CN110506124A - 用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法 - Google Patents

用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110506124A
CN110506124A CN201880024128.8A CN201880024128A CN110506124A CN 110506124 A CN110506124 A CN 110506124A CN 201880024128 A CN201880024128 A CN 201880024128A CN 110506124 A CN110506124 A CN 110506124A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotides
dna molecular
dna
biomolecule
label
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880024128.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110506124B (zh
Inventor
奥拉·索德伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Atlas Antibodies AB
Original Assignee
Atlas Antibodies AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Atlas Antibodies AB filed Critical Atlas Antibodies AB
Publication of CN110506124A publication Critical patent/CN110506124A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110506124B publication Critical patent/CN110506124B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/531—Glycosylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/131—Modifications characterised by incorporating a restriction site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/162—Helper probe
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C12Q2565/1015—Interaction between at least two labels labels being on the same oligonucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/20—Detection means characterised by being a gene reporter based analysis
    • C12Q2565/201—Two hybrid system

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于确定样品中的生物分子诸如蛋白质之间的相互作用水平的方法，其包括提供第一和第二携带信息(IC)的寡核苷酸，其中第一和第二IC寡核苷酸共价地或非共价地附接至具有与第一和第二生物分子结合的能力的第一和第二亲和试剂诸如抗体，其中第一和第二IC寡核苷酸各自包含与另一个寡核苷酸的一部分互补的至少一个单链链段，从而在第一和第二IC寡核苷酸中的至少一个中的至少一个单链链段与另一个寡核苷酸的其互补部分杂交后，能够在单细胞水平或单分子水平上测量样品中相互作用的第一和第二生物分子与非相互作用的第一和第二生物分子的相对比例。此外，本发明涉及包含实施本发明的方法必需的寡核苷酸和试剂的试剂盒。

Description

用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法
技术领域
本发明涉及用于确定样品中的生物分子诸如蛋白质之间的相互作用水平的方法。此外，本发明涉及用于在本发明的方法中使用的试剂盒。
技术背景
确定蛋白质-蛋白质相互作用水平的方法在对细胞信号传导活性的分析中是必需的。多年来，已经开发了多种方法来促进该分析。几种这样的方法基于遗传构建体，其中候选蛋白质与报告物分子融合，在相互作用时将重构为功能性报告物，即蛋白质片段互补测定(protein fragment complementation assay)。这样的方法的实例是酵母双杂交(Y2H)(Fields等人，1989，Nature 340(6230):245-246)、哺乳动物膜双杂交(MaMTH)(Petschnigg等人2014,Nat Methods 11(5):585-592)和生物分子荧光互补(BiFC)(Hu等人2002,MolCell 9(4):789-798)。另一种常见的方法是使用共振能量转移(FRET)以确定荧光融合蛋白的结合，具有相伴的发射变化。为了确定天然蛋白质之间的相互作用，存在几种基于抗体的靶向蛋白质的方法，其中抗体与官能团缀合以赋予蛋白质复合物的分离或检测，诸如基于免疫共沉淀抗体的FRET或邻位连接测定(PLA)。
邻位连接测定(PLA)(例如WO2009/021031)基于缀合有被称为邻近探针的寡核苷酸的抗体，所述邻近探针为两个随后添加的环化寡核苷酸连接成环状分子提供模板。仅当一对邻近探针结合相邻表位时，才会允许环状报告物分子的创建。然后邻近探针之一上的寡核苷酸将引发滚环扩增(RCA)。单个的邻近探针将为不能通过RCA扩增的线性分子的连接提供模板。因此，仅接近事件诸如蛋白质-蛋白质相互作用会被检测到。
在WO2015/118029中，公开了基于杂交链式反应的具有检测的邻位测定。
发明概述
尽管PLA和其他已知的邻位测定是用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏的和有选择性的方法，但确定蛋白质的池(pool)中有多大比例实际上参与了相互作用是不可能的。
本文描述的两个方法方面提供了关于相互作用的蛋白质和游离蛋白质二者的信息。一种设计使用扩增DNA寡核苷酸的DNA聚合酶提供信号扩增以检测单分子，该DNA寡核苷酸已经接收到关于蛋白质是否相互作用的信息，而另一种设计仅基于DNA杂交以对荧光团和猝灭剂定位使得它们以不同的颜色报告蛋白质是否游离或彼此相互作用。
因此，通常，本发明涉及一种用于确定样品中的生物分子诸如蛋白质之间的相互作用水平的方法，该方法包括提供第一携带信息(IC)的寡核苷酸和第二携带信息(IC)的寡核苷酸，其中第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸共价地或非共价地附接至具有与第一生物分子和第二生物分子结合的能力的第一亲和试剂和第二亲和试剂，该第一亲和试剂和第二亲和试剂诸如抗体，其中第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸各自包含与另一个寡核苷酸的一部分互补的至少一个单链链段(stretch)，从而在第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸中的至少一个中的至少一个单链链段与另一个寡核苷酸的其互补部分杂交后，能够在单细胞水平或单分子水平上测量样品中相互作用的第一生物分子和第二生物分子与非相互作用的第一生物分子和第二生物分子的相对比例。
“共价或非共价附接”在本上下文中意指亲和试剂，诸如抗体，借助于任何种类的化学结合(只要结合强到足以允许生物分子之间的相互作用可被分析)而附接至IC寡核苷酸。
“亲和试剂”通常意指抗体或包含抗体的试剂，虽然可以使用其他类型的分子，只要该“亲和试剂”具有与待分析的生物分子结合的能力，并且从而实现本发明的目的。“其他类型的分子”可以是例如具有与待分析的生物分子结合的能力的任何类型的生物分子，诸如核酸分子、多肽或任何其他种类。
“IC探针”或“探针”意指与亲和试剂结合的IC寡核苷酸。
相互作用的和非相互作用的生物分子的“相对比例的测量”意指可以测量彼此结合和彼此不结合的生物分子的相对量，这是本发明的重要目的。
“单细胞水平或单分子水平”意指可以对单个的细胞或单个的分子进行生物分子之间的相互作用和非相互作用的测量，即与现有技术方法相比提高了读出特性。
