JPH09107971A

JPH09107971A - 遺伝子探索方法

Info

Publication number: JPH09107971A
Application number: JP7270822A
Authority: JP
Inventors: Masaya Toyama; 正彌遠山; Tsutomu Takagi; 勉高木; Yutaka Suzuki; 豊鈴木; Naoya Sato; 直也佐藤
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1995-10-19
Publication date: 1997-04-28

Abstract

(57)【要約】【課題】複数生物試料間で発現量に差のある遺伝子を
効率よく探索して見い出す方法を提供する。また、この
方法を利用して発見した神経細胞分化に関与する新規ポ
リペプチド及びこれをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】（１）基準生物試料の二本鎖ｃＤＮＡプ
ールを調製してそのプール中の各ＤＮＡ断片の含量を均
一化する工程、（２）互いに比較対照する複数の生物試
料について各試料由来の二本鎖ｃＤＮＡプールを調製す
る工程、及び（３）工程（１）で得られた含量均一化基
準ｃＤＮＡプール中から、工程（２）で得たｃＤＮＡプ
ール中のＤＮＡ断片と会合した断片を除去する工程を含
むことを特徴とする、複数試料間で発現量に差のある遺
伝子を探索する方法。配列番号２で示されるアミノ酸配
列からなる新規ポリペプチド及びこれをコードするＤＮ
Ａ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の探索方
法、および該方法により見いだされるポリペプチドとそ
の遺伝子に関する。より詳細には、複数試料間で発現量
に差のある遺伝子を効率的に探索する方法、および胚性
細胞が神経細胞に分化する時に発現するポリペプチドと
それをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトを含む多細胞生物において生
命機能を維持管理する上で、細胞間のさまざまな情報伝
達が重要であることが知られている。また、種々の疾患
においては、細胞間情報伝達に重要な役割をもつ細胞接
着因子や受容体の発現異常がその発症に関与している例
も多数報告されており、これら因子等の遺伝子を発見す
ることは、各種疾患の発症メカニズムの解明、その予防
法あるいは治療法の開発に重要な知見をもたらすもので
ある。

【０００３】細胞間情報伝達に関与する遺伝子の多く
は、特定の生体部位あるいは特定の細胞でのみ発現して
いるか、あるいは、その発現量が増大（もしくは減少）
しているものである。また、多くの場合これらは発現量
が微量な遺伝子である。そこで、このような未知遺伝子
を発見するためには、例えば、正常細胞と異常細胞、未
分化細胞と分化細胞、或は異なる組織間で、発現量に差
がある遺伝子を見つける方法が重要となる。

【０００４】従来、多試料間で発現量に差のある遺伝子
をみつけようとする場合、ディファレンシャル・ハイブ
リダイゼーション法［Cell、第16巻、第443〜452頁（19
79年）］、サブトラクション法［Nucleic Acids Resear
ch、第16巻、第10937頁（1988年）及びProceedings of
the National Academy of Sciences、第88巻、第11505
〜11509頁（1991年）］、ディファレンシャル・ディス
プレイ法［Science、第257巻、第967〜971頁（1992年）
及びCancer Research、第52巻、第6966〜6968頁（1992
年）］などの方法が一般に利用されてきた。しかし、い
ずれの方法も、目的以外の遺伝子（false positive）が
選択されてくる頻度が高かったり、目的の遺伝子を得る
までに多大の労力と時間が必要である等、効率面で問題
点を有するものであった。しかも、従来の方法では、発
現レベルの低い遺伝子は、発現レベルの高い遺伝子に比
べて見出すことが非常に困難であった。そこで、これら
従来技術のもつ欠点を克服し、多試料間で発現量に差の
ある遺伝子を効率よく見つけることができ、しかも発現
量の少ない遺伝子にも適用できる方法が必要とされてい
た。

【０００５】一方、神経細胞の分化については、胚性腫
瘍細胞の分化誘導に伴っていくつかの細胞増殖因子、サ
イトカインなどの発現誘導がみられることが報告されて
おり、例えば、村松らによって、レチノイン酸処理後の
HM-1細胞で強く発現誘導されることが見出されたミッド
カインは、神経細胞増殖因子であることが明らかにされ
ている［Biochemical and Biophysical Research Commu
nications、第177巻、第652〜658頁（1991年）］。胚性
腫瘍細胞の分化に伴って発現誘導される遺伝子群の系統
的な取得・解析は、初期発生や分化、細胞増殖の分子機
構を解明する研究に役立つばかりでなく、ヒトの様々な
遺伝子について機能解析が可能な系を提供するととも
に、医薬品として有用ないくつかの遺伝子産物を提供す
る可能性を秘めている。また、神経系で発現する遺伝子
の総数は約３万個と推定されているが、その大部分はい
まだ未知である。種々の脳や神経系の疾患の予防あるい
は治療剤の開発のために、これら遺伝子の発見と役割の
解明が望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、正常
細胞と異常細胞、未分化細胞と分化細胞、或は異なる組
織間等、多試料間で発現量に差のある未知遺伝子を効率
よく探索して見い出すことができ、しかも発現量の少な
い遺伝子にも適用できる方法を提供することにある。ま
た、この方法を利用して発見した神経細胞分化に関与す
る新規ポリペプチド及びこれをコードするＤＮＡを提供
しようとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、神経系の
発生分化に関与する種々のポリペプチドや遺伝子につい
て研究を進める過程で、生体プロセスに関与する未知遺
伝子を効率よく探索して発見する方法を見出すととも
に、この方法を利用して、胚性腫瘍細胞Ｐ１９が神経系
細胞に分化するときに発現する新規遺伝子を取得し、本
発明を完成するに到った。

【０００８】すなわち、本発明は、（１）基準生物試料
の二本鎖ｃＤＮＡプールを調製し、得られたｃＤＮＡプ
ール中に含まれる各ＤＮＡ断片の含量を均一化して含量
均一化基準ｃＤＮＡプールを調製する工程、（２）互い
に比較対照する複数の生物試料について、各試料由来の
二本鎖ｃＤＮＡプールを調製する工程、及び（３）工程
（１）で得られた含量均一化基準ｃＤＮＡプール中か
ら、工程（２）で得たｃＤＮＡプール中のＤＮＡ断片と
会合したＤＮＡ断片を除去する操作を行なうことによ
り、比較対照する複数試料の各々について残存ｃＤＮＡ
プールを得る工程を含むことを特徴とする複数試料間
で発現量に差のある遺伝子を探索する方法である。

【０００９】本発明の遺伝子探索方法において、生物試
料は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を発現してい
る生物由来の材料を意味する。このような試料として
は、例えば、細胞、組織などが挙げられる。ＤＮＡはデ
オキシリボ核酸を、ＲＮＡはリボ核酸を、ｃＤＮＡはｍ
ＲＮＡに対する相補的ＤＮＡを、各々意味する。また、
ｃＤＮＡプールとは、異なる塩基配列や長さを有する種
々のｃＤＮＡを含む混合液を意味する。

【００１０】以下に本発明の遺伝子探索方法を、詳細に
説明する。なお、以下の説明において、「ｃＤＮＡプー
ル［Ａ］からｃＤＮＡプール［Ｂ］を『サブトラクト』
（引算、除去）する」とは、ｃＤＮＡプール［Ａ］か
ら、ｃＤＮＡプール［Ｂ］中の断片と会合した断片を除
去して、残存ｃＤＮＡプール［Ａ−Ｂ］を得る操作を意
味する。また、サブトラクション操作［Ａ］−［Ｂ］に
おいて、Ａをトレーサー、Ｂをドライバーと称する。

【００１１】従来のサブトラクション法、すなわち比較
対照する試料由来のＲＮＡもしくはｃＤＮＡ同士でサブ
トラクトを行う手法とは異なり、本発明の遺伝子探索方
法は、ｃＤＮＡ断片の含量を均一化した基準ｃＤＮＡプ
ールを用い、このような含量均一化基準ｃＤＮＡプール
から、比較対照したい複数試料由来のｃＤＮＡプールを
各々サブトラクト（引算）し、得られた各々の残存ｃＤ
ＮＡプールについて、ｃＤＮＡ断片の含量を比較すると
いう手法を用いる。このような手法によれば、ｍＲＮＡ
及びｃＤＮＡ断片の存在比が高い高発現レベルの遺伝子
群のみならず、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ断片の存在比が低
い低発現レベルの遺伝子でも、効率よくクローニングす
ることが可能である。また、比較対照したい複数試料が
３以上の場合にも、繁雑な操作を必要とすることなく容
易に適用できる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子探索方法は、例え
ば以下のように実施することができる。

【００１３】工程（１）及び工程（２）について：工程
（１）においては、ある一つの基準生物試料についてｃ
ＤＮＡプールを調製し、得られたｃＤＮＡプール中に含
まれる各ＤＮＡ断片の含量を均一化する。工程（２）に
おいては、相互に比較対照したい複数の生物試料につい
て各試料由来のｃＤＮＡプールを調製する。

【００１４】工程（１）及び（２）で用いる生物試料と
しては、ｍＲＮＡを発現している生物由来の材料を用い
る。このような試料としては、例えば、細胞、組織など
が挙げられる。工程（２）で用いる複数試料は、遺伝子
の発現量に差があって、相互に比較対照したい材料を用
いればよく特に限定されないが、通常は用いる複数の試
料が同一種由来であることが好ましい。また、発見しよ
うとする遺伝子に合わせて、比較対照する試料を適宜選
択することができる。例えば、細胞分化によって発現が
誘発される遺伝子を求める場合であれば、未分化細胞と
分化誘導された細胞、細胞の腫瘍化によって発現量の変
化する遺伝子を発見しようとする場合は、正常細胞と腫
瘍細胞を、また、臓器特異的に発現する遺伝子を発見し
ようとする場合は、異なる臓器の組織や細胞を比較対照
する試料として用いることができ、ある疾患により特異
的に発現量の変化する遺伝子を発見しようとする場合
は、正常個体及び疾病を有する個体由来の細胞等を比較
対照する試料として用いることができる。

