CN115010919B - 一种聚多肽、基于该聚多肽的纳米开关及其制备方法和应用 - Google Patents
一种聚多肽、基于该聚多肽的纳米开关及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚多肽、基于该聚多肽的纳米开关及其制备方法和应用，本发明的聚多肽合理利用了不同二级结构柔顺性的差异，通过调控聚多肽的二级结构，调控柔顺性，进而调控聚多肽主链两端连接物的距离，通过在聚多肽C端和N端引入合适的受体分子和供体分子，在聚多肽侧链引入合适的响应性基团，设计了聚多肽纳米开关，从而实现了荧光的关闭与打开，并在合成高分子层面模拟了蛋白变构，为通过合成手段研究自然界中的生物过程提供了启发。
Description
技术领域
本发明涉及聚多肽技术领域，尤其涉及一种聚多肽、基于该聚多肽的纳米开关及其制备方法和应用。
背景技术
在自然界中，蛋白质通过参与细胞过程，发挥着重要功能，包括酶催化、物质转运以及信号转导等。蛋白质的多功能性源于其动态以及高度有序的多级结构，通过蛋白质的变构效应可对其活性进行有效调节，具体来说，蛋白质中聚多肽构象的变化会影响链柔顺性的变化，这些动态转变对于微调蛋白质的活性区域至关重要，可促进蛋白质与其他分子的相互作用。例如，钙调蛋白可通过结合钙离子，调节聚多肽链柔顺性的转变，使蛋白结构域发生分离，从而实现对多种相关酶的激活；酪氨酸激酶Abl通过SH2结构域与激酶结构域的结合与分离，调控细胞的增殖、分化以及凋亡等通路。这些蛋白被激活的本质都是其柔顺性可调的聚多肽链发生构象转变，进而导致蛋白变构造成的。然而，在合成化学体系中，通过调控链的柔顺性进而调控分子相互作用极具有挑战性。
聚多肽因其良好的生物相容性、生物降解性以及可调的二级结构，近年来备受关注。如通过电荷相互作用(Nat Commun,2011,2:206–209；Angew Chem Int Ed,2013,52:9182–9186；Angew Chem Int Ed,2017,56:10826–10829；Proc Natl Acad Sci USA,2017,114:12675–12680)、极性以及亲疏水性(J Am Chem Soc,2012,134:4112–4115；J Am ChemSoc,2014,136:5547–5550；J Am Chem Soc,2019,141:14530–14533；J Am Chem Soc,2018,140:6604–6610)、氢键(Nat Commun,2017,8:92)以及多重相互作用(J Am Chem Soc,2018,140:11992–12000)等，均可对聚多肽的二级结构进行有效调控，从而赋予其独特的生物功能，如降低材料的长时程毒性、选择性抗菌治疗以及基因和药物递送等。例如，Yin等设计了一种侧基含阳离子和光响应硝基苯基团的聚多肽，在紫外光的照射下硝基苯基团脱落，实现二级结构由α-螺旋到无规线团的转变。Song等通过调控侧链氢键供体-受体模式的变化，实现对聚多肽无规线团与α-螺旋结构的调控。基于聚多肽二级结构可调性以及与蛋白质的结构相似性，聚多肽材料可作为十分理想的候选物，用于在合成化学体系模拟蛋白质的变构调节，从而为聚多肽材料构效关系的研究提供新平台。
聚多肽是一种蛋白质的类似物，具有良好的生物相容性、生物降解性，并且同蛋白质一样，具有有序的二级结构，包括α-螺旋、β-折叠以及无规线团等。因此和其他高分子材料相比，其具有独特的性质，因此在药物递送、抗菌以及抗肿瘤免疫治疗等方面具有广泛的应用。近年来，对聚多肽的二级结构以及调控等方面的研究也越来越多，例如α-螺旋是刚性的棒状结构，α-螺旋聚多肽可通过“打孔”机制同细胞膜相互作用，从而进行穿膜基因或药物递送以及抗菌治疗等，而无规线团聚多肽为柔性结构，其穿膜效率较低。基于不同二级结构的差异，人们对聚多肽的二级结构以及不同二级结构在生物应用上的差异产生极大的兴趣。以上，尽管对聚多肽的研究日渐成熟，对其二级结构以及调控的生物应用也越来越多。但是对于二级结构本身性质(如柔顺性、长度)的研究仍较少。
除此之外，对于目前常见的基于荧光共振能量转移(FRET)效应的荧光探针，当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般小于10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱。在FRET的基础上，基于金纳米粒子的荧光探针也有广泛的研究。例如，在金纳米粒子和荧光分子之间连接有发卡DNA的荧光探针，在正常情况下，金纳米粒子和荧光分子的距离较近，荧光被金纳米粒子淬灭，而一旦被外界响应触发(如pH或酶)等，发卡DNA就会断裂，导致金纳米粒子和荧光分子的距离增大，荧光恢复。但上述荧光探针最大的缺陷就是所用的发卡DNA不稳定，在递送过程中可能会被体内的相关酶降解。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种聚多肽，并合理地利用了不同二级结构柔顺性的差异，通过调控聚多肽的二级结构，调控柔顺性，进而调控聚多肽主链两端连接物的距离，通过在聚多肽C端和N端引入合适的受体分子和供体分子，在聚多肽侧链引入合适的响应性基团，设计了聚多肽纳米开关，从而实现了荧光的关闭与打开，并在合成高分子层面模拟了蛋白变构，为通过合成手段研究自然界中的生物过程提供了启发。
本发明的第一个目的是提供一种聚多肽，包括聚多肽主链和聚多肽侧链，该聚多肽侧链上包括阳离子基团(R4)和阴离子基团(R5)，聚多肽的结构如式(I)-(IV)所示之一：
其中，R4为X为0-20个碳原子的亚烃基，R选自胺基、胍基或季铵基；
R5选自
n表示聚多肽的聚合度，优选为10-1000的整数，x为0.01-0.99。
进一步地，R4选自其中，R1、R2和R3独立地选自氢或非氢取代基，如甲基、乙基、丙基和丁基等烷基。
进一步地，聚多肽的结构如下所示之一：
本发明中，聚多肽主链可以衍生自天然氨基酸序列，也可以是通过人工合成的氨基酸序列。通常，所述聚多肽主链包括10-1000个氨基酸的残基，优选20-500个氨基酸的残基，更优选20-200个氨基酸的残基，最优选50-200个氨基酸的残基。
进一步地，所述氨基酸是天然存在的氨基酸及其衍生物，天然存在的氨基酸包括但不限于谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、色氨酸等，衍生物包括但不限于谷氨酸酯、丝氨酸脂以及同型半胱氨酸等。
进一步地，聚多肽主链可包括一种或多种氨基酸或其衍生物的残基。如包括两种氨基酸或其衍生物的残基、三种或四种氨基酸或其衍生物的残基。
