CN100359004C

CN100359004C - 转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞

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Publication number: CN100359004C
Application number: CNB2003101184894A
Authority: CN
Inventors: 龚疆红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2008-01-02
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: CN1629285A

Abstract

本发明提供一种转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其为表达人体组织器官特异功能的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10，包括趋化因子受体CXCR4的配体趋化因子、CCR6的配体趋化因子、CCR7的配体趋化因子、CCR10的配体趋化因子、序列1所示的基因和蛋白质序列以及这些序列的同系物和修饰物；本发明还提供了该细胞株在制备治疗肿瘤、病毒或细菌感染、自身免疫疾病药物中的应用，以及其制备方法；本发明转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞在体内应用时具有减少丢失，生物利用度高的特点。

Description

转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞

一、技术领域

本发明涉及转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，以及其制备方法和应用。

二、背景技术

恶性肿瘤至今仍是我国死亡率最高的疾病。肿瘤一旦扩散转移，无论手术切除，化疗或是放射治疗都无法彻底根除体内的肿瘤。转移扩散的肿瘤最终恶性增长，导致患者死亡。至今还没有真正能防治肿瘤转移的办法。一方面因为上述这些疗法都受到条件和剂量的限制。过量的放射治疗或化疗引起的副作用使病人无法承受，甚至死亡。另一方面，许多肿瘤在治疗过程中不断突变，导致其对药品和射线不敏感。研究发现，这些抗药抗射线的肿瘤细胞大多对免疫疗法敏感，尤其对具有自然杀伤功能的自然杀伤(NK)细胞和T淋巴杀伤细胞(cytotoxic T-cell)敏感，可被杀伤细胞清除。所以，免疫疗法应是对手术，化疗和放射治疗的很好的补充疗法，以望达到防止扩散并彻底根除肿瘤的目的。因而我们很需要建立一种切实有效可行的细胞免疫治疗的法。

另一方面，我们也很需要一种对病毒感染和细胞内细菌感染切实有效可行的细胞免疫治疗方法。因为对于病毒感染至今世界上没有理想的治疗方法。大多数病毒，比方疱疹病毒(HERPES)，巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，艾滋病毒(HIV)，等等，虽然对于健康人导致的疾病都比较温和，但对于免疫功能低下的人和老年人这些病毒往往导致严重危害，比方CMV可导致免疫功能低下的如艾滋病人，移植病人的严重感染，是导致死亡的重要原因。而另外一些病毒如SARS冠状病毒，艾滋病毒，西尼罗病毒就可对所有人造成严重威胁。治疗病毒的困难在于病毒是与宿主细胞共生的。如何特异性地清除病毒感染细胞，而不伤害正常细胞是有效控制病毒的关键。研究发现自然杀伤细胞可以辨认并将病毒感染细胞特异杀死，适合用于进行病毒免疫治疗。

此外，细胞内细菌感染对治疗造成很大的困扰，比如，结核杆菌主要寄生在单核细胞内，感染的细胞在肺部形成囊包，使抗菌素无法进入细胞发挥杀菌效应。研究发现自然杀伤细胞可以特异地杀伤包在囊包里的结核杆菌感染细胞。

异体组织器官移植的排斥现象，研究发现异体自然杀伤细胞有消除抗自身组织免疫反应的功能。可用于防止组织器官的被排斥，以及移植物抗宿主病，或减轻自身免疫疾病症状。

许多肿瘤由于不表达或很少表达MHC，导致体内特异免疫系统无法辨认，导致T-淋巴杀伤细胞不能发挥作用，从而逃避免疫监控。由于自然杀伤细胞不受组织相容性抗原(MHC)限制，能够非特异地辨认并杀伤肿瘤、病毒和细菌感染的细胞，显然自然杀伤细胞是理想的治疗手段。问题是人体内的自然杀伤细胞的含量非常少，只占人体血液白细胞总数的4％，长期以来人们一直在致力于找到能大量生产自然杀伤细胞的办法。目前已可做到从人体干细胞培养出自然杀伤细胞，由于临床应用需要大量的细胞，该方法的应用有一定的局限性。目前人们还尝试利用异体的具有自然杀伤细胞功能的细胞株，比方NK-92，TALL-104等，来治疗上述疾病。这些细胞株的优点是不受MHC限制，具有很强的杀伤功能，可以通过体外培养快速获得大量的细胞，以满足大批临床应用的需要。然而该治疗方法的最大难题就是注射后只有很少量的细胞株进入血液循环，其余大部分细胞株都不能达到发病的部位，而消失到脾脏部位等器官。如何能使更多的杀伤细胞株达到发病的部位是亟待解决的问题，因为这不仅关系到治疗效果，也是减少治疗引起的副作用的关键。

三、发明内容

本发明的主要目的在于克服目前所研制的细胞免疫治疗方法在注射后只有很少量的细胞株进入血液循环，其余大部分细胞株都不能达到发病的部位，而消失到脾脏等器官的缺点，而提供一种转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其为自然杀伤细胞株转入人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10，可以达到减少该细胞株丢失，提高杀伤细胞体内生物利用度的效果，使更多的杀伤细胞株达到发病的部位，即提高达到有效部位的数量，从而有效提高治疗效果，减少治疗引起的副作用，根本解决临床应用的关键问题。

本发明的目的是由以下技术方案实现的(即发明主要包括以下内容)：

本发明主要内容之一是转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其特征在于，其为表达人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10，在体内应用时减少丢失，提高该细胞在体内生物利用度；所述人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10都是自然杀伤细胞本身不表达或很少表达的。

前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其中表达人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10包括序列1所示的基因和蛋白质序列及其这些序列的同系物和修饰物。

前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其中表达人体组织器官特异的趋化因子和趋化因子受体结合物包括：趋化因子受体CXCR4的配体趋化因子；CCR6的配体趋化因子；CCR7的配体趋化因子；CCR10及CCR10的配体趋化因子；所述所人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10都是自然杀伤细胞本身不表达或很少表达的。

前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其中表达趋化因子的细胞是指包括NK-92、TALL-104的人体自然杀伤细胞，这些细胞表面带有CD56分子，而且具有自然杀伤功能。

前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其中CXCR4的配体趋化因子包括SDF-1在内的与CXCR4结合的蛋白质；CCR6的配体趋化因子包括MIP-3α在内的与CCR6结合的蛋白质；CCR7的配体趋化因子包括SLC，ELC在内的与CCR7结合的蛋白质；CCR10的配体趋化因子包括CCL27和CCL28在内的与CCR10结合的蛋白质。

前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，在体内应用时减少丢失，提高该细胞在体内生物利用度；本发明的转基因表达趋化因子受体或其配体的自然杀伤细胞注射后到达体内血液或其它病变部位的数量与未经基因改造的原始细胞相比较有所增加。

本发明的目的还可通过以下技术方案实现：

本发明另一主要内容是前述的转基因表达趋化因子的自然杀伤细胞在制备治疗肿瘤、病毒和细菌感染、组织移植排斥、自身免疫疾病药物中的应用；其中所述的药物是指表达前述的趋化因子受体或其配体趋化因子的自然杀伤细胞株可被单独或与其它成分一起制备的药物，或与其它药物，比如抗菌素、抗肿瘤药物、放射治疗等组成共同对病人使用的药物和技术。

另外，本发明的目的还可进一步通过以下技术方案实现：

本发明再一主要内容是前述的转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括(1)种子细胞的建立；(2)细胞的扩大培养；(3)对细胞进行鉴定；(4)对细胞株进行抑制细胞分裂的处理；(5)对细胞产品的包装和加工。

又，本发明的目的可进一步通过以下技术方案实现：

本发明经转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞以外的其它体细胞，其特征在于，其为表达人体组织器官特异的趋化因子，趋化因子受体结合物或CCR10的体细胞，在体内应用该体细胞时，该体细胞丢失少，在体内的生物利用度高；其中的趋化因子和趋化因子受体结合物包括趋化因子受体CXCR4的配体趋化因子，CCR6的配体趋化因子，CCR7的配体趋化因子，CCR10及CCR10的配体趋化因子；CXCR4的配体趋化因子是指包括SDF-1在内的与CXCR4结合的蛋白质；CCR6的配体趋化因子是指包括MIP-3α在内的与CCR6结合的蛋白质；CCR7的配体趋化因子是指包括SLC和ELC在内的与CCR7结合的蛋白质；CCR10的配体趋化因子是指包括CCL27、CCL28在内的与CCR10结合的蛋白质；所述包括序列1所示的基因和蛋白质序列，及其这些序列的同系物和修饰物；所述的杀伤细胞以外的其它体细胞是指以输入细胞方式进行治疗所用的所有人体细胞，包括骨髓干细胞，由骨髓干细胞在体外培养分化成的各种血液白细胞，胰岛细胞。

本发明经转基因表达细胞趋化因子的杀伤细胞以外的其它体细胞的应用，其特征在于，该转基因细胞株可用于制备清除肿瘤，病毒和细菌感染，组织移植排斥，自身免疫疾病的产品、药品或含有上述转基因的细胞株的产品复合物。

本发明经转基因表达细胞趋化因子的杀伤细胞以外的其它人体细胞的制备方法，其特征在于，其包括(1)种子细胞的建立；(2)细胞的扩大培养；(3)对细胞进行鉴定；(4)对细胞株进行抑制细胞分裂的处理；(5)对细胞产品的包装和加工。

