CN110087676A

CN110087676A - 用于治疗癌症的包含表达nfatc4的细胞的分泌性胞外囊泡的组合物

Info

Publication number: CN110087676A
Application number: CN201780031271.5A
Authority: CN
Inventors: S.贾利亚克; L.卡马戈
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Paris
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-08-02
Also published as: EP3436056B1; CA3019412A1; JP2019513710A; WO2017167788A1; US11154598B2; JP7272796B2; EP3436056A1; US20190117688A1

Abstract

本发明涉及一种包含表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4(NFATC4)的细胞的分泌性胞外囊泡(SEV)的组合物，所述组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症。还涉及一种用于确定或预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物治疗癌症患者的治疗有效性的体外方法，所述方法基于包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物诱导TGFβ1表达水平增加的能力进行确定或预测。

Description

用于治疗癌症的包含表达NFATC4的细胞的分泌性胞外囊泡的组合物

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地涉及癌症和转移性癌症的治疗。涉及一种包含表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4(NFATC4)细胞分泌性胞外囊泡(SEV)的组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症的用途。还涉及一种用于确定或预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV 的组合物治疗癌症患者的治疗有效性的体外方法，所述方法基于包含表达 NFATC4的细胞的SEV的组合物诱导TGFβ1表达水平增加的能力进行确定或预测。

背景技术

乳腺癌是在世界范围内导致女性死亡的主要原因。这些患者的主要死因不是原发性肿瘤，而是远端转移，其与癌细胞的迁移和侵袭表型直接相关。此外，对抗癌剂的从头和获得性耐药仍是乳腺癌治疗中的主要障碍。而且，对治疗的耐药通常与癌症的侵袭性增强和出现转移相关，这表明一些治疗尽管最初能够有效治疗原发性癌症，但是在同时却促进了更多侵袭性细胞的出现，最终导致转移以及对治疗的耐药。其他癌症也是如此。因此，需要一种新的疗法，其不仅对原发性癌症有效，而且还能够抑制侵袭和转移的发展。

而且，现在众所周知，没有疗法在所有患者中均有效，不同比例的患者对任何给定的疗法都有耐药性。为了防止无效治疗的长期施用(这不仅成本高昂而且对患者的健康有害)，在对患者治疗之前或之后，还需要对给定患者进行能够预测或至少确定给定疗法的有效性的检测。

不同的研究表明，在肿瘤组织和很多体液中可以很容易地检测到分泌性胞外囊泡(SEV)，并且在肿瘤组织以及在癌症患者的血清和血浆中也发现了较高浓度的SEV(Tickner等，Front Oncol 4,127(2014))。

分泌性胞外囊泡(SEV)是通用术语，指尺寸范围约40nm至几μm的细胞分泌囊泡。其中，外来体包括了被最着重描述的SEV类别。外来体的直径小于约150nm，并且是内涵体小室的衍生物。SEV含有来自亲代细胞的胞质和膜蛋白。SEV的蛋白含量取决于其细胞来源，并且SEV富含某些分子特别是内涵体相关蛋白(例如，CD63)以及参与多泡体形成的蛋白，但是也含有靶向/粘附分子。值得注意的是，SEV不仅含有蛋白，而且还含有功能性mRNA、长非编码RNA和miRNA，以及在一些情况下，已证实其将这些遗传物质地送至受体细胞。

SEV的货物(cargo)对于针对肿瘤的靶向疗法可能是特别有意义的，因为SEV在胞外小室中分泌，由于其具有脂质膜而使得其中的内容物能够免于被降解，且SEV从已知能够与周围细胞融合的细胞中分泌，因此其具有启动信号传导应答的潜能(Hendrix,A.等，Cancer Res.70,9533-9537(2010).)。

然而，癌细胞来源的SEV已被很多人证实参与癌症进展和转移(van der Pol E.等，Pharmacol Rev 64:A-AD,2012)。特别是，已证实SEV在乳腺癌的肿瘤发生、转移和耐药中具有多功能启动子的功能(Yu等，Cancer Sci 106 (2015)959-964)。类似地，使用暴露于与MFGE8/乳凝集素27的C1C2结构域融合的膜结合荧光素的肿瘤来源SEV的研究显示出其在血液循环中的半衰期仅2分钟。从循环中消失几小时后，SEV重新出现在脾脏中，黑色素瘤来源的SEV也在肺、肝和骨髓中蓄积，这些器官被认为是转移的首选部位 (Peinado,H.等，Nat.Med.18,883–891(2012)；Takahashi,Y.等，J.Biotechnol. 165,77–84(2013).)。最近进行的另一项研究表明来自MDA-MB-231的SEV 能够在体内转移至T47D细胞中以增强其侵袭作用(Zomer,A.等，Cell 161, 1046–1057(2015).)。这与肿瘤发生特别相关，因为已知周围和远端组织均具有原发性肿瘤的特征。最近的一项研究表明，乳腺癌SEV是前-miRNA成熟以促进肿瘤生长的部位(Melo,S.A.等，Cancer Cell 26,707–721(2014).)。癌细胞来源的SEV对于癌症治疗的作用似乎是弊大于利的。

因此，大多数使用SEV治疗癌症的尝试依赖于使用负载有肿瘤特异性肽的抗原提呈细胞(APC)来源的SEV(特别是树突状细胞(DC)来源的外来体，其富含用于激发免疫应答的分子)促进针对癌症特异性物质的免疫应答的想法。尽管已经观察到了一些免疫应答，但是所观察到的治疗有效性通常较低(van der Pol E.等，Pharmacol Rev 64:A-AD,2012)。

NFAT转录因子家族包含5个基因。

已发现涉及NFAT家族特定成员的分子通路对乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力具有重要作用(Jauliac S,等，(2002).Nat Cell Biol 4:540–544)。而且，越来越多的证据表明NFAT因子在致癌过程中具有作用(Mancini M,Toker A. (2009).Nat Rev Cancer 9:810–820)。已发现NFATC4(也称为NFAT3)通过靶向脂质运载蛋白2的基因抑制乳腺癌细胞的迁移。特别是，已发现NFAT3 在具有较低侵袭能力的雌激素受体阳性(ERA+)乳腺癌细胞中特异性表达，以及使用表达NFAT3的载体转导能够抑制ERA+(具有较低侵袭能力)和ERA-(具有较高侵袭能力)乳腺癌细胞(Fougère,M.,等，(2010).Oncogene, 29(15),2292-2301)。

然而，尽管SEV的组成受到分泌其的细胞的影响，但是SEV的分子组成不仅仅是分泌其的细胞的反映。相反的是，SEV富含特定蛋白、脂质和RNA，而不存在其他蛋白、脂质和RNA，表明存在控制进入SEV的分子种类的特定机制(Villarroya-Beltri C.等，SeminCancer Biol.2014October；28:3-13； Al-Nedawi,K.等，Nature Publishing Group 10,619–624(2008)；Ohshima,K.等， PLoS ONE 5,e13247(2010)；Soldevilla,B.等，Hum.Mol.Genet.23,467–478 (2014))。特别是，已知SEV含有分泌其的细胞的跨膜受体，特别是致癌的跨膜受体如EGFRvIII(Al-Nedawi,K.等，Nature Publishing Group 10,619-624 (2008))。但是，不能保证在SEV中存在分泌其的细胞的转录因子。例如， Al-Nedawi,K.等发现尽管EGFRvIII+神经胶质瘤细胞SEV含有致癌跨膜受体 EGFRvIII并将其传递给其他EGFRvIII-神经胶质瘤细胞，但是在SEV中基本上检测不到EGFRvIII的效应物(如Erk1/2和Akt)。

而且，还发现由具有较低和较高侵袭能力的乳腺癌细胞系分泌性SEV能够促进细胞迁移(Harris DA,等，PLoS ONE 10(3):e0117495.)，表明这种SEV 将不会促进癌症进展和侵袭。

发明概述

在本发明的背景下，发明人令人惊奇地发现，与由人成纤维细胞或由高侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV不同，由表达NFATC4的低侵袭性乳腺癌细胞分泌性SEV不促进癌症进展和侵袭，而是在体外抑制侵袭以及在体内异体移植模型中抑制肿瘤生长和转移。发明人还令人惊奇地发现，由低侵袭性乳腺癌细胞产生的SEV对高侵袭性细胞系侵袭能力的抑制作用需要在低侵袭性 SEV产生细胞中表达NFATC4。

发明人还意外地发现，在低侵袭性SEV产生细胞中NFATC4的表达导致在高侵袭性乳腺癌细胞系中从头诱导TGFβ1表达，这是SEV在体外调节乳腺癌细胞侵袭所需要的，并且其与体内治疗有效性相关。因此，可以将给予由低侵袭性乳腺癌细胞产生的SEV的患者中TGFβ1浓度的增加情况作为这种治疗的治疗有效性的生物标记物。

因此，在第一个方面中，本发明涉及一种包含表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4(NFATC4)细胞分泌性胞外囊泡(SEV)的组合物，所述组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症。

在第二个方面中，本发明还涉及一种从细胞样品制备包含表达NFATC4 的细胞的SEV的组合物的方法，所述方法包括：

a)在所述细胞中诱导NFATC4表达或活性；

b)在允许其扩增的条件下，在无SEV培养基中培养所述诱导细胞；以及

c)纯化所述诱导细胞的SEV。

在第三个方面中，本发明还涉及一种用于确定使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所治疗癌症患者中的治疗有效性的体外方法，所述确定自所述治疗开始前采集的所述癌症患者的第一生物样品和所述治疗开始后癌症患者的第二相应生物样品进行，所述方法包括：

a)至少在体外测量在所述第一和第二生物样品中转化生长因子β1 (TGFβ1)的表达水平；

b)至少对所测量的TGFβ1表达水平进行比较；以及

c)通过所述比较确定使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所述所治疗癌症患者中的治疗有效性，其中如果至少在所述治疗开始后在所述生物样品中测得的所述TGFβ1表达水平高于至少在所述治疗开始前在所述生物样品中测得的所述TGFβ1表达水平，则认为所述治疗是有效的。

在第四个方面中，本发明还涉及一种用于预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物的治疗在癌症患者中的治疗有效性的体外方法，使用来自所述癌症患者的癌症样品，所述方法包括：

a)至少在体外测量在所述肿瘤样品中TGFβ1的表达水平；

b)使用包含表达NFATC4的SEV的组合物孵育所述癌症样品；

c)至少在体外测量使用包含由表达NFATC4的细胞产生的SEV的组合物孵育的所述肿瘤样品中所述TGFβ1的表达水平；以及

d)如果至少在步骤c)中测得的所述TGFβ1的表达水平高于至少在步骤a) 中测得的所述TGFβ1的表达水平，则预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所述癌症患者中的治疗是有效的，以及如果至少在步骤c)中测得的所述TGFβ1的表达水平低于或等于至少在步骤a) 中测得的所述TGFβ1的表达水平，则预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所述癌症患者中的治疗是无效的。

附图说明

图1：通过尺寸和特异性标记物对由T47D和MDA-MB-231细胞产生的 SEV的表征。由NanoSight评价得到的由MDA-MB-231(A)和T47D(B) 产生的SEV尺寸分布的代表性实例。SEV的浓度(颗粒/ml:pp/mL)以粒径(nm) 的函数表示。(C)SEV特征的Western印迹：使用针对钙联蛋白的抗体CD63 和CD81对两种细胞类型的全细胞蛋白提取物与SEV蛋白级分进行比较。

图2：由低侵袭性T47D和MCF7细胞产生的SEV抑制高侵袭性 MDA-MB-231和SUM159PT乳腺癌细胞以及WM.266.4黑色素瘤细胞的侵袭。(A)使用3,75x10⁸pp由WT T47D或由WT MDA-MB-231或由来自2名不同女性皮肤的2个不同原代皮肤成纤维细胞(FHN21，FHN32)生产的SEV 处理MDA-MB-231 24h，并进行6h体外侵袭测定(n＝2；*p<0,05)。根据经处理孔的侵袭细胞数占设定为1的任意对照孔的侵袭细胞数的比例计算侵袭指数。(B)使用3,75x10⁸pp由WT T47D生产的SEV处理黑色素瘤细胞系 (WM.266.4)24h，并进行6h体外侵袭测定(n＝3；**p<0,005)。(C)使用 3,75x10⁸pp由WT T47D或由WT MCF7产生的SEV处理MDA-MB-231 24h，并进行6h体外侵袭测定(n＝3；***p<0,0005)。(D)使用3,75x10⁸pp由WTT47D或由WT MCF7产生的SEV处理SUM-159-PT 24h，并进行6h体外侵袭测定(n＝3；***p<0,0005)。

图3：来自低侵袭性乳腺癌细胞的SEV不能改善高侵袭性乳腺癌细胞的增殖。使用所示量的来自T47D-WT的SEV处理高侵袭性MDA-MB-231(n＝2) (A)24h以及处理SUM-159-PT(n＝2)(B)24、48和72h以通过BrdU掺入(A)或直接细胞计数(B)评价细胞增殖情况。(C)使用来自T47D-WT 的SEV处理高侵袭性MDA-MB-231 48h以评价细胞凋亡情况(n＝2)。

图4：SEV对高侵袭性细胞系(MDA-MB-231和SUM-159-PT)侵袭能力的抑制性作用需要在低侵袭性SEV产生细胞系T47D中表达NFAT3。(A) 表达shCtrl、shNFAT3-3或shNFAT3-4的T47D细胞的Western印迹。用抗 -NFAT3检测全细胞裂解物并且将用抗-肌动蛋白检测的蛋白量归一化。使用由低侵袭性T47D乳腺癌细胞系WT或稳定表达使内源性NFAT3(shNFAT3-3， shNFAT3-4)的表达降至50％的shRNA低侵袭性T47D乳腺癌细胞系产生的 SEV以及作为对照的shRNA对照(shCtrl)预处理高侵袭性MDA-MB-231(B) 或SUM159PT(C)细胞或不对其进行处理，并检测其侵袭能力(n＝3，**p< 0.005)。根据经处理孔的侵袭细胞数占设定为1的任意对照孔的侵袭细胞数的比例计算侵袭指数。

图5：在MDA-MB-231细胞中从头诱导TGFb1是SEV调节乳腺癌细胞的侵袭所需要的。(A)在存在或不存在放线菌素的条件下使用由WT-T47D 分泌性SEV孵育MDA-MB-231并通过ELISA测量TGFβ1(n＝2；*p<0,05)。 (B)使用由低侵袭性WT-T47D乳腺癌细胞系产生的SEV预处理瞬时转染 siRNA对照或直接针对内源性TGFb1的siRNA的高侵袭性MDA-MB-231或不对其进行处理，并检测其侵袭能力。在一些情况下，使用内源性TGFb1处理MDA-MB-231，以逆转siRNA的作用(n＝2；*p<0,005)。

图6：WT-T47D细胞产生的SEV能上调hTGFB1启动子的活性。(A) hTGFb1启动子的示意图。利用其在以下网址的软件上开发的NFAT结合位点找到了6个潜在的NFAT结合位点：http://www.fast-db.com/perl/nfat.pl；显示了与+1起始位点相关的位置。(B)将pCS4-(n)-b-半乳糖苷酶与hTGFb1启动子质粒或作为对照的pGL3基本载体共转染SUM-159-PT细胞，并且不对其进行处理或使用来自WT-T47D的SEV对其进行处理。24h后，检测细胞荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。相对于其β-半乳糖苷酶的活性对hTGFb1启动子介导的荧光素酶活性的量进行归一化，并与pGL3基本载体的对照荧光素酶活性进行比较(n＝2；*p<0,005)。

图7：静脉内注射由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV抑制肿瘤的生长和转移并且其与TGFb1的诱导情况相关。(A)将含1.10⁶个MDA-MB-231 细胞(D3H2LN)的100ml PBS注射至每只6周龄雌性小鼠Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫中。以平均肿瘤体积(cm3)表示肿瘤生长情况，数据来自将细胞植入脂肪垫7天后每周静脉内注射PBS的小鼠N°629 (A和B)以及每周静脉内注射由WT T-47D产生的50.10⁸pp SEV的N°610 (A)或N°625(B)小鼠。血液中血清TGFb1的测量结果以ng/ml表示，数据来自每周静脉内注射PBS的小鼠N°629(A和B)以及每周静脉内注射由 WT T-47D产生的50.10⁸pp SEV的N°610(A)或N°625(B)小鼠。(C和D) 从第42天开始，在Xenoge系统上每周进行一次生物发光成像(将原发肿瘤用黑纸遮盖)，对由转移MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量进行定量。转移的量以由转移MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量表示，数据来自每周静脉内注射PBS的小鼠N°629(C和D)以及每周静脉内注射由WT T-47D 产生的50.10⁸pp SEV的N°610(C)或N°625(D)小鼠。血液中TGFb1的测量结果以ng/ml表示，数据来自每周静脉内注射PBS的小鼠N°629(A和B)以及每周静脉内注射由WT T-47D产生的50.10⁸pp SEV的N°610(C)或N°625 (D)小鼠。

图8：瘤内注射由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV抑制肿瘤的生长和转移并且其与TGFb1的诱导情况相关。(A)将含1.10⁶个MDA-MB-231细胞(D3H2LN)的100ml PBS注射至每只6周龄雌性小鼠Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫中。以平均肿瘤体积(cm3)表示肿瘤生长情况，数据来自将细胞植入脂肪垫7天后每周瘤内注射PBS的小鼠N°617(A和B)以及每周瘤内注射由WT T-47D产生的50.10⁸pp SEV的N°614(A) 或N°602(B)小鼠。血液中血清TGFb1的测量结果以ng/ml表示，数据来自每周瘤内注射PBS的小鼠N°629(A和B)以及每周瘤内注射由WT T-47D 产生的50.10⁸pp SEV的N°617(A)或N°602(B)小鼠。(C和D)从第42 天开始，在Xenoge系统上每周进行一次生物发光成像(将原发肿瘤用黑纸遮盖)，对由转移MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量进行定量。转移的量以由转移MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量表示，数据来自每周瘤内注射PBS的小鼠N°617(C和D)以及每周瘤内注射由WT T-47D产生的50.10⁸ pp SEV的N°614(C)或N°602(D)小鼠。血液中TGFb1的测量结果以ng/ml 表示，数据来自每周瘤内注射PBS的小鼠N°617(A和B)以及每周瘤内注射由WT T-47D产生的50.10⁸pp SEV的N°614(C)或N°602(D)小鼠。

图9：瘤内注射SEV的肿瘤生长抑制作用需要在T47D-SEV产生细胞中表达NFAT3并且其与TGFb1的诱导情况相关。将含1.10⁶个MDA-MB-231 细胞(D3H2LN)的100ml PBS注射至每只6周龄雌性小鼠Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫中。(A)以平均肿瘤体积(cm3)±SEM表示肿瘤生长情况，数据来自将细胞植入脂肪垫7天后每周瘤内注射PBS的小鼠(PBS)，来自每周使用由shCtrl-转染T47D细胞产生的50.10⁸ppSEV瘤内注射的小鼠(50.10⁸T47D-shCtrl瘤内注射)，来自每周使用由shNFAT3-4-转染T47D细胞产生的50.10⁸ppSEV瘤内注射的小鼠(50.10⁸T47D-shNFAT3-4 瘤内注射)，以及来自每周使用由shNFAT3-3-转染T47D细胞产生的50.10⁸ ppSEV瘤内注射的小鼠，每组8只小鼠。在每个时间点，使用双尾、非配对 Student t检验与使用PBS瘤内注射的小鼠进行比较。(B)从第42天开始，在 Xenoge系统上每周进行一次生物发光成像(将原发肿瘤用黑纸遮盖)，对由转移MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量进行定量。转移的量以由转移 MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量表示，数据来自每周使用PBS静脉内注射或使用50.10⁸pp SEV T47D-shCtrl瘤内注射或使用50.10⁸pp SEV T47D-shNFAT3-4瘤内注射或使用由50.10⁸pp SEVshNFAT3-3-转染T47D细胞产生的50.10⁸ppSEV瘤内注射的小鼠。*p<0.05**p<0.005和***p<0.0005。 (C)和(D)，每周收集(A)组小鼠的血清，并在实验结束时通过ELISA 测定评价血清中存在的TGFb1的浓度。(C)每组的各点表示在来自第1周至第9周的血清中60天的平均TGFb1浓度。在每个时间点，使用双尾、非配对Student t检验与使用PBS瘤内注射的小鼠进行比较。*p<0.05。(D)数据表示第1周至第9周中(A)中每组小鼠的数据。

图10：延迟注射由T47D细胞产生的SEV抑制肿瘤生长。将含0,5.10⁶个MDA-MB-231细胞(D3H2LN)的100ml PBS注射至每只6周龄雌性小鼠 Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫中。(A)以平均肿瘤体积(cm3) +/-SEM表示肿瘤生长情况，数据来自从第27天开始每周静脉内注射PBS的小鼠(PBS)，来自从第27天开始每周静脉内注射由T47D-WT细胞产生的50.10⁸ppSEV的小鼠。(B)以平均肿瘤体积(cm3)+/-SEM表示肿瘤生长情况，数据来自从第27天开始每周瘤内注射PBS的小鼠(PBS)，来自从第27 天开始每周瘤内注射由T47D-WT细胞产生的50.10⁸ppSEV的小鼠。在每个时间点，使用双尾、非配对Student t检验进行比较。*p<0,05、**p<0,005、 ***p<0,0005。(8只小鼠/组)。

图11：拟开发疗法的示意图。

图12：与在T47D细胞中一样，在HEK细胞中表达NFAT3。使用非靶向siRNA对照(siCtl)或靶向内源性NFAT3的siRNA(siNFAT3)对T47D 细胞和HEK细胞进行瞬时转染。转染48h后，使用针对NFAT3的抗体检测全细胞裂解物中的内源性NFAT3。通过使用针对肌动蛋白的抗体对细胞膜进行检测对等量上样的对照进行评价。

图13：表达NFAT3的HEK细胞的产生。(A)表示与tdTomato标签融合的用于转染HEK细胞的NFAT3构建体。(B)使用对照载体NFAT3WT、 ΔNFAT3或缺乏C-末端最后85个氨基酸的NFAT3瞬时转染的T47D乳腺癌细胞，并且在经典transwell侵袭测定中评估其侵袭能力。(C)通过western 印迹使用所示抗体评价在HEK产生的SEV中不同NFAT3构建体的表达情况。

图14：通过尺寸和特异性标记物对由HEK细胞产生的SEV的表征。由 HEK to-Ctl(A)和HEK to-NFAT3(B)产生的SEV的尺寸分布的代表性实例。通过NanoSight对HEK to-ΔNFAT3(C)和HEK to-NFAT3-85C(D)进行评价。SEV的浓度(颗粒/ml:pp/mL)以粒径(nm)的函数表示。

图15：由表达NFAT3的HEK细胞产生的外来体抑制高侵袭性 MDA-MB-231细胞的侵袭。(A)使用由低侵袭性T47D乳腺癌细胞系WT或由稳定表达to-NFAT3或to-ΔNFAT3或to-NFAT3-85C的HEK人胚胎细胞系产生的外来体以及作为对照的空载体(to-Ctl)预处理高侵袭性乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)或不对其进行处理，并检测其侵袭能力。与未经处理细胞(-)相比，*p<0.05**p<0.005和***p<0.0005(n＝2)。(B)使用由低侵袭性 T47D乳腺癌细胞系WT或由稳定表达to-NFAT3或to-ΔNFAT3或 to-NFAT3-85C的HEK人胚胎细胞系产生的外来体以及作为对照的空载体 (to-Ctl)预处理高侵袭性乳腺癌细胞(SUM-159-PT)或不对其进行处理，并检测其侵袭能力。与未经处理细胞(-)相比，*p<0.05**p<0.005和***p <0.0005(n＝2)。(C)使用由低侵袭性T47D乳腺癌细胞系WT或由稳定表达 to-NFAT3或to-ΔNFAT3或to-NFAT3-85C的HEK人胚胎细胞系产生的外来体以及作为对照的空载体(to-Ctl)预处理高侵袭性胰腺癌细胞(BXPC3)或不对其进行处理，并检测其侵袭能力。与未经处理细胞(-)相比，*p<0.05**p <0.005和***p<0.0005(n＝2)。(D)使用由低侵袭性T47D乳腺癌细胞系 WT或由稳定表达to-NFAT3或to-ΔNFAT3或to-NFAT3-85C的HEK人胚胎细胞系产生的外来体以及作为对照的空载体(to-Ctl)预处理高侵袭性胶质母细胞瘤癌细胞(U87MG)或不对其进行处理，并检测其侵袭能力。与未经处理细胞(-)相比，*p<0.05**p<0.005和***p<0.0005(n＝2)。