第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸的“单链链段”能够促成(a)第一IC寡核苷酸和/或第二IC寡核苷酸和接收信息(IR)的寡核苷酸之间的相互作用、(b)第一IC寡核苷酸和/或第二IC寡核苷酸和活化寡核苷酸之间的相互作用、或(c)第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸之间的直接相互作用。单链链段必须具有足以允许单链链段与另一个寡核苷酸的互补部分杂交的长度。
“活化寡核苷酸”意指这样的寡核苷酸，其在与IC寡核苷酸结合后可以引起IC寡核苷酸的分子内杂交的重构，并且从而显露出与另一个IC寡核苷酸互补的寡核苷酸链段，促成两个不同的IC寡核苷酸之间的杂交(这将引起荧光团和猝灭剂的重新定位)。
为了能够检测相互作用的蛋白质和非相互作用的蛋白质池二者，本发明的发明人开发了方法的第一方面，该方法可以当其在单细胞水平或单分子水平上报告非相互作用的蛋白质A或非相互作用的蛋白质B的量的同时使蛋白质A和蛋白质B之间的相互作用可视化。根据本发明的方法的此方面，提供了携带关于待分析的蛋白质或生物分子的身份的信息的寡核苷酸(信息携带物(IC))。预先形成的单链DNA分子(信息接收物(IR))(其可以是环状的)与这些信息携带物(IC)杂交，并且在它们是双链的区域即IR分子与IC分子杂交的区域被切开。在裂解后，与IC分子互补的短寡核苷酸标签将被掺入到IR分子中。现在重新创建的IR分子可以通过RCA(如果是环状的)或PCR(如果是线性的)扩增，并且掺入的标签的身份将通过例如荧光团标记的检测寡核苷酸的杂交来可视化，其中一个或两个标签的掺入将提供关于待分析的蛋白质或生物分子之间的相互作用的信息，以及游离的生物分子或蛋白质和相互作用的生物分子或蛋白质的相对量。用于分子Boolean(MolBoolean)分析的此方法提供了用于确定游离蛋白质和相互作用的蛋白质的关系的独特工具，该工具是对信号传导通路活性数学建模的必要条件。
因此，在第一方面，本发明的方法包括以下步骤：
a.提供单链的接收信息(IR)的DNA分子，其中IR DNA分子是环状的或线性的，该单链的接收信息(IR)的DNA分子携带至少第一裂解基序和第二裂解基序，其中裂解基序被选择为使得裂解基序位点必须变成双链的以便允许裂解；
b.提供第一携带信息(IC)的DNA分子，该第一携带信息(IC)的DNA分子包含与携带第一裂解基序的IR DNA分子的一部分互补的单链链段，其中第一IC DNA分子的出现反映样品中第一生物分子的量；
c.提供第二携带信息(IC)的DNA分子，该第二携带信息(IC)的DNA分子包含与携带第二裂解基序的IR DNA分子的一部分互补的单链链段，其中第二IC DNA分子的出现反映样品中第二生物分子的量；
d.将步骤a-步骤c的DNA分子在允许互补的单链链段的结合的条件下混合；
e.添加消化酶以在已经变成双链的裂解基序位点处创建切口(nick)，从而形成
i.第一报告物标签结合位点，该第一报告物标签结合位点将允许第一报告物标签DNA分子或序列的结合，该第一报告物标签DNA分子或序列包含与第一IC DNA分子的一部分互补的链段，和/或
ii.第二报告物标签结合位点，该第二报告物标签结合位点将允许第二报告物标签DNA分子或序列的结合，该第二报告物标签DNA分子或序列包含与第二IC DNA分子的一部分互补的链段；
f.通过以下替代方案中的任一种掺入报告物标签DNA序列：
i.添加第一报告物标签DNA分子和第二报告物标签DNA分子，其中如果已经在第一裂解基序位点处创建切口，则第一报告物标签DNA分子在第一报告物标签结合位点处被掺入IR DNA分子中，和/或如果已经在第二裂解基序位点处创建切口，则第二报告物标签DNA分子在第二报告物标签结合位点处被掺入IR DNA分子中；或
ii.如果已经在第一裂解基序位点处创建切口，则使用DNA聚合酶和核苷酸通过填充与第一IC寡核苷酸上的第一报告物标签结合位点互补的空位将第一报告物标签DNA序列掺入IR DNA分子中，和/或如果已经在第二裂解基序位点处创建切口，则通过填充与第二IC寡核苷酸上的第二报告物标签结合位点互补的空位将第二报告物标签DNA序列掺入IR DNA分子中；以及
添加连接IR DNA分子的连接酶，从而提供重新创建的IR DNA分子；
g.任选地扩增步骤f的重新创建的IR DNA分子；
h.监测第一报告物标签和/或第二报告物标签在重新创建的IR DNA分子中的掺入，作为对样品中第一生物分子和/或第二生物分子的出现和/或第一生物分子和/或第二生物分子之间的相互作用的量度。
IR DNA分子可以是线性的或环状的。重要的是，IR DNA分子具有当其与IC DNA分子结合时被裂解的能力，并且它需要与IC DNA分子部分互补。
IC DNA分子必须与IR DNA分子部分互补，并且包括另外的DNA碱基，所述DNA碱基为互补序列向裂解的IR DNA分子中的插入提供模板。
“反映生物分子的量”意指IC DNA分子的相对量或出现，以及其随后与IR DNA分子的杂交/结合，是对样品中游离的生物分子和相互作用的生物分子的相对出现或相对量的量度。因此，第一IC DNA分子和第二IC DNA分子的相对量分别是样品中游离的第一生物分子和第二生物分子与相互作用的第一生物分子和第二生物分子的量或出现的相对量度。
“允许互补的单链链段的结合的条件”意指通常被称为允许严格杂交的此类条件。本领域技术人员将知晓和/或将容易地找到用于实际杂交反应的合适的条件。
在本发明的上下文中，“裂解基序”意指DNA分子的限制性酶等可以识别的基序或短序列。然后识别裂解基序的限制性酶等可以与裂解基序的位点(即“裂解基序位点”)结合，并且在某些条件下，裂解双链DNA分子的一条链或对双链DNA分子的一条链“创建切口”，使得短报告物标签DNA分子的结合位点，即“报告物标签结合位点”被创建。
可以使用许多可能的裂解基序，只要它们仅当基序已经变成双链时允许裂解。优选的裂解基序选自尿嘧啶或限制性位点。
此外，用于在裂解基序位点处创建切口的消化酶优选地选自
i.切口内切核酸酶(nicking endonuclease)，例如Nb.Bsr.DI或Nt.BsmAI，该切口内切核酸酶对双链限制性位点中的特定链产生切口，或
ii.尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和EndoIV的组合，该尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)去除双链位点处的尿嘧啶碱基，该EndoIV去除脱嘧啶位点。
其他酶或酶组合也是完全可能的，例如限制性酶、在DNA修复中使用的酶诸如MutY，或工程化的限制性酶诸如转录激活子样效应子核酸酶(Talen)，只要所选择的酶或酶组合允许在双链位点处裂解一条DNA链。
在一个实施方案中，第一IC DNA分子缀合至等同于第一生物分子或靶向第一生物分子的第一抗体分子，并且第二IC DNA分子缀合至等同于第二生物分子或靶向第二生物分子的第二抗体分子。
报告物标签DNA分子是与IC DNA分子的一部分互补的短DNA分子。
作为提供报告物标签DNA分子的可选方案，报告物标签DNA序列通过使用DNA聚合酶以添加核苷酸来创建(分别参见步骤f(i)和步骤f(ii))。
因此，将序列信息转移至IR分子的可选方法是使用DNA聚合酶以添加核苷酸(以IC的核苷酸为模板)，以将通过对IR-IC杂交体切口而形成的空位密封(seal)。
连接酶可以例如选自DNA连接酶或任何其他替代物。
该方法的扩增步骤可以例如通过用于环状IR DNA分子的RCA(滚环扩增)或用于线性IR DNA分子的PCR(聚合酶链式反应)或任何其他常用的方法来进行。本领域技术人员将容易地知晓合适的扩增方法。
本发明的方法的监测步骤可以通过以下进行：
a.提供第一标记的检测寡核苷酸和第二标记的检测寡核苷酸，该第一标记的检测寡核苷酸与已经被掺入到IR中的第一报告物标签DNA分子的至少一部分互补，且该第二标记的检测寡核苷酸与已经被掺入到IR中的第二报告物标签DNA分子的至少一部分互补，并且
b.将第一标记的检测寡核苷酸和第二标记的检测寡核苷酸与任选地被扩增的重新创建的IR DNA分子杂交，
其中第一检测寡核苷酸和第二检测寡核苷酸的标记物选自具有不同的读出波长的荧光团、与猝灭剂组合的荧光团(图3)、酶(例如可以将底物转化为有色沉淀物的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、和具有不同质量的分子(质量标签可以被质谱仪记录)。标记物当然可以不同地选择，只要它们包含可以被测量和记录的特定特性。
在一个实施方案中，线性的重新创建的IR DNA分子被扩增，并且此后通过分离方法分离，该分离方法诸如电泳，特别是凝胶电泳，或层析，其中具有不同尺寸的分离产物指示不同的报告物标签的掺入。
在另一个实施方案中，通过测序来监测不同的报告物标签的身份。
在又另一个实施方案中，在已经形成重新创建的IR DNA分子的样品中诸如通过显微术监测重新创建的IR DNA分子，或者其中在已经形成重新创建的IR DNA分子的样品中收集重新创建的IR DNA分子，随后诸如通过显微术对其进行单分子的分选和分析。