进一步地，所述聚多肽主链可为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸苄酯)、聚(L-酪氨酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(L-丝氨酸)、聚(L-高丝氨酸)、聚(L-半胱氨酸)、聚(L-谷氨酸-γ-炔丙酯)、聚(γ-3-氯丙基-L-谷氨酸酯)或聚(γ-3-氯己基-L-谷氨酸酯)等。
本发明的第二个目的是提供上述聚多肽的制备方法，包括以下步骤：以胺、过渡金属引发剂、碱或氨基修饰的纳米粒子为引发剂，以N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或二氯甲烷和水的混合溶液为溶剂，将两种或两种以上式V所示的化合物(氨基酸或其衍生物的N-羧酸酐单体(NCA))通过开环聚合制备得到聚多肽主链，通过点击化学反应在聚多肽侧链接枝阳离子基团、通过磷酸化反应、酰胺化反应或酯化反应在聚多肽侧链接枝阴离子基团(其中，磷酸酯酶响应的聚多肽采用磷酸化反应，ROS响应的聚多肽采用酯化反应，pH响应的聚多肽采用酰胺化反应)，得到所述聚多肽；
其中，A为氨基酸或其衍生物。
进一步地，引发剂中，胺可为正丁胺、正己胺、炔丙胺、三乙胺以及己二胺等；过渡金属引发剂可为有机镍或有机钴等；碱可为六甲基二硅氮烷、六甲基二硅氮化锂以及碳酸氢钠等。
进一步地，所述的点击化学反应具体为Cu(I)催化的叠氮-炔基1,3-偶极环加成反应。一般地，以叠氮和炔基为活性基团、以溴化亚铜为催化剂、五甲基二亚乙基三胺为络合剂、室温(20-25℃)反应24-36小时。
进一步地，所述的磷酸化反应具体为醇羟基或酚羟基与磷酰氯的反应，一般地，体系中需要加入三乙胺以提供碱性环境，反应时间为12-24小时。
进一步地，所述的酰胺化反应具体为氨基和酸酐的反应，一般地，体系需通过NaOH溶液(0.2M)调节pH至9.0-10.0，反应时间为12-24小时。
进一步地，所述的酯化反应具体为醇羟基或酚羟基和酰氯的反应，一般地，体系需要加入三乙胺以提供碱性环境，反应时间为24-36小时。
在本发明的一实施例中，将聚合得到的侧基可功能化的聚多肽主链与叠氮季铵盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，在五甲基二亚乙基三胺和溴化亚铜存在的条件下引入阳离子基团，随后，将引入阳离子基团的产物在三乙胺和磷酰氯存在的条件下反应，得到具有磷酸酯酶响应的、侧链分别连接季铵盐基和磷酸基的聚多肽。
在本发明的一实施例中，将聚合得到的侧基可功能化的聚多肽主链与叠氮季铵盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，在五甲基二亚乙基三胺和溴化亚铜存在的条件下引入阳离子基团，随后，将引入阳离子基团的产物与末端含酰氯的羧酸反应，得到具有ROS响应的、侧链分别连接季铵盐基和羧基的聚多肽。
在本发明的一实施例中，将聚合得到的侧基可功能化的聚多肽主链与叠氮季铵盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，在五甲基二亚乙基三胺和溴化亚铜存在的条件下引入阳离子基团，随后，将引入阳离子基团的产物与乌头酸酐反应，得到具有pH响应的、侧链分别连接季铵盐基和羧基的聚多肽。
上述聚多肽中的叠氮季铵盐可替换为叠氮氨基小分子和叠氮胍基小分子，从而制备不同阳离子基团修饰的两性离子聚多肽。
上述聚多肽可用于制备纳米开关，该纳米开关用于外源性响应或内源性响应。
本发明的第三个目的是提供一种聚多肽纳米开关，包括上述聚多肽以及分别连接于聚多肽主链两端的金纳米粒子和/或光标记物，具体地，聚多肽纳米开关的结构如式(VI)-(IX)所示之一：
其中，R4为X选自0-20个碳原子的亚烃基，R选自胺基、胍基或季铵盐基；
R5选自
R6和R7独立地选自金纳米粒子或光标记物，且R6和R7不同时为金纳米粒子；
n表示聚多肽的聚合度，优选为10-1000的整数，x为0.01-0.99。
进一步地，R4选自其中，R1、R2和R3独立地选自氢或非氢取代基，如甲基、乙基、丙基和丁基等烷基。
进一步地，聚多肽纳米开关的结构如下所示之一：
/>
/>
/>
/>
/>
本申请所述的聚多肽纳米开关具有磷酸酯酶响应、pH响应和活性氧(ROS)响应等，可实现磷酸酯酶、pH或ROS浓度变化等触发的构象转变以及光标记物的激活。具体来说，将阴离子基团为磷酸基的聚多肽纳米开关与磷酸酯酶共孵育，相对于未孵育前，荧光大大增强。同样，将阴离子基团为羧基的聚多肽纳米开关与微酸或过氧化氢共孵育，相对于未孵育前，荧光大大增强。
进一步地，本申请主要基于正常细胞和肿瘤细胞中磷酸酯酶含量的差异，实现聚多肽纳米开关的功能。以荧光分子为例，在正常情况下，聚多肽为柔性、负电的无规线团结构，此时由于荧光分子距离金纳米粒子较近，荧光分子被淬灭。磷酸酯酶处理后，侧基的磷酸根基团脱去，聚多肽转变为刚性、正电的α-螺旋结构，荧光分子远离金纳米粒子，荧光恢复，实现聚多肽纳米开关由“关闭”到“开启”的过程。
进一步地，pH响应的纳米开关可通过将本发明一实施例中的酪氨酸替换为末端带氨基的赖氨酸制备，然后在赖氨酸部分接枝具有pH响应的、末端为羧基的乌头酸酐。在正常情况下，由于聚多肽侧链静电相互吸引，聚多肽为柔性、负电的无规线团结构，此时由于荧光分子距离金纳米粒子较近，荧光分子被淬灭。微酸处理后，侧基的羧酸根脱去，聚多肽转变为刚性、正电的α-螺旋结构，荧光分子远离金纳米粒子，荧光恢复，实现聚多肽纳米开关由“关闭”到“开启”的过程。
进一步地，ROS响应的纳米开关可通过将本发明一实施例中的酪氨酸替换为末端带羟基的丝氨酸或高丝氨酸制备，然后在丝氨酸或高丝氨酸末端引入下式所示具有ROS响应的、带羧基的基团。在正常情况下，由于聚多肽侧链静电相互吸引，聚多肽为柔性、负电的无规线团结构，此时由于荧光分子距离金纳米粒子较近，荧光分子被淬灭。经过氧化氢处理后，侧基的羧酸根脱去，聚多肽转变为刚性、正电的α-螺旋结构，荧光分子远离金纳米粒子，荧光恢复，实现聚多肽纳米开关由“关闭”到“开启”的过程。
进一步地，光标记物可为任何可以实现光识别物质，优选为荧光基团或光敏剂；
进一步地，金纳米粒子上修饰有氨基。
进一步地，金纳米粒子的粒径为3-50nm。
进一步地，荧光基团包括但不限于Cy5、Cy3、Cy5.5、FTIC以及罗丹明等。
进一步地，光敏剂包括但不限于Ce6、卟啉、酞菁类以及花菁类等。
本发明的第四个目的是提供上述聚多肽纳米开关的制备方法，包括以下步骤：
以金纳米粒子为引发剂，引发两种或两种以上式V所示氨基酸及衍生物的N-羧酸酐单体(NCA)无规共聚，聚合完成后，将反应后的产物与具有活性基团的光标记物反应，得到侧基可功能化的无规共聚多肽，再通过点击化学反应在所述无规共聚多肽侧链接枝阳离子基团；通过磷酸化反应、酰胺化反应或酯化反应等在所述无规共聚多肽侧链接枝阴离子基团，得到所述聚多肽纳米开关；