【００１５】また、工程（１）で用いる基準生物試料と
しては、発見しようとする遺伝子が発現している材料で
あればよく、工程（２）で用いる複数試料のいずれとも
違っていてもよいし、いずれかと同じであってもよい。
通常は工程（２）で用いる複数試料のうちのいずれか適
当なものを一つ選択して用いることができ、例えば、癌
細胞で特異的に発現している遺伝子を求める場合であれ
ば、正常細胞と腫瘍細胞を比較対照する試料として用
い、工程（１）で用いる基準試料としては、腫瘍細胞を
用いることができる。

【００１６】工程（１）で用いる基準試料、及び工程
（２）で用いる比較対照する複数試料からのｃＤＮＡプ
ールの調製は、例えば以下のように行うことができる。

【００１７】すなわち、各試料から、ｍＲＮＡを抽出
し、これらを鋳型としオリゴｄＴプライマーを用いる一
本鎖ｃＤＮＡの合成を行い、続いて二本鎖ｃＤＮＡを合
成することによって調製できる。

【００１８】ｍＲＮＡの単離は、例えばオカヤマらの方
法［Okayama, H. et al.、Methodsin Enzymology、第15
4巻、第3〜28頁（1987年）］によって実施できる。オリ
ゴｄＴプライマーを用いる一本鎖ｃＤＮＡの合成及び二
本鎖ｃＤＮＡの合成は、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及び
Maniatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ssより1989年に発刊］に記載の方法（以下同実験書記載
の方法については常法として記す）により、市販のキッ
ト等を用いて実施できる。

【００１９】ｃＤＮＡプールとしては、プール中の二本
鎖ｃＤＮＡが適当な大きさに断片化されたものを用いる
ことが望ましい。ｃＤＮＡ断片の大きさは、必要に応じ
てポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reactio
n、以下ＰＣＲと略す）による増幅を容易に実施できる
ように、約１５０〜１０００ｂｐ程度となるように調製
することが好ましい。断片化は、例えば制限酵素を用い
て好適に実施できる。用いる制限酵素は特に限定されな
いが、６塩基認識制限酵素より４塩基認識制限酵素（例
えばＡｌｕＩやＳａｕ３ＡＩなど）を用いることが、断
片を好ましい大きさとすることができ、ＰＣＲで増幅さ
せる操作を加える場合に断片の大きさによる増幅効率の
差が生じにくい点で好ましい。

【００２０】また、ｃＤＮＡプール中のｃＤＮＡ断片の
両端には、ＰＣＲ用プライマーをハイブリダイズさせる
ための配列（アダプター）を付加しておくのが好まし
い。このようなアダプターを付加しておくことにより、
必要に応じてＰＣＲにより容易に断片の増幅ができる。

【００２１】このようなアダプターとしては、任意の塩
基配列からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを用いればよ
い。アダプターの長さは約１０〜４０塩基対、とりわけ
約１５〜３０塩基対の範囲で設定することが好ましい。
また、工程（１）のｃＤＮＡプールのために用いるアダ
プターと工程（２）のｃＤＮＡプールのために用いるア
ダプターとは、異なった配列を有するものを用いること
が望ましい。工程（２）の複数の試料由来ｃＤＮＡプー
ルに用いるアダプターはすべて同じであっても違ってい
てもよいが、試料間で違った配列のアダプターを用いる
場合は、アダプターの違いによってＰＣＲの増幅効率に
差が生じないように、長さ及びＧＣ含量等、或はＴｍ値
等を同程度となるように設定するのが好ましい。アダプ
ターの調製は、ＤＮＡ合成機により、合成した各一本鎖
ＤＮＡを混合して会合させることにより調製できる。ま
た、二本鎖ｃＤＮＡ断片とアダプターの結合は常法によ
り、ＤＮＡリガーゼを用いて容易に実施できる。

【００２２】ｃＤＮＡプール中のＤＮＡは、必要に応じ
てＰＣＲにより増幅させることができる。ＰＣＲは、プ
ライマー、ＰＣＲ用自動化装置及び市販の酵素・試薬等
を用いて、「ＰＣＲ実験マニュアル」［M.A. Innis、D.
H.Gelfand、J.J.Sninsky及びT.J.White編、斉藤隆監
訳、ＨＢＪ出版局、1991年発刊］等に記載の常法により
実施できる。プライマーは、例えばＤＮＡ合成機により
調製できる。プライマーとしては、前記のｃＤＮＡプー
ル中の断片に付加したアダプター部分とハイブリダイズ
するような配列のものを通常用いることができ、ＰＣＲ
のサイクル数は、２０〜５０サイクル程度、好ましくは
２５〜３５サイクル程度の範囲で設定して実施できる。

【００２３】工程（１）においては、前記のようにして
得られるｃＤＮＡプールを用いて、このプール中の各Ｄ
ＮＡ断片の含量を均一化する操作を行う。均一化の操作
は、例えば、以下のように実施できる。

【００２４】ｃＤＮＡプールの溶液を高温で処理して二
本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、続いて低温で再
会合反応を行った後、再会合できずに残存している一本
鎖ＤＮＡを反応終了液中から分離し、得られた一本鎖Ｄ
ＮＡをＰＣＲにより必要に応じて増幅させる。再会合反
応で残存している一本鎖ＤＮＡの各断片の含量は、元の
二本鎖ＤＮＡの含量のばらつきにかかわらず、ほぼ等量
ずつとなること、すなわち含量が均一化されることが知
られている［Archives of Biochemistry and Biophysic
s、第179巻、第584〜599頁（1977年）、Proceedings of
the NationalAcademy of Sciences、第88巻、第1943〜
1947頁（1991年）及びNucleic Acids Research、第18
巻、第5705〜5711頁（1990年）記載］。従って上記操作
により、出発材料のｍＲＮＡの発現量に応じて異なる含
量で存在していた各ｃＤＮＡ断片の含量が均一化された
二本鎖ｃＤＮＡプール（含量均一化ｃＤＮＡプールと称
する）を得ることができる。かくして、基準生物試料か
ら、含量均一化基準ｃＤＮＡプールが調製できる。

【００２５】高温での解離反応は、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液中、約９０〜１００℃、好ましくは、約９５〜
１００℃にて、通常約２〜１０分間程度保温することに
より実施できる。低温での再会合反応は、配列特異的な
会合を行わせるために、ストリンジェンシー（stringen
cy；厳密性）の高い条件で長時間行うのが望ましく、具
体的には、高温処理後のＤＮＡ溶液を通常約３７〜７０
℃、好ましくは約５０〜７０℃にて、１時間〜２日間程
度保温することにより実施できる。

【００２６】一本鎖ＤＮＡの分離は、例えば、ハイドロ
キシアパタイト・カラムクロマトグラフィーにより分画
した後、一本鎖の含まれている画分を回収して実施でき
る。

【００２７】ハイドロキシアパタイト・カラムクロマト
グラフィーは、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」
［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年
に発刊］に記載の常法により実施できる。一本鎖ＤＮＡ
は、通常１００〜１２０ｍＭリン酸濃度で溶出されるの
で、その画分を分取して用いればよい。得られた一本鎖
ＤＮＡは、前記と同様にしてＰＣＲにより二本鎖とし、
増幅させることができる。

【００２８】工程（３）について：工程（３）において
は、工程（１）で得られた含量均一化基準ｃＤＮＡプー
ル［Ａ］から、工程（２）で得られた複数試料由来の各
ｃＤＮＡプール［Ｂ］と会合する断片を除去（サブトラ
クト）する操作を行って残存ｃＤＮＡプール［Ａ−Ｂ］
を得、残存ｃＤＮＡプールについて、必要に応じて同様
の操作を繰り返す。

【００２９】サブトラクト操作は、例えば、Methods in
Enzymology、第152巻、第423〜432頁（1987年）或はNu
cleic Acids Research、第16巻、第10937頁（1988年）
記載の方法に準じ、以下のように実施できる。すなわ
ち、工程（２）で得られたｃＤＮＡプール［Ｂ］をビオ
チン化する。ビオチン化したｃＤＮＡプール［Ｂ］の一
部を工程（１）で得られた含量均一化基準ｃＤＮＡプー
ル［Ａ］の一部（比較対照する試料数に合わせて等量ず
つ分けたもの）と混合した後、高温で処理して二本鎖Ｄ
ＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、続いて低温で反応させ
て再会合させる。次に、アビジン（またはストレプトア
ビジン）を反応液中に添加・混合した後フェノール処理
して、アビジン（またはストレプトアビジン）及び、こ
れらと結合したビオチン化ｃＤＮＡを除去する。これに
よって、ｃＤＮＡプール［Ａ］中の断片のうち、ビオチ
ン化ｃＤＮＡプール［Ｂ］の断片と再会合した断片も共
に除去される。かくして、［Ａ］から、［Ｂ］と会合す
る断片をサブトラクトする操作［Ａ］−［Ｂ］が実施で
き、残存ｃＤＮＡプール［Ａ−Ｂ］が得られるのでその
一部をサンプリングする。

