ES2870557T3 - Método para determinar los niveles de interacciones entre biomoléculas - Google Patents

Método para determinar los niveles de interacciones entre biomoléculas Download PDF

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Abstract

Método para determinar los niveles de interacción entre biomoléculas, tales como proteínas, en una muestra, que comprende proporcionar un primer y un segundo oligonucleótido portador de información (PI), en el que el primer y segundo oligonucleótido PI se unen, covalente o no covalentemente, a un primer y a un segundo reactivo de afinidad, tal como anticuerpos, que presentan la capacidad de unirse a una primera y a una segunda biomolécula, en el que el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden, cada uno, por lo menos un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de otro oligonucleótido receptor de información (RI) o un oligonucleótido activador; de esta manera, tras la hibridación de por lo menos un tramo de cadena sencilla en por lo menos uno de entre el primer y segundo oligonucleótido PI a su parte complementaria de otro oligonucleótido, resulta posible la medición de la proporción relativa de primera y segunda biomolécula interactuante y no interactuante en la muestra al nivel de células individuales o de moléculas individuales, en el que el tramo de cadena sencilla del primer y segundo oligonucleótido PI permite la interacción, (a) entre el primer y/o el segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido receptor de información (RI), en el que el oligonucleótido (RI) porta por lo menos dos sitios de motivo de corte que, tras la hibridación con un oligonucleótido PI, se convierten en bicatenarios para permitir el corte, o (b) entre el primer y/o segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido activador, en el que los oligonucleótidos PI conectados con dichos anticuerpos están diseñados para contener estructuras de horquilla, y en los que dichos oligonucleótidos PI están modificados con fluoróforos e inhibidores, que están situados de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, en el que la hibridación entre el primer y/o segundo oligonucleótido PI y el oligonucleótido activador reestructura las posiciones de los fluoróforos e inhibidores, de manera que el fluoróforo de señalización permite la discriminación entre biomoléculas interactuantes y no interactuantes.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para determinar los niveles de interacciones entre biomoléculas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para determinar los niveles de interacciones entre biomoléculas, tales como proteínas, en una muestra. Además, la invención se refiere a kits para la utilización en el método de la invención. Antecedentes técnicos
Los métodos para determinar los niveles de interacción proteína-proteína resultan esenciales en el análisis de la actividad de señalización celular. A lo largo de los años se ha desarrollado una multitud de métodos para facilitarlo. Algunos de dichos métodos se basan en constructos genéticos, en los que se fusionan proteínas candidatas con moléculas informadoras que con la interacción reconstituirán un informador funcional, es decir, ensayos de complementación de fragmentos de proteína. Son ejemplos de dichos métodos, doble híbrido de levadura (Y2H) (Fields et al., Nature 340(6230): 245-246, 1989), doble híbrido de membrana de mamífero (MaMTH) (Petschnigg et al. Nat. Methods 11(5): 585-592, 2014) y la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC, por sus siglas en inglés) (Hu et al. Mol. Cell 9(4): 789-798, 2002). Otro enfoque común es la utilización de transferencia de energía de resonancia Forster (FRET) para determinar la unión de proteínas de fusión fluorescentes, con un cambio concomitante de la emisión. Para determinar las interacciones entre proteínas, existen varios métodos basados en anticuerpos con diana en las proteínas, en los que los anticuerpos se conjugan con grupos funcionales para proporcionar el aislamiento o la detección de complejos de proteínas, tales como la FRET-coinmunoprecipitación basada en anticuerpos o el ensayo de ligación en proximidad (PLA).
El ensayo de ligación en proximidad (PLA) (p.ej., el documento n° WO2009/021031) se basa en anticuerpos conjugados con oligonucleótidos, denominados sondas de proximidad, que actúan como moldes de la ligación de dos oligonucleótidos de circularización añadidos posteriormente, para formar una molécula circular. Únicamente en el caso de que una pareja de sondas de proximidad se una a epítopos contiguos, se permitirá la creación de una molécula informadora circular. El oligonucleótido en una de las sondas de proximidad a continuación cebará una amplificación en círculo rodante (RCA). Las sondas de proximidad individuales actuarán como molde en la ligación de una molécula lineal, que no puede amplificarse mediante RCA. Por lo tanto, sólo se detectarán sucesos de proximidad, tales como interacciones proteína-proteína.
En el documento n° WO2015/118029, se da a conocer un ensayo de proximidad con detección basada en una reacción en cadena de hibridación.
Leuchowius et al. ("Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue", Molecular & Cellular Proteomics, 12(6): 1563-1571, junio de 2013) dan a conocer un ensayo de ligación en proximidad multiplex para la visualización simultánea de múltiples complejos de proteína in situ.
El documento n° WO2006/137932 se refiere a nuevas composiciones de pareja de unión de estabilidad definida y limitada que comprende marcadores de detección de ácidos nucleicos para la detección homogénea y sensible de analitos.
Descripción resumida de la invención
Aunque PLA y otros ensayos de proximidad conocidos son métodos sensibles y selectivos para detectar interacciones proteína-proteína, no resulta posible determinar la proporción de un pool de proteínas que realmente participa en una interacción.
Los dos aspectos metodológicos indicados en la presente memoria proporcionan información sobre proteínas tanto interactuantes como libres. Uno de los diseños proporciona amplificación de la señal para la detección de moléculas individuales, mediante la utilización de ADN polimerasa para amplificar un oligonucleótido de ADN que ha recibido información sobre si las proteínas interactúan o no, mientras que el otro diseño únicamente se basa en la hibridación de ADN para posicionar fluoróforos e inhibidores, de manera que señalan en diferentes colores si las proteínas son libres o interactúan unas con otras.
De esta manera, de manera general, la invención se refiere a un método para determinar los niveles de interacción entre biomoléculas, tales como proteínas, en una muestra, que comprende proporcionar un primer y un segundo oligonucleótido portador de información (PI), en el que el primer y segundo oligonucleótido PI se unen, covalente o no covalentemente, a un primer y a un segundo reactivo de afinidad, tal como anticuerpos, que presentan la capacidad de unirse a una primera y a una segunda biomolécula, en el que el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden, cada uno, por lo menos un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de otro oligonucleótido; de esta manera, tras la hibridación de por lo menos un tramo de cadena sencilla en por lo menos uno de entre el primer y segundo oligonucleótido PI a su parte complementaria de otro oligonucleótido, resulta posible la medición de la proporción relativa de primera y segunda biomolécula interactuante y no interactuante en la muestra al nivel de células individuales o de moléculas individuales.
La expresión "unión covalente o no covalente" en el presente contexto se refiere a que el reactivo o reactivos de afinidad, tales como anticuerpos, se unen al oligonucleótido PI mediante cualquier tipo de enlace químico, con la condición de que la unión sea suficientemente fuerte para permitir la interacción entre las biomoléculas que deben analizarse.
La expresión "reactivo de afinidad" típicamente se refiere a un anticuerpo o un reactivo que comprende un anticuerpo, aunque pueden utilizarse otros tipos de molécula, con la condición de que el "reactivo de afinidad" presenta la capacidad de unirse a la biomolécula que debe analizarse y, de esta manera, satisfacer el propósito de la invención. La expresión "otros tipos de molécula" podría ser, p.ej., cualquier tipo de biomolécula, tal como una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o cualquier otro tipo, que presente la capacidad de unirse a la biomolécula que debe analizarse.
La expresión "sonda PI" o "sonda" se refiere a un oligonucleótido PI unido a un reactivo de afinidad.
La expresión "medición de la proporción relativa" de biomoléculas interactuantes y no interactuantes se refiere a que pueden medirse las cantidades relativas de biomoléculas que se unen entre sí y que no se unen entre sí, lo que es un objetivo importante de la invención.
La expresión "nivel de células individuales o moléculas individuales" se refiere a que la medición de la interacción o no interacción entre biomoléculas puede llevarse a cabo para células individuales o moléculas individuales, es decir, propiedades de lectura mejoradas respecto a los métodos de la técnica anterior.