其中，A为氨基酸或其衍生物。
进一步地，无规共聚时，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或二氯甲烷和水的混合溶液。
本发明的第五个目的是提供一种肿瘤诊断试剂，该肿瘤诊断试剂中包括上述聚多肽或聚多肽纳米开关。
进一步地，肿瘤诊断试剂可用于肿瘤靶向成像。
本发明的第六个目的是提供一种光动力治疗剂，该试剂中包括上述聚多肽或聚多肽纳米开关。
进一步地，光标记物为光敏剂。
本发明的第七个目的是提供上述聚多肽或聚多肽纳米开关在制备抗炎剂或抗菌剂中的应用。炎症部位或细菌感染部位具有微酸环境和/或高ROS浓度，因此本发明的纳米开关可用于炎症或抗菌治疗。
本发明的第八个目的是提供上述聚多肽或聚多肽纳米开关在制备抗肿瘤药物中的应用，如作为载药平台。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明利用了聚多肽不同构象间柔顺性的差异，设计了一种构象可调的聚多肽，用于调节金纳米粒与光标记物的距离，从而在合成体系中巧妙地模拟了蛋白质的变构过程，为聚多肽的构效关系研究以及智能纳米材料的设计提供了指导。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例2中PAEY-Cy5(146，0.75)的核磁共振氢谱图；
图2为实施例4中PEY-Cy5(146，0.75)的核磁共振氢谱图；
图3为实施例5中PEYP-Cy5(146，0.75)的核磁共振氢谱图；
图4为实施例5中PEY-Cy5(n，0.75)和PEYP-Cy5(n，0.75)的圆二色谱、粒径和荧光发射光谱图；
图5为实施例5中不同酪氨酸含量的PEYP-Cy5(146)的螺旋度以及荧光强度关系图；
图6为实施例6中PAEY-Cy5(n，0.75)的GPC图谱；
图7为实施例7中PEYP-Cy5(146，0.75)和PEYS-Cy5(146，0.75)在有无磷酸酯酶处理的圆二色谱、粒径和荧光发射光谱图；
图8为实施例7中PEYP-M构象与荧光分子活性的关系图；
图9为测试例(1)中PE(L)-Cy5(146)和PE(DL)-Cy5(146)的圆二色谱和荧光发射光谱图；
图10为测试例(2)中不同细胞中磷酸酯酶含量图；
图11为测试例(3)中PEYP-Cy5(146，0.75)和PEYS-Cy5(146，0.75)在不同细胞中的摄取图；
图12为测试例(4)中不同浓度的PEYP-Cy5(146，0.75)在不同细胞上的细胞毒性测试图；
图13为测试例(5)中PEYP-Ce6(146，0.75)和PEYS-Ce6(146，0.75)的圆二色谱、荧光发射光谱以及在不同细胞中的摄取图；
图14为测试例(6)和测试例(7)中PEYP-Ce6(146，0.75)和PEYS-Ce6(146，0.75)在不同细胞中的ROS分布、H2O2定量分析以及细胞毒性测试图；
图15为测试例(8)中给药后荷瘤小鼠的肿瘤体积、存活率、HE染色以及TUNEL染色切片图；
图16为测试例(8)中给药后荷瘤小鼠的体重变化图；
图17为测试例(8)中给药后主要脏器的HE染色切片图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中，L-酪氨酸、四氯金酸三水合物、三乙胺、五甲基二亚乙基三胺和溴化亚铜等购买于阿拉丁化学；三光气、磷酰氯、磺酰氯、二氢卟吩e6(Ce6)、碘甲烷和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐购买于安耐吉化学；γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体(POBLG-NCA)按先前文献的方法合成(Nano Lett,2020,20:1738–1746)；水溶性Cy5活性酯(Cy5-NHS)购买于美仑生物；磷酸酯酶(来源于牛小肠，2250A)购买于Takara(大连，中国)。碱性磷酸酶检测试剂盒以及过氧化氢检测试剂盒购买于碧云天(上海，中国)。所有使用的玻璃仪器购买于欣维尔。
分析天平购买于Sartorius(型号：BSA224S)。磁力搅拌器购买于IKA(型号：RHdigital)。离心机购买于Thermo SCIENTIFIC(型号：MULTIFUGE X1R)。旋转蒸发仪购买于IKA(型号：RV10)。圆二色谱仪(CD，型号：J-900)。荧光光谱仪(FLUOROMAX-4)。凝胶渗透色谱仪(GPC，1260Infinity)。激光共聚焦显微镜(CLSM，TCS-SP5)。核磁共振氢谱仪(1H NMR，400MHz)。多功能酶标仪(A-2082)。
在本文中，如果没有特别的说明，百分数(％)都指相对于组合物的摩尔百分数；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案；所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案；所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；组合物中各组分的含量之和为100％；组合物中各组分的份数之和可以为100摩尔份；数值范围表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-20”表示本文中已经全部列出了“0-20”之间的全部实数，“0-20”只是这些数值组合的缩略表示；整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数；“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物；所用的术语“一种”指“至少一种”；所述的百分数(包括摩尔百分数)的基准都是所述组合物的总物质的量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5；所述的“残基”表示化合物或单体在反应之后形成的产物(例如聚合物)中的相应部分；“氨基酸”一般包括氨基酸及其衍生物。
由氨基酸形成α-螺旋聚多肽主链并对其二级结构进行调控的方法是本领域已知的。例如可参见Chem Soc Rev,2018,47:7401–7425；J Mater Chem B,2020,8:6530–6547；Angew Chem Int Ed,2017,56:10826–10829；Proc Natl Acad Sci U S A,2017,114:12675–12680。具体来说，以六甲基二硅氮烷为引发剂，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过开环聚合，引发基于两种氨基酸及衍生物的N-羧酸酐单体(NCA)无规共聚，并在聚多肽侧链接枝阳离子季铵盐基团和响应性阴离子磷酸根或羧酸根，从而制备二级结构可调节的聚多肽，通过磷酸酯酶或pH响应对其二级结构进行调节。