【００３０】また、必要に応じて、残りの残存ｃＤＮＡ
プールに、前記で用いたと同じビオチン化ｃＤＮＡプー
ル［Ｂ］を添加し、以下前記と同様にして残存ｃＤＮＡ
プール［（Ａ−Ｂ）−Ｂ］を得てその一部をサンプリン
グし、必要に応じてさらに同様のサブトラクト操作を繰
り返す。このようにして、残存ｃＤＮＡ系列が得られ
る。

【００３１】このような一連のサブトラクト操作を、比
較対照する複数試料由来のｃＤＮＡプール（工程（２）
で得られるもの）の各々について、同じ条件で実施す
る。

【００３２】上記サブトラクト操作において、使用する
含量均一化ｃＤＮＡプール［Ａ］とビオチン化ｃＤＮＡ
プール［Ｂ］の量比（モル比又は重量比）は、任意に設
定することができる。［Ａ］に対して用いる［Ｂ］の量
を多くすれば発現レベルの低い遺伝子由来のｃＤＮＡが
選択されやすくなり、逆に［Ｂ］の量を少なくすれば発
現量の高い遺伝子由来のｃＤＮＡも選択可能となる。従
って、上記サブトラクト操作においては、求める遺伝子
をより効率よく検出できるように、用いる含量均一化ｃ
ＤＮＡプール［Ａ］とビオチン化ｃＤＮＡプール［Ｂ］
の量比を設定すればよい。通常は、Ａ：Ｂを、総ＤＮＡ
の重量比で、およそ１：１〜１：１０００、好ましくは
およそ１：１０〜１：１００の範囲で設定して実施する
ことができる。

【００３３】サブトラクトを行う回数は、ｃＤＮＡプー
ル中の各断片の含量を比較しやすい残存ｃＤＮＡプール
が得られるように設定すればよい。少なくとも１回以上
行えばよいが、通常２回以上、とりわけ３〜１０回程度
行うのが好ましい。

【００３４】ｃＤＮＡのビオチン化は、常法により市販
のビオチン化試薬等を用いて実施できる。高温で処理し
て二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させるための、高
温処理は、ｃＤＮＡプールを、ハイブリダイゼーション
溶液中、約９０〜１００℃、好ましくは、約９５〜１０
０℃にて、通常約２〜１０分間程度保温することにより
実施できる。低温での再会合反応は、配列特異的な会合
を行わせるために、ストリンジェンシー（stringency；
厳密性）の高い条件で長時間行うのが望ましく、具体的
には、高温処理後のＤＮＡ溶液を通常約３７〜７０℃、
好ましくは約５０〜７０℃にて、１時間〜２日間程度保
温することにより実施できる。

【００３５】工程（３）で得られた残存ｃＤＮＡプール
を利用して、プール中のｃＤＮＡ断片の含量を比較し、
比較対照する試料間で残存ｃＤＮＡプール中の含量に差
の生じたｃＤＮＡ断片を選択して、これを求める遺伝子
（すなわち複数試料間で発現量に差のある遺伝子）由来
のｃＤＮＡ断片として回収することができる。

【００３６】残存ｃＤＮＡプール中のｃＤＮＡ断片の含
量の比較は、例えば、以下のようにディスプレイ（展
示、可視化）法により実施できる。すなわち、前記工程
（３）で得られた各試料由来の残存ｃＤＮＡを鋳型（te
mplate）とし、アイソトープラベルされたｄＮＴＰ（Ｎ
はＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇから選ばれる任意の塩基）、例えば³²
Ｐ−ｄＣＴＰなどを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣ
Ｒ産物をゲル電気泳動で分離した後、オートラジオグラ
フィーに供する。オートラジオグラフィーにより可視化
されたＤＮＡバンドの濃淡を比較して、残存ｃＤＮＡプ
ール間で濃淡に差の生じたバンドを、候補断片ｃＤＮＡ
として選択し、このバンドに相当するＤＮＡをゲルから
回収することにより実施できる。

【００３７】ＰＣＲは、通常２０〜５０サイクル程度、
好ましくは３０〜４０サイクル程度行なえばよく、ＰＣ
Ｒに用いるアイソトープラベルされたｄＮＴＰは、０．
３〜０．８μｍ程度で用いるのが好ましい。

【００３８】かかるディスプレイ法により目的ＤＮＡ断
片を選択する場合、スクリーニング対象とするＤＮＡ断
片の種類が多いほど、目的とするＤＮＡの選択が難しく
なるので、目的ＤＮＡの選択を容易とするために、一部
の断片のみがＰＣＲで増幅されるようにプライマーを設
定することができる。例えば、断片のアダプター部分に
相当する配列及び断片化に用いた制限酵素認識部位に相
当する配列に加え、さらに３’末端に任意の塩基配列を
付した配列を有するプライマーを設計して用いることに
より、一回にディスプレイされるＤＮＡの種類が減って
候補ＤＮＡ選択が容易となる。また任意の塩基配列部分
を種々変えたものを用いて、ディスプレイを行うことに
よりことにより、スクリーニング対象を広げることがで
きる。ゲル電気泳動は、例えばＤＮＡ塩基配列決定用に
用いる変性ポリアクリルアミドゲルなどを用い、常法に
より実施できる。

【００３９】オートラジオグラム上のＤＮＡバンドの濃
淡は、例えば目視あるいはデンシトメータなどにより比
較でき、サブトラクトの回数が同じである残存ｃＤＮＡ
プールについて、異なる試料間で濃淡に差があるバンド
を候補として選択すればよい。具体的には、例えば試料
Ｍと試料Ｎを比較して、試料Ｎでは発現していない（或
は発現量が少ない）が、試料Ｍでは発現している（或は
発現量が多い）遺伝子を得たい場合、ｎ回目のサブトラ
クト残存ｃＤＮＡプール同士で比較して、試料Ｍ由来の
残存ｃＤＮＡプールでは認められない（あるいは薄い）
が、試料Ｎ由来の残存ｃＤＮＡプールでは認められる
（或は濃い）バンドを、求める遺伝子由来ｃＤＮＡ断片
の候補として選択すればよい。

【００４０】また、前記のような試料間で濃淡に差があ
るバンドについて、さらにサブトラクト系列での濃さの
変化の違いを調べることにより、発現量に差のある遺伝
子由来のバンドを、さらに確実に選択することができ
る。すなわち、サブトラクトを繰り返すにつれて、サブ
トラクトＭ系列では消失していくが、サブトラクトＮ系
列では同程度の濃さで存在し続けるかもしくは見かけ上
濃くなるバンドは、試料Ｎに比べ試料Ｍで発現が増加し
ている遺伝子由来であると考えられる。

【００４１】このように選択されたバンドに相当するＤ
ＮＡを、求める遺伝子（すなわち発現量に差のある遺伝
子）由来のバンドとして、前記のＤＮＡ塩基配列決定用
のポリアクリルアミドゲルから回収すればよい。回収し
たＤＮＡ断片は、必要に応じて、ＰＣＲで増幅し、ま
た、プラスミドに連結して組換えプラスミドを得ること
ができる。

【００４２】このＤＮＡ断片を用いて、常法に従いノー
ザンブロッティング法にて生物試料中におけるｍＲＮＡ
の発現の有無を確認することができる。

【００４３】また、全長ｃＤＮＡもしくは対応する遺伝
子のクローニングを、例えば以下のようにして実施でき
る。回収したＤＮＡ断片を必要に応じてＰＣＲにより増
幅した後、適当なベクターＤＮＡに結合し、適当な宿主
細胞を形質転換してクローン化する。クローン化したＤ
ＮＡをプローブにして、常法により、適当なｃＤＮＡラ
イブラリーもしくはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングし、ハイブリダイズするｃＤＮＡもしくは染色
体遺伝子を取得できる。クローン化は、ベクターとして
公知の種々のプラスミドを、宿主細胞としても公知の大
腸菌等を使用して、常法により実施できる。ｃＤＮＡも
しくはゲノミックＤＮＡライブラリーは、目的遺伝子の
発現が見込まれる細胞などを用いて常法により調製でき
る他、市販のライブラリーを使用することもできる。Ｄ
ＮＡライブラリーを作製する方法としてプラスミドを用
いる方法とλファージを用いる方法等が挙げられるが、
好ましくはλファージを用いる方法がよい。

【００４４】単離した目的ｃＤＮＡもしくは染色体遺伝
子の塩基配列を決定し、さらに、決定された塩基配列を
もとに、新規なＤＮＡであるか否かを検定するととも
に、ｃＤＮＡもしくは染色体遺伝子でコードされるペプ
チドのアミノ酸配列を決定することができる。塩基配列
の決定は、例えば、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis,
T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989
年に発刊］に記載の方法に従って実施できる。

【００４５】本発明には、本発明の遺伝子探索方法に使
用されるキットが含まれる。かかるキットとしては、本
発明の遺伝子探索方法を迅速に行うために有用な、プラ
イマー、アダプターのセット又はビオチン化試薬等を含
むキットなどが挙げられる。

【００４６】また、本発明には、本発明の遺伝子探索方
法によって発見された新規なｃＤＮＡ、遺伝子、並びに
それらによってコードされるポリペプチドが含まれる。

【００４７】次に、本発明の新規ポリペプチド及びＤＮ
Ａについて詳述する。本発明の新規ポリペプチドは、胚
性腫瘍細胞が神経系細胞に分化するときに発現する遺伝
子によってコードされるポリペプチドとして、上記本発
明の遺伝子探索方法の実施により見いだされたものであ
る。

