CN102898528A

CN102898528A - 钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途

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Publication number: CN102898528A
Application number: CN2012102956468A
Authority: CN
Inventors: 刘朝奇
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2012-08-18
Filing date: 2012-08-18
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-08-18
Also published as: CN102898528B

Abstract

一种钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途，本发明提供了小鼠钙网蛋白C区部分截除与可溶性程序性死亡受体1胞外段的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，并将该融合蛋白进行真核表达，建立了稳定表达CRT_⊿-sPD1的细胞株且利用分泌肽使其分泌到细胞外。本发明的CRT_⊿-sPD1融合蛋白具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；还能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，可作为肿瘤免疫治疗候选药物，用于治疗肿瘤等疾病。

Description

钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和蛋白质药物领域，属于医药生物技术领域，具体涉及钙网蛋白-程序性死亡受体1融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的载体或质粒、宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤等疾病中的应用。

背景技术

钙网蛋白(calreticulin，CRT)是一种高度保守的钙结合蛋白，属于热休克蛋白家族，主要存在于内质网，具有多种生物学功能。CRT介导的免疫原性细胞凋亡(immunogenic apoptosis)在抗肿瘤免疫中具有重要意义。有研究发现某些抗肿瘤治疗能诱导细胞的CRT从胞内向膜表面快速转位并在细胞膜上簇集，出现在凋亡细胞膜上的CRT可被DC细胞识别和吞噬。Obeid研究小组应用双向电泳筛选并鉴定了一系列具有使CRT膜簇集的诱导剂，如蒽环类药物（anthracyclines），奥沙利铂（oxaliplatin），紫外线和γ-射线。这些诱导剂在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，还使CRT从细胞内质网转移到细胞膜并呈簇集分布。这类凋亡的肿瘤细胞具有良好的免疫原性，应用这类凋亡的小鼠肿瘤细胞接种小鼠能诱导出强大的抗肿瘤免疫活性。多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞凋亡但不能使CRT发生膜转位和簇集，这类凋亡的肿瘤细胞也不具备肿瘤免疫原性。但将这类凋亡细胞包被重组的CRT蛋白，则可获得同样的抗肿瘤免疫效应，这些结果表明CRT分子的膜簇集是凋亡细胞具有免疫原性的关键因素。研究发现，凋亡的肿瘤细胞膜表面簇集的CRT能作为“吞噬我(eat-me)”信号传递给DC，促使DC细胞活化并吞噬肿瘤细胞，DC在成熟的过程中加工并提呈肿瘤特异性抗原，从而诱导特异性CD4+和CD8+T细胞活化和增殖，由此产生对同种肿瘤的免疫杀伤活性。

程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)及其配体PD-L1（programmed cell death 1 ligand 1）是B7-CD28家族的免疫共刺激分子，产生负向免疫调节作用，在机体的免疫稳定方面具有重要的生理功能。PD-1主要表达于活化的淋巴细胞膜表面，PD-L1与PD-1结合后诱导淋巴细胞的无能甚至凋亡，防止免疫反应的过度活化。但在肿瘤免疫研究中发现肿瘤细胞表面PDL1的高表达，它与肿瘤组织内淋巴细胞上的PD-1结合后，将抑制效应性T细胞活性，同时降低后者IL-2和IFN-γ的表达和分泌，形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境，促进肿瘤的生长。阻断PD-1/PD-L1相互结合的方法可用于肿瘤的免疫治疗。有学者应用PD-1胞外区（sPD-1）的原核表达蛋白或者sPD-1的真核表达质粒处理荷瘤鼠，结果发现sPD-1蛋白不仅抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，增强肿瘤特异性CTL细胞的功能。应用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1途径后，也能促进CD8+T细胞增殖和细胞因子的分泌，诱导肿瘤的消退。应用人源化的PD-1单克隆抗体进行肿瘤治疗已进入临床Ⅱ期，并取得良好的抗肿瘤效果。这些结果提示阻断PD-1/PD-L1信号通路能达到有效的治疗肿瘤的目的。