在下述实施例中，根据聚多肽的侧基种类以及接枝率不同，将该聚多肽简称为PEYF、PEBF或PEKF(n，x)，其中E代表谷氨酸及衍生物；Y代表酪氨酸；B代表丝氨酸；K代表赖氨酸；F代表阴离子种类(F＝P时，为磷酸根；F＝S时，为磺酸根；F＝C时，为羧酸根)；n代表聚多肽的聚合度；x代表聚多肽中阳离子的接枝率。
以下反应流程列举了部分本申请所述聚多肽纳米开关的制备：
/>
其中，n＝27、46、76、115或146；x＝0.75、0.8、0.85或0.9。
优选地，上述流程中，所用金纳米粒的粒径为10nm，所用荧光分子M为Cy5或Ce6，所用阳离子为季铵盐，所用阴离子为磷酸根。
本申请所述的聚多肽可以通过构象转变调节两端所携带物质的距离(如金纳米粒子和光标记物的距离，当然本发明的聚多肽纳米开关仅为本发明聚多肽的一种应用形式，其聚多肽主链两端可连接不同分子实现不同领域的应用)，进而调控光标记物分子的活性。因此，本申请另一方面提供了一种聚多肽纳米开关，实现诊疗一体化。
实施例1氨基修饰的金纳米粒子的制备
将HAuCl4·3H2O(88.6mg，0.225mmol)溶于超纯水(7.5mL)，加入四辛基溴化铵(547mg)的甲苯溶液(20mL)，强烈搅拌30分钟，直至水相变为无色。除去水相，加入1-丁硫醇(3.38mg，0.037mmol，nAu/nS＝6/1)，并逐滴滴加硼氢化钠溶液(3mL，0.4mol/L)，室温搅拌3小时，将Au(III)还原为Au(0)。反应结束后，除去水相，有机相经浓缩后溶于二氯甲烷(20mL)，加入巯基乙胺进行配体交换，室温反应12小时。浓缩，将其滴入无水乙醇中，离心除去溶剂，粗产物用无水乙醇洗三次，真空干燥，得氨基修饰的金纳米粒。
实施例2PAEY-M(146，0.75)的制备
将L-酪氨酸(1.0g，5.52mmol)和三光气(0.71g，2.39mmol)溶于无水四氢呋喃(25mL)，50℃反应6小时。反应结束后，过滤除去不溶物，真空除去四氢呋喃以及残余的三光气，得淡黄色固体。随后加入四氢呋喃(5mL)将粗产物溶解，加入正己烷(60mL)将产物沉淀出，反复三次，得Tyr-NCA。
通过调节聚合度、酪氨酸含量以及荧光分子种类，合成金纳米粒引发的无规共聚多肽PAEY-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PAEY-Cy5(146，0.75)的合成为例，在手套箱中，将POBLG-NCA(100mg，0.315mmol，结构式如下所示)和Tyr-NCA(22mg，0.105mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)，加入含金纳米粒的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL，20mg/mL，氨基物质的量为3×10-3mmol)，室温反应三天。通过傅里叶变换红外光谱监测反应进程，直至单体转化率大于99％。反应结束后，加入含Cy5-NHS的二甲基亚砜溶液(270μL，5mg/mL)和N,N-二异丙基乙胺(10μL)，避光、室温继续反应12小时。反应结束后，将其逐滴滴入去离子水中(60mL)，得粗产物，用去离子水洗涤三次，以除去残余杂质，真空干燥，得蓝色固体PAEY-Cy5(146，0.75)。其核磁共振氢谱图见图1。
对于合成聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PAEY-Ce6(146，0.75)，将Ce6(7.5mg，0.012mmol)、EDC(7.2mg，0.037mmol)以及NHS(2.2mg，0.019mmol)混合，室温反应2小时。通过傅里叶变换红外光谱监测聚合反应结束后，加入上述混合液，避光、室温继续反应24小时。反应结束后，将其逐滴滴入去离子水中(60mL)，用去离子水洗涤三次，以除去残余杂质，真空干燥，得灰色固体PAEY-Ce6(146，0.75)。
实施例3叠氮季铵盐小分子的制备
将N,N-二甲基氯丙胺盐酸盐(1.0g，6.33mmol)溶于去离子水(10mL)，加入叠氮化钠(0.82g，12.65mmol)，70℃反应12小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，用氢氧化钠溶液(0.1mol/L)调pH至12，无水乙醚(30mL×5)萃取。合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得N,N-二甲基叠氮丙胺。
将N,N-二甲基叠氮丙胺(1.12g，8.74mmol)用无水乙醚(5mL)溶解，缓慢加入碘甲烷(1.86g，13.11mmol)，室温反应12小时。反应结束后，离心除去溶剂，将白色固体用无水乙醚洗涤(30mL×5)，旋蒸除去溶剂，得叠氮季铵盐小分子。
实施例4通过点击化学反应合成阳离子聚多肽PEY-M(n，x)。
以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PEY-Cy5(146，0.75)为例。在手套箱中，将PAEY-Cy5(146，0.75)(30mg，炔基物质的量为0.08mmol)和叠氮季铵盐小分子(60mg，0.22mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，加入五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，室温反应24小时。反应结束后，将混合物暴露于空气中使过量的溴化亚铜氧化，加入盐酸(4mL，1mol/L)，粗产物在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEY-Cy5(146，0.75)。其核磁共振氢谱图见图2。
PEY-Ce6(146，0.75)通过相同的方法合成。
实施例5引入阴离子基团磷酸基
通过磷酸化反应合成PEYP-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PEYP-Cy5(146，0.75)为例。将PEY-Cy5(146，0.75)(30mg)分散于无水N-甲基吡咯烷酮(3mL)，冰浴下缓慢滴加无水三乙胺(200μL)和磷酰氯(200μL)，避光、室温反应12小时。反应结束后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(7-8mL)，室温继续反应2小时。粗产物在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEYP-Cy5(146，0.75)。其核磁共振氢谱图见图3。