El "tramo de cadena sencilla" del primer y segundo oligonucleótido PI permite la interacción (a) entre el primer y segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido receptor de información (RI), (b) entre el primer y/o segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido activador, o (c) directamente entre el primer y segundo oligonucleótido PI. El tramo de cadena sencilla debe presentar una longitud que resulte suficiente para permitir la hibridación del tramo de cadena sencilla con una parte complementaria de otro oligonucleótido.
La expresión "oligonucleótido activador' se refiere a un oligonucleótido que tras la unión a un oligonucleótido PI puede causar la reestructuración de la hibridación intramolecular en el oligonucleótido PI y de esta manera revelar un tramo de oligonucleótidos complementario a otro oligonucleótido PI, permitiendo la hibridación entre dos oligonucleótidos PI diferentes que resultará en el reposicionamiento de fluoróforos e inhibidores.
Para poder detectar ambas proteínas interactuantes y el pool de proteínas no interactuantes, los inventores de la presente invención han desarrollado un primer aspecto el método, que puede visualizar las interacciones entre la proteína A y la proteína B informando simultáneamente de las cantidades de la proteína no interactuante A o la proteína no interactuante B al nivel de una sola célula o una sola molécula. Según dicho aspecto del método de la invención, se proporcionan los oligonucleótidos portadores de la información sobre la identidad de las proteínas o biomoléculas que deben analizarse (portador de información (PI)). A estos se hibrida una molécula de ADN de cadena sencilla preformada (receptor de información (RI)), que puede ser circular, y se corta en zonas en donde es de doble cadena, es decir, donde la molécula RI se hibrida con la molécula PI. Tras el corte, se incorpora un oligonucleótido de etiqueta corto, complementario a la molécula PI, a la molécula RI. La molécula PI ahora recreada puede amplificarse mediante RCA (en caso de ser circular) o PCR (en caso de ser lineal) y visualizarse la identidad de las etiquetas incorporadas mediante, p.ej., hibridación de oligonucleótidos de detección marcados con fluoróforo, en la que la incorporación de una o dos etiquetas proporcionará información sobre la interacción entre las proteínas o biomoléculas que deben analizarse, así como las cantidades relativas de biomoléculas o proteínas libres e interactuantes. Dicho método de análisis booleano molecular (MolBoolean) proporciona una herramienta única para determinar la relación entre proteínas libres e interactuantes, que es un requisito para el modelado matemático de la actividad de la ruta de señalización.
De esta manera, en un primer aspecto, el método de la invención comprende las etapas de:
a. proporcionar la molécula de ADN de cadena sencilla receptora de información (RI), en la que la molécula de ADN Ri es circular o lineal, y porta por lo menos un primer y un segundo motivo de corte, en el que los motivos de corte se seleccionan de manera que los sitios de motivo de corte deben convertirse en doble cadena para permitir el corte,
b. proporcionar la primera molécula de ADN portadora de información (PI), que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a la parte de la molécula de ADN RI portadora del primer motivo de corte, en el que la incidencia de la primera molécula de ADN PI refleja la cantidad de una primera biomolécula en la muestra, c. proporcionar la segunda molécula de ADN portadora de información (PI), que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a la parte de la molécula de ADN RI portadora del segundo motivo de corte, en el que la incidencia de la segunda molécula de ADN PI refleja la cantidad de una segunda biomolécula en la muestra, d. mezclar las moléculas de ADN de la etapa a-c bajo condiciones que permiten la unión de tramos de cadena sencilla complementarios,
e. añadir uno o más enzimas de digestión para crear una o más muescas en el sitio o sitios motivo de corte que se han convertido en doble cadena, formando de esta manera:
i. un primer sitio de unión de etiqueta informadora que permitirá la unión de una primera molécula o secuencia de ADN de etiqueta informadora, que comprende un tramo que es complementario a una parte de la primera molécula de a Dn PI, y/o
ii. un segundo sitio de etiqueta informadora que permitirá la unión de una segunda molécula o secuencia de ADN de etiqueta informadora que comprende un tramo que es complementario a una parte de la segunda molécula de ADN PI,
f. incorporar las secuencias de ADN de etiqueta informadora mediante una cualquiera de las alternativas siguientes:
i. añadir la primera molécula de ADN de etiqueta informadora y la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora, de manera que la primera molécula de ADN de etiqueta informadora se incorpora en la molécula de ADN PI en el sitio de unión de la primera etiqueta informadora en el caso de que se haya creado una muesca en el primer sitio motivo de corte, y/o se incorpora la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora en la molécula de ADN PI en el sitio de unión de la segunda etiqueta informadora en el caso de que se haya creado una muesca en el segundo sitio motivo de corte, o
ii. utilizar una ADN polimerasa y nucleótidos para incorporar la primera secuencia de ADN de etiqueta informadora en la molécula de a Dn PI mediante el llenado del hueco complementario al sitio de unión de la primera etiqueta informadora en el primer oligonucleótido PI en el caso de que se haya creado una muesca en el primer sitio motivo de corte, y/o para incorporar la segunda secuencia de ADN de etiqueta informadora en la molécula de ADN PI mediante llenado del hueco complementario al sitio de unión de la segunda etiqueta informadora en el segundo oligonucleótido PI en el caso de que se haya creado una muesca en el segundo motivo de corte, y añadir un enzima de ligación que liga la molécula de ADN PI, proporcionando de esta manera una molécula de ADN PI recreada,
g. opcionalmente amplificar la molécula de ADN PI recreada de la etapa f,
h. monitorizar la incorporación de la primera y/o segunda etiqueta informadora en la molécula de ADN PI recreada, como medida de la incidencia y/o interacción entre la primera y/o la segunda biomolécula en la muestra.
La molécula de ADN PI puede ser lineal o circular. Resulta importante que la molécula de ADN RI presente la capacidad de poderse corta al unirse a una molécula de ADN PI y necesita ser parcialmente complementaria a la molécula de ADN PI.
Las moléculas de ADN PI deben ser parcialmente complementarias a la molécula de ADN RI e incluir bases de ADN adicionales que actuarán como molde de la inserción de la secuencia del complemento en la molécula de ADN RI cortada.
La expresión "refleja la cantidad" de una biomolécula se refiere a que la cantidad o incidencia relativa de la molécula de ADN PI y su posterior hibridación/unión a la molécula de ADN RI, es una medida de la incidencia o cantidad relativa de biomolécula libre e interactuante en la muestra. Por lo tanto, las cantidades relativas de la primera y segunda molécula de ADN PI son una medida relativa de la cantidad o incidencia de primera y segunda biomoléculas libres e interactuantes, respectivamente, en la muestra.
La expresión "condiciones que permiten la unión de tramos de cadena sencilla complementarios" se refiere a condiciones tales como las que típicamente se indican como permisivas de hibridación restrictiva. El experto en la materia conocerá y/o podrá encontrar fácilmente las condiciones adecuadas para las reacciones de hibridación en cuestión.
La expresión "motivo de corte" se refiere, en el contexto de la presente invención, a un motivo o secuencia corta de la molécula de ADN que un enzima de restricción o similar puede reconocer. El enzima de restricción o similar que reconoce un motivo de corte a continuación podrá unirse al sitio del motivo de corte (es decir, el "sitio de motivo de corte") y, bajo determinadas condiciones, cortar o "crear una muesca" en una cadena de la molécula de ADN de doble cadena, de manera que se cree un sitio de unión para una molécula de ADN de etiqueta informadora corta, es decir, un "sitio de unión de etiqueta informadora".
Pueden utilizarse muchos posibles motivos de corte, con la condición de que permitan el corte únicamente en el caso de que el motivo se haya vuelto de doble cadena. Los motivos de corte preferentes se seleccionan de entre uracilos o sitios de restricción.