肿瘤的免疫逃逸是肿瘤得以发生、发展的关键因素，其中肿瘤诱导大量的免疫抑制分子构成的信号通路抑制了机体免疫系统对肿瘤组织的杀伤效应。鉴于sPD-1具有阻断PD-1/PD-L1、促进机体对肿瘤的免疫杀伤、及将CRT蛋白特异性包被在肿瘤细胞表面具有促进肿瘤特异性抗原提呈作用；因而本发明制备了小鼠钙网蛋白C区部分截短(Calreticulin，CRT_⊿)与可溶性程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD1）胞外段(sPD1)的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，并在小鼠黑色素瘤细胞B16-F1中分泌表达，使sPD-1与肿瘤细胞表面的PDL1结合，阻断PD1/PDL1信号通路，同时使CRT被包被在肿瘤细胞膜表面，使融合蛋白CRT_⊿-sPD1同时获得两方面的抗肿瘤免疫作用，达到有效抗肿瘤的免疫调节功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明所制备的CRT_⊿-sPD1融合蛋白具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；还能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，可作为肿瘤免疫治疗候选药物，用于治疗肿瘤等疾病。

本发明的目的之一是提供一种新的融合蛋白，该融合蛋白包括以下元件：1）钙网蛋白，或具有钙网蛋白活性的片段或变体；2）可溶性程序性死亡受体1，或具有可溶性程序性死亡受体1活性的片段或变体。

更佳地，本发明所使用的钙网蛋白和可溶性程序性死亡受体1均来源于小鼠。其中，更好的，所述钙网蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1所示，可溶性程序性死亡受体1的编码序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还有一个目的提供一种分离的DNA分子，它编码本发明的融合蛋白。更好的，该DNA分子包括SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明还有一个目的是提供包含上述DNA分子的质粒或载体、以及含有上述DNA分子或质粒或载体的宿主细胞。

本发明还有一个目的是提供生产本发明的融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：1）提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白的核苷酸序列；2）在所述生物中表达所述核酸以形成所述融合蛋白；和3）分离或纯化所述融合蛋白。

本发明还有一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白、或DNA分子、或质粒或载体、或宿主细胞。

本发明还有一个目的是将本发明的融合蛋白、或DNA分子、或质粒或载体、或宿主细胞应用于制备药物，所述药物用于治疗肿瘤或免疫调节。

本发明具体技术方案如下：

方法：

(1)利用分子克隆技术构建pcDNA 3.1(+)/CRT_⊿、pcDNA3.1(+)/sPD1及pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1真核表达质粒。

(2)将pcDNA 3.1(+)/CRT_⊿、pcDNA3.1(+)/sPD1、pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1和pcDNA3.1(+)（阴性对照）质粒转染B16-F1细胞，通过G418筛选后，挑取阳性克隆扩大培养，western blot鉴定CRT_Δ、sPD1、CRT_⊿-sPD1在B16-F1细胞中表达，并利用ELISA法和流式细胞术（FCM）检测融合蛋白分泌到细胞上清，并能与细胞膜上高表达的PDL1结合。

(3)建立稳定表达的细胞株上清与淋巴细胞混合共培养，MTT法检测融合蛋白对淋巴细胞增殖能力的影响；将CFSE染色后淋巴细胞与稳定表达细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况及乳酸脱氢酶法检测致后敏淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤作用。

(4)动物实验；表达重组蛋白的细胞株接种于小鼠右背部皮下，观察肿瘤的生长，肿瘤鼠的生存期及抑瘤率；并取各组小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞的增殖和特异杀伤性淋巴细胞数（CD8+和INF-γ双阳性），乳酸脱氢酶法检测淋巴细胞杀伤作用及ELISA法检测淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ量；由此判定融合蛋白的抗肿瘤作用的免疫活性。

结果：

(1)成功构建pcDNA 3.1(+)/CRT_⊿、pcDNA3.1(+)/sPD1及pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1真核表达质粒，经酶切和测序鉴定完全正确。

(2)将构建好的质粒转染B16-F1细胞，通过G418筛选后，建立了稳定稳定表达CRT_Δ、PD1和CRT_⊿-sPD1蛋白的B16/CRT_⊿、B16/sPD1及B16/CRT_Δ-sPD1细胞株及对照细胞株B16/3.1(+)。