【００４８】すなわち、本発明の新規ポリペプチド及び
ＤＮＡは、後記配列表の配列番号２で示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド、そのホモローグ、そのフラ
グメントまたはそのフラグメントのホモローグ、及びこ
れらをコードするＤＮＡである。

【００４９】本発明のポリペプチドとしては、配列番号
２で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その断
片もしくはそれらのホモローグが含まれる。その断片も
しくはホモローグとしては、例えば、その一部が欠損し
たもの（例えば、生物活性の発現に必須な部分だけから
成るポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換し
たもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したも
の）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入
されたもの等が含まれる。配列番号２で示されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に
少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個の連続
したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少
なくとも８０％または９０％、より好ましくは９５％以
上、配列番号２とのアミノ酸配列上の相同性を有するも
のである。さらに、ポリペプチドのフラグメント、また
はそれらのホモローグのフラグメントとは、ポリペプチ
ドまたはそのホモローグの少なくとも１０アミノ酸、好
ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、
３０、４０、５０または６０アミノ酸の連続した部分を
意味する。

【００５０】また、本発明のＤＮＡには、配列番号２で
示されるポリペプチド、その断片もしくはそれらのホモ
ローグをコードするすべての塩基配列群が含まれる。そ
の１態様として、天然型ｃＤＮＡの塩基配列（翻訳領
域、すなわち第４５４〜３７２９番目の塩基に相当する
領域、及び非翻訳領域を含む）を配列番号１に示す。所
望アミノ酸配列に対応するコドンはそれ自体公知であり
その選択も任意でよいが、ひとつのアミノ酸をコードす
るコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅ
ｕは６種類）知られており、例えば発現に利用する宿主
のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高い配列を決
定することができる［Grantham, R. et al.、Nucleic A
cids Research、第9巻、r43〜r74頁（1981年）］。

【００５１】本発明の新規ポリペプチドのｃＤＮＡもし
くは遺伝子は、例えば本ポリペプチドを産生し得る細胞
からクローニングして取得できる。本発明のポリペプチ
ドを産生し得る細胞としては、マウスの脳、胸腺、心臓
などが挙げられ、好ましくは、分化誘導したマウス胚性
腫瘍細胞Ｐ１９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１８２５］
等が使用できる。ｃＤＮＡもしくは遺伝子のスクリーニ
ング及び単離は、前記本発明の遺伝子探索方法により効
率よく実施できる。すなわち、例えば未分化胚性細胞
（例えばマウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９等）と同細胞をレチ
ノイン酸処理などにより分化誘導した細胞を比較対照す
る試料として用いて、分化誘導した細胞で特異的に発現
している遺伝子のｃＤＮＡ断片を単離することができ、
さらにこれをプローブとして用いて、例えばマウスのｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより全
長ｃＤＮＡを取得できる。得られた全長ｃＤＮＡの塩基
配列を決定することにより、本発明のポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡ配列（例えば配列番号１に示す配列；
天然型ｃＤＮＡ配列）、及びその翻訳領域にコードされ
る本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、すなわち配列
番号２で示される配列を得ることができる。

【００５２】本発明のＤＮＡは、その塩基配列が確定さ
れている場合には、化学合成法によって取得することが
できる。また、配列の一部が確定されている場合には、
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によるか、あ
るいは、該塩基配列の断片や化学合成した部分配列のＤ
ＮＡ等をプローブとして適当なｃＤＮＡもしくはゲノム
ＤＮＡライブラリー等をスクリーニングすることにより
取得できる。例えば、本発明のＤＮＡをプローブとして
ジェノミックＤＮＡを単離することもでき、同様にし
て、本発明のＤＮＡと相同性の高い異種生物由来の関連
ポリペプチドの遺伝子を単離することもできる。対応す
るヒトのポリペプチドの遺伝子ＤＮＡであれば、市販の
ヒトゲノミックＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることにより取得でき
る。

【００５３】所望のＤＮＡを得るためのＤＮＡの断片化
は常法により実施できる。ＤＮＡの断片（フラグメン
ト）とは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも
１５塩基、より好ましくは少なくとも３０塩基の連続す
る部分を意味する。また、ＤＮＡ配列の一部改変は、常
法に従い所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法
（site specific mutagenesis）［Mark, D. F. et a
l.、Proceedings of National Academy of Sciences、
第81巻、第5662〜5666頁（1984年）］等によって実施
できる。

【００５４】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、例えば、遺伝子組換え技術を用いて生産する方
法、生体または培養細胞から精製単離する方法、あるい
はペプチド合成する方法などが挙げられる。

【００５５】遺伝子組換え技術を用いる場合は、前記の
ようにして取得したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
及びポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベク
ター系）を用いて公知の方法により実施できる。発現系
（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、
昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。
このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞およ
び哺乳動物細胞を用いることが好ましい。

【００５６】哺乳動物細胞で発現させる場合には、例え
ば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、
配列番号１で示される塩基配列の第４５４〜３７２９番
目の塩基に相当する配列を含むＤＮＡを用い、これを適
当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピ
ローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクタ
ー、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター
（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入し
て発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクタ
ーで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細
胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞
等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養する
ことによって、その細胞中もしくは培地中に目的とする
ポリペプチドが生産される。

【００５７】また、大腸菌で発現させる場合には、本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λｐＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発
現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質
転換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ５、E.coli ＪＭ
１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養
して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ること
ができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例え
ば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリ
プラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することも
できる。さらに、他のポリペプチドとの融合蛋白（fusi
on protein）を生産することもできる。

【００５８】以上のようにして得られたポリペプチド
は、一般的な生化学的方法によって単離精製することが
できる。

【００５９】また、本発明のポリペプチドを用いて、そ
のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を取得する
ことができる。モノクローナル抗体は、本発明のポリペ
プチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイ
ブリドーマの技術により製造できる。また、モノクロー
ナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体
等を作成できる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例
えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接
種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造する
ことができる。このようにして得られるモノクローナル
抗体、またはポリクローナル抗体を利用することによ
り、生体または培養細胞から、本発明のポリペプチドも
しくは類似の構造を有するポリペプチドを検出し、精製
単離することができる。また生体における該ポリペプチ
ドの定量ができ、該ポリペプチドと疾患との関係の研究
あるいは疾患の診断などにも利用することができる。

【００６０】本発明のＤＮＡとしては、これを含むベク
ター、及びこれらで形質転換された宿主細胞も含まれ
る。このようなベクターとしては、複製起点（ｏｒｉ領
域）を含む複製ベクター、プロモーター領域、プロモー
ターの制御因子、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位又は転写集結配列等を含む発現ベクターが使用
できる。またこれらベクターは、ひとつまたはそれ以上
の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝
子を含んでいるのが好ましい。このようなベクターの具
体例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＲＳ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＳＧ
５、ｐＣＤＭ８、ｐＹＥＳ２等のプラスミドベクター、
ｐＢａｃＰＡＫ８、ｐＢａｃＰＡＫ９、ｐＡｃＵＷ３
１、バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ等）等のウイルスベ
クター、もしくはλｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等
のファージベクターが挙げられる。本発明のＤＮＡを含
むベクターは、例えばＤＮＡに相当するＲＮＡを調製す
るために、または宿主細胞を形質転換するために用いら
れる。宿主細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細
胞、哺乳動物細胞が挙げられ、用いるベクターに合わせ
て適当な宿主細胞選択するか、もしくは用いる宿主細胞
に合わせて適当なベクターを選択すればよい。

【００６１】また、本発明のＤＮＡとしては、本発明の
ポリペプチドのｃＤＮＡあるいはその遺伝子（その翻訳
領域もしくはプロモータ領域など）に選択的にハイブリ
ダイズするＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えばアンチセンス
ＤＮＡもしくはＲＮＡが含まれる。このようなＤＮＡも
しくはＲＮＡは例えば化学合成により取得できる。ま
た、アンチセンスＲＮＡは、例えばポリペプチドのｃＤ
ＮＡを前記のような発現ベクターに、逆向きで（アンチ
センス方向に）挿入することにより取得できる。これら
アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡは、細胞中の本発明
のポリペプチドの発現レベルを制御することに用いるこ
とができる。

【００６２】具体的には、配列番号１の第４５４番目か
ら第３７２９番目までの塩基配列を有するＤＮＡに選択
的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくと
も２０個、好ましくは少なくとも３０個の連続した塩基
配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも
８０または９０％、より好ましくは９５％以上、配列番
号１の第４５４番目から第３７２９番目までの塩基配列
との相同性を有するものである。

【００６３】以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【００６４】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年
に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試
薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使
用した。