PEYP-Ce6(146，0.75)通过相同的方法合成。
通过CD和荧光发射光谱表征PEY-Cy5(n，x)和PEYP-Cy5(n，x)的构象和荧光强度变化，如图4所示，PEY-Cy5(n，0.75)为刚性的α-螺旋构象，随着聚合度增加，纳米粒的粒径也增加，当聚合度为76时，粒径超过了40nm(即每条聚多肽链的长度超过15nm)，因此荧光强度不断增强。相反，PEYP-Cy5(n，0.75)为柔性的无规线团结构，随着聚合度增加，纳米粒的粒径增加不明显，由于Cy5靠近金纳米粒子，纳米粒的荧光也随即被淬灭。而对于PEYP-Cy5(146，x)，随着酪氨酸含量的增加，由于磷酸化后侧链电荷相互作用增强，聚多肽的螺旋度降低，荧光强度也降低，进一步表明通过调控聚多肽的螺旋度可调节纳米开关的荧光强度(图5)。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
实施例6
利用巯基乙胺将聚多肽单链PAEY-M(n，x)从纳米开关上置换下来，测定纳米开关上每条聚多肽的分子量。将PAEY-Cy5(n，0.75)(10mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，加入含巯基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液(0.2mL，6.48mol/L)，室温搅拌24小时。将混合液在去离子水中透析一天(MWCO＝3500Da)，冻干。所得固体溶于含LiBr(0.05mol/L)的N,N-二甲基甲酰胺，使聚合物的浓度为5mg/mL，离心除去金纳米粒子，用0.22μm的有机滤头过滤，通过GPC测定聚多肽的分子量以及多分散性。其GPC谱图及数据见图6。
实施例7
将PEYP-Cy5(146，0.75)和PEYS-Cy5(146，0.75)溶于PBS缓冲液(0.9mL，pH 7.4)，加入10×ALP缓冲液(0.1mL)和ALP(60U)，37℃孵育12小时。将溶液用去离子水稀释至0.02mg/mL，通过CD分析磷酸化以及去磷酸化后聚多肽的构象，将溶液用PBS稀释至5μg/mL，通过荧光发射光谱测定磷酸化以及去磷酸化后纳米粒的荧光变化。如图7-8所示，PEYP-Cy5(146，0.75)和PEYS-Cy5(146，0.75)均为无规线团构象，粒径分别为35.0和32.4nm，荧光被淬灭。而同磷酸酯酶共孵育后，由于侧链的磷酸根脱去，聚多肽转变为α-螺旋构象，纳米粒的粒径增大至53.3nm，荧光强度增强，而PEYS-Cy5(146，0.75)的构象、粒径以及荧光强度在磷酸酯酶处理后均无变化。此外，随着孵育时间增加，PEYP-Cy5(146，0.75)的荧光强度也增加。
其中，PEYS-Cy5(146，0.75)的制备方法如下：
通过磺酸化反应合成PEYS-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PEYS-Cy5(146，0.75)为例。将PEY-Cy5(146，0.75)(30mg)分散于无水N-甲基吡咯烷酮(3mL)，冰浴下缓慢滴加无水三乙胺(200μL)和磺酰氯(200μL)，避光、室温反应12小时。反应结束后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(7-8mL)，室温继续反应2小时。粗产物在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEYS-Cy5(146，0.75)。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
实施例8
将O-叔丁基-L-丝氨酸(1.0g，6.2mmol)和三光气(1.2g，4.13mmol)溶于无水四氢呋喃(25mL)，50℃反应3小时。反应结束后，真空除去四氢呋喃以及残余的三光气，得白色固体。随后加入四氢呋喃(5mL)将粗产物溶解，加入正己烷(60mL)将产物沉淀出，反复三次，得Ser(tBu)-NCA。
通过调节聚合度、丝氨酸含量以及荧光分子种类，合成金纳米粒引发的无规共聚多肽PAEB(tBu)-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PAEB(tBu)-Cy5(146，0.75)的合成为例，在手套箱中，将POBLG-NCA(100mg，0.315mmol)和Ser(tBu)-NCA(20mg，0.105mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)，加入含金纳米粒的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL，20mg/mL，氨基物质的量为3×10-3mmol)，室温反应三天。通过傅里叶变换红外光谱监测反应进程，直至单体转化率大于99％。反应结束后，加入含Cy5-NHS的二甲基亚砜溶液(270μL，5mg/mL)和N,N-二异丙基乙胺(10μL)，避光、室温继续反应12小时。反应结束后，将其逐滴滴入去离子水中(60mL)，得粗产物，用去离子水洗涤三次，以除去残余杂质，真空干燥，得蓝色固体PAEB(tBu)-Cy5(146，0.75)。
通过点击化学反应合成阳离子聚多肽PEB(tBu)-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PEB(tBu)-Cy5(146，0.75)为例。在手套箱中，将PAEB(tBu)-Cy5(146，0.75)(30mg，炔基物质的量为0.08mmol)和叠氮季铵盐小分子(60mg，0.22mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，加入五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，室温反应24小时。反应结束后，将混合物暴露于空气中使过量的溴化亚铜氧化，加入盐酸(4mL，1mol/L)，粗产物在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEB(tBu)-Cy5(146，0.75)。
通过脱保护反应合成PEB-Cy5。将PEB(tBu)-Cy5(100mg)和TFA/DCM(2mL，v/v＝1/3)混合，室温搅拌3小时。反应结束后，真空除去溶剂，得黄色固体。为了进一步除去残留的TFA，粗产物在去离子水中透析3天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEB-Cy5(146，0.75)。