在另外的实施方案中，寡核苷酸缀合至抗体，其中寡核苷酸携带关于每种抗体的身份的信息(信息携带物(IC))。预先形成的单链DNA环(信息接收物(IR))与这些缀合物杂交，并且在它们是双链的区域，即DNA环与抗体-寡核苷酸缀合物杂交的区域切开。在裂解后，与抗体-寡核苷酸缀合物互补的短寡核苷酸标签将被掺入到环中，此后该环被连接。现在重新创建的环将通过RCA扩增，并且掺入的标签的身份将通过荧光团标记的检测寡核苷酸的杂交来可视化。如果RCA产物从其中仅掺入一个标签的环生成，则RCA产物将仅在一个波长是荧光的，但是如果掺入了两个标签，则RCA产物将被两种不同的荧光团标记。
在又另一个实施方案中，去除脱碱基位点以提高检测效率。这可以在报告物标签分子已经被添加并且第一报告物标签和/或第二报告物标签已经被掺入到IR中后进行，并且进行以下步骤：
i.将消化模板与IR DNA分子杂交，使剩余的脱碱基位点周围的区域成为双链；
ii.通过合适的限制性酶诸如EndoIV消化双链区域；
iii.用合适的添加缺失的碱基诸如胸苷的聚合酶诸如T4 DNA聚合酶来填充消化的区域的空位；以及用连接酶诸如T4连接酶连接IR DNA分子，以提供重新创建的IR DNA分子。
去除脱碱基位点并且以这种方式连接环状分子，将提高针对在报告物标签掺入后具有剩余的脱碱基(脱嘌呤的或脱嘧啶的)位点的IR DNA分子的检测效率。“提高的检测效率”意指将生成针对其中已经去除脱碱基位点的IR DNA分子的更多扩增产物。
“消化模板”通常是也在去除脱碱基位点后具有足以与IR DNA分子杂交的长度的寡核苷酸。通常，长度是约20个-30个核苷酸，但是可以发生变化，只要消化模板与IR DNA分子在允许杂交的条件下杂交。
该实施方案对于其中在IR DNA分子中用于裂解的基序是尿嘧啶的情况特别有用，其中在空位填充过程中添加胸苷。
在进行这些步骤后，获得任选地可以被扩增的重新创建的IR DNA分子，此后监测第一报告物标签和/或第二报告物标签的掺入。
在第二方面中，本发明涉及一种方法，其中：
a.第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸包含发夹结构，荧光团和猝灭剂被安置在该发夹结构中，其中发夹结构被设计成使得每个寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光，并且其中每个荧光团具有独特的信号；
b.第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸中的发夹通过以下中的任一种被破坏或去稳定：
i.提供与第一IC寡核苷酸或第二IC寡核苷酸互补的活化寡核苷酸，从而与第一IC寡核苷酸或第二IC寡核苷酸结合，或
ii.降解一种或两种IC寡核苷酸的发夹中的一条链，从而释放第一IC寡核苷酸和/或第二IC寡核苷酸中的DNA的单链链段，
使得第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸可以彼此相互作用，引起荧光团和猝灭剂的重新定位；以及
c.包含与第一IC寡核苷酸或第二IC寡核苷酸偶联的亲和试剂的缀合物对被用于询问与亲和试剂结合的两个生物分子之间的邻近度，其中作为在第一生物分子和第二生物分子之间相互作用时寡核苷酸彼此杂交引起荧光团和猝灭剂的位置更改的结果，第一荧光团信号模式将在第一生物分子和第二生物分子之间相互作用时展示，并且第二荧光团信号模式将在第一生物分子和第二生物分子之间缺乏相互作用时展示。
“发夹结构”意指寡核苷酸的一部分，其中序列的两个链段彼此互补并且从而彼此杂交，在其间留下未杂交的序列的链段，使得分子在该部分形成发夹样结构。
“IC寡核苷酸的发夹”被“破坏或去稳定”意指寡核苷酸形成发夹的部分被破坏，使得发夹消失并且形成了寡核苷酸的一些其他结构。
“降解发夹中的一条链”意指发夹部分的至少一部分的核苷酸序列结构消失。
“释放”IC寡核苷酸的单链链段意指被释放的链段不再与例如发夹结构的互补部分结合，且反而可以至少部分地与另一个寡核苷酸或与同一寡核苷酸的一部分杂交。
“IC寡核苷酸彼此相互作用”意指寡核苷酸的某个部分的单链链段彼此杂交，引起IC寡核苷酸内的荧光团和猝灭剂的“重新定位”和/或“位置更改”。
“缀合物”意指亲和试剂和IC寡核苷酸的组合，其中亲和试剂与IC寡核苷酸共价地或非共价地结合。相应地，“缀合物对”意指各自与亲和试剂结合的两个IC寡核苷酸，其中亲和试剂可以彼此相互作用。
“询问邻近度”意指监测亲和试剂之间的邻近度和/或相互作用。
“荧光团信号模式”意指荧光团信号(例如不同波长的一个或两个荧光团信号)是可读的，并且该信号模式对于IC寡核苷酸之间的某些相互作用/结构是独特的，而IC寡核苷酸之间的另一种相互作用/结构具有另一种“荧光团信号模式”。
该方面基于用荧光团和猝灭剂修饰的两种或更多种寡核苷酸，所述荧光团和猝灭剂被安置为使得每个寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光。这些寡核苷酸可被活化，因此在缀合至这样的寡核苷酸的一对抗体接近结合时，寡核苷酸可以彼此杂交。因此重新定位荧光团和猝灭剂，使得先前可以发射光的荧光团现在被猝灭，并且显露出可以发射光的新的荧光团(即对蛋白质-蛋白质相互作用进行报告)。
因此，在所展示的这两个方面中，提供了一种方法，该方法解决了现有技术的技术挑战，并且通过在单细胞水平上提供关于游离蛋白质和复合物结合的蛋白质的信息，提供了与现有技术方法相比改善的读出特性。用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的现有技术方法，诸如PLA或Y2H，给出了关于相互作用水平的信息，但没有给出关于非相互作用的蛋白质的水平的信息。因此，确定记录的相互作用水平的差异是否是由相互作用的蛋白质的不同表达水平引起的，或者相互作用是否被例如蛋白质的翻译后修饰调控是不可能的。通过检索关于蛋白质的表达水平和参与由这些蛋白质组成的蛋白质复合物的比例二者的信息，使单细胞中的解离常数的变化可视化将是可能的，解离常数的变化反映由例如翻译后修饰引起的蛋白质的构象变化。本发明的方法将有利于对细胞信号传导活性的研究和理解，并且因此提供了具有广泛临床应用的新型研究工具。
本发明的方法的第一生物分子和第二生物分子可以是例如蛋白质或多肽，虽然还可以监测其他生物分子诸如DNA、RNA、碳水化合物、脂质、抗体或任何其他类型的生物分子。
通常，样品是生物样品，诸如一种或更多种细胞、或蛋白质的混合物。本发明的方法可以被用于许多应用。在优选的实施方案中，该方法被用于分析例如单细胞、组织切片、体液或蛋白质提取物中的蛋白质-蛋白质相互作用。
在第三方面中，本发明涉及用于在本发明的第一方面的方法中使用的试剂盒，该试剂盒包含
a.单链的接收信息(IR)的DNA分子，所述单链的接收信息(IR)的DNA分子携带第一裂解基序和第二裂解基序；
b.第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子，所述第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子反映样品中第一生物分子和第二生物分子的量，其中第一IC DNA分子和第二IC DNA分子缀合至亲和试剂或被提供为具有待由试剂盒使用者使用用于缀合的化学部分；
c.任选地酶，所述酶用于在IR DNA分子中的裂解基序位点处创建切口；
d.第一报告物标签DNA分子和第二报告物标签DNA分子；以及
e.任选地用于扩增重新创建的IR DNA分子的试剂；
f.任选地第一标记的检测寡核苷酸和第二标记的检测寡核苷酸；以及
g.任选地去除脱碱基位点的DNA分子和酶。
“去除脱碱基位点的DNA分子和酶”意指例如如上文定义的消化模板，以及如上文在涉及去除脱碱基位点的实施方案中讨论的合适的限制性酶、聚合酶和/或连接酶。
“被用于缀合的化学部分”意指用化学部分制备IC DNA分子，该化学部分在后期阶段中可以被用于与亲和试剂缀合。这样的“化学部分”可以例如选自生物素、链霉亲和素、亲和素、NHS-酯、马来酰亚胺、腙、醛、炔烃、叠氮化物、硫醇、胺或任何其他合适的化学部分。技术人员将知道其他可能的部分。
在第四方面中，本发明涉及用于在本发明的第二方面的方法中使用的试剂盒，该试剂盒包含
a.第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子，所述第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子包含发夹结构，荧光团和猝灭剂被安置在该发夹结构中，其中发夹结构被设计成使得每个寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光，并且其中每个荧光团具有独特的信号，从而具有反映样品中第一生物分子和第二生物分子的量的能力，其中第一IC DNA分子和第二IC DNA分子缀合至亲和试剂，诸如抗体或被提供为具有待由试剂盒使用者缀合的化学部分；以及
b.活化寡核苷酸，该活化寡核苷酸与第一IC DNA分子或第二IC DNA分子互补，从而具有与第一IC DNA分子或第二IC DNA分子结合的能力。
附图简述
图1：寡核苷酸设计的示意图。IR环分别与两个IC探针(最上排)，一个IC探针(后两排)杂交，IC探针由缀合至抗体(以A和B指示)的IC寡核苷酸组成(左图)。通过酶处理消化IR环，其中IR环与IC探针杂交，并且标签寡核苷酸侵入IC探针(中图)。再连接IR环，并且标签序列被掺入(右图)。