(3)收集稳定表达分泌性PD-1、CRT_⊿及CRT_⊿-sPD-1的细胞培养上清，流式细胞仪检测到PD1与CRT-sPD1能与EL4细胞表面的PDL1特异性结合。

(4)收集上述的细胞上清刺激脾脏淋巴细胞，发现融合蛋白CRT_⊿-sPD1能够显著的促进淋巴细胞增殖。

(5)将上述稳定表达细胞株与混合淋巴细胞共培养，发现对照细胞株B16/3.1(+)明显抑制淋巴细胞生长，但CRT_⊿-sPD-1克隆株能有效的促进淋巴细胞增殖；将这些致敏后的淋巴细胞进行CTL实验，与对照组相比CRT_⊿-sPD-1克隆株致敏的淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤明显增强。

(6)肿瘤模型中，CRT_⊿-sPD1融合蛋白能够有效的抑制肿瘤的生长，延长肿瘤鼠的生存期。

(7)制备各组小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞共培养，CRT_⊿-sPD1组小鼠淋巴细胞增殖能力增强，特异性杀伤淋巴细胞数（CD8+和INF-γ双阳性）增多，分泌INF-γ增多，对B16-F1细胞的杀伤能力增强。

结论：

(1)构建了pcNDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1真核表达质粒及建立了稳定表达CRT_⊿-sPD1的细胞株；

(2)分泌的CRT_⊿-sPD1蛋白在体外具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；

(3)融合蛋白CRT_⊿-sPD1能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，提示CRT_⊿-sPD1可作为肿瘤免疫治疗候选药物。

附图说明

图1为通过PCR获得的CRT_Δ、sPD1目的片段，其中，A-1：marker；A-2：CRT_⊿的PCR产物；B-1：marker；B-2：sPD1的PCR产物。

图2为pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1质粒的构建结果，其中，A-1：目的片段CRT_⊿的PCR产物；A-2：目的片段sPD1的PCR产物；A-3：marker；B-1：marker；B-2和B-3：CRT_Δ-sPD1融合基因；C-1：marker；C-2：pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1质粒；C-3：pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1质粒HindIII+XhoI双酶切产物；C-4：pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1质粒BamH1+XhoI双酶切产物；C-5：pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1质粒HindIII+BamH1双酶切产物。

图3所示为融合蛋白表达情况的Western blotting鉴定结果。

图4为B16-F1细胞表达的融合蛋白分泌到细胞上清的鉴定结果，其中，A：CRT竞争ELISA实验建立的标准曲线；B：利用CRT竞争ELISA法测得的细胞上清中的融合蛋白。

图5为融合蛋白结合与肿瘤细胞EL4表面PDL1的结合情况，其中，A：流式分析融合蛋白与肿瘤细胞EL4表面的PDL1结合，B：柱状图显示融合蛋白与PDL1的结合率。

图6显示了产生融合蛋白的细胞培养上清液促进淋巴细胞增殖的结果，其中*与B16/3.1比较，P<0.05。

图7显示了高表达融合蛋白组B16/C-P组肿瘤细胞促进淋巴细胞增殖的结果，其中**P<0.01，*P<0.05。

图8为高表达融合蛋白细胞致敏的淋巴细胞对B16-F1的体外杀伤活性的检测结果，其中3.1表示B16/3.1细胞株，C表示B16/CRT_⊿细胞株，P表示B16/sPD1细胞株，C-P为B16/C-P细胞株，N表示单独淋巴细胞增殖；**P<0.01，*P<0.05。

图9为MTT法检测B16/CRT_Δ、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞株的生长曲线图。

图10为高表达融合蛋白组B16/C-P组肿瘤鼠肿瘤生长受到抑制的曲线图（**P<0.01，*P<0.05）。

图11为高表达融合蛋白B16/C-P组肿瘤鼠生存期的比较延长结果（**P<0.01，*P<0.05）。

图12高表达融合蛋白B16/C-P组小鼠抗肿瘤免疫应答增强（**P<0.01，*P<0.05），其中，A：流式细胞术分析肿瘤鼠淋巴细胞特异性增殖能力；B：柱状图比较淋巴细胞增殖能力；C：流式细胞术检测CD8⁺和INF-γ双阳性淋巴细胞；D：柱状图比较双阳性淋巴细胞数差异。

