FI68261B - Foerfarande foer framstaellning av en rekombinations-dna-molekyl vilken har en humant korionsomatomammotropin kodande nukleotidsekvens - Google Patents

Description

68261

Menetelmä ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koo-daavan nukleotidisekvenssin sisältävän yhdistelmä-DNA-molekyy-lin valmistamiseksi 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 781676

Elävät organismit pystyvät syntetisoimaan mitä erilaisimpia proteiineja ja peptidejä. Useat proteiinit ja peptidit ovat käyttökelpoisia lääketieteessä, maatalou-10 dessa tai teollisuudessa. Eräät proteiinit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat monimutkaisia kemiallisia reaktioita. Toiset toimivat hormoneina, jotka vaikuttavat eliön kasvuun ja kehitykseen tai kudosten toimintaan lääketieteellisesti merkittävällä tavalla. Tietyillä sideprote-15 iineilla saattaa olla kaupallista merkitystä, kun halutaan eristää ja puhdistaa aineita tai poistaa epäpuhtauksia. Sekä proteiinit että peptidit koostuvat lineaarisista ami-nohappojetjuista, ja jälkimmäistä termiä käytetään lyhyistä yksiketjuisista sekvensseistä ja edellistä pitkistä moni-20 ketjuisista aineista. Tämän keksinnön sisältämät periaatteet soveltuvat yhtä hyvin proteiineihin kuin peptideihin.

Proteiinit ja peptidit ovat yleensä suurimolekyy-lisiä aineita joilla kullakin on spesifinen aminohappo-sekvenssi. Pieniä peptidejä lukuunottamatta on proteinien 25 ja peptidien kemiallinen synteesi usein epäkäytännöllistä, kallista ja aikaavievää ja jopa mahdotonta. Jotta halutulla proteiinilla olisi käytännön merkitystä, se pitää useimmiten ensin eristää organismista, joka valmistaa sitä. Usein on haluttua proteiinia läsnä vain pienenä pitoisuu-30 tena. Halutun proteiinin lähdettä on yleensä käytettävissä niin vähän, että proteiinia ei saada tarpeeksi. Näin ollen tietyille proteiineille on tiedossa useita maataloudellisia, teollisia ja lääketieteellisiä sovellutuksia joita ei ole voitu kehittää edelleen halutun proteiinin 35 tai peptidin riittämättömyydestä johtuen.

2 68261

Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 45 (Gefter, Malcolm, l.) on selitetty DNA-replikoinnin periaate, eli DNA:n synteesi solussa, ja on mainittu tarvittavat entsyymit ja proteiinit. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 5 (1975) 273 (Nathans, D. ja Smith, H.D.) on esitetty restrik-tioendonukleaaseja ja niiden käyttöä, mm. on mainittu näiden entsyymien luokitus, katkaisukohdat ja analyysimenetelmät, sekä entsyymien käyttö kromosomitutkimuksissa, geenien eristämisessä ja DNA:n kloonauksessa. Julkaisussa Am. Rev.

10 Biochem. 46 (1977) 415 (Sinsheimer, R.L.) on selitetty yh-distelmä-DNA-tekniikka; julkaisu koskee mm. plas-mideja, DNA:n modifiointia, kloonatun DNA:n eristämistä ym. Näissä julkaisuissa ei ole selitetty keksinnön mukaista menetelmää nukleotidifragmentin puhdistamiseksi, 15 jolloin ensin eristetään mRNA, sitten valmistetaan cDNA:n fragmentti, joka on oleellisesti puhdas, so. se ei sisällä kontaminoivia cDNA-sekvensseja. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 607 (Wu,R.) on selitetty menetelmä DNA-sekvenssin analysoimiseksi, tämän julkaisun mukaan DNA eristetään 20 ja puhdistetaan gradienttisentrifugoimalla ja restriktioendo-nukleaaseja käytetään DNA:n katkaisemiseksi analysoitavissa oleviin pätkiin. Julkaisussa on myös lyhyesti mainittu DNA:n kloonausta; erään menetelmän mukaan lähdetään suhteellisen puhtaasta mRNA:sta, ja saadaan 25 helposti kloonattavissa oleva cDNA, toisen menetelmän mukaan valmistetaan cDNA mRNA:ien seoksesta. Ei ole esitetty spesifisen cDNA:n eristämistä ja puhdistusta lähtien sellaisesta mRNA:ien seoksesta, jossa haluttua mRNA:a on läsnä vain pieniä määriä.

30 Julkaisussa Science 196 (1977) 1313 - 1319 (Ullrich A., et ai) on selitetty menetelmä cDNA:n puhdistamiseksi. Tällä tunnetulla menetelmällä voitiin kuitenkin puhdistaa vain dominoiva cDNA, sensijaan ei voitu puhdistaa sellaista cDNA:ta, jota esiintyy vain niukasti, ja heterogeenisessä 35 populaatiossa. On yllättävää, että uudella menetelmällä voidaan tällainen minoriteetti-DNA puhdistaa selektiivisesti, jolloin ensimmäistä kertaa saadaan puhtaana ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava DNA-fragmentti.

3 68261

Viime aikoina kehitetyt menetelmät (ks. esim.

FI-hakemus n:o 781 675) antavat mahdollisuuden käyttää nopea- ja runsaskasvuisia mikro-organismeja kaupallisesti hyödyllisien proteiinien ja peptidien syntetisointiin 5 riippumatta siitä, mikä niiden lähde on luonnossa. Näillä menetelmillä voidaan sopivalle mikro-organismille antaa geneettinen kyky syntetisoida sellainen proteiini tai peptidi, joka normaalitapauksessa on jonkun muun organismin valmistama. Menetelmissä käytetään hyväksi sitä periaatet-10 ta, joka vallitsee kaikkien elävien organismien geneettisen materiaalin, tavallisesti DNA:n ja organismien syntetisoimien proteiinien välillä. Tämän periaatteen mukaisesti proteiinin aminohapposekvenssi määräytyy DNA:n nukleotidisekvenssin perusteella. Kullekin proteiineissa 15 tavallisimmin esiintyvistä 20 aminohaposta on olemassa yksi tai useampia spesifisiä trinukleotidisekvenssiryhmiä. Tietyn trinukleotidisekvenssin ja sitä vastaavan aminohapon välinen yhteys muodostaa geneettisen koodin. Uskotaan, että kaikissa elävissä organismeissa geneettinen koodi 20 on joko sama tai samantapainen. Näin ollen jokaisen proteiinin tai peptidin aminohapposekvenssi määräytyy vastaavasta nukleotidisekvenssistä tunnetulla tavalla. Lisäksi pystyy periaatteessa mikä tahansa elävä organismi tulkitsemaan tämän nukleotidisekvenssin.

4 68261

Taulukko 1 Geneettinen koodi

5 Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

Isoleusiini (Iso) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAK

10 Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) GAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGK

Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGL

15 Päätesignaali TAJ

Päätesignaali TGA

Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti edustaa DNA:n trinuk-leotidia, jossa on .5'-pää vasemmalla ja 3’-pää oikealla. Kirjaimet 20 tarkoittavat puriini- ja pyrimidiiniemäksiä, joista nukleotidisek-venssi koostuu.

A = adeniini J = A tai G

G = guaniini K = T tai C

C = sytosiini L = A, T, C tai G

25 T = tyrniini M = A, C tai T

X = T tai C, jos Y on A tai G X = C, jos Y on C tai T

Y = A, G, C tai T, jos X on C

Y = A tai G, jos X on T

30 W = C tai A, jos Z on A tai G

W = C, jos Z on C tai T

Z = A, G, C tai T, jos W on C

Z = A tai G, jos W on A

QR = TC, jos S on A, G, C tai T

35 QR = AG, jos S on T tai C

S = A, G, C tai T, jos QR on TC

S = T tai C, jos QR on AG

5 68261

Taulukon 1 trinukleotidit, joita nimitetään kodo-neiksi, ovat DNA:n trinukleotideja, jotka esiintyvät elävän organismin geneettisessä materiaalissa. Näiden kodonien informaation siirtyminen proteiinisynteesis-5 sä vaatii lähetti-RNA:n (mRNA) muodostumisen, kuten myöhemmin tarkemmin selostetaan. mRNA:n kodoneilla on sama sekvenssi kuin taulukon 1 DNA-kodoneilla paitsi, että tymiinin tilalla on urasiili. Komplementaariset DNA:n trinukleotidisekvenssit, joiden säikeiden polaari-10 suus on päinvastainen, ovat funktionaalisesti ekvivalentteja taulukon 1 kodonien kanssa, kuten alaan perehtyneet tietävät. Tärkeä ja tunnettu geneettisen koodin piirre on sen runsaus, sillä useimpia proteiinien valmistukseen tarvittavia aminohappoja koodaa useampi kuin 15 yksi nukleotiditripletti. Näin ollen useat nukleotidi-sekvenssit voivat koodata samaa aminohapposekvenssiä. Tällaisia nukleotidisekvenssejä pidetään funktionaalises-ti ekvivalentteina, koska ne voivat johtaa saman aminohapposekvenssin valmistukseen kaikissa organismeissa, 20 vaikkakin tietyt kannat voivat tulkita eräitä sekvenssejä tehokkaammin kuin muita. Joskus nukleotidisekvenssistä saattaa löytyä puriinin tai pyrimidiinin metyloitu muunnos. Tällaiset metyloinnit eivät vaikuta millään tavalla koodaus s uht ees een.

25 Menetelmä, jolla mikro-organismi saatetaan kykene väksi syntetisoimaan uutta proteiinia, käsittää kolme päävaihetta: (1) puhdistetaan ja eristetään tietty geeni tai nukleotidisekvenssi, joka sisältää halutun proteiinin aminohapposekvenssin geneettisen informaation, (2) rekom-30 binoidaan eristetty nukleotidisekvenssi sopivan siirto- vektorin kanssa, joka yleensä on bakteriofagin tai plasmi-din DNA ja (3) siirretään vektori sopivaan mikro-organismiin ja näin saaduista mikro-organismeista valitaan kanta, joka sisältää halutun geneettisen informaation.

35 Kun edellä pääpiirteissään kuvattu menetelmä ha- 6 68261 lutaan kehittää kaupalliseksi, perustavaa laatua olevat vaikeudet liittyvät ensimmäiseen vaiheeseen eli halutun geneettisen informaation eristämiseen ja puhdistamiseen. Kaikissa elävissä soluissa DNA esiintyy erittäin suuri-5 molekyylisinä nukleotidiketjuina. Solu saattaa sisältää yli 10 000 rakennegeeniä, jotka koodaavat yli 10 000 spesifisen proteiinin aminohapposekvenssiä, ja kunkin geenin sekvenssi voi sisältää monta sataa nukleotidia.