Además, el enzima o enzimas de digestión utilizados para crear muescas en los sitios de motivo de corte se seleccionan preferentemente de entre:
i. endonucleasa de corte, p.ej., Nb.Bsr.DI o Nt.BsmAl que realiza una muesca en una cadena específica en un sitio de restricción de doble cadena, o
ii. una combinación de uracil-ADN glucosilasa (UDG) que elimina una base de uracilo en un sitio de doble cadena y EndoIV, que elimina el sitio apirimidínico.
Otro enzima o combinaciones de enzimas también resultan totalmente posibles, p.ej., enzimas de restricción, enzimas utilizados en la reparación de ADN, tales como MutY o enzimas de restricción manipulados, tales como nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (Talen), con la condición de que el enzima o combinación de enzimas seleccionado permite el corte de una cadena de ADN en un sitio de doble cadena.
En una realización, la primera molécula de ADN PI se conjuga con una primera molécula de anticuerpo que es igual o presenta como diana la primera biomolécula, y la segunda molécula de ADN PI se conjuga con una segunda molécula de anticuerpo que es igual o presenta como diana la segunda biomolécula.
La molécula de ADN de etiqueta informadora es una molécula de ADN corta que es complementaria a parte de la molécula de ADN PI.
La secuencia de ADN de etiqueta informadora se crea mediante la utilización de ADN polimerasas para añadir nucleótidos, como alternativa a proporcionar molécula de ADN de etiqueta informadora (ver la etapa f(i) y f(ii), respectivamente).
De esta manera, un enfoque alternativo a transferir la información de secuencia a la molécula RI es utilizar ADN polimerasas para añadir los nucleótidos, en los que los nucleótidos de la PI actúan de molde, para sellar el hueco formado mediante la creación de muesca en el híbrido RI-PI.
El enzima o enzimas de ligación pueden seleccionarse, p.ej., de ADN ligasa o cualquier otra alternativa.
La etapa de amplificación del método puede llevarse a cabo, p.ej., mediante RCA (por sus siglas en inglés, amplificación en círculo rodante) para las moléculas de ADN RI circulares o mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para moléculas de ADN RI lineales, o cualquier otro método utilizado comúnmente. El experto en la materia podrá conocer fácilmente métodos de amplificación adecuados.
La etapa de monitorización del método de la invención puede llevarse a cabo mediante:
a. provisión de un primer oligonucleótido de detección marcado que es complementario a por lo menos una parte de la primera molécula de ADN de etiqueta informadora que ha sido incorporada en el RI, y un segundo oligonucleótido de detección marcado que es complementario a por lo menos una parte de la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora que ha sido incorporado en el RI, e
b. hibridar el primer y segundo oligonucleótido de detección marcado con la molécula de ADN RI recreada, que opcionalmente se amplifica,
en el que los marcajes del primer y segundo oligonucleótido de detección se seleccionan de entre fluoróforos que presentan diferentes longitudes de onda de lectura, fluoróforos en combinación con inhibidores (figura 3), enzimas (p.ej., peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina que puede convertir un sustrato en un precipitado de color) y moléculas con diferentes masas (las etiquetas de masa pueden registrarse mediante un espectrómetro de masas). Los marcajes evidentemente pueden seleccionarse de manera diferente con la condición de que contengan una propiedad específica que pueda medirse y registrarse.
En una realización, se amplifica una molécula de ADN RI recreada lineal y después se separa mediante un método de separación, tal como electroforesis, especialmente electroforesis en gel, o cromatografía, en la que los productos de separación presentan diferentes tamaños, que indica la incorporación de diferentes etiquetas informadoras. En otra realización, las identidades de diferentes etiquetas informadoras se monitorizan mediante secuenciación. En todavía otra realización, la molécula de ADN RI recreada se monitoriza en la muestra en donde se ha formado, tal como mediante microscopía, o en la que las moléculas de ADN RI recreadas se recogen de la muestra en donde se han formado, seguido de la separación y análisis de moléculas individuales, tal como mediante microscopía.
En una realización adicional, los oligonucleótidos se conjugan con anticuerpos, en donde los oligonucleótidos son portadores de la información sobre la identidad de cada anticuerpo (portador de información (PI)). Con dichos conjugados se hibrida una molécula preformada de ADN circular (receptor de información (RI)) y se abre mediante corte en zonas en las que es de doble cadena, es decir, donde el ADN circular está hibridado con un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido. Tras el corte, se incorpora una etiqueta de oligonucleótido corto, complementario al conjugado de anticuerpo-oligonucleótido, en el circulo, que después se liga. El círculo ahora recreado se amplifica mediante RCA y la identidad de las etiquetas incorporadas se visualiza mediante hibridación de los oligonucleótidos de detección marcados con fluoróforo. En el caso de que el producto de RCA se genera a partir de un círculo en el que sólo se ha incorporado una etiqueta, será fluorescente en sólo una longitud de onda, aunque en el caso de que se hayan incorporado dos etiquetas, se encontrará marcado con dos fluoróforos diferentes.
En todavía otra realización, se eliminan los sitios abásicos a fin de mejorar la eficiencia de la detección. Lo anterior puede llevarse a cabo después de añadir las moléculas de etiqueta informadora e incorporar la primera y/o segunda etiqueta informadora en el RI y se llevan a cabo las etapas siguientes:
i. hibridar un molde de digestión con la molécula de ADN RI, convirtiendo la zona en torno al sitio abásico remanente en bicatenaria,
ii. digerir la zona bicatenaria con un enzima de restricción adecuado, tal como EndoIV,
iii. llenar el hueco de la zona digerida con una polimerasa adecuada, tal como ADN polimerasa de T4, para añadir la base faltante, tal como tidimina, y ligar la molécula de ADN RI con una ligasa, tal como ligasa de T4, para proporcionar una molécula de ADN R i recreada.
La eliminación del sitio o sitios abásicos y la ligación de la molécula circular de esta manera mejorará la eficiencia de detección de las moléculas de ADN RI con sitios abásicos (apurínicos o apirimidínicos) remanentes después de la incorporación de la etiqueta informadora. La expresión "eficiencia mejorada de detección" se refiere a que se generan más productos de amplificación para las moléculas de ADN RI, en las que los sitios abásicos han sido eliminados.
El "molde de digestión" es típicamente un oligonucleótido que presenta una longitud que resulta suficiente para la hibridación con la molécula de ADN RI, también después de la eliminación del sitio abásico. Típicamente, la longitud es de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos, aunque pueden ocurrir variaciones con la condición de que el molde de digestión se hibride con la molécula de ADN PI bajo condiciones que permiten la hibridación.
La presente realización resulta especialmente útil para situaciones en las que los motivos para el corte en la molécula de ADN PI son uracilos, en la que se añade una timidina en el procedimiento de llenado de huecos.
Tras la realización de dichas etapas, se obtiene una molécula de ADN PI recreada, que opcionalmente puede amplificarse, seguido de la monitorización de la incorporación de la primera y/o segunda etiqueta informadora.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método en el que:
a. el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden estructuras de horquilla en las que se posicionan los fluoróforos e inhibidores, en los que las estructuras de horquilla están diseñadas de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, y en los que cada fluoróforo presenta una señal única, b. las horquillas en el primer y segundo oligonucleótido PI resultan interrumpidos o desestabilizados por:
i. la provisión de un oligonucleótido activador que es complementario al primer o segundo oligonucleótido PI, uniéndose de esta manera al primer o segundo oligonucleótido PI, o
ii. la degradación de una de las cadenas en las horquillas de uno o o ambos oligonucleótidos PI, liberando de esta manera un tramo de cadena sencilla de ADN en el primer y/o segundo oligonucleótido PI,
de manera que el primer y segundo oligonucleótido PI pueden interactuar entre sí, causando el reposicionamiento de fluoróforos e inhibidores, y
c. pares de conjugados, que comprende reactivos de afinidad acoplados con el primer o segundo oligonucleótido PI, se utilizan para interrogar la proximidad entre dos biomolécula a las que se unen los reactivos de afinidad, en el que se obtiene un primer patrón de señal de fluoróforo tras la interacción entre la primera y segunda biomolécula, y se obtiene un segundo patrón de señal de fluoróforo por la falta de interacción entre la primera y segunda biomolécula, como resultado de que los oligonucleótidos se hibridan entre sí al interactuar la primera y segunda biomolécula, causando la reestructuración de las posiciones de fluoróforos e inhibidores.