具体实施方式

使用含有表达NFATC4细胞分泌性胞外囊泡(SEV)的组合物治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症

在第一个方面中，本发明涉及一种组合物(特别是一种药物组合物)，所述组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症，所述组合物包含表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4(NFATC4)细胞分泌性胞外囊泡(SEV)。

本发明还涉及一种在需要其的患者中用于治疗癌症或者用于治疗或预防转移性癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含表达 NFATC4的细胞的SEV的组合物。

本发明还涉及包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物用于制备用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症的药物的用途。

本发明还涉及包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物用于治疗癌症或者用于治疗或预防转移性癌症的用途。

分泌性胞外囊泡(SEV)

“分泌性胞外囊泡”或“SEV”指由细胞在其微环境中从其质膜释放的膜囊泡。在本发明的背景下，SEV的直径通常小于或等于约500nm，特别是在约30至约500nm之间，或者在约40至约500nm之间，或者在约50至约 500nm之间。SEV被磷脂膜包围，磷脂膜优选含有相对较高水平的胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺，并且优选地还含有对去垢剂具有抗性的膜结构域(脂筏)。

SEV的膜蛋白与细胞具有相同的取向。SEV的特征通常为存在肌动蛋白 β、参与膜转运和融合的蛋白(如Rab、GTPases、膜联蛋白和阀蛋白)、转运所需的内体分选(ESCRT)复合物的组分(如Alix)、肿瘤易感基因101 (TSG101)、热休克蛋白(HSP，如HSPA8、HSP90AA1、HSC70和HSC90)、整合素(如CD62L、CD62E或CD62P)以及四跨膜蛋白(特别是CD63、CD81、CD82、CD53、CD9和/或CD37)。

SEV还可以含有RNA，如mRNA和miRNA。

SEV可以采用各种方法由分泌其的细胞制备，其中最常见和最优选的方法是差速离心。可以用于制备在本发明中使用的SEV的方法包括如 Yakimchuk,K.材料和方法,vol.5,2015中所公开的方法：

·差速离心：

如上所述，该方法是本发明中最常用的技术之一和优选的方法。

该方法由若干步骤组成，优选在约4℃下进行，至少包括下述三个步骤 1)至3)：

1)低速离心以除去细胞和细胞碎片，

2)更高速离心以消除较大的囊泡(尺寸超过100nm)，以及最后

3)高速离心以沉淀SEV。

在步骤1)中，使用约1300至3500RPM(转每分)的离心加速度离心 5-30分钟以除去细胞和细胞碎片。任选地，步骤1)可以包括两个低速离心，第一个以极低速度离心(例如约1350RPM)，第二个以最高速度离心(例如 3500RPM)。

特别地，可以在步骤1)中使用在约4℃下以1350RPM离心10分钟，随后再在约4℃下以3500RPM离心20分钟。

在步骤2)中，使用约10000RPM的离心加速度离心15-45分钟以消除较大的囊泡(尺寸超过100nm)。特别地，可以在步骤2)中使用在约4℃下以约10,000RPM离心30分钟。

在步骤3)中，其优选地至少进行两次，使用约40000RPM的离心加速度离心60-120分钟以沉淀SEV。特别地，可以在步骤3)中使用在约4℃下以40,000RPM离心90分钟。

特别优选的方案如下所述：

a)在4℃下以1350RPM离心培养细胞10分钟并收集上清液；

b)在4℃下以3500RPM离心收集的上清液20分钟并收集上清液；

c)在4℃下以10,000RPM离心收集的上清液30分钟并收集上清液；

d)在4℃下以40,000RPM超速离心收集的上清液90分钟并收集球团 (pellet)；

e)将所述球团重悬于冰冷PBS中；以及

f)在4℃下以40,000RPM超速离心90分钟并收集所述球团。

·密度梯度离心：

该方法将超离心与蔗糖密度梯度相结合。

更具体地，将密度梯度离心用于将SEV与非囊泡颗粒(如蛋白和蛋白 /RNA聚集物)分离。因此，这种方法将囊泡与不同密度的颗粒分离。充分的离心时间是非常重要的，否则如果其具有相似的密度污染颗粒可能仍存在于SEV级分中。最新的研究表明，在进行离心之前，应将来自超速离心的SEV 球团应用到蔗糖梯度上。

·体积排阻色谱：

体积排阻色谱用于根据尺寸而不是根据分子量分离大分子。该技术应用填充了含有多个孔和管道的多孔性聚合物小珠的柱子。分子是否能够通过小珠取决于其直径。具有较小半径的分子需要花费更长时间才能迁移通过柱子的孔，而大分子则较早从柱孔中洗脱出来。体积排阻色谱能够精确分离大分子和小分子。而且，可以将不同的洗脱溶液用于这种方法。

·过滤：

还可以将超滤膜用于分离SEV。根据微囊尺寸不同，这种方法能够将SEV 与蛋白和其他大分子分离。SEV也可以通过多孔结构将其捕获而分离(图2)。最常见滤膜的孔径为0.8μm、0.45μm或0.22μm，可以将其用于收集大于800 nm、400nm或200nm的SEV。特别地，设计了一种微柱多孔硅纤化结构，以分离40-100nm的SEV。在初始步骤中，将较大的囊泡除去。在接下来的步骤中，将SEV群浓缩在滤膜上。分离步骤相对较短，但是该方法需要使用 PBS缓冲液对硅结构进行预孵育。在接下来的步骤中，将SEV群浓缩在滤膜上。

·基于聚合物的沉淀：

基于聚合物的沉淀技术通常包括将生物流体与含有聚合物的沉淀溶液混合，在4℃下孵育以及低速离心。聚乙二醇(PEG)是聚合物沉淀中最常见的聚合物之一。使用这种聚合物的沉淀具有很多优点，包括对分离的SEV影响较小以及使用中性pH。制备了用于分离SEV的应用PEG的多种商品化试剂盒。最常用的试剂盒是ExoQuick^TM(SystemBiosciences,Mountain View,CA, USA)。这种试剂盒的操作简便快捷并且不需要额外的设备。最新的研究表明使用ExoQuick^TM法进行超滤获得了SEV的最高收率。

·免疫分离：

已开发了基于表面SEV受体或SEV胞内蛋白的SEV免疫分离的几项技术。然而，这些方法通常主要用于对SEV蛋白进行检测、分析和定量。

·筛分：

这种技术通过膜从生物液体中筛分SEV，并通过压力或电泳进行过滤分离SEV。

NFATC4

如在本申请中使用的“表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4”或“NFATC4”指由在Entrez Gene数据库中具有基因名NFATC4(基因编号4776)的人类基因或其如下文所定义的变体编码的蛋白。NFATC4基因也称为“活化T细胞核因子，胞质4”、“T细胞转录因子NFAT3”、“NFAT3”、 “NF-AT”和“NF-ATC4”。该基因编码几种mRNA和蛋白亚型，其均包括在本发明背景下对NFATC4的定义中。NFATC4各种亚型的cDNA和蛋白序列如下表1中所示：

表1：人NFATC4亚型1至7的cDNA和蛋白序列。

如上所述，NFATC4的所有亚型均包括在本发明背景下对NFATC4的定义中。然而，在优选的实施方式中，分泌存在于用于根据本发明的组合物中的SEV的细胞表达上表1中公开的NFATC4的亚型2(902个氨基酸的蛋白) (SEQ ID NO:4)或其变体。其他优选的亚型是上表1中公开的亚型4(SEQ ID NO:8，832个氨基酸)和亚型7(SEQ ID NO:14，965个氨基酸)，因为这些亚型与亚型2均具有下文所述的变体序列“ΔNFATC4”，并且因为发明人已发现表达ΔNFATC4细胞的SEV是高效的。

在本发明的背景下，不仅所有亚型的NFATC4均包括在NFATC4的定义中，而且与天然的NFATC4相比所有变体均保持了NFATC4的功能或具有增加的功能。这些主要包括等位基因变体。

特别关注的变体是ΔNFATC4，其对应于上表1中公开的NFATC4的亚型 2，其521个N-末端氨基酸被截去(参见Molkentin等，(1998).Cell 93:215-228 的图1A中被挽救的NF-AT3)：

ΔNFATC4的氨基酸序列如下所示：

DCAGILKLRNSDIELRKGETDIGRKNTRVRLVFRVHVPQGGGKVVSV QAASVPIECSQRSAQELPQVEAYSPSACSVRGGEELVLTGSNFLPDSKVVFI ERGPDGKLQWEEEATVNRLQSNEVTLTLTVPEYSNKRVSRPVQVYFYVSN GRRKRSPTQSFRFLPVICKEEPLPDSSLRGFPSASATPFGTDMDFSPPRPPYP SYPHEDPACETPYLSEGFGYGMPPLYPQTGPPPSYRPGLRMFPETRGTTGC AQPPAVSFLPRPFPSDPYGGRGSSFSLGLPFSPPAPFRPPPLPASPPLEGPFPSQ SDVHPLPAEGYNKVGPGYGPGEGAPEQEKSRGGYSSGFRDSVPIQGITLEEVSEIIGRDLSGFPAPPGEEPPA(SEQ ID NO:15，381个氨基酸)

在本发明背景下，可以将包含表达任何NFATC4变体细胞的SEV的组合物用于治疗癌症或者用于治疗或预防转移性癌症，所述任何NFATC4变体含有ΔNFATC4的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)。

当细胞表达NFATC4变体时，所述变体优选地包含上表1中公开的 NFATC4亚型2的85个C-末端氨基酸(其与ΔNFATC4的亚型2的85个C- 末端氨基酸是相同的)。

表达NFATC4的细胞

在本发明背景下，可以将任何表达NFATC4的细胞用于制备SEV。表达 NFATC4的细胞的非限制性实例包括：

·具有较低侵袭能力的癌细胞，以及

·被诱导以表达NFATC4的任何细胞。

在本发明优选的实施方式中，表达NFATC4细胞的SEV被从具有较低侵袭能力的癌细胞中纯化。事实上，此类癌细胞通常表达NFATC4。

在本说明书中，“侵袭能力”或“相对侵袭能力”指癌细胞通过细胞外基质(ECM)进入邻近组织的能力，该过程涉及ECM降解和蛋白水解。可以在体外或体内侵袭测定中检测特定癌细胞的侵袭能力。体外侵袭测定通常依赖于使用天然的或重构的基质，将该基质用于具有适宜孔径(通常是5、8、 10或12μm)的滤器(也称为膜)上，所述孔径取决于所检测的癌细胞，所述滤器位于含有针对所检测癌细胞的趋化剂的培养基上面。然后可以根据能够穿过基质和滤器到达趋化基质的细胞数计算侵袭指数。根据侵袭性细胞数相对于在同一检测中已知的低侵袭性(如T47D、MCF7)或高侵袭性(如 MDA-MB-231、SUM159PT)细胞数量的比值计算相对侵袭能力。

可以使用各种类型的天然或重构基质，包括但不限于从细胞中分离的天然基质(如“Matrigel”，一种由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌性明胶蛋白混合物)、I型或IV型胶原凝胶基质以及I型层粘连蛋白凝胶基质。在体外侵袭测定中最常用的基质是Matrigel。

如上所述，滤器孔径应与所检测的细胞类型相适应，通常选自5、8、10 和12μm，其取决于细胞类型。对于乳腺癌细胞，一般采用8μm孔径的滤器。

在趋化基质中也可以使用各种趋化剂，其取决于所检测细胞的类型。常用的趋化剂是条件NIH-3T3培养基。

侵袭水平取决于多种参数，包括细胞类型、基质的类型和厚度、测定持续时间以及滤器上的初始细胞密度。因此，为了定义细胞样品的侵袭能力，应与新细胞样品平行检测具有较低或较高侵袭能力的参照细胞样品。然后，通过将其侵袭指数与参照细胞样品的侵袭指数进行比较评估新细胞样品的侵袭能力。

对于大多数类型的癌症，现有技术中已经定义了具有较低或较高侵袭能力的细胞系。在本发明背景下，“具有较低侵袭能力的癌细胞”指在体外侵袭测定中的侵袭指数低于或等于至少一种相同细胞类型已知具有较低侵袭能力的癌细胞系的癌细胞。

具有较低或较高侵袭能力的癌细胞系的实例如下表2中所述。

表2：按细胞类型的已知具有较低或较高侵袭能力的癌细胞系。

在乳腺癌细胞的情况下，表达雌激素受体α(ERA)的乳腺癌细胞通常具有较低的侵袭能力，因此表达NFATC4细胞的SEV可以从表达雌激素受体α (ERA)的乳腺癌细胞中纯化。

或者，表达NFATC4细胞的SEV也可以从被诱导以表达NFATC4的任何其他细胞中纯化。

“被诱导以表达NFATC4的细胞”指天然表达或不表达NFATC4，但是已使用至少一种能够在细胞中诱导NFATC4表达或者增强NFATC4活性的化合物处理的细胞。当初始细胞不表达NFATC4时，处理应能够使初始细胞产生NFATC4表达或增强NFATC4的活性。当初始细胞已经表达NFATC4时，处理应能够在初始细胞中增加NFATC4表达或增强NFATC4的活性。

可以使用任意类型的初始细胞，包括但不限于：

·如上文所定义的，具有较低侵袭能力的癌细胞，以及

·健康细胞。

在这两种情况下，可以使用原代细胞或细胞系。对初始细胞的类型并没有特别地限制。对于具有较低侵袭能力的癌细胞，可以使用如下文所述的任意类型的癌细胞。在健康细胞的情况下，可以使用任意类型的细胞，包括成纤维细胞、上皮细胞、HEK293(人胚肾)、树突状细胞、干细胞。“健康细胞” 指不是肿瘤源性的且来自或衍生自正常组织的细胞。换言之，健康细胞指原代非癌细胞，或指来自正常、健康原代细胞的细胞系。此外，可以使用贴壁和悬浮细胞，但贴壁细胞是优选的。

对于治疗人类患者，将优选使用人细胞(原代细胞或细胞系、贴壁细胞或悬浮细胞、具有较低侵袭能力的癌细胞或健康细胞)。

当使用健康细胞诱导NFATC4表达时，在优选的实施方式中，所述健康细胞是来自待治疗患者的自体细胞(特别是自体成纤维细胞)。在另一个实施方式中，所述健康细胞是人胚胎细胞系，其中所述人胚胎细胞系是商业化可购得的或受赠予的细胞系，特别是HEK293T细胞。

这确实限制了对所施用的SEV组合物的任何免疫应答。

可以使用用于诱导NFATC4表达的任意适宜方法。

在优选的实施方式中，为了诱导NFATC4表达，细胞已被包含编码 NFATC4的核酸分子的表达载体所转染。

“转染”指通过本领域技术人员公知的任意适宜技术故意将核酸引入细胞的过程。特别地，在本发明背景下，术语转染旨在包括用于将核酸引入细胞的病毒和非病毒方法。

如在本申请中所使用的“表达载体”指包含编码NFATC4的核酸分子以及使其表达所必需的元件的载体。特别地，编码NFATC4的核酸分子与适宜的调控序列可操作地连接。

如在本申请中所使用的，术语“调控元件”或“调控序列”指允许、有助于或调节核酸分子在给定宿主细胞或对象中表达的任何元件，所述表达包括核酸或其衍生物(即，mRNA)的复制、倍增、转录、剪接、翻译、稳定和/或转运。本领域技术人员将意识到的是，调控序列的选择可能取决于诸如载体本身和待转染细胞等的此类因素，并且本领域技术人员可根据关于这一主题的一般知识和出版物容易地选择这些因素。用于在真核系统中组成型表达的适宜启动子包括病毒启动子，如SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子或增强子、腺病毒早期和晚期启动子、单纯疱疹病毒(HSV) -1的胸苷激酶(TK)启动子和逆转录病毒长末端重复序列(例如，MoMuLV 和劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR)以及细胞启动子如磷酸甘油激酶(PGK)启动子。用于慢病毒载体的适宜启动子的实例包括由Clontech市售的pLVX-tdTomato-C1载体中存在的那些。

表达载体可以特别地选自质粒和病毒表达载体。

如在本申请中所使用的“质粒载体”指可复制的DNA构建体。适宜质粒载体的代表性实例包括但不限于pREP4、pCEP4(Invitrogen)、pCI(Promega)、 pVAX(Invitrogen)和pGWiz(Gene Therapy System Inc)。对于转染，可以将质粒载体与脂质或聚合物复合以形成特定结构，如脂质体、脂质复合物或纳米颗粒。

如在本申请中所使用的，术语“病毒载体”指包含病毒基因组的至少一个元件并且可以包装进入病毒颗粒的核酸载体。术语“病毒”、“病毒体”、“病毒颗粒”和“病毒载体颗粒”可以互换使用，指在使得产生病毒颗粒的适宜条件下当将核酸载体转导进入适宜细胞或细胞系中时形成的病毒颗粒。在本发明的背景下，必须将术语“病毒载体”广义地理解为包括核酸载体(例如， DNA病毒载体)以及由其产生的病毒颗粒。术语“感染性”指病毒载体感染并进入宿主细胞或对象的能力。

在优选的实施方式中，使用包含编码NFATC4的核酸分子的病毒表达载体。

病毒载体可以是可复制的或选择性的(例如，进行工程化改造以使其更好地复制或在特定宿主细胞中具有选择性)，或者可以是遗传禁用的，以使得产生复制缺陷或复制受损。通常地，此类载体是市售的(例如，从nvitrogen、 Stratagene、AmershamBiosciences、Promega等购得)，或者可以从诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)的保藏机构获得，或者已经是描述其序列、组织和生产方法以使得技术人员能够应用其的很多出版物的主题。

适宜病毒载体的代表性实例来自各种不同病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、 α病毒、水泡性口炎病毒等)。如上文所述，术语“病毒载体”包含载体DNA、基因组DNA以及由其产生的病毒颗粒，特别是感染性病毒颗粒。

在优选的实施方式中，使用包含编码NFATC4的核酸分子的逆转录病毒表达载体(以及特别是慢病毒表达载体)。逆转录病毒具有感染性，并且在大多数情况下整合进入分裂细胞，这方面特别适于本发明用于生产表达高水平 NFATC4细胞的背景使用。适宜的逆转录病毒通常含有LTR序列，衣壳化区和编码NFATC4的核酸分子。重组逆转录病毒可以来自任意来源(鼠源、灵长类、猫科动物、人等)的逆转录病毒，以及特别是来自MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)、MVS(鼠肉瘤病毒)、Friend鼠逆转录病毒(Fb29)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、LN病毒或鼠干细胞病毒(MSCV)。其在衣壳化细胞系中增殖，该细胞系反而能够提供构成病毒颗粒所需的病毒多肽gag、pol和/ 或env。在文献中对此类细胞系进行了描述(PA317、Psi CRIP GP+Am-12、 HEK 293T等)。在本发明中使用的逆转录病毒(以及更特别是慢病毒)表达载体可以含有修饰，特别是在LTR(使用真核启动子替代启动子区域)或者衣壳化区域中(使用异源性衣壳化区域替代)。可以用于本发明背景的市售慢病毒载体的实例包括由Clontech销售的pLVX-tdTomato-C1载体。

然而，可以使用包含编码NFATC4的核酸分子的其他类型的病毒表达载体。

用于本发明背景的病毒载体的实例包括腺病毒载体，其可以来自多种人或动物来源(例如，犬、绵羊、猿腺病毒等)。可以使用任何血清型，特别优选人腺病毒，以及特别优选C亚属，如Ad2、Ad5、Ad6，以及B亚属，如 Ad11、Ad34和Ad35。所述的腺病毒可以从ATCC获得，或者已经是描述其序列、组织和生产方法以使得技术人员能够应用其的很多出版物的主题。当使用腺病毒载体时，优选是E1缺陷型腺病毒载体，E1缺失从大约459位延伸至3328位或从大约459位延伸至3510位(参见GenBank中公开的序列Ad5，登录号M73260.1)。可以通过缺失腺病毒基因组的其他部分(全部或部分非必需E3区(例如，缺失约27867位至30743位)或其他必需的E2和/或E4 区)进一步改善克隆能力。然后，可以将编码NFATC4的核酸分子插入腺病毒基因组的任何位置，特别优选插入以替换E1和/或E3区。其可以位于相对于所讨论区域的天然转录方向的有意义或反义方向。

可以用于本发明背景的病毒载体的其他实例包括痘病毒载体，如禽痘病毒载体(例如，FP9)、金丝雀痘病毒载体(例如，ALVAC)和痘苗病毒载体，后者是优选的。适宜的痘苗病毒包括但不限于哥本哈根株、Wyeth株、NYVAC 和经修饰的Ankara(MVA)株。用于构建和生产重组痘病毒的一般条件是本领域所熟知的。优选地将编码NFATC4的核酸分子插入痘病毒基因组的非必需基因座中。胸苷激酶基因特别适于插入哥本哈根痘苗病毒载体以及缺失II 或III以插入MVA载体。

适用于本发明背景的其他病毒载体是麻疹病毒，其可以从副粘病毒科获得，特别优选麻疹病毒。将编码NFATC4的核酸分子插入P和M基因之间或者H和L基因之间是特别适宜的。

或者，代替使用包含编码NFATC4的核酸分子的表达载体感染初始细胞，可以通过任意其他适宜的方法诱导初始细胞表达NFATC4或使其显示出增强的NFATC4活性。值得注意的是，可以将初始细胞与化合物接触或者使用包含编码能够诱导或增加NFATC4表达或增强NFATC4活性的蛋白的核酸分子的表达载体对其进行转染。

癌症治疗

可以将包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症。

在本说明书中，“癌症”指以失调或不受控制的细胞生长为特征的恶性肿瘤。特别地，“癌细胞”指具有失调或不受控制的细胞生长的细胞。

术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(也称为“原发性癌症”，对应于细胞未迁移到对象体内除原始肿瘤部位以外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(也称为“继发性癌症”或“转移性癌症”，指由转移引起的，肿瘤细胞迁移到不同于原始肿瘤部位的继发性部位的那些)。

使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物可以治疗的癌症类型或者可以治疗或预防的转移性癌症的类型没有特别限制。此类癌症可以特别地选自实体癌症。实体癌症特别地包括癌(从器官、腺体或身体结构的衬里层(上皮细胞)起始的癌症，也称为“上皮癌”)、肉瘤(从诸如软骨、脂肪、肌肉、肌腱或骨骼等结缔组织起始的癌症)和脑癌(从脑细胞起始的癌，如胶质瘤、胶质母细胞瘤和星形细胞瘤)。以其起源的身体部位对癌症进行进一步命名。当癌症扩散时，保持同一名称。在本发明背景下，癌症可以特别地选自下述癌，包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、消化道癌(也称为胃肠道癌，包括结肠直肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管细胞癌和畸胎癌)、肺癌、前列腺癌和喉癌，特别是人类对象的。在本发明背景下，癌症还可以选自脑肿瘤，包括但不限于胶质母细胞瘤，特别是人类对象的。在优选的实施方式中，癌症可以特别地选自乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和肺癌；更优选地，所述癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和胶质母细胞瘤，最优选地，所述癌症是乳腺癌，特别是转移性乳腺癌。