Kaikki olemassa olevat sekvenssit koostuvat pääasiassa 10 neljästä eri nukleotidiemäksestä. Nämä ovat adeniini (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja tyrniini (T). Tiettyjen proteiinien rakennegeenien sekvenssit ovat näin ollen hyvin samanlaisia kemialliselta rakenteeltaan ja fysikaalisilta ominaisuuksiltaan. Yhtä tällaista sekvenssiä 15 ei voida erottaa tavallisilla fysikaalisilla eikä kemiallisilla menetelmillä muista eristetyssä DNArssa läsnäolevista sekvensseistä.

DNA:n nukleotidisekvenssi-informaatio muuttuu lähetti-RNA:n avulla proteiinin aminohapposekvenssiksi.

20 Tämän prosessin ensimmäisessä vaiheessa, joka on nimeltään transskriptio, kopioidaan RNA:han se DNA-segmentti, jonka nukleotidisekvenssi spesifioi valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksiriboosin tilalla on riboosi ja ty-25 miinin tilalla on urasiili. RNA:n nukleotidiemäkset kykenevät asettumaan samanlaisiksi emäspareiksi, jollaisia tiedetään olevan komplementaaristen DNA-säikeiden välillä. A ja U (T) ovat komplementaarisia ja G ja C ovat komplementaarisia. DNA-nukleotidisekvenssin RNA-transskripti 30 on komplementaarinen kopioidun sekvenssin kanssa. Tätä RNA:ta kutsutaan lähetti-RNA:ksi (mRNA), koska se toimii välittäjänä solun geneettisen mekanismin ja proteiineja syntetisoivan mekanismin välillä. Yleensä solussa on tietyllä hetkellä läsnä vain sellaisia mRNA-sek-35 venssejä, jotka vastaavat sillä hetkellä syntetisoitavia 7 68261 proteiineja. Näin ollen erikoistunut solu, jonka toiminta kohdistuu pääasiassa yhden proteiinin syntetisointiin, sisältää pääasiassa tätä proteiinia vastaavaa RNArta. Tiettyä proteiinia koodaava nukleotidisekvenssi 5 voidaan eristää ja puhdistaa tietyissä tapauksissa siten, että tämän proteiinin valmistukseen erikoistuneista soluista erotetaan kyseinen mRNA.

Edellä mainitussa menetelmässä on se heikkous, että sitä voidaan soveltaa vain niihin melko harvinai-10 siin soluihin, jotka ovat erikoistuneet pääasiassa yhden proteiinin tuottamiseen. Suurinta osaa kaupallisesti mielenkiintoisista proteiineista ei syntetisoida tällaisella erikoistuneella tavalla. Haluttu proteiini saattaa olla yksi noin sadasta eri proteiinista, joita kudoksen 15 solut tai organismi tuottaa tietyllä hetkellä. mRNA:n eristysmenetelmä on kuitenkin hyödyllinen siksi, että solussa läsnäolevat RNA-lajit edustavat tavallisesti vain osaa DNA-sekvenssien kokonaismäärästä, ja tällä perusteella voidaan suorittaa alkupuhdistus. Jotta tällai-20 sesta puhdistuksesta olisi hyötyä, tarvitaan menetelmä, jolla pieninä kuten muutaman prosentin pitoisuuksina esiintyvät sekvenssit voidaan eristää hyvin puhtaina.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka sisältää ihmisen 25 sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan nukleo-tidisekvenssin, ja jota voidaan käyttää mikro-organismin transformoimiseen, jossa menetelmässä eristetään ihmisen istukkakudosta, eristetään pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeenisten mRNA:ien populaatio mainitusta istukkaku-30 doksesta, syntetisoidaan käänteistransskriptaasin avulla cDNA:ien populaatio, joka on pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeeninen, mainitusta mRANrista, puhdistetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava cDNA, ja saatetaan puhdistettu cDNA reagoimaan DNA-siirto-35 vektorin kanssa, jolloin mainittu puhdistettu cDNA edustaa pienehköä osaa mainitusta cDNA:ien populaatiosta ja ainakin osalla mainituista cDNA:ista on vähintään kaksi restrik-tiokohtaa.

8 68261

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaa-va cDNA puhdistetaan seuraavalla tavalla: a) mainittua pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeenista cDNA-populaatiota käsitellään spesifisesti maini-5 tuissa restriktiokohdissa mainituille restriktiokohdille spesifisellä restriktioendonukleaasilla, esimerkiksi inku-boimalla mainittua populaatiota Hae III-endonukleaasin läsnäollessa pH:ssa noin 7,5 ja noin 37°C lämpötilassa 1-2 tunnin ajan, jolloin saadaan cDNA-fragmentteja, 10 b) kohdassa a) saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan niiden pituuden mukaan esimerkiksi geelielektroforeesin avulla, jolloin saadaan pituudeltaan homogeenisia cDNA-fragmentteja sisältäviä fraktioita, ja c) kohdassa b) saaduista cDNA-fragmenteista pois-15 tetaan 5'-fosfaattipääteryhmät esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja alkalisella fosfataasilla pH:ssa noin 7,5 ja 60°C lämpötilassa noin 10 minuutin ajan, d) katkaistaan kohdan c) mukaisesti käsitellyt cDNA-fragmentit spesifisesti sikiön suonikalvon somatomammo- 20 tropiinin nukleotidisekvenssin sisällä olevassa restriktio-kohdassa ja restriktiokohdille spesifisen restriktioendonuk-leaasin avulla, joka ei ole sama kuin kohdassa a) käytetty, esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja Hha I:lla tai Hpa II:11a pH:ssa noin 7,6 37°C lämpötilassa noin 2 tun-25 tia, jolloin saadaan mainittujen fragmenttien osafragmentte-ja, 9 68261 e) fraktioidaan saadut osafragmentit pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, f) otetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammo-tropiinia koodaavaa kahta DNA-osafragmenttia käsittävät frak- 5 tiot talteen, g) yhdistetään kohdan f) mukaiset osafragmentit entsymaattisesti toisiinsa kovalenttisidoksin DNA-ligaasin avulla, ATP:n läsnäollessa, esimerkiksi inkuboimalla pH:ssa 7,6 noin 15°C lämpötilassa noin 2 tunnin ajan, jolloin saadaan 10 ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavia cDNA-fragmenttej a, h) kohdan g) mukaisesti saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, ja 15 i) otetaan kohdan h) mukaisesti saatu ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan cDNA:n fragmentteja sisältävä tuote talteen, jolloin mainitut fragmentit ovat jopa 99 %:isesti vapaita kontaminoivista cDNA-sekvensseistä, j) liitetään saatu puhdistettu ihmisen sikiön suoni- 20 kalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssiä koodaava cDNA-fragmentti sinänsä tunnetulla tavalla siirtovektoriin, joka on bakteeriplasmidi, jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli.

10 68261

Geneettisen koodin perusteella on olemassa äärellinen määrä nukleotidisekvenssejä, jotka voivat geneettisesti koodata tiettyä aminohappoa. Kaikki tällaiset ek-vivalenttiset nukleotidisekvenssit ovat käyttökelpoisia 5 vaihtoehtoisia kuvatuille sekvensseille, koska kaikki johtavat samaan proteiinihormoniin, jolla on sama aminohapposekvenssi, kun tapahtuu in vivo-transskriptio ja -translaatio.

Seuraavassa taulukossa esitetään käytetyt symbolit 10 ja lyhenteet.

Taulukko 2 DNA deoksiribonukleiinihappo RNA ribonukleiinihappo cDNA komplementaarinen DNA (syntetisoitu entsymaattises-15 ti mRNA-sekvenssistä)

mRNA lähetti-RNA

dATP deoksiadenosiinitrifosfaatti dGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP deoksisytidiinitrifosfaatti 20 dTTP tymidiinitrifosfaatti dT12_18 deoksitymidylaatti (12-18 emästä) HCS ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiini TCA trikloorietikkahappo HGH ihmisen kasvuhormoni 25 A adeniini T tyrniini G guaniini C sytosiini U urasiili 30 Tris 2-amino-2-hydroksietyyli-l,3-propaanidioli EDTA ety 1 eenidiamii ni tetraetikkahappo ATP adenosiinitrifosfaatti

Hpa I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai- ψ see kohdassa GTT AAC (nuoli osoittaa katkaisukohdan) 35 Hpa II-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai

see kohdassa C CGG

68261 11

Hae ΙΙΙ-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai-

kohdassa GG^CC

Hha I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisi'

see kohdassa GCG C

5 Hsu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisi see kohdassa A AGCTT . (1

Mbo II-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat- ψ kaisee kohdassa GAAGA N8 ,„ CTTCT N7

10 Alu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai-see kohdassa AG CT

Eco RI-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisi

see kohdassa G AATTC

Hind ΙΙΙ-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat-

15 kaisee kohdassa A^AGCTT

Hinf I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat- >1/ (2

kaisee kohdassa G ANTC

Pvu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassa CGAT^CG

20 ----------------------- (1 Mbo II tunnistaa non-palindronisen sekvenssin, minkä takia on esitetty kumpikin DNA-ketju; ylemmän ketjun suunta on 5’ - 3* (ks. Watson, J. D. et ai., Recombinant DNA - a short course, Appendix A, W. H. Freeman 25 and Co., New York, 1983).

(2 N merkitsee mitä tahansa nukleotidia.

68261 12

Koska DNA:n replikaatiossa ja transkriptiossa vallitsee tunnettu emäsparijärjestelmä, vastaa sen mRNA:n eristäminen, joka sisältää tietyn proteiinin aminohapposekvenssiä koodaavan nukleotidisekvenssin, 5 saman sekvenssin tai geenin eristämistä itse DNA:sta.

Jos mRNA transkriboidaan komplementaariseksi DNA:kseen (cDNA), saadaan rekonstruoiduksi DNA-sekvenssi, joka voidaan sopivilla menetelmillä siirtää toisen organismin geneettiseen materiaaliin. Tietyn sekvenssin komple-10 mentaariset muodot ovat näin ollen vaihtoehtoisia ja funktionaalisesta ekvivalentteja.

DNA:n ja RNA:n nukleotidiyksiköt ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesterisidoksilla, jotka ovat toisen nukleotidisokerin 5'-asemassa ja viereisen nukleotidi-15 sokerin 3'-asemassa. Kun tällaiset sidokset muodostetaan uudelleen, saadaan lineaarinen polynukleotidi, joka on polaarinen siten, että toinen pää voidaan erottaa toisesta, 3'-päässä voi olla vapaa hydroksyyliryhmä tai hydroksyyliryhmä voi olla substituoitu fosfaatilla 20 tai jollakin monimutkaisemmalla rakenneyksiköllä. Tilanne on sama 5'-pään kohdalla. Eukaryoottisissa organismeissa eli niissä, joissa on erillinen tuma ja mdteettinen mekanismi, funktionaalisen mRNA:n synteesiin sisältyy tavallisesti polyadenyylihapon liittyminen 25 mRNA:n 3'-päähän. Tästä syystä mRNA voidaan erottaa muista eukaryoottisesta organismista eristetyistä RNA-tyypeistä pylväskromatografisesti selluloosalla, johon on liitetty polytymidyylihappoa, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 69, 1408 (1972). Käyt-30 tökelpoisia ovat myös muut kromatografiset menetelmät, joissa käytetään hyväksi poly A:n ja kromatografisen täytemateriaalin emäspari-affiniteettia, kun täytemateriaali sisältää oligo-dT:tä, poly-U:ta tai jotakin poly-T:n ja poly-U:n yhdistelmää.