图2：用于IR环的酶促消化的不同设计的示意图，指示了尿嘧啶碱基和限制性位点的位置。
图3：使用用于检测β-连环蛋白、E-钙粘蛋白和β-连环蛋白-E-钙粘蛋白相互作用的MolBoolean方法，对来自三幅单独的图像的信号的平均数+/-SD的定量。图像示出了针对β-连环蛋白、E-钙粘蛋白和β-连环蛋白-E-钙粘蛋白相互作用被标记的细胞。在图像中标记出了细胞核的边界。
图4：使用三种Alexa染料和两种Black hole猝灭剂的Invader-MolBoolean的设计的示意图。(A)当邻近探针(缀合至IC寡核苷酸1或IC寡核苷酸2的抗体(参见表))结合单独的抗原时，每个探针的一个荧光团将能够发射光：Alexa555(A555)和Alexa647(A647)，而Alexa488(A488)将被猝灭因为它位于猝灭剂(BHQ1)附近。(B)当添加激活子寡核苷酸(activator oligonucleotide)时，它将侵入IC寡核苷酸1。如果邻近探针是紧邻的，则打开的IC寡核苷酸1将与IC寡核苷酸2杂交，从而更改荧光团和猝灭剂的位置。现在A555将位于BHQ1附近，并且A647位于猝灭剂(BHQ3)附近，这两种荧光团将被猝灭，而A488现在与猝灭剂BHQ1分离并且将发射光。
图5：空位填充过程的示意图。首先，消化模板跨越AP位点杂交，允许环被EndoIV消化。此后，创建的切口(箭头)可以通过将掺入胸苷的T4 DNA聚合酶填充。连接酶将使被切口的环密封，使得其在该方案的下一个步骤中被扩增。
图6：具有空位填充设计的原位蛋白质检测。将探针在四种不同的条件下在HaCat细胞上孵育：具有抗E-钙粘蛋白抗体和抗β-连环蛋白抗体二者、具有抗E-钙粘蛋白抗体、具有抗β-连环蛋白抗体、或不具有任何一级抗体(背景)。所有示出的条件通过减去背景条件来归一化。误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。
发明详述
本发明的发明人已经开发了用于确定样品中的生物分子诸如蛋白质之间的相互作用水平的一般方法，该方法包括提供第一携带信息(IC)的寡核苷酸和第二携带信息(IC)的寡核苷酸，其中第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸共价地或非共价地附接至具有与第一生物分子和第二生物分子结合的能力的第一亲和试剂和第二亲和试剂，该第一亲和试剂和第二亲和试剂诸如抗体，其中第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸各自包含与另一个寡核苷酸的一部分互补的至少一个单链链段，从而在第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸中的至少一个中的至少一个单链链段与另一个寡核苷酸的其互补部分杂交后，能够在单细胞水平或单分子水平上测量样品中相互作用的第一生物分子和第二生物分子与非相互作用的第一生物分子和第二生物分子的相对比例。
该方法将在本说明书中通过两种可选择的方法例示；一种可选择的方法使用IC寡核苷酸中的发夹结构与荧光团/猝灭剂技术的组合，发夹结构被设计成使得每个IC寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光，并且另一种可选择的方法除了IC寡核苷酸之外，使用携带至少两个裂解基序位点的IR(接收信息的)寡核苷酸，所述裂解基序位点必须变成双链的以便允许裂解。通过使用这些方法中的任一种，可以在单细胞水平或单分子水平上测量样品中相互作用的生物分子和非相互作用的生物分子的相对比例的测量值。
因此，对于本发明的方法的各方面中的一个方面，本发明的发明人设计了由单链环状DNA分子(信息接收物(IR))组成的寡核苷酸体系，该单链环状DNA分子(信息接收物(IR))携带用于裂解的基序，例如尿嘧啶或限制性位点。寡核苷酸系统被创建为使得裂解将要求位点是双链的，该位点仅当结合互补寡核苷酸时将是双链的。这些互补寡核苷酸(信息携带物(IC))被设计成使得它们由发夹结构组成，该发夹结构侧翼为将与IR环互补的单链DNA的链段。创建在IR环中的切口将有利于随后添加的与IC探针的一部分互补的短标签寡核苷酸侵入IC寡核苷酸的发夹并且连接到IR环中。可选择地，可以用DNA聚合酶、用来自IC探针的模板进行空位填充。为了将空位密封并且重新创建环状DNA分子，添加DNA连接酶。IC寡核苷酸的独特标签和发夹可以被用于将信息转移至已经结合IC寡核苷酸的IR环。当IR环结合两种不同的IC寡核苷酸时，将掺入两种对应的标签。如在一个实施方案中，通过将IC寡核苷酸缀合至抗体，本发明人已经创建了一种方法，其中IR环可以被用于监测两种蛋白质是否相互作用，即两个标签是否被掺入到IR环中。针对人们意图研究的蛋白质选择抗体。对于不相互作用的蛋白质，仅一个标签将被掺入到IR环中(图1)。
测试用于切开环并整合标签的不同方法。IR环可以通过切口内切核酸酶切开，该切口内切核酸酶仅裂解其双链靶中的一条链。可选择地，通过在酶组合UNG和EndoIV的帮助下去除尿嘧啶碱基可以创建切口。对于切口内切核酸酶，本发明人测试了两种不同的酶：将在发夹的3’侧进行切割的Nb.BsrDI(3’Nb.BsrDI)和在5’侧切割的Nt.BsmAI(5’Nt.BsmAI)。本发明人还通过将尿嘧啶碱基掺入相对于发夹的3’侧或5’侧(3’尿嘧啶和5’尿嘧啶)来测试裂解效率。(图2)。在Nupack.org的帮助下，本发明人设计并且分析了所有寡核苷酸序列以确保正确的二级结构和杂交(表1)。
然后，包含掺入的标签的重新创建的IR环可以通过滚环扩增(RCA)从IC探针之一引发来扩增。RCA产物包含数百个互补的IR环的重复。然后RCA产物的身份可以通过与其中已经掺入标签的RCA产物的部分互补的标记的检测寡核苷酸的杂交来解码。取决于将使用哪种读出，检测寡核苷酸的标记可以是例如不同的荧光团、酶或具有不同质量的分子。单标记的RCA产物将是仅掺入一个标签的结果，而双标记的RCA产物将是掺入两个标签的结果。
结果会看上去如何的实例在图3中示出。在此处，本发明人使用将IC寡核苷酸缀合至抗小鼠抗体和抗兔抗体的5’尿嘧啶设计。这些IC探针在用靶向E-钙粘蛋白的小鼠抗体和靶向β-连环蛋白的兔抗体标记的MCF10细胞系上测试。包含β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的复合物将产生用Cy3和FITC二者检测到的RCA产物，而非相互作用的蛋白质给出用Cy3或FITC标记的RCA产物。RCA产物的不同身份使用软件CellProfiler确定，并且不同类型的RCA产物是伪彩色的以使β-连环蛋白和E-钙粘蛋白之间的相互作用以及单独的蛋白质(β-连环蛋白和E-钙粘蛋白)可视化。
提取信息的可选择的方法是使用IR环或线性IR分子询问IC探针之间的邻近度。在连接标签序列后，重新创建的IR分子可以通过PCR扩增并且通过凝胶电泳分离。尺寸差异将指示不同标签的掺入。扩增单个IR分子并且通过对扩增子的测序来解码不同标签的身份也将是可能的。
MolBoolean分析可以在细胞中、在蛋白质的混合物(所述蛋白质在批量混合物(bulk mixture)中，或例如通过凝胶电泳分离)中进行。如果读出平台支持单分子检测，可以直接在形成重新创建的IR分子的样品中询问(例如通过显微术，如图3中示出的)重新创建的IR分子，或可以收集重新创建的IR分子并且随后可以单独地对单分子进行分选和分析。
在一些情况中，IR分子中剩余的脱碱基位点(AP位点)可以干扰扩增和/或检测效率。作为用于提高检测效率的手段并且为了降低环状IR分子的未消化的脱碱基位点(AP位点)阻止信号的检测的风险，本发明人用替代设计版本修改了该设计(图5)。为了去除脱碱基位点，在掺入标签的步骤后添加了两个步骤。在第一个另外的步骤中，消化模板与DNA环杂交，使AP位点周围的区域成为双链。此后脱碱基位点通过EndoIV消化来去除。在下一个步骤中，空位填充用T4 DNA聚合酶进行以添加缺失的胸苷，并用T4连接酶通过连接来使切口闭合。
空位填充设计使用先前描述的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白相互作用测定来评估(图6)。检测到E-钙粘蛋白和β-连环蛋白相互作用以及明显更高的总E-钙粘蛋白的量，总E-钙粘蛋白的量等于仅存在该抗体时的E-钙粘蛋白的总量。同样地，在使用该抗体的两个条件下，β-连环蛋白的总量保持在相当的水平。
对于本发明的方法的其他方面，本发明人开发了一种可选择的方法以监测游离蛋白质和相互作用的蛋白质二者。在该方法中，与抗体连接的IC寡核苷酸可以被设计成包含发夹结构。通过将荧光团和猝灭剂附接至这样的发夹，仅当荧光团与猝灭剂分隔开一定距离时，将允许荧光团发射光。荧光团和猝灭剂的定位将有利于允许每个这样的IC寡核苷酸仅一个荧光团发射光。一旦IC寡核苷酸在与它们连接的抗体的指导下与它们的靶结合，一种发夹结构将通过激活子寡核苷酸的侵入而被去稳定。这将改变IC寡核苷酸的构象，并且将显露出先前隐藏在茎中的DNA的链段，该DNA的链段与第二IC寡核苷酸的链段反向互补。仅当去稳定的/活化的第一IC寡核苷酸和第二IC寡核苷酸结合至紧邻的靶分子时，去稳定的/活化的第一IC寡核苷酸将与第二IC寡核苷酸杂交，这将使荧光团和猝灭剂重新定位，使得先前发射光的荧光团现在被猝灭并且在IC寡核苷酸的一个中被猝灭的一个荧光团与猝灭剂分离。仅当一对IC寡核苷酸彼此杂交时，该荧光团将能够发射光。因此，游离蛋白质和相互作用的蛋白质的荧光可以在不同的波长同时被记录。在本文中被称为Invader-MolBoolean的该方法在图4中描述。在Nupack.org的帮助下，本发明人设计并且分析了所有寡核苷酸序列以确保正确的二级结构和杂交(表1)。