通过和实施例5中相同的方法合成PEBP-Cy5(146，0.75)。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
实施例9
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯(1.0g，5.4mmol)和三光气(0.8g，2.7mmol)溶于无水四氢呋喃(25mL)，室温反应24小时。反应结束后，真空除去四氢呋喃以及残余的三光气，得淡黄色液体。随后加入乙酸乙酯(50mL)将粗产物溶解，分别用饱和碳酸氢钠(50mL×3)和饱和氯化钠(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得无色粘稠液体PLG-NCA。
以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％、光标记物为Cy5的PAEY-Cy5-2的合成为例，将POBLG-NCA替换为PLG-NCA，按照实施例2中的方法合成金纳米粒引发的无规共聚多肽PAEY-Cy5-2。
在PAEY-Cy5-2的基础上，通过点击化学反应，按照实施例4中的方法合成PEY-Cy5-2。
在PEY-Cy5-2的基础上，通过磷酸化反应，按照实施例5中的方法合成PEYP-Cy5-2。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
实施例10
以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％、光标记物为Cy5的PAEB(tBu)-Cy5-2的合成为例，将POBLG-NCA替换为PLG-NCA，按照实施例8中的方法合成金纳米粒引发的无规共聚多肽PAEB(tBu)-Cy5-2。
在PAEB(tBu)-Cy5-2的基础上，通过点击化学反应，按照实施例8中的方法合成PEB(tBu)-Cy5-2。
在PEB(tBu)-Cy5-2的基础上，通过脱保护反应，按照实施例8中的方法合成PEB-Cy5-2。
在PEB-Cy5-2的基础上，通过磷酸化反应，按照实施例5中的方法合成PEBP-Cy5-2。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
实施例11ROS响应纳米开关
冰浴下，将草酰氯(1.41g，11mmol)和乳酸(1g，11mmol)溶于四氢呋喃(30mL)，反应1小时。反应结束后，真空除去溶剂，得化合物ACC。
将PEB-Cy5(30mg)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，冰浴下，加入ACC(10mg)和三乙胺(200μL)，室温反应24小时，反应结束后，在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEBC-Cy5。
在PEB-Cy5-2的基础上，通过相同的方法，合成PEBC-Cy5-2。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
或
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
或
实施例12pH响应纳米开关
将N(e)-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(1.1g，4.4mmol)和三光气(0.58g，1.9mmol)溶于无水四氢呋喃(25mL)，50℃反应1小时。反应结束后，过滤除去不溶物，真空除去四氢呋喃以及残余的三光气，得白色固体。随后加入四氢呋喃(10mL)将粗产物溶解，加入正己烷(100mL)将产物沉淀出，反复三次，得Ser(tBu)-NCA。
通过调节聚合度、赖氨酸含量以及荧光分子种类，合成金纳米粒引发的无规共聚多肽PAEK(Boc)-M(n，x)。以聚合度为146、谷氨酸酯含量为75％的PAEK(Boc)-Cy5(146，0.75)的合成为例，在手套箱中，将POBLG-NCA(100mg，0.315mmol)和Boclys-NCA(29mg，0.105mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)，加入含金纳米粒的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL，20mg/mL，氨基物质的量为3×10-3mmol)，室温反应三天。通过傅里叶变换红外光谱监测反应进程，直至单体转化率大于99％。反应结束后，加入含Cy5-NHS的二甲基亚砜溶液(270μL，5mg/mL)和N,N-二异丙基乙胺(10μL)，避光、室温继续反应12小时。反应结束后，将其逐滴滴入去离子水中(60mL)，得粗产物，用去离子水洗涤三次，以除去残余杂质，真空干燥，得蓝色固体PAEK(Boc)-Cy5(146，0.75)。
在PAEK(Boc)-Cy5的基础上，通过点击化学反应，按照实施例8中的方法合成PEK(Boc)-Cy5。
在PEK(Boc)-Cy5的基础上，通过脱保护反应，按照实施例8中的方法合成PEK-Cy5。
将PEK-Cy5(50mg)溶于去离子水(2mL)，加入乌头酸酐(14mg)，通过NaOH溶液(0.2M)调节体系pH至9.0，室温搅拌12小时。反应结束后，混合物在去离子水(pH＝9.0)中透析3天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PEKC-Cy5。
将POBLG-NCA替换为PLG-NCA，通过相同的方法，合成PEKC-Cy5-2。
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮氨基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为氨基的两性离子聚多肽，如下式：
或
将叠氮季铵盐小分子更换为叠氮胍基小分子，通过相同的方法，合成阳离子为胍基的两性离子聚多肽，如下式：
或
测试例
(1)构象对荧光分子活性的影响
合成金纳米粒引发的L型均聚多肽PAE(L)-M(n)。以聚合度为100的PAE(L)-Cy5(100)的合成为例，在手套箱中，将POBLG-NCA(134mg，0.42mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，加入含金纳米粒的N,N-二甲基甲酰胺(0.7mL，20mg/mL，氨基物质的量为4.2×10- 3mmol)，室温反应三天。通过傅里叶变换红外光谱监测反应进程，直至单体转化率大于99％。反应结束后，加入含Cy5-NHS的二甲基亚砜溶液(270μL，5mg/mL)和N,N-二异丙基乙胺(10μL)，避光、室温继续反应12小时。反应结束后，将其逐滴滴入去离子水中(60mL)，得粗产物，用去离子水洗涤三次，以除去残余杂质，真空干燥，得蓝色固体PAE(L)-Cy5(100)。