35 Käänteistranskriptaasi katalysoi RNA-tempLaatti- 13 68261 säikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesin RNA-templaatin, primerin, joka voi olla mikä tahansa komplementaarinen 3'-hydroksyylin sisältävä oligo- tai poly-nukleotidi, ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin 5 (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) läsnäollessa. Reaktio käynnistyy oligodeoksinukleotidiprimerin ei-kovalenttisel-la liittymisellä lähelle mRNA:n 3'-päätä ja sen jälkeen liitetään vaiheittain sopivia deoksinukleotideja mRNA-nukleotidisekvenssin määrittelemiseksi emäspareiksi 10 kasvavan ketjun 3'-päähän. Tuotteeksi saatua molekyyliä voidaan kuvailla hiusneularakenteeksi, jossa alkuperäisen RNA:n rinnalla on komplementaarinen DNA- vety-silloilla liittyneenä ja osittain toisesta päästä itsensä päälle taittuneena. DNA- ja RNA-säie eivät ole 15 liittyneet toisiinsa kovalenttisesti. Käänteistranskrip-taasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-hiusneulaa, jossa päitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,69> 1^08 (1972) ja 20 Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.M. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsymeejä, jotka kykenevät hydrolysoimaan DNA:n fosfodiesterisidoksia ja siten katkaisemaan DNA-säikeen. Jos DNA on suljettu 25 rengas, se muuttuu tämän entsyymin vaikutuksesta lineaariseksi. Restriktioentsyymin pääominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tällainen sekvenssi on nimeltään restriktioendonukleaasin 30 lunnistuskohta. Restriktioendonukleaaseja on eristetty useista lähteistä ja ne on tunnistettu restriktiokoh-tiensa nukleotidisekvenssin perusteella. Kaksisäikeistä DNA:ta hydrolysoidessaan eräät restriktioendonukleaasit katkaisevat fosfodiesterisidoksen samasta kohdasta 35 kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää.

14 68261

Toiset puolestaan katalysoivat sellaisten sidosten hydrolyysin, joita muutama nukleotidi erottaa toisistaan, ja näin muodostuu vapaat yksisäikeiset alueet katkaisu-kohtaan. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomple-5 mentaarisia ja siten kohesiivisiä ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenkytkentään. Koska tällainen entsyymi katkaisee minkä tahansa DNA:n vain samasta restriktiokohdasta, syntyy samat kohesiiviset päät, ja tämä antaa mahdollisuuden liittää heterogeenisiä 10 DNA-sekvenssejä toisiinsa, kunhan ne on ensin käsitelty samalla restriktioentsyymillä. Restriktioendonukleaasit nimitetään bakteerikantalähteen mukaan; käytetään sukunimen ensimmäistä kirjainta ja lajinimen kahta ensimmäistä kirjainta, ja mikäli samasta kannasta on saatu 15 enemmän kuin yksi endonukleaasi, lisätään vielä roomalainen luku. Esimerkiksi Hae III tarkoittaa yhtä kolmesta Haemophilus aegyptius-restriktioendonukleaasista. Nimessä saattaa olla tämän lisäksi muitakin kirjaimia, mikäli täytyy ilmoittaa lisäksi erikoinen isolaatti 20 tai serotyyppi. (Ks. Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem.

4, 123 (1976)).

On havaittu, että tietyn entsyymin restriktio-kohtia on melko harvassa ja ne ovat epätasaisesti jakautuneina. On tutkittava kokeellisesti, esiintyykö tiet-25 ty restriktiokohta jossakin segmentissä. Kuitenkin eri lähteistä on voitu eristää lukuisa ja yhä kasvava määrä restriktioendonukleaaseja, joilla on toisistaan poikkeava restriktiokohta spesifisyys, ja näin voidaan olettaa, että esimerkiksi jokin tietty tuhannen nukleotidin 30 sekvenssi sisältää yhden tai useampia restriktiokohtia.

Tämä keksintö kohdistuu uuteen menetelmään, jolla voidaan puhdistaa halutun nukleotidisekvenssin omaava cDNA, joka on komplementaarinen tietylle mRNA:lle. Menetelmässä katkaistaan restriktioendonukleaasin avulla 35 sellainen cDNA, joka on transkriboitu heterogeenisesta mRNA-seoksesta. Menetelmä ei edellytä RNA:n tarkkaa puh- 68261 15 distamista, mutta sen sijaan siinä käytetään hyväksi RNA:n transkriboimista cDNA:ksi, tämän cDNA:n spesifistä jakamista yhdellä tai kahdella restriktioendonukleaasil-la fragmenteiksi ja näiden cDNA-fragmenttien eristä-5 mistä pituuden perusteella. Restriktioendonukleaaseja käyttämällä vältytään heterogeeniselta koolta ja saadaan samanpituisia DNA-fragmentteja mistä tahansa cDNA:sta, josta ainakin osa sisältää vähintään kaksi restriktiokohtaa. Alun perin heterogeenisesta cDNA-transkriptipopulaatiosta saa-10 daan samankokoisia fragmentteja, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmenttien pituus voi olla useita satoja nukleotideja ja joissakin tapauksissa ne voivat sisältää halutun proteiinin koko rakennegeenin. Fragmentin pituus riippuu restriktiokohtien välillä olevien nuk-15 leotidien lukumäärästä, joka tavallisesti on erilainen DNA:n eri kohdissa. Kun erottaminen suoritetaan pituuden perusteella, saadaan homogeenisia fragmenttipopu-laatioita, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmentit saadaan kooltaan homogeenisina ja nukleotidisekvenssil-20 tään erittäin puhtaina. Tämän keksinnön sisältämällä erotus- ja analysointimenetelmillä on mahdollista erottaa sellaisia cDNA-fragmentteja, jotka ovat peräisin vastaavista mRNA-lajeista, määrän ollessa n. 2 % transskri-boitavan RNA:n massasta. Jos mRNA puhdistetaan ennen 25 transskriptiota ennestään tunnetuilla RNA:n fraktiointi-menetelmillä, saadaan alarajaksi vähemmän kuin 2 % organismista erotetusta kokonais-mRNA:sta.

Edellä pääpiirteissään selostetulla menetelmällä puhdistettujen spesifisten sekvenssien puhdis-30 tusta voidaan vielä jatkaa siten, että annetaan toisen restriktioendonukleaasin katkaista haluttu sekvenssi jostakin keskikohdasta. Tämä katkaisu johtaa kahteen rakenteeltaan haluttuun alafragmenttiin, jotka voidaan pituuden perusteella erottaa toisistaan. Alafragmentit· 35 erotetaan katkeamattomista ja spesifisesti katkenneista epäpuhtaussekvensseistä, joiden alkuperäinen koko on 16 6 82 61 ollut käytännöllisesti katsoen sama. Menetelmä perustuu restriktioendonukleaasin restriktiokohtien harvinaisuuteen ja satunnaiseen sijaintiin, sillä sen vuoksi on erittäin epätodennäköistä, että alun perin samanpituinen 5 epäpuhtausfragmentti katkeaa fragmenteiksi, jotka ovat samanpituisia kuin sekvenssiltään halutut alafragmentit. Kun epäpuhtauksista on päästy eroon, sekvenssiltään halutut alafragmentit voidaan yhdistää toisiinsa tunnetuilla menetelmillä ja näin rekonstruoida alkuperäinen 10 sekvenssi. Kahden alafragmentin liittyminen toisiinsa alkuperäiseen sekvenssiin nähden käänteisesti pitää estää. Tämän keksinnön yhteydessä selostetaan menetelmä, jolla alafragmentit saadaan liitetyksi toisiinsa oikeassa järjestyksessä.

15 Edellä selostettuja menetelmiä voidaan muunnel la ja yhdistää sopiviin merkintämenetelmiin niin, että eristettyjen sekvenssien puhtaudesta ja määrästä saadaan tarkat tiedot. Yhdistetyillä menetelmillä on voitu valmistaa tunnettu nukleotidisekvenssi, jonka puhtaus-20 aste on yli 99 %.

Kuvatuilla menetelmillä eristetty ja puhdistettu cDNA voidaan rekombinoida sopivan siirtovektorin kanssa ja siirtää tunnetuilla menetelmillä sopivaan isäntämikro-organismiin.

25 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään lähtöaineena polyadenyloitua, epäpuhdasta tai osittain puhdistettua lähetti-RNA:ta, jonka sekvenssisisältö ja molekyylikoko voivat olla heterogeeniset. On tärkeätä, että menetelmän lähtöaineeksi valitaan sopiva haluttua 30 mRNArta sisältävä kudos. Valinta tapahtuu usein sen seikan perusteella, että vain erilaistuneen organismin tietyt erikoistuneet kudokset tuottavat mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia. Näin on asia esimerkiksi sellaisten peptidihormonien kuin kasvuhormonin ja ihmisen sikiön suo-35 nikalvon somatomammotropiinin ollessa kyseessä. Muissa tapauksissa taas voidaan todeta, että monet solutyypit tai mikrobilajit voivat toimia halutun mRNA:n lähteinä.

17 6 8 2 61

Kun RNA on erotettu soluista, voidaan halutut mRNA-sekvenssit rikastaa käyttämällä esipuhdistuksessa tavanomaisia RNA:n fraktiointimenetelmiä. Kaikki sellaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia, joissa RNA ei hajoa.

5 Erittäin sopivia menetelmiä ovat preparatiivinen sedi-mentointi sakkaroosigradientissa ja geelielektroforeesi.

mRNA tulee eristää lähdesoluista sellaisissa olosuhteissa, joissa se ei hajoa. Varsinkin ribonukleaasi-entsyymien toiminta pitää estää, sillä nämä hajottavat 10 RNA:n nukleotidisekvenssiä hydrolyyttisesti. Jos yksi sidos hydrolysoituu, kyseinen sekvenssi rikkoutuu ja se fragmentti menetetään, joka sisältää sekvenssin alkuperäisen 5'-pään. FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675 selostetaan sopivaa menetelmää, jolla ribonukleaasi 15 saadaan inhiboiduksi uuton aikana. Menetelmässä käytetään 4-molaarista guanidiniumtiosyanaattia ja 1-molaa-rista merkaptoetanolia solujen rikkomisvaiheessa. Eristettävän RNA:n hajoamista ribonukleaasin vaikutuksesta voidaan vielä vähentää, jos käytetään matalaa lämpöti-20 laa ja pH:ta, joka on lähellä arvoa 5.