现在将参考以下非限制性实施例来描述本发明。
实施例
实施例1-β-连环蛋白和E-钙粘蛋白相互作用的原位检测：
通过连接两个单链片段(即IR环片段1和IR环片段2(参见表1))来创建接收信息的DNA环，该接收信息的DNA环携带将确保正确的杂交的基序，所述两个单链片段即环中的两个发夹结构。两种寡核苷酸以1μM在T4连接缓冲液中的最终浓度混合在一起。此后，将0.02U/μl的T4连接酶加入混合物中，并且在37℃孵育持续2h，随后在4℃孵育48h。
根据制造商的说明，使用Amicon Ultra 10K离心过滤器单元(Merck Millipore,Massachusetts,USA)将350μg的驴抗兔抗体或驴抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,USA)/缀合的PLA探针在PBS中浓缩至浓度为3mg/ml。将S-HyNic交联剂(Solulink,San Diego,USA)溶解在DMSO中至20mM，并且以交联剂比抗体25×摩尔过量将交联剂和抗体混合。在室温在伴随轻轻搅拌地孵育该混合物，并且避光2小时。在抗体活化后，通过预洗涤的Zeba旋转脱盐柱7K MWCO(Thermo Scientific)将缓冲液交换为100mMNaHPO4、150mM NaCl、pH 6.0缓冲液。在缓冲液交换之后，以1:3的抗体:寡核苷酸比将抗体与醛修饰的寡核苷酸(表1)混合。以10mM的最终浓度添加苯胺以催化反应。在室温伴随轻轻搅拌地孵育抗体寡核苷酸混合物，并且避光2小时。在孵育后立即使用预洗涤的Zeba旋转脱盐柱7K MWCO(Life Technologies)将缓冲液交换为PBS。在缀合后，通过Pure HPLC(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)使用Superdex 20010/300柱(GE Healthcare)将缀合物从未缀合的抗体和寡核苷酸中纯化出来。根据制造商的说明，通过Amicon Ultra 10K离心过滤器单元(Merck Millipore)将通过HPLC纯化收集的级分浓缩至80μl，并且通过电泳验证。将缀合物与Novex TBE-尿素样品缓冲液(Life Technologies)混合，并且在Novex TBE-尿素凝胶10％(Life Technologies)上通过180V，50分钟分离。使用SYBR Gold核酸凝胶染色(Life Technologies)使DNA可视化，并且使用考马斯染色(Bio-Rad,Hercules,USA)使蛋白质可视化。用Bio-Rad Gel-Doc XR(Bio-Rad)使凝胶可视化。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Life Technologies)确定缀合物的浓度。
显微镜载玻片上的细胞通过3.7％PFA固定10分钟，并且然后在具有0.2％tritonX100的1×PBS中透化，并且此后在1×PBS中洗涤两次，然后添加封闭溶液；在1×TBS中的50％Odyssey封闭缓冲液(目录#927-50000,LiCor)。在较潮湿的室中在37℃封闭30min后，将细胞与抗E-钙粘蛋白(目录#BD610182,BD biosciences,1:100稀释)和抗β-连环蛋白(目录#sc7199,santacruz,1:200稀释)在封闭溶液中在4℃孵育过夜。将每个载玻片在具有0.05％吐温20的1×TBS(TBST)中洗涤三次，持续三分钟。
将Molboolean IC探针以100ng/ml的最终浓度混合在封闭溶液中，并且在37℃将其与细胞孵育60分钟。然后将载玻片在TBST中洗涤三次，持续三分钟。将Molboolean IR环在补充有0.25mg/ml BSA的T4连接缓冲液中稀释至0.025μM以允许该环与IC探针的杂交，同时将其与细胞在37℃孵育30分钟。此后将细胞在TBST中洗涤两次，每次持续3分钟，并且然后取决于设计，在37℃将其与消化酶孵育。5’尿嘧啶设计是通过0.1U/μl的Endo IV和0.05U/μl的UNG在具有30mM NaCl、1mM EDTA、100mM KCl、1mM DTT和0.25mg/ml BSA的20mMTris-HCl(pH 7.6)缓冲液中消化持续45min，然后洗涤。同时，5’Nt.BsmAI设计用稀释在补充有0.25mg/ml BSA的1×NEBuffer Cut smart中的0.125U/μl Nt.BsmAI酶孵育1h。将细胞在TBST中洗涤2次，持续3min，并且此后将其与均为0.125μM的标签1和标签2在补充有0.25mg/ml BSA的T4连接缓冲液中，在0.05U/μL T4连接酶的存在下，在37℃孵育30min。在连接后，存在另一次在TBST中的洗涤(2×3min)。
空位填充设计引入了两个额外的步骤。将载玻片与0.05μM的消化模板以及0.01U/μl的Endo IV在具有30mM NaCl、1mM EDTA、100mM KCl、1mM DTT和0.25mg/ml BSA的20mMTris-HCl(pH 7,6)缓冲液中在RT孵育60min。将载玻片在TBST中洗涤三次，持续3min。为了填充空位，将载玻片与0.025U/μl T4 DNA聚合酶和0.05U/μl T4连接酶在补充有0.25mg/mlBSA和0.1mM dNTP的1×T4连接酶缓冲液中在RT孵育30min。此后将细胞在TBST中洗涤两次，每次持续3分钟。
此后，对新形成的环进行RCA反应以在37℃扩增信号，持续60min。在以下溶液中通过0.5U/μl phi29催化RCA：33mM Tris-乙酸盐、10mM乙酸镁、66mM乙酸钾、0.1％吐温20、1mMDTT、7.5ng/ml多聚A(polyA)和0.25mM dNTP。将载玻片在TBST中洗涤两次，持续三分钟。通过使0.025μM DO1和2与RCA产物在补充有0.0025μg/ml鲑精DNA和0.25mg/ml BSA的PBS中杂交来检测RCA产物，并且混合物还包含0.04mg/ml Hoechst 33342用于细胞核染色。
在染色之后，进行在1×TBS中的两次10min的洗涤和在0.2×TBS中的一次15min的洗涤，并且此后将载玻片用70％etOH干燥并使用Vectasheld封片。
表1
序列表
<110> 奥拉·索德伯格
<120> 用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的方法
<130> P41604751PCT00
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 1
cgaggtgctt ttagcacctc gaagtaaagc ccgtcccagt gaatgcgagt ccgtctgata 60
acctagataa acgtcacact tttcgtgtga cg 92
<210> 2
<211> 94
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 2
tttatctata tccctacttc acctgccucg tctattccac ctcaaaaagt gtccactcct 60
accuctgccc actacctacc tcaaaccttt actt 94
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 3
tctgcagtta tacgtccaat cataa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 4
tcgtacgtag atcctgccat ttcta 25
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 5
aaaaaggtag gtagtgggca gttatgattg gacgtataac tgcagaggta ggagtggaca 60
c 61
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 6
aaaaagaggt ggaatagacg tagaaatggc aggatctacg tacgaggcag gtgaagtagg 60
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 7
taggtagtgg gcagaggtag gagtggaca 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 8