此类癌症还可以选自造血系统癌症，特别是选自由白血病、淋巴瘤和骨髓瘤组成的组，特别是人类患者的。

在本说明书中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指改善患者疾病，所述疾病可以是在临床、组织学、生化水平上观察到的。特别地，对疾病临床、组织学或生化症状的任何减轻均包括在术语“治疗”中。因此，在原发性癌症背景下，“治疗”特别地涉及减少癌症生长或通过转移扩散的事实。因此，在转移性癌症背景下，“治疗”特别地涉及减少转移性癌症生长或进一步通过转移扩散的事实。治疗可能需要多次给予药剂和/或治疗。治疗还包括将表达NFATC4的细胞的SEV与另一抗癌剂组合的可能性。在这种情况下，两种抗癌剂(表达NFATC4的细胞的SEV和其他抗癌剂)可以顺序或同时施用。在本说明书中，术语“顺序”指给予(一次或多次给予)第一抗癌剂(表达NFATC4的细胞的SEV或其他抗癌剂)，随后停止给予第一抗癌剂并给予(一次或多次给予)第二抗癌剂(其他抗癌剂或表达NFATC4的细胞的SEV)。在本说明书中，术语“同时”指在同一段时间内给予两种抗癌剂(表达NFATC4的细胞的SEV和其他抗癌剂)。这包括在含有两种药剂的一个组合物中或者在含有两种药剂之一的单独组合物中给予两种抗癌剂(表达 NFATC4的细胞的SEV和其他抗癌剂)。在同一时间段内混合给药(一种药剂和另一种药剂交替给药)被认为是同时给药。

抗癌剂可以选自手术治疗、化疗、放疗、免疫疗法和细胞疗法。

在本说明书中，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”指排除或推迟发病或降低与疾病相关的临床、组织学或生化事件强度的事实。因此，在癌症背景下，“预防”特别地涉及至少部分地抑制新的癌症生长或扩散的事实。预防可能需要多次给予药剂和/或治疗。同样是在预防的背景下，可以顺序或同时将表达NFATC4的细胞的SEV与另一抗癌剂联用。

在本说明书中，术语“患者”指哺乳动物，例如人、犬、奶牛、马、袋鼠、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、家兔、大鼠和非人转基因动物。在本发明优选的实施方式中，对象是人类对象。

包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物是以治疗有效量施用的。

如在本申请中所使用的，“治疗有效量”指足以用于预期用途的量。对于根据本发明的抗癌组合物而言，其指足以减少癌症生长或扩散的量。

在小鼠中，已成功使用了每只小鼠每周给药50.10⁸pp SEV(由从Malvern 购得的NanoSight装置测得的颗粒数)，并且可以预期每周给药10⁸至10¹¹pp SEV是成功的，因为已知小鼠的总血容量为约1.5mL。可以根据总血容量将适宜的剂量外推至其他物种。例如，在人体中(总血容量为约5L)可以使用至少约15.10¹²SEV的剂量。在本发明的背景下，优选使用NanoSight装置(从 Malvern购得)确定组合物中存在的SEV数量，在这种情况下SEV数量优选以“pp”计，其对应于使用NanoSight装置检测的颗粒数量。因此，在人体中 (总血容量为约5L)可以使用至少约15.10¹²pp SEV的剂量。

所给予的剂量可以根据对象的年龄、体表面积或体重、或给药途径和相关的生物利用度而改变。这种剂量调整是本领域技术人员熟知的。

可以以任意适宜的给药途径给予包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物，包括静脉内、瘤内、局部、鼻内、直肠、口服、透皮、皮下和舌下途径。在优选的实施方式中，包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物旨在以静脉内或瘤内途径施用。

根据所选择的给药途径，本领域技术人员将知晓如何将上文所定义的化合物或其药学上可接受的盐制剂以优化体内递送和生物利用度。特别地，可以使用适宜的药学上可接受的载体、赋形剂、载剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、染料、调味剂、旨在改善渗透压的盐、缓冲剂、味道校正剂和抗氧剂将上文定义的SEV制剂。这些化合物是本领域技术人员所熟知的。关于这些化学物质的详细信息可以参见最新版的雷明顿的制药科学(Maack Publishing Co.,Easton,Pa.)。本领域技术人员将根据所选择的给药途径选择最佳递送制剂。

对于静脉内、瘤内或鼻内给药，可以使用含有药理学上相容的分散剂和/ 或润湿剂的水性混悬液、等渗盐水溶液或者无菌、可注射溶液。可以使用水、醇类、多元醇、甘油、植物油等作为赋形剂。

对于局部给药，组合物可以以凝胶、糊剂、软膏、乳膏、乳液、水性或含醇水性混悬剂、油性溶液、乳液或精华型分散体、无水或亲脂性凝胶、将脂肪相在水相中分散或反之获得的具有液体或半固体乳状稠度的乳剂、具有较软或半固体乳膏或凝胶型稠度的混悬剂或乳膏、或者微乳、微囊、微粒或者离子和/或非离子型囊泡分散体形式存在。根据标准方法制备这些组合物。而且，可以在组合物中包含表面活性剂，以使得SEV能够更深的渗透。能够增加渗透的物质可以选自例如矿物油、乙醇、甘油三乙酸酯、甘油和丙二醇；例如，选自下组的凝聚剂：聚异丁烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇，以及增稠剂。

对于直肠给药，可以使用栓剂，其使用在直肠温度下熔化的粘合剂制备，例如可可脂或者半固体或液体多元醇，如聚乙二醇、蜡、天然或氢化油、脂肪等。

用于口服给药的适宜单位剂量给药制剂特别地包括片剂、包衣片、丸剂、胶凝和软明胶胶凝、口服粉剂、颗粒剂、溶液剂和混悬剂。

当制备片剂形式的固体组合物时，可以将主要活性成分与诸如明胶、淀粉、蔗糖、硬脂酸或硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯胶或其类似物的药物载剂混合。可以使用蔗糖或其他适宜物质对片剂包衣，或者甚至对其进行处理以使得其具有延长或延迟的活性以及持续释放预定量的活性成分。

可以通过将活性成分与稀释剂混合并将所获得的混合物与诸如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等的赋形剂一起倒入软胶囊或硬胶囊中获得胶囊制剂。

糖浆或酏剂形式的制剂可以含有活性成分以及甜味剂、防腐剂以及赋予味道的物质和适宜染料。可以使用诸如水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖等的赋形剂。

粉剂或水分散性颗粒可以含有活性成分与分散剂、润湿剂和混悬剂的混合物，以及矫味剂和甜味剂。

对于皮下给药，可以使用任意药学上可接受的载剂。特别地，可以使用药学上可接受的油载剂，如芝麻油。

从癌症患者健康细胞的样品制备包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物的方法

在第二个方面中，本发明还涉及一种用于从细胞样品制备包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物的方法，所述方法包括：

a)在所述细胞中诱导NFATC4表达或活性；

c)纯化所述诱导细胞的SEV。

在步骤a)中，如上所述，在初始细胞中诱导NFATC4表达或活性。特别地，可以使用上文所公开的任意类型的初始细胞(优选健康细胞，特别是自体细胞和尤其是所治疗患者的自体成纤维细胞，或成纤维细胞系如WI38，该细胞系已批准用于生产疫苗)，以及可以使用上文公开的任意类型对 NFATC4表达或活性的诱导(优选使用病毒载体，以及更特别地慢病毒载体，用于诱导NFATC4表达)。

在步骤b)中，在允许其扩增的条件下，在无SEV培养基中培养诱导细胞。一些市售培养基已经是无SEV培养基。然而，对于含有动物来源成分(例如，血清)的培养基，应对培养基进行SEV耗竭。可以通过在约4℃下将培养基在30,000至40,000RPM下离心8-16小时(例如，过夜)进行该操作。

在该方法中使用的允许诱导细胞扩增的条件根据初始细胞类型(原代细胞/细胞系；细胞类型，贴壁/悬浮细胞)的不同而改变，以及可以由本领域技术人员根据其细胞培养的普通技术知识确定。重要的一点是，细胞应处于良好的状态，因为细胞死亡和凋亡小体均能够导致SEV球团污染。因此，应当使用允许以指数生长使诱导细胞扩增和维持的条件，并且应在指数生长期结束之前(即，当细胞死亡变得显著的平台期之前)对SEV进行纯化。

在步骤c)中，如上文所述，从培养基上清中纯化SEV。特别地，可以使用上文所述的任意纯化方法，优选如上文所述的差速离心。

用于治疗目的时，整个方法优选在无菌条件下进行。

用于确定或预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的体外方法

本发明还显示表达NFATC4的细胞的SEV在癌细胞中诱导转化生长因子 β1(TGFβ1)表达，以及在动物模型中治疗癌症的体内有效性与在所治疗患者中TGFβ1表达的增加具有相关性。

因此，在第三个方面中，本发明还涉及一种用于确定使用包含表达 NFATC4的细胞的SEV的组合物在所治疗癌症患者中的治疗有效性的体外方法，来自所述癌症患者的第一生物样品取自所述治疗开始前和癌症患者相应的第二生物样品取自所述治疗开始后，所述方法包括：

b)至少对所测量的TGFβ1表达水平进行比较；以及

由于使用表达NFATC4的细胞的SEV治疗的有效性与在所治疗患者中 TGFβ1的表达增加相关，因此上述方法依赖于对在患者两个连续生物样品中 TGFβ1表达水平的比较，第一个样品取自使用表达NFATC4的细胞的SEV治疗开始之前，第二个样品取自使用表达NFATC4的细胞的SEV治疗开始之后。

“生物样品”指可以测量其中TGFβ1表达的患者的任何样品。此类样品优选包括肿瘤样品、血液样品、血清样品和尿液样品。用于比较目的时，第一个和第二个样品应优选具有相同性质(例如，两个肿瘤样品、两个血液样品、两个血清样品或两个尿液样品)。

“转化生长因子β1”或“TGFβ1”指由在Entrez Gene数据库中具有基因名TGFB1(基因编号7040)的人类基因编码的蛋白。TGFB1基因也称为 “TGF-β-1”、“预转化生长因子β-1”、“CED”、“LAP”或“潜伏相关肽”、 “DPD1”、“TGFB”和“TGFβ”。TGFβ1的cDNA和蛋白序列如下表3中所示：

表3：人TGFβ1的cDNA和蛋白序列。

a)至少在体外测量在所述肿瘤样品中TGFβ1的表达水平；

b)使用包含表达NFATC4的SEV的组合物孵育所述癌症样品；

在用于预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的方法中，检测表达NFATC4的细胞的SEV诱导或增加癌细胞TGFβ1表达的能力。在与表达NFATC4的细胞的SEV接触后，癌细胞 TGFβ1表达增加，将预测治疗是有效的，而在与表达NFATC4的细胞的SEV 接触后，癌细胞TGFβ1表达稳定或减少，将预测治疗是无效的。

“癌症样品”指包含癌细胞的任何样品，包括但不限于癌组织活检物或者全部或部分癌症手术切除物，或血液样品。事实上，本领域技术人员熟知，循环癌细胞存在于血液中。

在上文所述的两个用于确定或预测使用包含NFATC4细胞SEV的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的体外方法中，可以采用任意适宜方法测量在所述癌症患者的两个生物样品中TGFβ1的表达水平。

在一个特定的实施方式中，可以在核酸水平通过测量TGFβ1转录物的量测量在所述癌症患者的两个生物样品中TGFβ1的表达水平。可以采用本领域技术人员公知的任何技术测量TGFβ1转录物的量。特别地，可以在提取的信使RNA(mRNA)样品上直接进行测量，或者在通过本领域熟知的技术由提取的mRNA制备得到的逆转录互补DNA(cDNA)上进行测量。可以采用本领域技术人员公知的任意技术测量mRNA或cDNA样品中核酸转录物的量，包括核酸微阵列、定量PCR、新一代测序以及与标记探针的杂交。

特别地，可以使用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)。例如，可以使用基于市售qRT-PCR的方法(例如，阵列)，根据上表3中所示的TGFβ1 序列能够容易地设计引物和/或探针。

还可以使用核酸测定或阵列在体外评估TGFβ1的表达水平。在一些实施方式中，可以制备或购买核酸微阵列。阵列通常含有固体支持物以及与固体支持物接触的至少一种核酸(cDNA或寡核苷酸)，其中寡核苷酸对应于靶基因的至少一部分。例如，可以在膜、芯片、盘、检测试纸、滤器、微球、微孔板等形式中进行测定。测定系统可以具有固体支持物，其上连接着对应于靶基因的核酸(cDNA或寡核苷酸)。固体支持物可以包括例如塑料、硅、金属、树脂或玻璃。可以作为用于检测基因的试剂盒将测定成分制备和包装在一起。为确定靶核酸样品的表达性质，将所述样品标记，在杂交条件下与微阵列接触，这导致在靶核酸与同其互补的微阵列表面上附着的探针序列之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在情况。微阵列杂交技术的很多变体是本领域技术人员可获得的。

在另一个特定的实施方式中，可以在蛋白水平测量在所述癌症患者的两个生物样品中TGFβ1的表达水平。例如，在蛋白水平，可以采用本领域技术人员公知的任意方法在体外测量TGFβ1的表达水平，包括但不限于ELISA或质谱分析。这些技术容易地适用于任何流体或固体样品。事实上，可以使用本领域技术人员熟知的各种技术提取流体或固体样品中的蛋白，以便通过 ELISA或质谱在溶液中测量。或者，可以通过直接在组织切片上使用质谱分析生物样品中的蛋白表达水平。为了在蛋白水平确定TGFβ1的表达，ELISA 是一项优选的技术。

在上文所述的两个用于确定或预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV 的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的体外方法中，所检测的患者可以患有如上文所述的任意类型的癌症。

这对于上文所述的用于确定使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的体外方法是特别重要的，其不需要将癌症样品置于培养物中。在这种情况下，待测患者所患的癌症可以特别地选自：实体癌症；优选地选自癌和脑癌，更优选地选自乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、肺癌和胶质母细胞瘤；甚至更优选地所述癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和胶质母细胞瘤，最优选地所述癌症是乳腺癌，特别是转移性乳腺癌。

尽管可以将上述用于预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在癌症患者中治疗的治疗有效性的方法用于任意类型的癌症，但是优选将其用于患有液体癌症的患者，如白血病或淋巴瘤。事实上，更易于将液体癌症样品置于培养基中，以测量与表达NFATC4的细胞的SEV接触之前和之后 TGFβ1的表达情况。

以下实施例仅用于说明本发明。

实施例

实施例1：由低侵袭性乳腺癌细胞生产的SEV抑制癌症进展和转移

材料和方法

细胞培养

MDA-MB-231、T-47D、MCF7、NIH3T3、HEK293T细胞系来自美国典型培养物保藏中心，SUM-159-PT细胞系由Alex Toker(Harvard Medical School)提供，MDA-MB-231 D3H2LN-Luc和4T1-Red-Fluc细胞系来自Perkin Elmer。将MDA-MB-231 D3H2 LN-Luc细胞系维持在含75μg/ml Zeocin的 Eagle MEM中。将4T1-Red-FLuc细胞系维持在含10％胎牛血清的RPMI 1640 中。将MDA-MB-231和SUM-159-PT细胞维持在低糖(1g/L D-葡萄糖)、含 10％胎牛血清的经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将T-47D和 MCF7维持在含10％胎牛血清的RPMI 1640中。将NIH-3T3细胞维持在高糖 (4,5g/L D-葡萄糖)、含10％新生小牛血清的经Dulbecco改良的Eagle培养基 (DMEM)中。将HEK293T细胞系维持在高糖(4,5g/L D-葡萄糖)、含10％胎牛血清的经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。所有培养基均加入了2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

SEV生产

SEV耗竭培养基的制备

对于含有动物来源成分(例如，血清)的培养基，应对培养基进行SEV 耗竭。

1.制备含有高达20％血清的培养基(不推荐更高血清浓度)。

2.将超速离心机和转子预冷至4℃。

·对于SW32Ti型转子：

i.使用pollyallomer 38.5ml管(326823)。将38ml培养基加入各管并按重量配平(目标为具有0.01-0.02gr的差异)。

ii.在4℃下以30,000RPM离心过夜(标准化-18小时)。

·对于45Ti型转子：

i.使用标记为用于耗竭的65ml可重复使用的管。将65ml培养基加入各管并按重量配平(目标为具有0.01-0.02gr的差异)。

ii.在4℃下以38,000RPM离心过夜(标准化-15小时)。

3.仔细吸取上清液，不要搅动球团。

4. 0.22μm过滤并在4℃下保存。1周内使用。

更换培养基

按照针对不同类型细胞进行SEV生产的优化条件培养细胞，在特定时间点更换为SEV耗竭培养基。

1.由SEV耗竭培养基制备培养基，如有必要进行稀释。

2.真空吸去培养基。

3.对于150mm培养皿，加入7ml PBS。

4.真空吸去孔中的所有PBS或残留的培养基。

5.加入SEV耗竭培养基。

SEV生产

按照针对不同类型细胞进行SEV生产的优化条件培养细胞，如有必要更换为SEV耗竭培养基并在所示的时间点进行SEV分离(通常为更换培养基后 24-48小时)。

注意：细胞应处于良好的状态，因为细胞死亡和凋亡小体均能够导致SEV 球团污染。

如果SEV用于功能测定，则在无菌条件下进行。

将带有45Ti型转子的超速离心机预冷(将这种转子冷却耗费的时间较长，最好在生产开始之前将其置于冰箱中过夜)。

1.将培养基从培养皿转移至50ml离心管中。

2.在4℃下以1350RPM离心10分钟。

同时，对于代表性数量的培养皿(在使用30个培养皿生产时，通常为3 个)：

a.使用PBS洗涤并真空吸去PBS

b.加入胰酶，在37℃下孵育直至细胞脱壁

c.加入含10％血清的培养基，优选使用SEV耗竭的

d.分别对每个培养皿进行细胞计数并记录用于生产的总细胞数。

e.加入冰冷的PBS

f.在4℃下以1350RPM离心7分钟。

g.真空吸出上清液

h.在-80°c下冻存用于测定蛋白/RNA。

3.小心地将上清液移入新的50ml离心管中。弃去含有球团的离心管。

4.在4℃下以3500RPM将上清液离心20分钟。

5.小心地将上清液移入新的50ml离心管中。弃去含有球团的离心管。

6.在离心机5810R转子F-34-6-38中：在4℃下以10,000RPM离心30 分钟。

7.小心地将上清液移入用于45Ti型转子的无菌超速离心管中(离心管355622)。仔细检查离心管是否裂开。将65ml上清液加入离心管中并按重量配平(目标为具有0.01-0.02gr的差异)。在靠近转子的一侧标记离心管以记录球团的位置。

在该步骤中，在超速离心之前，可以将培养基在4℃下保存几天(最长 3-4天)。

8.在4℃下以40,000RPM超速离心90分钟。

9.小心地，在尽可能远离球团的位置弃去上清液，留下尽可能小的体积 (如果能看见球团，则将其完全吸出，如果不能，则最多保留2mL培养基)。

10.使用p1000将球团重悬于2mL冷PBS(或剩余上清液)中并转移至另一离心管。

11.加入2ml冷PBS并使用p1000洗涤，仔细洗涤所标记的球团位置。将洗涤液转移至同一离心管。

12.重复用2ml PBS洗涤并转移至同一离心管。

13.对所有离心管进行重复操作，将洗涤液均转移至同一离心管。

14.使用冷PBS加入离心管中至65ml并按重量配平。

15.在4℃下以40,000RPM超速离心90分钟。

16.小心地，在尽可能远离球团的位置弃去上清液，留下尽可能小的体积。

17.使用剩余上清液重悬或加入最少量的冷PBS重悬(其将取决于所使用的细胞量和细胞类型)。仔细洗涤所标记的球团位置。将洗涤液转移至无菌硅化离心管(sigmaT3281)。

18.以最少量的冷PBS洗涤离心管，特别是球团位置。将洗涤液转移至同一硅化离心管。

19.测量最终体积并记录。

20.分装至无菌硅化离心管并在-80℃下保存。

重要意见：

对于MDA-MB 231和SUM 159PT细胞：每个直径150mm的培养皿接种1x10E6个细胞；3天后更换已耗竭SEV的培养基；2天后开始生产；

对于T47-D细胞：每个直径150mm的培养皿接种6x10E6个细胞；5天后更换已耗竭SEV的培养基；2天后开始生产；

对于MCF7细胞：每个直径150mm的培养皿接种7x10E6个细胞；5天后更换已耗竭SEV的培养基；2天后开始生产；

当使用直径150mm的培养皿时，将细胞保持在25mL培养基中；

对于上文列出的所有细胞类型，甚至在第一次超速离心之后就获得了可见球团，因此重要的是除去第1次超速离心之后和使用PBS洗涤之后的所有上清液，以避免仍能够混悬于上清液中的蛋白的污染；

使用20％血清；1％P/S(和1-glu，在RPMI的情况下)制备SEV耗竭的 RPMI和DMEM。在超速离心后过滤培养基，其可以在冰箱中保存达1个月。当在更换用于生产的细胞培养基之前稀释20％SEV耗竭培养基时，应使用一瓶新的培养基。在更换用于生产的细胞培养基之前，稀释后应重新过滤经稀释的培养基。

抗体和试剂

使用了下述抗体：抗-CD63(#克隆H5C6，BD Biosciences)、抗-NFAT3 (Sigma；#F1804，Thermo Scientific；#PA1-021，Santa-Cruz Biotechnology； sc-13036)、抗-CD9(#克隆CBL162，Millipore)、抗肌动蛋白(Thermo Scientific； #MA5-15739)、ESR1(Santa-Cruz Biotechnology；sc-543)。

重组TGFB1来自Invitrogen(#PHG9214)

SEV鉴定

使用NanoSight评价SEV的尺寸分布。

Western印迹

每个泳道使用在Laemelli缓冲液中的400 000个T47D或MDA-MB-231 细胞。每个泳道分别加入含20ug SEV的Laemelli缓冲液+2％SDS。将样品在95℃下煮沸30min，再上样到凝胶上。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上并在室温下使用TBS-0,05％吐温-20封闭1h。然后使用图中所示的不同抗体将膜孵育过夜。次日，使用TBS-0,05％吐温-20洗膜4次，并使用辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1h。然后，使用TBS-0,05％吐温-20洗膜4次，在室温下孵育1h，并使用ECL显色以显示蛋白。

侵袭测定

基本如上所述进行侵袭测定，使用包被了Matrigel(Becton Dickinson) 的具有8-μm孔膜的Transwell小室(Becton Dickinson)。在检测当天使用不含 10％胎牛血清的培养基洗涤4次，以使得使用或未使用相关siRNA转染的细胞饥饿，最后一次洗涤细胞后加入600ul不含10％胎牛血清的培养基。次日，在12孔板中，使用PBS或0,375.10⁹个颗粒/孔处理细胞24h。在一些情况下，加入5ng/mL重组hTGF 1(#PHG9214，Invitrogen)或载剂。次日，使用胰酶消化细胞并收集至含0.1％BSA的无血清培养基中，以及将细胞加入各孔中。向小室的孔底加入条件NIH-3T3培养基。6小时后，使用棉签除去滤器上表面未侵入的细胞，并将侵入滤器下表面的细胞在100％甲醇中固定10 min，然后使用结晶紫染色30min。将每个Transwell中的所有细胞计数。将在各条件下侵入的细胞数与设定比例为1的任意PBS条件下进行比较。当使用siRNA瞬时转染的细胞进行测定时，使用结晶紫对细胞进行染色，因为95％的细胞被有效转染。在一些情况下，在测定过程中向细胞中加入5ng/mL重组TWEAK孵育6小时。