图13显示了高表达融合蛋白B16/C-P组淋巴细胞的杀伤作用增强（**P<0.01，*P<0.05）。

图14显示了高表达融合蛋白B16/C-P组淋巴细胞培养上清中IFN-γ量增加（**P<0.01，*P<0.05）。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。

本次发明依次包括下述步骤：

一、重组真核表达质粒的构建和鉴定

pcDNA3.1(+)/CRT_Δ、pcDNA3.1(+)/sPD1及pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1真核表达质粒的构建

以小鼠淋巴细胞的cDNA为模板PCR克隆获得mCRT、mPD1目的片段，其中在上游引物和下游引物的5’末端分别引入HindⅢ和XhoⅠ限制性酶切位点以利于随后的克隆操作。PCR引物设计如下：

mCRT上游引物：

GTCGAAGCTTAACCATGCTCCTTTCGGTGCCGCTC

下游引物：

CAAGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCCCCTTCTGGGTGTATCCAGGTAC

mPD1上游引物：

CAGTAAGCTTATGTGGGTCCGGCAGGTAC

下游引物：

CAAGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCCCCGCTGGGATATCTTGTTGAGG

PCR反应条件：94℃变性5min；以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min为一个PCR循环，反应进行29个循环；最后，72℃延伸5min结束扩增4℃保存备用。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见其大小分别约为930bp和518bp的特异性条带。

PCR获得的CRT、PD1的DNA片段分别用限制性核酸内切酶HindⅢ+XhoI双酶切消化，经PCR纯化试剂盒纯化回收，用T4连接酶将CRT、PD1酶切片段连接到经HindⅢ+XhoI双酶切消化的质粒pcDNA3.1(+)中。用CaCl2法制备DH5a感受态细胞，并用热激法将连接产物转化至感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜。提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆，用限制性酶切和DNA测序法鉴定质粒pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1插入方向和碱基序列正确。

以小鼠淋巴细胞的cDNA为模板，PCR克隆获得截去部分C区的CRT(CRT_⊿)（即SEQ ID NO：1）、sPD1胞外区(sPD1)片段（即SEQ ID NO：2）。其中在CRT_⊿上游引物和下游引物的5’末端分别引入HindⅢ和BamH1限制性酶切位点，sPD1上游引物和下游引物的5’末端分别引入BamH1和XhoI限制性酶切位点以利于随后的克隆操作。PCR引物设计如下：

CRT_⊿上游引物：

GTCGAAGCTTAACCATGCTCCTTTCGGTGCCGCTC（SEQ ID NO：4）

下游引物：

CAAGGGATCCACCTCCACCTTCTGGGTGTATCCAGGTAC（SEQ ID NO：5）

sPD1上游引物：

CAAGGGATCCGGTGGAGGTGGAGAGGTCCCCAATGGGCCCTG（SEQ IDNO：6）

下游引物：

AAGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCCCCGCTGGGATATCTTGTTGAGG（SEQ ID NO：7）

PCR反应条件：94℃变性5min；以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min为一个PCR循环，反应进行29个循环；最后，72℃延伸5min结束扩增4℃保存备用。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见其大小分别约为912bp和454bp的特异性条带。

将PCR获得的CRT_⊿和sPD1的DNA片段分别用限制性核酸内切酶HindⅢ和BamH1、BamH1和XhoI双酶切消化，经PCR纯化试剂盒纯化回收，用T4连接酶将CRT_⊿和sPD1酶切片段连接到经HindⅢ和XhoI双酶切消化的质粒pcDNA3.1(+)中。通过筛选成功构建阳性克隆，用限制性酶切和DNA测序法鉴定质粒pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1所得限制性片段与预期结果一致（见图2）。DNA测序证实目的基因两阅读框架（ORF）对接无误。