【００６５】

【実施例】

実施例１：胚性腫瘍細胞Ｐ１９からのＧＡ３−４３ク
ローンの取得（１）胚性腫瘍細胞Ｐ１９の培養と全ＲＮＡの抽出マウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９（ＡＴＣＣＣＲＬ１８２
５）を、１０％ＦＣＳを添加したα−ＭＥＭ培地（ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ社製）中、３７℃で、５％炭酸ガス含有
空気を気相として培養した。培養容器は、直径１５ｃｍ
の動物細胞培養用のプラスチックシャーレ（ＮＵＮＣ社
製）を培養容器として用い、培養開始時の細胞密度は、
１ｍｌあたり１００，０００個とした。２日間培養後、
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）
を用いて細胞をシャーレからはがし、前記の細胞密度に
なるように培地を用いて細胞懸濁液を調製した。この細
胞懸濁液を二分し、一方はそのまま、前記の方法で継代
培養した。（この細胞を以下、細胞Ｎと称する。）残り
の細胞は、胚性細胞から神経系細胞への分化を誘導する
ために、微生物用プラスチックシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ
社製）を培養容器として用い、１μＭのレチノイン酸
（ＲＡ）の存在下で、４８時間培養した（このレチノイ
ン酸処理した細胞を以下、細胞Ｒと称する。）前記で得
た細胞Ｎと細胞Ｒをそれぞれ遠心分離で集め、「新細胞
工学実験プロトコール」［豊島久真男、山本雅監修、
１９９３年、秀潤社から発刊］の第４２〜４７頁に記載
の方法に従い、アシッド・グアニジン−フェノール−ク
ロロホルム法（ＡＧＰＣ法）により、全ＲＮＡを抽出
し、更にオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラ
フィーにより全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。

【００６６】（２）ｃＤＮＡの断片化、アダプターの付
加及びＰＣＲによる増幅前記（１）で得た細胞Ｎ及び細胞ＲのｍＲＮＡから、オ
リゴ（ｄＴ）プライマーとＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮ
Ａ合成キット（商品名、ファルマシア・バイオテク社
製）を用いて、各々の二本鎖ｃＤＮＡを合成した。得ら
れた二本鎖ｃＤＮＡを、制限酵素ＡｌｕＩで消化し、断
片化した。

【００６７】細胞Ｒ由来の断片化された二本鎖ｃＤＮＡ
を二分し、その一方には、両端に、下記のＢａｍＨＩア
ダプター：

【００６８】

【化１】

【００６９】を、Ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．
２．０（商品名、宝酒造社製、ＤＮＡライゲーション用
キット）を用いて連結し、アダプターを付加した断片化
二本鎖ｃＤＮＡのプールを得た。アダプターは、一本鎖
オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機で合成して各鎖を混
合しアニールさせて調製したものを用いた（以下、同
様）。

【００７０】また、細胞Ｒ由来の断片化された二本鎖ｃ
ＤＮＡの残りと、細胞Ｎ由来の断片化された二本鎖ｃＤ
ＮＡには、両端に、下記のＨｉｎｄＩＩＩアダプター：

【００７１】

【化２】

【００７２】を、Ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．
２．０を用いて連結した。かくして、細胞Ｎと細胞Ｒか
ら、アダプターを付加した断片化二本鎖ｃＤＮＡのプー
ルを得た。

【００７３】前記で得た、ＢａｍＨＩアダプターを連結
した細胞Ｒ由来断片化ｃＤＮＡプールを鋳型とし、下記
のプライマー１（ＢａｍＨＩプライマー）：５’ ＡＧＡＡＧＣＴＡＣＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡ３’ を用いてＰＣＲを行った。アダプターは、ＤＮＡ合成機
で合成したものを用いた（以下、同様）。また、ＰＣＲ
は、自動化装置ＰＣ−７００（アステック社製）とパー
キンエルマー社製の反応試薬を用い、９５℃で２分、６
０℃で２分、７２℃で３分を１サイクル、９５℃で４０
秒、６０℃で６０秒、７２℃で９０秒を２５サイクル、
７２℃で１０分を１サイクルの計２７サイクルの条件で
行った。

【００７４】得られたＰＣＲ反応終了液をフェノール抽
出後エタノール沈殿に付し、得られたＤＮＡを５０μＬ
のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００７５】前記で得た、ＨｉｎｄＩＩＩアダプターを
連結した細胞Ｎ由来断片化ｃＤＮＡプール、および、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩアダプターを連結した細胞Ｒ由来断片化ｃ
ＤＮＡプールのそれぞれを鋳型とし、下記のプライマー
２（ＨｉｎｄＩＩＩプライマー）：５’ ＧＴＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧ３’ を用い、前記と同様の条件でＰＣＲを行ってＤＮＡを増
幅した。ＰＣＲ反応終了液を、フェノール抽出後エタノ
ール沈殿し、得られたＤＮＡを蒸留水に溶解した。

【００７６】（３）含量均一化トレーサーｃＤＮＡの調
製前記（２）で得た、ＢａｍＨＩアダプターを連結した後
ＰＣＲで増幅した細胞Ｒ由来断片化ｃＤＮＡプールの溶
液１０μＬを、１０μＬの２ｘハイブリダイゼーション
液（１００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、２０ｍＭＥＤＴ
Ａ、３００ｍＭＮａＣｌ、０．２％ＳＤＳ）と混合し
た。この混合液を、９５℃で１０分間熱処理して一本鎖
ＤＮＡに解離させた後、６５℃で２日間保温して再会合
させた。このＤＮＡ溶液に１３０μＬの１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加え、これを、３０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムにかけ、ＤＮＡを吸着させた。
ついで、６５℃で保温した３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍ
Ｍ、６２．５ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍ
Ｍ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ及び２００ｍＭのリン酸ナ
トリウム緩衝液をこの順で順次カラムに流し、溶出液を
各々回収した。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液によ
る溶出液を一本鎖ＤＮＡとして分取し、この溶出液と前
記のＢａｍＨＩプライマーを用い、前記と同様の条件で
ＰＣＲを行ってＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲにより得ら
れたＤＮＡを、フェノール抽出後エタノール沈殿に付
し、これを１０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。かくし
て、細胞Ｒ由来の均一化トレーサーｃＤＮＡ溶液を得
た。なお、前記ＰＣＲ産物のうちの少量をサンプリング
し、これについてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なったところ、特に目立ったバンドがなく一様に産物が
分布して染色されること、すなわち含量均一化されてい
ることが確認できた。

【００７７】（４）ビオチン化ドライバーｃＤＮＡの調
製前記（２）で得た、ＨｉｎｄＩＩＩアダプターを連結し
た後ＰＣＲで増幅した細胞Ｎ及び細胞Ｒ由来断片化ｃＤ
ＮＡのプール溶液各１２０μＬを、各々、１２０μＬの
ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥＢＩＯＴＩＮ（商品名、ＶＥＣ
ＴＯＲ社製、ビオチン化試薬、１ｍｇ／ｍｌの水溶液と
して使用）と混合後、０℃にて強い光に３０分間曝し
た。これらの反応液に０．５ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ９．５）６０μＬを加えることにより反応を停止さ
せ、ブタノール抽出により未反応のビオチンを除去した
後エタノール沈殿して、ビオチン化されたＤＮＡを回収
し、これを、元のＰＣＲ反応終了液と同じ濃度になるよ
うにＴＥ緩衝液に溶解した。かくして、細胞Ｎ由来のビ
オチン化ドライバーｃＤＮＡ（以下、ドライバーＮと称
する）と細胞Ｒ由来のビオチン化ドライバーｃＤＮＡ
（以下、ドライバーＲと称する）を得た。

【００７８】（５）サブトラクトされたＤＮＡ系列の調
製前記（３）及び（４）で調製したトレーサー及びドライ
バーｃＤＮＡを用い、以下のようにしてサブトラクトＤ
ＮＡ系列を調製した。３０μＬの細胞Ｒ由来均一化トレ
ーサー溶液と２０μＬのドライバーＮ溶液との混合液、
および、３０μＬの細胞Ｒ由来均一化トレーサー溶液と
２０μＬのドライバーＲ溶液との混合液の２種を調製
し、それぞれエタノール沈殿した。得られた各々のＤＮ
Ａを１０μＬの１ｘハイブリダイゼーション液（５０ｍ
ＭＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ）に溶解し、ミネラルオ
イルを重層した後、９８℃で１５分間、６５℃で３０分
間、９８℃で５分間、６５℃で２日間と続けて熱処理
し、二本鎖ＤＮＡの解離・再会合反応を行った。その
後、１００μＬの緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８）と７０
μＬのストレプトアビジン溶液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製、ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌの濃度
のもの）を加え、室温で３０分間反応させた後、フェノ
ール抽出してストレプトアビジンと結合したビオチン化
ＤＮＡを除去し、水相中に残存するＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡ溶液の一部（２μＬ）を蒸留水（１８μ
Ｌ）で希釈し保存した（この希釈液を以下、各々サブト
ラクトＮ１およびサブトラクトＲ１と称する）。

【００７９】残りのＤＮＡ溶液に対し、細胞Ｒ由来均一
化トレーサーｃＤＮＡ溶液とドライバーＮ溶液との混合
液から得られたものには、再び２０μＬのドライバーＮ
を加え、細胞Ｒ由来均一化ｃＤＮＡとドライバーＲの混
合液から得られたものには、再び２０μＬのドライバー
Ｒを加えて、以下、前記と同じ操作を繰り返し、ＤＮＡ
希釈液サブトラクトＮ２とサブトラクトＲ２を得た。以
下さらに同じ操作を繰り返して、サブトラクトされたＤ
ＮＡ系列（サブトラクトＮ３、サブトラクトＲ３、サブ
トラクトＮ４、サブトラクトＲ４）を得た。