Ennenkuin keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa, mRNA täytyy saada puhdistetuksi epäpuhtaus-proteiineista, DNA:sta, polysakkarideista ja lipideistä. Tähän puhdistukseen käytetään ennestään tunnettuja 25 menetelmiä. Näin saatu RNA sisältää sekä mRNA:ta että muuta RNA:ta.

Edullinen eukaryoottisen mRNA:n eristysmenetelmä on pylväskromatografia oligo-dT-selluloosan avulla tai jonkun muun oligonukleotidisubstituoidun täytemateriaalin 30 avulla, sillä tällöin voidaan käyttää hyväksi vetysidos-spesifisyyttä, joka aiheutuu eukaryoottisen mRNA:n 3'-päässä olevasta polyadenyylihaposta.

Tämän keksinnön sisältämän menetelmän ensimmäisessä vaiheessa muodostetaan DNA, joka on kompiementaa-35 rinen eristetyille heterogeenisille mRNA-sekvensseille. Tähän reaktioon valitaan entsyymiksi käänteistranskrip-taasi, vaikka periaatteessa voidaan käyttää mitä ta- ib 68261 hansa sellaista entsyymiä, joka pystyy muodostamaan komplementaarisen DNA-kopion mRNA-templaatille. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa käyttämällä mRNA:ta templaattina ja neljän deoksinukleosidi-5 trifosfaatin seosta (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) DNA-säi-keen prekursoreina. On edullista, jos yksi deoksinukleo- siditrifosfaatti on merkitty radioisotoopilla, esimer-32 kiksi *U- P:llä, sillä sen avulla voidaan seurata reaktion kulkua, se toimii merkkinä, kun tuote otetaan tal-10 teen esimerkiksi kromatografisen tai elektroforeettisen erotuksen jälkeen, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia arvioita talteenotosta, ks. Efstratiadis, A., et ai., edellä.

Käänteistranskriptaasin avulla valmistetut 15 cDNA-transkriptit ovat hieman heterogeenisia mitä tulee 5’-päähän ja 3'-päähän sillä alku- ja päätepiste mRNA-templaatin suhteen saattaa vaihdella. 5'-pään vaihtelevuuden ajatellaan johtuvan siitä, että synteesin käynnistämisessä käytetty oligo-dT-primeri kykenee kiinnit-20 tymään useihin eri kohtiin mRNA:n polyadenyloidulla alueella. cDNA:n synteesi alkaa määrittelemättömästä kohdasta poly-A-alueelta, ja vaihteleva matka poly-A-aluetta transkriboidaan riippuen oligo-dT-primerin alkuperäisestä liittymiskohdasta. Tältä epämääräisyy-25 deltä voidaan välttyä käyttämällä primeriä, joka sisältää yhden tai kaksi itse RNA-sekvenssin nukleotidia, sillä näin muodostuu primeri, jolla on edullinen ja määritelty liittymiskohta transkriptioreaktion käynnistämisessä.

30 cDNA-transkriptin 3'-pään epämääräisyys johtuu useista käänteistranskriptaasin reaktioon vaikuttavista tekijöistä ja RNA-templaatin mahdollisesta osittaisesta hajoamisesta. Pituudeltaan maksimaalisten spesifisten cDNA-transkriptien eristämistä voidaan helpot-35 taa suuresti, jos käänteistranskriptaasin reaktio-olosuhteet valitaan siten, että tasapaino asettuu täysi- 19 68261 pitkien ketjujen synteesin puolelle lyhyiden DNA-ket-jujen syntetisoitumisen jäädessä vähemmälle. Linnun myeloblastosisviruksen käänteistranskriptaasin edulliset reaktio-olosuhteet on esitetty esimerkkien yhteydes-5 sä. Reaktiolämpötila, suolakonsentraatio, entsyymimäärä, primerin ja templaatin konsentraatioiden suhde ja reaktioaika ovat parametreja, joita muuttamalla voidaan vaikuttaa siihen, että syntyy mahdollisimman paljon samanlaisia DNA-transkripteja.

10 Lämpötila ja suolakonsentraatio valitaan siten, että oligo-dT-primerin ja RNA-templaatin polyadenyloi-dun osan välinen spesifinen emäsparimuodostus saadaan optimoiduksi. Oikein valituissa olosuhteissa primer kykenee sitoutumaan RNA-templaatin polyadenyloituun 15 osaan ja vältytään oleellisesti sellaisilta ei-spesi-fisiltä käyntiinpanoreaktioilta, jotka johtuvat primerin sitoutumisesta muihin templaatin kohtiin, kuten lyhyihin A-pitoisiin sekvensseihin. Lämpötilan ja suolan vaikutukset ovat riippuvaisia toisistaan. Korkeat läm-20 pötilat ja pienet suolakonsentraatiot vähentävät spesifisen emäsparivuorovaikutuksen pysyvyyttä. Reaktioaika pidetään mahdollisimman lyhyenä, jotta vältyttäisiin ei-spesifisiltä käynnistymisiltä ja hajoaminen jäisi mahdollisimman vähäiseksi. Reaktioaika ja lämpötila 25 ovat toisistaan riippuvaisia siten, että matala lämpötila vaatii pitemmän reaktioajan. 42°C:ssa on 1-10 minuutin välillä oleva reaktioaika sopiva. Primeriä pitäisi olla läsnä 50-500-kertainen molaarinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna ja entsyymiä pitäisi olla 30 samansuuruinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna. Entsyymi- ja primeriylimäärä edesauttavat reaktion käynnistymistä ja cDNA-ketjun kasvua siten, että lyhyen reaktioajan kuluessa muodostuu tehokkaasti pitkäketjui-sia cDNA-transkripteja.

20 68261

Usein on mahdollista suorittaa tämän keksinnön mukaisen puhdistusmenetelmän loppuosa käyttämällä mRNArsta transkriboituja yksisäikeisiä cDNA-sekvenssejä. Kuten myöhemmin selostetaan, saattaa olla niin, että 5 haluttu restriktioentsyymi katkaisee vain kaksisäikeis-tä DNA:ta. Tällöin voidaan kaksisäikeinen DNA syntetisoida käyttämällä templaattina edellä kuvatulla tavalla valmistettua cDNA:ta ja entsyymeinä DNA-polymeraasia, kuten käänteistranskriptaasia, ja yksisäikeistä DNA:ta IQ hydrolysoivaa nukleaasia. Kaksisäikeisen DNA:n valmistusta tällä tavalla on selostettu kirjallisuudessa, ks. esim. Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W. J. Ja Goodman, H.H.,

Science 196, 1313 (1977).

15 Heterogeenisista mRNA-sekvensseistä transkriboi tu heterogeeninen cDNA käsitellään senjälkeen yhdellä tai kahdella restriktioendonukleaasilla. Endonukleaasin valinta riippuu ensi sijassa siitä, mitä entsyymin restriktiokohtia eristettävä cDNA-sekvenssi sisältää.

20 Menetelmä riippuu kahden tällaisen kohdan olemassa olosta. Yksi entsyymi riittää, jos kohdat ovat identtisiä. Haluttu sekvenssi katkaistaan kummastakin kohdasta ja muodostuu pituudeltaan homogeeninen molekyyli- eli fragment-tipopulaatio, jolla on haluttu sekvenssi ja homogeeninen 25 pituus, ainakin halutun cDNA-sekvenssin kohdassa. Jos restriktiokohdat poikkeavat toisistaan, tarvitaan haluttujen, pituudeltaan homogeenisten fragmenttien valmistamiseen kaksi entsyymiä.

Koko haluttua proteiinia tai vain osaa siitä k.oo-30 daavan nukleotidisekvenssifragmentin valmistukseen tarvittava restriktioentsyymi (tai resktriktioentsyymit) on valittu kokeellisesti. Jos halutun proteiinin aminohappo-sekvenssi tunnetaan, on mahdollista verrata keskenään restriktioendonukleaasin katkaisemien, pituudeltaan homo-35 geenisten nukleotidifragmenttien nukleotidisekvenssiä ja sen koodaamaa aminohapposekvenssiä, sillä tunnettu geneettinen koodi on yhteinen kaikille elänönmuodoille. Halutun proteiinin täydellinen aminohapposekvenssi ei ole tarpeen, sillä osittaisen sekvens- 21 68261 sin perusteella voidaan tehdä verrattain tarkka identifiointi. Jos halutun proteiinin aminohapposekvenssiä ei tunneta, restriktioendonukleaasin avulla valmistettuja pituudeltaan homogeenisia polynukleotideja 5 voidaan käyttää näytteinä, joiden avulla voidaan syntetisoida proteiini sopivalla in vitro-menetelmällä ja identifioida se. Vaihtoehtoisesti voidaan mRNA puhdistaa affiniteettikromatografisesti. Alaan perehtyneiden tiedossa saattaa olla muita tähän tarkoitukseen sopivia 10 menetelmiä.

Käyttökelpoisten restriktioentsyymien lukumäärä riippuu siitä, käytetäänkö yksisäikeistä vai kaksisäikeistä cDNA:ta. Edullisia entsyymejä ovat ne joiden vaikutus kohdistun siihen yksisäikeiseen DNAthan, joka on 15 mRNA:n käänteisen transkription välitön reaktiotuote.

Tällä hetkellä tunnetaan vain eräitä sellaisia restrik-tioendonukleaaseja, joiden vaikutus kohdistuu yksisäikeiseen DNA:hän, esimerkiksi Haelll ja HhaI. Restriktio-endonukleaasikäsittelyä varten valmistettava cDNA voidaan 20 merkitä radioaktiivisesti niin, että se voidaan tunnistaa myöhempien erotusvaiheiden jälkeen. On edullista sisällyttää radioaktiivinen merkki, kuten (X- P, yhteen neljästä deoksinukleosiditrifosfaattiprekursorista. Suurin aktiivisuus saadaan, jos radioaktiivisen perkursorin väkevyys 25 on suuri ei-radioaktiivisen osan väkevyyteen verraituna. Jokaisen deoksinukleosiditrifosfaatin kokonaisväkevyy-den pitäisi kuitenkin olla yli 30 pm mol/], jotta kään- 22 68261 teistranskriptaasin katalysoimassa reaktiossa saavutettaisiin mahdollisimman pitkä cDNA. ks. Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, F. C., Jeffrey, A. ja Vournakis, J.N., Cell H, 367 (1975). cDNA:n nukleotidi- 5 sekvenssin määritystä varten on 5'-päät hyvä merkitä 3 2 ^ zP:llä käyttämällä hyväksi polynukleotidikinaasin katalysoimaa reaktiota, ks. Maxam, A.M. ja Gilbert, W., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977).

Fragmentit, jotka ovat syntyneet restriktioent-10 syymin vaikutuksesta tai kahden restriktioentsyymin yhdistelmän vaikutuksesta, voidaan erottaa toisistaan ja heterodispersseistä sekvensseistä, joissa ei ole tunnistamis kohtaa , niiden pituuden perusteella. Tämä voidaan tehdä useilla elektroforeettisella menetelmällä 15 ja sedimentointimenetelmällä ultrasentrifugia käyttäen. Geelielektroforeesi on asetettava etusijalle, sillä sen avulla saavutetaan paras resoluutio polynukleotidin pituuden perusteella. Lisäksi menetelmällä on helppo saada erotetut aineet talteen kvantitatiivisesti. Edullisia 20 geelielektroforeerimenetelmiä on selostettu seuraavis-sa julkaisuissa: Dingman, C.W. ja Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659 (1968) ja Maniatis, T., Jeffrey, A., ja van de Sande, H., Biochemistry 14, 3787 (1975).

Ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä ovat 25 useimmista lähteistä saadut cDNA-transkriptit pituudeltaan heterodisperssejä. Kun sopivasti valitun restriktioendonukleaasin tai restriktioendonukleaasipa-rin annetaan vaikuttaa polynukleotidiketjuihin, jotka sisältävät halutun sekvenssin, ketju katkeaa vastaavis-30 ta restriktiokohdista, ja saadaan yhtä pitkiä polynukleot idifragmentteja. Geelielektroforeesissa nämä havaitaan selvästi erottuvina viivoina. Restriktiokohtien 23 6 8 2 61 läsnäolosta tai puuttumisesta riippuen voidaan myös muista sekvensseistä saada erillisiä viivoja, joiden sisältämien sekvenssien pituudet kuitenkin todennäköisesti poikkeavat halutun sekvenssin pituudesta. Näin 5 ollen restriktioendonukleaasin vaikutuksen seurauksena saadaan geelielektroforeesissa esiin yksi tai useampia erillisiä viivoja ja loput cDNA:sta jää heterodis-persiksi. Kun suurin osa läsnäolevista polynukleoti-disekvensseistä on haluttua cDNArta, saadaan elektro-10 foreesin tuloksena yksi ainoa cDNA-viiva.

Vaikka onkin epätodennäköistä, että restriktio-entsyymit katkaisevat kaksi erilaista sekvenssiä siten, että syntyy käytännöllisesti katsoen samanpituisia fragmentteja, on kuitenkin toivottavaa, että tietynpituis-15 ten fragmenttien puhtaus voidaan jollakin menetelmällä varmistaa. Elektroforeesiviivan sekvenssianalyysillä voidaan ilmaista epäpuhtaudet, joita on 10 % tai sitä enemmän kaistan materiaalissa. Niinpä on kehitetty menetelmä, jolla voidaan ilmais-20 ta edellä mainittua pienemmätkin epäpuhtaudet, ja menetelmä perustuu samoihin seikkoihin kuin edellä kuvattu erotusmenetelmä. Menetelmä edellyttää sitä, että haluttu nukleotidisekvenssifragmentti sisältää sellaisen restriktioendonukleaasin restriktiokohdan, jota ei 25 ole käytetty ensimmäisessä erotuksessa. Sopivia restrik-tioendonukleaaseja on selitetty edellä. Kun elektrofo-reesiviivasta eluoitu polynukleotidimateriaali käsitellään sellaisella restriktioendonukleaasilla, joka pystyy katkaisemaan halutun sekvenssin sisäisesti, saadaan 30 kaksi alafragmenttia, jotka hyvin todennäköisesti ovat· eripituisia. Elektroforeesissa nämä alafragmentit muodostavat pituuttaan vastaaviin kohtiin kaksi erillistä viivaa, joiden sisältämien fragmenttien pituuksien summa on yhtä suuri kuin polynukleotidin pituus ennen kat-35 kaisua. Alkuperäisen viivan sisältämien epäpuhtauksien, < 24 68261 joihin restriktioentsyymi ei vaikuta, voidaan odottaa kulkeutuvan alkuperäiseen kohtaan. Epäpuhtaudet, joissa on yksi tai useampia restriktiokohtia, hajoavat kahdeksi tai useammaksi alafragmentiksi. Koska restrik-5 tiokohtien sijaintia pidetään satunnaisena, on hyvin epätodennäköistä, että epäpuhtauksista syntyy samankokoisia alafragmentteja kuin halutusta sekvenssistä.

Minkä tahansa viivan sisältämä radioaktiivisesti merkityn polynukleotidin määrä voidaan mitata kvantitatiivi-10 sesti radioaktiivisuusmittauksella tai millä tahansa muulla sopivalla menetelmällä. Halutun sekvenssin fragmenttien kvantitatiivinen mitta saadaan vertaamalla halutun sekvenssin alafragmenttien kaistojen ainemääriä kokonaisainemäärään.

15 Edellä selostetun erotuksen jälkeen haluttu sek venssi voidaan rekonstruoida. Tähän tarkoitukseen sopii DNA-ligaasi, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa. Halutun sekvenssin alafragmentit voidaan eluoida erikseen geelielektroforeesiviivoista 20 ja yhdistää sopivissa olosuhteissa DNA-ligaasin läsnäollessa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E.colin ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, 25 I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointi lähtien restriktioendonukleaasikäsittelyssä syntyneistä ala fragmenteista paranee huomattavasti, jos väärien sekvenssien muodostuminen saadaan estetyksi. Haitalliselta loppuiu-30 lokselta vältytään, jos halutun sekvenssin sisältävä, pituudeltaan homogeeninen cDNA-fragmentti käsitellään ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä sellaisella reagenssilla, joka pystyy poistamaan 5'-päätefosfaat-tiryhmät cDNA:sta. Emäsfosfataasi on edullinen entsyy-35 mi tähän tarkoitukseen. DNA-ligaasi pystyy katalysoimaan 25 68261 katkenneiden fragmenttien liittymisen toisiinsa vain siinä tapauksessa, että 5'-päätefosfaattiryhmä on läsnä. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää, joissa ei ole 5T-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan 5 liittää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5'-fosfaatin, joka on syntynyt restriktioendonukleaasin katkaistessa erotettuja DNA-fragmentteja. Tätä menetelmää on selostettu yksityiskohtaisesti FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675.

10 Käytetyissä olosuhteissa on suurin osa cDNA- transkripteistä johdettu siitä mRNA-alueesta, joka sisältää mRNA-templaatin 5'-pään käyttämällä tässä templaa-tissa primerinä fragmenttia, joka on saatu restriktioendonukleaasin katalysoimassa katkaisussa. Tällä ta-15 valla voidaan edellä kuvatulla menetelmällä saada sekä sellaisia fragmentteja, jotka sisältävät vain osan halutun proteiinin koodaavasta nukleotidisekvenssistä, että koko nukleotidisekvenssi.

Ihmisen geenien kloonauksessa on puhdistusmene-20 telmä erittäin tärkeä, sillä vallitsevien määräysten mukaan ihmisen geeni tulee ennen rekombinointia DNA:n kanssa ja sen siirtämistä bakteeriin puhdistaa erittäin huolellisesti, ks. USA:n "Federal Register", Voi.

41, no 131, 1967-07-07, ss. 27902-27943. Tämän keksinnön 25 mukaisella menetelmällä on onnistuttu tuottamaan riittävän puhtaita ihmisen geenejä, jotka sisältävät pääosan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia kooda-vasta rekenteesta. Edellä kuvatulla menetelmällä eristetty ja puhdistettu ihmisen geneettinen materiaali 30 voidaan rekombinoida'plasmideihin tai muihin siirto-vektoreihin.

26 68261

Edellä kuvatuilla puhdistus- ja analyysimenetelmillä on voitu eristää suurin osa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin rakennegeenin nukleotidisekvenssistä, jolloin puhtausaste on ollut yli 99 %. On syntetisoitu uu-5 siä plasmideja, jotka sisältävät ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan nukleotidisekvenssin. On valmistettu uusia mikro-organismeja, joiden geneettisen rakenteen osana on ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava nukleotidisekvenssi.

10 Liitteenä olevilla kuvilla ja piirroksilla valais taan tämän keksinnön sisältämiä esimerkkejä.

Kuva 1 esittää autoradiogrammia geelielektroforeesi- 3 2 sarjasta, joka on suoritettu OL P-merkitylle cDNA:lle, ja jota selostetaan yksityiskohtaisesti esimerkissä 1.

15 Kuva 2 on kaavioesitys ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssikoodista ja siinä näkyvät eri restriktiokohtien suhteelliset sijainnit, kuten esimerkissä 1 selostetaan yksityiskohtaisesti.

3 2

Kuva 3 on autoradiogrammi OL P:llä merkityllä 20 cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 2).

3 2

Kuvat H ja 5 ovat autoradiogrammeja OL P:llä merkityllä cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 3).

68261 27

Esimerkki 1 Tässä kuvataan tietyn cDNA-sekvenssin yleistä erotusmenetelmää ottamalla esimerkiksi ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan alueen 5 sekvenssiosan erottaminen istukkakudosuutteesta.

mRNArn uuttaminen istukoista

Keisarinleikkauksessa saadut ihmisen täysiaikaiset istukat jäähdytettiin nopeasti nestemäisessä types-sä ja säilytettiin -60°C:ssa. Kokonais-RNA:n uuttamisek-10 si 40 g jäähdytettyä istukkakudosta hienonnettiin ja liuotettiin 0°C:ssa 140 ml:aan vastavalmistettua liuosta, joka sisälsi 7 mol/1 guanidinium-HCl:ää (Cox, R.A., Medhods in Enzymology 12, 120 (1968), 20 mmol/1 tris-HC1 (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA ja 1 % sarkosyyliä (Ciba-15 Geigy Corp., Greensboro, N.C.). Tämän jälkeen kutakin ml:a liuosta kohti lisättiin 0,5 g CsCl, ja syntynyttä tummanruskeaa liuosta kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja kerrostettiin nitro-selluloosaputkissa (2,54 x 8,89 cm), joiden pohjalla 20 oli 5 ml liuosta, joka sisälsi 5,7 mol/1 CsCl, 10 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5) ja 1 mmol/1 EDTA, sentrifugoimalla 16 tuntia 15°C:ssa nopeudella 27 000 r/min SW27-roottorilla (Beckman Instruments Corp., Fullerton, California), ks. Clisin, V., Grkvenjakov, R. ja Ryus, C., Biohem 25 13, 2633 (1974). Sentrifugoinnin jälkeen putkien sisäl löt dekantoitiin, putket kuivattiin ja alimpana puolen cm RNA-hiukkaset sisältävä kerros leikattiin irti partaterällä. Aine liuotettiin 20 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl, pH 7,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 % 30 sarkosyyliä ja 5 % fenolia steriilissä erlenmeyer- pullossa. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin NaCl pitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja sen jälkeen ravistettiin voimakkaasti 40 ml:n kanssa seosta, joka sisälsi 50 % fenolia ja 50 % kloroformia. RNA saostettiin vesifaasista eta-35 nolilla natriumasetaatin (0,2 mol/1, pH 5,5) läsnäollessa. RNA-tuote pestiin 95 % etanolilla, kuivattiin 28 68261 ja liuotettiin steriiliin veteen. Tavallisesti 40 g:sta istukkakudosta saatiin noin 30 mg RNA:ta, ja tästä taas noin 300 ^ug polyadenyloitua RNA:ta, kun kromatogra-foitiin kahdesti oligo-dT-selluloosalla (ks. Aviv ja 5 Leder, edellä).

cDNA-synteesi

Analyyttiset reaktiot suoritettiin 5 ^ulissa liuosta, joka sisälsi 50 uuno 1/1 tris-KCl (pH 8,3), 0,1 mmol/1 EDTA, 7 mmol/1 MgClgj 20 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 10 /^-merkaptoetanolia, 40 ^umol/1 dCTP (50 000 laskinyk-sikköä/min/pmol„^P), DGTP, dATP ja dTTP (500 ^umol/1 kutakin), 100 ^ug/ml polyadenyloitua RNA:ta, 20 ^ug/ml oligo-dT^2_]_g (toimittaja Collaborative Research,

Waltham, Mass), ja 100 yksikköä/ml linnun Myeloblastosis-15 viruksen käänteistranskriptaasia. Tätä entsyymiä toimittaa D.J. Beard, Life Science Incorporated, St.