增殖和凋亡测定

凋亡检测

使用所示量的来自T47D-WT的SEV分别处理高侵袭性MDA-MB-231 (A)和SUM-159-PT(B)24h，以评估细胞凋亡。使用SEV处理24h后，除去细胞上清液，使用胰酶消化细胞并在冷PBS中洗涤两次。在冷结合缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、140mM NaCl、2.5mM CaCl2、0.1％BSA)中重悬细胞，使其浓度为1.10⁶个细胞/mL。然后，将100μL细胞(1x 105至1x106) 加入聚丙烯FACS管中，并向细胞中加入10μL标记的Annexin V。将细胞避光在冰上孵育15分钟。然后，不进行洗涤，向各管中加入380μL冷1X结合缓冲液，采用流式细胞仪立即对Annexin V进行分析，以评价凋亡。

增殖检测

使用所示量的来自T47D-WT的SEV处理高侵袭性MDA-MB-231(A) 24h和SUM-159-PT(B)24、48和72h，以评价细胞增殖。采用BrdU掺入测定根据生产厂商的建议(Roche：#11444611001)评价MDA-MB-231的增殖。

shRNA

shRNA均是Dharmacon在pGIPZ慢病毒载体中克隆得到的。

pGIPZ sh(hNFAT3)-3 5‘-CAATGAACACCACCTTGGA-3’(克隆ID： V3LHS_383428，SEQID NO:18)

pGIPZ sh(hNFAT3)4 5’-AGTCTCAGGGAACATCCGC-3’(克隆ID： V3LHS_383431，SEQID NO:19)

pGIPZ sh(hTGFβ1)1 5’-ATGCTGTGTGTACTCTGCT-3’(克隆ID：V3LHS_356824，SEQID NO:20)

pGIPZ sh(hTGFβ1)2 5’-TGATGTCCACTTGCAGTGT-3’(克隆ID： V3LHS_356823，SEQID NO:21)

在HEK293T细胞中生产shRNA慢病毒颗粒

·第1天：

使用10％SVF/HIGH DMEM将细胞铺板

	细胞数	培养基体积
			100cm2	3,5.10<sup>6</sup>	14ml

·第2天：

1-使用磷酸钙转染质粒

2-向经稀释的上述DNA中加入所示体积的CaCl2

	CaCl2
		100cm2	15ul

3-以足以充分混合试剂但不使其溢出的速度涡旋离心管。在涡旋的同时，滴加所示体积的2x HBSS：

	2x HBSS
		100cm2	1050ul

4-在室温下孵育3分钟。在该孵育期间，应出现浅白垩色沉淀(沉淀可能并不总是很明显的)。

5-将总体积(300μL或2.1mL)的转染混合物滴加入细胞中。

(注意：由于移液损失精确体积可能略有减少，但是这不会对转染效率产生负面影响。)

6-在37℃、5％CO2条件下培养细胞10-16小时

·第3天：

1-制备血清减少的培养基：

a.高糖DMEM

b.5％胎牛血清

c.2mM L-谷氨酰胺

d.1x青霉素/链霉素

2-从细胞中除去含有磷酸钙的培养基并换用14ml血清减少的培养基。

3-在37℃、5％CO2条件下再培养细胞48小时。

·第5天：收集病毒颗粒和浓缩

1-在更换培养基48小时后，通过将培养基移入15mL无菌有盖锥形管中收集含病毒颗粒的上清液。

2-通过将非贴壁细胞球团和碎片在4℃下以1600×g离心10分钟沉淀细胞碎片。

3-在低速离心步骤之后，通过将上清液通过无菌0.22-0.45μM低蛋白结合滤器进行过滤步骤，以除去任何残留的细胞碎片。将经过滤的病毒培养基直接置于超速离心管中。

4-在摇摆式超速离心机转子中进行超速离心浓缩。将经处理的上清液转移至无菌超速离心管中。使用无血清DMEM培养基几乎充满离心管的体积，以避免在超速离心过程中离心管发生制动。对于SW28转子，在4℃下以 23,000rpm离心2小时。

5-向离心管底部的球团上加入所需重悬体积的DMEM(无血清)。

6-可见的球团(如果可见)主要由转染细胞培养基的血清蛋白组成。需要将病毒颗粒从该蛋白球团中移出。在向球团加入DMEM后，在4℃下孵育10分钟。然后，轻柔吹打约30次，避免产生气泡。

7-将重悬的球团转移至无菌微量离心管中并全速离心3-4分钟。该离心将沉淀血清蛋白，使其粘附在管底部。离心后，将上清液转移至新的微量离心管中，并使其悬浮在100ul PBS中(每次感染将使用20ul。始终将慢病毒颗粒保存在80℃下)。

使用慢病毒颗粒感染细胞并进行选择

·第1天：

使用含10％SVF+AB的相应培养基，将细胞接种在24孔板中

细胞类型	细胞数	培养基体积
			MDA-MB-231	2,5.10<sup>5</sup>	1ml DMEM低糖
SUM-159PT	1,5.10<sup>5</sup>	1ml DMEM低糖
			MDA-MB-231 D3H2LN	2,5.10<sup>5</sup>	1ml MEM+丙酮酸钠+ZEOCINE 75ug/ml
T47D	3.10<sup>5</sup>	1ml RPMI
			MCF7	3.10<sup>5</sup>	1ml RPMI

·第2天：

1.将培养基更换为250ul加入4ug/ml Polybrene的相应培养基

2.通过向细胞上直接加入20ul病毒感染细胞

3.在培养箱中放置4h

4.4h后，加入含Polybrene的相应培养基，1ml/孔

·第6天：

1.使用胰酶消化细胞，以将其转移至25cm培养瓶中

·第9天：

1.将细胞带回实验室并将其转移至：

细胞类型	培养瓶
		MDA-MB-231	150cm
SUM-159PT	150cm
		MDA-MB-231 D3H2LN	150cm
T47D	75cm
		MCF7	75cm

当细胞在培养瓶中融合时，可以进行FACS分选

·细胞分选：

应具有10.10⁶个细胞/ml的分选浓度

1.使用胰酶消化细胞并对其进行计数

2.使用PBS洗涤细胞1次

3.将细胞重悬于所需体积的含2X AB的PBS中

4.使细胞通过细胞过滤器以消除聚集体

5.将细胞转移至聚丙烯FACS管中

6.准备管以接收含有分选细胞的100％SVF加2X AB

7.准备6孔板以使得分选细胞在不含SVF但含有2X AB的相应培养基中生长(当加入分选细胞时，最终将含20％SVF)

8.然后使细胞生长，直至其足以进行不同的验证检测。

9.不要忘记冻存克隆。

siRNA

所有siRNA均来自Dharmacon的Target plus smartpool

对于人TGFβ1，siRNA为：

siRNA1 5’-AUUGAGGGCUUUCGCUUA-3’(SEQ ID NO:22)，

siRNA2 5’-CCGAGAAGCGGUACCUGAA-3’(SEQ ID NO:23)，

siRNA3 5’-GCAGAGUACACAGCAUA-3’(SEQ ID NO:24)，

siRNA4 5’-GGACUAUCCACCUGCAAGA-3’(SEQ ID NO:25)，

siRNA对照为经验证的来自Dharmacon的非靶向smartpool。生产厂商未提供序列(参见Dharmacon：D-001810-02-20)

为瞬时沉默人TGFβ1，我们使用了30nM上文所述的特定siRNA，并根据生产厂商的说明书使用DharmaFECT转染细胞48hr。经ELISA验证，内源性TGFβ1被有效下调。

针对人TGFβ1的ELISA

在细胞上清液中

根据生产厂商的说明，使用来自R&D systems的试剂盒(#DY240)在 100μl经活化的细胞上清液中进行针对TGFβ1的ELISA。

在小鼠血清中

从小鼠收集血液并在BD Microtainer SSR管(#365968)中实现血清分离。根据生产厂商的说明，使用来自R&D systems的试剂盒(#DY240)在1μl经活化的血清中进行针对TGFβ1的ELISA。

质粒构建

通过PCR在PGL3基本载体(Promega)中使用从MDA-MB-231分离的基因组DNA作为模板克隆人TGFβ1启动子(PGL3-hTGFβ1-1670)。通过测序对所有构建体进行验证。已对pCS2-(n)-βgal进行了描述(Jauliac,S等， (2002).Nature Cell Biology,4(7),540–544)。

根据生产厂商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，采用适宜质粒对细胞进行瞬时转染。

不同构建体的序列：

·PGL3基本(Promega，空载体)：SEQ ID NO：26；

·PGL3-hTGFβ1-1670启动子(在hTGFβ1启动子控制下表达荧光素酶)： SEQ IDNO：27；

荧光素酶测定

使用Lipofectamine 2000，采用PGL3基本质粒或PGL3-hTGFβ1-1670荧光素酶启动子构建体和pCS2-(n)-β-半乳糖苷酶对细胞进行共转染。次日，在 6孔板中使用PBS或1.10⁹个颗粒/孔处理细胞24h。24h后，使用报告蛋白裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，并使用荧光素酶测定系统(Promega)和 Galacton-plus(Tropix)在光度计上测量荧光素酶和β-gal的活性。相对于相应β-gal的活性，对荧光素酶活性进行归一化处理。

小鼠实验：

体内接种移植瘤和随访

·对于在Hsd:AthymicNude-Foxn1nu雌性小鼠中接种MB-231 D3H2 LN-Luc：

6周龄Hsd:AthymicNude-Foxn1nu雌性小鼠来自Envigo公司。进行任何操作之前，将小鼠在IUH的动物房中饲养1周。当小鼠达到7周龄时，将在 100μl PBS中稀释的1至0.5.10⁶个MDA-MB-231 D3H2 LN-Luc细胞注射至第 2右下脂肪垫中。3天后，通过注射在PBS中稀释的XenoLight D-荧光素的钾盐并在Xenogen系统上采集30s发光，能够看见成功接种的移植瘤所发出的光。针对每种条件，设置每组8只小鼠，其具有相同的发光情况。实验持续2 个月。第1个月，每周一和周四使用卡尺测量肿瘤尺寸。如在不同实验中所述的，在这2个月期间，每周四瘤内或静脉内注射给予小鼠50.10⁸SEV T47D-WT、T47D-shCtrl、T47D-shNFAT3-3或T47D-shNFAT3-4。每周五通过眶内取血采集血液。从第2个月起，开始出现转移，因此在每周一和周四测量完肿瘤尺寸之后，评价转移形成情况。注射给予小鼠在PBS中稀释的 XenoLight D-荧光素的钾盐并在Xenogen系统上进行生物发光成像(使用黑布遮盖原发性肿瘤)，以便对由转移性MDA-MB-231 D3H2 LN-Luc细胞产生的平均光子通量进行定量。转移量由转移性MDA-MB-231 D3H2 LN-Luc细胞产生的平均光子通量表示。在2个月结束时，处死小鼠并将原发性肿瘤以及肺、腋窝淋巴结和肝在-80℃下保存以便进一步进行免疫荧光标记。

结果

由低侵袭性乳腺癌T47D和MCF7细胞产生的SEV的鉴定

由MDA-MB-231和T47D细胞产生的SEV尺寸分布的代表性实例如图 1A(MDA-MB-231)和图1B(T47D)所示，结果表明由MDA-MB-231和 T47D细胞产生的SEV具有100至200nm之间的相似平均尺寸。

还通过Western印迹对由MDA-MB-231和T47D细胞产生的SEV进行表征并与全细胞提取物进行比较，检测使用了针对钙联蛋白；CD63和CD81的抗体(图1C)。结果表明纯化样品仅含有SEV，因为其表达CD63标记物，但是不表达钙联蛋白，提示在所述样品中不存在细胞。

由低侵袭性乳腺癌T47D-WT和MCF7-WT细胞产生的SEV特异性抑制高侵袭性MDA- MB-231和SUM-159-PT乳腺癌细胞以及WM.266.4黑色素瘤细胞的侵袭

制备来自不同细胞系的SEV，其目的是检测其在经典transwell侵袭测定中特异性调节高侵袭性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，SUM159PT)或黑色素瘤细胞(WM.266.4)侵袭的能力。选择五种类型的细胞生产SEV：2种低侵袭性乳腺癌细胞系(T47D-WT，MCF7)，1种高侵袭性乳腺癌细胞系 (MDA-MB-231)以及2种来自青年人和老年人组织活检样品的人成纤维细胞(FHN21-WT，20岁；FHN32-WT，74岁)。

结果如图2中所示，结果表明：

·由来自青年人和老年人组织活检样品的人成纤维细胞(FHN21-WT和 FHN32-WT)以及由高侵袭性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)产生的 SEV不能显著改变高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的侵袭指数 (见图2A)；

·由2种低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT和MCF7-WT细胞产生的SEV 使高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图2A和2C)和SUM-159-PT (见图2D)的侵袭指数显著降低约50％。两种不同低侵袭性乳腺癌细胞系具有相同作用的事实表明，由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV 的抑制作用不是SEV产生细胞特异性的，而是一种一般作用；

·由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT和MCF7-WT产生的SEV还使高侵袭性黑色素瘤细胞系WM.266.4的侵袭指数显著降低约60％(见图2B)。两种低侵袭性乳腺癌细胞系对高侵袭性黑色素瘤细胞系具有相同作用的事实表明，由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV的抑制作用不是特异性针对高侵袭性乳腺癌细胞系的，而是一种对于高侵袭性细胞系的一般作用，无论其原始细胞类型如何。

来自低侵袭性乳腺癌细胞(T47D-WT)的SEV不改变高侵袭乳腺癌细胞(MDA-MB-231 和SUM-159-PT)的增殖情况

进一步评估了来自低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT的SEV改变高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SUM159PT增殖的能力，以及其诱导高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231凋亡的能力。

结果如图3中所示，结果表明来自低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT的 SEV不改变高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图3A)和SUM159PT (见图3B)的增殖情况，以及不诱导高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231 凋亡。

由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D产生的SEV对高侵袭性细胞系(MDA-MB-231和SUM- 159-PT)的抑制作用需要在低侵袭性SEV产生细胞系T47D-WT中表达NFAT3

发明人此前已发现与高侵袭性乳腺癌细胞系相比低侵袭性乳腺癌细胞系特异性表达较高量的NFAT3，这是其具有较低侵袭能力所需要的(Fougère,M. 等，(2010).Oncogene,29(15),2292–2301)。

因此，作出假设，在SEV产生细胞(T47D-WT)中的内源性NFAT3可能是这些SEV钝化高侵袭性细胞系的细胞侵袭所需要的。为了检测这种可能性，他们制备了通过使用2个shRNA将内源性NFAT3的表达减少50％ (ShNFAT3-3，ShNFAT3-4)或通过使用shRNA对照(shCtrl)未改变内源性 NFAT3表达的T47D细胞(见图4A)。由表达shRNA的T47D细胞系生产SEV 并将其用于检测高侵袭性细胞系MDA-MB-231和SUM-159-PT的侵袭能力。

结果如图4B和图4C中所示，结果表明在SEV-T47D产生细胞系中表达内源性NFAT3是阻止乳腺癌细胞侵袭的绝对必要条件，因为与无shRNA (T47D-WT)或表达对照shRNA(shCtrl)的T47D细胞系产生的SEV相反的是，由表达使内源性NFAT3表达减少50％的shRNA(ShNFAT3-3， ShNFAT3-4)的T47D细胞系产生的SEV不能降低高侵袭性细胞系 MDA-MB-231和SUM-159-PT的侵袭指数。

这些数据首次表明，在SEV生产细胞系中表达NFAT3是将侵袭抑制能力转移至高侵袭性细胞系的关键。

在MDA-MB-231细胞中从头诱导TGFβ1是SEV调节乳腺癌细胞侵袭所需要的

为了开始阐明由T47D-WT细胞系产生的SEV是通过何种机制阻遏了高侵袭性乳腺癌细胞系的侵袭，在受体细胞(MDA-MB-231)中评价了SEV对不同因子的调节情况。

图5A中所示的数据表明由T47D-WT细胞产生的SEV诱导MDA-MB-231 中TGFβ1分泌增加。而且，这种TGFβ1分泌增加需要转录活化，因为使用转录抑制剂(放线菌素)预处理细胞完全阻止了这种分泌增加。这些结果是至关重要的，因为其表明TGFβ1分泌增加是在接受细胞(MDA-MB-231)中发生的活性机制，并且与潜在的SEV TGFβ1蛋白的贡献无关。

然后检测了这种TGFβ1分泌增加可能是SEV抑制细胞侵袭所需的可能性。为了这一目的，在瞬时转染测定中，通过使用针对TGFβ1的siRNA (siTGFB1)或对照siRNA(siCtrl)在接受细胞(MDA-MB-231)中单独下调了内源性TGFβ1。为了挽救内源性TGFβ1的丧失，使用外源性TGFβ1处理接受细胞。图5B中所示的结果表明通过SEV增加TGFβ1分泌对于抑制细胞侵袭是绝对必要的，因为与接受shCtrl-细胞(siCtrl，+SEV)相比，当TGFβ1 下调时，SEV不再能够阻止细胞侵袭(siTGFB1，+SEV)。而且，在SEV中再加入外源性TGFβ1足以恢复SEV抑制细胞侵袭的能力(siTGFB1，+SEV， +TGFβ1)。此外，加入外源性TGFβ1而没有先下调内源性TGFβ1(siCtrl， +/-SEV，+TGFb1)不足以抑制侵袭，这表明单独使用外源性TGFb1处理不足以抑制细胞侵袭。这些结果表明来自低侵袭性细胞系的SEV在高侵袭性接受细胞系中诱导TGFβ1分泌的转录增加，这对于SEV抑制侵袭的能力是绝对必要的。

由T47D-WT细胞产生的SEV能够上调hTGFB1启动子的活性

hTGFb1启动子的示意图如图6A中所示。利用其在以下网址的软件上开发的NFAT结合位点找到了6个潜在的NFAT结合位点： http://www.fast-db.com/perl/nfat.pl。显示了与+1起始位点相关的位置。

因此，检测了由T47D-WT细胞产生的SEV是否能够上调hTGFB1启动子的活性。结果如图6B中所示，结果表明由T47D-WT细胞产生的SEV的确上调了hTGFB1启动子的活性。

静脉内或瘤内注射由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT产生的SEV抑制肿瘤生长和转移并且其与TGFβ1的诱导相关

然后检测了由低侵袭性乳腺癌细胞产生的SEV在体内模型中是否能够产生与在体外相同的抑制作用。为了这一目的，将表达荧光素酶基因的 MDA-MB-231细胞(D3H2LN)注射进入6周龄雌性小鼠Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫。从注射移植瘤细胞一周后开始，每周通过尾静脉或在瘤内注射由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT产生的SEV或作为对照的PBS。

通过使用卡尺测量10周监测肿瘤生长情况。

静脉注射的结果如图7中所示，瘤内注射的结果如图8中所示，结果首次表明尽管在体外对细胞增殖没有抑制作用(图3)，但是与注射PBS的小鼠相比(静脉内：图7A，小鼠N°629；瘤内：图8A，小鼠N°617)，来自T47D-WT 细胞的SEV在体内能够显著阻止肿瘤生长(静脉内：图7A，小鼠N°610；瘤内：图8A，小鼠N°614)。

有趣的是，在这两种注射类型中(静脉内或瘤内)SEV的抑制作用与所治疗小鼠血液中TGFβ1的诱导密切相关。事实上，与注射PBS的小鼠相比(静脉内：图7B，小鼠N°629；瘤内：图8B，小鼠N°617)，每周注射SEV但肿瘤生长速率未改变的小鼠未显示出任何血液中TGFβ1的增加(静脉内：图7B，小鼠N°625；瘤内：图8B，小鼠N°602)。

在同一组小鼠中，从第42天开始在Xenogen系统上通过生物发光成像利用由转移性MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量评价转移形成情况(将原发性肿瘤用黑纸遮盖)。静脉内注射的结果如图7中所示，瘤内注射的结果如图8中所示，结果首次表明无论是尾静脉内还是瘤内注射，与注射PBS的小鼠相比(静脉内：图7C，小鼠N°629；瘤内：图8C，小鼠N°617)，使用来自T47D-WT细胞的SEV注射的小鼠具有显著降低的暴露和转移性生长(静脉内：图7C，小鼠N°610；瘤内：图8C，小鼠N°614)。

而且，与肿瘤生长的结果一样，SEV对转移的抑制作用与在血液中TGFβ1 的诱导密切相关。事实上，与注射PBS的小鼠相比(静脉内：图7D，小鼠N°629；瘤内：图8D，小鼠N°617)，每周注射SEV但转移未改变的小鼠未显示出任何血液中TGFβ1的增加(静脉内：图7D，小鼠N°625；瘤内：图8D，小鼠 N°602)。

这些结果是至关重要的，并且首次证明了来自侵袭性乳腺癌细胞的SEV 在体内能够阻止肿瘤生长和转移并且其与血液循环中TGFβ1的增加密切相关。TGFβ1的这种增加可能是在癌症患者中评价SEV注射有效性的良好工具。

SEV瘤内注射对肿瘤生长的抑制作用需要在T47D-SEV生产细胞中表达NFAT3并且其与TGFβ1的诱导相关

然后检测了由内源性NFAT3被shRNA下调的低侵袭性乳腺癌细胞产生的SEV是否能够在体内模型中诱导相同的抑制作用。

为了这一目的，将表达荧光素酶基因的MDA-MB-231细胞(D3H2LN) 注射进入6周龄雌性小鼠Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫。从注射移植瘤细胞一周后开始，每周在瘤内注射由通过转染shRNA(ShNFAT3-3， ShNFAT3-4)使内源性NFAT3的表达降低50％或通过转染shRNA对照(shCtrl) 的T47D细胞产生的SEV或作为对照的PBS。通过使用卡尺测量10周监测肿瘤生长情况。图9A中所示的结果首次表明，尽管在体外对细胞增殖没有抑制作用，但是与注射PBS的小鼠相比，来自T47D-shCtrl细胞的SEV在体内能够显著阻止肿瘤生长(减少约50％)。而且，当在SEV产生细胞中下调内源性NFAT3时(T47D-shNFAT3-3，T47D-shNFAT3-4)，然后各种SEV不再能够抑制肿瘤生长并且生长速率与给予PBS的对照小鼠相同(见图9A)。

这些结果是至关重要的，并且首次证明了来自低侵袭性乳腺癌细胞的 SEV需要在SEV产生细胞中表达内源性NFAT3以便在体内阻止肿瘤生长。

在同一组小鼠中，在Xenogen系统上通过生物发光成像利用由转移性 MDA-MB-231细胞产生的平均光子通量评价转移形成情况(将原发性肿瘤用黑纸遮盖)。如图9B中所示的结果表明，与使用PBS注射的小鼠相比，使用来自T47D-shCtrl的SEV注射的小鼠具有显著降低的暴露和转移性生长。而且，当在SEV产生细胞中下调内源性NFAT3时(T47D-shNFAT3-3， T47D-shNFAT3-4)，然后各种SEV不再能够阻止转移形成和暴露并且生长速率与给予PBS的对照小鼠相同(见图9B)。

这些结果扩展了我们获得的体外数据并且首次证明了来自低侵袭性乳腺癌的SEV能够在体内阻止转移形成并且其需要在SEV生产细胞中表达内源性 NFAT3。

而且，再次发现了来自T47D-shCtrl细胞的SEV的抗癌作用与TGFβ1平均血清浓度的增加相关(见图9C和9D)。

静脉内或瘤内注射由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D-WT产生的SEV抑制已建立肿瘤的肿瘤生长和转移

为了模拟临床状况，然后检测了由低侵袭性乳腺癌细胞产生的SEV是否能够在肿瘤已建立的体内模型中诱导同样的抑制作用。为了这一目的，将表达荧光素酶基因的MDA-MB-231细胞(D3H2LN)注射进入6周龄雌性小鼠 Athymic Nude-Foxn1nu小鼠的左侧脂肪垫。在D3H2LN注射27天后，首次注射由T47D细胞产生的SEV。SEV注射后通过使用卡尺测量5周监测肿瘤生长情况。如图10A和B中所述的结果首次表明了，无论给药途径如何(静脉内或瘤内)，以及尽管在体外对细胞增殖没有抑制作用，但是与注射PBS 的小鼠相比，来自T47D细胞的SEV能够显著阻止肿瘤建立27天后肿瘤在体内的生长(减少约50％)。