La expresión "estructura de horquilla" se refiere a una sección del oligonucleótido en la que dos tramos de la secuencia son complementarios entre sí y de esta manera se hibridan dejando un tramo de secuencia no hibridada entre ellos, de manera que la molécula en esta sección forma una estructura de tipo horquilla.
La expresión "horquillas de los oligonucleótidos PI" están "interrumpidos o desestabilizados" se refiere a que la sección del oligonucleótido que forma una horquilla resulta interrumpida de manera que la horquilla se disuelve y se forma alguna otra estructura del oligonucleótido.
La expresión "degradación de una de las cadenas en las horquillas" se refiere a que la estructura de la secuencia de nucleótidos de por lo menos parte de la sección de horquilla se disuelve.
El término "liberar" referido a un tramo de cadena sencilla de un oligonucleótido PI SE refiere a que el tramo liberado ya no se une a una parte complementaria de, p.ej., una estructura de horquilla y, por el contrario, puede, por lo menos parcialmente, hibridarse con otro oligonucleótido o sección del mismo oligonucleótido.
La expresión "oligonucleótidos PI que interactúan entre sT' se refiere a que los tramos de cadena sencilla de alguna parte de los oligonucleótidos se hibridan entre sí, causando el "reposicionamiento" y/o "reestructuración de posiciones" de los fluoróforos e inhibidores dentro de los oligonucleótidos PI.
El término "conjugados" se refiere a una combinación de reactivo de afinidad y oligonucleótido PI, en el que el reactivo de afinidad se une covalente o no covalentemente al oligonucleótido PI. De acuerdo con lo anterior, la expresión "pares de conjugados" se refiere a dos oligonucleótidos PI, cada uno unido a un reactivo de afinidad, en el que los reactivos de afinidad pueden interactuar entre sí.
La expresión "interrogar la proximidad" se refiere a que se monitoriza la proximidad y/o interacción entre los reactivos de afinidad.
La expresión "un patrón de señales de fluoróforo" se refiere a que las señales del fluoróforo (p.ej., una o dos señales de fluoróforo de diferentes longitudes de onda) son legibles, y que dicho patrón de señales es único para una determinada interacción/estructura entre los oligonucleótidos PI, mientras que otra interacción/estructura entre los oligonucleótidos PI presenta otro "patrón de señales de fluoróforo".
Dicho aspecto se basa en dos, o más, oligonucleótidos que son modificados por fluoróforos e inhibidores, que están posicionados de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz. Dichos oligonucleótidos pueden activarse, de manera que, con la unión proximal de un par de anticuerpos, conjugado con dichos oligonucleótidos, los oligonucleótidos pueden hibridarse entre sí. De esta manera, el reposicionamiento de los fluoróforos e inhibidores, de manera que los que previamente podían emitir luz ahora se encuentran inhibidores, y que revela un nuevo fluoróforo que puede emitir luz (es decir, que informa de una interacción de proteína-proteína). De esta manera, con los dos aspectos presentados, se proporciona un método que resuelve los retos técnicos de la técnica anterior y que ofrece propiedades de lectura mejoradas en comparación con métodos de la técnica anterior mediante la provisión de información sobre proteínas tanto libres como unidas a complejo al nivel de células individuales. Los métodos de la técnica anterior utilizados para detectar interacciones de proteína-proteína, tales como PLA o Y2H, proporcionan información sobre los niveles de interacción, aunque no sobre los niveles de las proteínas no interactuantes. Por lo tanto, no ha resultado posible determinar si las diferencias en los niveles de las interacciones registrados se deben a diferentes niveles de expresión de las proteínas interactuantes o si la interacción está regulada por, p.ej., modificaciones post-traduccionales de la proteína. Mediante la recuperación de información sobre los niveles de expresión de las proteínas y la proporción en que participan en un complejo proteico, que consiste en dichas proteínas, resulta posible visualizar los cambios en las constantes de disociación, que reflejan los cambios conformacionales de las proteínas que están causados por, p.ej., modificaciones post-traduccionales, en las células individuales. El método de la invención facilitará el estudio y la comprensión de las actividades de señalización celular y, por lo tanto, proporcionará una nueva herramienta de investigación con amplia aplicación clínica.
La primera y segunda biomolécula del método de la invención pueden ser, p.ej., proteínas o polipéptidos, aunque también pueden monitorizarse otras biomoléculas, tales como ADN, Arn, carbohidratos, lípidos, anticuerpos o cualquier otro tipo de biomolécula.
Típicamente, la muestra es una muestra biológica, tal como una o más células, o una mezcla de proteínas. El método de la presente invención puede utilizarse en muchas aplicaciones. En una realización preferente, el método se utiliza para analizar interacciones proteína-proteína, p.ej., en células individuales, secciones de tejidos, en líquidos corporales o en extractos de proteínas.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la utilización en el método del primer aspecto de la invención, que comprende:
a. una molécula de ADN receptora de información (RI) de cadena sencilla, que porta un primer y un segundo motivo de corte,
b. una primera y una segunda molécula de ADN portadora de información 8PI), que refleja las cantidades de una primera y una segunda biomolécula en una muestra, en la que la primera y segunda molécula de ADN PI están conjugadas con reactivos de afinidad, o se proporcionan con fracciones químicas para la utilización en la conjugación por un usuario del kit,
c. opcionalmente enzimas para crear muescas en los sitios de motivo de corte en la molécula de ADN PI, d. una primera y una segunda molécula de ADN de etiqueta informadora, y
e. opcionalmente reactivos para la amplificación de una molécula de ADN PI recreada,
f. opcionalmente, un primer y un segundo oligonucleótido de detección marcado, y
g. opcionalmente, una o más moléculas de ADN y enzimas para eliminar sitios abásicos.
La expresión "una o más moléculas de ADN y enzimas para eliminar sitios abásicos", p.ej., se refiere a moldes de digestión, tal como se han definido anteriormente, así como un enzima de restricción adecuado, polimerasa y/o ligasa, tal como se ha comentado anteriormente en la realización referida a la eliminación de uno o más sitios abásicos.
La expresión "una fracción química para la utilización en la conjugación" se refiere a que las moléculas de ADN PI se preparan con una parte química que en una etapa posterior puede utilizarse para la conjugación con un reactivo de afinidad. Dicha "fracción química" podría seleccionarse, p.ej., de entre biotina, estreptavidina, avidina, NHS-éster, maleimida, hidrazona, aldehído, alquino, azida, tiol, amina o cualquier otra fracción química adecuada. El experto en la materia concebirá otras fracciones posibles.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un kit para la utilización en el método del segundo aspecto de la invención, que comprende:
a. una primera y una segunda molécula de ADN portadora de información (PI) que comprende estructuras de horquilla en las que se posicionan fluoróforos e inhibidores, en las que las estructuras de horquilla están diseñadas de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, y en las que cada fluoróforo presenta una señal única, presentando de esta manera la capacidad de reflejar las cantidades de una primera y una segunda biomolécula en una muestra, en la que la primera y segunda molécula de ADN PI están conjugadas con reactivos de afinidad, tales como anticuerpos, o se proporcionan con fracciones químicas para la conjugación por un usuario del kit, y
b. un oligonucleótido activador que es complementario a la primera o la segunda molécula de ADN PI, presentando de esta manera la capacidad de unirse a la primera o segunda molécula de ADN PI.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: presentación esquemática de los diseños de oligonucleótidos. el círculo PI se hibrida con dos proteínas (fila superior) o una sonda PI respectiva (filas inferiores), que consiste en oligonucleótidos PI conjugados con anticuerpos (indicados como A y B) (panel izquierdo). El círculo PI se digirió mediante tratamiento enzimático, en el que el círculo PI se hibrida con una sonda PI y el oligonucleótido de etiqueta invade las sondas IP (panel intermedio). Los círculos PI se ligan nuevamente y la secuencia de etiqueta resulta incorporada (panel derecho). Figura 2: presentación esquemática de los diferentes diseños para la digestión enzimática de círculos PI, que indican las posiciones de las bases uracilo y los sitios de restricción.
