JPH11332597A - 核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法 - Google Patents
核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法Info
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- JPH11332597A JPH11332597A JP10143197A JP14319798A JPH11332597A JP H11332597 A JPH11332597 A JP H11332597A JP 10143197 A JP10143197 A JP 10143197A JP 14319798 A JP14319798 A JP 14319798A JP H11332597 A JPH11332597 A JP H11332597A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の核酸の測定において、核酸を遺伝子
増幅法により増幅した産物を、蛍光偏光法を利用して再
現性良く、正確かつ迅速に測定する方法、および該方法
を用いてＶｅｒｏ毒素生産菌の有無を迅速に検出する方
法を提供する。 【解決手段】 試料中の２本鎖からなる核酸の一方の１
本鎖配列をプライマーＢ及びＣにて非対称ＰＣＲ増幅
し、他方の１本鎖配列をプライマーＡ及びＣにて非対称
ＰＣＲ増幅し、得られた２つの増幅核酸配列をハイブリ
ダイゼーションさせてハイブリッド核酸とし、該ハイブ
リッド核酸と、該ハイブリッド核酸の１本鎖配列領域に
対して完全にまたは部分的に相補性を有する配列からな
る蛍光標識プローブとを、蛍光偏光度を測定しながらハ
イブリダイゼーションさせることを特徴とする。
増幅法により増幅した産物を、蛍光偏光法を利用して再
現性良く、正確かつ迅速に測定する方法、および該方法
を用いてＶｅｒｏ毒素生産菌の有無を迅速に検出する方
法を提供する。 【解決手段】 試料中の２本鎖からなる核酸の一方の１
本鎖配列をプライマーＢ及びＣにて非対称ＰＣＲ増幅
し、他方の１本鎖配列をプライマーＡ及びＣにて非対称
ＰＣＲ増幅し、得られた２つの増幅核酸配列をハイブリ
ダイゼーションさせてハイブリッド核酸とし、該ハイブ
リッド核酸と、該ハイブリッド核酸の１本鎖配列領域に
対して完全にまたは部分的に相補性を有する配列からな
る蛍光標識プローブとを、蛍光偏光度を測定しながらハ
イブリダイゼーションさせることを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の核酸の測定方
法に関し、特に核酸を遺伝子増幅（ＰＣＲ）法により増
幅した産物を、蛍光偏光法を利用して迅速に測定する方
法に関し、更には該方法によってＶｅｒｏ毒素生産菌の
有無を迅速に検出する方法に関する。
法に関し、特に核酸を遺伝子増幅（ＰＣＲ）法により増
幅した産物を、蛍光偏光法を利用して迅速に測定する方
法に関し、更には該方法によってＶｅｒｏ毒素生産菌の
有無を迅速に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子の本体である核酸を測定す
る必要性が高まっており、従来の免疫測定法をモデルと
して、放射性標識や酵素標識を用いる測定法が研究され
一部実用化されている。これらに代表される従来の核酸
の測定法はほとんどの場合、不均一系の測定系として構
成されている。すなわち測定物質核酸を含む試料と測定
に用いる試薬（測定試薬）とを混合し反応させた後、未
反応の測定物質または測定試薬を既反応のそれらと分離
した上で、標識に起因して発生する信号を計測する方法
である。上述の分離操作は通常、Ｂ／Ｆ分離とよばれ
る。このようなＢ／Ｆ分離の方法としては、反応容器や
フィルム等に固定化されたＤＮＡ試薬を用いる方法、磁
性微粒子を用いる方法または電気泳動を用いる方法など
があるが、いずれの場合も煩雑なあるいは長時間の操作
を必要とする。
る必要性が高まっており、従来の免疫測定法をモデルと
して、放射性標識や酵素標識を用いる測定法が研究され
一部実用化されている。これらに代表される従来の核酸
の測定法はほとんどの場合、不均一系の測定系として構
成されている。すなわち測定物質核酸を含む試料と測定
に用いる試薬（測定試薬）とを混合し反応させた後、未
反応の測定物質または測定試薬を既反応のそれらと分離
した上で、標識に起因して発生する信号を計測する方法
である。上述の分離操作は通常、Ｂ／Ｆ分離とよばれ
る。このようなＢ／Ｆ分離の方法としては、反応容器や
フィルム等に固定化されたＤＮＡ試薬を用いる方法、磁
性微粒子を用いる方法または電気泳動を用いる方法など
があるが、いずれの場合も煩雑なあるいは長時間の操作
を必要とする。
【０００３】このようなＢ／Ｆ分離が不要な測定法とし
て、均一系の測定系に適用できる蛍光偏光法が知られて
いる。該方法は、従来から試料中の薬物等の簡便かつ迅
速な測定法として知られているが、また同様に、核酸の
測定法として応用可能であると考えられている（特開平
５−１２３１９６号公報など）。該方法により核酸を測
定するためには、検出すべき核酸の塩基配列と相補的な
塩基配列を含む核酸に蛍光物質を標識し、これを試薬と
して用いる。ここで上記試薬を蛍光標識試薬（標識プロ
ーブ）とよぶ。通常、該試薬には１本鎖の核酸が用いら
れる。
て、均一系の測定系に適用できる蛍光偏光法が知られて
いる。該方法は、従来から試料中の薬物等の簡便かつ迅
速な測定法として知られているが、また同様に、核酸の
測定法として応用可能であると考えられている（特開平
５−１２３１９６号公報など）。該方法により核酸を測
定するためには、検出すべき核酸の塩基配列と相補的な
塩基配列を含む核酸に蛍光物質を標識し、これを試薬と
して用いる。ここで上記試薬を蛍光標識試薬（標識プロ
ーブ）とよぶ。通常、該試薬には１本鎖の核酸が用いら
れる。
【０００４】蛍光偏光法による核酸の測定法のプロセス
の例を以下に示す。まず、測定すべき試料に蛍光標識試
薬を加える。該試料中に標的とする塩基配列を含む核酸
が存在する場合、該試薬にある反応時間で標的とする塩
基配列を有する部位と、互いに相補的な配列同士が会合
し結合する。この反応をハイブリダイゼーションとよ
ぶ。ここで試料中の核酸は温度あるいは薬品等の処理に
よって１本鎖の状態に前処理されているものとする。ハ
イブリダイゼーションにより、蛍光標識試薬が標的とす
る核酸と結合すると該試薬の見かけ上の分子量は結合前
より増大する。一般に溶液中での分子運動は分子量が大
きいほど緩慢である。そこで反応前後の蛍光偏光度をモ
ニターすると、ハイブリダイゼーションによる結合後の
値は結合前より大きくなる。これは標的核酸とのハイブ
リダイゼーションにより、蛍光標識試薬の見かけ上の分
子量または実効体積が増大するからである。蛍光標識試
薬の量を一定とすれば、この変化の程度は標的とする核
酸の量に対応する。そこで反応前後の蛍光偏光度の変化
により、標的とする核酸の量を測定することができる。
の例を以下に示す。まず、測定すべき試料に蛍光標識試
薬を加える。該試料中に標的とする塩基配列を含む核酸
が存在する場合、該試薬にある反応時間で標的とする塩
基配列を有する部位と、互いに相補的な配列同士が会合
し結合する。この反応をハイブリダイゼーションとよ
ぶ。ここで試料中の核酸は温度あるいは薬品等の処理に
よって１本鎖の状態に前処理されているものとする。ハ
イブリダイゼーションにより、蛍光標識試薬が標的とす
る核酸と結合すると該試薬の見かけ上の分子量は結合前
より増大する。一般に溶液中での分子運動は分子量が大
きいほど緩慢である。そこで反応前後の蛍光偏光度をモ
ニターすると、ハイブリダイゼーションによる結合後の
値は結合前より大きくなる。これは標的核酸とのハイブ
リダイゼーションにより、蛍光標識試薬の見かけ上の分
子量または実効体積が増大するからである。蛍光標識試
薬の量を一定とすれば、この変化の程度は標的とする核
酸の量に対応する。そこで反応前後の蛍光偏光度の変化
により、標的とする核酸の量を測定することができる。
【０００５】なお通常、蛍光偏光度は、励起側、蛍光側
ともに偏光素子をセットし、蛍光側の偏光素子を回転さ
せ励起光の偏光面と平行および垂直の偏光面を有する蛍
光を測定することによって得られるので、１分以内の短
時間で１回の測定を終了することができる。以上説明し