结论

上述结果表明：

·与由人成纤维细胞或由高侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV不同的是，由两种低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV能够降低两种高侵袭性乳腺癌细胞系和一种高侵袭性黑色素瘤细胞系的侵袭指数。这表明可以将由低侵袭性癌细胞产生的SEV用于减少癌症进展和转移。

·尽管在体外对侵袭性乳腺癌细胞系的增殖不具有作用，但是进一步发现了由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV在体内移植瘤模型中阻止肿瘤生长和转移，这进一步证明了可以将由低侵袭性癌细胞生产的SEV用于减少癌症进展和转移。

·由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D产生的SEV对高侵袭性细胞系 (MDA-MB-231和SUM-159-PT)侵袭能力的抑制作用需要在低侵袭性 SEV生产细胞中表达NFAT3。

·在低侵袭性SEV生产细胞中表达NFAT3导致在高侵袭性乳腺癌细胞系中从头诱导TGFβ1，这是SEV在体外调节乳腺癌细胞侵袭所需要的。在体内，发现对由低侵袭性乳腺癌细胞系产生的SEV的应答与TGFβ1 血清浓度相关。因此，可以将给予由低侵袭性癌细胞产生的SEV后患者TGFβ1浓度增加作为评价治疗的治疗有效性的生物标记物。

实施例2：由经修饰的自体或非自体成纤维细胞产生的SEV抑制侵袭

由于已发现低侵袭性乳腺癌细胞中NFAT3的表达对于来自这些细胞的 SEV抑制癌症进展和转移是至关重要的，因此进一步检测了经诱导以表达 NFAT3的健康成纤维细胞抑制癌症进展和转移的能力。

在此基础上，所提出的治疗发展的示意图如图10中所示。

材料和方法

除非另有说明，否则对于相应检测，使用与实施例1中相同的方案。

从Balbc小鼠的皮肤分离成纤维细胞

将已剃毛的Balbc小鼠的皮肤在37℃ 5％CO2下在Dispase II(Sigma； #000000004942078001)中放置过夜。24h后，将真皮与表皮分离，将真皮切成极小的块并将其粘在塑料培养板上。然后加入10ml含10％胎牛血清的高糖(4,5g/LD-葡萄糖)经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。成纤维细胞将沿培养物出现并且将扩增以使得能够使用下文所述的不同慢病毒载体将其感染。

质粒构建

通过PCR在来自Clontech的pLVX-tdTomato-C1质粒中使用与td Tomato 标签融合的已描述的质粒(Fougère,M.等，(2010).Oncogene,29(15), 2292–2301)作为模板克隆人NFAT3WT、NFAT3-85C、ΔNFAT3WT、 ΔNFAT3-85C。通过测序对所有构建体进行验证。

通过PCR在来自Clontech的pLVX-tdTomato-C1质粒中使用与td Tomato 标签融合的由Curie Institute的Dr Clothilde Thery惠赠的质粒作为模板克隆人 CD63。通过测序对所有构建体进行验证。

不同构建体的序列：

·pLVX-tdTomato-C1(Clonetech，空载体)：SEQ ID NO：28，编码序列 SEQ ID NO：34所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3WT(NFATC4亚型2的表达载体，如上表1中所定义的)：SEQ ID NO:29，编码序列SEQ ID NO：35所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3-85C(NFATC4亚型2的表达载体，如上表1中所定义的，截去85个C末端氨基酸)：SEQ ID NO：30，编码序列SEQ ID NO：36所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1hΔNFAT3WT(NFATC4亚型2的表达载体，如上表 1中所定义的，截去521个N末端氨基酸)：SEQ ID NO：31，编码序列SEQ ID NO：37所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1hΔNFAT3-85C(NFATC4亚型2的表达载体，如上表1中所定义的，截去521个N末端氨基酸和85个C末端氨基酸)： SEQ ID NO：32；

·pLVX-tdTomato-C1-hCD63(hCD63的表达载体)：SEQ ID NO：33。

在HEK293T细胞中生产慢病毒颗粒

除了第2天的第2步以外，使用与实施例1中所述相同的方案：

实施例3：

材料和方法

慢病毒质粒构建

使用下述实施例2的表达载体：

·pLVX-tdTomato-C1(Clonetech，空载体，也称为“to-Ctl”)：SEQ ID NO： 28，编码序列SEQ ID NO：34所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3WT(NFATC4亚型2的表达载体，如上表1中所定义的，也称为“to-NFAT3WT”)：SEQ ID NO：29，编码序列SEQ ID NO：35所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3-85C(NFATC4亚型2的表达载体，如上表1中所定义的，截去85个C末端氨基酸，也称为“to-NFAT3-85C”)： SEQ ID NO：30，编码序列SEQ IDNO：36所示的蛋白tdTomato-C1；

·pLVX-tdTomato-C1hΔNFAT3WT(NFATC4亚型2的表达载体，如上表 1中所定义的，截去521个N末端氨基酸，也称为“to-ΔNFAT3”)：SEQ ID NO：31，编码序列SEQ ID NO：37所示的蛋白tdTomato-C1；

在HEK293T细胞中生产慢病毒颗粒

第1天：

使用10％SVF/HIGH DMEM将细胞铺板

	细胞数	培养基体积
			100cm2	3,5.10<sup>6</sup>	14ml

第2天

1-使用磷酸钙转染质粒

对于慢病毒ORF表达载体

2-向经稀释的上述DNA中加入所示体积的CaCl2

	CaCl2
		100cm2	15ul

	2x HBSS
		100cm2	1050ul

5-将总体积(300μL或2.1mL)的转染混合物滴加入细胞中。

6-在37℃、5％CO2条件下培养细胞10-16小时

第3天：

1-制备血清减少的培养基：

a.高糖DMEM

b.5％胎牛血清

c.2mM L-谷氨酰胺

d.1x青霉素/链霉素

3-在37℃、5％CO2条件下再培养细胞48小时。

第5天：收集病毒颗粒和浓缩

5-向离心管底部的球团上加入所需重悬体积的DMEM(无血清)。

使用慢病毒颗粒感染细胞并进行选择

第1天：

使用含10％SVF+AB的相应培养基，将细胞接种在24孔板中

细胞类型	细胞数	培养基体积
			HEK 293T	1,5.10<sup>5</sup>	1ml DMEM高糖

第2天：

1-将培养基更换为250ul加入4ug/ml Polybrene的相应培养基

2-通过向细胞上直接加入20ul病毒感染细胞

3-在培养箱中放置4h

4-4h后，加入含Polybrene的相应培养基，1ml/孔

第6天：

1-使用胰酶消化细胞，以将其转移至25cm培养瓶中

第9天：

将细胞带回实验室并将其转移至：

细胞类型	培养瓶
		HEK 293T	150cm

当细胞在培养瓶中融合时，可以进行FACS分选

细胞分选：

应具有10.10⁶个细胞/ml的分选浓度

1.使用胰酶消化细胞并对其进行计数

2.使用PBS洗涤细胞1次

3.将细胞重悬于所需体积的含2X AB的PBS中

4.使细胞通过细胞过滤器以消除聚集体

5.将细胞转移至聚丙烯FACS管中

6.准备管以接收含有分选细胞的100％SVF加2X AB

8.然后使细胞生长，直至其足以进行不同的验证检测。

9.不要忘记冻存克隆。

抗体和试剂

使用了下述抗体：抗-CD63(#克隆H5C6，BD Biosciences)、抗-NFAT3 (Sigma；#F1804，Thermo Scientific；#PA1-021，Santa-Cruz Biotechnology； sc-13036)、抗-CD9(#克隆CBL162，Millipore)、抗肌动蛋白(Thermo Scientific； #MA5-15739)、抗-tdTomato(SICGENANTIBODIES；#AB8181-200)。

根据生产厂商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)或对于 siRNA使用DharmaFECT(Dharmacon)，采用适宜质粒对细胞进行瞬时转染。

结果

与T47D乳腺癌细胞系一样，HEK细胞系表达内源性NFAT3

发明人想要评价使用除MCF7和T47D以外的另一种细胞系的可能性，以检测在非乳腺癌细胞系中通过过表达NFAT3WT或NFAT3突变体转移和增强SEV抑制能力的可能性。为此，发明人选择了HEK细胞系，这是一种易于生长和可编辑的细胞系。发明人首先通过使用非靶向siRNA对照(siCtl) 或靶向内源性NFAT3的siRNA(siNFAT3)对其进行瞬时转染评价了内源性 NFAT3的潜在表达。发明人使用表达内源性NFAT3的T47D乳腺癌细胞系作为对照。

结果如图12中所示，结果表明与T47D乳腺癌细胞系一样，通过siNFAT3 处理使得HEK细胞系表达的内源性NFAT3下调。

使用NFAT3突变体以产生HEK克隆

在图13A中描述了与tdTomato标签融合的用于产生HEK克隆的不同 NFAT3突变体。使用了野生型NFAT3(NFAT3WT)，或缺乏前342个N末端氨基酸的组成型活性NFAT3突变体(ΔNFAT3)，或缺失其抑制侵袭所必需区域的无活性突变体(NFAT3-85C)。

在T47D乳腺癌细胞系中NFAT3过表达的鉴定

使用对照载体或者使用表达NFAT3WT、ΔNFAT3T47D或缺失最后85个 C末端氨基酸的NFAT3的载体对T47D乳腺癌细胞进行瞬时转染，并在经典 transwell侵袭测定中评估其侵袭能力。

结果如图13B中所示，结果表明：

·与使用空载体转染的细胞(载体)相比，NFAT3WT过表达(NFAT3WT) 使T47D乳腺癌细胞的侵袭指数减少约50％。

·与使用空载体转染的细胞(载体)相比，组成型活性NFAT3突变体 ΔNFAT3过表达(ΔNFAT3)比NFAT3WT降低的程度更高，其使T47D 乳腺癌细胞的侵袭指数减少约70％。

·与使用载体转染的细胞(载体)和使用NFAT3WT或ΔNFAT3转染的细胞相比，缺失其抑制侵袭所必需区域的无活性突变体NFAT3-85C过表达(NFAT3-85C)不再能够降低侵袭指数。

由过表达to-Ctl、to-NFAT3WT、to-ΔNFAT3和to-NFAT3-85C的HEK细胞产生的SEV 的鉴定

由过表达to-Ctl、to-NFAT3WT、to-ΔNFAT3和to-NFAT3-85C的HEK细胞产生的SEV尺寸分布的代表性实例参见图14A(HEK to-Ctl)、图14B(HEK to-NFAT3WT)、图14C(HEK to-ΔNFAT3)和图14D(HEK to-NFAT3-85c)，结果表明由HEK克隆产生的SEV具有100至200nm之间相似的平均尺寸。

表达NFAT3 WT和NFAT3突变体的HEK细胞系的产生

发明人通过慢病毒感染和嘌呤霉素选择制备了表达to-Ctl、to-NFAT3 WT、to-ΔNFAT3或to-NFAT3-85C的稳定HEK克隆。

结果如图13C中所示，并且结果表明HEK克隆稳定表达to-Ctl、to-NFAT3 WT、to-ΔNFAT3或to-NFAT3-85C。

与由内源性表达NFAT3的细胞(如T47D细胞)和使用对照病毒稳定感染的HEK细胞 (HEK to-Ctl)产生的SEV相比由NFAT3过表达HEK细胞产生的SEV能够更大程度的抑制高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞、胰腺癌BXPC3细胞和胶质母细胞瘤癌细胞的侵袭

由使用对照病毒(HEK to-Ctl)或者使用编码NFAT3WT(HEK to-NFAT3) 或NFAT3的组成型活性突变体(HEK to-ΔNFAT3)或缺失其最后85个C末端氨基酸的NFAT3的无活性突变体(HEK to-NFAT3-85C)的病毒稳定感染 HEK细胞生产SEV，以旨在在经典transwell侵袭测定中检测其调节高侵袭性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，SUM-159-PT)、胰腺癌细胞(BXPC3)和胶质母细胞瘤癌细胞(U87MG)侵袭的特异性能力。将使用PBS或由T47D乳腺癌细胞系产生的SEV处理的细胞作为对照。

结果如图15中所示，结果表明：

·由低侵袭性乳腺癌细胞系T47D产生的SEV将所有检测细胞系的侵袭指数显著减少约40％-60％，所检测的细胞系：高侵袭性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231(见图15A)和SUM-159-PT(见图15B)、胰腺癌细胞系 BXPC3(见图15C)和胶质母细胞瘤细胞系U87MG(见图15D)。

·由使用对照病毒感染的HEK细胞系(HEK to-Ctl)产生的SEV能够将高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图15A)和胶质母细胞瘤细胞系U87MG(见图15D)的侵袭指数显著减少约40％-45％，但其不能减少胰腺癌细胞系BXPC3(见图15C)和SUM-159-PT(见图15B)的侵袭指数。

这些结果与NFAT3是HEK细胞系内源性表达的事实一致(见图12，结果表明与使用siRNA对照转染的HEK细胞(siCtl)相比，使用靶向内源性 NFAT3的siRNA(siNFAT3)靶向HEK细胞导致NFAT3的表达特异性降低)。

·由使用编码NFAT3WT的病毒感染的HEK细胞系(HEK to-NFAT3)产生的SEV将所有检测细胞系的侵袭指数显著减少约40％-60％，所检测的细胞系：高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图15A)和 SUM-159-PT(见图15B)、胰腺癌细胞系BXPC3(见图15C)和胶质母细胞瘤细胞系U87MG(见图15D)。

这种降低的趋势高于当使用在T47D细胞系(针对MDA-MB-231见图15A 和针对U87MG见图15D)中或在HEK to-Ctl细胞系(针对SUM-159PT见图 15B和针对BXPC3见图15C)中生产的SEV处理癌细胞时。

·由使用NFAT3的组成型活性突变体感染HEK细胞(HEK to-NFAT3) 产生的SEV将所有检测细胞系的侵袭指数显著减少约60-80％，所检测的细胞系：高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图15A)和 SUM-159-PT(见图15B)、胰腺癌细胞系BXPC3(见图15C)和胶质母细胞瘤细胞系U87MG(见图15D)。

对于图15中的所有癌细胞系，这种降低进一步高于当使用在HEK to-NFAT3细胞系中生产的SEV处理癌细胞时。

·由使用缺失其最后85个C末端氨基酸的NFAT3的无活性突变体感染 HEK细胞系(HEK to-NFAT3-85C)产生的SEV不再能够减少高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见图15A)和SUM-159-PT(见图15B)、胰腺癌细胞系BXPC3(见图15C)和胶质母细胞瘤细胞系U87MG(见图15D)的侵袭指数。

这些结果再次表明，在SEV生产细胞中表达NFAT3(内源性和/或外源性)对于SEV抑制乳腺癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤细胞的侵袭是绝对必要的。可以通过WT NFAT3的异位表达(HEK to-NFAT3)增强这种抑制的强度。而且，可以通过NFAT3组成型活性突变体的异位表达(HEK to-ΔNFAT3)进一步增强这种对侵袭的抑制(对侵袭指数的抑制可达80％)。通过由表达使用缺失其最后85个C末端氨基酸的NFAT3无活性突变体的HEK细胞系(HEKto-NFAT3-85C)产生的SEV对侵袭不具有抑制作用证实了在所检测的所有癌细胞系中NFAT3对侵袭指数的抑制作用是特异性的。

这些结果进一步表明，NFAT3在另一种细胞系(HEK)中的异位表达足以向由这种其他细胞系生产的SEV中转移NFAT3的抑制作用。

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序列表

<110> 国家健康和医学研究院(INSERM)

巴黎大学迪德罗特第七分校

公共救济事业局-巴黎医院

<120> 包含表达NFATC4细胞分泌的胞外囊泡的组合物用于治疗癌症的用途

<130> B372224D36019

<150> EP16305362.2

<151> 2016-03-29

<160> 37

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5747

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gtaaacgtct gacctggggc cgtcgcttaa ccgtttagtt gctgggatgg ggcggcgttg 60

ggggtgcggc cctgaaccgg agggatttag agactggaga cgcggcctct aagagaggtt 120

gaaactgtgt gtgtgtggga gaaaatgata accaccctcc catctctcct acccgccagc 180

ctcgccagta tctcccaccg agtcacgaat ctcccatcta actccctctc acacaaccca 240

ggcctctcca agcctgactt tcccggaaac tccagtccag gtcttccttc ctcctccagc 300

ccaggccggg acctgggggc tcctgccgga tccatggggg cggccagctg cgaggatgag 360

gagctggaat ttaagctggt gttcggggag gaaaaggagg cccccccgct gggcgcgggg 420

ggattggggg aagaactgga ctcagaggat gccccgccat gctgccgtct ggccttggga 480

gagccccctc cctatggcgc tgcacctatc ggtattcccc gacctccacc ccctcggcct 540

ggcatgcatt cgccaccgcc gcgaccagcc ccctcacctg gcacctggga gagccagccc 600

gccaggtcgg tgaggctggg aggaccagga gggggtgctg ggggtgctgg gggtggccgt 660

gttctcgagt gtcccagcat ccgcatcacc tccatctctc ccacgccgga gccgccagca 720

gcgctggagg acaaccctga tgcctggggg gacggctctc ctagagatta ccccccacca 780

gaaggctttg ggggctacag agaagcaggg ggccagggtg ggggggcctt cttcagccca 840

agccctggca gcagcagcct gtcctcgtgg agcttcttct ccgatgcctc tgacgaggca 900

gccctgtatg cagcctgcga cgaggtggag tctgagctaa atgaggcggc ctcccgcttt 960

ggcctgggct ccccgctgcc ctcgccccgg gcctcccctc ggccatggac ccccgaagat 1020

ccctggagcc tgtatggtcc aagccccgga ggccgagggc cagaggatag ctggctactc 1080

ctcagtgctc ctgggcccac cccagcctcc ccgcggcctg cctctccatg tggcaagcgg 1140

cgctattcca gctcgggaac cccatcttca gcctccccag ctctgtcccg ccgtggcagc 1200

ctgggggaag aggggtctga gccacctcca ccacccccat tgcctctggc ccgggacccg 1260

ggctcccctg gtccctttga ctatgtgggg gccccaccag ctgagagcat ccctcagaag 1320

acacggcgga cttccagcga gcaggcagtg gctctgcctc ggtctgagga gcctgcctca 1380

tgcaatggga agctgccctt gggagcagag gagtctgtgg ctcctccagg aggttcccgg 1440

aaggaggtgg ctggcatgga ctacctggca gtgccctccc cactcgcttg gtccaaggcc 1500

cggattgggg gacacagccc tatcttcagg acctctgccc tacccccact ggactggcct 1560

ctgcccagcc aatatgagca gctggagctg aggatcgagg tacagcctag agcccaccac 1620

cgggcccact atgagacaga aggcagccgt ggagctgtca aagctgcccc tggcggtcac 1680

cccgtagtca agctcctagg ctacagtgag aagccactga ccctacagat gttcatcggc 1740

actgcagatg aaaggaacct gcggcctcat gccttctatc aggtgcaccg tatcacaggc 1800

aagatggtgg ccacggccag ctatgaagcc gtagtcagtg gcaccaaggt gttggagatg 1860

actctgctgc ctgagaacaa catggcggcc aacattgact gcgcgggaat cctgaagctt 1920

cggaattcag acattgagct tcggaagggt gagacggaca tcgggcgcaa aaacacacgt 1980

gtacggctgg tgttccgggt acacgtgccc cagggcggcg ggaaggtcgt ctcagtacag 2040

gcagcatcgg tgcccatcga gtgctcccag cgctcagccc aggagctgcc ccaggtggag 2100

gcctacagcc ccagtgcctg ctctgtgaga ggaggcgagg aactggtact gactggctcc 2160

aacttcctgc cagactccaa ggtggtgttc attgagaggg gtcctgatgg gaagctgcaa 2220

tgggaggagg aggccacagt gaaccgactg cagagcaacg aggtgacgct gaccctgact 2280

gtccccgagt acagcaacaa gagggtttcc cggccagtcc aggtctactt ttatgtctcc 2340

aatgggcgga ggaaacgcag tcctacccag agtttcaggt ttctgcctgt gatctgcaaa 2400

gaggagcccc taccggactc atctctgcgg ggtttccctt cagcatcggc aacccccttt 2460

ggcactgaca tggacttctc accacccagg cccccctacc cctcctatcc ccatgaagac 2520

cctgcttgcg aaactcctta cctatcagaa ggcttcggct atggcatgcc ccctctgtac 2580

ccccagacgg ggcccccacc atcctacaga ccgggcctgc ggatgttccc tgagactagg 2640

ggtaccacag gttgtgccca accacctgca gtttccttcc ttccccgccc cttccctagt 2700

gacccgtatg gagggcgggg ctcctctttc tccctggggc tgccattctc tccgccagcc 2760

ccctttcggc cgcctcctct tcctgcatcc ccaccgcttg aaggcccctt cccttcccag 2820

agtgatgtgc atcccctacc tgctgaggga tacaataagg tagggccagg ctatggccct 2880

ggggaggggg ctccggagca ggagaaatcc aggggtggct acagcagcgg cttccgagac 2940

agtgtcccta tccagggtat cacgctggag gaaggtgggt gtgggactgg gggctgtgag 3000

tgtgagtgtg tgcaagagat tgctctgcat gtttgctgag ggctggagct gggcttttca 3060

gagatcgggc atccctggtc tctcagggcc agttggaggt tcccaggagg catgttcttg 3120

atgcctgtgg ctgcctgaat ccaattaact gaattctgaa gagtgcatgg ggtaactgtc 3180

tcagcctttc tcctgtctct gcctctgtcc tctgctccaa atcataaaat ctcagagcta 3240

gaagcacttt caagatcatt ccatccagcg cattcaattt gcaagtttag gcgttgagtt 3300

ccagagaggg atggtagctt gctgaggtcc cagtcaagca cacttgccat tgcctcagct 3360

ttcccctaaa cacggtgtct gtggtcaggg ttggtgagga ggagctttcc tgttttgcct 3420

ctccttcttc ccattggcta cacccatctc tggccctgct gataccgatt cccctgacat 3480

ttcaggctaa gccagcagga aagggctagg acgggtgcct gggagcccac atggagggag 3540

ttgggcaaga tttgattcgg agcaggtgtc aagacgtgtt ggggaaactg aggcccagtg 3600

gaatagaagc cagtagagga ggaatctaga ggcctcctag attaagacct gcctggaatg 3660

gattgggggt gggtctttgg aaaaggaggg gacccacctc tagcccagtc tctcaactgc 3720

ccctccttta cagtgagtga gatcattggc cgagacctga gtggcttccc tgcacctcct 3780

ggagaagagc ctcctgcctg aaccacgtga actgtcatca cctggcaacc ccagccccag 3840

cctcagccct gccccctttc cctccttcct ggagtggtgg ctacagaagc ttggggccaa 3900

ccctggctcc tctttcccca gcttctgtct gtctcactgt cttccctccc ctcccccagc 3960

tgaggtgtgg ccctcaggcc tggtgctgcc ttggagggct gggggaagga gtgtgtggag 4020

gagggaggag ggtgaagact gaggctaggt gccagaatgg actggagtga aggcgtgtct 4080

agagtgtggg ctggctgttg tgctggaaag ctggggacag gttgatggta ataaactgct 4140

caatgaccag tgcttcaggc tccagagctc tttggagaga tgggttgggg cagcttactc 4200

cagccctggc ccaaggaggc ccagaagttg gaaagagatg gaatgtggct gggaacattg 4260

catcccaaag agcttctcag tggaggaggc tggggaaggc atgagggggc tcagaggctc 4320

cttgactggg accaggattg ggggccaggg cttgagtagg cctctccact ctcctccttg 4380

ggggtccaga ttccttagga gctttgggat gaggcccagg aggctgcatt tttccaggtc 4440

cttagtcttg ccaccacaca gatgattctg attcatagcc aagatgagga cacactgatg 4500

tagctgatct ctcatttaca gaggaggatt ctaaagttca gagagggaaa ggggcttgcc 4560

tgaggtcacg tagataatca gcagcacatt gaacgctgca ctcctgggct cctgtcccca 4620

gcccccattc agacacgctg actcaggagg tccaggcctc taaggcttct ctccctggag 4680

tgagggtgga ggtgagggag agctggcaca agccctccct ctggatcctc cactcctggg 4740

gattatgaag atattctgga aagatttgtg cttcagaggt agactgcaga aagcaaacag 4800

tctacccagc agctctgaat gtcacctgcc ctggggctta cagcactata tgagttcctg 4860

gcctatcctg caaatatgcc catgctggcc ttctaaatag ctggtacatc catcaccact 4920

gacgggcctg gcctggaaac ctggtttgtc ccctgtcttg atggcctacg agaggccaag 4980

ttccactggg ctgggaaaag tcactttgtc tgtcttgttc acctggagcc tgacacaccg 5040

taggtactga gtacaaatag cttgatttgg ctaggcttgg ctgcaggggg acgtgcctaa 5100

aagacattcc gggcatttgc acttgggaaa cttgcctcac cttcaggctt gtggggcctc 5160

tctatgccca atgagtccag gcagtcctag caagtactca ggagagcagg ggtgggtgtg 5220

acagaggctg gctctggatt gggggacaac agaaccagag taactcctcg cctgttgctg 5280

ctttgcaatg aatttccttt acctttctgg aacacaagct gctgtgaacc aaactgatat 5340

caagtgatta gctcaccggg ccttggttgc ttttcaaaga tccccttcag ccccctgcca 5400

gagtcactgc cccataatca ccatgtcaga agggacccta gggcattcgt gtcctattta 5460

tcaatcttca gcaccacctc taagatctct gagagagggt ggatcagcct ctgtgtaaac 5520

aaaaagctgt taggacttgt tgcctctcaa ggtggactat tctgttttct gccaggacac 5580

tgccattcat gcattgtcag atatttatta aacagcagca aagtgccagc caatttgtcc 5640

tggaggaatt catagcctca tggggcaaaa gtaaataaac agcttattac aattcaacaa 5700

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 5747

<210> 2

<211> 964

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ile Thr Thr Leu Pro Ser Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ala Ser Ile