本发明的有益效果是：本发明通过对上述自然杀伤细胞株转入前述的人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10，从而与未经改造的原始细胞株相比较，该细胞株通过分泌的趋化因子减少了在体内应用时的丢失，增加了到达有效部位的自然杀伤细胞株达数量，解决了现有细胞免疫疗法不能有效地达到治疗部位的难题，增加对靶细胞的杀伤机率，提高了治疗的效果。

四、附图说明

图1A为本发明转基因表达趋化因子基因的自然杀伤细胞株生产分泌SDF-1示意图。

图1B为本发明转基因表达趋化因子基因的自然杀伤细胞株生产分泌ELC示意图。

图2为本发明比较转SDF-1基因自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞生长曲线示意图。

图3A为本发明放射线照射终止表达的趋化因子自然杀伤细胞分裂，但不抑制细胞产生分泌趋化因子的示意图。

图3B为本发明使用ELISA方法测定图照射或未照射的转基因和原始NK-92细胞株分泌ELC的示意图。

图4A为本发明转基因表达趋化因子基因的自然杀伤细胞的分泌物诱导靶细胞CEM-M3定向移动示意图。

图4B为本发明转基因表达趋化因子基因的自然杀伤细胞的分泌物诱导靶细胞Hut78定向移动示意图。

图5为本发明转SDF-1基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在体内对淋巴瘤CEM-M3细胞杀伤能力比较示意图。

图6为本发明转导ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对乳腺癌细胞T47杀伤能力比较示意图。

图7为本发明转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对抑制疱疹病毒HSV-1感染细胞的病毒扩散能力比较示意图。

图8A为原始杀伤细胞株在小鼠体内各器官的分布示意图。

图8B为注射后的转SDF-1基因或转SDF-1P2G的杀伤细胞株TALL-104在小鼠体内各器官的分布示意图。

图9A为本发明比较注射后的转SDF-1基因或转SDF-1P2G的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠脾脏中分布示意图。

图9B为本发明比较注射后的转SDF-1基因或转SDF-1P2G的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠血液中分布示意图。

图10为本发明比较转SDF-1或SDF-1P2G基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对乳腺癌T47固体肿瘤中积累数量示意图。

图11为本发明转SDF-1或SDF-1P2G基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对淋巴细胞瘤CEM-M3细胞生长的抑制作用比较示意图。

图12为本发明转ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对乳腺癌T47实体瘤生长的抑制作用比较示意图。

图13为本发明转SDF-1基因的由小鼠干细胞诱导出的单核细胞与原始自然杀伤细胞株在小鼠血液中分布示意图。

五、本发明的详细内容和具体实施方式

本发明中应用的一些用语的确切定义：

1、MHC：即主要组织相容性复合物，由种系基因构成，具有多样性和多态性。MHC多样性表现在个体和种群之间，分为I型和II型；人体MHC也称为HLA；MHC对动物的免疫应答等功能起着关键性作用，比如人T淋巴细胞只有在MHC相吻合时才能发挥作用，换言之T细胞的功能是受到MHC约束的。

2、自然杀伤细胞：natural killer(NK)细胞，NK细胞特征是表面带有CD56分子；NK细胞杀伤其靶细胞不受MHC限制，也不需抗原刺激，不依赖抗体，属于自然杀伤，而且反应迅速；NK细胞的靶细胞有肿瘤细胞，病毒感染细胞，寄生虫等；NK细胞在抵抗感染和肿瘤方面起关键的作用。

3、体细胞：本发明中所述的体细胞是指以给输入细胞进行治疗所用的所有人体细胞，包括骨髓干细胞，由骨髓干细胞在体外培养分化成的各种血液白细胞，胰岛细胞等。

4、细胞趋化因子：是体内一类具有特异诱导体内靶细胞定向移动作用的蛋白质。人体内共存在大约50种趋化因子，分别诱导不同的靶细胞移动。趋化因子的靶细胞主要是各种血液白细胞。趋化因子根据其化学结构共分为CC，CXC，XC1和CX3C四个家族，具体命名见表1。针对某一受体的趋化因子又被称为该受体的配体趋化因子。本发明中所述的趋化因子受体的配体或配体趋化因子是指能与该受体特异结合的趋化因子和蛋白质。某些人体器官或组织表达特殊的趋化因子或趋化因子受体，比如人的皮肤表达CLL27和CCL28，人的骨髓表达SDF-1。

5、细胞趋化因子的受体：细胞趋化因子作用是通过其在靶细胞膜上的特异受体其之间的关系犹如钥匙和锁。趋化因子通过与受体特异结合将受体激活，引发靶细胞的移动。趋化因子和受体有多样性，既同一受体可与一种以上的趋化因子结合。各种趋化因子的受体见表1。

6、细胞免疫治疗：细胞免疫治疗是免疫治疗方法之一。该法通过给病人输入各种血液白细胞，借助这些细胞增加病人的免疫能力。输入的细胞常见的有自然杀伤细胞，T淋巴细胞等。用于免疫治疗的细胞可以是病人本身的(自供)，经体外培养增多；也可来自其它人(供者)；近年来尝试用具有独特功能的肿瘤细胞株进行免疫治疗。细胞免疫治疗主要用于肿瘤和病毒感染等疾病。

7、药物体内半衰期：药物在体内血液中减到初始剂量的一半时所需的时间，半衰期越长药物有效浓度维持时间越久。

8、自身免疫疾病：对于人体自身组织或器官产生免疫反应，从而造成组织或器官结构和功能的损害。例如关节炎，多发性硬肌症，红斑狼疮等疾病。

9、生物利用度：用药后药物在体内血液循环中能达到的数量与给药总量的比例关系。生物利用度是衡量药物在体内可以有效分布以发挥作用的指标。本发明所述的生物利用度是指杀伤细胞注射之后在体内血液中或其它病变部位所能达到的数量与注射总量的比例关系。

本发明技术方案的简述：本发明是由下述主要技术步骤实现的：(1)克隆前述的趋化因子受体及其配体趋化因子基因(2)构建前述的趋化因子受体及其配体趋化因子基因的表达载体；(3)将上述的趋化因子基因载体转导到自然杀伤细胞株内表达，并选出稳定表达细胞株；(4)收集细胞株培养上清液，检测表达趋化因子活性；(5)生产制备转基因的自然杀伤细胞株；(6)对转基因的自然杀伤细胞株在体外作功能测定(7)对转基因的自然杀伤细胞株在动物体内证明其对疾病的治疗效果。

有关本发明的详细内容：

现有的细胞免疫治疗技术，将细胞注射到体内后只有很少量的细胞株进入血液循环，其余大部分细胞株都不能达到发病的部位，而消失到脾脏，肾脏等器官。

本发明达到了一种减少用于治疗的人体自然杀伤细胞在体内丢失，提高该细胞在体内生物利用度的目的，从而能使更多的杀伤细胞株达到发病的部位，而能使更多杀伤细胞株达到发病的部位不仅提高治疗效果，也是减少治疗引起的副作用的关键。

简要地说，本发明包括一种转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞或其它人体细胞，其为表达人体组织器官特异的趋化因子，趋化因子受体结合物或CCR10。所述人体组织器官特异的趋化因子、趋化因子受体结合物或CCR10都是自然杀伤细胞本身不表达或很少表达的。本发明包括了如何对这些杀伤细胞株进行基因改造的方法；包括这些转入杀伤细胞的趋化因子受体及其配体趋化因子的基因和蛋白序列；相比未经改造的原始细胞株该转基因细胞株具有在体内应用时减少丢失，提高该细胞在体内生物利用度的特征；本发明还包括了上述经基因改造而表达前述的趋化因子，趋化因子受体结合物或CCR10的杀伤细胞株的制备方法，测定方法；以及含有这些细胞株的药物组合物或产品的几项内容。其中所述的产品是用于治疗肿瘤，病毒感染和特殊的细菌感染，自身免疫疾病等疾病的药品或产品组合物。

细胞免疫治疗技术。其中用于转基因的细胞主要是指自然杀伤(naturalkiller，简称NK)细胞。自然杀伤细胞的特征是细胞表面带有特殊的分子CD56，并具有自然杀伤靶细胞的功能。其中所述的自然杀伤靶细胞的功能是指辨认和杀伤靶细胞的过程不受MHC限制，也不需抗原刺激，不依赖抗体，反应迅速，属于自然杀伤。自然杀伤细胞可以从人体血液中分离得到，可以从人体干细胞在体外经特殊培养技术获得，还包括从人的自然杀伤细胞肿瘤中建立起的人体自然杀伤细胞株(包括但不限于NK-92，TALL-104细胞株)，只要这些细胞具备上述自然杀伤功能的特征都属于本发明所指的自然杀伤细胞的范围。

本发明不仅适合利用自然杀伤细胞的细胞免疫治疗的产品或药品，还适合利用其它各种免疫细胞的细胞治疗的产品或药品。通过利用本发明提供的基因改造技术使这些细胞表达趋化因子受体及其配体，从而提高该细胞在体内生物利用度。

本发明中提到趋化因子受体或其配体趋化因子，其广泛的定义见“本发明中应用的一些用语的确切定义”。简要来说趋化因子是指体内一类具有特异诱导体内靶细胞定向移动作用的蛋白质。趋化因子通过与其在靶细胞表面的受体特异结合，并激活受体，引发靶细胞的移动。针对某一受体的趋化因子又被称为该受体的配子趋化因子。趋化因子和受体有多样性，同一受体可与一种以上的趋化因子结合。各种趋化因子的受体见表1。人体内共存在大约50种趋化因子，分别诱导不同的靶细胞移动。趋化因子的靶细胞主要是各种血液白细胞。趋化因子根据其化学结构共分为CC，CXC，XC1和CX3C四个家族。具体命名见表1。