たように、蛍光偏光法はＢ／Ｆ分離操作が不要であり、
迅速・簡便な核酸測定法に応用することが可能である。
しかし、同法の測定感度は、基本的に蛍光標識物質（ラ
ベル）の検出感度に依存しているため、高感度とはいい
難い。一方、たとえば、患者からの検体や食品中の微生
物の核酸を測定する場合、その量は微量であることが多
く、蛍光偏光法によると感度的に測定困難な場合があ
る。
ともに偏光素子をセットし、蛍光側の偏光素子を回転さ
せ励起光の偏光面と平行および垂直の偏光面を有する蛍
光を測定することによって得られるので、１分以内の短
時間で１回の測定を終了することができる。以上説明し
たように、蛍光偏光法はＢ／Ｆ分離操作が不要であり、
迅速・簡便な核酸測定法に応用することが可能である。
しかし、同法の測定感度は、基本的に蛍光標識物質（ラ
ベル）の検出感度に依存しているため、高感度とはいい
難い。一方、たとえば、患者からの検体や食品中の微生
物の核酸を測定する場合、その量は微量であることが多
く、蛍光偏光法によると感度的に測定困難な場合があ
る。
【０００６】そこで、これらの微生物や細胞等の核酸を
高感度に測定する為には、予めPCR（たとえば、 Erlic
h, H. A., Gelfand, D. H. and Saiki, R. K. (1988) S
pecific DNA amplification. Nature 331, 461-462.参
照）等の遺伝子増幅法により、微生物の遺伝子（核酸）
の量を増幅させておき、これを蛍光偏光法によって測定
すればよいだろうということは容易に想像される。ま
た、すでに、蛍光標識したオリゴDNAを遺伝子核酸の増
幅用プライマーとして用い、増幅の進行とともに蛍光偏
光度が増大することを利用して、核酸を測定する方法も
提唱されている（Tamiya, E. and Karube, I. (1993) N
ew Functionality Materials B, 99-104.参照）。
高感度に測定する為には、予めPCR（たとえば、 Erlic
h, H. A., Gelfand, D. H. and Saiki, R. K. (1988) S
pecific DNA amplification. Nature 331, 461-462.参
照）等の遺伝子増幅法により、微生物の遺伝子（核酸）
の量を増幅させておき、これを蛍光偏光法によって測定
すればよいだろうということは容易に想像される。ま
た、すでに、蛍光標識したオリゴDNAを遺伝子核酸の増
幅用プライマーとして用い、増幅の進行とともに蛍光偏
光度が増大することを利用して、核酸を測定する方法も
提唱されている（Tamiya, E. and Karube, I. (1993) N
ew Functionality Materials B, 99-104.参照）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】前項の従来の技術に記
したように、ＤＮＡ等の核酸を測定する場合、感度上の
理由から、あらかじめ遺伝子増幅法により核酸の量を増
幅し、この増幅産物を蛍光偏光法により測定することが
想像される。しかしながら、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を測定した実験によると、測定試料に対して通常の
ＰＣＲ操作（たとえば、 Erlich, H. A., Gelfand, D.
H. andSaiki, R. K. (1988) Specific DNA amplificati
on. Nature 331,Nature 331 (1988) 461-462参照）を行
い、該産物中のＤＮＡをそのまま蛍光偏光法によって測
定した場合、未だに検出感度が不十分であったり、結果
の再現性が低い等の問題が見られることがあった。従っ
て、本発明は、従来の技術の欠点を克服し、試料中の核
酸の測定において、核酸を遺伝子増幅法により増幅した
産物を、蛍光偏光法を利用して再現性良く、正確かつ迅
速に測定する方法、および該方法を用いてＯ−１５７等
のＶｅｒｏ毒素生産菌の有無を迅速に検出する方法を提
供しようとするものである。
したように、ＤＮＡ等の核酸を測定する場合、感度上の
理由から、あらかじめ遺伝子増幅法により核酸の量を増
幅し、この増幅産物を蛍光偏光法により測定することが
想像される。しかしながら、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を測定した実験によると、測定試料に対して通常の
ＰＣＲ操作（たとえば、 Erlich, H. A., Gelfand, D.
H. andSaiki, R. K. (1988) Specific DNA amplificati
on. Nature 331,Nature 331 (1988) 461-462参照）を行
い、該産物中のＤＮＡをそのまま蛍光偏光法によって測
定した場合、未だに検出感度が不十分であったり、結果
の再現性が低い等の問題が見られることがあった。従っ
て、本発明は、従来の技術の欠点を克服し、試料中の核
酸の測定において、核酸を遺伝子増幅法により増幅した
産物を、蛍光偏光法を利用して再現性良く、正確かつ迅
速に測定する方法、および該方法を用いてＯ−１５７等
のＶｅｒｏ毒素生産菌の有無を迅速に検出する方法を提
供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は以下の通
りである。 （１）試料中の核酸を遺伝子増幅し、該増幅産物中の核
酸量を蛍光偏光法によって測定する方法において、試料
中の２本鎖からなる核酸の一方の１本鎖配列を、プライ
マーＢおよびプライマーＣを用いる非対称ＰＣＲにより
選択的に増幅し、他方の１本鎖配列を、プライマーＢお
よびプライマーＣを用いて増幅する配列よりも短くなる
ように、プライマーＡおよびプライマーＣを用いる非対
称ＰＣＲにより選択的に増幅し、得られた長さの異なる
２つの増幅核酸配列をハイブリダイゼーションさせて、
端部に１本鎖配列を有するハイブリッド核酸とし、該ハ
イブリッド核酸と、該ハイブリッド核酸の１本鎖配列領
域に対して完全にまたは部分的に相補性を有する配列か
らなる蛍光標識プローブとを、蛍光偏光度を測定しなが
らハイブリダイゼーションさせることを特徴とする核酸
の測定方法。
りである。 （１）試料中の核酸を遺伝子増幅し、該増幅産物中の核
酸量を蛍光偏光法によって測定する方法において、試料
中の２本鎖からなる核酸の一方の１本鎖配列を、プライ
マーＢおよびプライマーＣを用いる非対称ＰＣＲにより
選択的に増幅し、他方の１本鎖配列を、プライマーＢお
よびプライマーＣを用いて増幅する配列よりも短くなる
ように、プライマーＡおよびプライマーＣを用いる非対
称ＰＣＲにより選択的に増幅し、得られた長さの異なる
２つの増幅核酸配列をハイブリダイゼーションさせて、
端部に１本鎖配列を有するハイブリッド核酸とし、該ハ
イブリッド核酸と、該ハイブリッド核酸の１本鎖配列領
域に対して完全にまたは部分的に相補性を有する配列か
らなる蛍光標識プローブとを、蛍光偏光度を測定しなが
らハイブリダイゼーションさせることを特徴とする核酸
の測定方法。
【０００９】（２）前記蛍光偏光度の測定時における蛍
光標識プローブの初期濃度が１０-9〜１０-7Ｍであるこ
とを特徴とする前記（１）の核酸の測定方法。 （３）前記蛍光偏光度の測定時におけるＮａＣｌ濃度が
０．１５〜３Ｍであることを特徴とする前記（１）の核
酸の測定方法。 （４）前記蛍光標識プローブの蛍光標識がＦＩＴＣ（フ
ルオレセインイソチオシアネート）もしくはフルオレセ
インであることを特徴とする前記（１）または（２）の
核酸の測定方法。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかの方法を用いるＶ
ｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。 （６）プライマーＡが配列表の配列番号１に示す配列を
有するオリゴヌクレオチドであり、プライマーＢが同配
列番号２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドであ
り、プライマーＣが同配列番号３に示す配列を有するオ
リゴヌクレオチドであり、蛍光標識プローブが同配列番
号４に示す配列を有するものであることを特徴とする前
