JP2020511122A - 生体分子間の相互作用の度合いを決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a. 一本鎖情報受容(IR)DNA分子は環状または線状であり、少なくとも第一および第二の切断モチーフを有し、ここで当該切断モチーフは、切断を可能にするために当該切断モチーフ部位が必ず二重鎖になるよう選択される、IR DNA分子を提供する;
b. 第一の切断モチーフを有するIR DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第一の情報伝達(IC)DNA分子の出現はサンプル中の第一の生体分子の量を反映する、第一のIC DNA分子を提供する;
c. 第二の切断モチーフを有するIR DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第二の情報伝達(IC)DNA分子の出現はサンプル中の第二の生体分子の量を反映する、第二のIC DNA分子を提供する;
d. 相補的な一本鎖ストレッチの結合を可能にする条件下で工程a〜cのDNA分子を混合する;
e. 消化酵素を追加し、二本鎖になった切断モチーフ部位にニックを引き起こし、それにより、
i. 第一のIC DNA分子の部分に相補的なストレッチを含む、第一のレポータータグDNA分子または配列の結合を可能にする第一のレポータータグ結合部位、および/または
ii. 第二のIC DNA分子の部分に相補的なストレッチを含む、第二のレポータータグDNA分子または配列の結合を可能にする第二のレポータータグ結合部位、
を形成する;
f. 以下の選択肢のいずれか一つによってレポータータグDNA配列を組み込む:
i. 第一のレポータータグDNA分子および第二のレポータータグDNA分子を追加することにより、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のレポータータグDNA分子は、第一のレポータータグ結合部位でIR DNA分子に組み込まれる、および/または第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のレポータータグDNA分子は、第二のレポータータグ結合部位でIR DNA分子に組み込まれる;または
ii. DNAポリメラーゼおよびヌクレオチドを使用して、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のICオリゴヌクレオチド上の第一のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第一のレポータータグDNA配列をIR DNA分子に組み込む、および/または
第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のICオリゴヌクレオチド上の第二のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第二のレポータータグDNA配列をIR DNA分子に組み込む;および
IR DNA分子をライゲーションするライゲーション酵素を追加して、それにより再構築されたIR DNA分子を提供する;
g. 工程fで再構築されたIR DNA分子を任意で増幅する;
h. サンプル中の第一のおよび/または第二の生体分子の出現および/または相互作用の測定(measurement)として、再構築されたIR DNA分子中の第一のおよび/または第二のレポータータグの組み込みを測定する(monitor)。
i. 二本鎖制限部位の特定の鎖をニッキングする、ニッキングエンドヌクレアーゼ、たとえばNb.Bsr.DI、またはNt.BsmAI、または
ii. 二本鎖部位においてウラシル塩基を除去するウラシル−DNAグリコシラーゼ(Uracil−DNA glycosylase;UDG)、脱ピリミジン部位を除去するEndoIVの組み合わせ、
から選択される。
a. IRに組み込まれた第一のレポータータグDNA分子の少なくとも一部に相補的な第一の標識検出オリゴヌクレオチド、およびIRに組み込まれた第二のレポータータグDNA分子の少なくとも一部に相補的な第二の標識検出オリゴヌクレオチド、を提供する、および
b. 第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチドを、場合により増幅される再構築されたIR DNA分子にハイブリダイズさせる、
によって実行することができる。ここで、第一および第二の検出オリゴヌクレオチドの標識は、異なる読み出し波長を有するフルオロフォア、クエンチャーと組み合わせたフルオロフォア(図3)、酵素(たとえば、基質を着色沈殿物に転換できる西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ)、および質量の異なる分子(質量タグは、質量分析計で記録できる)から選択される。標識は、測定および記録できる特定の特性を含む限り、もちろん異なるように選択されうる。
i. 消化テンプレートをIR DNA分子にハイブリダイズさせて残りの脱塩基部位周辺を二本鎖にする;
ii. 好適な制限酵素、たとえばEndoIVで二本鎖領域を消化する;
iii. 好適なポリメラーゼ、たとえばT4 DNAポリメラーゼで消化領域をギャップ充填し、欠損塩基、たとえばチミジンを追加する;およびIR DNA分子をリガーゼ、たとえばT4リガーゼでライゲーションし、再構築されたIR DNA分子を提供する。
a. 第一および第二のICオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されるヘアピン構造を含み、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるよう設計されており、そしてここで各フルオロフォアは固有のシグナルを有する;
b. 第一および第二のICオリゴヌクレオチド中のヘアピンは、
i. 第一または第二のICオリゴヌクレオチドに相補的な活性化オリゴヌクレオチドを提供し、それにより第一または第二のICオリゴヌクレオチドに結合する、または