Petersburg, Florida, joka valmistaa entsyymiä National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella seuraavalla menetelmällä: Kacian, D.L. ja Spiegelman, 20 S., Methods in Enzymology 29, L. Grossman ja K. Moldave, eds. Academic Press, N.Y. (1974), s. 150. Reaktiot aloitettiin lisäämällä entsyymi 0°C:ssa ja synteesi kesti 6 minuuttia 42°C:ssa. Näissä olosuhteissa noin 10 las-kinyksikköä/min ^ P saatiin sisällytetyksi TCA:lla 25 saostuvaan materiaaliin, ja kukin ^ug RNA:ta antoi noin 50 ng cDNA. Jotta sekvenssianalyysiä varten olisi saatu riittävästi cDNA:ta, reaktiotilavuus nostettiin 100 ,ug:aan ja dCTP-väkevyys 250 ,umol/l:ksi 32 (ominaisaktiivisuus 500 laskinyksikköä/min/pmolOt P).

30 Näissä olosuhteissa saatiin cDNA:han sisällytetyksi 3? noin 200 000 1/min ^ P:llä merkittyä dCTPitä. Restriktioendonukleaasikäsittely Restriktioendonukleaasikäsittelyä varten analyyttiset reaktiot pysäytettiin siten, että lisät- * 35 tiin 20 ^ul jääkylmää vettä, keitettiin 2 minuuttia, 29 6 8 2 61 jäähdytettiin nopeasti jäällä ja lisättiin sen verran magnesiumkloridia, että pitoisuudeksi tuli 7 mmol/1.

5 Näytteitä (5 ^ul, noin 2 a 10 1/min) käsiteltiin ylimäärällä restriktioendonukleaasia Hae III (voidaan 5 myös käyttää HhaI tai HaeIII:n ja Hhal:n seosta, ks. kuvio 1) 1 tunti 37°C:ssa. Haelll valmistettiin seu-raavalla menetelmällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchinson, C.A.III, J. Virol. 10, 42 (1972). New England Bio-Labs, Beverly, Mass., toimitti entsyymit 10 HhaI ja Hpall. Viimeksimainittu toimittaa myös entsyymiä Haelll. Koetulosten perusteella käytettiin entsyymiä enemmän kuin mitä tarvitaan restriktiosensitiivisen DNA:n täydelliseen käsittelyyn identtisissä reaktio-olosuhteissa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 5 ^ul 15 liuosta, joka sisälsi 20 mmol/1 EDTA, 20 % sakkaroosia ja 0,05 % bromifenolisinistä, ja kuumentamalla 1 minuutti 100°C:ssa, ja sen jälkeen suoritettiin analyysi polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tuotteet erotettiin polyakryyliamidiyhdistelmälevygeelillä (4,5 % -20 10 %) tris-boraatti-EDTA-puskurissa (2,5 tuntia, 150 V) (ks. Dingman, C.W. ja Peacock. A.C., edellä) ja visualisointiin autoradiografisesti kuivasta geelistä.

Kuviossa 1 nähdään geelielektroforeesi- ja auto-3 2 radiograf.iatulokset oi, P:llä merkitystä cDNA:sta, joka 25 on valmistettu edellä kuvatulla tavalla. Näytetäplät kulkeutuivat alkupisteestään elektroforeettisesti ensin 4,5-% akryyliamidin ja sitten 10-% äkryy 1 iamiöin läpi. Kuvan vasemmassa laidassa oleva viiva osoittaa kahden geelialueen välistä rajaa. Kaista A edustaa koko cDNA-transskriptin 30 elektroforeettista liikkuvuutta. Kaista B esittää Hha-entsyymillä käsitelty cDNA:n liikkuvuutta. Kaista C esittää sekä HhaI-entsyymillä että Haelll-entsyymillä käsitellyn koko cDNA:n liikkumista. Kaista E esittää sen materiaalin elektroforeettista liikkumista, jonka viiva 35 on voimakkain kaistassa C. Kaista F esittää kaistan C voimakkaimmasta viivasta eristetyn materiaalin liikku- 3o 68261 vuutta, kun se on ensin käsitelty Hhal-entsyymillä. Koko- standardina käytettiin yksisäikeistä fagin M13 DNA:ta, 32 jonka 5'-pää oli merkittyc*£. P:llä, ja joka oli katkaistu HaelII-entsyymillä (Horiuchi, K. ja Zinder, N.D., 5 Proc. Nat. Acad. Sei. Usa, 72, 2555 (1975) ja sen liikkuvuus näkyy kaistassa G. Näiden DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla oikealle.

Kaistan A tuloksesta voidaan todeta, että täysi-10 aikaisen istukan mRNA:n cDNA-transkripti on heterodis- perssi. Käsittely entsyymillä HhaI, kaista B, tai entsyymillä Haelll, kaista C, johtaa tietynpituisten poly-nukleotidien kasautumiseen. Tällaisten erillisten viivojen syntyminen todistaa sitä, että heterogeenisessa 15 cDNA-transkriptipopulaatiossa on läsnä useampana kappaleena vähintään yhtä sekvenssiä, jossa on kaksi HhaI:n ja HaeIII:n tunnistamiskohtaa. HhaI-käsittely tuottaa fragmentin, jonka pituus on noin 470 nukleotidia, ja Haelll-käsittely tuottaa fragmentin, jonka 20 pituus on noin 550 nukleotidia. Käsittely molemmilla entsyymeillä tuottaa kolme fragmenttia, joiden pituudet ovat 90 nukleotidia (A), 460 nukleotidia (B) ja noin 10 nukleotidia (C). Pienen kokonsa vuoksi fragmentti C kulkeutuu pois geeliltä kuvan 1 olosuhteissa.

25 10-% ja 4,5-% geelin rajalla oleva viiva edustaa hete rogeenista materiaalia, joka on liian suurikokoista siirtyäkseen 10-prosenttiseen geeliin ja joka kerääntyy sen vuoksi rajalle. Kaistan D viivoista päätellen näyttäisivät fragmentit A ja B olevan lähtöisin samasta 30 cDNA-molekyylistä. Tämä johtopäätös varmistettiin eluoi-malla geelistä suurempi Haelll-fragmentti, joka liikkui kaistalla E näkyvällä tavalla, ja käsittelemällä se entsyymillä HhaI. Tämä käsittely tuotti kaksi fragmenttia, joiden liikkuvuus oli sama kuin niillä, jotka 35 saatiin käsiteltäessä joko cDNA samanaikaisesti Haelll:11a 31 68261 ja Hhal:llä, kuten voidaan havaita vertaamalla kaistoja D ja F. Koko cDNA:n hajoamistuotteessa, kaista D, autoradiografinen densiteetti, joka on viivan sisältämän kokonaisradioaktiivisuuden mitta, on suurempi 5 fragmentilla A kuin fragmentilla B, vaikka koon perusteella voitaisiin olettaa päinvastaista. Tämän havainnon perusteella voidaan arvioida, että fragmentti A on transkriboitu lähempänä mRNA:n 3’-päätä kuin fragmentti B.

Kuva 2 on kaavioesitys cDNA-molekyylistä ja 10 Haelll- ja HhaI-i^estriktiokohdat näkyvät siinä suhteessa toisiinsa. Samasta cDNA-molekyylistä johdetut DNA-fragmentit A ja B luokiteltiin suhteellisen intensi-teettinsä mukaan, joka oli saatu kuvan 1 kaistan D autoradiogrammista. Fragmentin C olemassaolo pääteltiin 15 kuvan 1 kaistoissa B ja D olevan viivan erilaisesta elektroforeettisesta liikkuvuudesta. DNA-fragmentin A koko tunnetaan tarkoin nukleotidisekvenssimäärityksen perusteella, ks. Maxam, A. ja Gilbert, W. edellä. DNA-fragmentin B koko määritettiin vertaamalla kuvan 1 20 kaistan G M13-DNA-kokomerkkeihin.

Nukleotidisekvenssit DNA-fragmentille A ja osalle fragmentin B 5'-päätä määritettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä, ks. edellä. Koska ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin aminohapposekvenssi 25 tunnetaan, voitiin näiden kahden fragmentin nukleoti-disekvenssejä verrata aminohapposekvenssiin tunnetun geneettisen koodin perusteella. Vertailun perusteella voitiin todeta, että sekvenssit todella koodasivat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin osia 30 ja tämä vahvisti myös kuvassa 2 esitettyä fragmentti-järjestystä.

Esimerkki 2

Seuraavassa kuvatulla rekonstruointikokeella osoitetaan, kuinka tämän keksinnön mukaisella menetel-35 mällä voidaan puhdistaa haluttu nukleotidisekvenssi, 32 6 8 2 61 jota on alunperin vain pieni määrä koko nukleotidi-sekvenssipopulaatiossa. Koostumukseltaan tunnettuja RNA-seoksia, jotka sisältivät puhdistettua rotan glo-biinin RNA:ta ja ihmisen polyadenyloitua istukan RNA:ta, 5 käytettiin käänteistranskriptaasin templaatteina et P- 5 dCTP:n läsnäollessa (lopullinen ominaisaktiivisuus 10' laskinyksikköä/min/pmol. cDNA-tuotteet katkaistiin Haelll-endonukleaasi11a ja fragmentit erotettiin toisistaan polyakryyliamidiyhdistelmägeelilevyillä (4,5 % -10 10 %). cDNA-fragmentit visualisoitiin suorittamalla autoradiografia kuivatuille geeleille.

Koetulokset on esitetty kuvassa 3. Geelielektro-foreesi suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kaistoilla A ja H on ajettu 15 kokoa ilmaisevat merkit, jotka on valmistettu katkaisemalla fagin M13 DNA Haelll-endonukleaasilla ja merkit - 3 2 semällä näin saatujen fragmenttien 5'-päät eC -P:llä. Näiden DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla vasemmalle puo-20 lelle. Kaistoilla B-G on elektroforeesikuviot, jotka on saatu käynnistämällä edellämainitut reaktiot seoksilla, jotka sisälsivät globiinin RNArta ja istukan RNA:ta seuraavassa taulukossa esitetyissä suhteissa.