記（５）のＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。
光標識プローブの初期濃度が１０-9〜１０-7Ｍであるこ
とを特徴とする前記（１）の核酸の測定方法。 （３）前記蛍光偏光度の測定時におけるＮａＣｌ濃度が
０．１５〜３Ｍであることを特徴とする前記（１）の核
酸の測定方法。 （４）前記蛍光標識プローブの蛍光標識がＦＩＴＣ（フ
ルオレセインイソチオシアネート）もしくはフルオレセ
インであることを特徴とする前記（１）または（２）の
核酸の測定方法。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかの方法を用いるＶ
ｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。 （６）プライマーＡが配列表の配列番号１に示す配列を
有するオリゴヌクレオチドであり、プライマーＢが同配
列番号２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドであ
り、プライマーＣが同配列番号３に示す配列を有するオ
リゴヌクレオチドであり、蛍光標識プローブが同配列番
号４に示す配列を有するものであることを特徴とする前
記（５）のＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。
【００１０】通常のＰＣＲ法で得られる核酸増幅産物
は、完全な２本鎖がほとんどであり、これに対して、蛍
光偏光法で用いる蛍光標識試薬は、基本的には比較的短
い１本鎖である。サンプル中のこれより長い２本鎖核酸
を熱処理等により変性させ一本鎖とし、次いで該蛍光標
識試薬と、これと相補的な塩基配列を有する側の１本鎖
核酸とのハイブリダイゼーションを試みると、該蛍光標
識試薬と相補的な塩基配列を有さない側の１本鎖核酸
が、該蛍光標識試薬と競合し、エネルギー的にハイブリ
ダイゼーションが困難になると考えられる。以上のよう
に、蛍光偏光法を応用した核酸の測定法において、通常
知られているＰＣＲ等の遺伝子増幅法と蛍光偏光法を単
に組み合わせても、核酸を再現性よくかつ高感度に測定
することは期待できなかった。
は、完全な２本鎖がほとんどであり、これに対して、蛍
光偏光法で用いる蛍光標識試薬は、基本的には比較的短
い１本鎖である。サンプル中のこれより長い２本鎖核酸
を熱処理等により変性させ一本鎖とし、次いで該蛍光標
識試薬と、これと相補的な塩基配列を有する側の１本鎖
核酸とのハイブリダイゼーションを試みると、該蛍光標
識試薬と相補的な塩基配列を有さない側の１本鎖核酸
が、該蛍光標識試薬と競合し、エネルギー的にハイブリ
ダイゼーションが困難になると考えられる。以上のよう
に、蛍光偏光法を応用した核酸の測定法において、通常
知られているＰＣＲ等の遺伝子増幅法と蛍光偏光法を単
に組み合わせても、核酸を再現性よくかつ高感度に測定
することは期待できなかった。
【００１１】これに対して、本発明者らは、先に出願し
た特願平９−２１９７４４号において、遺伝子増幅に際
して非対称ＰＣＲ増幅法を用い、蛍光標識試薬が相補的
に結合する塩基配列を有する側の１本鎖核酸を選択的に
増幅することにより、該１本鎖核酸が他方の１本鎖核酸
より多くなり、該蛍光標識試薬のこれと相補的に結合す
る塩基配列を有する側の１本鎖核酸へのハイブリダイゼ
ーション効率を向上することができることを見出した。
本発明は、この特願平９−２１９７４４号に記載の非対
称ＰＣＲ増幅法を用い、この特願平９−２１９７４４号
のハイブリダイゼーション効率を向上させる作用に加
え、更に以下の作用を与えることにより、試料中に存在
する微量の核酸を感度良く測定できるものである。
た特願平９−２１９７４４号において、遺伝子増幅に際
して非対称ＰＣＲ増幅法を用い、蛍光標識試薬が相補的
に結合する塩基配列を有する側の１本鎖核酸を選択的に
増幅することにより、該１本鎖核酸が他方の１本鎖核酸
より多くなり、該蛍光標識試薬のこれと相補的に結合す
る塩基配列を有する側の１本鎖核酸へのハイブリダイゼ
ーション効率を向上することができることを見出した。
本発明は、この特願平９−２１９７４４号に記載の非対
称ＰＣＲ増幅法を用い、この特願平９−２１９７４４号
のハイブリダイゼーション効率を向上させる作用に加
え、更に以下の作用を与えることにより、試料中に存在
する微量の核酸を感度良く測定できるものである。
【００１２】即ち、蛍光標識試薬が標的とする核酸とハ
イブリダイゼーションすると蛍光標識物質の見かけ上の
分子量は結合前より増大し、この分子量が増大にともな
って蛍光偏光度が変化する。この蛍光偏光度の変化量を
大きくして感度の向上を図るために、ハイブリダイゼー
ション後の蛍光標識物質の見かけ上の分子量が大きくな
ることが好ましい。本願発明は、このハイブリダイゼー
ション後の蛍光標識物質の見かけ上の分子量が、先に出
願した特願平９−２１９７４４号に記載のものよりも大
きくなり、これによって、蛍光偏光度の測定感度も向上
できるものである。
イブリダイゼーションすると蛍光標識物質の見かけ上の
分子量は結合前より増大し、この分子量が増大にともな
って蛍光偏光度が変化する。この蛍光偏光度の変化量を
大きくして感度の向上を図るために、ハイブリダイゼー
ション後の蛍光標識物質の見かけ上の分子量が大きくな
ることが好ましい。本願発明は、このハイブリダイゼー
ション後の蛍光標識物質の見かけ上の分子量が、先に出
願した特願平９−２１９７４４号に記載のものよりも大
きくなり、これによって、蛍光偏光度の測定感度も向上
できるものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の核酸の測定方法を、図１
および図２を用いて説明する。試料中に存在する２本鎖
からなる核酸の１本鎖配列を、増幅を目的とする核酸配
列領域における両端、即ち図２に示す位置で相補的な配
列を有する（アニーリングする）プライマーＢおよびプ
ライマーＣを用いて、非対称ＰＣＲにより選択的に増幅
を行う（ａ）。なお本明細書中にて、この（ａ）の非対
称ＰＣＲを「ＢＣ非対称ＰＣＲ」とも称することとす
る。
および図２を用いて説明する。試料中に存在する２本鎖
からなる核酸の１本鎖配列を、増幅を目的とする核酸配
列領域における両端、即ち図２に示す位置で相補的な配
列を有する（アニーリングする）プライマーＢおよびプ
ライマーＣを用いて、非対称ＰＣＲにより選択的に増幅
を行う（ａ）。なお本明細書中にて、この（ａ）の非対
称ＰＣＲを「ＢＣ非対称ＰＣＲ」とも称することとす
る。
【００１４】また、他方の１本鎖核酸を、プライマーＢ
およびプライマーＣを用いて増幅する（ａ）核酸配列よ
りも短くなるように、図２に示す位置で相補的な配列を
有する（アニーリングする）プライマーＡおよびプライ
マーＣを用いて、非対称ＰＣＲにより選択的に増幅を行
う（ｂ）。なお本明細書中にて、（ｂ）の非対称ＰＣＲ
を「ヘルパー非対称ＰＣＲ」とも称することとする。次
に、得られた長さの異なる２つの増幅核酸配列をハイブ
リダイゼーション（アニーリング）させ（ｃ）、端部に
１本鎖配列を有するハイブリッド核酸とする。
およびプライマーＣを用いて増幅する（ａ）核酸配列よ
りも短くなるように、図２に示す位置で相補的な配列を
有する（アニーリングする）プライマーＡおよびプライ
マーＣを用いて、非対称ＰＣＲにより選択的に増幅を行
う（ｂ）。なお本明細書中にて、（ｂ）の非対称ＰＣＲ
を「ヘルパー非対称ＰＣＲ」とも称することとする。次
に、得られた長さの異なる２つの増幅核酸配列をハイブ
リダイゼーション（アニーリング）させ（ｃ）、端部に
１本鎖配列を有するハイブリッド核酸とする。
【００１５】そして、このハイブリッド核酸と、このハ
イブリッド核酸の１本鎖配列領域に相補性を有する配列
からなる蛍光標識（ＦＩＴＣなどの）プローブとを、蛍
光偏光度を測定しながらハイブリダイゼーションさせ
る。この段階の蛍光偏光度の変化を経時的に測定するこ
とにより、目的とする配列を有する核酸を感度良く迅速
に測定することができる。
イブリッド核酸の１本鎖配列領域に相補性を有する配列
からなる蛍光標識（ＦＩＴＣなどの）プローブとを、蛍
光偏光度を測定しながらハイブリダイゼーションさせ
る。この段階の蛍光偏光度の変化を経時的に測定するこ
とにより、目的とする配列を有する核酸を感度良く迅速
に測定することができる。