在手套箱中，将PAE(L)-Cy5(100)(30mg，炔基物质的量为0.11mmol)和叠氮季铵盐小分子(60mg，0.22mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，加入五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，室温反应24小时。反应结束后，将混合物暴露于空气中使过量的溴化亚铜氧化，加入盐酸(4mL，1mol/L)，粗产物在去离子水中透析三天(MWCO＝3500Da)，冻干，得蓝色固体PE(L)-Cy5(100)。
DL型均聚多肽PE(DL)-M(n)通过相同的方法合成。其构象和荧光强度变化见图9，可以看到PE(L)-Cy5(100)为α-螺旋构象，因Cy5远离金纳米粒，其荧光未被淬灭。而PE(DL)-Cy5(100)为无规线团构象，由于Cy5距离金纳米粒较近，其荧光被淬灭，表明通过构象调节可调控荧光分子的活性。
(2)磷酸酯酶含量测定
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至6孔板中(2.0×105细胞/孔)，培养24小时。细胞用PBS缓冲液清洗三次，加入不含抑制剂的细胞裂解液(1mL)，超声20分钟，离心收集上清液，按照说明书要求，加入检测缓冲液和显色底物，37℃孵育10分钟。随后加入终止液，通过碱性磷酸酶试剂盒定量分析不同细胞中磷酸酯酶的活性，使用酶标仪读取405nm处的吸光度。37℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸酯显色底物产生1微摩尔对硝基苯酚所需的磷酸酯酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。为了确定不同细胞中磷酸酯酶的浓度，使用BCA试剂盒确定总蛋白质含量，并根据公式计算磷酸酯酶活性，结果表示为nmol min-1mg-1蛋白。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行测定。如图10所示，HeLa、HepG2和4T1细胞中磷酸酯酶的含量远大于H9C2和3T3细胞中的含量。
(3)基于Cy5的纳米开关的胞内分布测试
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至底部带有圆玻璃片的24孔板中(3.0×104细胞/孔)，培养24小时。更换新鲜的培养基，将PEYP-Cy5(146，0.75)和PEYS-Cy5(146，0.75)(15μg/mL)加入到孔中，37℃孵育4小时。用冷的PBS溶液洗三次，4％的多聚甲醛固定15分钟，DAPI(5μg/mL)染色8分钟，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察聚多肽纳米开关在不同细胞中的分布。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行观察。如图11所示，PEYP-Cy5(146，0.75)在HeLa、HepG2以及4T1中有较多的分布，而在H9C2和3T3细胞中分布很少。对于非响应型聚多肽PEYS-Cy5(146，0.75)，其在所有细胞中均分布极少，表明肿瘤细胞中过表达的磷酸酯酶可将PEYP-Cy5(146，0.75)侧链的磷酸根切断，聚多肽转变刚性、正电的α-螺旋结构，一方面提高细胞摄取水平，另一方面使纳米开关的荧光恢复。
(4)细胞毒性测试
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至96孔板中(1.0×104细胞/孔)，培养24小时。更换新鲜的培养基，将PEYP-Cy5(146，0.75)按照不同的浓度加入到孔中，37℃孵育4小时。更换新鲜的含10％FBS的DMEM继续孵育20小时。用MTT法测定细胞的存活率，以未经处理的细胞作为对照，结果表示为经样品处理的细胞与对照细胞吸光值的百分比。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行细胞毒性测试。如图12所示，PEYP-Cy5(146，0.75)纳米开关对所有的细胞均具有较低的细胞毒性。
(5)基于Ce6的纳米开关的胞内分布测试
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至底部带有圆玻璃片的24孔板中(3.0×104细胞/孔)，培养24小时。更换新鲜的培养基，将PEYP-Ce6(146，0.75)和PEYS-Ce6(146，0.75)(15μg/mL)加入到孔中，37℃孵育4小时。用冷的PBS溶液洗三次，4％的多聚甲醛固定15分钟，DAPI(5μg/mL)染色8分钟，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察聚多肽纳米开关在不同细胞中的分布。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行观察。如图13所示，PEYP-Ce6(146，0.75)在HeLa、HepG2以及4T1中有较多的分布，而在H9C2和3T3细胞中分布很少。对于非响应型聚多肽PEYS-Ce6(146，0.75)，其在所有细胞中均分布极少，表明肿瘤细胞中过表达的磷酸酯酶亦可将PEYP-Ce6(146，0.75)侧链的磷酸根切断，聚多肽转变刚性、正电的α-螺旋结构，一方面提高细胞摄取水平，另一方面激活聚多肽纳米开关。
(6)ROS含量测试