aggtggaata gacgaggcag gtgaagtag 29
<210> 9
<211> 93
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 9
tttatctata tccctactta cgtctctcgt ctattccacc tcaaaaagtg tccactcgtc 60
tcactgccca ctacctacct caaaccttta ctt 93
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 10
ctgcgcagtt atacgtccaa tcataa 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 11
cgtacgtaga tcctgccatt tcta 24
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 12
ggtaggtagt gggcagttat gattggacgt ataactgcgc agtgagacga gtggacac 58
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 13
gaggtggaat agacgtagaa atggcaggat ctacgtacga gagacgtaag tagg 54
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被Cy3取代
<400> 14
tctgcagtta tacgtccaat uuu 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被FITC取代
<400> 15
tcgtacgtag atcctgccat uuu 23
<210> 16
<211> 112
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 16
tttatctata tccctacttc acctgcctcg tacgtagauc tattccacct ctctaaaaaa 60
aatccactcc tacctctgta gttauaccta cctcgtgagg aaacctttac tt 112
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 17
tcacgtccaa tcgataacta cagttat 27
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 18
ttcctgccat tatctacgtg tagat 25
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 19
aacctcacga ggtaggtata actgtagtta tcgattggac gtgataacta cagaggtagg 60
agtgga 66
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 20
aatagagagg tggaatagat ctacacgtag ataatggcag gaatctacgt acgaggcagg 60
tgaag 65
<210> 21
<211> 109
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 21
tttatctata tccctacttc acctgcctcg tacgtagatc attgcacctc tctaaaaaat 60
ccactcctac ctctgtagtt atcattgcct cgtgaggaaa cctttactt 109
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 22
cacgtccaat cgataactac agttat 26
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 23
tcctgccatt atctacgtgt agat 24
<210> 24
<211> 64
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 24
cctcacgagg caatgataac tgtagttatc gattggacgt gataactaca gaggtaggag 60
tgga 64
<210> 25
<211> 62
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代
<400> 25
tagagaggtg caatgatcta cacgtagata atggcaggaa tctacgtacg aggcaggtga 60
ag 62
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被Cy3取代
<400> 26
tccaatcgat aactacagtt at 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被FITC取代
<400> 27
tgccattatc tacgtgtaga t 21
<210> 28
<211> 96
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'-末端被醛取代；荧光团alexa 555在T19位置处；猝灭剂BHQ3在A43位置处
<400> 28
aaaaaaaaaa ggtcctgatc cactcctact tccactccca tcaggtgaag tgaagtaggt 60
aagtgatggg agtggaagta ggagtggatc aggacc 96
<210> 29
<211> 72
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<220>
<221> misc_feature
<223> 荧光团Alexa 488在T1位置处；荧光团alexa 647在T29位置处； 猝灭剂BHQ1在T55位置处；3'-末端被醛取代
<400> 29
tccacttcta tttccactcc catcatcggt gatgggagtg gaagtaggag tggatcagga 60
ccaaaaaaaa aa 72
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成的(synthetic)
<400> 30
cctacttcca ctcccatcac ttacctactt cacttcacc 39

Claims (17)

1.用于确定样品中的生物分子诸如蛋白质之间的相互作用水平的方法，所述方法包括提供第一携带信息(IC)的寡核苷酸和第二携带信息(IC)的寡核苷酸，其中所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸共价地或非共价地附接至具有与第一生物分子和第二生物分子结合的能力的第一亲和试剂和第二亲和试剂，所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂诸如抗体，其中所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸各自包含与另一个寡核苷酸的一部分互补的至少一个单链链段，从而在所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸中的至少一个中的所述至少一个单链链段与另一个寡核苷酸的其互补部分杂交后，能够在单细胞水平或单分子水平上测量所述样品中相互作用的第一生物分子和第二生物分子与非相互作用的第一生物分子和第二生物分子的相对比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸的所述单链链段能够促成(a)所述第一IC寡核苷酸和/或所述第二IC寡核苷酸和接收信息(IR)的寡核苷酸之间的相互作用、(b)所述第一IC寡核苷酸和/或所述第二IC寡核苷酸和活化寡核苷酸之间的相互作用、或(c)所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸之间的直接相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供单链的接收信息(IR)的DNA分子，其中所述IR DNA分子是环状的或线性的，携带至少第一裂解基序和第二裂解基序，其中所述裂解基序被选择为使得裂解基序位点必须变成双链的以便允许裂解；
b.提供第一携带信息(IC)的DNA分子，所述第一携带信息(IC)的DNA分子包含与携带所述第一裂解基序的所述IR DNA分子的一部分互补的单链链段，其中所述第一IC DNA分子的出现反映所述样品中第一生物分子的量；