ii. 一つまたは両方のICオリゴヌクレオチドのヘアピン中の鎖の一つを分解し、それにより第一、および/または第二のICオリゴヌクレオチドのDNAの一本鎖ストレッチを解放する、
のいずれかによって破壊または不安定化され、そのため、第一および第二のICオリゴヌクレオチドは互いに相互作用し、フルオロフォアおよびクエンチャーの再配置を引き起こすことができる;および
c. 第一または第二のICオリゴヌクレオチドに結合した親和性試薬を含む複合体のペアが、親和性試薬が結合する二つの生体分子間の近接性を調べる(interrogate)ために使用され、ここで第一のフルオロフォアのシグナルパターンは第一のおよび第二の生体分子間の相互作用により示され、そして第二のフルオロフォアのシグナルパターンは、第一および第二の生体分子間の相互作用によってオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置の再構築を引き起こす結果として、第一のおよび第二の生体分子間の相互作用の欠損により示される。
a. 第一および第二の切断モチーフを有する、一本鎖情報受容(IR)DNA分子;
b. サンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する、第一および第二の情報伝達(IC)DNA分子であって、ここで第一および第二のIC DNA分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合のために使用される化学部分を備える;
c. 任意でIR DNA分子の切断モチーフ部位にニックを引き起こすための酵素;
d. 第一および第二のレポータータグDNA分子;および
e. 任意で再構築されたIR DNA分子の増幅のための試薬;
f. 任意で第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチド;および
g. 任意で脱塩基部位を除去するためのDNA分子および酵素
を含む。
a. フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されたヘアピン構造を含む第一および第二の情報伝達(IC)DNA分子であって、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光可能であり、そしてここでそれぞれのフルオロフォアは固有のシグナルを有し、それによりサンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する能力を有し、ここで第一および第二のIC DNA分子は親和性試薬、たとえば抗体に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える;および
b. 第一または第二のIC DNA分子に相補的であり、それにより第一または第二のIC DNA分子に結合する能力を有する活性化オリゴヌクレオチド
を含む。
本発明の発明者らは、生体分子、たとえばサンプル中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定するための一般的な方法であって、第一および第二の情報伝達(IC)オリゴヌクレオチドを提供することを含み、ここで第一および第二のICオリゴヌクレオチドは、共有結合または非共有結合により、第一および第二の親和性試薬、たとえば第一および第二の生体分子に結合する能力を有する抗体に結合しており、ここで第一および第二のICオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチドの一部に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチをそれぞれ含み、それによって、少なくとも一つの第一のおよび第二のICオリゴヌクレオチド中の少なくとも一つの一本鎖ストレッチを別のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズすることで、単一細胞または単一分子レベルでサンプル中の相互作用および非相互作用の第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を可能にする、方法を開発した。
情報受容DNA環は、適切なハイブリダイゼーションを保証するモチーフ、すなわち環内の二つのヘアピン構造を有する、二つの一本鎖断片(すなわち、IR環断片1および2(表1を参照))をライゲーションすることにより、作成された。二つのオリゴヌクレオチドは、T4 Ligation bufferで最終濃度1μMで混合された。その後、0.02U/μlのT4リガーゼを混合物に添加し、37℃で2時間インキュベートした後、4℃で48時間インキュベートした。
Claims (17)
- 生体分子、たとえば試料中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定する方法であって、第一のおよび第二の情報伝達(IC)オリゴヌクレオチドを提供することを含み、ここで第一のおよび第二の情報伝達(IC)オリゴヌクレオチドは共有結合または非共有結合により、第一のおよび第二の親和性試薬、たとえば、第一のおよび第二の生体分子に結合する能力を有する抗体に結合しており、ここで第一のおよび第二のICオリゴヌクレオチドはそれぞれ、別のオリゴヌクレオチドの一部に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチを含み、それによって、当該少なくとも一つの第一のおよび第二のICオリゴヌクレオチド中の当該少なくとも一つの一本鎖ストレッチの別のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズすることで、単細胞または単分子レベルでサンプル中の相互作用および非相互作用の第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を可能にする、方法。