1 5 10 15

Ser His Arg Val Thr Asn Leu Pro Ser Asn Ser Leu Ser His Asn Pro

20 25 30

Gly Leu Ser Lys Pro Asp Phe Pro Gly Asn Ser Ser Pro Gly Leu Pro

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Gly Ala Pro Ala Gly Ser Met

50 55 60

Gly Ala Ala Ser Cys Glu Asp Glu Glu Leu Glu Phe Lys Leu Val Phe

65 70 75 80

Gly Glu Glu Lys Glu Ala Pro Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gly Glu

85 90 95

Glu Leu Asp Ser Glu Asp Ala Pro Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu Gly

100 105 110

Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Pro Ile Gly Ile Pro Arg Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ser

130 135 140

Pro Gly Thr Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly Gly

145 150 155 160

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu Cys

165 170 175

Pro Ser Ile Arg Ile Thr Ser Ile Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Glu Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp

195 200 205

Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Gly Gln

210 215 220

Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala

245 250 255

Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe

260 265 270

Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp

275 280 285

Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly Arg

290 295 300

Gly Pro Glu Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr Pro

305 310 315 320

Ala Ser Pro Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Lys Arg Arg Tyr Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser

340 345 350

Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu

355 360 365

Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala Pro

370 375 380

Pro Ala Glu Ser Ile Pro Gln Lys Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln

385 390 395 400

Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys

405 410 415

Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg

420 425 430

Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala

435 440 445

Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu

465 470 475 480

Glu Leu Arg Ile Glu Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His Tyr

485 490 495

Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val Lys Ala Ala Pro Gly Gly His

500 505 510

Pro Val Val Lys Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln

515 520 525

Met Phe Ile Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala Phe

530 535 540

Tyr Gln Val His Arg Ile Thr Gly Lys Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr

545 550 555 560

Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Lys Val Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro

565 570 575

Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu

580 585 590

Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg

595 600 605

Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly

610 615 620

Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys

625 630 635 640

Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro

645 650 655

Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser

660 665 670

Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp

675 680 685

Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser

690 695 700

Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg

705 710 715 720

Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg

725 730 735

Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys

740 745 750

Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser

755 760 765

Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro

770 775 780

Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu

785 790 795 800

Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly

805 810 815

Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg

820 825 830

Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg

835 840 845

Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu

850 855 860

Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu Pro

865 870 875 880

Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro Phe Pro Ser Gln Ser Asp Val His

885 890 895

Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn Lys Val Gly Pro Gly Tyr Gly Pro

900 905 910

Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu Lys Ser Arg Gly Gly Tyr Ser Ser

915 920 925

Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro Ile Gln Gly Ile Thr Leu Glu Glu Gly

930 935 940

Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Glu Cys Glu Cys Val Gln Glu Ile Ala

945 950 955 960

Leu His Val Cys

<210> 3

<211> 4976

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

gaagagagga cagagggagg gagggtgggg gaggacgagg ggcgcgtggt tttcccatct 60

catccctgga ggaggggctg gagcatcccc ggcagccaat cagggacagg ctgggggggg 120

gaccgctttg aagaagtttg ggggaaaaaa gtttggaaaa gtttctataa taacgagggg 180

gcttctggag ggaggcggca gcgacggagg agggggcttc tcagagaaag ggagggaggg 240

agccacccgg gtgaagatac agcagcctcc tgaactcccc cctcccaccc aggccgggac 300

ctgggggctc ctgccggatc catgggggcg gccagctgcg aggatgagga gctggaattt 360

aagctggtgt tcggggagga aaaggaggcc cccccgctgg gcgcgggggg attgggggaa 420

gaactggact cagaggatgc cccgccatgc tgccgtctgg ccttgggaga gccccctccc 480

tatggcgctg cacctatcgg tattccccga cctccacccc ctcggcctgg catgcattcg 540

ccaccgccgc gaccagcccc ctcacctggc acctgggaga gccagcccgc caggtcggtg 600

aggctgggag gaccaggagg gggtgctggg ggtgctgggg gtggccgtgt tctcgagtgt 660

cccagcatcc gcatcacctc catctctccc acgccggagc cgccagcagc gctggaggac 720

aaccctgatg cctgggggga cggctctcct agagattacc ccccaccaga aggctttggg 780

ggctacagag aagcaggggg ccagggtggg ggggccttct tcagcccaag ccctggcagc 840

agcagcctgt cctcgtggag cttcttctcc gatgcctctg acgaggcagc cctgtatgca 900

gcctgcgacg aggtggagtc tgagctaaat gaggcggcct cccgctttgg cctgggctcc 960

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tatggtccaa gccccggagg ccgagggcca gaggatagct ggctactcct cagtgctcct 1080

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gggtctgagc cacctccacc acccccattg cctctggccc gggacccggg ctcccctggt 1260

ccctttgact atgtgggggc cccaccagct gagagcatcc ctcagaagac acggcggact 1320

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Ser Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly

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Leu Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala

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Gln Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly

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Arg Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu

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Ala Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr

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Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro

610 615 620

Asp Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln

625 630 635 640

Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys

645 650 655

Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg

660 665 670

Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys

675 680 685

Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala

690 695 700

Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro

705 710 715 720

Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr

725 730 735

Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr

740 745 750

Gly Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr

755 760 765

Arg Gly Thr Thr Val Ser Glu Ile Ile Gly Arg Asp Leu Ser Gly Phe

770 775 780

Pro Ala Pro Pro Gly Glu Glu Pro Pro Ala

785 790

<210> 7

<211> 4630

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

acggttgcga tggcaactgg ggctcctgcc agcgccgttt gggggtttgg gaaccgctgc 60

taattgggtt catgtaactg gactcagagg atgccccgcc atgctgccgt ctggccttgg 120

gagagccccc tccctatggc gctgcaccta tcggtattcc ccgacctcca ccccctcggc 180

ctggcatgca ttcgccaccg ccgcgaccag ccccctcacc tggcacctgg gagagccagc 240

ccgccaggtc ggtgaggctg ggaggaccag gagggggtgc tgggggtgct gggggtggcc 300

gtgttctcga gtgtcccagc atccgcatca cctccatctc tcccacgccg gagccgccag 360

cagcgctgga ggacaaccct gatgcctggg gggacggctc tcctagagat taccccccac 420

cagaaggctt tgggggctac agagaagcag ggggccaggg tgggggggcc ttcttcagcc 480

caagccctgg cagcagcagc ctgtcctcgt ggagcttctt ctccgatgcc tctgacgagg 540

cagccctgta tgcagcctgc gacgaggtgg agtctgagct aaatgaggcg gcctcccgct 600

ttggcctggg ctccccgctg ccctcgcccc gggcctcccc tcggccatgg acccccgaag 660

atccctggag cctgtatggt ccaagccccg gaggccgagg gccagaggat agctggctac 720

tcctcagtgc tcctgggccc accccagcct ccccgcggcc tgcctctcca tgtggcaagc 780

ggcgctattc cagctcggga accccatctt cagcctcccc agctctgtcc cgccgtggca 840

gcctggggga agaggggtct gagccacctc caccaccccc attgcctctg gcccgggacc 900

cgggctcccc tggtcccttt gactatgtgg gggccccacc agctgagagc atccctcaga 960

agacacggcg gacttccagc gagcaggcag tggctctgcc tcggtctgag gagcctgcct 1020

catgcaatgg gaagctgccc ttgggagcag aggagtctgt ggctcctcca ggaggttccc 1080

ggaaggaggt ggctggcatg gactacctgg cagtgccctc cccactcgct tggtccaagg 1140

cccggattgg gggacacagc cctatcttca ggacctctgc cctaccccca ctggactggc 1200

ctctgcccag ccaatatgag cagctggagc tgaggatcga ggtacagcct agagcccacc 1260

accgggccca ctatgagaca gaaggcagcc gtggagctgt caaagctgcc cctggcggtc 1320

accccgtagt caagctccta ggctacagtg agaagccact gaccctacag atgttcatcg 1380

gcactgcaga tgaaaggaac ctgcggcctc atgccttcta tcaggtgcac cgtatcacag 1440

gcaagatggt ggccacggcc agctatgaag ccgtagtcag tggcaccaag gtgttggaga 1500

tgactctgct gcctgagaac aacatggcgg ccaacattga ctgcgcggga atcctgaagc 1560

ttcggaattc agacattgag cttcggaagg gtgagacgga catcgggcgc aaaaacacac 1620

gtgtacggct ggtgttccgg gtacacgtgc cccagggcgg cgggaaggtc gtctcagtac 1680

aggcagcatc ggtgcccatc gagtgctccc agcgctcagc ccaggagctg ccccaggtgg 1740

aggcctacag ccccagtgcc tgctctgtga gaggaggcga ggaactggta ctgactggct 1800

ccaacttcct gccagactcc aaggtggtgt tcattgagag gggtcctgat gggaagctgc 1860

aatgggagga ggaggccaca gtgaaccgac tgcagagcaa cgaggtgacg ctgaccctga 1920

ctgtccccga gtacagcaac aagagggttt cccggccagt ccaggtctac ttttatgtct 1980

ccaatgggcg gaggaaacgc agtcctaccc agagtttcag gtttctgcct gtgatctgca 2040

aagaggagcc cctaccggac tcatctctgc ggggtttccc ttcagcatcg gcaaccccct 2100

ttggcactga catggacttc tcaccaccca ggccccccta cccctcctat ccccatgaag 2160

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agagtgatgt gcatccccta cctgctgagg gatacaataa ggtagggcca ggctatggcc 2520

ctggggaggg ggctccggag caggagaaat ccaggggtgg ctacagcagc ggcttccgag 2580

acagtgtccc tatccagggt atcacgctgg aggaagtgag tgagatcatt ggccgagacc 2640

tgagtggctt ccctgcacct cctggagaag agcctcctgc ctgaaccacg tgaactgtca 2700

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tggctacaga agcttggggc caaccctggc tcctctttcc ccagcttctg tctgtctcac 2820

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tggactggag tgaaggcgtg tctagagtgt gggctggctg ttgtgctgga aagctgggga 3000

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ggcatgaggg ggctcagagg ctccttgact gggaccagga ttgggggcca gggcttgagt 3240

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aggaggctgc atttttccag gtccttagtc ttgccaccac acagatgatt ctgattcata 3360

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gcactcctgg gctcctgtcc ccagccccca ttcagacacg ctgactcagg aggtccaggc 3540

ctctaaggct tctctccctg gagtgagggt ggaggtgagg gagagctggc acaagccctc 3600

cctctggatc ctccactcct ggggattatg aagatattct ggaaagattt gtgcttcaga 3660

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tagctggtac atccatcacc actgacgggc ctggcctgga aacctggttt gtcccctgtc 3840

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ttcacctgga gcctgacaca ccgtaggtac tgagtacaaa tagcttgatt tggctaggct 3960

tggctgcagg gggacgtgcc taaaagacat tccgggcatt tgcacttggg aaacttgcct 4020

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tcaggagagc aggggtgggt gtgacagagg ctggctctgg attgggggac aacagaacca 4140

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ctagggcatt cgtgtcctat ttatcaatct tcagcaccac ctctaagatc tctgagagag 4380

ggtggatcag cctctgtgta aacaaaaagc tgttaggact tgttgcctct caaggtggac 4440

tattctgttt tctgccagga cactgccatt catgcattgt cagatattta ttaaacagca 4500

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aacagcttat tacaattcaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620

aaaaaaaaaa 4630

<210> 8

<211> 832

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ser Pro Gly Thr Trp Glu

1 5 10 15

Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu Cys Pro Ser Ile Arg Ile

35 40 45

Thr Ser Ile Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ala Ala Leu Glu Asp Asn

50 55 60

Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp Tyr Pro Pro Pro Glu

65 70 75 80

Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gly Ala Phe

85 90 95

Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser Ser Trp Ser Phe Phe

100 105 110

Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Cys Asp Glu Val

115 120 125

Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe Gly Leu Gly Ser Pro

130 135 140

Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp Thr Pro Glu Asp Pro

145 150 155 160

Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly Arg Gly Pro Glu Asp Ser

165 170 175

Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr Pro Ala Ser Pro Arg Pro

180 185 190

Ala Ser Pro Cys Gly Lys Arg Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Thr Pro Ser

195 200 205

Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser Leu Gly Glu Glu Gly

210 215 220

Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Gly

225 230 235 240

Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala Pro Pro Ala Glu Ser Ile

245 250 255

Pro Gln Lys Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln Ala Val Ala Leu Pro

260 265 270

Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ala

275 280 285

Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg Lys Glu Val Ala Gly

290 295 300

Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala Trp Ser Lys Ala Arg

305 310 315 320

Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser Ala Leu Pro Pro Leu

325 330 335

Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu Glu Leu Arg Ile Glu

340 345 350

Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His Tyr Glu Thr Glu Gly Ser

355 360 365

Arg Gly Ala Val Lys Ala Ala Pro Gly Gly His Pro Val Val Lys Leu

370 375 380

Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln Met Phe Ile Gly Thr

385 390 395 400

Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala Phe Tyr Gln Val His Arg

405 410 415

Ile Thr Gly Lys Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr Glu Ala Val Val Ser

420 425 430

Gly Thr Lys Val Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro Glu Asn Asn Met Ala

435 440 445

Ala Asn Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ser Asp Ile

450 455 460

Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn Thr Arg Val

465 470 475 480

Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly Gly Gly Lys Val Val

485 490 495

Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys Ser Gln Arg Ser Ala

500 505 510

Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro Ser Ala Cys Ser Val

515 520 525

Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser Asn Phe Leu Pro Asp

530 535 540

Ser Lys Val Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp Gly Lys Leu Gln Trp

545 550 555 560

Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser Asn Glu Val Thr Leu

565 570 575

Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val

580 585 590

Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg Lys Arg Ser Pro Thr

595 600 605

Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro

610 615 620

Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly

625 630 635 640

Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro

645 650 655

His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe Gly

660 665 670

Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly Pro Pro Pro Ser Tyr

675 680 685

Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg Gly Thr Thr Gly Cys

690 695 700

Ala Gln Pro Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg Pro Phe Pro Ser Asp

705 710 715 720

Pro Tyr Gly Gly Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu Gly Leu Pro Phe Ser

725 730 735

Pro Pro Ala Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ser Pro Pro Leu

740 745 750

Glu Gly Pro Phe Pro Ser Gln Ser Asp Val His Pro Leu Pro Ala Glu

755 760 765

Gly Tyr Asn Lys Val Gly Pro Gly Tyr Gly Pro Gly Glu Gly Ala Pro

770 775 780

Glu Gln Glu Lys Ser Arg Gly Gly Tyr Ser Ser Gly Phe Arg Asp Ser

785 790 795 800

Val Pro Ile Gln Gly Ile Thr Leu Glu Glu Val Ser Glu Ile Ile Gly

805 810 815

Arg Asp Leu Ser Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gly Glu Glu Pro Pro Ala

820 825 830

<210> 9

<211> 4664

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

gtaaacgtct gacctggggc cgtcgcttaa ccgtttagtt gctgggatgg ggcggcgttg 60

ggggtgcggc cctgaaccgg agggatttag agactggaga cgcggcctct aagagaggtt 120

gaaactgtgt gtgtgtggga gaaaatgata accaccctcc catctctcct acccgccagc 180

ctcgccagta tctcccaccg agtcacgaat ctcccatcta actccctctc acacaaccca 240

ggcctctcca agcctgactt tcccggaaac tccagtccag gtcttccttc ctcctccagc 300

ccaggccggg acctgggggc tcctgccgga tccatggggg cggccagctg cgaggatgag 360

gagctggaat ttaagctggt gttcggggag gaaaaggagg cccccccgct gggcgcgggg 420

ggattggggg aagaactgga ctcagaggat gccccgccat gctgccgtct ggccttggga 480

gagccccctc cctatggcgc tgcacctatc ggtattcccc gacctccacc ccctcggcct 540

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gttctcgagt gtcccagcat ccgcatcacc tccatctctc ccacgccgga gccgccagca 720

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gaaggctttg ggggctacag agaagcaggg ggccagggtg ggggggcctt cttcagccca 840

agccctggca gcagcagcct gtcctcgtgg agcttcttct ccgatgcctc tgacgaggca 900

gccctgtatg cagcctgcga cgaggtggag tctgagctaa atgaggcggc ctcccgcttt 960

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ctcagtgctc ctgggcccac cccagcctcc ccgcggcctg cctctccatg tggcaagcgg 1140

cgctattcca gctcgggaac cccatcttca gcctccccag ctctgtcccg ccgtggcagc 1200

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cggattgggg gacacagccc tatcttcagg acctctgccc tacccccact ggactggcct 1560

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cgggcccact atgagacaga aggcagccgt ggagctgtca aagctgcccc tggcggtcac 1680

cccgtagtca agctcctagg ctacagtgag aagccactga ccctacagat gttcatcggc 1740

actgcagatg aaaggaacct gcggcctcat gccttctatc aggtgcaccg tatcacaggc 1800

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gtacggctgg tgttccgggt acacgtgccc cagggcggcg ggaaggtcgt ctcagtacag 2040

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aacttcctgc cagactccaa ggtggtgttc attgagaggg gtcctgatgg gaagctgcaa 2220

tgggaggagg aggccacagt gaaccgactg cagagcaacg aggtgacgct gaccctgact 2280

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tatgaagata ttctggaaag atttgtgctt cagaggtaga ctgcagaaag caaacagtct 3720

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atgcccaatg agtccaggca gtcctagcaa gtactcagga gagcaggggt gggtgtgaca 4140

gaggctggct ctggattggg ggacaacaga accagagtaa ctcctcgcct gttgctgctt 4200

tgcaatgaat ttcctttacc tttctggaac acaagctgct gtgaaccaaa ctgatatcaa 4260

gtgattagct caccgggcct tggttgcttt tcaaagatcc ccttcagccc cctgccagag 4320

tcactgcccc ataatcacca tgtcagaagg gaccctaggg cattcgtgtc ctatttatca 4380

atcttcagca ccacctctaa gatctctgag agagggtgga tcagcctctg tgtaaacaaa 4440

aagctgttag gacttgttgc ctctcaaggt ggactattct gttttctgcc aggacactgc 4500

cattcatgca ttgtcagata tttattaaac agcagcaaag tgccagccaa tttgtcctgg 4560

aggaattcat agcctcatgg ggcaaaagta aataaacagc ttattacaat tcaacaaaaa 4620

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Met Ile Thr Thr Leu Pro Ser Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ala Ser Ile

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Ser His Arg Val Thr Asn Leu Pro Ser Asn Ser Leu Ser His Asn Pro

20 25 30

Gly Leu Ser Lys Pro Asp Phe Pro Gly Asn Ser Ser Pro Gly Leu Pro

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Ser Ser Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Gly Ala Pro Ala Gly Ser Met

50 55 60

Gly Ala Ala Ser Cys Glu Asp Glu Glu Leu Glu Phe Lys Leu Val Phe

65 70 75 80

Gly Glu Glu Lys Glu Ala Pro Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gly Glu

85 90 95

Glu Leu Asp Ser Glu Asp Ala Pro Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu Gly

100 105 110

Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Pro Ile Gly Ile Pro Arg Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ser

130 135 140

Pro Gly Thr Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly Gly

145 150 155 160

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu Cys

165 170 175

Pro Ser Ile Arg Ile Thr Ser Ile Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Glu Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp

195 200 205

Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Gly Gln

210 215 220

Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala

245 250 255

Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe

260 265 270

Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp

275 280 285

Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly Arg

290 295 300

Gly Pro Glu Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr Pro

305 310 315 320

Ala Ser Pro Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Lys Arg Arg Tyr Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser

340 345 350

Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu

355 360 365

Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala Pro

370 375 380

Pro Ala Glu Ser Ile Pro Gln Lys Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln

385 390 395 400

Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys

405 410 415

Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg

420 425 430

Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala

435 440 445

Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu

465 470 475 480

Glu Leu Arg Ile Glu Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His Tyr

485 490 495

Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val Lys Ala Ala Pro Gly Gly His

500 505 510

Pro Val Val Lys Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln

515 520 525

Met Phe Ile Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala Phe

530 535 540

Tyr Gln Val His Arg Ile Thr Gly Lys Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr

545 550 555 560

Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Lys Val Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro

565 570 575

Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu

580 585 590

Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg

595 600 605

Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly

610 615 620

Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys

625 630 635 640

Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro

645 650 655

Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser

660 665 670

Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp

675 680 685

Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser

690 695 700

Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg

705 710 715 720

Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg

725 730 735

Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys

740 745 750

Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser

755 760 765

Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro

770 775 780

Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu

785 790 795 800

Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly

805 810 815

Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg

820 825 830

Gly Thr Thr Val Ser Glu Ile Ile Gly Arg Asp Leu Ser Gly Phe Pro

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Ala Pro Pro Gly Glu Glu Pro Pro Ala