Figura 3: cuantificación de los números medios de señales /- SD de tres imágenes separadas utilizando el método MolBoolean para la detección de p-catenina, E-cadherina e interacciones p-catenina-E-cadherina. Las imágenes que muestran células marcadas para p-catenina, E-cadherina e interacciones p-catenina-E-cadherina. Los bordes de los núcleos celulares están señalados en las imágenes.
Figura 4: presentación esquemática de un diseño de Invader-Molboolean, utilizando tres pigmentos Alexa y dos inhibidores Black hole. (A) En el caso de que las sondas de proximidad (anticuerpos conjugados con el oligonucleótido PI 1 o 2 (ver la Tabla)) se unan a antígenos individuales, un fluoróforo por cada sonda podrá emitir luz. Alexa555 (A555) y Alexa647 (A647), mientras que Alexa488 (A488) resultará desactivado, ya que se encuentra situado en proximidad a un inhibidor (BHQ1). (B) En el caso de que se añada un oligonucleótido activador, invadirá el oligonucleótido PI 1. En el caso de que las sondas de proximidad se encuentren en estrecha proximidad, el oligonucleótido PI 1 abierto se hibridará con el oligonucleótido PI 2, reestructurando de esta manera las posiciones de los fluoróforos e inhibidores. Ahora A555 está situado en proximidad a BHQ1 y A647 se encontrará próximo al inhibidor (BHQ3) - los dos fluoróforos resultarán inhibidos, mientras que ahora A488 se encontrará separado del inhibidor BHQ1 y emitirá luz.
Figura 5: presentación esquemática del procedimiento de llenado de huecos. En primer lugar, se hibrida un molde de digestión en el sitio AP, permitiendo que el círculo sea digerido por EndoIV. Después, la muesca creada (flecha) podrá ser llenada por la ADN polimerasa de T4, que incorporará una timidina. Una ligasa sellará el círculo con muesca, de manera que podrá amplificarse en la etapa siguiente del protocolo.
Figura 6: detección in situ de proteínas con diseño de llenado de hueco. Las sondas se incubaron sobre células HaCat bajo cuatro condiciones diferentes: con anticuerpos anti-E-cadherina y anti-p-catenina, con anticuerpos anti-E-cadherina, con anticuerpos anti-p-catenina o sin ningún anticuerpo primario (fondo). Todas las condiciones mostradas fueron normalizadas mediante la resta de la condición de fondo. Las barras de error representan errores estándares de la media (SEM, por sus siglas en inglés).
Descripción detallada de la invención
Los inventores de la presente invención han desarrollado un método general para determinar los niveles de interacción entre biomoléculas, tales como proteínas, en una muestra, que comprende proporcionar un primer y un segundo oligonucleótido portador de información (PI), en el que el primer y segundo oligonucleótido PI se unen, covalente o no covalentemente, a un primer y a un segundo reactivo de afinidad, tal como anticuerpos, que presentan la capacidad de unirse a una primera y a una segunda biomolécula, en el que el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden, cada uno, por lo menos un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de otro oligonucleótido; de esta manera, tras la hibridación de por lo menos un tramo de cadena sencilla en por lo menos uno de entre el primer y segundo oligonucleótido PI a su parte complementaria de otro oligonucleótido, resulta posible la medición de la proporción relativa de primera y segunda biomolécula interactuante y no interactuante en la muestra al nivel de células individuales o de moléculas individuales.
El método se ejemplifica en la presente descripción mediante dos enfoques alternativos: uno que utiliza tecnología de fluoróforo/inhibidor en combinación con estructuras de horquilla en los oligonucleótidos PI que están diseñados de manera que sólo un fluoróforo por cada oligonucleótido PI pueda emitir luz, y uno que, además de los oligonucleótidos PI, utiliza un oligonucleótido RI (receptor de información) que porta por lo menos dos sitios de motivo de corte que deben convertirse en bicatenarios para permitir el corte. Mediante la utilización de cualquiera de dichos enfoques, puede medirse la proporción relativa de biomoléculas interactuantes y no interactuantes en una muestra a nivel de células individuales o de moléculas individuales.
De esta manera, para uno de los aspectos del método de la invención, los inventores de la presente invención han diseñado un sistema de oligonucleótido que consiste en una molécula de ADN circular de cadena sencilla (receptor de información (RI)), que porta un motivo para el corte, p.ej., uracilos o sitios de restricción. El sistema de oligonucleótido ha sido creado para que el corte requiera que los sitios sean de doble cadena, que solo lo serán en el caso de que se una a un oligonucleótido complementario. Dichos oligonucleótidos complementarios (portadores de información (PI)) han sido diseñados para que consistan en una estructura de horquilla flanqueada por tramos de ADN de cadena sencilla que serían complementarios al círculo RI. Las muescas creadas en los círculos RI facilitarán que un oligonucleótido de etiqueta corto añadido después complementario a partir de las sondas PI invada las horquillas de los oligonucleótidos PI y resulte ligado dentro del círculo PI. Alternativamente, puede llevarse a cabo el llenado de huecos con una ADN polimerasa, con molde de las sondas PI. Para sellar los huecos y recrear una molécula de ADN circular, se añade ADN ligasa. Pueden utilizarse etiquetas únicas y horquillas de los oligonucleótidos PI para transferir información al círculo PI del oligonucleótido PI al que se ha unido. Al unirse un círculo PI a dos oligonucleótidos PI diferentes, se incorporan ambas etiquetas correspondientes. Mediante la conjugación de los oligonucleótidos PI a anticuerpos, tal como en una realización, los inventores han creado un método en el que los círculos PI pueden utilizarse para monitorizar si dos proteínas están interactuando, es decir, si se han incorporado ambas etiquetas en el círculo PI. Los anticuerpos se seleccionan contra las proteínas que se pretenden estudiar. Para las proteínas que no interactúan, sólo se incorporará una etiqueta en el círculo PI (figura 1).
Se sometieron a ensayo diferentes enfoques de corte para abrir el círculo e integrar la etiqueta. El círculo PI puede abrirse mediante corte por una endonucleasa creadora de muescas que sólo corta una de las cadenas en su diana de doble cadena. Alternativamente, podría crearse una muesca mediante eliminación de una base uracilo con ayuda de la combinación de enzimas UNG y EndoIV. Para las endonucleasas de creación de muesca, los inventores han sometido a ensayo dos enzimas diferentes. Nb.BsrDl, que realizará un corte en el lado 3' de la horquilla (3' Nb.BsrDI) y Nt.BsmAl, que corta en el lado 5' (5' Nt.BsmAl). Los inventores también han sometido a ensayo la eficiencia en el corte mediante la incorporación de la base uracilo en el lado 3' o en el lado 5' (3'-uracilo y 5'-uracilo) en relación a la horquilla. (Figura 2). Con ayuda de Nupack.org, los inventores han diseñado y analizado todas las secuencias de oligonucleótidos para garantizar estructuras secundarias e hibridaciones correctas (Tabla 1).
Los círculos PI recreados, que contienen las etiquetas incorporadas, a continuación pueden amplificarse mediante amplificación en círculo rodante (RCA), cebada a partir de una de las sondas PI. Los productos de RCA contienen varios cientos de repeticiones del RI. A continuación, las identidades de los productos de RCA pueden descodificarse mediante hibridación de los oligonucleótidos de detección marcados, complementarios a las partes del producto de RCA en el que se han incorporado las etiquetas. El marcaje de los oligonucleótidos de detección podría ser, p.ej., de diferentes fluoróforos, enzimas o moléculas con diferentes masas, según qué lectura se utilice. El producto de RCA de marcaje único será el resultado de la incorporación de solo una etiqueta, mientras que los productos de RCA de doble marcaje serán una consecuencia de la incorporación de dos etiquetas.