Kaista Globiinin RNA Istukan RNA

ng ng 25 B 300 0 C 60 240 D 30 270 E 15 2 35 F 7,5 292,5 30 G 0 300

Voidaan havaita, että 320 nukleotidia sisältävä Haelll-fragmentti on peräisin globiinin cDNA:sta. Globiinin cDNA-transkripti voidaan vielä havaita, vaikka globiinin RNA:ta on koko RNA:ssa läsnä vain 2-5 %. (Jos 35 eristetyssä RNA-seoksessa on haluttua RNA-laatua niin 33 68261 vähän, ettei tämä analyysimenetelmä sovi, voidaan suorittaa esipuhdistus jollakin tunnetulla RNA:n puhdistus-menetelmällä niin, että halutun RNA-laadun pitoisuudeksi tulee noin 2-5 %).

5 Esimerkki 3 Tämä esimerkki valaisee sellaisen nukleotidi-sekvenssifragmentin puhdistuksen, joka sisältää noin 550 emäsparia, ja joka koodaa osaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinista, ja menetelmän, jol-10 la voidaan määrittää eristetyn sekvenssin puhtaus. Puhdistetun fragmentin puhtausasteeksi saatiin yli 99 %.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin komplementaarisen DNA:n puhdistus Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla erotettu poly-15 adenyloitu istukan RNA rikastettiin ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin mRNA:n suhteen sentrifu-goimalla 4°C:ssa 16 tuntia 25 000 r/min Beckman Instruments-ultrasentrifugin SW 27-roottorissa sakka-roosigr’adientissa (5 % - 20 % paino/ti lav.) . Gradientin 20 llS-14S-alue otettiin talteen ja 100 ^ug tästä RNArsta käytettiin kaksisäikeisen cDNA:n syntetisointiin (ks.

Ullrich, A., et ai., edellä). Toisen säikeen synteesi pysäytettiin uuttamalla reaktioseos tilavuudellaan etanolia -70°C:ssa. cDNA hajoitettiin 50 ^ulissa liuosta, 25 joka sisälsi 6 mmol/1 tris-HCl, (pH 7,5), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 /»-merkaptoetanolia, 2 Haell-yksiköllä 37°C:ssa 2 tunnin aikana ja sen jälkeen lisättiin 0,1 yksikköä bakteeriperäistä emäsfosfataasia (BAPF-tyyppi, Worthington Biohemical Corp., Freehold, 30 N.J., yksikkö on tuottajan määrittelemä), jonka annet tiin vaikuttaa 10 minuuttia 60°C:ssa. Tämän jälkeen reaktioseos uutettiin yhdellä tilavuusosalla fenolin kyllästettyä kloroformiliuosta, DNA seostettiin kahdella tilavuudella etanolia -70°C:ssa ja liuotettiin 20 ^ul:aan 35 liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1 mmol/1 > 34 68261 EDTA, ja sen jälkeen suoritettiin elektroforeesi poly-akryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Kuvassa H (F) on edellä mainitun reaktioseoksen elektroforeesikuvio, jossa näkyy yksi viiva, joka vastaa noin 550 emäsparin 5 nukleotidisekvenssiä. Kun 550 parin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti, saatiin kuvassa 4 (F) näkyvä tulos.

Kuvassa 4 (E) näkyvää 550 emäsparia vastaavaa materiaalia käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 4 yksiköllä 10 Hhal-endonukleaasia 50 ^ul:ssa samaa puskuria, jota käytettiin Haelll-endonukleaasikäsittelyssä. Sen jälkeen uutettiin etanoli-kloroformiseoksella, saostettiin etanolilla ja hajoamistuotteet erotettiin elektroforeettisesti polyakryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.). 15 Tulos nähdään kuvassa 4(D).

Molemmat fragmentit eluoitiin elektroforeettisesti ja liitettiin toisiinsa inkuboimalla 2 tuntia 15°C:ssa 20 ^ulissa seosta, joka sisälsi 66 mmol/1 tris-HCl, (pH 7,6), 6 mmol/1 MgCl2, 15 mmol/1 ditio-20 tritolia, 1 mmol/1 ATP ja 20 ^ug/ml T4 DNA-ligaasia.

Tämän jälkeen reaktioseos laimennettiin 200 ^uliksi 0,1-m natriumkloridiliuoksella, uutettiin yhdellä tilavuudellaan fenoli-kloroformiseosta ja DNA saostettiin 2 tilavuudella etanolia. Tuote suspendoitiin 20 ^ul: 25 aan liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8), ja ImM EDTA,ja erotettiin elektroforeettisesti polyakryy-liamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Tulos näkyy kuvassa 4(C). Kuvan 4(C) elektroforeesikuviosta voidaan havaita, että 550 nukleotidin fragmentti saatiin rekonstruoiduksi 30 ligaasikäsittelyllä. Emäs fosfataasiesikäsittelyllä varmistettiin se, että HhaI-fragmentit liittyivät toisiinsa oikein päin alkuperäiseksi 550 nukleotidin segmentiksi. Kuvassa 4(C) näkyvät lisäviivat johtuvat Hhal-fragmenttien välisestä dimeerimuodostuksesta, jota ei 35 68261 voida estää emäsfosfataasikäsittelyliä.

Rekonstruoitu 550 nukleotidin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti. Eluoidun materiaalin elektroforeesikuvio on kuvassa 4(B).

5 Kuvassa 4(A) on kokostandardin elektroforeesikuvio, . 3 2 joka saatiin ^ P:llä merkitystä kaksisäikeisen M13-DNA:n Haelll-hajoitustuotteesta. Elektroforeettiset analyysit suoritettiin polyakryyliamidigeelissä (6 % paino/tilav.) 2 tunnin aikana 100 V jännitteessä liuok-10 sessa, joka sisälsi 50 mmol/1 tris-boraattia (pH 8) ja 1 mmol/1 EDTA. Elektroforeesin jälkeen geeli kuivattiin ja autoradiogrammit valmistettiin kuvaamalla Kodak NS2T-röntgenfilmille.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin 15 cDNA:n rekonstruoidun 550 nukleotidia sisältävän fragmentin puhtaus.

Eristetyt rekonstruoidut ihmisen sikiön suoni-kalvon somatomammotropiinin cDNA:n Haelll-fragmentit merkittiin 5’-päästään P:llä käyttäen apuna polynuk-20 leotidikinaasia, joka oli saatu bakteriofagi-T4:llä infektoidusta E. colista seuraavalla menetelmällä:

Panet, A. et. ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). P-L Biochemical, Milwaukee, Wisconsin, toimittaa myös poly-nukleotidikinaasia. Sen jälkeen fragmenttia käsiteltiin 25 2 tuntia 37°C:ssa joko Hhal:llä tai Hpall:11a 50 ^ulissa liuosta, jossa oli 6 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 y^-merkaptoetanolia. Sen jälkeen reak-tioseos uutettiin tilavuudellansa fenoli-kloroformi-seosta, DNA-saostettiin 2 tilavuudella etanolia -70°C:ssa, 30 suspendoitiin 20 ^ul:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1 mM EDTA, suoritettiin elektroforeesi ja geeli kuvattiin röntgenfilmille edellä kuvatulla tavalla niin, että merkityt fragmentit saatiin visualisoiduiksi.

35 Tulokset on esitetty kuvassa 5. Kuvat 5(B) ja 5(E) 36 68261 esittävät 550 nukleotidin fragmentille tehtyjä rinnakkaisajoja ennen restriktioentsyymikäsittelyä. Kuvan 5(0 kuvio esittää HhaI-katkaisua ja kuva 5(D) Hpall-kat-kaisua.

5 550 nukleotidin fragmentin puhtaus mitattiin si ten, että restriktioentsyymin katkaisutuotteiden auto-radiogrammi skannattiin ja fragmenttiviivojen radioaktiivisuus j akau tuma tulkittiin kvantitatiivisesti. Mittaukset osoittavat, että ihmisen sikiön suonikalvon 10 samatomammotropiinin cDNA:n rekontruoidun Haelll-fragmentin puhdistuksessa saavutettiin yli 99 % puhtausaste.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä syntetisoidaan plasmidi, joka sisältää 550 emäsparin nukleotidisekvenssin, joka koodaa 15 suurinta osaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotro-piinista.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatcmammotropiinin cDNA:n 550 nukleotidia sisältävä fragmentti, jonka puhtausaste oli yli 99 %, valmistettiin esimerkissä 3 ku-20 vatulla tavalla. 5'-päätefosfaattiryhmät liitettiin suorittamalla inkubointi 37°C:ssa 2 tunnin aikana reak-tioseoksessa, joka sisälsi 50 mmol/1 tris-HCl (pH 8,5), 10 mmol/1 MgC^, 0,1 mmol/1 spermidiiniä, 5 mmol/1 -merkaptoetanolia, 5 % (paino/tilav.) glyserolia, 333 25 pmol ATP ja 5 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia, ja jonka lopullinen tilavuus oli 40 ^ul. DNA erotettiin reaktioseoksesta uuttamalla ensin fenolilla ja saosta-malla sen jälkeen etanolilla. Synteettiset dekanukleo-tidit, jotka sisälsivät EcoRI:n restriktiokohdan, ja 30 joiden sekvenssi oli 5’-CCGAATTCGG-3', ja jotka oli valmistettu edellä mainitulla Scheller, et al:n menetelmällä, liitettiin ihmisen sikiön suonikalvon somato-mammotropiinin DNA:hän moolisuhteessa noin 50:1 50 ^ulissa liuosta, joka sisälsi 66 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6) 9 mmoi/1 35 MgC^ , ja 15 mmol/1 ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP ja 20 37 6 8 2 61 yUg/ml T4-DNA-ligaasia. Restriktiokohtasekvenssejä toimittaa Collaborative Research, Waltham, Massachusetts. Reaktioseosta inkuboitiin 18 tuntia 4°C:ssa ja sen jälkeen reaktio pysäytettiin fenoli-kloroformiuutolla.

5 Tuote saostettiin etanolilla, sakka liuotettiin 50 ^ul:aan liuosta, joka sisälsi 100 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6), ja 7 mmol/1 MgCl2, ja käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 50 yksiköllä EcoRI-endonukleaasia. Endonukleaasikäsittelyssä dekameerien EcoRI-kohta kat-10 kesi, ja syntyi ihmisen sikiön suonikalvon somatomammot-ropiinin cDNA:ta, jossa oli EcoRI-kohesiiviset päät, sekä katkenneita reagoimattomia dekanukleotideja ja itseensä liittyneitä dekanukleotideja. Koska katkenneet dekameerit sisälsivät myös EcoRI-päät ja näin ollen 15 olisivat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammctropii-nin cDNA:n kilpailijoita plasmidin kanssa tapahtuvassa rekombinoinnissa, ihmisen sikiön suonikalvon somatomam-motropiinin cDNA erotettiin geelielektroforeettisesti ennen siirtovektorin kanssa tapahtuvaa reaktiota. Edel-20 lä kuvatun dekanukleotidiliitännän käyttö on edullista siksi, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotro-piinin cDNA-fragmentti voidaan erottaa plasmidista uudelleen muodossa joka on identtinen alkuperäisen fragmentin kanssa.