【００１６】本発明でいう核酸とは、一般的にＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）を示
す。非対称増幅法とは、２本鎖からなる複製元の核酸
の、ある１本鎖側の配列のみを選択的に増幅するか、あ
る１本鎖側の配列を他の１本鎖側の配列よりも多くなる
ように増幅する方法である。
（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）を示
す。非対称増幅法とは、２本鎖からなる複製元の核酸
の、ある１本鎖側の配列のみを選択的に増幅するか、あ
る１本鎖側の配列を他の１本鎖側の配列よりも多くなる
ように増幅する方法である。
【００１７】通常のＰＣＲでは、測定試料に２種類のプ
ライマーを等量添加し、ＤＮＡの複製反応を連鎖的に行
う。通常、複製元のＤＮＡは２本鎖であるため、複製さ
れるＤＮＡもほとんどは２本鎖となる。これに対し、非
対称増幅法によると、２種類のプライマーのうちの１種
のみを添加するか、あるいは、２種類のプライマーのう
ち１種のプライマーの量をもう１種のプライマーの量よ
り多く添加して行う（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85(1988) 7652-7656 参照）。一例として、２種類
のプライマーの量を２〜１０倍の比率で変化させること
で、非対称増幅法を行うことが好ましい。
ライマーを等量添加し、ＤＮＡの複製反応を連鎖的に行
う。通常、複製元のＤＮＡは２本鎖であるため、複製さ
れるＤＮＡもほとんどは２本鎖となる。これに対し、非
対称増幅法によると、２種類のプライマーのうちの１種
のみを添加するか、あるいは、２種類のプライマーのう
ち１種のプライマーの量をもう１種のプライマーの量よ
り多く添加して行う（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85(1988) 7652-7656 参照）。一例として、２種類
のプライマーの量を２〜１０倍の比率で変化させること
で、非対称増幅法を行うことが好ましい。
【００１８】核酸を測定する方法としては、下記具体例
がある。 Ａ．（１）蛍光標識された１本鎖核酸プローブを（２）
試料と混合し、２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形
成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、試料
中の核酸に存在する、上記１本鎖核酸プローブに相補的
に対応する塩基配列を測定する方法。
がある。 Ａ．（１）蛍光標識された１本鎖核酸プローブを（２）
試料と混合し、２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形
成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、試料
中の核酸に存在する、上記１本鎖核酸プローブに相補的
に対応する塩基配列を測定する方法。
【００１９】Ｂ．（１）試料中の測定対象核酸および
（２）該測定対象核酸と相同な塩基配列を有する蛍光標
識された１本鎖核酸プローブを、（３）該測定対象核酸
と相補的な塩基配列を含む核酸を固定化担体に結合させ
た固定化試薬に対して競合させて、２本鎖ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中の核酸に存在する、上記１本鎖核酸プ
ローブに対応する塩基配列を測定する方法。
（２）該測定対象核酸と相同な塩基配列を有する蛍光標
識された１本鎖核酸プローブを、（３）該測定対象核酸
と相補的な塩基配列を含む核酸を固定化担体に結合させ
た固定化試薬に対して競合させて、２本鎖ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中の核酸に存在する、上記１本鎖核酸プ
ローブに対応する塩基配列を測定する方法。
【００２０】Ｃ．（１）試料中の測定対象核酸および
（２）試料中の測定対象核酸と相同な塩基配列を有する
核酸を固定化担体に結合させた固定化試薬を、（３）検
体中の測定対象核酸と相補的な塩基配列を有する蛍光標
識された核酸プローブに対して競合させて、２本鎖ＤＮ
ＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍
光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度の変化を測定し
て、試料中の核酸に存在する、該核酸プローブに相補的
に対応する塩基配列を測定する方法。
（２）試料中の測定対象核酸と相同な塩基配列を有する
核酸を固定化担体に結合させた固定化試薬を、（３）検
体中の測定対象核酸と相補的な塩基配列を有する蛍光標
識された核酸プローブに対して競合させて、２本鎖ＤＮ
ＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍
光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度の変化を測定し
て、試料中の核酸に存在する、該核酸プローブに相補的
に対応する塩基配列を測定する方法。
【００２１】本発明において使用する蛍光標識として
は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネートなどがある。核酸に蛍光物質を結合させる方法と
しては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合によ
るものがある。例えばオリゴＤＮＡをホスホアミダイト
法によって合成し、蛍光標識、例えばＦＩＴＣを標識す
る。本発明に使用する蛍光標識試薬としては、塩基数は
２０ないし３０塩基程度あれば、ある特定の遺伝子を特
異的に検出できる（たとえば、Eur. J. Clin. Microbio
l. Infect, Dis., 10 (1991) 1048-1055 ; Nei, M. a
nd Li, W. H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76(197
9), 5269-5273 参照）。
は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネートなどがある。核酸に蛍光物質を結合させる方法と
しては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合によ
るものがある。例えばオリゴＤＮＡをホスホアミダイト
法によって合成し、蛍光標識、例えばＦＩＴＣを標識す
る。本発明に使用する蛍光標識試薬としては、塩基数は
２０ないし３０塩基程度あれば、ある特定の遺伝子を特
異的に検出できる（たとえば、Eur. J. Clin. Microbio
l. Infect, Dis., 10 (1991) 1048-1055 ; Nei, M. a
nd Li, W. H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76(197
9), 5269-5273 参照）。
【００２２】本発明における蛍光偏光法の測定感度は、
長さの異なる２つの増幅核酸配列をハイブリダイゼーシ
ョン（アニーリング）させたものと蛍光標識（ＦＩＴ
Ｃ）プローブとを混合してハイブリダイゼーションさせ
る際の、蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃度に依
存する。蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃度が大
き過ぎると、標的ＤＮＡの初期濃度との関係から、未ハ
イブリダイゼーションプローブの画分が平衡で極めて高
くなり、蛍光偏光度の相対的な増加が小さすぎて測定で
きない。また、蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃
度が小さ過ぎると、蛍光偏光度の測定における感度が小
さくなり測定が不可能となる。この蛍光標識（ＦＩＴ
Ｃ）プローブの初期濃度としては、１０-9〜１０-7Ｍで
あることが好ましい。このことについては、後に示す実
施例により証明する。
長さの異なる２つの増幅核酸配列をハイブリダイゼーシ
ョン（アニーリング）させたものと蛍光標識（ＦＩＴ