Un ejemplo de la posible apariencia del resultado se muestra en la figura 3. En la presente invención, los inventores utilizando el diseño de 5'-uracilo, conjugando los oligonucleótidos PI con anticuerpos antiratón y anticonejo. Se sometieron a ensayo dichas sondas PI en la línea celular MCF10 con un anticuerpo de ratón con diana en E-cadherina y un anticuerpo de conejo con diana en p-catenina. Los complejos que contenían p-catenina y E-cadherina resultarán en productos de RCA detectados tanto con Cy3 como con FITC, mientras que las proteínas no interactuantes dieron lugar a productos de RCA marcados con Cy3 o FITC. Las diferentes identidades de los productos de RCA se determinaron utilizando el software CellProfiler y los diferentes tipos de productos de RCA se pseudocolorearon para visualizar la interacción entre la p-catenina y la E-cadherina, así como las proteínas individuales p-catenina y E-cadherina.
Un enfoque alternativo de extracción de información es utilizar un círculo PI o molécula de RI lineal para interrogar la proximidad entre las sondas PI. Tras la ligación de secuencias de etiqueta, las moléculas PI recreadas pueden amplificarse mediante PCR y separarse mediante electroforesis en gel. Las diferencias de tamaño indican la incorporación de diferentes etiquetas. También resultaría posible amplificar moléculas PI individuales y descodificar las identidades de las diferentes etiquetas mediante secuenciación de los amplicones.
Los análisis MolBoolean pueden llevarse a cabo en células, en mezclas de proteínas (en mezclas en bruto o separadas, p.ej., mediante electroforesis en gel). Las moléculas PI recreadas pueden interrogarse directamente en la muestra en la que se han formado (p.ej., mediante microscopía, tal como se muestra en la figura 3) en el caso de que la plataforma de lectura soporte la detección de moléculas individuales, o las moléculas PI recreadas pueden recogerse y posteriormente pueden separarse y analizarse individualmente moléculas individuales.
En algunos casos, los sitios abásicos (sitios AP) remanentes en la molécula PI pueden interferir con la eficiencia de amplificación y/o detección. Como medio de mejora de la eficiencia de detección y para reducir el riesgo de que sitios abásicos (sitios AP) no digeridos de las moléculas PI circulares bloqueen la señal, los inventores han modificado el diseño con una versión de diseño alternativa (figura 5). Con el fin de eliminar los sitios abásicos, se añadieron dos etapas después de la etapa de incorporación de las etiquetas. En la primera etapa adicional, se hibridó un molde de digestión con el ADN circular, convirtiendo la zona en torno al sitio AP en bicatenaria. El sitio abásico seguidamente se eliminó mediante digestión con EndoIV. En la etapa siguiente, se llevó a cabo el llenado de huecos con ADN polimerasa de T4 para añadir la timidina faltante y con ligasa de T4 para cerrar la muesca mediante ligación.
Se evaluó el diseño del llenado de huecos utilizando el ensayo de interacción de E-cadherina y p-catenina anteriormente indicado (figura 6). Se detectó la interacción de la E-cadherina y p-catenina junto con una cantidad notablemente más elevada de E-cadherina total, que era igual a la cantidad total de E-cadherina en el caso de que sólo se encontrase presente ese anticuerpo. De manera similar, la cantidad total de p-catenina se mantuvo en un nivel comparable bajo ambas condiciones en que se utilizó ese anticuerpo.
Para el otro aspecto del método de la invención, los inventores desarrollaron un enfoque alternativo de monitorización de proteínas tanto libres como interactuantes. En dicho enfoque, los oligonucleótidos PI que están conectados a los anticuerpos están diseñados para contener estructuras de horquilla. Mediante la unión de fluoróforos e inhibidores a dichas horquillas, se permite que los fluoróforos emitan luz únicamente en el caso de que se encuentren separados por una distancia de los inhibidores. El posicionamiento de fluoróforos e inhibidores facilitará que sólo un fluoróforo de cada uno de dichos oligonucleótidos PI pueda emitir luz. Una vez el oligonucleótido PI se ha unido a sus dianas, guiado por los anticuerpos conectados a ellas, una de las estructuras de horquilla resultará desestabilizada por la invasión de un oligonucleótido activador. Lo anterior modificará la conformación del oligonucleótido PI y revelará un tramo de ADN que previamente se encontraba oculto en el tallo, que es inversamente complementario a un tramo del segundo oligonucleótido PI. El primer oligonucleótido PI desestabilizado/activado se hibridará con el segundo oligonucleótido PI, únicamente en el caso de que se encuentren unidos a moléculas diana en estrecha proximidad, que reposicionará los fluoróforos e inhibidores de manera que los que previamente habían emitido luz ahora estén inhibidos y un fluoróforo que se encontraba inhibido en uno de los oligonucleótidos PI resulte separado del inhibidor. Dicho fluoróforo solo podrá emitir luz en el caso de que una pareja de oligonucleótidos PI se hibride. Por lo tanto, la fluorescencia de las proteínas libres e interactuantes puede registrarse simultáneamente a diferentes longitudes de onda. Dicho método, en la presente memoria denominado Invader-MolBoolean se describe en la figura 4. Con ayuda de Nupack.org, los inventores han diseñado y analizado todas las secuencias de oligonucleótidos para garantizar estructuras secundarias e hibridaciones correctas (Tabla 1).
A continuación, se describe la invención en mayor detalle en referencia a los ejemplos no limitativos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Detección in situ de la interacción de beta-catenina y E-cadherina:
El ADN circular receptor de información se creó mediante ligación de dos fragmentos de cadena sencilla (es decir, círculo PI fragmentos 1 y 2 (ver la Tabla 1)), que porta motivos que garantizarán la hibridación correcta, es decir, las dos estructuras de horquilla en el círculo. Se mezclaron los dos oligonucleótidos a una concentración final de 1 pM en tampón de ligación de T4. Después, se añadieron 0,02 U/pl de ligasa de T4 a la mezcla y se incubó durante 2 h a 37°C seguido de una incubación de 48 h a 4°C.
Se concentraron 350 pg de anticuerpo, anticonejo o de burro antiratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, EE.UU.) por cada sonda PLA conjugada, utilizando la unidad de filtración centrífuga Amicon Ultra 10K (Merck Millipore, Massachusetts, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante hasta la concentración de 3 mg/ml en PBS. Se disolvió entrecruzante S-HyNic (Solulink, San Diego, EE.UU.) en DMSO a 20 mM y el entrecruzante y el anticuerpo se mezclaron con un exceso 25x molar de entrecruzante respecto al anticuerpo. La mezcla se incubó bajo agitación suave a temperatura ambiente y se protegió de la luz, durante 2 horas. Tras la activación de los anticuerpos, se intercambió el tampón por tampón de NaHPO4100 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, mediante columnas desaladoras centrífugas Zeba prelavadas de 7K de MWCO (Thermo Scientific). Después del intercambio de tampones, el anticuerpo se mezcló con un oligonucleótido modificado con aldehído (Tabla 1) en una proporción de anticuerpo:oligonucleótido de 1:3. Se añadió anilina, a una concentración final de 10 mM, para catalizar la reacción. La mezcla de anticuerpo-oligonucleótido se incubó bajo agitación suave a temperatura ambiente y se protegió de la luz, durante 2 horas. Inmediatamente después de la incubación, se intercambió el tampón por PBS utilizando columnas desaladoras centrífugas Zeba prelavadas de 7K de MWCO (Life Technologies). Tras la conjugación, los conjugados se purificaron a partir de anticuerpo no conjugado y oligonucleótido mediante HPLC ÁKTA Pure (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) utilizando una columna Superdex 200 107300 (GE Healthcare). Las fracciones recogidas de la purificación mediante HPLC se concentraron a 80 pl mediante una unidad de filtración centrífuga Amicon Ultra 10K (Merck Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante y se validaron mediante electroforesis. Los conjugados se mezclaron con tampón de muestra de TBE-Urea Novex (Life Technologies) y se separaron en gel de TBE-Urea Novex al 10% (Life Technologies) con 180 V durante 50 minutos. Se visualizó el ADN utilizando la tinción en gel de ácidos nucleicos SYBR Gold (Life Technologies) y las proteínas utilizando tinción de Coomassie (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). El gel se visualizó con Bio-Rad Gel-Doc XR (Bio-Rad). Se determinaron las concentraciones de los conjugados utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Life Technologies).