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至6孔板中(3.0×104细胞/孔)，培养24小时。更换新鲜的培养基，将PEYP-Ce6(146，0.75)和PEYS-Ce6(146，0.75)(15μg/mL)加入到孔中，37℃孵育6小时。移除培养基，细胞用PBS缓冲液清洗三次，加入DCFH-DA(0.2mL，10μmol/L)，将细胞光照30分钟(660nm，5mW/cm2)，4％的多聚甲醛固定15分钟，DAPI(5μg/mL)染色8分钟，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)定性分析不同细胞中ROS含量。并通过过氧化氢检测试剂盒定量分析不同细胞中过氧化氢含量。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行测定。如图14所示，对于PEYP-Ce6(146，0.75)，光照后，在HeLa、HepG2和4T1细胞中有较多的绿色荧光分布，而在H9C2和3T3中几乎无绿色荧光分布。而对于PEYS-Ce6(146，0.75)，所有细胞中均无绿色荧光分布。表明光照后PEYP-Ce6(146，0.75)在HeLa、HepG2和4T1细胞中可产生大量的ROS。定量分析表明，光照后HeLa、HepG2和4T1细胞中过氧化氢含量分别可达到157、131和69μM。表明肿瘤细胞中过量的磷酸酯酶可切断聚多肽侧链上的磷酸根，使聚多肽纳米开关由无规线团转变为α-螺旋结构，从而使光敏剂Ce6与金纳米粒的距离增加并发挥其功能。
(7)体外抗肿瘤测试
将HeLa、HepG2、4T1、H9C2以及3T3细胞接种至96孔板中(1.0×104细胞/孔)，培养24小时。更换新鲜的培养基，将PEYP-Ce6(146，0.75)和PEYS-Ce6(146，0.75)(32μg/mL)加入到孔中，37℃孵育4小时。随后将细胞光照30分钟(660nm，5mW/cm2)，更换新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，继续孵育20小时。通过MTT法测定细胞的存活率，以未经处理的细胞作为对照，结果表示为经样品处理的细胞与对照细胞吸光值的百分比。其中，4T1细胞用含10％FBS的1640培养基培养并进行细胞毒性测试。如图14所示，HeLa、HepG2和4T1细胞的存活率分别降至36％、40％和52％，表明PEYP-Ce6(146，0.75)具有优异的体外抗肿瘤功效。
(8)体内抗肿瘤及生物相容性测试
以HeLa荷瘤雌性裸鼠为模型。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分配为5组，每组6只，分别命名为PBS组、Ce6+L组、PEYS-Ce6+L组、PEYP-Ce6组以及PEYP-Ce6+L组。通过尾静脉给药的方式在第1、4、7、10天分别注射PBS、Ce6、PEYS-Ce6(146，0.75)以及PEYP-Ce6(146，0.75)(85μg Ce6/kg)。给药6小时后，将PBS组、Ce6+L组、PEYS-Ce6+L组以及PEYP-Ce6+L组光照30分钟(660nm，5mW/cm2)。并且每两天用游标卡尺测量肿瘤的体积，并对小鼠称重。肿瘤体积的计算公式：体积＝长度×宽度2/2。当肿瘤体积达到1000mm3以上时，默认小鼠死亡，并结束治疗，继续观察小鼠的存活。在治疗第19天后，处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤，石蜡包埋后切片，苏木精和伊红(HE)染色，光学显微镜观察并进行组织学分析。此外，将肿瘤组织用OCT包埋，-20℃过夜，冷冻切片。利用一步法TUNEL凋亡检测试剂盒对肿瘤组织冷冻切片进行染色，用DAPI(5μg/mL)对细胞核染色，通过CLSM观察肿瘤细胞的凋亡情况。如图15-17所示，给药19天后，PEYP-Ce6+L组的肿瘤被明显抑制，而PBS组、Ce6+L组、PEYS-Ce6+L组以及PEYP-Ce6组的肿瘤未被有效抑制，肿瘤体积均超过了1000mm3，表明PEYP-Ce6(146，0.75)+L可通过光动力治疗有效抑制肿瘤生长。此外，PEYP-Ce6+L组裸鼠的生存期也显著延长。且所有治疗组小鼠的体重在19天的观察期内并没有发生明显变化。肿瘤组织的免疫组化切片及免疫荧光结果显示PEYP-Ce6+L组呈现最高的细胞坏死和细胞凋亡率，表明其具有优异的体内抗肿瘤功效。在给药19天后，收集小鼠的心、肝、脾、肺以及肾，并对这些脏器进行HE染色分析。结果表明，给药后主要脏器均没有发生明显变化，表明聚多肽纳米开关具有良好的生物相容性。
(9)纳米开关的响应类型(A代表磷酸酯酶响应；R代表ROS响应；P代表pH响应；N代表非响应)
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综上，以氨基修饰的金纳米粒为引发剂，通过引发氨基酸或其衍生物的N-羧酸酐单体(NCA)无规共聚，并在聚多肽主链末端引入荧光分子(Cy5)或光敏剂(Ce6)，再经点击化学和磷酸化反应制备了一系列具有磷酸酯酶响应的纳米开关，旨在通过FRET技术研究二级结构变化对纳米粒子尺寸以及纳米开关发光行为的影响。研究表明，正常生理环境时，由于侧链的静电相互吸引，纳米开关表面的聚多肽(PEYP-M)为柔性的无规线团结构，此时荧光分子与金纳米粒子距离较近(<10nm)，荧光分子被“淬灭”。一旦纳米粒子进入肿瘤微环境，过量的磷酸酯酶(ALP)会切断侧链的磷酸根，由于此时侧链缺乏静电相互作用，聚多肽转变为刚性的α-螺旋构象(PEYP-M+ALP)，使荧光分子或光敏剂和金纳米粒子的距离大大增加(>10nm)，荧光恢复，从而实现精准的成像或光动力治疗。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一种聚多肽纳米开关，其特征在于，所述聚多肽纳米开关包括聚多肽主链、连接于所述聚多肽侧链上的阳离子基团和阴离子基团以及连接于所述聚多肽主链两端的金纳米粒子和光标记物，结构如式（VI）-（IX）所示之一：
；
其中，R4为，X选自0-20个碳原子的亚烃基，R为季铵盐基；
R5为；
R6和R7独立地选自金纳米粒子或光标记物，且R6和R7不同时为金纳米粒子；
n为10-1000的整数，x为0.01-0.99。
2.根据权利要求1所述的聚多肽纳米开关，其特征在于：所述聚多肽纳米开关为外源性响应纳米开关或内源性响应纳米开关。
3.根据权利要求2所述的聚多肽纳米开关，其特征在于：所述外源性响应纳米开关或内源性响应纳米开关至少具有磷酸酯酶响应、pH响应或活性氧响应性。
4.权利要求1-3任一项所述的聚多肽纳米开关的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以金纳米粒子为引发剂，引发两种或两种以上式V所示化合物无规共聚；
S2、聚合完成后，将反应后的产物与光标记物反应，得到侧基可功能化的无规共聚多肽；
S3、通过点击化学反应在所述无规共聚多肽侧链接枝阳离子基团；通过磷酸化反应在所述无规共聚多肽侧链接枝阴离子基团，得到所述聚多肽纳米开关；
；
其中，A为氨基酸或其衍生物。
5.权利要求1-3任一项所述的聚多肽纳米开关在制备肿瘤诊断试剂、光动力治疗剂、抗肿瘤药物、抗炎剂或抗菌剂中的应用。
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