二、重组质粒在B16-F1细胞蛋白表达的检测

将pcDNA3.1(+)/CRT_⊿、pcDNA3.1(+)/sPD1及pcDNA3.1(+)/CRT_⊿-sPD1真核表达质粒转染B16-F1细胞，G418筛选，获得稳定表达CRT_⊿、sPD1及CRT_⊿-sPD1真核表达细胞(分别命名为B16/CRT_Δ、B16/sPD1及B16/C-P)。用细胞裂解液分别提取稳定表达细胞株B16/CRT_Δ、B16/sPD1、B16/C-P和阴性对照B16/3.1(+)蛋白，SDS-PAGE胶电泳后将蛋白电转至PVDF膜上，经脱脂牛奶封闭，鼠源的特异性抗体（其中sPD1和CRT_⊿-sPD1应用sPD1单克隆抗体、CRT_⊿应用CRT单克隆抗体）结合膜上蛋白，偶联HRP的羊抗鼠多克隆抗体孵育后ECL显影（见图3）。实验中以β-actin作为内参照。

重组蛋白在B16-F1中是否以分泌的方式释放到细胞外，因此应用竞争ELISA法检测了细胞培养上清中的CRT蛋白，图4A所示为其标准曲线，随着CRT浓度的增加其OD值相应降低，并具有良好的线性关系(R²=0.9713)。进一步检测细胞培养上清中的分泌蛋白，结果发现在B16/3.1和B16/sPD1细胞上清中未测到CRT，在B16/CRT_⊿及B16/C-P细胞上清中检测到CRT蛋白（图4B）。

三、体外检测融合蛋白CRT_Δ-sPD1活性

1、融合蛋白CRT_⊿-sPD1结合活性的测定

正常培养的小鼠肿瘤细胞EL4，经DDP诱导后其细胞表面的PDL1高表达，经流式细胞仪检测阳性率可达80.9％。收集上述稳定表达细胞株的培养上清与高表达PD-L1的EL4细胞孵育，经山羊血清封闭，加入抗PD1的一抗及荧光标记二抗结合后，流式细胞仪分析，与B16/3.1上清相比B16/sPD1、B16/C-P上清中的蛋白能够与PD-L1结合（图5A），说明表达并分泌到的细胞培养上清中的sPD1及融合蛋白CRT_⊿-sPD1与EL4细胞表面的PDL1有结合活性（图5B）。

2、融合蛋白CRT_⊿-sPD1促进淋巴细胞增殖

正常培养B16/CRT_Δ、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞株，待长至80％左右去细胞上清，PBS洗一次，加入无血清无酚红培养基培养4h后收取培养上清与等体积的20％胎牛血清无酚红培养基混合后重悬小鼠脾脏淋巴细胞至终浓度为1×10⁵个/ml,平铺于96孔板中，每孔100μl。37℃混合共培养48h后，MTT法测细胞增殖率。结果(图6)显示在淋巴细胞培养基中加有CRT_Δ、sPD1蛋白组淋巴细胞分裂增殖能力上升，而加入CRT_⊿-sPD1组的细胞增殖能力显著提高(p<0.05)。

四、融合蛋白CRT_Δ-sPD1的生物学活性确定

1、促进淋巴细胞增殖，抑制肿瘤细胞活性

将对数生长期的B16/CRT_⊿、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞以1×10⁵个/ml接种于24孔板中，每孔500μl。37℃培养24h后，向孔内加入终浓度为2×10⁶个/ml CFSE染色的小鼠脾脏淋巴500μl。培养48h后，收集培养上清中的淋巴细胞，1500rpm/min、5min去上清，PBS洗三次后，400μl PBS重悬，流式细胞仪检测淋巴细胞增殖（图7A）。肿瘤细胞株B16/3.1明显抑制淋巴细胞增殖，而融合蛋白有效的减缓了这种抑制作用（图7B）。

2、融合蛋白CRT_⊿-sPD1诱导体外致敏淋巴细胞对肿瘤细胞B16-F1的杀伤

将对数生长期的B16/CRT_⊿、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞以1×10⁵个/ml接种于24孔板中，每孔500μl。37℃培养24h后，向孔内加入2×10⁶个/ml小鼠脾脏淋巴细胞悬浮液500μl，并加入IL-2至终浓度为30ng/ml，诱导72h后，收集淋巴细胞用于下述的实验，以乳酸脱氢酶法测定诱导后的淋巴细胞对肿瘤B16-F1的杀伤作用(图8)，结果显示融合蛋白CRT_⊿-sPD1有效的增强了淋巴细胞的杀伤作用。