Las células en un portaobjetos de microscopía se fijaron con PFA al 3,7% durante 10 minutos y después se permeabilizaron en 1x PBS con Triton X100 al 0,2% y después se lavaron dos veces en 1x PBS antes de añadir solución de bloqueo; solución de bloqueo Odyssey al 50% (n° de cat. 927-50000, LiCor) en 1x TBS. Tras 30 min de bloqueo a 37°C en una cámara húmeda, las células se incubaron con anti-E-cadherina (n° de cat. BD610182, BD Biosciences, diluido 1:100) y anti-beta-catenina (n° de cat. sc7199, Santacruz, diluido 1:200) en solución de bloqueo durante la noche a 4°C. Cada portaobjetos se lavó tres veces durante tres minutos en 1x TBS con Tween-20 al 0,05% (TBST).
Las sondas PI Molboolean se mezclaron en solución de bloqueo, a una concentración final de 100 ng/ml y se incubaron con las células durante 60 minutos a 37°C. A continuación, los portaobjetos se lavaron tres veces, durante tres minutos, en TBST. El círculo PI Moolboolean se diluyó a 0,025 pM en tampón de ligación de T4 complementado con 0,25 mg/ml de BSA para permitir la hibridación del círculo con las sondas PI, incubándolo simultáneamente durante 30 minutos a 37°C con las células. Después, las células se lavaron dos veces en TBST durante tres minutos cada vez y después se incubaron con enzimas de digestión dependientes del diseño a 37°C. El diseño de 5'-uracilo se digirió con 0,1 U/pl de endo-IV y 0,05 U/pl de UNG en Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) con NaCl 30 mM, EDTA 1 mM, KCl 100 mM, DTT 1 mM y 0,25 mg/ml de BSA durante 45 minutos antes del lavado. Simultáneamente, el diseño 5' Nt.BsmAI se incubó con 0,125 U/pl de enzima Nt.BsmAI diluido en 1x NEBuffer Cut smart complementado con 0,25 mg/ml de BSA, durante 1 h. Las células se lavaron durante 3 min dos veces en TBST y después se incubaron durante 30 min a 37°C con las etiquetas 1 y 2, ambas a 0,125 pM, en presencia de 0,05 U/pl de ligasa de T4 en tampón de ligación de T4 complementado con 0,25 mg/ml de BSA. Después de la ligación, se realizó otro lavado en TBST (2x3 min).
El diseño de llenado de huecos introduce dos etapas adicionales: los portaobjetos se incubaron con 0,05 pM de molde de digestión junto con 0,01 U/pl de Endo-IV en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) con NaCl 30 mM, EDTA 1 mM, KCl 100 mM, DTT 1 mM y 0,25 mg/ml de BSA, durante 60 min a TA. Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 3 min en TBST. Para llenar los huecos, los portaobjetos se incubaron con 0,025 U/pl de ADN polimerasa de T4 y 0,05 U/pl de ligasa de T4 en 1x tampón de ligasa de T4 complementado con 0,25 mg/ml de BSA y dNTP 0,1 mM, durante 30 min a TA. Seguidamente las células se lavaron dos veces en TBST, 3 min cada vez.
Después, se llevó a cabo una reacción de RCA en los círculos recién formados, a fin de amplificar la señal, durante 60 min a 37°C. La RCA se catalizó con 0,5 U/pl de phi29 en la solución siguiente: Tris 33 mM, Mg-acetato 10 mM, K-acetato 66 mM, Tween-20 al 0,1%, DTT 1 mM, 7,5 ng/ml de poliA y dNTP 0,25 mM. Se lavó dos veces durante tres minutos en TBST. Los productos de RCA se detectaron mediante hibridación de DO1 y 20,025 pM a ellos en PBS complementado con 0,0025 pg/ml de ADN de esperma de salmón y 0,25 mg/ml de BSA, y la mezcla también contenía 0,04 mg/ml de Hoechst 33342 para la tinción de los núcleos.
Después de la tinción se realizaron dos lavados de 10 min en 1xTBS y un lavado de 15 min en 0,2x TBS y el portaobjetos seguidamente se secó con EtOH al 70% y se montó utilizando Vectasheld.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Método para determinar los niveles de interacción entre biomoléculas, tales como proteínas, en una muestra, que comprende proporcionar un primer y un segundo oligonucleótido portador de información (PI), en el que el primer y segundo oligonucleótido PI se unen, covalente o no covalentemente, a un primer y a un segundo reactivo de afinidad, tal como anticuerpos, que presentan la capacidad de unirse a una primera y a una segunda biomolécula, en el que el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden, cada uno, por lo menos un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de otro oligonucleótido receptor de información (RI) o un oligonucleótido activador; de esta manera, tras la hibridación de por lo menos un tramo de cadena sencilla en por lo menos uno de entre el primer y segundo oligonucleótido PI a su parte complementaria de otro oligonucleótido, resulta posible la medición de la proporción relativa de primera y segunda biomolécula interactuante y no interactuante en la muestra al nivel de células individuales o de moléculas individuales, en el que el tramo de cadena sencilla del primer y segundo oligonucleótido PI permite la interacción,
    (a) entre el primer y/o el segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido receptor de información (RI), en el que el oligonucleótido (RI) porta por lo menos dos sitios de motivo de corte que, tras la hibridación con un oligonucleótido PI, se convierten en bicatenarios para permitir el corte, o
    (b) entre el primer y/o segundo oligonucleótido PI y un oligonucleótido activador, en el que los oligonucleótidos PI conectados con dichos anticuerpos están diseñados para contener estructuras de horquilla, y en los que dichos oligonucleótidos PI están modificados con fluoróforos e inhibidores, que están situados de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, en el que la hibridación entre el primer y/o segundo oligonucleótido PI y el oligonucleótido activador reestructura las posiciones de los fluoróforos e inhibidores, de manera que el fluoróforo de señalización permite la discriminación entre biomoléculas interactuantes y no interactuantes.
    Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
    a. proporcionar la molécula de ADN de cadena sencilla receptora de información (RI), en la que la molécula de ADN RI es circular o lineal, y porta por lo menos un primer y un segundo motivo de corte, en el que los motivos de corte se seleccionan de manera que los sitios de motivo de corte deben convertirse en doble cadena para permitir el corte,
    b. proporcionar la primera molécula de ADN portadora de información (PI), que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a la parte de la molécula de ADN RI portadora del primer motivo de corte, en el que la incidencia de la primera molécula de ADN PI refleja la cantidad de una primera biomolécula en la muestra,
    c. proporcionar la segunda molécula de ADN portadora de información (PI), que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a la parte de la molécula de ADN RI portadora del segundo motivo de corte, en el que la incidencia de la segunda molécula de ADN PI refleja la cantidad de una segunda biomolécula en la muestra,
    d. mezclar las moléculas de ADN de la etapa a-c bajo condiciones que permiten la unión de tramos de cadena sencilla complementarios,
    e. añadir uno o más enzimas de digestión para crear una o más muescas en el sitio o sitios motivo de corte que se han convertido en doble cadena, formando de esta manera:
    i. un primer sitio de unión de etiqueta informadora que permitirá la unión de una primera molécula o secuencia de ADN de etiqueta informadora, que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de la primera molécula de ADN PI, y/o
    ii. un segundo sitio de etiqueta informadora que permitirá la unión de una segunda molécula o secuencia de ADN de etiqueta informadora que comprende un tramo de cadena sencilla que es complementario a una parte de la segunda molécula de ADN PI,
    f. incorporar las secuencias de ADN de etiqueta informadora mediante una cualquiera de las alternativas siguientes:
    i. añadir la primera molécula de ADN de etiqueta informadora y la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora, de manera que la primera molécula de ADN de etiqueta informadora se incorpora en la molécula de ADN PI en el sitio de unión de la primera etiqueta informadora en el caso de que se haya creado una muesca en el primer sitio motivo de corte, y/o se incorpora la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora en la molécula de ADN PI en el sitio de unión de la segunda etiqueta informadora en el caso de que se haya creado una muesca en el segundo sitio motivo de corte, o
    ii. utilizar una ADN polimerasa y nucleótidos para incorporar la primera secuencia de ADN de etiqueta informadora en la molécula de ADN PI mediante el llenado del hueco complementario al sitio de unión de la primera etiqueta informadora en el primer oligonucleótido PI en el caso de que se haya creado una muesca en el primer sitio motivo de corte, y/o para incorporar la segunda secuencia de ADN de etiqueta informadora en la molécula de ADN PI mediante llenado del hueco complementario al sitio de unión de la segunda etiqueta informadora en el segundo oligonucleótido PI en el caso de que se haya creado una muesca en el segundo motivo de corte, y añadir un enzima de ligación que liga la molécula de ADN PI, proporcionando de esta manera una molécula de ADN PI recreada,
    g. opcionalmente amplificar la molécula de ADN PI recreada de la etapa f,
    h. monitorizar la incorporación de la primera y/o segunda etiqueta informadora en la molécula de ADN PI recreada, como medida de la incidencia y/o interacción entre la primera y/o la segunda biomolécula en la muestra.
    3. Método según la reivindicación 2, en el que los motivos de corte se seleccionan de entre uracilos o sitios de restricción.
    4. Método según la reivindicación 2 o 3, en el que el enzima o enzimas de digestión utilizados para crear muescas en los sitios de motivo de corte se seleccionan de entre:
    i. endonucleasa de creación de muesca 3' Nb.Bsr.DI que crea una muesca 3' respecto a un sitio de restricción de doble cadena,
    ii. endonucleasa de creación de muesca 5' Nt.BsmAI que crea una muesca 5' respecto a un sitio de restricción de doble cadena, o
    iii. una combinación de uracil-ADN glucosilasa (UDG) que elimina una base de uracilo en un sitio de doble cadena y EndoIV, que elimina el sitio apirimidínico.
    5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la monitorización se lleva a cabo mediante:
    a. provisión de un primer oligonucleótido de detección marcado que es complementario a por lo menos una parte de la primera molécula de ADN de etiqueta informadora y un segundo oligonucleótido de detección marcado que es complementario a por lo menos una parte de la segunda molécula de ADN de etiqueta informadora, y
    b. hibridar el primer y segundo oligonucleótido de detección marcado con la molécula de ADN RI recreada que, opcionalmente se amplifica,
    6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que se amplifica una molécula de ADN RI recreada lineal y después se separa mediante un método de separación, tal como electroforesis o cromatografía, en la que los productos de separación presentan diferentes tamaños, que indica la incorporación de diferentes etiquetas informadoras.
    7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que las identidades de las diferentes etiquetas informadoras se monitorizan mediante secuenciación.
    8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la molécula de ADN RI recreada se monitoriza en la muestra en donde se ha formado, tal como mediante microscopía, o en la que la molécula de ADN RI recreada se recoge de la muestra en donde se han formado, seguido de la separación y análisis de moléculas individuales, tal como mediante microscopía.
    9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para la eliminación de sitios abásicos y la mejora de la eficiencia de detección, en el que después de que las moléculas de etiqueta informadora hayan sido añadidas y la primera y/o segunda etiqueta informadora se haya incorporado en el RI, se llevan a cabo las etapas siguientes:
    i. hibridar un molde de digestión con la molécula de ADN RI, convirtiendo la zona en torno al sitio abásico remanente en bicatenaria,
    ii. eliminar el sitio abásico mediante digestión de la zona de doble cadena con un enzima de restricción adecuado, tal como EndoIV,
    iii. llenar el hueco de la zona digerida con una polimerasa adecuada, tal como ADN polimerasa de T4, para añadir la base faltante, tal como tidimina, y ligar la molécula de ADN RI con una ligasa, tal como ligasa de T4, para proporcionar una molécula de ADN RI recreada.
    10. Método según la reivindicación 1,
    a. en el que el primer y segundo oligonucleótido PI comprenden estructuras de horquilla en las que se posicionan los fluoróforos e inhibidores, en los que las estructuras de horquilla están diseñadas de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, y en los que cada fluoróforo presenta una señal única,
    b. en el que las horquillas en el primer y segundo oligonucleótido PI se interrumpen o desestabilizan mediante la provisión de un oligonucleótido activador que es complementario al primer o segundo oligonucleótido PI, uniéndose de esta manera al primer o segundo oligonucleótido PI de manera que el primer y segundo oligonucleótido PI puedan interactuar entre sí causando un reposicionamiento de fluoróforos e inhibidores,
    c. en el que pares de conjugados, que comprende reactivos de afinidad acoplados con el primer o segundo oligonucleótido PI, se utilizan para interrogar la proximidad entre dos biomoléculas a las que se unen los reactivos de afinidad, en el que se obtiene un primer patrón de señales de fluoróforo tras la interacción entre la primera y segunda biomolécula, y se obtiene un segundo patrón de señal de fluoróforo por la falta de interacción entre la primera y segunda biomolécula, como resultado de que los oligonucleótidos se hibridan entre sí al interactuar la primera y segunda biomolécula, causando la reestructuración de las posiciones de fluoróforos e inhibidores.
    11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera y la segunda biomolécula son proteínas o polipéptidos.
    12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una muestra biológica de una o más células, o una mezcla de proteínas.
    13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera molécula de ADN PI se conjuga con una primera molécula de anticuerpo que es igual o presenta como diana la primera biomolécula, y la segunda molécula de ADN PI se conjuga con la segunda molécula de anticuerpo que es igual o presenta como diana la segunda biomolécula.
    14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para analizar las interacciones de proteínaproteína en células individuales o en moléculas individuales.
    15. Kit para la utilización en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 a 14, que comprende:
    a. una molécula de ADN receptora de información (RI) de cadena sencilla, que porta un primer y un segundo motivo de corte,
    b. una primera y una segunda molécula de ADN portadora de información (PI), que refleja las cantidades de una primera y una segunda biomolécula en una muestra, en la que la primera y segunda molécula de ADN PI están conjugadas con reactivos de afinidad, o se proporcionan con fracciones químicas para la conjugación por un usuario del kit,
    c. opcionalmente, enzimas para crear muescas en los sitios de motivo de corte en la molécula de ADN PI,
    d. una primera y una segunda molécula de ADN de etiqueta informadora,
    e. opcionalmente, reactivos para la amplificación de una molécula de ADN PI recreada, f. opcionalmente, un primer y un segundo oligonucleótido de detección marcado, y g. opcionalmente una o más moléculas de ADN y los enzimas para eliminar los sitios abásicos.
    16. Kit para la utilización en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 10 a 14, que comprende:
    a. una primera y una segunda molécula de ADN portadora de información (PI) que comprende estructuras de horquilla en las que se posicionan fluoróforos e inhibidores, en las que las estructuras de horquilla están diseñadas de manera que únicamente un fluoróforo por cada oligonucleótido puede emitir luz, y en las que cada fluoróforo presenta una señal única, presentando de esta manera la capacidad de reflejar las cantidades de una primera y una segunda biomolécula en una muestra, en la que la primera y segunda molécula de ADN PI están conjugadas con reactivos de afinidad o se proporcionan con fracciones químicas para la conjugación por un usuario del kit, y
    b. un oligonucleótido activador que es complementario a la primera o la segunda molécula de ADN PI, presentando de esta manera la capacidad de unirse a la primera o segunda molécula de ADN PI.
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