【００８０】（６）細胞Ｒで特異的に発現されている遺
伝子のディスプレイによる選択とノーザンブロット解析
による確認前記（５）で得られたサブトラクトＤＮＡ系列（すなわ
ちサブトラクトＮ１、サブトラクトＲ１、サブトラクト
Ｎ２、サブトラクトＲ２、サブトラクトＮ３、サブトラ
クトＲ３、サブトラクトＮ４、およびサブトラクトＲ
４）の各々を鋳型とし、前記ＢａｍＨＩプライマーの
３’側１４塩基に５’−ＣＴＧＡ−３’（ＡｌｕＩ認
識部位の一部に対する相補配列及びランダムな２塩基配
列）を付加した配列を有する下記のプライマー３：５’ ＡＣＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＡ３’ を用いて、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ存在下で、ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲは、９５℃で２分間、５５℃で２分間、７２
℃で３分間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で
１分間、７２℃で９０秒間を４５サイクル、７２℃で１
０分間を１サイクルの条件で行い、反応溶液中のｄＮＴ
Ｐｓ濃度は、³²Ｐの取込み率（比放射能）を高めるため
に、通常と異なり２．５μＭに変更して行なった。

【００８１】ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを、シーケ
ンス用ゲル（５％尿素変性ポリアクリルアミドゲル）で
電気泳動した後、オートラジオグラムを撮った。オート
ラジオグラム上のバンドの濃さを各サブトラクトＤＮＡ
系列で比較したところ、サブトラクトＮの系列で１から
４へ濃さが増大もしくはほぼ同じ濃さで存在し続けるバ
ンドで、かつ、サブトラクトＲの系列では１から４へ濃
さが減少もしくは消失するバンドを見出し、これを、Ｒ
細胞での発現量がＮ細胞と比較して増大している遺伝子
（すなわち、神経細胞への分化に特異的と考えられる遺
伝子）由来のバンドとして選択した。

【００８２】このバンドに相当するＤＮＡ（以下、ＧＡ
３−４３と称する）をシーケンス用ゲルから抽出し、こ
れを鋳型として、前記のプライマー３を用いて、前記
（３）と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ
を回収した。回収したＤＮＡとプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ
（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで連
結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換してＧＡ３−４３
のｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得た。

【００８３】この組換えプラスミドからＳｐｈＩとＰｓ
ｔＩ断片として切り出したＧＡ３−４３ｃＤＮＡをプロ
ーブとして用い、レチノイン酸処理及び無処理の条件に
て培養したＰ１９細胞の全ＲＮＡに対するノーザンブロ
ット解析を行った。プローブは、ＲａｎｄｏｍＰｒｉ
ｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＶｅｒ．
２（商品名、宝酒造社製）を用い、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ
でラベルしたものを用いた。その結果、図１に示したよ
うに、ＧＡ３−４３ｃＤＮＡの由来する遺伝子は、レチ
ノイン酸処理して分化誘導した細胞で特異的に発現して
いることが確認された。

【００８４】実施例２ＧＡ３−４３遺伝子の全長ｃＤ
ＮＡのクローニングと解析（１）全長ｃＤＮＡの取得と塩基配列決定前記実施例１（６）で得られたＧＡ３−４３ｃＤＮＡ
（ＳｐｈＩ−ＰｓｔＩ断片）をα−³²Ｐ−ｄＣＴＰとＲ
ａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ
ＫｉｔＶｅｒ．２（商品名、宝酒造社製）を用いて
ラベルし、これをプローブとして、マウス脳ｃＤＮＡラ
イブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をスクリーニ
ングしたところ、１８個の陽性クローンを得た。その中
で挿入断片が最も長いクローンを選び、このクローンか
らプラスミド（ｐ０５と称する。ベクター部分はＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−）
を回収した。さらに、上記のプラスミドの挿入断片ｃＤ
ＮＡをプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリ
ーを再度スクリーニングし、多数の陽性クローンを得
た。その中で挿入断片が長いクローンを選び、これらク
ローンからプラスミド（ｐＳ４及びｐＰ１と称する。い
ずれもベクター部分はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−）を回収した。

【００８５】これらのプラスミドについてＫｉｌｏ−Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ用ＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（商品名、宝
酒造社製）を用いて作成した種々の欠失プラスミドを用
い、ダイデオキシ法により、これらプラスミドの挿入断
片ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。かくして、ＧＡ３−
４３ｃＤＮＡの由来する遺伝子（以下、ＧＡ３−４３遺
伝子と称する）の全長ｃＤＮＡを含む全塩基配列を決定
した（配列番号１）。

【００８６】プラスミドｐ０５には、塩基配列の第１５
４５〜第４８０４番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片
が、プラスミドｐＳ４には、配列番号１に示した塩基配
列の第１〜第１９５８番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断
片が、プラスミドｐＰ１には、配列番号１に示した塩基
配列の第３９５２〜第４８２２番目の塩基に相当するｃ
ＤＮＡ断片が含まれていた。

【００８７】（２）塩基配列及びアミノ酸配列の解析前記（１）で得られた全長ｃＤＮＡの塩基配列のデータ
を解析した結果、配列番号１に示したｃＤＮＡ配列中第
４５４番目から３７２９番目の塩基の部分にオープンリ
ーディングフレームがあると考えられた。このオープン
リーディングフレーム中にコードされるアミノ酸配列を
配列番号２の配列に示した。

【００８８】配列番号１、配列番号２に示した配列、及
び推定された成熟ポリペプチドの配列について、既知Ｄ
ＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及
びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−
ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検
索を行った結果、一致するものはなく、本発明のｃＤＮ
Ａとポリペプチドは新規なものであることが判った。

【００８９】また、前記で得たアミノ酸配列について、
ＢＬＡＳＴプログラムを用いてプロテインデータベース
に含まれる配列に対してホモロジー検索を行い、その結
果を詳細に検討したところ、１５個のロイシンリッチリ
ピートと３個の免疫グロブリンＣ２ドメイン、１つの膜
貫通領域、および細胞内領域を有する図２に示したよう
な構造であると考えられた。この構造的特徴から、ＧＡ
３−４３遺伝子の遺伝子産物と考えられる本発明のポリ
ペプチドは、細胞接着因子もしくは受容体として機能し
ていることが推察された。

【００９０】実施例３マウス各臓器におけるＧＡ３−
４３遺伝子の発現マウスの各臓器組織から抽出した全ＲＮＡに対して、前
記（１）で得られたＧＡ３−４３遺伝子の全長ｃＤＮＡ
を含む断片をプローブとして用い、ノーザンブロット解
析を、前記実施例１（６）と同様にして行った。その結
果、図３に示したように、脳、胸腺、および心臓で、ｃ
ＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡのシングルバンド
が認められ、このことからＧＡ３−４３遺伝子がこれら
臓器で発現されていることが判明した。

【００９１】

【発明の効果】本発明の遺伝子探索方法によれば、高発
現レベルの遺伝子群のみならず低発現レベルの遺伝子も
効率よくクローニングでき、また、比較対照したい複数
試料が３以上の場合にも容易に適用できる。すなわち、
複数試料間で発現量に差のある遺伝子を効率よく探索し
て発見することができ、ひいては特定の臓器、特定の細
胞、特定の生物学的プロセスにおいて重要な機能を果た
す新規な遺伝子及びそれにコードされるタンパク質を見
いだすことができる。

【００９２】また、本発明の遺伝子探索方法によって見
出された新規なポリペプチド及びそれをコードするＤＮ
Ａは、胚性腫瘍細胞が神経系細胞に分化するときに発現
するものであり、小脳のグリア細胞、胸腺および心臓で
発現している。これらは、小脳の機能異常に基づく疾
患、たとえば、運動失調症、晩発性間質性小脳萎縮症、
オリーブ橋小脳萎縮症、Ｆｒｅｄｒｅｉｃｈ病など、お
よびＴ細胞機能異常に基づく疾患、たとえば、慢性関節
リウマチや自己免疫疾患など各種疾患のモデル動物作成
や治療剤の開発研究に有用である。