五、融合蛋白CRT_Δ-sPD1体内抗肿瘤作用

1、Balb/C小鼠皮下接种肿瘤

6周龄雌性Balb/C小鼠中，随机分组后分笼饲养，并做好标记。共计7组如表1.1。用1ml无菌注射器于小鼠右背部皮下接种各组细胞悬液（细胞浓度为1×10⁶/ml），每只0.1ml。接种后每3天观察接种局部皮肤，若有黑色斑点或其它不规则黑色印记则记为黑色素瘤发生，即B16-F1在活体Balb/C小鼠体内存活并生长。

表1.1肿瘤细胞接种分组(n=12)

2、MTT法比较几种克隆株的生长活性

将对数生长期的B16/CRT_Δ、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞以4×10⁴/ml加入到96孔板中，每孔100μl，37℃培养。12后时细胞贴壁即为0小时，加入浓度为400mg/L的MTT/RPMI-1640培养基（无血清和双抗）每孔100μl，37℃继续培养4h，去上清后每孔加200μl DMSO，室温下溶解结晶20min，然后在全波长酶标仪上读取波长为570nm的吸光值，并依次测细胞培养24h、48h、72h、96h小时的吸光度值。B16/CRT_Δ、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1增殖速率结果显示（图9），在96h内检测细胞分裂增殖，显示B16/CRT_⊿、B16/sPD1、B16/C-P、B16/3.1细胞株增殖能力没有明显的差异，说明融合蛋白不影响肿瘤细胞B16-F1的生长活性。

3、融合蛋白CRT_⊿-sPD1对肿瘤组织的生长及肿瘤鼠生存期的影响

将SPF级Balb/C小鼠随机分为7组，包括：PBS组，B16-F1组，稳定表达CRT_Δ、sPD1、CRT_⊿-sPD1实验组和载体pcDNA3.1(+)的B16-F1对照组，另外将稳定表达CRT_⊿和sPD1的B16-F1两组细胞混合的对照组。在小鼠背部皮下接种这些肿瘤细胞，每三天观察并记录黑色素瘤生长情况，测肿瘤块体积V=0.526ab²(a：最长直径，b：最短直径)，计算肿瘤的消长状况(图10A)，共33天。33天后杀死小鼠，取肿瘤组织称重，以B16-F1组小鼠的肿瘤为对照组，按公式计算各实验组小鼠肿瘤生长抑制率，肿瘤生长抑制率（％）=对照组平均瘤重-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重×100％。与对照组B16/3.1相比表达融合蛋白组B16/C-P的肿瘤生长受到显著抑制(p<0.01)(图10B)。

将SPF级Balb/C小鼠随机分为2组，包括：B16/C-P组和B16/3.1组，每组16只，在小鼠背部皮下接种不同传代培养的细胞株，每天观察并记录黑色素瘤生长情况，并记录小鼠的死亡情况，总共90天（图11）。从图中可以看出表达融合蛋白CRT_⊿-sPD1组小鼠的生长期显著延长。

4、融合蛋白CRT_⊿-sPD1对肿瘤鼠淋巴细胞特异性增殖与杀伤的影响

将对数生长期的B16-F1细胞以1×10⁵个/L接种于24孔板中，每孔500μl。37℃培养24h后，通过4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，用于下述实验致敏淋巴细胞。取接种上述各组小鼠的脾脏细胞CFSE染色后1×10⁶/ml加入到制备好的固定的B16-F1细胞中，并加入IL-2至终浓度为30ng/ml，37℃培养48h后，收集淋巴细胞上流式细胞仪，分析淋巴细胞增殖(图12A)。结果表明实验组小鼠淋巴细胞明显增殖，其中B16/sPD1组的淋巴细胞增殖能力最强(p<0.01)，融合蛋白组B16/C-P组较对照组增殖能力加强(p<0.05)(图12B)。