850 855

<210> 11

<211> 5538

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

atgtgtgagt cgcccccagt ccagcccagt gcctcaagaa acacgcctcc aggcccagcc 60

ccagctccag cccctctgga cccacctctc tcaccttaag acccactgga tcgggtaccc 120

tcggtcctag gatccagggg ccagtgggca aaggcctggc atgcctgctt caatctcctc 180

catcttccca ggtccaactc tgcttttgtc ttgtggctca gaagaactgg actcagagga 240

tgccccgcca tgctgccgtc tggccttggg agagccccct ccctatggcg ctgcacctat 300

cggtattccc cgacctccac cccctcggcc tggcatgcat tcgccaccgc cgcgaccagc 360

cccctcacct ggcacctggg agagccagcc cgccaggtcg gtgaggctgg gaggaccagg 420

agggggtgct gggggtgctg ggggtggccg tgttctcgag tgtcccagca tccgcatcac 480

ctccatctct cccacgccgg agccgccagc agcgctggag gacaaccctg atgcctgggg 540

ggacggctct cctagagatt accccccacc agaaggcttt gggggctaca gagaagcagg 600

gggccagggt gggggggcct tcttcagccc aagccctggc agcagcagcc tgtcctcgtg 660

gagcttcttc tccgatgcct ctgacgaggc agccctgtat gcagcctgcg acgaggtgga 720

gtctgagcta aatgaggcgg cctcccgctt tggcctgggc tccccgctgc cctcgccccg 780

ggcctcccct cggccatgga cccccgaaga tccctggagc ctgtatggtc caagccccgg 840

aggccgaggg ccagaggata gctggctact cctcagtgct cctgggccca ccccagcctc 900

cccgcggcct gcctctccat gtggcaagcg gcgctattcc agctcgggaa ccccatcttc 960

agcctcccca gctctgtccc gccgtggcag cctgggggaa gaggggtctg agccacctcc 1020

accaccccca ttgcctctgg cccgggaccc gggctcccct ggtccctttg actatgtggg 1080

ggccccacca gctgagagca tccctcagaa gacacggcgg acttccagcg agcaggcagt 1140

ggctctgcct cggtctgagg agcctgcctc atgcaatggg aagctgccct tgggagcaga 1200

ggagtctgtg gctcctccag gaggttcccg gaaggaggtg gctggcatgg actacctggc 1260

agtgccctcc ccactcgctt ggtccaaggc ccggattggg ggacacagcc ctatcttcag 1320

gacctctgcc ctacccccac tggactggcc tctgcccagc caatatgagc agctggagct 1380

gaggatcgag gtacagccta gagcccacca ccgggcccac tatgagacag aaggcagccg 1440

tggagctgtc aaagctgccc ctggcggtca ccccgtagtc aagctcctag gctacagtga 1500

gaagccactg accctacaga tgttcatcgg cactgcagat gaaaggaacc tgcggcctca 1560

tgccttctat caggtgcacc gtatcacagg caagatggtg gccacggcca gctatgaagc 1620

cgtagtcagt ggcaccaagg tgttggagat gactctgctg cctgagaaca acatggcggc 1680

caacattgac tgcgcgggaa tcctgaagct tcggaattca gacattgagc ttcggaaggg 1740

tgagacggac atcgggcgca aaaacacacg tgtacggctg gtgttccggg tacacgtgcc 1800

ccagggcggc gggaaggtcg tctcagtaca ggcagcatcg gtgcccatcg agtgctccca 1860

gcgctcagcc caggagctgc cccaggtgga ggcctacagc cccagtgcct gctctgtgag 1920

aggaggcgag gaactggtac tgactggctc caacttcctg ccagactcca aggtggtgtt 1980

cattgagagg ggtcctgatg ggaagctgca atgggaggag gaggccacag tgaaccgact 2040

gcagagcaac gaggtgacgc tgaccctgac tgtccccgag tacagcaaca agagggtttc 2100

ccggccagtc caggtctact tttatgtctc caatgggcgg aggaaacgca gtcctaccca 2160

gagtttcagg tttctgcctg tgatctgcaa agaggagccc ctaccggact catctctgcg 2220

gggtttccct tcagcatcgg caaccccctt tggcactgac atggacttct caccacccag 2280

gcccccctac ccctcctatc cccatgaaga ccctgcttgc gaaactcctt acctatcaga 2340

aggcttcggc tatggcatgc cccctctgta cccccagacg gggcccccac catcctacag 2400

accgggcctg cggatgttcc ctgagactag gggtaccaca ggttgtgccc aaccacctgc 2460

agtttccttc cttccccgcc ccttccctag tgacccgtat ggagggcggg gctcctcttt 2520

ctccctgggg ctgccattct ctccgccagc cccctttcgg ccgcctcctc ttcctgcatc 2580

cccaccgctt gaaggcccct tcccttccca gagtgatgtg catcccctac ctgctgaggg 2640

atacaataag gtagggccag gctatggccc tggggagggg gctccggagc aggagaaatc 2700

caggggtggc tacagcagcg gcttccgaga cagtgtccct atccagggta tcacgctgga 2760

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tgtttgctga gggctggagc tgggcttttc agagatcggg catccctggt ctctcagggc 2880

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ctctgctcca aatcataaaa tctcagagct agaagcactt tcaagatcat tccatccagc 3060

gcattcaatt tgcaagttta ggcgttgagt tccagagagg gatggtagct tgctgaggtc 3120

ccagtcaagc acacttgcca ttgcctcagc tttcccctaa acacggtgtc tgtggtcagg 3180

gttggtgagg aggagctttc ctgttttgcc tctccttctt cccattggct acacccatct 3240

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aggcctccta gattaagacc tgcctggaat ggattggggg tgggtctttg gaaaaggagg 3480

ggacccacct ctagcccagt ctctcaactg cccctccttt acagtgagtg agatcattgg 3540

ccgagacctg agtggcttcc ctgcacctcc tggagaagag cctcctgcct gaaccacgtg 3600

aactgtcatc acctggcaac cccagcccca gcctcagccc tgcccccttt ccctccttcc 3660

tggagtggtg gctacagaag cttggggcca accctggctc ctctttcccc agcttctgtc 3720

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ctttggagag atgggttggg gcagcttact ccagccctgg cccaaggagg cccagaagtt 4020

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ctggggaagg catgaggggg ctcagaggct ccttgactgg gaccaggatt gggggccagg 4140

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cctggggctt acagcactat atgagttcct ggcctatcct gcaaatatgc ccatgctggc 4680

cttctaaata gctggtacat ccatcaccac tgacgggcct ggcctggaaa cctggtttgt 4740

cccctgtctt gatggcctac gagaggccaa gttccactgg gctgggaaaa gtcactttgt 4800

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gctaggcttg gctgcagggg gacgtgccta aaagacattc cgggcatttg cacttgggaa 4920

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gcaagtactc aggagagcag gggtgggtgt gacagaggct ggctctggat tgggggacaa 5040

cagaaccaga gtaactcctc gcctgttgct gctttgcaat gaatttcctt tacctttctg 5100

gaacacaagc tgctgtgaac caaactgata tcaagtgatt agctcaccgg gccttggttg 5160

cttttcaaag atccccttca gccccctgcc agagtcactg ccccataatc accatgtcag 5220

aagggaccct agggcattcg tgtcctattt atcaatcttc agcaccacct ctaagatctc 5280

tgagagaggg tggatcagcc tctgtgtaaa caaaaagctg ttaggacttg ttgcctctca 5340

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agtaaataaa cagcttatta caattcaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5520

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 5538

<210> 12

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Met Pro Ala Ser Ile Ser Ser Ile Phe Pro Gly Pro Thr Leu Leu Leu

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Arg Leu Ala Leu Gly Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Pro Ile Gly

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Ile Pro Arg Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro

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Arg Pro Ala Pro Ser Pro Gly Thr Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser

65 70 75 80

Val Arg Leu Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly

85 90 95

Arg Val Leu Glu Cys Pro Ser Ile Arg Ile Thr Ser Ile Ser Pro Thr

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Pro Glu Pro Pro Ala Ala Leu Glu Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp

115 120 125

Gly Ser Pro Arg Asp Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg

130 135 140

Glu Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Leu Ser Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu

165 170 175

Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu

180 185 190

Ala Ala Ser Arg Phe Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala

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Ser Pro Arg Pro Trp Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro

210 215 220

Ser Pro Gly Gly Arg Gly Pro Glu Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Pro Gly Pro Thr Pro Ala Ser Pro Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Lys

245 250 255

Arg Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu

260 265 270

Ser Arg Arg Gly Ser Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro

275 280 285

Pro Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp

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Tyr Val Gly Ala Pro Pro Ala Glu Ser Ile Pro Gln Lys Thr Arg Arg

305 310 315 320

Thr Ser Ser Glu Gln Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala

325 330 335

Ser Cys Asn Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro

340 345 350

Pro Gly Gly Ser Arg Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val

355 360 365

Pro Ser Pro Leu Ala Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro

370 375 380

Ile Phe Arg Thr Ser Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser

385 390 395 400

Gln Tyr Glu Gln Leu Glu Leu Arg Ile Glu Val Gln Pro Arg Ala His

405 410 415

His Arg Ala His Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val Lys Ala

420 425 430

Ala Pro Gly Gly His Pro Val Val Lys Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys

435 440 445

Pro Leu Thr Leu Gln Met Phe Ile Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu

450 455 460

Arg Pro His Ala Phe Tyr Gln Val His Arg Ile Thr Gly Lys Met Val

465 470 475 480

Ala Thr Ala Ser Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Lys Val Leu Glu

485 490 495

Met Thr Leu Leu Pro Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn Ile Asp Cys Ala

500 505 510

Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu

515 520 525

Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val

530 535 540

His Val Pro Gln Gly Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser

545 550 555 560

Val Pro Ile Glu Cys Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val

565 570 575

Glu Ala Tyr Ser Pro Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu

580 585 590

Val Leu Thr Gly Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile

595 600 605

Glu Arg Gly Pro Asp Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val

610 615 620

Asn Arg Leu Gln Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu

625 630 635 640

Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val

645 650 655

Ser Asn Gly Arg Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu

660 665 670

Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly

675 680 685

Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser

690 695 700

Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys

705 710 715 720

Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu

725 730 735

Tyr Pro Gln Thr Gly Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met

740 745 750

Phe Pro Glu Thr Arg Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro Ala Val

755 760 765

Ser Phe Leu Pro Arg Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Gly

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Ser Ser Phe Ser Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Phe Arg

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Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro Phe Pro Ser

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Gln Ser Asp Val His Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn Lys Val Gly

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Pro Gly Tyr Gly Pro Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu Lys Ser Arg

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Gly Gly Tyr Ser Ser Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro Ile Gln Gly Ile

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<212> DNA

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<400> 13

gtaaacgtct gacctggggc cgtcgcttaa ccgtttagtt gctgggatgg ggcggcgttg 60

ggggtgcggc cctgaaccgg agggatttag agactggaga cgcggcctct aagagaggtt 120

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ctcgccagta tctcccaccg agtcacgaat ctcccatcta actccctctc acacaaccca 240

ggcctctcca agcctgactt tcccggaaac tccagtccag gtcttccttc ctcctccagc 300

ccaggccggg acctgggggc tcctgccgga tccatggggg cggccagctg cgaggatgag 360

gagctggaat ttaagctggt gttcggggag gaaaaggagg cccccccgct gggcgcgggg 420

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gagccccctc cctatggcgc tgcacctatc ggtattcccc gacctccacc ccctcggcct 540

ggcatgcatt cgccaccgcc gcgaccagcc ccctcacctg gcacctggga gagccagccc 600

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gttctcgagt gtcccagcat ccgcatcacc tccatctctc ccacgccgga gccgccagca 720

gcgctggagg acaaccctga tgcctggggg gacggctctc ctagagatta ccccccacca 780

gaaggctttg ggggctacag agaagcaggg ggccagggtg ggggggcctt cttcagccca 840

agccctggca gcagcagcct gtcctcgtgg agcttcttct ccgatgcctc tgacgaggca 900

gccctgtatg cagcctgcga cgaggtggag tctgagctaa atgaggcggc ctcccgcttt 960

ggcctgggct ccccgctgcc ctcgccccgg gcctcccctc ggccatggac ccccgaagat 1020

ccctggagcc tgtatggtcc aagccccgga ggccgagggc cagaggatag ctggctactc 1080

ctcagtgctc ctgggcccac cccagcctcc ccgcggcctg cctctccatg tggcaagcgg 1140

cgctattcca gctcgggaac cccatcttca gcctccccag ctctgtcccg ccgtggcagc 1200

ctgggggaag aggggtctga gccacctcca ccacccccat tgcctctggc ccgggacccg 1260

ggctcccctg gtccctttga ctatgtgggg gccccaccag ctgagagcat ccctcagaag 1320

acacggcgga cttccagcga gcaggcagtg gctctgcctc ggtctgagga gcctgcctca 1380

tgcaatggga agctgccctt gggagcagag gagtctgtgg ctcctccagg aggttcccgg 1440

aaggaggtgg ctggcatgga ctacctggca gtgccctccc cactcgcttg gtccaaggcc 1500

cggattgggg gacacagccc tatcttcagg acctctgccc tacccccact ggactggcct 1560

ctgcccagcc aatatgagca gctggagctg aggatcgagg tacagcctag agcccaccac 1620

cgggcccact atgagacaga aggcagccgt ggagctgtca aagctgcccc tggcggtcac 1680

cccgtagtca agctcctagg ctacagtgag aagccactga ccctacagat gttcatcggc 1740

actgcagatg aaaggaacct gcggcctcat gccttctatc aggtgcaccg tatcacaggc 1800

aagatggtgg ccacggccag ctatgaagcc gtagtcagtg gcaccaaggt gttggagatg 1860

actctgctgc ctgagaacaa catggcggcc aacattgact gcgcgggaat cctgaagctt 1920

cggaattcag acattgagct tcggaagggt gagacggaca tcgggcgcaa aaacacacgt 1980

gtacggctgg tgttccgggt acacgtgccc cagggcggcg ggaaggtcgt ctcagtacag 2040

gcagcatcgg tgcccatcga gtgctcccag cgctcagccc aggagctgcc ccaggtggag 2100

gcctacagcc ccagtgcctg ctctgtgaga ggaggcgagg aactggtact gactggctcc 2160

aacttcctgc cagactccaa ggtggtgttc attgagaggg gtcctgatgg gaagctgcaa 2220

tgggaggagg aggccacagt gaaccgactg cagagcaacg aggtgacgct gaccctgact 2280

gtccccgagt acagcaacaa gagggtttcc cggccagtcc aggtctactt ttatgtctcc 2340

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cctgcttgcg aaactcctta cctatcagaa ggcttcggct atggcatgcc ccctctgtac 2580

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ggtaccacag gttgtgccca accacctgca gtttccttcc ttccccgccc cttccctagt 2700

gacccgtatg gagggcgggg ctcctctttc tccctggggc tgccattctc tccgccagcc 2760

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ggggaggggg ctccggagca ggagaaatcc aggggtggct acagcagcgg cttccgagac 2940

agtgtcccta tccagggtat cacgctggag gaagtgagtg agatcattgg ccgagacctg 3000

agtggcttcc ctgcacctcc tggagaagag cctcctgcct gaaccacgtg aactgtcatc 3060

acctggcaac cccagcccca gcctcagccc tgcccccttt ccctccttcc tggagtggtg 3120

gctacagaag cttggggcca accctggctc ctctttcccc agcttctgtc tgtctcactg 3180

tcttccctcc cctcccccag ctgaggtgtg gccctcaggc ctggtgctgc cttggagggc 3240

tgggggaagg agtgtgtgga ggagggagga gggtgaagac tgaggctagg tgccagaatg 3300

gactggagtg aaggcgtgtc tagagtgtgg gctggctgtt gtgctggaaa gctggggaca 3360

ggttgatggt aataaactgc tcaatgacca gtgcttcagg ctccagagct ctttggagag 3420

atgggttggg gcagcttact ccagccctgg cccaaggagg cccagaagtt ggaaagagat 3480

ggaatgtggc tgggaacatt gcatcccaaa gagcttctca gtggaggagg ctggggaagg 3540

catgaggggg ctcagaggct ccttgactgg gaccaggatt gggggccagg gcttgagtag 3600

gcctctccac tctcctcctt gggggtccag attccttagg agctttggga tgaggcccag 3660

gaggctgcat ttttccaggt ccttagtctt gccaccacac agatgattct gattcatagc 3720

caagatgagg acacactgat gtagctgatc tctcatttac agaggaggat tctaaagttc 3780

agagagggaa aggggcttgc ctgaggtcac gtagataatc agcagcacat tgaacgctgc 3840

actcctgggc tcctgtcccc agcccccatt cagacacgct gactcaggag gtccaggcct 3900

ctaaggcttc tctccctgga gtgagggtgg aggtgaggga gagctggcac aagccctccc 3960

tctggatcct ccactcctgg ggattatgaa gatattctgg aaagatttgt gcttcagagg 4020

tagactgcag aaagcaaaca gtctacccag cagctctgaa tgtcacctgc cctggggctt 4080

acagcactat atgagttcct ggcctatcct gcaaatatgc ccatgctggc cttctaaata 4140

gctggtacat ccatcaccac tgacgggcct ggcctggaaa cctggtttgt cccctgtctt 4200

gatggcctac gagaggccaa gttccactgg gctgggaaaa gtcactttgt ctgtcttgtt 4260

cacctggagc ctgacacacc gtaggtactg agtacaaata gcttgatttg gctaggcttg 4320

gctgcagggg gacgtgccta aaagacattc cgggcatttg cacttgggaa acttgcctca 4380

ccttcaggct tgtggggcct ctctatgccc aatgagtcca ggcagtccta gcaagtactc 4440

aggagagcag gggtgggtgt gacagaggct ggctctggat tgggggacaa cagaaccaga 4500

gtaactcctc gcctgttgct gctttgcaat gaatttcctt tacctttctg gaacacaagc 4560

tgctgtgaac caaactgata tcaagtgatt agctcaccgg gccttggttg cttttcaaag 4620

atccccttca gccccctgcc agagtcactg ccccataatc accatgtcag aagggaccct 4680

agggcattcg tgtcctattt atcaatcttc agcaccacct ctaagatctc tgagagaggg 4740

tggatcagcc tctgtgtaaa caaaaagctg ttaggacttg ttgcctctca aggtggacta 4800

ttctgttttc tgccaggaca ctgccattca tgcattgtca gatatttatt aaacagcagc 4860

aaagtgccag ccaatttgtc ctggaggaat tcatagcctc atggggcaaa agtaaataaa 4920

cagcttatta caattcaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980

aaaaaaaa 4988

<210> 14

<211> 965

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Met Ile Thr Thr Leu Pro Ser Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ala Ser Ile

1 5 10 15

Ser His Arg Val Thr Asn Leu Pro Ser Asn Ser Leu Ser His Asn Pro

20 25 30

Gly Leu Ser Lys Pro Asp Phe Pro Gly Asn Ser Ser Pro Gly Leu Pro

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Gly Ala Pro Ala Gly Ser Met

50 55 60

Gly Ala Ala Ser Cys Glu Asp Glu Glu Leu Glu Phe Lys Leu Val Phe

65 70 75 80

Gly Glu Glu Lys Glu Ala Pro Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gly Glu

85 90 95

Glu Leu Asp Ser Glu Asp Ala Pro Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu Gly

100 105 110

Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Pro Ile Gly Ile Pro Arg Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ser

130 135 140

Pro Gly Thr Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly Gly

145 150 155 160

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu Cys

165 170 175

Pro Ser Ile Arg Ile Thr Ser Ile Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Glu Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp

195 200 205

Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Gly Gln

210 215 220

Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala

245 250 255

Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe

260 265 270

Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp

275 280 285

Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly Arg

290 295 300

Gly Pro Glu Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr Pro

305 310 315 320

Ala Ser Pro Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Lys Arg Arg Tyr Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser

340 345 350

Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu

355 360 365

Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala Pro

370 375 380

Pro Ala Glu Ser Ile Pro Gln Lys Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln

385 390 395 400

Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys

405 410 415

Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg

420 425 430

Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala

435 440 445

Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu

465 470 475 480

Glu Leu Arg Ile Glu Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His Tyr

485 490 495

Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val Lys Ala Ala Pro Gly Gly His

500 505 510

Pro Val Val Lys Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln

515 520 525

Met Phe Ile Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala Phe

530 535 540

Tyr Gln Val His Arg Ile Thr Gly Lys Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr

545 550 555 560

Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Lys Val Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro

565 570 575

Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu

580 585 590

Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg

595 600 605

Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly

610 615 620

Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys

625 630 635 640

Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro

645 650 655

Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser

660 665 670

Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp

675 680 685

Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser

690 695 700

Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg

705 710 715 720

Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg

725 730 735

Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys

740 745 750

Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser

755 760 765

Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro

770 775 780

Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu

785 790 795 800

Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly

805 810 815

Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg

820 825 830

Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg

835 840 845

Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu

850 855 860

Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu Pro

865 870 875 880

Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro Phe Pro Ser Gln Ser Asp Val His

885 890 895

Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn Lys Val Gly Pro Gly Tyr Gly Pro

900 905 910

Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu Lys Ser Arg Gly Gly Tyr Ser Ser

915 920 925

Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro Ile Gln Gly Ile Thr Leu Glu Glu Val

930 935 940

Ser Glu Ile Ile Gly Arg Asp Leu Ser Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gly

945 950 955 960

Glu Glu Pro Pro Ala

965

<210> 15

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短521个N-末端氨基酸的NFATC4的亚型2（dNFATC4）

<400> 15

Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val

20 25 30

Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln

35 40 45

Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu

50 55 60

Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly

65 70 75 80

Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val

85 90 95

Val Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu

100 105 110

Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr

115 120 125

Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr

130 135 140

Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe

145 150 155 160

Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser

165 170 175

Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met

180 185 190

Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp

195 200 205

Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met

210 215 220

Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly

225 230 235 240

Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro

245 250 255

Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly

260 265 270

Gly Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala

275 280 285

Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro

290 295 300

Phe Pro Ser Gln Ser Asp Val His Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn

305 310 315 320

Lys Val Gly Pro Gly Tyr Gly Pro Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu

325 330 335

Lys Ser Arg Gly Gly Tyr Ser Ser Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro Ile