【００９３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４８２２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源生物名：マウス配列： GGTGCGCTCC GGCCGCTCCG GGACGCGCAG GCGCGTGGGG TCCACGGCTA TCATCAGCTC 60 AGCGTCCTCA GTGAGATGCC CGCCCGCGTC ACGGCAGAGG CCGAGGCTAA GCGTTTTCAG 120 TCCTCAGAGG CGGCGGCTCT CGGCGTGCGC CCGAGCTCTG AAGGCGACTC TCAGCGCGGC 180 GGGAAGGACG AGCAGCGGCG GCCGGGCACT CACTGCGGGA CTCCACAGAG TTCGCCGCGC 240 GCGGGGCTCG GCCCGGATGG CGCGGGGGTG GCGGTCCCCG CAGTGCTGCG AACGGCCCGG 300 GCAGAGCGTG CCGGCTGAGC GCCGCGGCCC CGGAGCCGAC TGGAGTCGTG CGTCCATGTC 360 CCGACGCGGT GCTAGGTCCT AGCACAGCCA CGTTCGAGTT CGTCCGCACC TCGCAGCCCT 420 CGCTCCCCGG CTTCGCGGCG CGTTCCAGAC AAGATGGCGC GGCCCGGTCC GGGAGTGCTC 480 GGAGCCCCGC GCCTTGCGCC TCGCCTTCTG CTCTGGCTGC TCTTGCTGCT ACTGCAATGG 540 CCGGAGTCAG CGGGCGCCCA GGCTCGCCCG CGGGCCCCCT GCGCGGCCGC CTGCACTTGC 600 GCCGGGAACT CGCTGGACTG CAGTGGGCGC GGGCTGGCGA CGCTGCCCCG GGACCTGCCC 660 TCCTGGACGC GCAGCCTAAA CCTGAGTTAT AACAGACTCT CCGAGATCGA CTCTGCTGCT 720 TTTGAGGACT TGACGAATCT GCAGGAAGTG TACCTCAACA GCAATGAGCT GACAGCCATA 780 CCATCACTGG GCACTGCTTC CATAGGAGTT GTCTCTCTCT TTTTGCAGCA CAACAAGATC 840 CTTAGTGTGG ATGGGAGCCA GCTGAAGTCG TACCTGTCCT TGGAAGTGCT GGATCTGAGT 900 TCCAACAACA TCACGGAAAT TCGGAGCTCC TGTTTCCCGA ACGGCCTGCG TATAAGGGAA 960 CTCAACTTGG CGAGCAACCG CATCAGCATC CTGGAGTCTG GAGCATTTGA TGGTCTGTCG 1020 CGGTCACTGC TGACTCTCCG TCTGAGCAAA AACAGGATCA CCCAGCTTCC TGTGAAAGCG 1080 TTCAAGCTAC CCAGGCTGAC ACAACTAGAC CTGAATCGGA ATCGGATTCG GCTGATTGAA 1140 GGCCTCACGT TCCAGGGGCT CGACAGCTTA GAGGTGCTGA GGCTTCAGAG GAACAACATC 1200 AGCAGGCTGA CGGACGGGGC CTTCTGGGGG CTGTCTAAGA TGCACGTGCT GCACCTGGAG 1260 TACAACAGTC TGGTGGAAGT GAACAGTGGC TCCCTCTATG GCCTCACAGC CCTGCACCAG 1320 CTGCACCTCA GCAACAACTC CATCTCTCGA ATTCAGCGTG ATGGCTGGAG CTTCTGCCAA 1380 AAGCTGCATG AGTTGATTCT GTCCTTCAAC AACCTCACGC GGCTGGATGA GGAGAGTCTA 1440 GCGGAGTTGA GCAGCCTCAG TATCCTGCGC CTCAGTCACA ACGCCATCAG TCACATTGCT 1500 GAAGGCGCCT TCAAGGGACT CAAGAGTCTG CGGGTCTTGG ACCTGGACCA TAACGAGATC 1560 TCGGGTACAA TCGAGGATAC CAGTGGTGCC TTTACGGGGC TTGACAACCT CAGCAAGCTG 1620 ACTCTGTTTG GAAACAAGAT CAAATCTGTG GCTAAGAGAG CCTTCTCGGG CCTGGAAAGC 1680 CTGGAACACC TGAACCTTGG AGAGAATGCA ATCAGGTCTG TCCAGTTTGA TGCCTTTGCA 1740 AAGATGAAGA ACCTTAAAGA GCTCTACATC AGCAGTGAGA GCTTCCTGTG TGACTGCCAG 1800 CTCAAGTGGC TGCCCCCATG GCTAATGGGT AGGATGCTGC AGGCCTTTGT GACAGCCACC 1860 TGTGCCCATC CAGAGTCGCT GAAGGGCCAG AGCATTTTCT CAGTGCTGCC AGACAGCTTT 1920 GTGTGTGATG ACTTTCCAAA GCCACAGATC ATCACCCAGC CTGAGACGAC CATGGCTGTG 1980 GTGGGCAAGG ACATCCGTTT CACATGCTCC GCAGCCAGCA GCAGCAGCTC ACCAATGACC 2040 TTCGCCTGGA AGAAGGACAA TGAGGTCCTG GCCAATGCAG ACATGGAGAA CTTTGCCCAC 2100 GTCCGTGCAC AGGACGGCGA AGTGATGGAG TATACCACTA TCCTGCACCT CCGTCACGTC 2160 ACCTTTGGGC ACGAGGGCCG CTACCAGTGT ATCATCACAA ACCACTTTGG CTCCACATAC 2220 TCCCACAAAG CCAGGCTCAC TGTGAATGTG TTGCCATCAT TCACTAAAAT ACCCCATGAC 2280 ATTGCCATCC GGACTGGCAC CACAGCCCGC CTCGAGTGTG CTGCCACGGG CCACCCTAAC 2340 CCTCAGATTG CCTGGCAGAA GGATGGAGGC ACCGATTTCC CGGCAGCTCG TGAGCGACGC 2400 ATGCATGTTA TGCCAGACGA TGATGTGTTC TTCATCACTG ATGTGAAAAT AGACGACATG 2460 GGGGTCTACA GCTGCACTGC CCAGAACTCG GCAGGCTCGG TTTCAGCCAA CGCTACCCTC 2520 ACAGTCTTAG AAACTCCATC CTTGGCAGTG CCTCTGGAAG ACCGTGTGGT AACTGTGGGA 2580 GAAACAGTGG CCTTCCAGTG CAAAGCAACC GGGAGCCCCA CACCACGCAT CACCTGGCTT 2640 AAGGGAGGTC GCCCATTGAG CCTCACAGAG CGCCACCATT TCACTCCAGG CAACCAGCTG 2700 CTGGTTGTTC AGAATGTGAT GATAGACGAT GCAGGGCGGT ATACCTGTGA GATGTCTAAT 2760 CCCCTGGGCA CTGAGCGAGC ACATAGCCAG CTGAGCATTT TACCTACCCC TGGCTGCCGG 2820 AAGGATGGGA CCACCGTAGG CATCTTCACC ATTGCTGTGG TGTGCAGTAT TGTCCTGACC 2880 TCGCTGGTGT GGGTGTGCAT CATCTACCAG ACCAGGAAGA AGAGCGAGGA GTACAGCGTC 2940 ACTAACACAG ATGAAACCAT TGTGCCTCCA GATGTTCCAA GCTACCTCTC CTCTCAGGGA 3000 ACCCTTTCTG ACCGGCAGGA AACTGTGGTC AGGACTGAGG GTGGTCATCA GGCCAATGGG 3060 CACATTGAAA GCAATGGTGT GTGTCTGAGA GACCCGAGCC TCTTCCCAGA GGTCGACATT 3120 CATAGCACTA CATGTAGGCA GCCCAAGCTG TGTGTTGGAT ACACTAGAGA GCCCTGGAAG 3180 GTGACGGAGA AAGCCGACAG GACAGCTGCC CCACATACAA CAGCACACAG TGGCTCTGCT 3240 GTATGTAGTG ACTGCAGTAC TGACACAGCC TACCATCCCC AGCCTGTGCC CAGAGACAGT 3300 GGGCAGCCAG GCACAGCGAG CAGCCAAGAG CTCAGGCAGC ATGACCGGGA ATATTCTCCA 3360 CACCATCCTT ACAGTGGGAC TGCGGATGGG TCTCATACCC TCTCTGGGGG GTCCCTCTAT 3420 CCAAGCAACC ATGACAGAAT ACTGCCATCC TTGAAGAACA AGGCGGCGTC TGCAGATGGG 3480 AACGGAGATT CCTCTTGGAC TTTAGCAAAG TTACATGAAG CAGACTGCAT AGACCTAAAG 3540 CCTTCTCCTA CGTTAGCTTC AGGCAGCCCA GAGCTCATGG AAGACGCCAT ATCTACTGAA 3600 GCCCAGCACT TGCTTGTTTC CAATGGCCAC CTCCCCAAGG CCTGTGACTC CAGCCCTGAA 3660 TCTGTGCCAC TGAAAGGGCA GATCACTGGG AAACGGAGGG GACCACTGCT ATTGGCACCG 3720 AGAAGCTAGG CTTCATCTAC CTCAGCTCTT TTAAAGCAGT CGCTACAGGA AAGAGGTAGG 3780 AGAGGCCGTG GAAAGCTTGT GTCCAGACGT CACTCCGGAC AGTCCGACTT CCGTGTGGAA 3840 TGTCAGTCAG TCGGCTAGAG GAGTGGCATC TGGAGCTCAG AAACGTGAGA GACTATTTGT 3900 GTACAAAAGG CAGGAAAAAG TATTTGATAC CACTGTACAT AAGAGTTTTC AGAGATTTCA 3960 TATATATTAT ATATCTTTTA CAGAGACTAT TTTAATCCTT AGCGCATGGG TCCCGCTTTT 4020 GGTGATATTT TCACATTAGG TTGCTGTCTA ATTTTGGAGA GGGTCAGGAA TCGTTCTGGT 4080 GCCTTAATGC ACAGCTGGAA TTCAGGTAAA CACATCAGCT GTTGCTGGCG GTTGGAAAGG 4140 AGGGCATCTT GGCTGTGTGG CACTTAGTGG TCAGATTCGA GTGCACTGGC CAGACCTATG 4200 CAGGCGTGGT GTTGGCAGCC TCACTGTAGA GCAGGGTGCA CGGGTCTGTA GTTGAGGACG 4260 AGATTGAGAG CTGTTAATCC ACCAAATGCA ATGGCTCAGA CAATTAAGCA CTGCCTTTCG 4320 TCTTTCTTTG TAACTCACTT GGTAAAAGCA AATGTCTTGT CTCCTTCAGT GGTTCTTTGA 4380 AGCTTAGTGA GGCGGAGGCT GCCAGTGTTG GTACCTGTGG ATTTTCCAAT AGTGAGGGTT 4440 AGCTCTGCCT CCAGGGCCCG CTAAGTTCTG CTGAGCAGGC CTGTCCACGC TGTTCCTTAC 4500 CGGTGAGACT GGGCTTGGAC TGTACAAGAC TTGAGTCCTA GACCTGGGTG TATTTGCACT 4560 TTGGGGCCCT GTTGCTAGCC ATCACTGTGC CAGAGCAAGC ACGCTGAGAA GGCTAGTCTC 4620 CATAGTTGAT GGTTAATGTT ACTTCCACAA AATATGTGAA TTTGCTGCTT CTGAGAGGCA 4680 ATGTGAAAGA GGAAGTATTA CTTTTATGTA CAGAGTTATT TATTTATAGA AATTTTGGTA 4740 CAGTGTACAT TGAAAACATG TAAAATATTG AAGTGTCTAA CAAATGGCAT AAAGTGTCTT 4800 TAATAAAGGT TCATTTATAA AT 4822 配列番号：２配列の長さ：１０９１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：マウス配列： Met Ala Arg Pro Gly Pro Gly Val Leu Gly Ala Pro Arg Leu Ala 1 5 10 15 Pro Arg Leu Leu