25 Siirtovektorina käytettiin bakteeriplasmidia 0 pMB-9, jonka molekyylikoko oli 3,5 x 10 , ja joka sisälsi yhden EcoRI-kohdan, ja joka oli valmistettu seuraa-valla menetelmällä: Rodriquez, R.L., Bolivar, F.,

Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCIA 30 Symposium On Molecular and Genetic Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter ja C. F. Fox, (Academic press, New York, 1976) ss. 471-477. Plasmidia pMB-9 toimittaa Bethesda Research Labs, Rockville, Maryland. Jos E. coli-kanta on infektoitunut pMB-p:llä, sillä on vastus-35 tuskyky tetrasykliinin suhteen. DNA:n liittäminen 38 6 8 2 61 pMB-9:n EcoRI-kohtaan ei vaikuta tetrasykliinin vastustuskykyyn eikä mihinkään muuhunkaan plasmidin ominaisuuteen. Näin ollen ei rekombinoidun ja normaalin plasmidin fenotyypissä ole eroa. Tästä syystä EcoRI:llä kat-5 kaistu pMB-9 käsiteltiin ensin emäsfosfataasilla käyttämällä menetelmää, joka on tarkemmin kuvattu FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675 ks. myös Ullrich, et ai., EcoRI:llä käsitellyistä päistä, ja näin plasmidi-DNA:n ligaatio itsensä kanssa estyy ja renkaanmuodostus ja 10 samalla transformaatio tapahtuu vain, jos 5'-fosfory- loidun pään sisältävää DNA-fragmenttia on mukana. Emäs-fosfataasikäsittely suoritettiin 30 minuutin aikana 65°C: ssa reaktioseoksessa, joka sisälsi 1,0 entsyymiyksikköä plasmidi-DNA-grammaa kohti 25 millimoolisessa tris-HCl-15 liuoksessa, pH 8, ja sen jälkeen fosfataasi poistettiin fenoliuutolla ja DNA saostettiin etanolilla. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNA:n liittäminen edellä kuvatulla tavalla käsiteltyyn pMB-9:ään suoritettiin 50 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi 60 20 mmol/1 tris-HCl (pH 8), 10 mmol/1 y^-merkaptoetanolia, 8 mmol/1 MgCl2, 10-50 ng puhdistettua ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNA:ta ja noin 500 ng EcoRI:llä katkaistua 5'-defosforyloitua plasmidi-DNA:ta. Reaktiot aloitettiin lisäämällä TU-DNA-ligaasia 5 ^,ug/ml, 25 niiden annettiin jatkua 1 tunti 15°C:ssa ja sen jälkeen seokset laimennettiin 0,25 ml:ksi liuoksella, joka oli 120 millimolaarinen natriumkloridin suhteen ja 1 millimolaarinen EDTA:n suhteen. Laimennettu reaktio-seos käytettiin sellaisena E. coli X-1776:n transfor-30 mointiin.

E. coli X-1776 (ATCC 31 391) on erityisesti rekombinaatti-DNA-työskentelyyn kehitetty kanta (National Institutes of Health, EK-2-kanta). Kantaa toimittaa Roy Curtiss III, University of Alabama, Department 35 of Microbiology, Birmingham, Alabama. Bakteeria kasvatet- 39 6 8 2 61 tiin 150 ml:ssa ravintolientä, johon oli lisätty 100 yUg/ml diaminopimeliinihappoa (DAP) ja 40 ^ug/ml tymii-niä, solutiheyteen noin 2 x 10^ solua/ml. Solut sentri-fugoitiin talteen, pestiin 60 ml: 11a 10 mi Himo laari s-5 ta NaCl, sentrifugoitiin uudelleen ja suspendoitiin 60 ml:aan transformointipuskuria, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8), 140 mmol/1 NaCl ja 75 mmol/1 CaCl^· Solususpensioita pidettiin 15 minuuttia jäässä, solut sentrifugoitiin talteen ja suspendoitiin 1,5 ml:aan salo maa transformointipuskuria. 0,5 ml solususpensiota lisättiin jäässä, sen jälkeen 4 minuuttia 25°C:ssa ja lopuksi 30 minuuttia jäässä. 0,2 ml solususpensiota laitettiin suoraan ravinneagarlevyille, joihin oli lisätty 100 yUg/ml DAP ja 40 ^ug/ml tymiiniä ja 20 ^ug/ml tetra-15 sykliiniä. Saatiin neljä transformaattia, jotka kaikki sisälsivät 550 emäsparin fragmentin, joka irtosi plas-midi-DNA:sta joko EcoRI- tai Haelll-käsittelyllä.

Sekvenssianalyysiin valittiin transformaatti-klooni, jolle annettiin nimitys pHCS-1. E coli X-1776-20 pHCS-l-kantaa kasvatettiin sopivassa elatusaineessa, plasmidi-DNA eristettiin siitä ja katkaistiin EcoRI-endonukleaasilla. 550 emäsparin fragmentti erotettiin lineaarisesta pMB-9:stä (ATCC 40 002) suorittamalla elektroforeesi 6 % polyakryyliamidigeelissä ja sen jäl-25 keen DNA:n sekvenssi analysoitiin Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä, ks. edellä. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin alafragmentit. valmistettiin inku-boimalla Hpall-restriktioendonukleaasin kanssa ja 5'-päät merkittiin käyttämällä '/'^P-ATP:tä ja polynukleo-30 tidikinaasia. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin kloonatun DNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin Maxam'in ja Gilbert1inmenetelmällä. Vertailemalla ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin tunnettuun aminohapposekvenssiin voitiin todeta, että 557-35 nukleotidin sekvenssi edusti aminohappojen 24-191 välis- 40 6 8 2 61 tä mRNA:n koodialuetta, ja lisäksi oli 3*-päässä 50 nukleotidin alue, jossa ei tapahtunut translaatiota, ks. Niall, H.D. Hogan, M.L., Sauer, R., Rosenblum, I.Y. ja Greenwood, F.C., Proc. Nat. Acad. Sei USA 68, 5 866 (1971). Taulukossa 3 on esitetty ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin mRNA:n primäärira-kenne kloonatun pHCS-l:n DNA-fragmentista määritettynä ja sen perusteella arvioitu aminohapporakenne, kun arvioinnissa käytetään hyväksi tunnettua geneettis-10 tä koodia. Nukleotidisekvenssin perusteella määritetty aminohapposekvenssi on identtinen aikaisemmin julkaistun kemiallisilla menetelmillä määritetyn aminohappo-sekvenssin kanssa. Tämä osoittaa, että alunperin eristetty ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropii-15 nin mRNA on toisiintunut hyvin tarkasti in vitro ja ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin kloonattu DNA-fragmentti on toisiintunut transformoiduissa bakteereissa hyvin tarkasti.

Taulukko 3 20 Kloonatusta pHCS-l:stä saadun ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin yhden DNA-säikeen nukleotidisekvenssi. Numerot tarkoittavat aminohappo-sekvenssiä aminopäästä lähtien. DNA-sekvenssi vastaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin 25 mRNA-sekvenssiä siten, että mRNA:ssa T:n kohdalla on U. Kohtien 1-23 välinen aminohapposekvenssi on myös merkitty näkyviin.

41 6 8261 3 3 5, c £ μ 30 w t < •5 8 ^ U H H <0 5 2 5 8 υυ 3 2 2 8 ,3 5 3o too 5 8 ^ υ > υ o 2 5 2 5 8 ^ .3¾ S η 3¾ 3 δ SL ^ 3-¾ °° >3 ^ 52 58 £2

<υ 3 < ο c u too 0.0 (3 CT

3 μη 8 2 2 5 3 32 « < 5 8 0) ·Η< u < < <ο ο 6 7 Ä ° 5¾ 52 >> ο μη ομο c 30 3¾ 3 3 Öu “3 00«Η r-< <Ι»Η **<**· U U π- Ο »—*ί>0 2 ι-ΐυ u u coo u o en · ., ., I rt) f s _j »% »»f ^ U U U f**i •3 5 2 «38 ^ 5 5 5 5 * ^H £3 5 g 3 0 MO »u !

On) l·* O H 3 2 5 n £ C MO

f MH 22 3 2 H O MO CO u M 5,2 °° MH 3 2 2 7 H H 2 3 3 g 2 3 3 0 au 2 5 wo ou wc Öu 5 3 £1-4 o rj >, c ^ o u < < pl. f-ι u I -1^ 32 MO 0)U WC WC u

3 CO HC CC £ £ £2 -3 0 H

Ή O H C ^ ^ HC H < u 3 Tj-oo 3 C 30 o >, O rs m in 2 2 5-¾ « 3 2 222 52 22 2 35 <0 2¾ 52 23 oh wtJ 2 3 £8 ° υ ^ h 2 o £2 > 2 2 7 · J ^ 32 f? g 22 * o «o 2 W oc “< Cu nn ^3 >>C o ω wo ^ u oo n C oc u

1' ^ U 3 0 H U 3 C MU p. O H

2 22 >0. " ö «< <2 2 3 M c M O O o' O, O w O ij n £ 2 £2 « hÖ 5 2 £2 5¾ 2 o. wo £ 8 22 ΙΊ 2¾ 2 25 .25 « 3 2 2 2 §5 1 2 ° ° 22 2-2 30 O MO M O 2 3 2 5 « H 2 52 2 2^5 5¾ g £ U U ^ H MO MU CO cu n J3 3 2 52 22 53 | g 2

U H ~ * u hJCJ CX, H O

5 ^ H 5 2 22 tL2 « ^ «oo o n 3o w h 00 2" 2 [i H >> o c « rl C u HH MC OH h o OO 0.0 4)0 an _. ,, I MC >—t t-i ,„ ^ 3 0 M u ·~ι a) u

3 CO C o 2¾ 52 nn ,£ < O' .C H

O H C ^ O OO H H n a. i-· 2 ου 5 2 32 s*g *8 3 μ m.

2 2 5,¾ MH 3Ö 52 2 8 5ö 2 8 1 I iö ^ ^ is as ie 2 k 5-¾ s-^ 5 2 5 8 2 8 5¾ £ 2 <CJ 58 5 8 H o «O O M o >.u H e «h H H 5 2 5 2 5 8 2>*< 2-8 7 M< 58 58 3 μ mu cu cu - -« 30 52 HC £ 8 3¾ ^ - ·. 5¾

rt'tr-iu ^ HC WC CC OO

> ^ < ° 5 8 ff 8 Ä 8 SN U MO HO

0 HC 58 52 28 ^3 } <0 OO >-2 < >0 1 1

•-O

Claims (2)

1. 42 6 8 2 61