- 前記第一のおよび第二のICオリゴヌクレオチドの一本鎖ストレッチは、(a)第一のおよび/または第二のICオリゴヌクレオチドおよび情報受信(IR)オリゴヌクレオチド間、(b)第一のおよび/または第二のICオリゴヌクレオチドおよび活性化オリゴヌクレオチド間、または(c)直接第一のおよび第二のICオリゴヌクレオチド間、の相互作用を可能にする、請求項1に記載の方法。
- a. 一本鎖情報受容(IR)DNA分子は環状または線状であり、少なくとも第一および第二の切断モチーフを有し、ここで当該切断モチーフは、切断を可能にするために当該切断モチーフ部位が必ず二重鎖になるよう選択される、IR DNA分子を提供する;
b. 第一の切断モチーフを有するIR DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第一の情報伝達(IC)DNA分子の出現はサンプル中の第一の生体分子の量を反映する、第一のIC DNA分子を提供する;
c. 第二の切断モチーフを有するIR DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第二の情報伝達(IC)DNA分子の出現はサンプル中の第二の生体分子の量を反映する、第二のIC DNA分子を提供する;
d. 相補的な一本鎖ストレッチの結合を可能にする条件下で工程a〜cのDNA分子を混合する;
e. 消化酵素を追加し、二本鎖になった切断モチーフ部位にニックを引き起こし、それにより
i. 第一のIC DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含む、第一のレポータータグDNA分子または配列の結合を可能にする第一のレポータータグ結合部位、および/または
ii. 第二のIC DNA分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含む、第二のレポータータグDNA分子または配列の結合を可能にする第二のレポータータグ結合部位、
を形成する;
f. 以下の選択肢のいずれか一つによってレポータータグDNA配列を組み込む:
i. 第一のレポータータグDNA分子および第二のレポータータグDNA分子を追加することにより、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のレポータータグDNA分子は、第一のレポータータグ結合部位でIR DNA分子に組み込まれる、および/または第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のレポータータグDNA分子は、第二のレポータータグ結合部位でIR DNA分子に組み込まれる;または
ii. DNAポリメラーゼおよびヌクレオチドを使用して、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のICオリゴヌクレオチド上の第一のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第一のレポータータグDNA配列をIR DNA分子に組み込む、および/または
第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のICオリゴヌクレオチド上の第二のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第二のレポータータグDNA配列をIR DNA分子に組み込む;および
IR DNA分子をライゲーションするライゲーション酵素を追加して、それにより再構築されたIR DNA分子を提供する;
g. 工程fで再構築されたIR DNA分子を任意で増幅する;
h. サンプル中の第一のおよび/または第二の生体分子の出現および/または相互作用の測定(measurement)として、再構築されたIR DNA分子中の第一のおよび/または第二のレポータータグの組み込みを測定する(monitor)、
工程を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記切断モチーフ部位は、ウラシルまたは制限部位から選択される、請求項3に記載の方法。
- 切断モチーフ部位においてニックを引き起こすために使用される前記消化酵素(単数または複数)は、
i. 二本鎖制限部位の3’をニッキングするニッキングエンドヌクレアーゼ3’ Nb.Bsr.DI、
ii. 二本鎖制限部位の5’をニッキングするニッキングエンドヌクレアーゼ5’ 、Nt.BsmAI、または
iii. 二本鎖部位においてウラシル塩基を除去するウラシル−DNAグリコシラーゼ(Uracil−DNA glycosylase ;UDG)、および脱ピリミジン部位を除去するEndoIVの組み合わせ、
から選択される、請求項3または4に記載の方法。 - 前記測定(monitoring)は、
a. 第一のレポータータグDNA分子の少なくとも一部に相補的な第一の標識検出オリゴヌクレオチド、および第二のレポータータグDNA分子の少なくとも一部に相補的な第二の標識検出オリゴヌクレオチド、を提供する、および
b. 第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチドを、場合により増幅される再構築されたIR DNA分子にハイブリダイズさせる、