c.提供第二携带信息(IC)的DNA分子，所述第二携带信息(IC)的DNA分子包含与携带所述第二裂解基序的所述IR DNA分子的一部分互补的单链链段，其中所述第二IC DNA分子的出现反映所述样品中第二生物分子的量；
d.将步骤a-步骤c的DNA分子在允许互补的单链链段的结合的条件下混合；
e.添加消化酶以在已经变成双链的所述裂解基序位点处创建切口，从而形成
i.第一报告物标签结合位点，所述第一报告物标签结合位点将允许第一报告物标签DNA分子或序列的结合，所述第一报告物标签DNA分子或序列包含与所述第一IC DNA分子的一部分互补的单链链段，和/或
ii.第二报告物标签结合位点，所述第二报告物标签结合位点将允许第二报告物标签DNA分子或序列的结合，所述第二报告物标签DNA分子或序列包含与所述第二IC DNA分子的一部分互补的单链链段；
f.通过以下替代方案中的任一种掺入报告物标签DNA序列：
i.添加所述第一报告物标签DNA分子和所述第二报告物标签DNA分子，其中如果已经在所述第一裂解基序位点处创建切口，则所述第一报告物标签DNA分子在所述第一报告物标签结合位点处被掺入所述IR DNA分子中，和/或如果已经在所述第二裂解基序位点处创建切口，则所述第二报告物标签DNA分子在所述第二报告物标签结合位点处被掺入所述IRDNA分子中；或
ii.如果已经在所述第一裂解基序位点处创建切口，则使用DNA聚合酶和核苷酸通过填充与所述第一IC寡核苷酸上的所述第一报告物标签结合位点互补的空位来将所述第一报告物标签DNA序列掺入所述IR DNA分子中，和/或如果已经在所述第二裂解基序位点处创建切口，则通过填充与所述第二IC寡核苷酸上的所述第二报告物标签结合位点互补的空位来将所述第二报告物标签DNA序列掺入所述IR DNA分子中；以及
添加连接所述IR DNA分子的连接酶，从而提供重新创建的IR DNA分子；
g.任选地扩增步骤f的所述重新创建的IR DNA分子；
h.监测所述第一报告物标签和/或所述第二报告物标签在所述重新创建的IR DNA分子中的掺入，作为对所述样品中所述第一生物分子和/或所述第二生物分子的出现和/或所述第一生物分子和/或所述第二生物分子之间的相互作用的量度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中裂解基序选自尿嘧啶或限制性位点。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中用于在所述裂解基序位点处创建切口的所述消化酶选自
i.在双链限制性位点的3’产生切口的切口内切核酸酶3’Nb.Bsr.DI，
ii.在双链限制性位点的5’产生切口的切口内切核酸酶5’Nt.BsmAI，或
iii.尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和EndoIV的组合，所述尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)去除在双链位点处的尿嘧啶碱基，所述EndoIV去除脱嘧啶位点。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述监测通过以下进行：
a.提供第一标记的检测寡核苷酸和第二标记的检测寡核苷酸，所述第一标记的检测寡核苷酸与所述第一报告物标签DNA分子的至少一部分互补，且所述第二标记的检测寡核苷酸与所述第二报告物标签DNA分子的至少一部分互补，并且
b.将所述第一标记的检测寡核苷酸和所述第二标记的检测寡核苷酸与任选地被扩增的所述重新创建的IR DNA分子杂交。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中线性的重新创建的IR DNA分子被扩增，并且此后通过分离方法分离，所述分离方法诸如电泳或层析，其中具有不同尺寸的分离产物指示不同的报告物标签的掺入。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中不同的报告物标签的身份通过测序来监测。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中在已经形成所述重新创建的IR DNA分子的所述样品中诸如通过显微术监测所述重新创建的IR DNA分子，或者其中在已经形成所述重新创建的IR DNA分子的所述样品中收集所述重新创建的IR DNA分子，随后诸如通过显微术对所述重新创建的IR DNA分子进行单分子的分选和分析。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，所述方法用于去除脱碱基位点和提高检测效率，其中在所述报告物标签分子已经被添加并且所述第一报告物标签和/或所述第二报告物标签已经被掺入到所述IR中后，进行以下步骤：
i.将消化模板与所述IR DNA分子杂交，使剩余的脱碱基位点周围的区域成为双链；
ii.通过合适的限制性酶消化双链区域来去除所述脱碱基位点，所述限制性酶诸如EndoIV；
iii.用合适的添加缺失的碱基诸如胸苷的聚合酶诸如T4 DNA聚合酶来填充消化的区域的空位，；以及用连接酶诸如T4连接酶连接所述IR DNA分子以提供重新创建的IR DNA分子。
11.根据权利要求1或2所述的方法，
a.其中所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸包含发夹结构，荧光团和猝灭剂被安置在所述发夹结构中，其中所述发夹结构被设计成使得每个寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光，并且其中每个荧光团具有独特的信号；
b.其中所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸中的所述发夹通过以下中的任一种被破坏或去稳定：
i.提供与所述第一IC寡核苷酸或所述第二IC寡核苷酸互补的活化寡核苷酸，从而与所述第一IC寡核苷酸或所述第二IC寡核苷酸结合，或
ii.降解一种或两种IC寡核苷酸的所述发夹中的一条链，从而释放所述第一IC寡核苷酸和/或所述第二IC寡核苷酸中的DNA的单链链段，
使得所述第一IC寡核苷酸和所述第二IC寡核苷酸可以彼此相互作用，引起荧光团和猝灭剂的重新定位；
c.其中缀合物对被用于询问与所述亲和试剂结合的两个生物分子之间的邻近度，所述缀合物对包含与所述第一IC寡核苷酸或所述第二IC寡核苷酸偶联的亲和试剂，其中作为在所述第一生物分子和所述第二生物分子之间相互作用时所述寡核苷酸彼此杂交而引起荧光团和猝灭剂的位置更改的结果，第一荧光团信号模式将在所述第一生物分子和所述第二生物分子之间相互作用时展示，而第二荧光团信号模式将在所述第一生物分子和所述第二生物分子之间缺乏相互作用时展示。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子是蛋白质或多肽。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是一种或更多种细胞的生物样品或蛋白质的混合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一IC DNA分子缀合至第一抗体分子，所述第一抗体分子等同于所述第一生物分子或靶向所述第一生物分子，并且所述第二IC DNA分子缀合至第二抗体分子，所述第二抗体分子等同于所述第二生物分子或靶向所述第二生物分子。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法用于分析单个细胞或单个分子的蛋白质-蛋白质相互作用。
16.用于在权利要求1-15中任一项所述的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含
a.单链的接收信息(IR)的DNA分子，所述单链的接收信息(IR)的DNA分子携带第一裂解基序和第二裂解基序；
b.第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子，所述第一携带信息(IC)的DNA分子和所述第二携带信息(IC)的DNA分子反映样品中第一生物分子和第二生物分子的量，其中所述第一IC DNA分子和所述第二IC DNA分子缀合至亲和试剂或被提供为具有待由试剂盒使用者缀合的化学部分；
c.任选地酶，所述酶用于在所述IR DNA分子中的所述裂解基序位点处创建切口；
d.第一报告物标签DNA分子和第二报告物标签DNA分子；
e.任选地用于扩增重新创建的IR DNA分子的试剂；
f.任选地第一标记的检测寡核苷酸和第二标记的检测寡核苷酸；以及
g.任选地去除脱碱基位点的DNA分子和酶。
17.用于在权利要求1-15中任一项所述的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含