Ｃ）プローブとを混合してハイブリダイゼーションさせ
る際の、蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃度に依
存する。蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃度が大
き過ぎると、標的ＤＮＡの初期濃度との関係から、未ハ
イブリダイゼーションプローブの画分が平衡で極めて高
くなり、蛍光偏光度の相対的な増加が小さすぎて測定で
きない。また、蛍光標識（ＦＩＴＣ）プローブの初期濃
度が小さ過ぎると、蛍光偏光度の測定における感度が小
さくなり測定が不可能となる。この蛍光標識（ＦＩＴ
Ｃ）プローブの初期濃度としては、１０-9〜１０-7Ｍで
あることが好ましい。このことについては、後に示す実
施例により証明する。
【００２３】また、本発明における蛍光偏光法の測定感
度は、ＮａＣｌ濃度にも依存する。Ｎａ+ イオン濃度が
高くなるほど、ＤＮＡハイブリダイゼーションが促進さ
れるとが知られている。しかしＮａＣｌ濃度が高くなる
と、これに伴いＮａＣｌを含む溶液も高粘度になる。蛍
光標識（ＦＩＴＣ）プローブの旋回移動は、高粘度溶液
で制限されるため、蛍光偏光法を用いた測定を行う場合
には、ＮａＣｌ濃度に上限がある。よって、このＮａＣ
ｌ濃度としては、０．１５〜３Ｍであることが好まし
い。このことについては、後に示す実施例により証明す
る。本発明における試料中の核酸としては、例えば血
清、尿、各種培養液などの測定試料における細菌、ウイ
ルスなどの核酸、または組織細胞やそれらの遊離核酸な
どがある。試料中の核酸と蛍光標識試薬とのハイブリダ
イゼーション反応を行う緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝
液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などがある。該緩衝
液には無機酸塩または有機酸塩のほかに、アジ化ナトリ
ウムやＥＤＴＡ等を含んでいてもよい。
度は、ＮａＣｌ濃度にも依存する。Ｎａ+ イオン濃度が
高くなるほど、ＤＮＡハイブリダイゼーションが促進さ
れるとが知られている。しかしＮａＣｌ濃度が高くなる
と、これに伴いＮａＣｌを含む溶液も高粘度になる。蛍
光標識（ＦＩＴＣ）プローブの旋回移動は、高粘度溶液
で制限されるため、蛍光偏光法を用いた測定を行う場合
には、ＮａＣｌ濃度に上限がある。よって、このＮａＣ
ｌ濃度としては、０．１５〜３Ｍであることが好まし
い。このことについては、後に示す実施例により証明す
る。本発明における試料中の核酸としては、例えば血
清、尿、各種培養液などの測定試料における細菌、ウイ
ルスなどの核酸、または組織細胞やそれらの遊離核酸な
どがある。試料中の核酸と蛍光標識試薬とのハイブリダ
イゼーション反応を行う緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝
液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などがある。該緩衝
液には無機酸塩または有機酸塩のほかに、アジ化ナトリ
ウムやＥＤＴＡ等を含んでいてもよい。
【００２４】本発明に使用する担体としては、ポリスチ
レン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ、Ａｇなどの金属粒子などが挙
げられる。またタンパク質などの高分子物質を用いるこ
ともできる。固定化体担体の分子量は、蛍光偏光法の原
理に基づき、相補核酸の分子量が蛍光標識核酸の分子量
に対して十分に大きくなるように選択される。固定化担
体の分子量は蛍光標識核酸の分子量よりも５倍以上であ
ることが好ましい。核酸を固定化担体に結合させる方法
としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビオチンと
の特異的結合を利用する方法などがある。
レン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ、Ａｇなどの金属粒子などが挙
げられる。またタンパク質などの高分子物質を用いるこ
ともできる。固定化体担体の分子量は、蛍光偏光法の原
理に基づき、相補核酸の分子量が蛍光標識核酸の分子量
に対して十分に大きくなるように選択される。固定化担
体の分子量は蛍光標識核酸の分子量よりも５倍以上であ
ることが好ましい。核酸を固定化担体に結合させる方法
としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビオチンと
の特異的結合を利用する方法などがある。
【００２５】以下に蛍光偏光測定の原理について簡単に
説明すると、光源から出る光はフィルターによって試薬
に含まれる蛍光物質の励起波長に濾過され、偏光板によ
って直線偏光とされる。この励起波長の偏光は測定物質
（サンプル）を入れたセルに投射され、サンプル中の蛍
光物質を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じ
た波長の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさ
に対応して、該蛍光は偏光面の分散を起こす。該蛍光は
その波長を透過するフィルターを透過し、偏光板を透過
し、光検知器によって電気信号に変換される。偏光板を
回転することにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光
と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂ
を求める。これらの値を用いて、次に示す数式（Ｉ）で
測定物質の蛍光偏光度Ｐが求められる。
説明すると、光源から出る光はフィルターによって試薬
に含まれる蛍光物質の励起波長に濾過され、偏光板によ
って直線偏光とされる。この励起波長の偏光は測定物質
（サンプル）を入れたセルに投射され、サンプル中の蛍
光物質を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じ
た波長の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさ
に対応して、該蛍光は偏光面の分散を起こす。該蛍光は
その波長を透過するフィルターを透過し、偏光板を透過
し、光検知器によって電気信号に変換される。偏光板を
回転することにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光
と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂ
を求める。これらの値を用いて、次に示す数式（Ｉ）で
測定物質の蛍光偏光度Ｐが求められる。
【００２６】
【数１】
【００２７】Ｉａは励起偏光と同じ向きの偏光成分を示
す。Ｉｂは上記Ｉａに垂直な偏光成分を示す。この場
合、蛍光物質または蛍光物質を結合する物質のブラウン
運動が激しいほど、励起偏光と垂直な向きの偏光成分Ｉ
ｂは大きく、同時にこれと平行の偏光成分Ｉａは小さく
なり、したがってＰは小さくなる。
す。Ｉｂは上記Ｉａに垂直な偏光成分を示す。この場
合、蛍光物質または蛍光物質を結合する物質のブラウン
運動が激しいほど、励起偏光と垂直な向きの偏光成分Ｉ
ｂは大きく、同時にこれと平行の偏光成分Ｉａは小さく
なり、したがってＰは小さくなる。
【００２８】本発明では、サンプルセルに蛍光標識（蛍
光標識相補）核酸を含む溶液を入れ、測定対象核酸を含
む溶液を加え、続いて必要により固定化相補（固定化）
核酸断片を含む溶液を加える。ただし、これらの２（必
要により３種）の溶液を加える順序は限定しない。しか
し試料中の核酸と蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーシ
ョン反応を行わせるに際し、蛍光標識試薬の混合前、同
時あるいは混合後に、無機酸塩または有機酸塩を添加す
る。加える蛍光標識核酸および固定化核酸（必要によ
り）の濃度は、測定対象核酸の測定濃度範囲に応じて適
切に選択される。
光標識相補）核酸を含む溶液を入れ、測定対象核酸を含
む溶液を加え、続いて必要により固定化相補（固定化）
核酸断片を含む溶液を加える。ただし、これらの２（必
要により３種）の溶液を加える順序は限定しない。しか