工程によって実行される、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 線状の再構築されたIR DNA分子が増幅され、その後分離方法、たとえば電気泳動またはクロマトグラフィーによって分離され、ここで異なるサイズを有する分離産物が異なるレポータータグの組み込みを示す、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なるレポータータグの組み込みはシーケンシングによってモニター(monitor)される、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再構築されたIR DNA分子が形成されたサンプル中でたとえば顕微鏡によってモニター(monitor)される、または前記再構築されたIR DNA分子が形成されたサンプルから、続いてたとえば顕微鏡による単一分子の分類および分析によって回収される、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 脱塩基性部位を除去し、検出効率を改善するための請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法であって、前記レポータータグ分子が追加され、第一の、および/または第二のレポータータグがIRに組み込まれた後で、以下の工程が実行される、方法:
i. 消化テンプレートをIR DNA分子にハイブリダイズさせて残りの脱塩基部位周辺を二本鎖にする;
ii. 好適な制限酵素、たとえばEndoIVで二本鎖領域を消化することにより、脱塩基部位を除去する;
iii. 好適なポリメラーゼ、たとえばT4 DNAポリメラーゼで消化領域をギャップ充填し、欠損塩基、たとえばチミジンを追加する;およびIR DNA分子をリガーゼ、たとえばT4リガーゼでライゲーションし、再構築されたIR DNA分子を提供する。 - 請求項1または2に記載の方法であって、
a. ここで、第一および第二のICオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されるヘアピン構造を含み、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるよう設計されており、そしてここで各フルオロフォアは固有のシグナルを有する;
b. ここで、第一および第二のICオリゴヌクレオチド中のヘアピンは、
i. 第一または第二のICオリゴヌクレオチドに相補的な活性化オリゴヌクレオチドを提供し、それにより第一または第二のICオリゴヌクレオチドに結合する、または
ii. 一つまたは両方のICオリゴヌクレオチドのヘアピン中の鎖の一つを分解し、それにより第一、および/または第二のICオリゴヌクレオチドの一本鎖ストレッチを解放する、
のいずれかによって破壊または不安定化され、そのため、第一および第二のICオリゴヌクレオチドは互いに相互作用し、フルオロフォアおよびクエンチャーの再配置を引き起こすことができる;
c. ここで、第一または第二のICオリゴヌクレオチドに結合した親和性試薬を含む複合体のペアが、親和性試薬が結合する二つの生体分子間の近接性を調べる(interrogate)ために使用され、ここで第一のフルオロフォアのシグナルパターンは第一のおよび第二の生体分子間の相互白湯により示され、そして第二のフルオロフォアのシグナルパターンは、第一および第二の生体分子間の相互作用によってオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置の再構築を引き起こす結果として、第一のおよび第二の生体分子間の相互作用の欠損により示される。 - 前記第一のおよび前記第二の生体分子はタンパク質またはポリペプチドである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルは、一つまたは複数の細胞の生物サンプル、またはタンパク質の混合物である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一のIC DNA分子は、第一の生体分子に等価なまたは標的とする第一の抗体分子に結合し、そして前記第二のIC DNA分子は、第二の生体分子に等価なまたは標的とする第二の抗体分子に結合する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 単一細胞または単一分子におけるタンパク質間相互作用を分析するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- a. 第一および第二の切断モチーフを有する、一本鎖情報受容(IR)DNA分子;
b. サンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する、第一および第二の情報伝達(IC)DNA分子であって、ここで前記第一および第二のIC DNA分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える;
c. 任意でIR DNA分子の切断モチーフ部位にニックを引き起こすための酵素;
d. 第一および第二のレポータータグDNA分子;
e. 任意で再構築されたIR DNA分子の増幅のための試薬;
f. 任意で第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチド;および
g. 任意で脱塩基部位を除去するためのDNA分子および酵素
を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。 - a. フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されたヘアピン構造を含む第一および第二の情報伝達(IC)DNA分子であって、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが固有のシグナルを有し、それによりサンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する能力を有し、ここで前記第一および第二のIC DNA分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える;および
b. 前記第一または第二のIC DNA分子に相補的であり、それにより前記第一または第二のIC DNA分子に結合する能力を有する活性化オリゴヌクレオチド
を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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