本发明指的人体组织器官特异的趋化因子和趋化因子受体结合物，都是自然杀伤细胞本身不表达或很少表达的，主要包括但不限于趋化因子受体CXCR4的配体趋化因子，CCR6的配体趋化因子，CCR7的配体趋化因子，CCR10及CCR10的配体趋化因子。其中CXCR4的配体趋化因子是指包括SDF-1在内的与CXCR4结合的蛋白质；CCR6的配体趋化因子是指包括MIP-3□在内的与CCR6□结合的蛋白质；CCR7的配体趋化因子是指包括SLC和ELC在内的与CCR7结合的蛋白质；CCR10的配体趋化因子是指包括CCL27和CCL28在内的与CCR10结合的蛋白质。其中所述的趋化因子受体的配体趋化因子是指那些与趋化因子受体特异结合的蛋白质或化合物，包括附件1所示的基因和蛋白质序列，及其这些序列的同系物和修饰物。

有关上述的趋化因子受体或其配体趋化因子的同系物和修饰物，如下的各种对专利物的改变和修饰应当包括在本发明之内。基本上说，如果对上述专利物的改变和修饰是为了达到增强治疗或预防效应；或是为了提高产品的稳定性(对体内蛋白酶的抵御能力)；或对专利蛋白质在翻录合成后所做的修饰，如改变糖化或磷酸化成分，由这些变化衍生出的产物只要保留有本专利物的主要特征，亦即表达的蛋白质具有趋化因子受体或配体趋化因子功能之一，既应当包括在本发明之内。

这种修饰包括对专利物的氨基酸或它们的核酸序列通过取代，增加或截短来加以改变，但改变的产物仍旧保留专利物的主要特征。比如亮氨酸可被异亮氨酸或颉氨酸取代，酸性氨基酸之间(或碱性氨基酸之间，中性氨基酸之间，极性氨基酸之间或非极性氨基酸之间，芳香性氨基酸之间)等等可相互取代。一般认为，只要改变后的产物与本发明的各种趋化因子或其受体的序列有80％或以上相同，同时具有趋化因子受体或配体功能之一，就应属于本发明范围之内。

另外，专利物蛋白质或它们的核酸序列亦可在其侧链化学基团上加上其它化合物而保留专利物的主要特征，如盐基，从而增加其可溶性；或同位素，如钴60，碘125，硫35等等，或荧光物，以达到杀伤靶细胞的作用(生物导弹)或体内对靶细胞(如肿瘤细胞)的跟踪作用，从而增强疗效或应用于体内诊断。另外，专利物蛋白质或它们的核酸序列亦可与其它功能的蛋白质或它们的核酸序列嵌合杂交，如毒素片段，以达到杀伤靶细胞的作用。这些都是普遍运用的保留专利物主要特征的方法。

本发明包括了如何对这些杀伤细胞株进行基因改造的方法。是由下述主要技术步骤实现的：(1)将趋化因子受体及趋化因子的基因片段克隆出来；(2)构建特殊的趋化因子受体或其配体趋化因子基因的表达载体；(3)将上述基因载体放到杀伤细胞株内表达，并选出稳定表达细胞株；(4)收集细胞株培养上清液，检测表达趋化因子或受体的活性；(5)生产制备转基因的杀伤细胞株；(6)对转基因的杀伤细胞株在体外作功能测定。

趋化因子受体及趋化因子的基因片段可根据已发表的论文合成相应的核酸引物，根据需要引物的起始端可加上限制性内切酶切点的序列。具体例子如实施案例1所述的制备SDF-1和SDF-1P2G。用该引物将所选定的趋化因子受体或趋化因子的基因片段由人体的核酸库利用RT-PCR方法先克隆出来。其具体操作方法如一般分子生物学常规方法。克隆出来的趋化因子受体或趋化因子的基因片段通过限制性内切酶切点接到表达载体中，从而构建成趋化因子受体及其配体基因的表达载体。具体可参考本发明的实施案例1。本发明提到的其它的趋化因子或受体CCR10都可以与实施案例1中SDF-1类似的方法制备，区别仅在于用不同的引物来替换制备SDF-1所用的引物。本发明提到的其它的趋化因子受体结合物，如ELC(8-77)等，都可以与实施案例1中SDF-1P2G类似的方法制备，区别仅在于用不同的引物来替换制备SDF-1P2G所用的引物。

有关其中所述的表达载体。表达载体可利用质粒载体，如实施例1所示的pcDNA3.1哺乳动物表达载体(Invitrogen)，也可是病毒载体(实施例13)，或其它通用的载体。为了筛选方便，载体还可装进针对不同抗菌素的阻抗基因，比如此处利用的抗Neomycin的基因。表达载体DNA在线性化后可通过电击等方法放到自然杀伤细胞株内表达，并选出稳定表达细胞株。筛选稳定表达细胞株可通过筛选细胞的表达载体对抗菌素的不敏感性，比如抗Neomycin性，或测定其分泌的所转基因的趋化因子受体及其配体活性。具体方法可采用文献Gong JH.et al，J.Biol.Chem.1996，271：10521-10527所述。

本发明提供了检测表达趋化因子活性的方法。可通过如下的实验方法加以鉴定：测定其与趋化因子或趋化因子受体结合能力。测定方法可利用配体趋化因子结合竞争实验方法。该方法首先将选定的趋化因子用同位素(比如碘¹²⁵)或其它试剂加以标记。然后将固定量的标记配体趋化因子与不同量的转基因细胞所表达的蛋白一起与受体靶细胞保温。该受体靶细胞表面带有所要检测的趋化因子受体。如果待测表达蛋白与这个受体结合，则同位素标记的配体趋化因子受到该蛋白的竞争，与受体结合量必定减少。由此可以鉴定出转基因的趋化因子受体或配体趋化因子是否已在自然杀伤细胞株内得到表达。另一个方法是利用针对选出趋化因子或趋化因子受体的单克隆抗体来鉴定。具体方法可用常规的酶联反应(ELISA)方法或FAX分析方法等能鉴定抗原抗体结合反应的方法。另外，还可通过趋化因子诱导靶细胞移动或靶细胞内钙离子流变化等功能来鉴定表达的趋化因子或趋化因子受体。上述实验的具体方法如文献Gong JH.et al，J.Biol.Chem.1996，271：10521-10527所述。

有关本发明所述的经转基因而表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，在体内应用时减少丢失，提高该细胞在体内生物利用度。其特征在于本发明的表达趋化因子受体或其配体的自然杀伤细胞注射后到达体内血液或其它病变部位的数量相比未经基因改造的原始细胞有所增加。由于转导不同趋化因子及其受体基因的自然杀伤细胞在体内的分布情况有所不同，利用这一特点可以根据发病的不同部位而有所选择地转导不同的趋化因子和趋化因子受体基因。

本发明包括利用前述转导趋化因子基因的杀伤细胞株制备用于治疗肿瘤，病毒感染，细菌感染，自身免疫疾病的药物组合物或产品。其中所述的肿瘤可以是任意一种肿瘤；其中所述的病毒是指各种对人体致病病毒，包括但不限于疱疹病毒(HERPES)，巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，艾滋病毒(HIV)，SARS冠状病毒(Corona virus)，西尼罗病毒等等；其中细菌主要指各种细胞内感染细菌，包括但不限于结核杆菌等；其中自身免疫疾病包括各种由于对身体自身组织产生免疫反应所造成的疾病以及移植排斥反应。其中所述的药物组合物或产品是指含有前述的任何一种趋化因子或趋化因子受体的自然杀伤细胞株的药物组合物或产品。其中所述经转基因而表达前述的趋化因子或趋化因子受体的杀伤细胞株可被单独或与其它成分一起制备产品或药物，或与其它药物，比如抗菌素，抗肿瘤药物，或放射治疗等组成共同对病人使用的产品和技术。

本发明提供了生产制备前述经转基因而表达前述人体组织器官特异的趋化因子，趋化因子受体结合物或CCR10的杀伤细胞株的药物组合物或产品的方法。其特征在于利用细胞培养技术的方法来制备和生产。主要技术包括(1)种子细胞株的建立(2)细胞株的扩大培养；(3)建立对细胞株的鉴定标准及方法；(4)对细胞株的特殊处理，即对细胞株进行抑制细胞分裂的处理，包括对细胞株的放射线处理；(5)对细胞株产品的包装和加工。其中上述(1)转基因的种子自然杀伤细胞株的建立包括对转基因细胞的鉴定，鉴定对该细胞有无任何细菌或病毒感染，以确定该细胞株可以用于临床试验。为了确保前述的自然杀伤细胞株给到受者体内不会生长成肿瘤，前述转基因的自然杀伤细胞株可用放射线照射，药物或其它方法以达到抑制其分裂生长。放射照射可用各种不同类型gamma射线的仪器。前述转基因的自然杀伤细胞株的扩大培养可用一般的细胞培养方法。比如(但不限于)利用细胞培养瓶或自动控制的发酵罐培养。

本发明包括了对于前述经转基因而表达人体组织器官特异的趋化因子，趋化因子受体结合物或CCR10的自然杀伤细胞株的药物组合物或产品的鉴定标准及方法：检测转基因的自然杀伤细胞株细胞表面抗原特征，即CD56阳性；检测转导基因的蛋白表达，即检测分泌所转导的趋化因子受体或其配体趋化因子。检测方法如前所述，包括ELISA，与趋化因子受体结合实验等。

实施例1：克隆人的趋化因子SDF-1基因片段以及由SDF-1改造的SDF-1P2G基因片段并构建上述片段的表达载体。

从人血管内皮组织按Trizol方法制备RNA.通过逆转录生化反应将mRNA转变成cDNA库。设计一组引物如下：5’引物，5‘-TTGCTAGCTCCACCATGAACGCCAAGGTC和3’引物，5‘-TACAAGCTTGCCATCTTGAACCTCTTGTTTAA。利用这一方法获得包括先导序列的趋化因子SDF-1的cDNA。将SDF-1的cDNA克隆到质粒载体比方PCR2.1载体(INVITROGEN)中。为了获得SDF-1P2G的核酸序列，利用基因突变方法，将SDF-1的基因改造成序列ND。2，亦即SDF-1P2G。然后，分别将上述SDF-1和改造成的SDF-1P2G基因片段通过限制性酶切点接到表达的载体中。比方这里用的是pCR3.1载体(INVITROGEN)，该载体中CMV为启动子，EU为增强子，neomycin不敏感基因为筛选标志。

本发明提到的其它的趋化因子或受体CCR10都可以与实施案例1中SDF-1类似的方法制备，区别仅在于用不同的引物来替换制备SDF-1所用的引物。

本发明提到的其它的趋化因子受体结合物，如ELC(8-77)等，都可以与实施案例1中SDF-1P2G类似的方法制备，区别仅在于用不同的引物来替换制备SDF-1P2G所用的引物。

实施例2：趋化因子SDF-1和ELC基因转导自然杀伤细胞株及其表达。

具体方法如下：将接好的趋化因子基因载体，SDF-1-pcDNA3.1和ELC-pcDNA3.1质粒载体的DNA利用限制性内切酶线性化后，用电击法转入自然杀伤细胞株NK92细胞内：准备1X10⁷NK-92细胞，悬浮在10微升磷酸缓冲液和90微升的AMEXA提供的溶液。加入5微克的的DNA并与细胞混合。利用AMEXA的电冲仪将载体DNA利用电击法转入NK-92细胞内。在37度保温10分钟之后转入CO₂培养箱培养4小时。由于载体带有抗Gentamycin的基因，所以用Gentamycin来筛载体的表达。经过用Gentamycin(4毫克/毫升)4周的筛选，绝大多数细胞死亡，只有极少数细胞存活.由此而得到稳定表达细胞株。将筛选的细胞株扩大培养，冷冻收藏。

将筛选的细胞株培养4天后收集细胞的培养上清。通过ELISA方法鉴定转基因的细胞是否合成并分泌转基因的趋化因子SDF-1和ELC。具体说来，将收集的培养上清液与制备好的鼠抗人SDF-1抗体和鼠抗人ELC抗体作结合试验。图1A、图1B所示，原始NK-92细胞不分泌SDF-1和ELC，而大多数筛选出的转基因的NK-92细胞克隆已成功表达SDF-1或ELC蛋白并已分泌到培养液中，因而可以与抗人SDF-1

抗体或抗人ELC抗体呈剂量依赖的结合竞争。

实施例3：比较转SDF-1基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株的生长曲线。

为了确定转趋化因子基因的自然杀伤细胞NK-92与原始NK-92细胞株是否有所不同，首先对转SDF-1基因的NK-92与原始NK-92的两种细胞株的生长速度和形态作一比较，如图2所示，在含有淋巴介素IL-2的培养条件下，转SDF-1基因的NK-92和原始NK-92的两种细胞株的生长速度基本相同，大约每24小时分裂一次.在没有淋巴介素IL-2的条件下，转SDF-1基因的NK-92和原始NK-92两种细胞株都不能生长分裂(利用³H-TdR标记试验证实，结果在此未显示)，本试验说明转SDF-1基因没有改变自然杀伤细胞NK-92对生长因子IL-2的依赖性；也没有改变NK-92的生长速度。

实施例4：放射线照射对转基因自然杀伤细胞的生长及分泌趋化因子能力的影响。

将转导ELC基因得到的自然杀伤细胞株NK-92和原始NK-92细胞用gamma射线照射，照射剂量为500cGy。将未经照射的和照射之后的细胞以相同的起始密度培养48小时之后，加入等量的(1×10⁵cpm/样品)同位素氢3标记的胸腺素(³H-TdR)。保温2小时后，利用液闪仪对每个细胞样品作³H-TdR放射性记数。图3A所示，未经照射的细胞生长分裂，因而吸收利用³H-TdR；而经上述剂量gamma射线照射过的转基因NK-92和原始NK-92细胞都不再吸收³H-TdR，表明它们已终止生长分裂，使用ELISA方法测定上述照射或未照射的转基因和原始NK-92细胞株分泌ELC(图3B所示)。结果表明，原始NK-92细胞不分泌ELC；而转基因的NK-ELC-P-22和经过gamma射线照射过的NK-ELC-P-22都生产分泌ELC，而且分泌量变化不大。本实验结果显示在此条件下，放射线照射可以终止自然杀伤细胞NK-92的生长分裂，但对该细胞分泌趋化因子的能力影响不大。

实施例5：转导趋化因子基因的自然杀伤细胞NK-92的细胞上清诱导趋化因子靶细胞定向移动。

为了对转SDF-1基因，转SDF-1P2G基因，转ELC基因和转ELC片段基因，亦即ELC(8-77)基因的自然杀伤细胞NK-92生产表达的趋化因子作进一步的特征鉴定，分别收集上述转基因的NK-92细胞株的48小时培养上清液，为了测定该上清液中是否存在SDF-1和ELC趋化因子活性，做了趋化因子诱导靶细胞移动实验。具体方法是将上述收集的四种转基因的NK-92细胞培养上清液分别加到带有穿孔膜(孔径0.5微米)的细胞培养板的下孔中，将靶细胞CEM-M3(细胞表达SDF-1受体CXCR4)和HuT78(细胞带有ELC受体CCR7)分别加到上孔中.在37度保温3小时后，观察有多少肿瘤靶细胞从上孔穿膜移到下孔中.如图4A所示，原始NK-92细胞上清不能诱导肿瘤细胞的移动。转SDF-1基因的NK-92上清由于分泌出的趋化因子SDF-1而特异诱导其靶细胞CEM-M3的移动。由于该细胞不分泌ELC，所以对HuT78无作用；图4B所示，转ELC的NK-92的细胞上清由于分泌出的趋化因子ELC而特异诱导其靶细胞Hut78的移动。与上述情况不同的是，转SDF-1P2G基因和转ELC片段基因ELC(8-77)的NK-92细胞株生产表达的趋化因子类似物完全不具有诱导细胞移动的功能，但它们能抑制SDF-1或ELC的活性。本试验证明表达的SDF-1P2G和ELC片段分别与趋化因子SDF-1和ELC结合同一受体。

实施例6：转SDF-1基因和转SDF-1P2G的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对淋巴瘤CEM-M3细胞杀伤能力的比较。

为了将转SDF-1基因和转SDF-1P2G基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对淋巴瘤CEM-M3细胞杀伤能力加以比较，我们作了体外试验肿瘤杀伤试验。具体方法是，首先将肿瘤靶细胞CEM-M3用同位素铬51(⁵¹Cr)进行了标记。将剩余的⁵¹Cr洗净后，同样数量的靶细胞与不同数量的转基因的或原始的NK-92细胞(亦即不同的E∶T比，如图5所示)一起保温。四小时后，分别收集细胞上清液，并利用Gamma射线记数仪测定⁵¹Cr释放量。并按下列公式计算出靶细胞杀伤率。结果如图5所示。

本试验结果说明，在体外试验中，转SDF-1基因和转SDF-1P2G基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对肿瘤细胞CEM-M3细胞杀伤能力比较，转SDF-1基因的NK-92细胞株比原始NK-92细胞株杀伤力稍高。而转SDF-1P2G基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对

肿瘤细胞CEM-M3的杀伤力就没有显著区别。

实施例7：比较转ELC基因和ELC片段基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对乳腺癌T47D细胞杀伤能力。

为了将转导ELC基因和转导ELC片段基因，亦即ELC(8-77)基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对乳腺癌T47D细胞杀伤能力加以比较，做肿瘤体外杀伤试验。具体方法如实施例4所述，结果如图6所示。本试验结果说明，在体外试验中，转ELC基因的NK-92细胞株比原始NK-92细胞株杀伤力稍高，而转ELC片段，即ELC(8-77)基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对乳腺癌T47D细胞的杀伤力没有显著区别。

实施例8：转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对抑制疱疹病毒HSV-1感染细胞的病毒扩散能力的比较。

本实施案例观察了转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对疱疹病毒HSV-1感染的Colo-205细胞抑制其病毒扩散能力的变化。人的Colo-205(ATCC)细胞株用疱疹病毒HSV-1加以感染(10MOI)1小时。用培养液将细胞清洗3遍之后，将感染的Colo-205细胞保温1小时。将转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株作为效应细胞(E)，HSV-1感染的Colo-205细胞作为靶细胞(T)，以E∶T＝5∶1的比例放在一起离心后保温4或18小时。之后测定HSV-1病毒扩散能力：将细胞清洗之后，以500个细胞/2毫升加到35厘米培养皿的单层BSC-1(ATCC)细胞上面进行保温。12小时之后将细胞上清吸去，并用含有0.8％琼脂的培养液将细胞铺盖。三天之后将细胞用甲醛固定，龙胆紫染色，对病毒空斑记数。结果如图7所示。未作处理的感染的靶细胞中HSV-1相对滴度为136；转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株与感染靶细胞共同保温4小时抑制HSV-1滴度达到40％，18小时达到100％。结果说明转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株都显著地抑制疱疹病毒HSV-1病毒扩散能力，但它们彼此之间对HSV-1感染的抑制效果没有明显区别。

实施例9：转导SDF-1基因的自然杀伤细胞与原始自然杀伤细胞株注射后在小鼠体内分布的比较。为了解注射到体内的自然杀伤细胞株是如何分布的，做如下试验：首先将转基因的和原始的自然杀伤细胞株TALL-104分别用0.25mCi的Na2(⁵¹Cr)O₄保温过夜以对细胞用同位素⁵¹Cr加以标记，将标记的细胞用gamma射线照射致死。准备三组津白一号小鼠，每组4只，给每只小鼠从腹腔注射2.5×10⁷个上述标记的转基因的TALL-104细胞和原始TALL-104细胞。注射后2小时或24小时后将每组中的两个小鼠杀掉，分别收集各种主要器官，并将两只小鼠的同一种器官混合。用gamma记数器测定各种器官中同位素⁵¹Cr的数量，以cpm/克组织加以表达(图8A、图8B所示)。结果显示注射的原始TALL-104细胞和转导SDF-1基因的TALL-104细胞主要分布在脾脏，肝脏和肾脏。但相对来说，转导SDF-1基因的TALL-104细胞比原始NK-92细胞在血液中的分布要大得多。

另一试验显示(图9所示)注射转SDF-1基因或SDF-1P2G基因的NK-92细胞在血液中的分布明显比原始NK-92细胞增高，提高的幅度大约2-3倍。与血液相反，在脾脏聚集的转SDF-1或SDF-1P2G基因的NK-92的数量就比原始的NK-92明显少。本试验说明在自然杀伤细胞NK-92中转导SDF-1或SDF-1P2G基因明显地减少了其在脾脏和其它器官的丢失，明显提高了其在血液中的数量。如从静脉注射⁵¹Cr标记的NK-92细胞，在2小时之内其在血液的数量迅速减少，绝大部分聚集到肺部。在以后的时间里，⁵¹Cr-标记的NK-92细胞逐渐转移到肝脏，肾脏，脾脏，骨髓，很少量重新回到血液里。而转导SDF-1基因或SDF-1P2G基因的NK-92细胞，在注射后2小时之内其在血液的含量虽然也逐渐减少，但减少的程度就比原始NK-92要小得多。两小时之后在血液中的含量就比原始NK-92多出大约2-3倍(结果未显示)。

实施例10：比较转导ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对乳腺癌T47D固体肿瘤中的积累数量。

将人体乳腺癌T47D细胞用磷酸缓冲液制备成2×10⁶/微升悬浮液，其中0.5毫升接种到雌性SCID小鼠皮下。将转ELC基因的自然杀伤细胞NK-92细胞和原始NK-92细胞分别按照图8所述用同位素⁵¹Cr加以标记。经X光射线照射(500cGy)后将上述细胞分别制备成1×10⁸/毫升细胞悬液。当T47D肿瘤已长成大约直径为1厘米时，给每只小鼠从腹腔注射2.5×10⁷个上述标记的转导ELC基因NK-92细胞和原始NK-92细胞。注射后2小时24或48小时后将每组中的两个小鼠杀掉，剥离并收集实体肿瘤，并将每组的样品合并。用gamma记数器测定肿瘤组织中同位素⁵¹Cr的数量，以cpm/克组织加以表达。并以未经注射的T47D肿瘤的读数作为1来比较各肿瘤中积累的自然杀伤细胞量。结果显示(图10)注射转ELC基因的NK-92细胞在T47D肿瘤中的分布明显比原始NK-92细胞增高，提高的幅度在48小时后达到原始NK-92的大约3倍。

实施例11：转SDF-1或SDF-1P2G基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对淋巴细胞瘤CEM细胞生长的抑制作用比较。

人淋巴细胞瘤CEM用磷酸缓冲液制备成1×10⁶/微升悬浮液，其中0.5毫升由尾静脉接种到雌性SCID小鼠体内。作为细胞免疫治疗，转SDF-1或SDF-1P2G基因的NK-92细胞和原始NK-92细胞经X光射线照射(500cGy)以中止其分裂生长。各种NK-92细胞株制备成1×10⁸/毫升细胞悬液，按照不同的剂量在上述肿瘤细胞注射后半小时，从尾静脉注射到小鼠体内.记录的小鼠的存活率如图11所示。未经治疗的小鼠大约在肿瘤接种后40天内死亡.原始自然杀伤细胞NK-92治疗延缓了动物的死亡时间大约1倍，亦即70天内.而用转导SDF-1基因的NK-92或转导SDF-1P2G基因的NK-92细胞治疗的小鼠比原始NK-92的死亡时间又进一步明显推迟。直到90天试验结束仍有两只小鼠存活。本试验说明转导SDF-1或其类似蛋白基因明显提高了自然杀伤细胞株NK-92对人淋巴细胞瘤CEM-M3在体内生长的抑制。

实施例12：转ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对乳腺癌T47实体瘤生长的抑制作用比较。

雌性SCID小鼠共分为两组，每组10支。将人的乳腺癌细胞T47D制备成细胞悬浮液，给所有的小鼠在皮下接种(5×10⁵/只)。两周后，T47D已在皮下长成实体瘤。此时，将用同位素⁵¹Cr将转导趋化因子ELC基因的自然杀伤细胞NK-92(圆圈)或原始NK-92(三角)从腹腔分别注射到两组小鼠体内。每隔2天重复注射自然杀伤细胞一次，总共治疗两周。停止治疗之后一个月终止试验。将肿瘤剥离并称重。如图12中所示，转ELC基因的NK-92细胞对肿瘤生长的抑制效果明显高于原始NK-92。结果显示注射转ELC基因的NK-92细胞对在皮下生长的T47D肿瘤生长抑制明显提高。

实施例13：转导SDF-1基因的其它干细胞衍生细胞在小鼠体内分布的比较。为了解转导SDF-1基因的其它干细胞衍生细胞在体内分布相比原细胞有何区别，特以小鼠骨髓干细胞衍生的单核细胞为例加以证实。做如下试验：将小鼠的骨髓干细胞由小鼠股骨骨髓取出，放在含有M-CSF等生长因子的培养液中培养20天。此时，骨髓干细胞已经分化成单核细胞，细胞大量增殖。另一方面，将SDF-1的基因按照前述地方法克隆到载体，比方此处使用的鼠逆转录病毒干细胞载体(retroviral murine stem cell vector)中。将收集到的干细胞分化成的单核细胞洗净，并与含有SDF-1基因片段的病毒载体混合培养，以将载体转导到细胞里。然后，对细胞加以标记，比方此处用位素³⁵S加以标记(将转基因的和原始的单核细胞分别在无S的培养液中加入同位素³⁵S，对细胞培养2天)。给小鼠从腹腔注射上述标记的转基因的单核细胞和原始单核细胞。注射24小时后将每组中的小鼠杀掉，分别收集各种主要器官。用gamma记数器测定各种器官中同位素³⁵S的数量‘如图13结果所示，注射的原始单核细胞和转导SDF-1基因的单核细胞主要分布在脾脏，肝脏和肾脏。但相对来说，转导SDF-1基因的单核细胞比原始单核细胞在血液中的分布要大得多。24小时之后在血液中转导SDF-1基因的单核细胞的含量就比原始单核细胞多出大约2倍。

图表说明：

图1A、图1B为转趋化因子基因的自然杀伤细胞株生产分泌SDF-1或ELC自然杀伤细胞株。NK-92经过转入SDF-1-pcDNA3.1或ELC-pcDNA3.1基因，并经过抗菌素Gentamycin 4-5周的筛选得到稳定表达细胞株NK-SDF-P-12(图1A)和NK-ELC-P-22(图1B)。将其以及未转基因的原始N-92细胞在37度培养4天，所收集的培养上清分别与制备好的鼠抗人SDF-1抗体或鼠抗人ELC抗体(Santa CruzBiotech.)作酶联反应试验。图中所示是上清中所含趋化因子SDF-1(图1A)和ELC(图1B)的相对量。原始NK-92细胞株不产生任何SDF-1和ELC，将其读数作为1。NK-SDF-P-12分泌SDF-1(三角型)，而转基因的NK-92细胞株NK-ELC-P-22分泌ELC(圆型)，其产量高低以相对于对照组(方型)的比例表示。

图2为比较转SDF-1基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞的生长曲线。将转SDF-1基因得到的稳定表达细胞株NK-SDF-P-12，以及用SDF-1类似物SDF-1P2G转基因得到的NK-SDF-1P2G-A-10，还有原始NK-92细胞，以相同的起始浓度培养72小时。培养掖中含有淋巴介素-2(IL-2，100U/毫升)。每个12小时将细胞记数。图中显示转基因细胞株NK-SDF-P-12，NK-SDF-1P2G-A-10与NK-92生长速度相同，大约每24小时增长幅度倍。转基因并不改变NK-92生长速度。图3A、图3B为放射线照射终止转基因自然杀伤细胞分裂，但不抑制细胞产生分泌趋化因子。将转基因得到的细胞株NK-ELC-P-和原始NK-92细胞用gamma射线照射，照射剂量为500cGy。将未经照射的和照射之后的细胞以相同的起始密度培养48小时之后，加入等量的(1×10⁵cpm/样品)同位素氢3标记的胸腺素(³H-TdR)。保温2小时后，利用液闪仪对每个细胞样品作³H-TdR放射性记数(n＝4)。图3A显示，未经照射的细胞生长分裂，因而吸收利用³H-TdR；而经上述剂量gamma射线照射过的NK-ELC-P-22和原始NK-92细胞都不再吸收³H-TdR，表明它们已终止生长分裂。图3B显示的是对上述照射或未照社射的NK-ELC-P-22和原始NK-92细胞株分泌的ELC的测定结果。