a.第一携带信息(IC)的DNA分子和第二携带信息(IC)的DNA分子，所述第一携带信息(IC)的DNA分子和所述第二携带信息(IC)的DNA分子包含发夹结构，荧光团和猝灭剂被安置在所述发夹结构中，其中所述发夹结构被设计成使得每个寡核苷酸仅一个荧光团可以发射光，并且其中每个荧光团具有独特的信号，从而具有反映样品中第一生物分子和第二生物分子的量的能力，其中所述第一IC DNA分子和所述第二IC DNA分子缀合至亲和试剂或被提供为具有待由试剂盒使用者缀合的化学部分；以及
b.活化寡核苷酸，所述活化寡核苷酸与所述第一IC DNA分子或所述第二IC DNA分子互补，从而具有与所述第一IC DNA分子或所述第二IC DNA分子结合的能力。
CN201880024128.8A 2017-02-09 2018-02-09 用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法 Active CN110506124B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1750122-2 2017-02-09
SE1750122 2017-02-09
PCT/SE2018/050121 WO2018147794A1 (en) 2017-02-09 2018-02-09 Method for determining levels of interactions between biomolecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110506124A true CN110506124A (zh) 2019-11-26
CN110506124B CN110506124B (zh) 2024-04-02

Family

ID=61244675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880024128.8A Active CN110506124B (zh) 2017-02-09 2018-02-09 用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220042069A1 (zh)
EP (1) EP3580356B1 (zh)
JP (1) JP2020511122A (zh)
KR (1) KR102513181B1 (zh)
CN (1) CN110506124B (zh)
AU (1) AU2018218875B2 (zh)
CA (1) CA3051350A1 (zh)
ES (1) ES2870557T3 (zh)
SG (1) SG11201906689SA (zh)
WO (1) WO2018147794A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202213956D0 (en) 2022-09-23 2022-11-09 Xu Bo Molecular interaction detection and profiling

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015118029A1 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Olink Ab Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (hcr)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8338579B2 (en) * 2004-11-03 2012-12-25 Iris Molecular Diagnostics, Inc. Homogeneous analyte detection
US20080293051A1 (en) 2005-08-30 2008-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System proximity ligation assay

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015118029A1 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Olink Ab Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (hcr)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARL-JOHAN LEUCHOWIUS等: "Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue", 《MOL CELL PROTEOMICS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201906689SA (en) 2019-08-27
WO2018147794A1 (en) 2018-08-16
AU2018218875B2 (en) 2023-12-07
KR20190120214A (ko) 2019-10-23
ES2870557T3 (es) 2021-10-27
EP3580356B1 (en) 2021-03-31
AU2018218875A1 (en) 2019-08-22
EP3580356A1 (en) 2019-12-18
JP2020511122A (ja) 2020-04-16
CN110506124B (zh) 2024-04-02
KR102513181B1 (ko) 2023-03-23
US20220042069A1 (en) 2022-02-10
CA3051350A1 (en) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11390908B2 (en) Detection of gene loci with CRISPR arrayed repeats and/or polychromatic single guide ribonucleic acids
Söderberg et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay
CN102084001B (zh) 用于核酸测序的组合物和方法
US8592202B2 (en) Biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US9951376B2 (en) Methods for the selection of aptamers
CN109072205A (zh) 核酸的检测
US20110171647A1 (en) Method for quantifying or detecting dna
JP5088034B2 (ja) 物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法
CN107109469A (zh) 选择靶核酸序列的方法
CN101365804A (zh) 活化的分裂多肽及其制备方法和用途
US20240209378A1 (en) Methods and compositions for protein and peptide sequencing
US20210079557A1 (en) Methods and Compositions for Protein and Peptide Sequencing
US11926820B2 (en) Methods and compositions for protein and peptide sequencing
CN110506124A (zh) 用于确定生物分子之间的相互作用水平的方法
Li et al. Molecular Beacons for Protein—DNA Interaction Studies
JP5652850B2 (ja) 核酸結合蛋白質アッセイ法およびキット
CN108646014A (zh) 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法
Li et al. Interference reduction isothermal nucleic acid amplification strategy for COVID-19 variant detection
US20240158784A1 (en) Molecular barcodes and related methods and systems
Karhunen Switchable Lanthanide Luminescence for Detection of Biomolecules
CN103328655A (zh) 信号放大

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40016108

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant