여주는 별개의 두 히트맵으로 나타내었다. 도 3은 CCR7의 발현을 구동시키는 것이 본 발명자들의 세포주와 연관된 1차 표현형 마커에는 의미 있게 영향을 주지 않는다는 것을 제시한다. 구체적으로, CCR7 발현이 NKp30 또는 NKG2D 발현에는 영향을 주는 것으로 보이지 않고, ICAM-1 발현은 약간 증가시킬 수 있다.

변형된 NK-92 세포의 세포독성을 측정하기 위해, 이펙터 세포 (Nk-92 세포 및 변형된 NK-92 세포 클론)를 (옆으로 돌린) 96-웰 V-바닥 플레이트의 좌측 웰에 시딩하고, 이어서, 플레이트 간에 연속하여 희석하였으며, 여기서 농도가 가장 높은 웰에는 100k 이펙터가 그대로 남겨졌고, 플레이트의 8개의 행 간에는 7개의 추가의 2-배 희석액이 존재하였다. 이어서, 염색된 표적 세포 (K562 (도 4), HL-60 (도 5))를, 이펙터를 함유하는 모든 웰 중에 10k/웰로 시딩하였고, 배경 사멸을 측정하기 위해 단지 표적으로만 이루어진 대조군 웰에도 함께 시딩하였다. 이어서, 플레이트를 잠깐 동안 스핀 다운시키고, 37℃ 및 5% CO₂에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 스핀 다운시키고, 상청액을 흡출시키고, 세포 사멸을 측정하기 위해 세포를 프로피디움 아이오다이드를 함유하는 PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 플러스를 통해 살펴보고, (그의 염료에 의하면 이펙터로부터 분화된) PI 염색에 대해서도 또한 양성인 표적 세포의 비율을 측정하였다. 이 시점에서, 아이큐에 의해 계수된 이펙터 대 표적 세포의 개수를 나타내면서, "실제" 이펙터 대 표적 비를 또한 계산하였다. 이어서, 대조군 웰 중의 자연적 사멸 세포의 개수 대비로 사멸 세포의 백분율을 비교하였고, 이펙터에 의해 특이적으로 사멸된 세포의 백분율을 계산하였다. 결과는 도 4 및 5에 제시되어 있다. 도 4는 모체 세포주 vs. K562 세포와 비교하여 CCR7 상향조절된 클론에서의 유사한 세포독성을 제시하고, 도 5는 모체 세포주 vs. HL-60 세포와 비교하여 CCR7 상향조절된 클론에서의 유사한 세포독성을 제시한다.

보이덴(Boyden) 챔버 검정법 및 이동을 차단하는 마트리겔(Matrigel) 층을 이용하는 것으로 이루어진 시험관내 시험. CCR7을 발현하는 변형된 세포는 본 검정법에서 CCL21 및 CCL19 (대안적 CCR7 리간드) 방향으로 이동하는 것으로 나타났다. 세포를 상부 웰에 배치하고, 8 uM 포어 상에 코팅된 얇은 마트리겔 층 (ECM 유사 기판)에 의해 하부 챔버로부터 분리시켰다. 세포 (25k/웰)를 혈청 감소된 배지 (X-비보 10 + 1% 인간 혈청 + 500 U/mL IL-2) 중 상부 챔버에 배치하였고, 동일한 혈청 감소 배지 그 자체를 또는 관심 케모카인을 함유하는 것을 하부 챔버에서 사용하였다. 본 경우에서, CCL21을 15 ng/mL로 사용하였고, CCL19를 15 ng/mL로 사용하였고, SDF-1a를 20 ng/mL로 사용하였다. 각 시험은 Nk-92 세포 또는 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포에 대하여 삼중으로 수행하였다. 이어서, 18시간 침습 검정법을 위해 플레이트를 인큐베이터에 밤새도록 놓아둔 후, 상부 챔버를 제거하고, 철저히 혼합한 후 하부 웰로부터 (총 부피 750 μL 중) 150 μL를 샘플링하고, 맥콴트(MacsQuant) FACS 분석 기기 상에서 판독하였다. 하부 챔버 중의 생 세포를 계수하고, 이어서, 세포 개수를, 케모카인을 함유하지 않는 웰의 것과 비교하였고, 침습성 지수를 생성하였다. 이들 수치의 평균값을 구하고, 양측 t 검정을 이용하여 통계 관련성을 계산하였다. 하부 웰은 세포의 하부 막으로부터의 어떤 탈착도 없이 샘플링하였기 때문에, ECM의 하부 부분에 여전히 부착되어 있는 상기 세포는 상기 개수에 표시되지 않을 것이며, 이는 가능하게는 CCL19와 CCL21 사이의 차이를 초래할 수도 있다. 본 결과는 도 7에 제시되어 있다. 구체적으로, 도 7은 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 CCR7 케모카인인 CCL19 방향으로의 침습성이 통계학상 유의적으로 증가하였음을 제시한다. 이는 또한 가능하게는 CCR7 수용체의 상향조절에 대한 반응으로, 골수 전이에 관여하는 케모카인인 SDF-1a 방향으로의 침습성이 저하되었음을 제시한다. CCL21에 대하여 통계학상 유의적인 반응이 부족한 것은 가능하게는 수행된 검정법의 성질에 기인한다. 본 검정법은 침습, 및 CCL19 구배 이동과 일관된 거동인, ECM으로부터의 후속적 탈착 둘 다를 측정한다. CCL21은 이동을 유도하면서, 매트릭스로부터의 탈착은 유도하지 않고, 통계학상 유의적인 침습 잠재능을 입증하기 위해 추가 단계를 필요로 한다.

인간 케모카인 CCL19를 발현하도록 조작된 세포 (K-19 세포) 방향으로 이동할 수 있는 (도 8에서 aNK로 지칭된 NK-92 야생형 대조군도 함께) 각종의, CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포 클론의 능력을 평가하였다. 동일한 유형의 야생형 세포 (K562) 방향으로의 세포 동원을 또한 측정하였다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 염색된 이펙터와 함께 코닝 바이오코트 트랜스웰(Corning Biocoat Transwell) 검정법을 이용하여 침습 검정법을 수행하였다. 트랜스웰의 바닥 웰을 야생형 K562 또는 K-19 (CCL19를 발현하도록 조작된 K562 변이체)와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, 유세포 분석법에 의해 K-19 웰 중 침습성 세포의 개수를 K562 웰 중 침습성 세포의 개수와 비교하였다. 결과는 도 8에 제시되어 있다. CCR7 을 발현하는 NK-92 세포가 K-19 세포 방향으로 이동한다.

한쪽 옆구리에는 K562, 및 나머지 다른 쪽 옆구리에는 K-19 (CCL19를 발현하도록 조작된 K562)를 갖는 것으로 NSG 마우스 상에서 대측성 종양을 개시하여 CCR7 분포에 관한 생체내 연구를 수행하였다. 이펙터 세포를 CFSE로 염색한 후, 꼬리 정맥 주사를 통해 투약하였다. 다양한 시점에 종양을 수거하고, 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 생성한 후, 유세포 분석기 상에 유동시켜 CFSE 염색된 침윤 이펙터의 개수를 계수하였다. 도 9a는 주사 후 3시간째의 모든 코호트에서의 누적 세포 개수를 제시하며, 이는 CCR7 수용체가 장착된 이펙터 투약 시, CCL19 공급원과 관련하여 발생하는 종양으로의 귀소가 유의적으로 개선되었음을 입증한다. 도 9b는 24시간째 CCR7+ 코호트로부터의 마우스 4마리 중 3마리에서 CCL19를 분비하는 종양으로의 증가된 동원을 제시한다.

CCR7을 발현하는 NK-92 세포는 또한 Fc 수용체 및 CAR도 발현할 수 있다. 3개의 변이체와 함께 야생형 NK-92 세포를 CCR7 수용체로 염색하였다. 결과는 도 10에 제시되어 있다. 도 10의 제1행은 CCR7, CD16, 및 CD19 CAR에 대한 야생형 세포의 염색을 제시하며, 이는 모두 기준선에서 음성이다. 제2행은 오직 CCR7만을 발현하는 세포를 제시한다. 제3행은 CCR7 및 CD16을 발현하는 세포 (이는 또한 인간 혈청 유래 IgG에 기인하여 프로테인 L(Protein L) 염색에 의해 일부 양성 반응을 보인다)를 제시한다. 제4행은 CCR7, CD16, 및 CD19 CAR을 발현하는 세포 (Prot. L 염색에 대해 양성)를 제시한다

실시예 2. CCL21 발현 제어를 위한 NFAT 반응성 구축물 생성.

NFAT 반응성 요소를 확인하기 위해, 정지 영역, 이어서, 3개의 NFAT 반응 요소 (서열식별번호: 4), 및 최소 프로모터 (서열식별번호: 5)를 함유하고, 따라서, 활성화된 NFAT의 존재 하에서는 반딧불이 루시페라제의 생산을 유도하게 되는 선형화된 구축물을 Nk-92 세포 내로 전기천공시킴으로써 NFAT-기반 루시페라제 발현 카세트 (NR2.2)를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하였다. 이들 세포 중 서브세트에는 또한 항-CD19 CAR (Sup-B15 세포 상에 존재하는 항원, 그 외에는 NK-92 세포에 의한 사멸에 대해 내성)을 함유하는 mRNA를 전기천공시켰다. 이들 세포는 좌측 그래프에 ENR2.2로 제시되어 있다. 이어서, 세포를 표적 세포의 부재 또는 존재 하에서 삼중으로 플레이팅하고, 2.5시간 내지 24시간 범위의 기간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 종료 시, 프로메가 듀얼글로(Promega DualGlo) 시스템으로부터의 스텝(Step) 1 시약을 웰에 첨가하여 (기질이 루시페린을 제공함으로써) 루시페라제를 활성화시켰다. 이어서, 스펙트라맥스(SpectraMax) i3x 플레이트 판독기 상에서 결과를 판독하고, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에서 계산된 바와 같이 평균과 표준 편차로 제시하였다. 결과는 도 6a 및 6b에 제시되어 있다. NFAT 활성화는 시간에 의존하는 방식으로 K562에 결합, 및 오직 CD19-CAR에 대한 mRNA로 전기천공된 경우에만 Sup-B15에 결합하는 표적 결합 맥락에서 입증되었다.

실시예 3. CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK 세포주.

레콤비나제 매개 카세트 교환으로 pNKAT-CCR7-LP3 구축물 중에 임베딩된 LoxP 부위를 이용하여 pCRENFAT-CCL21 플라스미드를 CCR7 함유 NK-92 세포 내로 도입한다. 고리형 플라스미드 (pCRENFAT-CCL21)의 전기천공 후, 기존 선택 카세트 대신으로 새 LoxP 플랭킹된 카세트로의 교환을 매개하는 Cre 레콤비나제를 일시적으로 발현한다. 블라스티시딘에서의 선택을 이용하여 새 카세트의 도입을 유리하게 만들고, 앞서 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방식으로 모노클로날 세포주를 생성된 집단으로부터 서브클로닝하여 CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK-92 세포를 수득한다.

CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK-92 세포를 평가하기 위해, 비염색된 변형된 NK-92 세포를 NFAT 활성화를 유발하는 것으로 공지된 세포 (K562 또는 다른 세포주)와 함께 보이덴 챔버의 하부 웰에서 공동-배양하고, 염색된 변형된 NK-92 세포를 상부 챔버에 배치한다. 감수성 세포주와 함께 공동-배양함으로써 이동이 유도되는 것으로 입증되었다면, 이때 상기 시스템은 작동하는 것이다.

보충 생체내 검정을 위해, 마트리겔 플러그에 임베딩된, CCL21 분비 표적 세포를 사용함으로써 이동 부분을 시험한다. 표적 세포를 이용하여 동계 또는 NSG 마우스 모델에서 작은 종양을 형성하고, 이어서, 조작된 이펙터 세포를 마우스에게 상이한 경로로 (예를 들어, 피하 대 꼬리 정맥에 의해) 제공한다. 세포가, 적절한 화학주성 리간드를 분비하는 세포 방향으로 우선적으로 이동한다면, 이는 변형된 세포가 암 세포로 표적화된다는 것을 입증하는 것이다.

표 1. 서열.

SEQUENCE LISTING <110> NantKwest Inc. <120> Chemokine Responsive Activated Natural Killer Cells with Secondary Homing Activation for Verified Targets <130> 104066-1097364-6800PC <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 gccaccatga aaagcgtgct ggtggtggct ctccttgtca ttttccaggt atgcctgtgt 60 caagatgagg tcacggacga ttacatcgga gacaacacca cagtggacta cactttgttc 120 gagtctttgt gctccaagaa ggacgtgcgg aactttaaag cctggttcct ccctatcatg 180 tactccatca tttgtttcgt gggcctactg ggcaatgggc tggtcgtgtt gacctatatc 240 tatttcaaga ggctcaagac catgaccgat acctacctgc tcaacctggc ggtggcagac 300 atcctcttcc tcctgaccct tcccttctgg gcctacagcg cggccaagtc ctgggtcttc 360 ggtgtccact tttgcaagct catctttgcc atctacaaga tgagcttctt cagtggcatg 420 ctcctacttc tttgcatcag cattgaccgc tacgtggcca tcgtccaggc tgtctcagct 480 caccgccacc gtgcccgcgt ccttctcatc agcaagctgt cctgtgtggg catctggata 540 ctagccacag tgctctccat cccagagctc ctgtacagtg acctccagag gagcagcagt 600 gagcaagcga tgcgatgctc tctcatcaca gagcatgtgg aggcctttat caccatccag 660 gtggcccaga tggtgatcgg ctttctggtc cccctgctgg ccatgagctt ctgttacctt 720 gtcatcatcc gcaccctgct ccaggcacgc aactttgagc gcaacaaggc catcaaggtg 780 atcatcgctg tggtcgtggt cttcatagtc ttccagctgc cctacaatgg ggtggtcctg 840 gcccagacgg tggccaactt caacatcacc agtagcacct gtgagctcag taagcaactc 900 aacatcgcct acgacgtcac ctacagcctg gcctgcgtcc gctgctgcgt caaccctttc 960 ttgtacgcct tcatcggcgt caagttccgc aacgatctct tcaagctctt caaggacctg 1020 ggctgcctca gccaggagca gctccggcag tggtcttcct gtcggcacat ccggcgctcc 1080 tccatgagtg tggaggccga gaccaccacc accttctccc catag 1125 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 accgccatgg ctcagtcact ggctctgagc ctccttatcc tggttctggc ctttggcatc 60 cccaggaccc aaggcagtga tggaggggct caggactgtt gcctcaagta cagccaaagg 120 aagattcccg ccaaggttgt ccgcagctac cggaagcagg aaccaagctt aggctgctcc 180 atcccagcta tcctgttctt gccccgcaag cgctctcagg cagagctatg tgcagaccca 240 aaggagctct gggtgcagca gctgatgcag catctggaca agacaccatc cccacagaaa 300 ccagcccagg gctgcaggaa ggacaggggg gcctccaaga ctggcaagaa aggaaagggc 360 tccaaaggct gcaagaggac tgagcggtca cagacccctt aa 402 <210> 3 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga 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aagtagctga agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt 1080 tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa 1140 tatgtaattt tcagtgttag actagtaaat tgtccgctaa attctggccg tttttggctt 1200 ttttgttaga c 1211 <210> 10 <211> 500 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 10 gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60 gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120 gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctacccct cccctagtca 180 ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt catgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240 gtctcactag tctcgtgcaa atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccctt 300 ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360 gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420 ccggaggccc ggcattccgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcttctt 480 cctcatctcc gggcctttcg 500 <210> 11 <211> 508 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 11 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catgctgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagct 508 <210> 12 <211> 254 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 12 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 13 <211> 765 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 13 atgtggcagc tgctgctgcc tacagctctc ctgctgctgg tgtccgccgg catgagaacc 60 gaggatctgc ctaaggccgt ggtgttcctg gaaccccagt ggtacagagt gctggaaaag 120 gacagcgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tacagccccg aggacaatag cacccagtgg 180 ttccacaacg agagcctgat cagcagccag gccagcagct acttcatcga cgccgccacc 240 gtggacgaca gcggcgagta tagatgccag accaacctga gcaccctgag cgaccccgtg 300 cagctggaag tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggccc ccagatgggt gttcaaagaa 360 gaggacccca tccacctgag atgccactct tggaagaaca ccgccctgca caaagtgacc 420 tacctgcaga acggcaaggg cagaaagtac ttccaccaca acagcgactt ctacatcccc 480 aaggccaccc tgaaggactc cggctcctac ttctgcagag gcctcgtggg cagcaagaac 540 gtgtccagcg agacagtgaa catcaccatc acccagggcc tggccgtgtc taccatcagc 600 agctttttcc cacccggcta ccaggtgtcc ttctgcctcg tgatggtgct gctgttcgcc 660 gtggacaccg gcctgtactt cagcgtgaaa acaaacatca gaagcagcac ccgggactgg 720 aaggaccaca agttcaagtg gcggaaggac ccccaggaca agtga 765 <210> 14 <211> 483 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctcgt gaccaacagc 60 gcccctacca gcagcagcac caagaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 120 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 180 accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 240 gaggaactga agcccctgga agaagtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 300 aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa aggcagcgag 360 acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 420 tggatcacct tctgccagag catcatcagc accctgaccg gctccgagaa ggacgagctg 480 tga 483 <210> 15 <211> 160 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 15 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 145 150 155 160 <210> 16 <211> 294 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 16 atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60 agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120 tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180 gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240 cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 17 cagtgcacca actacgccct gctgaagctg gccggcgacg tggagagcaa ccctggccct 60 <210> 18 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 18 gagggcagag gcagcctgct gacctgcggc gatgtggagg aaaacccagg ccca 54

Claims

프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7)을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92 세포.
제1항에 있어서, CCR7을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, CCR7이 변형된 NK-92 세포의 세포 표면 상에 발현되는 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 NK-92 세포가 프로모터에 작동가능하게 연결된 C-C 모티프 리간드 21 (CCL21)을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제4항에 있어서, CCL21을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 NK-92 세포가 C-C 모티프 리간드 19 (CCL19)를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제6항에 있어서, CCL19를 코딩하는 핵산이 2A 펩티드 링커에 의해 CCL21을 코딩하는 핵산에 연결되며, 여기서 동일한 프로모터가 CCL19 및 CCL21의 발현을 구동시키는 것인 변형된 NK-92 세포.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 하나 이상의 NFAT 결합 요소 및 최소 프로모터를 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 서열식별번호: 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 NK-92 세포 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 NK-92 세포 및 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트.
대상체에게 제10항의 조성물을 투여하여, 이로써 대상체에서 암 전이를 감소시키는 것을 포함하는, 대상체에서 암 전이를 감소시키는 방법.
하기 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법:
(a) 암을 앓는 대상체를 선택하는 단계;
(b) 그의 세포 표면 상에 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92 세포의 치료 유효량을 대상체에게 투여하며, 여기서 투여가 대상체에서 암을 치료하는 것인 단계.
제13항에 있어서, 세포가 CCL21을 추가로 발현하는 것인 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 1×10³ 내지 1×10¹⁰개/㎡의 NK-92 세포가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, NK-92 세포가 비경구적으로 투여되는 것인 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, NK-92 세포가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, NK-92 세포가 종양주위로 투여되는 것인 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, NK-92 세포가 소정의 기간에 걸쳐 주입에 의해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 기간이 5 내지 130분인 방법.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, NK-92 세포가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 초과의 일 동안 매일 1회 대상체에게 투여되는 것인 방법.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.