图4A、图4B为转导趋化因子基因的自然杀伤细胞的分泌物诱导靶细胞CEM-M3和Hut78定向移动。将图中所示各种不同的转趋化因子基因NK-92细胞株和原始NK-92细胞培养48小时，收集细胞上清。利用24孔穿膜实验板来做诱导靶细胞移动实验。将上述细胞上清分别加到穿膜实验板(Transwell plate，Bacton & Dicson)的下孔，将5×10⁵个带有CXCR4受体的REH细胞(图4A)和带有CCR7受体的HUT78细胞(图4B)分别加到实验板的上孔(n＝2)。经保温3小时后记算移动到下孔中的靶细胞。图4A所示，原始NK-92细胞不分泌SDF-1活性，因而不诱导CXCR4靶细胞移动。转导SDF-1基因的NK-92细胞，即NK-SDF-P-12细胞(转基因A)分泌SDF-1，因而诱导其受体CXCR4靶细胞移动。用SDF-1类似物SDF-1P2G转基因得到的NK-SDF-1P2G-A-10(转基因B)分泌的SDF-1P2G，其本身不具有趋化因子活性，但可抑制转基因A细胞分泌的SDF-1的活性。这说明SDF-1P2G是没有活性的CXCR4受体的配体。图4B所示，只有转导ELC基因的NK-92细胞，即NK-ELC-P-22细胞(转基因C)分泌ELC，因而可诱导CCR7靶细胞HUT78移动。而转导ELC类似物ELC(8-77)基因的NK-92(转基因D)分泌的蛋白质本身没有ELC活性，但可与CCR7受体结合，是没有活性的CCR7配体。原始NK-92细胞和其余的转基因细胞不分泌ELC，不诱导CCR7靶细胞移动。

图5为转SDF-1基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对淋巴瘤CEM-M3细胞杀伤能力的比较。首先将肿瘤靶细胞CEM-M3用同位素铬51(⁵¹Cr)进行了标记。将剩余的⁵¹Cr洗净后，同样数量的靶细胞(T)与不同数量的转基因的或原始的NK-92细胞(E)，即以不同的E∶T比例一起保温。四小时后，分别收集细胞上清液，并利用Gamma射线记数仪测定⁵¹Cr释放量。并按下列公式计算出靶细胞杀伤率。

图中所示的每组数据从左到右依此为E∶T＝9∶1；3∶1；1∶1；0.3∶1。其中E分别表示原始NK-92，转导SDF-1基因的NK-92(NK-SDF-P-12)，和转导SDF-1P2G的NK-92细胞。各种NK细胞株对肿瘤CEM-M3细胞的杀伤力都与E∶T比例成正比。在E∶T＝9时，大约50-70％的CEM-M3细胞都被NK细胞在4小时之内杀死。其中NK-SDF-P-12比原始NK-92细胞对肿瘤的杀伤力略强。图6为转ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对乳腺癌细胞T47D杀伤能力的比较。实验方法与图5的方法基本一样。首先将乳腺癌细胞T47用同位素铬51(⁵¹Cr)进行了标记。将同样数量的靶细胞与不同数量的转基因的或原始的NK-92细胞(亦即不同的E∶T比)一起保温(n＝3)。四小时后，分别收集细胞上清液，并利用Gamma射线记数仪测定⁵¹Cr释放量。并计算出靶细胞杀伤率。图中所示的每组数据从左到右依此为E∶T＝9∶1；3∶1；1∶1；0.3∶1。其中E分别表示原始NK-92(圆行)，转导ELC基因的NK-92(方形)，和转导ELC(8-77)的NK-92细胞(三角形)。各种NK细胞株对肿瘤T47细胞的杀伤力都与E∶T比例成正比。在E∶T＝9时，大约50-70％的T47D细胞(T)都被NK细胞在4小时之内杀死。转导ELC基因和转导ELC(8-77)基因的NK-92比原始NK-92细胞对肿瘤的杀伤力略强。

图7为转SDF-1基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株对HSV-1病毒感染的和未感染的鼠细胞杀伤能力的比较。本图显示了转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株对疱疹病毒HSV-1感染的Colo-205细胞抑制其病毒扩散能力的情况。人的Colo-205(ATCC)细胞株用疱疹病毒HSV-1加以感染作为靶细胞(T)。将转导SDF-1基因的NK-92细胞株与原始NK-92细胞株作为效应细胞(E)，以E∶T＝5∶1的比例一起与感染的靶细胞一起保温4或18小时之后测定HSV-1病毒扩散能力。图7所示的是HSV-1的相对滴度。未作处理的感染的靶细胞中HSV-1相对滴度为136；转导SDF-1基因的NK-92细胞株(斜线图案)与原始NK-92细胞株(点图案)与感染靶细胞共同保温都可明显抑制病毒扩散能力：4小时抑制HSV-1滴度约为40％，18小时达到100％。它们彼此之间对HSV-1感染的抑制效果没有明显区别。

图8A、图8B为比较注射后的转SDF-1基因或转SDF-1P2G的杀伤细胞株TALL104与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内各器官的分布。转导SDF-1基因的TALL-104细胞和原始TALL-104细胞用同位素⁵¹Cr加以标记。将细胞用gamma射线照射致死。给每只津白一号小鼠从腹腔注射2.5×10⁷个上述标记的转基因TALL-104细胞和原始TALL-104细胞。注射后2小时或24小时后分别收集各种主要器官，并将每组(n＝2)小鼠的同一种器官混合。用gamma记数器测定各种器官中同位素⁵¹Cr的数量(cpm/克组织)。图中浅颜色的柱表示注射后2小时测定的结果；深色柱表示24小时后的结果。结果显示注射的原始TALL-104细胞和转导SDF-1基因的TALL-104细胞主要分布在脾脏，肝脏和肾脏。但相对来说，转导SDF-1基因的TALL-104细胞比原始TALL-104细胞在血液中的分布要大得多。

图9A、图9B为比较注射后的转SDF-1基因或转SDF-1P2G的自然杀伤与原始自然杀伤细胞株在小鼠脾脏和血液中的分布。将转导SDF-基因的NK-92和转导SDF-1P2G的NK-92细胞，以及原始NK-92细胞分别按照图8所述用同位素⁵¹Cr加以标记。将细胞用gamma射线照射致死。注射后2小时或24小时后分别收集血液和脾脏，并将每组(n＝2)小鼠的同一种器官混合。用gamma记数器测定各种器官中同位素⁵¹Cr的数量(cpm/克组织)。图中圆圈表示转导SDF-1基因的NK-92细胞；三角表示转SDF-1P2G的NK-92细胞，方形表示原始NK-92细胞。结果显示注射转SDF-1基因或SDF-1P2G基因的NK-92细胞在血液中的分布明显比原始NK-92细胞增高大约2-3倍；而在脾脏积累转SDF-1基因或SDF-1P2G基因的NK-92细胞比原始NK-92细胞明显地减少。

图10为比较转导SDF-1或转导SDF-1P2G基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内乳腺癌T47D固体肿瘤中的积累数量。将0.5毫升人体乳腺癌T47细胞悬浮液接种到雌性SCID小鼠皮下。当T47D肿瘤已长成大约直径为1厘米时，将经放射线照射致死的⁵¹Cr标记的转导ELC基因的NK-92细胞和原始NK-92细胞，分别然后给每只SCID小鼠从腹腔注射2.5×10⁷个上述标记的转基因NK-92细胞和原始NK-92细胞。注射后2小时24或48小时后剥离小鼠的实体肿瘤，并将每组样品合并。用gamma记数器测定肿瘤组织中同位素⁵¹Cr的数量，以cpm/克组织加以表达。并以未经注射的T47肿瘤的读数作为1来比较各肿瘤中积累的自然杀伤细胞量。图中圆圈表示NK-ELC-P-8细胞；三角表示转ELC(8-77)的NK-92细胞，方形表示原始NK-92细胞。结果显示注射转ELC基因或ELC(8-77)基因的NK-92细胞在T47D肿瘤中的分布明显比原始NK-92细胞增高，提高的幅度在48小时后达到原始NK-92的大约3倍。

图11为本发明转导SDF-1基因或SDF-1P2G基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对淋巴细胞瘤CEM细胞生长的抑制作用比较。人淋巴细胞瘤CEM用磷酸缓冲液制备成1×10⁶/微升悬浮液，其中0.5毫升由尾静脉接种到雌性SCID小鼠体内。将转导SDF-1或SDF-1P2G基因的NK-92细胞和原始NK-92细胞经gamma射线照射(500cGy)并分别制备成1×10⁸/毫升细胞悬液，按照不同的剂量在上述肿瘤细胞注射后半小时，从尾静脉注射到小鼠体内.图中所示为小鼠的存活率。未经治疗的小鼠大约在肿瘤接种后40天内死亡.原始自然杀伤细胞NK-92治疗延缓了动物的死亡时间大约1倍，亦即70天内.而用转SDF-1基因的NK-92或用SDF-1P2G转基因的NK-92细胞治疗的小鼠比原始NK-92的死亡时间又进一步明显推迟.90天后仍有两只小鼠存活。本试验说明转SDF-1或其类似蛋白基因明显提高了自然杀伤细胞株NK-92对人淋巴细胞瘤CEM在体内的抑制作用。