同上述方法制备小鼠脾淋巴细胞，不进行CFSE染色，经过B16-F1抗原刺激后，加蛋白质转运抑制剂monensin 2μmol/L，以阻止细胞因子分泌至细胞外，收集细胞，分别进行细胞膜FITC-CD8⁺抗体染色和穿膜后PE-INF-γ抗体的胞内染色，进行流式细胞术检测（图12C）。其中B16/sPD1组的CD8⁺阳性淋巴细胞率最高(p<0.01)，而融合蛋白组B16/C-P组双阳性率高于其他组(p<0.05)（图12D），结果表明融合蛋白CRT_⊿-sPD1能够有效的活化免疫系统，刺激特异性的淋巴细胞的增殖。

同样方法致敏但不用CFSE染色的小鼠脾脏细胞培养72h后，收集淋巴细胞作为效应细胞，以B16-F1（细胞浓度为1×10⁵/ml）为靶细胞，效靶比100∶1。其中以不加入效应细胞，代之以无酚红培养基的为自然释放组，以单独无酚红培养基孔为空白组，以单独B16-F1细胞加入0.1％NP-40为最大释放组。以上各组均设3个复孔。5％C02，37℃恒温孵育4个小时后测细胞杀伤活性（图13），结果显示B16/C-P组特异性杀伤作用能力增强(p<0.05)。同时取淋巴细胞培养上清，通过ELISA法测细胞上清中的INF-γ含量（图14）。如图所示，实验组B16/C-P的淋巴细胞的CTL值、分泌的的IFN-γ的分泌量都有显著的提升(p<0.05)，提示融合蛋白CRT_⊿-sPD1有效增强淋巴细胞对肿瘤的特异性杀伤。

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<110> 申请人

<120> 钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途

<130> 2012

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

atgctccttt cggtgccgct cctgcttggc ctcctcggcc tggccgccgc agaccctgcc 60

atctatttca aagagcagtt cttggacgga gatgcctgga ccaaccgctg ggtcgaatcc 120

aaacataagt ccgattttgg caaatttgtc ctcagctctg gcaaatttta cggggacctg 180

gagaaggata aagggctgca gacaagccaa gatgcccgat tttacgcact gtccgccaaa 240

ttcgaaccct tcagcaataa gggccagaca ctggtggtac agttcacggt gaagcatgag 300

cagaatatcg actgtggggg cggctacgtg aagctgtttc cgagtggctt ggaccagaag 360

gacatgcatg gagactcaga atataacatc atgtttggtc cggacatctg cggtcctggc 420

accaagaagg ttcatgtcat ctttaactac aagggcaaga atgtgctgat caacaaggat 480

atccggtgta aggatgatga attcacacac ctatacacac tgattgtgcg gccagacaac 540

acctatgagg tgaaaattga caacagccag gtggagtcag gctccttgga ggatgattgg 600

gactttctgc cacccaagaa gataaaggac cctgatgctg ccaagccgga agactgggat 660

gaacgagcca agatcgatga ccccacagat tccaagcctg aggactggga caagccagag 720

cacatccctg accctgatgc taagaagcct gaggactggg atgaagagat ggatggagag 780

tgggaaccac cagtgattca aaatcctgaa tacaagggcg agtggaaacc acgtcaaatt 840

gacaacccag attacaaggg tacctggata cacccagaag gtggaggtgg atccggtgga 900

ggtggagagg tc 912

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

cccaatgggc cctggaggtc cctcaccttc tacccagcct ggctcacagt gtcagaggga 60

gcaaatgcca ccttcacctg cagcttgtcc aactggtcgg aggatcttat gctgaactgg 120

aaccgcctga gtcccagcaa ccagactgaa aaacaggccg ccttctgtaa tggtttgagc 180

caacccgtcc aggatgcccg cttccagatc atacagctgc ccaacaggca tgacttccac 240

atgaacatcc ttgacacacg gcgcaatgac agtggcatct acctctgtgg ggccatctcc 300

ctgcacccca aggcaaaaat cgaggagagc cctggagcag agctcgtggt aacagagaga 360

atcctggaga cctcaacaag atatcccagc 390

<210> 3

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgctccttt cggtgccgct cctgcttggc ctcctcggcc tggccgccgc agaccctgcc 60