し試料中の核酸と蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーシ
ョン反応を行わせるに際し、蛍光標識試薬の混合前、同
時あるいは混合後に、無機酸塩または有機酸塩を添加す
る。加える蛍光標識核酸および固定化核酸（必要によ
り）の濃度は、測定対象核酸の測定濃度範囲に応じて適
切に選択される。
【００２９】また本発明においては、蛍光標識（蛍光標
識相補）核酸は、測定対象の核酸に特異的に結合させる
ために用いられるのであり、同様に、核酸に対して特異
的に結合する性質を有する物質、例えばＰＮＡ（peptid
e nucleic acid, PerSeptiveBiosystems, U.S.A.)等に
蛍光物質を標識し、これを蛍光標識核酸の代替として用
いることも原理的に可能である。ただし、蛍光偏光法は
蛍光偏光解消法とよばれることがあるが、事実上同じ方
法を意味すると考えてよい。また、多くの場合それぞれ
の指標として用いられる蛍光偏光度および蛍光偏光解消
度に関しても同様である。
識相補）核酸は、測定対象の核酸に特異的に結合させる
ために用いられるのであり、同様に、核酸に対して特異
的に結合する性質を有する物質、例えばＰＮＡ（peptid
e nucleic acid, PerSeptiveBiosystems, U.S.A.)等に
蛍光物質を標識し、これを蛍光標識核酸の代替として用
いることも原理的に可能である。ただし、蛍光偏光法は
蛍光偏光解消法とよばれることがあるが、事実上同じ方
法を意味すると考えてよい。また、多くの場合それぞれ
の指標として用いられる蛍光偏光度および蛍光偏光解消
度に関しても同様である。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。なお、本実施例では、１９９６年に日本国内で大
きな集団感染を引き起こした、Ｏ−１５７を中心とする
病原性大腸菌（Ｖｅｒｏ毒素（ＶＴ２）生産菌）の迅速
測定のために使用することを試みた。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。なお、本実施例では、１９９６年に日本国内で大
きな集団感染を引き起こした、Ｏ−１５７を中心とする
病原性大腸菌（Ｖｅｒｏ毒素（ＶＴ２）生産菌）の迅速
測定のために使用することを試みた。
【００３１】検体試料としては、大阪大学の微生物病研
究所（大阪、日本）から入手した、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ
７株を用いた。このＯ１５７：Ｈ７株を、１．５リット
ルのスケールで一晩培養した。細胞を、遠心分離により
集めた。この細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）及びプロテアーゼＫにより破砕した。ゲノムＤＮＡ
を、フェノール抽出とエタノール沈澱により精製し、１
００℃にて熱処理し、１本鎖ＤＮＡとした。
究所（大阪、日本）から入手した、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ
７株を用いた。このＯ１５７：Ｈ７株を、１．５リット
ルのスケールで一晩培養した。細胞を、遠心分離により
集めた。この細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）及びプロテアーゼＫにより破砕した。ゲノムＤＮＡ
を、フェノール抽出とエタノール沈澱により精製し、１
００℃にて熱処理し、１本鎖ＤＮＡとした。
【００３２】オリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、Ｃ
及びプローブ配列を、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７由来のベロ
トキシン２型（ＶＴ２）遺伝子として、Z. Lin et al.
Microbial. Immunol. 37(1993) 451-459. T. Karasaw
a, T. Inouo, S. に公開されているヌクレオチド配列
に基づいて合成した。プライマーＡの配列は配列表の配
列番号１に、プライマーＢの配列は同表の配列番号２
に、プライマーＣの配列は同配列番号３に、プローブ配
列は同配列番号４にそれぞれ示す。なおプローブはその
５’末端をＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネー
ト）で標識した。
及びプローブ配列を、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７由来のベロ
トキシン２型（ＶＴ２）遺伝子として、Z. Lin et al.
Microbial. Immunol. 37(1993) 451-459. T. Karasaw
a, T. Inouo, S. に公開されているヌクレオチド配列
に基づいて合成した。プライマーＡの配列は配列表の配
列番号１に、プライマーＢの配列は同表の配列番号２
に、プライマーＣの配列は同配列番号３に、プローブ配
列は同配列番号４にそれぞれ示す。なおプローブはその
５’末端をＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネー
ト）で標識した。
【００３３】前記の変性した１本鎖ＤＮＡ試料を、プラ
イマーＢ及びプライマーＣ（プライマーＢ／プライマー
Ｃ比＝１：５０）を用いて非対称ＰＣＲ反応を行った。
なおこのプライマーＢ及びプライマーＣを用いての非対
称ＰＣＲ反応を「ＢＣ非対称ＰＣＲ」と定義した。この
ＢＣ非対称ＰＣＲは、以下の通りの反応溶液を用いて実
施した。２．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）；５０ｍＭＫＣｌ；鋳型ＤＮＡ ２
０ｎｇ；０．２ｍＭ（各々）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ及びｄＴＴＰ；０．０１μＭプライマーＢ、０．５
μＭプライマーＣ；ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（寳酒造（株）製）２．５Ｕを含有する１００μｌ容の
水溶液。
イマーＢ及びプライマーＣ（プライマーＢ／プライマー
Ｃ比＝１：５０）を用いて非対称ＰＣＲ反応を行った。
なおこのプライマーＢ及びプライマーＣを用いての非対
称ＰＣＲ反応を「ＢＣ非対称ＰＣＲ」と定義した。この
ＢＣ非対称ＰＣＲは、以下の通りの反応溶液を用いて実
施した。２．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）；５０ｍＭＫＣｌ；鋳型ＤＮＡ ２
０ｎｇ；０．２ｍＭ（各々）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ及びｄＴＴＰ；０．０１μＭプライマーＢ、０．５
μＭプライマーＣ；ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（寳酒造（株）製）２．５Ｕを含有する１００μｌ容の
水溶液。
【００３４】前記のＢＣ非対称ＰＣＲとは別に、前記の
変性した１本鎖ＤＮＡ試料を、プライマーＡ及びプライ
マーＣ（プライマーＡ／プライマーＣ比＝５０：１）を
用いて非対称ＰＣＲ反応を行った。なおこのプライマー
Ａ及びプライマーＣを用いての非対称ＰＣＲ反応を「ヘ
ルパー非対称ＰＣＲ」と定義した。このヘルパー非対称
ＰＣＲは、プライマーＡ及びプライマーＣをそれぞれ
０．５μＭ及び０．０１μＭとした以外は、前記ＢＣ非
対称ＰＣＲと同様の組成の反応溶液を用いて実施した。
変性した１本鎖ＤＮＡ試料を、プライマーＡ及びプライ
マーＣ（プライマーＡ／プライマーＣ比＝５０：１）を
用いて非対称ＰＣＲ反応を行った。なおこのプライマー
Ａ及びプライマーＣを用いての非対称ＰＣＲ反応を「ヘ
ルパー非対称ＰＣＲ」と定義した。このヘルパー非対称
ＰＣＲは、プライマーＡ及びプライマーＣをそれぞれ
０．５μＭ及び０．０１μＭとした以外は、前記ＢＣ非
対称ＰＣＲと同様の組成の反応溶液を用いて実施した。
【００３５】非対称ＰＣＲ法の条件を以下に示す。 １．使用機器 PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9600, MicroAmp Rea
ction Tube(0.2ml) ２．ＰＣＲ反応サイクル ９４℃、１分間の熱変性により増幅対象ＤＮＡの１本鎖
化を行い、次いで下記の〜の操作を４０サイクル行
った後、氷冷（４℃）した。 熱変性による１本鎖化；９４℃，１分間、 プライマーの増幅対象ＤＮＡへのアニーリング；５８
℃，１分間、 Taq ポリメラーゼによるＤＮＡの伸長；７２℃，１分
間、 なお、４０サイクル目では、Taq ポリメラーゼによるＤ
ＮＡの伸長を７２℃，５分間とした。
ction Tube(0.2ml) ２．ＰＣＲ反応サイクル ９４℃、１分間の熱変性により増幅対象ＤＮＡの１本鎖
化を行い、次いで下記の〜の操作を４０サイクル行
った後、氷冷（４℃）した。 熱変性による１本鎖化；９４℃，１分間、 プライマーの増幅対象ＤＮＡへのアニーリング；５８
℃，１分間、 Taq ポリメラーゼによるＤＮＡの伸長；７２℃，１分
間、 なお、４０サイクル目では、Taq ポリメラーゼによるＤ
ＮＡの伸長を７２℃，５分間とした。
【００３６】前記ＢＣ非対称ＰＣＲおよびヘルパー非対
称ＰＣＲによる各核酸増幅産物溶液を等量づつ採って混
合し、９５℃で１０分間加熱し、室温までゆっくりと冷
却した。ＴＥ緩衝液（５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１００
μｌとＦＩＴＣプローブ１００μｌとを、この核酸増幅
産物混合溶液３００μｌに添加し、その溶液の蛍光偏光
度を測定した。なお、蛍光偏光度の測定は、路長３ｍｍ
のキュベットにおいて試料５００μｌを用いて４０℃で
実施した。励起波長は４７０ｎｍであり、発光を５２０
ｎｍでモニターした。蛍光偏光度Ｐは、前記数式（Ｉ）
の定義に従う。
称ＰＣＲによる各核酸増幅産物溶液を等量づつ採って混
合し、９５℃で１０分間加熱し、室温までゆっくりと冷
却した。ＴＥ緩衝液（５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１００
μｌとＦＩＴＣプローブ１００μｌとを、この核酸増幅
産物混合溶液３００μｌに添加し、その溶液の蛍光偏光
度を測定した。なお、蛍光偏光度の測定は、路長３ｍｍ
のキュベットにおいて試料５００μｌを用いて４０℃で
実施した。励起波長は４７０ｎｍであり、発光を５２０
ｎｍでモニターした。蛍光偏光度Ｐは、前記数式（Ｉ）
の定義に従う。
【００３７】〔実施例１〕本発明の方法の最適条件を確
立するために、蛍光偏光度の測定の際の、蛍光標識（Ｆ
ＩＴＣ）プローブの初期濃度の適正値を検討した。３種
の異なる初期濃度（１０-9Ｍ、１０-8Ｍ及び１０-7Ｍ）
のＦＩＴＣプローブを使用し、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏
光度の変化ΔＰとの関係から、ＦＩＴＣプローブ初期濃
度の蛍光偏光度の変化ΔＰに対する影響を観察した。結
果をそれぞれ図３、図４、図５に示す。本測定条件で
は、ＦＩＴＣプローブの初期濃度が１０-9Ｍでは、低す
ぎるため、標的ＤＮＡを検出できないことが判明した。
ＦＩＴＣプローブの初期濃度が１０-7Ｍでは、信頼性の
ある感度が得られるのは、標的ＤＮＡ濃度１０-7Ｍが検
出限界であり、ＰＣＲ産物を検出できない。したがっ
て、１０-8Ｍ ＦＩＴＣプローブを、最適条件として選
択した。
立するために、蛍光偏光度の測定の際の、蛍光標識（Ｆ
ＩＴＣ）プローブの初期濃度の適正値を検討した。３種
の異なる初期濃度（１０-9Ｍ、１０-8Ｍ及び１０-7Ｍ）
のＦＩＴＣプローブを使用し、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏
光度の変化ΔＰとの関係から、ＦＩＴＣプローブ初期濃
度の蛍光偏光度の変化ΔＰに対する影響を観察した。結
果をそれぞれ図３、図４、図５に示す。本測定条件で
は、ＦＩＴＣプローブの初期濃度が１０-9Ｍでは、低す
ぎるため、標的ＤＮＡを検出できないことが判明した。
ＦＩＴＣプローブの初期濃度が１０-7Ｍでは、信頼性の
ある感度が得られるのは、標的ＤＮＡ濃度１０-7Ｍが検
出限界であり、ＰＣＲ産物を検出できない。したがっ
て、１０-8Ｍ ＦＩＴＣプローブを、最適条件として選
択した。
【００３８】〔実施例２〕本発明の方法の最適条件を確
立するために、蛍光偏光度の測定の際の、ＮａＣｌ濃度
の適正値を検討した。前記蛍光偏光度を測定する際、溶
液のＮａＣｌ濃度を変化させたΔＰ（蛍光偏光度の変
化）に対する影響をそれぞれ、図６に示す。図６の実験
結果から、蛍光偏光度の変化ΔＰはＮａＣｌ濃度の増加
とともに増加し、約１Ｍ ＮａＣｌで最大となった。し
かしながら、ＦＩＴＣプローブの旋回移動は、高粘度溶
液では制限された。蛍光偏光度は、溶液粘度によっても
影響される。高ＮａＣｌ濃度で、蛍光偏光度は高かった
が、ハイブリダイゼーション後の実効体積変化により生
じる蛍光偏光度の相対的増加はより小さい。したがっ
て、蛍光偏光度ΔＰの変化には、最大値がある。
立するために、蛍光偏光度の測定の際の、ＮａＣｌ濃度
の適正値を検討した。前記蛍光偏光度を測定する際、溶
液のＮａＣｌ濃度を変化させたΔＰ（蛍光偏光度の変
化）に対する影響をそれぞれ、図６に示す。図６の実験
結果から、蛍光偏光度の変化ΔＰはＮａＣｌ濃度の増加
とともに増加し、約１Ｍ ＮａＣｌで最大となった。し
かしながら、ＦＩＴＣプローブの旋回移動は、高粘度溶
液では制限された。蛍光偏光度は、溶液粘度によっても
影響される。高ＮａＣｌ濃度で、蛍光偏光度は高かった
が、ハイブリダイゼーション後の実効体積変化により生
じる蛍光偏光度の相対的増加はより小さい。したがっ
て、蛍光偏光度ΔＰの変化には、最大値がある。
【００３９】〔実施例３〕本発明の方法を用いて、大腸
菌Ｏ１５７：Ｈ７とＶＴ２遺伝子を持たない大腸菌ＪＭ
１０９株の検出の有無を確認した。なお比較例として、
ＢＣ非対称ＰＣＲ法のみと、プライマーＢ及びＣを用い
た通常の対称ＰＣＲ増幅法も併せて行った。なお、蛍光
偏光度測定時のＦＩＴＣプローブ濃度は１０-8Ｍ、Ｎａ
Ｃｌ濃度は１Ｍとした。プライマーＢ及びＣを用いた通
常の対称ＰＣＲ増幅法においては、反応溶液のプライマ
ーＢ及びＣを各０．５μＭとし、ＰＣＲサイクルを３０
サイクルとした以外は、ＢＣ非対称ＰＣＲと同様に行っ
た。結果を図７に示す。
菌Ｏ１５７：Ｈ７とＶＴ２遺伝子を持たない大腸菌ＪＭ
１０９株の検出の有無を確認した。なお比較例として、
ＢＣ非対称ＰＣＲ法のみと、プライマーＢ及びＣを用い
た通常の対称ＰＣＲ増幅法も併せて行った。なお、蛍光
偏光度測定時のＦＩＴＣプローブ濃度は１０-8Ｍ、Ｎａ
Ｃｌ濃度は１Ｍとした。プライマーＢ及びＣを用いた通
常の対称ＰＣＲ増幅法においては、反応溶液のプライマ
ーＢ及びＣを各０．５μＭとし、ＰＣＲサイクルを３０
サイクルとした以外は、ＢＣ非対称ＰＣＲと同様に行っ
た。結果を図７に示す。
【００４０】本発明法、非対称ＰＣＲ増幅法（ＢＣ非対
称ＰＣＲのみ）、通常対称ＰＣＲ増幅法のいずれも、Ｈ
７由来試料には確実に応答し、ＪＭ１０９由来試料には
応答しなかった。その中でも本発明の方法は、通常の対
称ＰＣＲ増幅法とＢＣ非対称ＰＣＲ法のみと比較して、
蛍光偏光度の相対的増加ΔＰが極めて大きかった。
称ＰＣＲのみ）、通常対称ＰＣＲ増幅法のいずれも、Ｈ
７由来試料には確実に応答し、ＪＭ１０９由来試料には
応答しなかった。その中でも本発明の方法は、通常の対
称ＰＣＲ増幅法とＢＣ非対称ＰＣＲ法のみと比較して、
蛍光偏光度の相対的増加ΔＰが極めて大きかった。
【００４１】また、ヘルパー非対称ＰＣＲにより生成す
る一本鎖ＤＮＡの別の重要な役割は、ＢＣ非対称ＰＣＲ
により生成する一本鎖ＤＮＡ中のプローブ相補配列を含
有しない配列部へのハイブリダイゼーションであると考
えられる。このハイブリダイゼーションにより、非対称
ＰＣＲからの一本鎖ＤＮＡが自己ハイブリダイゼーショ
ンし、プローブの相補配列を含有する配列部をマスクす
るのを防止するものと考えられる。なお、本発明の核酸
測定方法は、試料からの核酸精製、核酸増幅、蛍光偏光
度測定の工程を含め、所要時間が４時間以内と、非常に
迅速に行えるものである。
る一本鎖ＤＮＡの別の重要な役割は、ＢＣ非対称ＰＣＲ
により生成する一本鎖ＤＮＡ中のプローブ相補配列を含
有しない配列部へのハイブリダイゼーションであると考
えられる。このハイブリダイゼーションにより、非対称
ＰＣＲからの一本鎖ＤＮＡが自己ハイブリダイゼーショ
ンし、プローブの相補配列を含有する配列部をマスクす
るのを防止するものと考えられる。なお、本発明の核酸
測定方法は、試料からの核酸精製、核酸増幅、蛍光偏光
度測定の工程を含め、所要時間が４時間以内と、非常に
迅速に行えるものである。
【００４２】
【発明の効果】本発明に基づく測定方法によれば、微生
物、細胞やその他の試料に含まれる核酸を特異的かつ迅
速に測定することが可能となり、微生物の検査、臨床診
断、その他の検査や研究等に有益な情報を得ることがで
きる。特に、１９９６年夏、社会的問題となった、Ｏ−
１５７を中心とする病原性大腸菌（Ｖｅｒｏ毒素生産
菌）等の迅速かつ正確な検知に利用できる。
物、細胞やその他の試料に含まれる核酸を特異的かつ迅
速に測定することが可能となり、微生物の検査、臨床診
断、その他の検査や研究等に有益な情報を得ることがで
きる。特に、１９９６年夏、社会的問題となった、Ｏ−
１５７を中心とする病原性大腸菌（Ｖｅｒｏ毒素生産
菌）等の迅速かつ正確な検知に利用できる。
【００４３】
【配列表】 配列番号： 1 配列の長さ：21 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTGTCCGTTG TCATGGAAAC C 21
【００４４】 配列番号： 2 配列の長さ：21 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAACGTTCCA GCGCTGCGAC A 21
【００４５】 配列番号： 3 配列の長さ：21 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCCGGGTTCG TTAATACGGC A 21
【００４６】 配列番号： 4 配列の長さ：21 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGTTGCAGAG TGGTATAACT G 21
【図１】本発明の方法の概略を示す図。
【図２】本発明の方法に用いるプライマーおよびプロー
ブの、標的核酸に対するアニーリング位置を示す図。
ブの、標的核酸に対するアニーリング位置を示す図。
【図３】実施例１における、蛍光標識プローブ濃度を１
０-7Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
０-7Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
【図４】実施例１における、蛍光標識プローブ濃度が１
０-8Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
０-8Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
【図５】実施例１における、蛍光標識プローブ濃度が１
０-9Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
０-9Ｍとした場合の、標的ＤＮＡ濃度と蛍光偏光度の変
化ΔＰとの関係を表すグラフ。
【図６】実施例２における、ＮａＣｌ濃度と蛍光偏光度
の変化ΔＰとの関係を表すグラフ。
の変化ΔＰとの関係を表すグラフ。
【図７】実施例３における、本発明方法と他の方法の検
出感度を比較したグラフ。
出感度を比較したグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 鶴岡 誠 広島県広島市安佐南区大塚西６丁目11−２ −608号 (72)発明者 軽部 征夫 神奈川県川崎市宮前区東有馬１−３−16 (72)発明者 橋本 邦彦 広島県広島市西区三篠町２丁目２番８号 西川ゴム工業株式会社内
Claims (6)
- 【請求項１】 試料中の核酸を遺伝子増幅し、該増幅産
物中の核酸量を蛍光偏光法によって測定する方法におい
て、 試料中の２本鎖からなる核酸の一方の１本鎖配列を、プ
ライマーＢおよびプライマーＣを用いる非対称ＰＣＲに
より選択的に増幅し、 他方の１本鎖配列を、プライマーＢおよびプライマーＣ
を用いて増幅する配列よりも短くなるように、プライマ
ーＡおよびプライマーＣを用いる非対称ＰＣＲにより選
択的に増幅し、 得られた長さの異なる２つの増幅核酸配列をハイブリダ
イゼーションさせて、端部に１本鎖配列を有するハイブ
リッド核酸とし、 該ハイブリッド核酸と、該ハイブリッド核酸の１本鎖配
列領域に対して完全にまたは部分的に相補性を有する配
列からなる蛍光標識プローブとを、蛍光偏光度を測定し
ながらハイブリダイゼーションさせることを特徴とする
核酸の測定方法。 - 【請求項２】 前記蛍光偏光度の測定時における蛍光標
識プローブの初期濃度が１０-9〜１０-7Ｍであることを
特徴とする請求項１記載の核酸の測定方法。 - 【請求項３】 前記蛍光偏光度の測定時におけるＮａＣ
ｌ濃度が０．１５〜３Ｍであることを特徴とする請求項
１記載の核酸の測定方法。 - 【請求項４】 蛍光標識プローブの蛍光標識がＦＩＴＣ
（フルオレセインイソチオシアネート）もしくはフルオ
レセインであることを特徴とする請求項１または２記載
の核酸の測定方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかの方法を用いる
Ｖｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。 - 【請求項６】 プライマーＡが配列表の配列番号１に示
す配列を有するオリゴヌクレオチドであり、プライマー
Ｂが同配列番号２に示す配列を有するオリゴヌクレオチ
ドであり、プライマーＣが同配列番号３に示す配列を有
するオリゴヌクレオチドであり、蛍光標識プローブが同
配列番号４に示す配列を有するものであることを特徴と
する請求項５記載のＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10143197A JPH11332597A (ja) | 1998-05-25 | 1998-05-25 | 核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10143197A JPH11332597A (ja) | 1998-05-25 | 1998-05-25 | 核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11332597A true JPH11332597A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=15333139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10143197A Pending JPH11332597A (ja) | 1998-05-25 | 1998-05-25 | 核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11332597A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006021131A1 (fr) * | 2004-08-26 | 2006-03-02 | Capitalbio Corporation | Amplification acp asymétrique, ses amorce et application spéciales |
-
1998
- 1998-05-25 JP JP10143197A patent/JPH11332597A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006021131A1 (fr) * | 2004-08-26 | 2006-03-02 | Capitalbio Corporation | Amplification acp asymétrique, ses amorce et application spéciales |
| US8735067B2 (en) | 2004-08-26 | 2014-05-27 | Capitalbio Corporation | Asymmetric PCR amplification, its special primer and application |
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