图12为本发明转导ELC基因的自然杀伤细胞株与原始自然杀伤细胞株在小鼠体内对乳腺癌T47D实体瘤生长抑制的比较。雌性SCID小鼠共分为两组，每组10支。将人的乳腺癌细胞T47D制备成细胞悬浮液，给所有的小鼠在皮下接种(5×10⁵/只)。两周后，T47D已在皮下长成实体瘤。此时，将用同位素⁵¹Cr将转导趋化因子ELC基因的自然杀伤细胞NK-92(圆圈)或原始NK-92(三角)从腹腔分别注射到两组小鼠体内。每隔2天重复注射自然杀伤细胞一次，总共治疗两周。停止治疗之后一个月终止试验。将肿瘤剥离并称重。如图中所示，转ELC基因的NK-92细胞对肿瘤生长的抑制效果高于原始NK-92。

图13为转导SDF-1基因的干细胞衍生单核细胞与原始细胞注射后在小鼠体内分布的比较。取2只纯系小鼠，分离其股骨，并将骨髓洗出。将小鼠的骨髓细胞放在含有20％的L-929细胞株上清液(含有M-CSF等生长因子)的培养液中培养20天。此时，骨髓干细胞已经分化成单核细胞，细胞数量增殖到几百万。另一方面，将SDF-1的基因按照前述地方法克隆到鼠逆转录病毒干细胞载体(retroviral murine stem cell vector)中。将收集到的干细胞衍生单核细胞洗净，并与含有SDF-1基因片段的病毒载体混合培养，以将载体转导到细胞里。然后，将转基因的和原始的单核细胞分别在无硫的培养液中加入同位素³⁵S，对细胞培养2天，以对细胞用位素³⁵S加以标记。准备两组纯系小鼠，每组2只，给每只小鼠从腹腔注射2.5×10⁶个上述标记的转基因的单核细胞和原始单核细胞。注射24小时后将小鼠杀掉，分别收集各种主要器官，并将两只小鼠的同一种器官混合。用gamma记数器测定各种器官中同位素³⁵S的数量，以cpm/克组织表达细胞分布的情况。其中斜线代表未经转基因的细胞，黑色代表转SDF-1的细胞。

表1趋化因子受体及其配体趋化因子^*

趋化因子受体的配体趋化因子：是指与该受体特异结合的蛋白或化合物。

趋化因子受体	趋化因子受体的配体趋化因子(新命名)	趋化因子受体的配体趋化因子(习惯命名)
趋化因子受体	趋化因子受体的配体趋化因子(新命名)	趋化因子受体的配体趋化因子(习惯命名)	CCR1	CCL3，CCL5	MIP-1α，MIP-1β
CCR2	CCL2，CCL7，CCL13	MCP-1，MCP-3	CCR1	CCL3，CCL5	MIP-1α，MIP-1β
CCR2	CCL2，CCL7，CCL13	MCP-1，MCP-3	CCR3	CCL7，CCL8，CCL11，CCL24，CCL26	Eotaxin，Eotaxin-2，Eotaxin-3
CCR4	CCL17，CCL22	MDC	CCR3	CCL7，CCL8，CCL11，CCL24，CCL26	Eotaxin，Eotaxin-2，Eotaxin-3
CCR4	CCL17，CCL22	MDC	CCR5	CCL3，CCL4，CCL5，CCL8，CCL14	RANTES，MIP-1β
CCR6	CCL25	MIP-3β，TECK	CCR5	CCL3，CCL4，CCL5，CCL8，CCL14	RANTES，MIP-1β
CCR6	CCL25	MIP-3β，TECK	CCR7	CCL19，CCL21	ELC，SLC
CCR8	CCL1，CCL4，CCL17	I-309	CCR7	CCL19，CCL21	ELC，SLC
CCR8	CCL1，CCL4，CCL17	I-309	CCR10	CCL28，CCL27	MEC，CTARCK
CXCR1	CXCL8	IL-8	CCR10	CCL28，CCL27	MEC，CTARCK
CXCR1	CXCL8	IL-8	CXCR2		GROα/β，
CXCR3	CXCL-9，CXCL-10，CXCL11	IP-10，Mig，ITAC	CXCR2		GROα/β，
CXCR3	CXCL-9，CXCL-10，CXCL11	IP-10，Mig，ITAC	CXCR4	CXCL12	SDF-1
CXCR5	CXCL13	BCA-1	CXCR4	CXCL12	SDF-1
CXCR5	CXCL13	BCA-1	XCR1	XCL1，XCL2	Lymphotactin

*趋化因子受体及其配体趋化因子的定义见前述用语确切定义。本表列出的只是自然界存在的趋化因子受体及其配体趋化因子，没有包括广义的配体趋化因子，即一切与趋化因子受体特异结合的蛋白质。另外，本表列出的是所有趋化因子受体及其配体趋化因子，包括本发明所指的特殊趋化因子受体及其配体趋化因子。

序列1：为本发明转入自然杀伤细胞的趋化因子受体及其配体趋化因子的基因和蛋白质序列

附件1专利物的序列(例证，不限于此)

<110>龚小迪

<120>表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞

<160>20

<210>1

<211>67

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Mutagen

<222>N-末端

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CXCR4的配体SDF-1P2G，序列(PD1)

<400>1

Lys Gly Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1 5 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Try Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

50 55 60

Ala Leu Asn

65

<210>2

<211>67

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CXCR4的配体SDF-1，序列(PD2)

<400>2

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

15 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

55 60 65

Ala Leu Asn

67

<210>3

<211>77

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR7的配体MIP-3β(或称ELC)，序列(PD3)

<400>3

Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro

15 10 15

Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp

20 25 30

Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln

35 40 45

Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg

50 55 60

Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser

65 70 75 77

<210>4

<211>70

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Mutagen

<222>N-末端

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR7的配体MIP-3β(8-77)，序列(PD4)

<400>4

Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg

1 5 10 15

Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val

20 25 30

Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln

35 40 45

Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys

50 55 60

Met Lys Arg Arg Ser Ser

65 70

<210>5

<211>79

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Domain

<222>N-末端

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR7的配体SLC(1-79)或6CKine(1-79)，序列

(PD5)

<400>5

Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys

1 5 10 15

Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu

20 25 30

Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln

35 40 45

Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met

50 55 60

Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Iys Pro Ala Gln Gly

<210>6

<211>111

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR7的配体趋化因子SLC或6CKine，序列(PD6)

<400>6

Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys

1 5 10 15

Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu

20 25 30

Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln

35 40 45

Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met

50 55 60

Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Iys Pro Ala Gln Gly Cys

65 70 75 80

Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser

85 90 95

Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro

100 105 111

<210>7

<211>88

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR10的配体CCL27或CTARCK，序列(PD7)

<400>7

Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys

5 10 15

Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg Lys Val Ieu Gln Val Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala

354 40 45

Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp

50 55 60

Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn

65 70 75 80

Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly

85 88

<210>8：

<211>105

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR10的配体CCL28或MEK，序列(PD8)

<400>8

Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr Glu Val Ser His His Ile

1 5 15

Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met Cys Arg Ile Gln Arg Ala

20 25 30

Asp Gly Asp Cys Glu Leu Ala Ala Val Ile Leu His Val Lys Arg Arg

35 40 45

Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr Val Lys Gln Trp Met Lys

50 55 60

Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly Asn Val Cys His Arg Lys

65 70 75 80

Iys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg Ala His Gln Gly Lys His

85 90 95

Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr

100 105

<210>9

<211>127

<212>PRT

<213>人(human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR6的配体CCL25或TECK，序列(PD9)

<400>9

Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly

5 10 15

Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser

20 25 30

Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His

35 40 45

Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met

50 55 60

Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn

65 70 75 80

Thr Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser

85 90 95

Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser

100 105 110

Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu

115 120 125 127

<210>10

<211>385

<212>PRT

<213>人<human)

<220>

<221>Peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR10，序列(PD10)

《400》10

Met Ala Ala Thr Ala Ser Pro Gln Pro Leu Ala Thr Glu Asp Ala Asp

1 5 10 15

Ala Glu Asn Ser Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Leu Asp Glu Val Ala

20 25 30

Phe Met Leu Cys Arg Lys Asp Ala Val Val Ser Phe Gly Lys Val Phe

35 40 45

Leu Pro Val Phe Tyr Ser Leu Ile Phe Val Leu Gly Leu Ser Gly Asn

50 55 60

Leu Leu Leu Leu Met Val Leu Leu Arg Tyr Val Pro Arg Arg Arg Met

65 70 75 80

Val Glu Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asn Leu Leu Phe Leu

85 90 95

Val Thr Leu Pro Phe Trp Gly Ile Ser Val Ala Trp His Trp Val Phe

100 105 110

Gly Ser Phe Leu Cys Lys Met Val Ser Thr Leu Tyr Thr Ile Asn Phe

115 120 125

Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ser Cys Met Ser Leu Asp Lys Tyr Leu

130 135 140

Gln Ile Val His Ala Gln Pro Tyr His Arg Leu Arg Thr Arg Ala Lys

145 150 155 160

Asn Leu Leu Leu Ala Thr Ile Val Trp Ala Val Ser Leu Ala Val Ser

165 170 175

Ile Pro Glu Met Val Phe Val Gln Thr His Glu Asn Pro Lys Gly Val

180 185 190

Trp Asn Cys His Ala Glu Phe Gly Gly His Gly Thr Ile Trp Lys Leu

195 200 205

Phe Leu Arg Phe Gln Gln Asn Leu Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu

210 215 220

Leu Ala Met Ile Phe Phe Tyr Ser Arg Ile Gly Cys Val Leu Val Arg

225 230 235 240

Leu Arg Pro Ala Gly Gln Gly Arg Ala Leu Lys Ile Ala Ala Ala Leu

245 250 255

Val Val Ala Phe Phe Val Leu Trp Phe Pro Tyr Asn Leu Thr Leu Phe

260 265 270

Leu His Thr Leu Leu Asp Leu Gln Val Phe Gly Asn Cys Glu Val Ser

275 280 285

Gln His Leu Asp Tyr Ala Leu Gln Val Thr Glu Ser Ile Ala Phe Leu

290 295 300

His Cys Cys Phe Ser Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Ser Ser His Arg Phe

305 310 315 320

Arg Gln Tyr Leu Iys Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp His Leu

325 330 335

Ala Pro Gly Thr Ala Gin Ala Ser Leu Ser Ser Cys Ser Glu Ser Ser

340 345 350

Ile Leu Thr Ala Leu Glu Glu Met Thr Gly Met Asn Asp Leu Gly Glu

355 360 365

Arg Gln Ser Phe Asn Tyr Pro Asn Lys Glu Asp Val Gly Asn Lys Ser

370 375 380

Ala

385

<210>11

<211>264

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mutagen

<222>5‘末端

<223>用于转导杀伤细胞的带有前导序列的趋化因子受体CXCR4配体，SDF-1P2G，序列(ND.1)的基

因核酸序列-1

<400>_11

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60

gggaagggcg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaac 264

<210>12

<211>264

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的带有前导序列的趋化因子受体CXCR4配体，SDF-1，序列(ND.2)的基因核酸序列-2

<400>12

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60

gggaag cccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaac 264

<210>13

<211>297

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的带有前导序列的趋化因子受体CCR7配体，MIP-3β或ELC，序列(ND.3)的基因核酸序列-1

<400>13

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagttaa 297

<210>14

<211>276

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mutation

<222>5‘末端

<223>用于转导杀伤细胞的带有前导序列的趋化因子受体CCR7配体，MIP-3β(8-77)或ELC(8-77)，序列

(ND.3)的的基因核酸序列-2

<400>14

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agttgctgcc tgtctgtgac ccagaaaccc atccctgggt acatcgtgag gaacttccac 120

taccttctca tcaaggatgg ctgcagggtg cctgctgtag tgttcaccac actgaggggc 180

cgccagctct gtgcaccccc agaccagccc tgggtagaac gcatcatcca gagactgcag 240

aggacctcag ccaagatgaa gcgccgcagc agttaa 276

<210>15

<211>306

<212>CDS

<213>人(human)

<220>mutagen

<221>

<222>5‘末端

<223>用于转导杀伤细胞的带有前导序列的趋化因子受体CCR7配体，6CKine(1-79)或SLC(1-79)，序列(ND.5)的基因核酸序列-3

<400>15

atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60

acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120

cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180

gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240

ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300

cagggc

<210>16

<211>405

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的，带有前导序列的趋化因子受体CCR7的配体-CCL21或SLC，序列(ND6)的基因核酸序列-4

<400>16

atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60

acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120

cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180

gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240

ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300

cagggctgca ggaaggacag gggggcctcc aagactggca agaaaggaaa gggctccaaa 360

ggctgcaaga ggactgagcg gtcacagacc cctaaagggc catag 405

<210>17

<211>335

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的，带有前导序列的趋化因子受体CCR10的配体，CCL27或CTARCK，序列(ND7)的基因核酸序列-1

<400>17

Atgaaggggc ccccaacctt ctgcagcctc ctgctgctgt cattgctcct gagcccagac 60

cctacagcagc attcctactg ccacccagca ctgcctgctg tactcagctc taccgaaag 120

ccactctcag acaagctact gaggaaggtc atccaggtgg aactgcagga ggctgacggg 180

gactgtcacc tccaggcttt cgtgcttcac ctggctcaac gcagcatctg catccacccc 240

cagaacccca gcctgtcaca gtggtttgag caccaagaga gaaagctcca tgggactctg 300

cccaagctga attttgggat gctaaggaaa atgggc 333

<210>18

<211>381

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的，带有前导序列的趋化因子受体CCR10的配体，CCL28或MEK，序列(ND8)的基因核酸序列-2

<400>18

Atgcagcaga gaggactcgc catcgtggcc ttggctgtct gtgcggccct acatgcctca 60

gaagccatac ttcccattgc ctccagctgt tgcacggagg tttcacatca tatttccaga 120

aggctcctgg aaagagtgaa tatgtgtcgc atccagagag ctgatgggga ttgtgacttg 180

gctgctgtca tccttcatgt caagcgcaga agaatctgtg tcagcccgca caaccatact 240

gttaagcagt ggatgaaagt gcaagctgcc aagaaaaatg gtaaaggaaa tgtttgccac 300

aggaagaaac accatggcaa gaggaacagt aacagggcac atcaggggaa acacgaaaca 360

tacggccata aaactcctta t 381

<210>19

<211>450

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>mat-peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的，带有前导序列的趋化因子受体CCR6的配体，CCL25或TECK，序列(ND9)的基因核酸序列-1

<400>19

atgaacctgt ggctcctggc ctgcctggtg gccggcttcc tgggagcctg ggcccccgct 60

gtccacaccc aaggtgtctt tgaggactgc tgcctggcct accactaccc cattgggtgg 120

gctgtgctcc ggcgcgcctg gacttaccgg atccaggagg tgagcgggag ctgcaatctg 180

cctgctgcga tattctacct ccccaagaga cacaggaagg tgtgtgggaa ccccaaaagc 240

agggaggtgc agagagccat gaagctcctg gatgctcgaa ataaggtttt tgcaaagctc 300

caccacaaca cgcagacctt ccaagcaggc cctcatgctg taaagaagtt gagttctgga 360

aactccaagt tatcatcgtc caagtttagc aatcccatca gcagcagtaa gaggaatgtc 420

tccctcctga tatcagctaa ttcaggactg 450

<210>20

<211>1155

<212>CDS

<213>人(human)

<220>

<221>peptide

<222>

<223>用于转导杀伤细胞的趋化因子受体CCR10，序列(ND10)的基因核酸序列

<400>20

atggccgcca ctgcctctcc gcagccactc gccactgagg atgccgatgc tgagaatagc 60

agcttctatt actatgacta cctggatgaa gtggccttca tgctctgcag gaaggatgca 120

gtggtgtcct ttggcaaagt cttcctccca gtcttctata gcctgatttt tgtgttgggc 180

ctcagcggga acctccttct tctcatggtc ttgctccgtt acgtgcctcg caggcggatg 240

gttgagatct atctgctgaa tctggccatc tccaaccttc tgtttctggt gacactgccc 300

ttctggggca tctccgtggc ctggcattgg gtcttcggga gtttcttgtg caagatggtg 360

agcactcttt atactattaa cttttacagt ggcatctttt tcattagctg catgagcctg 420

gacaagtacc tggagatcgt tcatgctcag ccctaccaca ggctgaggac ccgggccaag 480

aacctgctcc ttgctaccat agtatgggct gtgtccctgg ccgtctccat ccctgatatg 540

gtctttgtac agacacatga aaatcccaag ggtgtgtgga actgccacgc agatttcggc 600

gggcatggga ccatttggaa gctcttcctc cgcttccagc agaacctcct agggt ttctc 660

cttccactcc ttgccatgat cttcttctac tcccgtattg gttgtgtctt ggtgaggctg 720

aggcccgcag gccagggccg ggctttaaaa atagctgcag ccttggtggt ggccttcttc 780

gtgctatggt tcccatacaa tctcaccttg tttctgcata cgctgttgga cctgcaagta 840

ttcgggaact gtgaggtcag ccagcatcta gactacgcac tccaggtaac agagagcatc 900

gccttccttc actgctgctt ttcccccatc ctgtatgcct tctccagtca ccgcttccgc 960

cagtacctga aggctttcct ggctgccgtg cttggatggc acctggcacc tggcactgcc 1020

caggcctcat tatccagctg ttctgagagc agcatactta ctgcccttga ggaaatgact 1080

ggcatgaatg accttggaga gaggcagtct gagaactacc ctaacaagga ggatgtgggg 1140

aataaatcag cctga 1155

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1、经转基因而表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其特征在于，其表达人体组织器官特异的趋化因子，在体内应用时减少丢失，提高该细胞在体内生物利用度，所述表达人体组织器官特异的趋化因子为受体CXCR4的配体趋化因子SDF-1或受体CCR7的配体趋化因子ELC。

2、根据权利要求1所述的经转基因而表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞，其特征在于，所述表达趋化因子的细胞是指人体自然杀伤细胞NK-92或TALL-104，这些细胞表面带有CD56分子，而且具有自然杀伤功能。

3、权利要求1所述的经转基因而表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞的应用，其特征在于用于制备清除肿瘤，病毒和细菌感染，组织移植排斥，自身免疫疾病的药品。

4、权利要求1所述的经转基因而表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，其包括(1)种子细胞的建立；(2)细胞的扩大培养；(3)对细胞进行鉴定；(4)对细胞株进行抑制细胞分裂的处理；(5)对细胞产品的包装和加工。