340 345 350

Gln Gly Ile Thr Leu Glu Glu Val Ser Glu Ile Ile Gly Arg Asp Leu

355 360 365

Ser Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gly Glu Glu Pro Pro Ala

370 375 380

<210> 16

<211> 2583

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

agccggtccc cgccgccgcc gcccttcgcg ccctgggcca tctccctccc acctccctcc 60

gcggagcagc cagacagcga gggccccggc cgggggcagg ggggacgccc cgtccggggc 120

acccccccgg ctctgagccg cccgcggggc cggcctcggc ccggagcgga ggaaggagtc 180

gccgaggagc agcctgaggc cccagagtct gagacgagcc gccgccgccc ccgccactgc 240

ggggaggagg gggaggagga gcgggaggag ggacgagctg gtcgggagaa gaggaaaaaa 300

acttttgaga cttttccgtt gccgctggga gccggaggcg cggggacctc ttggcgcgac 360

gctgccccgc gaggaggcag gacttgggga ccccagaccg cctccctttg ccgccgggga 420

cgcttgctcc ctccctgccc cctacacggc gtccctcagg cgcccccatt ccggaccagc 480

cctcgggagt cgccgacccg gcctcccgca aagacttttc cccagacctc gggcgcaccc 540

cctgcacgcc gccttcatcc ccggcctgtc tcctgagccc ccgcgcatcc tagacccttt 600

ctcctccagg agacggatct ctctccgacc tgccacagat cccctattca agaccaccca 660

ccttctggta ccagatcgcg cccatctagg ttatttccgt gggatactga gacacccccg 720

gtccaagcct cccctccacc actgcgccct tctccctgag gacctcagct ttccctcgag 780

gccctcctac cttttgccgg gagaccccca gcccctgcag gggcggggcc tccccaccac 840

accagccctg ttcgcgctct cggcagtgcc ggggggcgcc gcctccccca tgccgccctc 900

cgggctgcgg ctgctgccgc tgctgctacc gctgctgtgg ctactggtgc tgacgcctgg 960

ccggccggcc gcgggactat ccacctgcaa gactatcgac atggagctgg tgaagcggaa 1020

gcgcatcgag gccatccgcg gccagatcct gtccaagctg cggctcgcca gccccccgag 1080

ccagggggag gtgccgcccg gcccgctgcc cgaggccgtg ctcgccctgt acaacagcac 1140

ccgcgaccgg gtggccgggg agagtgcaga accggagccc gagcctgagg ccgactacta 1200

cgccaaggag gtcacccgcg tgctaatggt ggaaacccac aacgaaatct atgacaagtt 1260

caagcagagt acacacagca tatatatgtt cttcaacaca tcagagctcc gagaagcggt 1320

acctgaaccc gtgttgctct cccgggcaga gctgcgtctg ctgaggctca agttaaaagt 1380

ggagcagcac gtggagctgt accagaaata cagcaacaat tcctggcgat acctcagcaa 1440

ccggctgctg gcacccagcg actcgccaga gtggttatct tttgatgtca ccggagttgt 1500

gcggcagtgg ttgagccgtg gaggggaaat tgagggcttt cgccttagcg cccactgctc 1560

ctgtgacagc agggataaca cactgcaagt ggacatcaac gggttcacta ccggccgccg 1620

aggtgacctg gccaccattc atggcatgaa ccggcctttc ctgcttctca tggccacccc 1680

gctggagagg gcccagcatc tgcaaagctc ccggcaccgc cgagccctgg acaccaacta 1740

ttgcttcagc tccacggaga agaactgctg cgtgcggcag ctgtacattg acttccgcaa 1800

ggacctcggc tggaagtgga tccacgagcc caagggctac catgccaact tctgcctcgg 1860

gccctgcccc tacatttgga gcctggacac gcagtacagc aaggtcctgg ccctgtacaa 1920

ccagcataac ccgggcgcct cggcggcgcc gtgctgcgtg ccgcaggcgc tggagccgct 1980

gcccatcgtg tactacgtgg gccgcaagcc caaggtggag cagctgtcca acatgatcgt 2040

gcgctcctgc aagtgcagct gaggtcccgc cccgccccgc cccgccccgg caggcccggc 2100

cccaccccgc cccgcccccg ctgccttgcc catgggggct gtatttaagg acacccgtgc 2160

cccaagccca cctggggccc cattaaagat ggagagagga ctgcggatct ctgtgtcatt 2220

gggcgcctgc ctggggtctc catccctgac gttcccccac tcccactccc tctctctccc 2280

tctctgcctc ctcctgcctg tctgcactat tcctttgccc ggcatcaagg cacaggggac 2340

cagtggggaa cactactgta gttagatcta tttattgagc accttgggca ctgttgaagt 2400

gccttacatt aatgaactca ttcagtcacc atagcaacac tctgagatgc agggactctg 2460

ataacaccca ttttaaaggt gaggaaacaa gcccagagag gttaagggag gagttcctgc 2520

ccaccaggaa cctgctttag tgggggatag tgaagaagac aataaaagat agtagttcag 2580

gcc 2583

<210> 17

<211> 390

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr

20 25 30

Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala

35 40 45

Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser

50 55 60

Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu

85 90 95

Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu

100 105 110

Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr

115 120 125

His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val

130 135 140

Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu

145 150 155 160

Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn

165 170 175

Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser

180 185 190

Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu

195 200 205

Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser

210 215 220

Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr

225 230 235 240

Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro

245 250 255

Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln

260 265 270

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser

275 280 285

Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys

290 295 300

Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn

305 310 315 320

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr

325 330 335

Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala

340 345 350

Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr

355 360 365

Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val

370 375 380

Arg Ser Cys Lys Cys Ser

385 390

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人NFATC4 shRNA3

<400> 18

caatgaacac caccttgga 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人NFATC4 shRNA4

<400> 19

agtctcaggg aacatccgc 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 shRNA1

<400> 20

atgctgtgtg tactctgct 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 shRNA2

<400> 21

tgatgtccac ttgcagtgt 19

<210> 22

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 siRNA1

<400> 22

auugagggcu uucgcuua 18

<210> 23

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 siRNA2

<400> 23

ccgagaagcg guaccugaa 19

<210> 24

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 siRNA3

<400> 24

gcagaguaca cagcaua 17

<210> 25

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TGFbeta1 siRNA4

<400> 25

ggacuaucca ccugcaaga 19

<210> 26

<211> 4818

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Promega PGL3基础空载体

<400> 26

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctaa gtaagcttgg 60

cattccggta ctgttggtaa agccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg 120

gcgccattct atccgctgga agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag 180

agatacgccc tggttcctgg aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc 240

acttacgctg agtacttcga aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg 300

ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg 360

gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa 420

cgtgaattgc tcaacagtat gggcatttcg cagcctaccg tggtgttcgt ttccaaaaag 480

gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa aagctcccaa tcatccaaaa aattattatc 540

atggattcta aaacggatta ccagggattt cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat 600

ctacctcccg gttttaatga atacgatttt gtgccagagt ccttcgatag ggacaagaca 660

attgcactga tcatgaactc ctctggatct actggtctgc ctaaaggtgt cgctctgcct 720

catagaactg cctgcgtgag attctcgcat gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc 780

attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt ccattccatc acggttttgg aatgtttact 840

acactcggat atttgatatg tggatttcga gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag 900

ctgtttctga ggagccttca ggattacaag attcaaagtg cgctgctggt gccaacccta 960

ttctccttct tcgccaaaag cactctgatt gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa 1020

attgcttctg gtggcgctcc cctctctaag gaagtcgggg aagcggttgc caagaggttc 1080

catctgccag gtatcaggca aggatatggg ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt 1140

acacccgagg gggatgataa accgggcgcg gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg 1200

aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg ctgggcgtta atcaaagagg cgaactgtgt 1260

gtgagaggtc ctatgattat gtccggttat gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg 1320

attgacaagg atggatggct acattctgga gacatagctt actgggacga agacgaacac 1380

ttcttcatcg ttgaccgcct gaagtctctg attaagtaca aaggctatca ggtggctccc 1440

gctgaattgg aatccatctt gctccaacac cccaacatct tcgacgcagg tgtcgcaggt 1500

cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag 1560

acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag 1620

ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac 1680

gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag gccaagaagg gcggaaagat cgccgtgtaa 1740

ttctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt 1800

ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 1860

attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 1920

cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 1980

tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatccg tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc 2040

agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 2100

ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 2160

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 2220

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 2280

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<212> DNA

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<220>

<223> Clonetech, pLVX-tdTomato-C1，空载体

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<213> 人工序列

<220>

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tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc 9420

atggacgagc tgtacaagtc cggactcaga tctcgagtgg cctatccata tgacgtacca 9480

gattatgcgg gggcggccag ctgcgaggat gaggagctgg aatttaagct ggtgttcggg 9540

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agaggaggcg aggaactggt actgaccggc tccaacttcc tgccagactc caaggtggtg 11340

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cggggtttcc cttcagcatc ggcaaccccc tttggcactg acatggactt ctcaccaccc 11640

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gaaggcttcg gctatggcat gccccctctg tacccccaga cggggccccc accatcctac 11760

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3-85C

<400> 30

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gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3900

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gattatgcgg gggcggccag ctgcgaggat gaggagctgg aatttaagct ggtgttcggg 9540

gaggaaaagg aggccccccc gctgggcgcg gggggattgg gggaagaact ggactcagag 9600

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ggagggggtg ctgggggtgc tgggggtggc cgtgttctcg agtgtcccag catccgcatc 9840

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gccaacattg actgcgcggg aatcctgaag cttcggaatt cagacattga gcttcggaag 11100

ggtgagacgg acatcgggcg caaaaacaca cgtgtacggc tggtgttccg ggtacacgtg 11160

ccccagggcg gcgggaaggt cgtctcagta caggcagcat cggtgcccat cgagtgctcc 11220

cagcgctcag cccaggagct gccccaggtg gaggcctaca gccccagtgc ctgctctgtg 11280

agaggaggcg aggaactggt actgactggc tccaacttcc tgccagactc caaggtggtg 11340

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tcccggccag tccaggtcta cttttatgtc tccaatgggc ggaggaaacg cagtcctacc 11520

cagagtttca ggtttctgcc tgtgatctgc aaagaggagc ccctaccgga ctcatctctg 11580

cggggtttcc cttcagcatc ggcaaccccc tttggcactg acatggactt ctcaccaccc 11640

aggcccccct acccctccta tccccatgaa gaccctgctt gcgaaactcc ttacctatca 11700

gaaggcttcg gctatggcat gccccctctg tacccccaga cggggccccc accatcctac 11760

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<210> 31

<211> 11121

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1 hdNFAT3 WT

<400> 31

ggatccaccg gatctagata actgatcata attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 60

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 120

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 180

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ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag 420

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cgcaagcccg gtgcctgacc gcgtctggaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 1200

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 1260

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 1320

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 1380

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cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 1500

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 1560

ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 1620

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aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaaga ggggactgga agggctaatt 1980

cactcccaac gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc 2040

cctgattagc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 2100

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tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 4020

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tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 4980

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taaagaaatt gtatttgtta aatatgtact acaaacttag tagttggaag ggctaattca 5220

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tgattagcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg 5340

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gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc atccggagta 5520

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tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga 5880

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gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg 6000

cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag 6060

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caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac 6720

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caactgcccg gctactacta cgtggacacc aagctggaca tcacctccca caacgaggac 9360

tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc 9420

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tacctggcag tgccctcccc actcgcttgg tccaaggccc ggattggggg acacagccct 9600

atcttcagga cctctgccct acccccactg gactggcctc tgcccagcca atatgagcag 9660

ctggagctga ggatcgaggt acagcctaga gcccaccacc gggcccacta tgagacagaa 9720

ggcagccgtg gagctgtcaa agctgcccct ggcggtcacc ccgtagtcaa gctcctaggc 9780

tacagtgaga agccactgac cctacagatg ttcatcggca ctgcagatga aaggaacctg 9840

cggcctcatg ccttctatca ggtgcaccgt atcacaggca agatggtggc cacggccagc 9900

tatgaagccg tagtcagtgg caccaaggtg ttggagatga ctctgctgcc tgagaacaac 9960

atggcggcca acattgactg cgcgggaatc ctgaagcttc ggaattcaga cattgagctt 10020

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tctctgcggg gtttcccttc agcatcggca accccctttg gcactgacat ggacttctca 10560

ccacccaggc ccccctaccc ctcctatccc catgaagacc ctgcttgcga aactccttac 10620

ctatcagaag gcttcggcta tggcatgccc cctctgtacc cccagacggg gcccccacca 10680

tcctacagac cgggcctgcg gatgttccct gagactaggg gtaccacagg ttgtgcccaa 10740

ccacctgcag tttccttcct tccccgcccc ttccctagtg acccgtatgg agggcggggc 10800

tcctctttcc ccctggggct gccattctct ccgccagccc cctttcggcc gcctcctctt 10860

cctgcatccc caccgcttga aggccccttc ccttcccaga gtgatgtgca tcccctacct 10920

gctgagggat acaataaggt agggccaggc tatggccctg gggagggggc tccggagcag 10980

gagaaatcca ggggtggcta cagcagcggc ttccgagaca gtgtccctat ccagggtatc 11040

acgctggagg aagtgagtga gatcattggc cgagacctga gtggcttccc tgcacctcct 11100

ggagaagagc ctcctgcctg a 11121

<210> 32

<211> 10886

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1 hdNFAT3-85C

<400> 32

ggatccaccg gatctagata actgatcata attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 60

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 120

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 180

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gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat 300

ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct 360

ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag 420

gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac 480

gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac 540

ctgcagccca agcttaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac 600

gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc 660

cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc 720

acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg 780

gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc 840

atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg 900

ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac 960

cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc 1020

ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc 1080

ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc 1140

cgcaagcccg gtgcctgacc gcgtctggaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 1200

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 1260

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 1320

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 1380

gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 1440

cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 1500

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 1560

ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 1620

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<210> 33

<211> 11121

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<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1-hCD63

<400> 33

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ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga tcaacttgtt tattgcagct 4920

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 4980

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tggataactc aagctaacca aaatcatccc aaacttccca ccccataccc tattaccact 5100

gccaattacc tgtggtttca tttactctaa acctgtgatt cctctgaatt attttcattt 5160

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cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca 6540

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gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag 8880

gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac 8940

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tcctctttcc ccctggggct gccattctct ccgccagccc cctttcggcc gcctcctctt 10860

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gagaaatcca ggggtggcta cagcagcggc ttccgagaca gtgtccctat ccagggtatc 11040

acgctggagg aagtgagtga gatcattggc cgagacctga gtggcttccc tgcacctcct 11100

ggagaagagc ctcctgcctg a 11121

<210> 34

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Clonetech, pLVX-tdTomato-C1 , 空载体

<400> 34

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Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

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Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

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Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

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Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg Gly Thr

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Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg

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His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

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<210> 35

<211> 941

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3 WT

<400> 35

Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Val Ala Tyr

20 25 30

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Cys Glu Asp Glu

35 40 45

Glu Leu Glu Phe Lys Leu Val Phe Gly Glu Glu Lys Glu Ala Pro Pro

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Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu Gly Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala

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Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly

180 185 190

Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Ala Gln Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro

195 200 205

Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala

210 215 220

Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu

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Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser

245 250 255

Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu

260 265 270

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275 280 285

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Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro

325 330 335

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly

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Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu

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Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser

385 390 395 400

Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr

405 410 415

Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly

420 425 430

His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro

435 440 445

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Val Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr

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Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser

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Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met

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Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp

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Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met

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<210> 36

<211> 1309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1-HA hNFAT3-85C

<400> 36

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

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130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Ser Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ser Ser Glu Asp Asn Asn Met Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg

245 250 255

Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile

260 265 270

Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys

275 280 285

Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu

290 295 300

Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala

305 310 315 320

Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp

325 330 335

Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln

340 345 350

Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg

355 360 365

Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met

370 375 380

Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu

385 390 395 400

Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr

405 410 415

Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu

420 425 430

Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn

435 440 445

Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His

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His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg

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Ser Cys Glu Asp Glu Glu Leu Glu Phe Lys Leu Val Phe Gly Glu Glu

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Ser Glu Asp Ala Pro Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu Gly Glu Pro Pro

530 535 540

Pro Tyr Gly Ala Ala Pro Ile Gly Ile Pro Arg Pro Pro Pro Pro Arg

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Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ser Pro Gly Thr

565 570 575

Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly Gly Pro Gly Gly

580 585 590

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu Cys Pro Ser Ile

595 600 605

Arg Ile Thr Ser Ile Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ala Ala Leu Glu

610 615 620

Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg Asp Tyr Pro Pro

625 630 635 640

Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Ala Gln Gly Gly Gly

645 650 655

Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu Ser Ser Trp Ser

660 665 670

Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Cys Asp

675 680 685

Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg Phe Gly Leu Gly

690 695 700

Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro Trp Thr Pro Glu

705 710 715 720

Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly Arg Gly Pro Glu

725 730 735

Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr Pro Ala Ser Pro

740 745 750

Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Lys Arg Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Thr

755 760 765

Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly Ser Leu Gly Glu

770 775 780

Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp

785 790 795 800

Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala Pro Pro Ala Glu

805 810 815

Ser Ile Pro Gln Lys Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu Gln Ala Val Ala

820 825 830

Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly Lys Leu Pro Leu

835 840 845

Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser Arg Lys Glu Val

850 855 860

Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala Trp Ser Lys

865 870 875 880

Ala Arg Ile Gly Gly His Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser Ala Leu Pro

885 890 895

Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu Glu Leu Arg

900 905 910

Ile Glu Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His Tyr Glu Thr Glu

915 920 925

Gly Ser Arg Gly Ala Val Lys Ala Ala Pro Gly Gly His Pro Val Val

930 935 940

Lys Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln Met Phe Ile

945 950 955 960

Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala Phe Tyr Gln Val

965 970 975

His Arg Ile Thr Gly Lys Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr Glu Ala Val

980 985 990

Val Ser Gly Thr Lys Val Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro Glu Asn Asn

995 1000 1005

Met Ala Ala Asn Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn

1010 1015 1020

Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys

1025 1030 1035

Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Gly

1040 1045 1050

Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro Ile Glu

1055 1060 1065

Cys Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr

1070 1075 1080

Ser Pro Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu

1085 1090 1095

Thr Gly Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val Phe Ile Glu

1100 1105 1110

Arg Gly Pro Asp Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val

1115 1120 1125

Asn Arg Leu Gln Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro

1130 1135 1140

Glu Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe

1145 1150 1155

Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe

1160 1165 1170

Arg Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser

1175 1180 1185

Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr

1190 1195 1200

Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro

1205 1210 1215

His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe

1220 1225 1230

Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly Pro Pro Pro

1235 1240 1245

Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg Gly Thr

1250 1255 1260

Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg Pro

1265 1270 1275

Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Gly Ser Ser Phe Pro Leu

1280 1285 1290

Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu

1295 1300 1305

Pro

<210> 37

<211> 1036

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pLVX-tdTomato-C1 h?NFAT3 WT

<400> 37

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg Gly Thr

115 120 125

Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Ser Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ser Ser Glu Asp Asn Asn Met Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg

245 250 255

Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile

260 265 270

Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys

275 280 285

Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu

290 295 300

Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala

305 310 315 320

Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp

325 330 335

Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln

340 345 350

Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg

355 360 365

Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met

370 375 380

Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu

385 390 395 400

Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr

405 410 415

Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu

420 425 430

Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn

435 440 445

Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His

450 455 460

His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg

465 470 475 480

Ser Arg Ala Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro

485 490 495

Gly Ser Met Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Tyr Leu

500 505 510

Ala Val Pro Ser Pro Leu Ala Trp Ser Lys Ala Arg Ile Gly Gly His

515 520 525

Ser Pro Ile Phe Arg Thr Ser Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu

530 535 540

Pro Ser Gln Tyr Glu Gln Leu Glu Leu Arg Ile Glu Val Gln Pro Arg

545 550 555 560

Ala His His Arg Ala His Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val

565 570 575

Lys Ala Ala Pro Gly Gly His Pro Val Val Lys Leu Leu Gly Tyr Ser

580 585 590

Glu Lys Pro Leu Thr Leu Gln Met Phe Ile Gly Thr Ala Asp Glu Arg

595 600 605

Asn Leu Arg Pro His Ala Phe Tyr Gln Val His Arg Ile Thr Gly Lys

610 615 620

Met Val Ala Thr Ala Ser Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Lys Val

625 630 635 640

Leu Glu Met Thr Leu Leu Pro Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn Ile Asp

645 650 655

Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys

660 665 670

Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe

675 680 685

Arg Val His Val Pro Gln Gly Gly Gly Lys Val Val Ser Val Gln Ala

690 695 700

Ala Ser Val Pro Ile Glu Cys Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro

705 710 715 720

Gln Val Glu Ala Tyr Ser Pro Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu

725 730 735

Glu Leu Val Leu Thr Gly Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Lys Val Val

740 745 750

Phe Ile Glu Arg Gly Pro Asp Gly Lys Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala

755 760 765

Thr Val Asn Arg Leu Gln Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val

770 775 780

Pro Glu Tyr Ser Asn Lys Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe

785 790 795 800

Tyr Val Ser Asn Gly Arg Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg

805 810 815

Phe Leu Pro Val Ile Cys Lys Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu

820 825 830

Arg Gly Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp

835 840 845

Phe Ser Pro Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro

850 855 860

Ala Cys Glu Thr Pro Tyr Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro

865 870 875 880

Pro Leu Tyr Pro Gln Thr Gly Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu

885 890 895

Arg Met Phe Pro Glu Thr Arg Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro

900 905 910

Ala Val Ser Phe Leu Pro Arg Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly

915 920 925

Arg Gly Ser Ser Phe Pro Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro

930 935 940

Phe Arg Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro Phe

945 950 955 960

Pro Ser Gln Ser Asp Val His Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn Lys

965 970 975

Val Gly Pro Gly Tyr Gly Pro Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu Lys

980 985 990

Ser Arg Gly Gly Tyr Ser Ser Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro Ile Gln

995 1000 1005

Gly Ile Thr Leu Glu Glu Val Ser Glu Ile Ile Gly Arg Asp Leu

1010 1015 1020

Ser Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gly Glu Glu Pro Pro Ala

1025 1030 1035

Claims

1.一种包含表达胞质钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4(NFATC4)的细胞的分泌性胞外囊泡(SEV)的组合物，所述组合物用于治疗癌症或者治疗或预防转移性癌症。

2.用于根据权利要求1所述用途的组合物，其中所述表达NFATC4的细胞的分泌性胞外囊泡(SEV)已被从具有较低侵袭能力的癌细胞中纯化，优选地所述表达NFATC4的细胞的SEV已被从具有较低侵袭能力的乳腺癌细胞中纯化。

3.用于根据权利要求1或权利要求2所述用途的组合物，其中所述表达NFATC4的细胞的SEV已被从转染了包含编码NFATC4核酸分子的表达载体的细胞中纯化。

4.用于根据权利要求3所述用途的组合物，其中所述转染了包含编码NFATC4核酸分子的表达载体的细胞选自：

·具有较低侵袭能力的癌细胞，以及

·健康细胞，优选地所述健康细胞是来自待治疗患者的自体成纤维细胞或人胚胎细胞系，其中所述人胚胎细胞系是商业化可购得的或受赠予的细胞系，特别是HEK293T细胞。

5.用于根据权利要求1至4中任意一项所述用途的组合物，其中所述癌症选自实体癌症；优选乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌和肺癌；更优选地所述癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和胶质母细胞瘤，最优选地所述癌症是乳腺癌，特别是转移性乳腺癌。

6.用于根据权利要求1至5中任意一项所述用途的组合物，其中所述组合物包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物旨在通过静脉内或瘤内途径施用。

7.一种从细胞样品制备包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物的方法，所述方法包括：

a)在所述细胞中诱导NFATC4表达或活性；

b)在允许诱导细胞扩增的条件下，在无SEV培养基中培养所述诱导细胞；以及

c)纯化所述诱导细胞的SEV。

8.根据权利要求7所述的方法，其中用于制备包含SEV的组合物的细胞选自：

·具有较低侵袭能力的癌细胞，以及

·健康细胞，优选地所述健康细胞是来自待治疗患者的自体成纤维细胞。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中通过使用包含编码NFATC4核酸分子的表达载体转染所述细胞来诱导NFATC4表达；优选地所述表达载体是质粒或病毒表达载体。

10.根据权利要求7至9中任意一项所述的方法，其中由经转染的细胞得到的所述SEV通过超速离心采用下述步骤纯化获得：

a)在4℃下以1350RPM离心培养细胞10分钟并收集上清液；

b)在4℃下以3500RPM离心收集的上清液20分钟并收集上清液；

c)在4℃下以10,000RPM离心收集的上清液30分钟并收集上清液；

d)在4℃下以40,000RPM超速离心收集的上清液90分钟并收集球团(pellet)；

e)将所述球团重悬于冰冷PBS中；以及

f)在4℃下以40,000RPM超速离心90分钟并收集所述球团。

11.一种用于确定使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所治疗癌症患者中的治疗有效性的体外方法，所述确定自所述治疗开始前采集的所述癌症患者的第一生物样品和所述治疗开始后癌症患者的第二相应生物样品进行，所述方法包括：

a)至少在体外测量在所述第一和第二生物样品中转化生长因子β1(TGFβ1)的表达水平；

b)至少对所测量的TGFβ1表达水平进行比较；以及

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品选自肿瘤样品、血液样品、血清样品和尿液样品。

13.一种用于自癌症患者的癌症样品预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物的治疗在所述癌症患者中的治疗有效性的体外方法，所述方法包括：

a)至少在体外测量在所述肿瘤样品中TGFβ1的表达水平；

b)使用包含表达NFATC4的SEV的组合物孵育所述癌症样品；

d)如果至少在步骤c)中测得的所述TGFβ1的表达水平高于至少在步骤a)中测得的所述TGFβ1的表达水平，则预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所述癌症患者中的治疗是有效的，以及如果至少在步骤c)中测得的所述TGFβ1的表达水平低于或等于至少在步骤a)中测得的所述TGFβ1的表达水平，则预测使用包含表达NFATC4的细胞的SEV的组合物在所述癌症患者中的治疗是无效的。

14.根据权利要求11至13中任意一项所述的方法，其中至少在核酸水平或在蛋白水平测量在所述癌症患者的两个生物样品中所述TGFβ1的表达水平。

15.根据权利要求11至14中任意一项所述的方法，其中所述癌症选自实体癌症；优选乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌和肺癌；更优选地所述癌症是乳腺癌，特别是转移性乳腺癌。