atctatttca aagagcagtt cttggacgga gatgcctgga ccaaccgctg ggtcgaatcc 120

aaacataagt ccgattttgg caaatttgtc ctcagctctg gcaaatttta cggggacctg 180

gagaaggata aagggctgca gacaagccaa gatgcccgat tttacgcact gtccgccaaa 240

ttcgaaccct tcagcaataa gggccagaca ctggtggtac agttcacggt gaagcatgag 300

cagaatatcg actgtggggg cggctacgtg aagctgtttc cgagtggctt ggaccagaag 360

gacatgcatg gagactcaga atataacatc atgtttggtc cggacatctg cggtcctggc 420

accaagaagg ttcatgtcat ctttaactac aagggcaaga atgtgctgat caacaaggat 480

atccggtgta aggatgatga attcacacac ctatacacac tgattgtgcg gccagacaac 540

acctatgagg tgaaaattga caacagccag gtggagtcag gctccttgga ggatgattgg 600

gactttctgc cacccaagaa gataaaggac cctgatgctg ccaagccgga agactgggat 660

gaacgagcca agatcgatga ccccacagat tccaagcctg aggactggga caagccagag 720

cacatccctg accctgatgc taagaagcct gaggactggg atgaagagat ggatggagag 780

tgggaaccac cagtgattca aaatcctgaa tacaagggcg agtggaaacc acgtcaaatt 840

gacaacccag attacaaggg tacctggata cacccagaag gtggaggtgg atccggtgga 900

ggtggagagg tccccaatgg gccctggagg tccctcacct tctacccagc ctggctcaca 960

gtgtcagagg gagcaaatgc caccttcacc tgcagcttgt ccaactggtc ggaggatctt 1020

atgctgaact ggaaccgcct gagtcccagc aaccagactg aaaaacaggc cgccttctgt 1080

aatggtttga gccaacccgt ccaggatgcc cgcttccaga tcatacagct gcccaacagg 1140

catgacttcc acatgaacat ccttgacaca cggcgcaatg acagtggcat ctacctctgt 1200

ggggccatct ccctgcaccc caaggcaaaa atcgaggaga gccctggagc agagctcgtg 1260

gtaacagaga gaatcctgga gacctcaaca agatatccca gc 1302

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgaagctt aaccatgctc ctttcggtgc cgctc 35

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagggatcc acctccacct tctgggtgta tccaggtac 39

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caagggatcc ggtggaggtg gagaggtccc caatgggccc tg 42

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagctcgagt taatgatgat gatgatgatg acccccgctg ggatatcttg ttgagg 56

Claims

1.融合蛋白CRT_⊿-sPD1，其特征在于，该融合蛋白包括以下部分：

1）钙网蛋白，或具有钙网蛋白活性的片段或变体；

2）可溶性程序性死亡受体1，或具有可溶性程序性死亡受体1活性的片段或变体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，其特征在于，所述钙网蛋白和可溶性程序性死亡受体1来源于小鼠。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，其特征在于，所述钙网蛋白或具有钙网蛋白活性的片段或变体的编码序列如SEQ ID NO：1所示，所述可溶性程序性死亡受体1或具有可溶性程序性死亡受体1活性的片段或变体的编码序列如SEQ ID NO：2所示。

4.分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1-3任一项的融合蛋白CRT_⊿-sPD1。

5.权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它包括SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.质粒或载体，其特征在于，所述质粒或载体包含权利要求4或5的DNA分子。

7.宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4或5的DNA分子或权利要求6的质粒或载体。

8.产生权利要求1-3任一项的融合蛋白CRT_⊿-sPD1的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白CRT_⊿-sPD1的核苷酸序列；

2）在所述生物中表达所述DNA分子以形成所述融合蛋白CRT_⊿-sPD1；和

3）分离或纯化所述融合蛋白CRT_⊿-sPD1。

9.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-3任一项的融合蛋白CRT_⊿-sPD1、或权利要求4或5的DNA分子、或权利要求6的质粒或载体、或权利要求7的宿主细胞。

10.权利要求1-3任一项的融合蛋白CRT_⊿-sPD1、或权利要求4或5的DNA分子、或权利要求6的质粒或载体、或权利要求7的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤或免疫调节。