Leu Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Trp Pro 20 25 30 Glu Ser Ala Gly Ala Gln Ala Arg Pro Arg Ala Pro Cys Ala Ala 35 40 45 Ala Cys Thr Cys Ala Gly Asn Ser Leu Asp Cys Ser Gly Arg Gly 50 55 60 Leu Ala Thr Leu Pro Arg Asp Leu Pro Ser Trp Thr Arg Ser Leu 65 70 75 Asn Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Ser Glu Ile Asp Ser Ala Ala Phe 80 85 90 Glu Asp Leu Thr Asn Leu Gln Glu Val Tyr Leu Asn Ser Asn Glu 95 100 105 Leu Thr Ala Ile Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ile Gly Val Val 110 115 120 Ser Leu Phe Leu Gln His Asn Lys Ile Leu Ser Val Asp Gly Ser 125 130 135 Gln Leu Lys Ser Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser Ser 140 145 150 Asn Asn Ile Thr Glu Ile Arg Ser Ser Cys Phe Pro Asn Gly Leu 155 160 165 Arg Ile Arg Glu Leu Asn Leu Ala Ser Asn Arg Ile Ser Ile Leu 170 175 180 Glu Ser Gly Ala Phe Asp Gly Leu Ser Arg Ser Leu Leu Thr Leu 185 190 195 Arg Leu Ser Lys Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Val Lys Ala Phe 200 205 210 Lys Leu Pro Arg Leu Thr Gln Leu Asp Leu Asn Arg Asn Arg Ile 215 220 225 Arg Leu Ile Glu Gly Leu Thr Phe Gln Gly Leu Asp Ser Leu Glu 230 235 240 Val Leu Arg Leu Gln Arg Asn Asn Ile Ser Arg Leu Thr Asp Gly 245 250 255 Ala Phe Trp Gly Leu Ser Lys Met His Val Leu His Leu Glu Tyr 260 265 270 Asn Ser Leu Val Glu Val Asn Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Leu Thr 275 280 285 Ala Leu His Gln Leu His Leu Ser Asn Asn Ser Ile Ser Arg Ile 290 295 300 Gln Arg Asp Gly Trp Ser Phe Cys Gln Lys Leu His Glu Leu Ile 305 310 315 Leu Ser Phe Asn Asn Leu Thr Arg Leu Asp Glu Glu Ser Leu Ala 320 325 330 Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ile Leu Arg Leu Ser His Asn Ala Ile 335 340 345 Ser His Ile Ala Glu Gly Ala Phe Lys Gly Leu Lys Ser Leu Arg 350 355 360 Val Leu Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Ser Gly Thr Ile Glu Asp 365 370 375 Thr Ser Gly Ala Phe Thr Gly Leu Asp Asn Leu Ser Lys Leu Thr 380 385 390 Leu Phe Gly Asn Lys Ile Lys Ser Val Ala Lys Arg Ala Phe Ser 395 400 405 Gly Leu Glu Ser Leu Glu His Leu Asn Leu Gly Glu Asn Ala Ile 410 415 420 Arg Ser Val Gln Phe Asp Ala Phe Ala Lys Met Lys Asn Leu Lys 425 430 435 Glu Leu Tyr Ile Ser Ser Glu Ser Phe Leu Cys Asp Cys Gln Leu 440 445 450 Lys Trp Leu Pro Pro Trp Leu Met Gly Arg Met Leu Gln Ala Phe 455 460 465 Val Thr Ala Thr Cys Ala His Pro Glu Ser Leu Lys Gly Gln Ser 470 475 480 Ile Phe Ser Val Leu Pro Asp Ser Phe Val Cys Asp Asp Phe Pro 485 490 495 Lys Pro Gln Ile Ile Thr Gln Pro Glu Thr Thr Met Ala Val Val 500 505 510 Gly Lys Asp Ile Arg Phe Thr Cys Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser 515 520 525 Ser Pro Met Thr Phe Ala Trp Lys Lys Asp Asn Glu Val Leu Ala 530 535 540 Asn Ala Asp Met Glu Asn Phe Ala His Val Arg Ala Gln Asp Gly 545 550 555 Glu Val Met Glu Tyr Thr Thr Ile Leu His Leu Arg His Val Thr 560 565 570 Phe Gly His Glu Gly Arg Tyr Gln Cys Ile Ile Thr Asn His Phe 575 580 585 Gly Ser Thr Tyr Ser His Lys Ala Arg Leu Thr Val Asn Val Leu 590 595 600 Pro Ser Phe Thr Lys Ile Pro His Asp Ile Ala Ile Arg Thr Gly 605 610 615 Thr Thr Ala Arg Leu Glu Cys Ala Ala Thr Gly His Pro Asn Pro 620 625 630 Gln Ile Ala Trp Gln Lys Asp Gly Gly Thr Asp Phe Pro Ala Ala 635 640 645 Arg Glu Arg Arg Met His Val Met Pro Asp Asp Asp Val Phe Phe 650 655 660 Ile Thr Asp Val Lys Ile Asp Asp Met Gly Val Tyr Ser Cys Thr 665 670 675 Ala Gln Asn Ser Ala Gly Ser Val Ser Ala Asn Ala Thr Leu Thr 680 685 690 Val Leu Glu Thr Pro Ser Leu Ala Val Pro Leu Glu Asp Arg Val 695 700 705 Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ala Phe Gln Cys Lys Ala Thr Gly 710 715 720 Ser Pro Thr Pro Arg Ile Thr Trp Leu Lys Gly Gly Arg Pro Leu 725 730 735 Ser Leu Thr Glu Arg His His Phe Thr Pro Gly Asn Gln Leu Leu 740 745 750 Val Val Gln Asn Val Met Ile Asp Asp Ala Gly Arg Tyr Thr Cys 755 760 765 Glu Met Ser Asn Pro Leu Gly Thr Glu Arg Ala His Ser Gln Leu 770 775 780 Ser Ile Leu Pro Thr Pro Gly Cys Arg Lys Asp Gly Thr Thr Val 785 790 795 Gly Ile Phe Thr Ile Ala Val Val Cys Ser Ile Val Leu Thr Ser 800 805 810 Leu Val Trp Val Cys Ile Ile Tyr Gln Thr Arg Lys Lys Ser Glu 815 820 825 Glu Tyr Ser Val Thr Asn Thr Asp Glu Thr Ile Val Pro Pro Asp 830 835 840 Val Pro Ser Tyr Leu Ser Ser Gln Gly Thr Leu Ser Asp Arg Gln 845 850 855 Glu Thr Val Val Arg Thr Glu Gly Gly His Gln Ala Asn Gly His 860 865 870 Ile Glu Ser Asn Gly Val Cys Leu Arg Asp Pro Ser Leu Phe Pro 875 880 885 Glu Val Asp Ile His Ser Thr Thr Cys Arg Gln Pro Lys Leu Cys 890 895 900 Val Gly Tyr Thr Arg Glu Pro Trp Lys Val Thr Glu Lys Ala Asp 905 910 915 Arg Thr Ala Ala Pro His Thr Thr Ala His Ser Gly Ser Ala Val 920 925 930 Cys Ser Asp Cys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr His Pro Gln Pro Val 935 940 945 Pro Arg Asp Ser Gly Gln Pro Gly Thr Ala Ser Ser Gln Glu Leu 950 955 960 Arg Gln His Asp Arg Glu Tyr Ser Pro His His Pro Tyr Ser Gly 965 970 975 Thr Ala Asp Gly Ser His Thr Leu Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Pro 980 985 990 Ser Asn His Asp Arg Ile Leu Pro Ser Leu Lys Asn Lys Ala Ala 995 1000 1005 Ser Ala Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Trp Thr Leu Ala Lys Leu 1010 1015 1020 His Glu Ala Asp Cys Ile Asp Leu Lys Pro Ser Pro Thr Leu Ala 1025 1030 1035 Ser Gly Ser Pro Glu Leu Met Glu Asp Ala Ile Ser Thr Glu Ala 1040 1045 1050 Gln His Leu Leu Val Ser Asn Gly His Leu Pro Lys Ala Cys Asp 1055 1060 1065 Ser Ser Pro Glu Ser Val Pro Leu Lys Gly Gln Ile Thr Gly Lys 1070 1075 1080 Arg Arg Gly Pro Leu Leu Leu Ala Pro Arg Ser 1085 1090

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス胚性腫瘍細胞及びその分化細胞におけ
るＧＡ３−４３遺伝子の発現をノーザンブロッティング
により解析した結果を示す写真。

【図２】ＧＡ３−４３遺伝子産物の構造的特徴を示す
概念図。

【図３】マウス各種臓器におけるＧＡ３−４３遺伝子
の発現ノーザンブロッティングにより解析した結果を示
す写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/02 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 33/577 Ｂ 33/577 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者鈴木豊兵庫県三田市あかしあ台５丁目29番地Ａ− 102 (72)発明者佐藤直也大阪府大阪市淀川区加島３丁目13−31− 304

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）基準生物試料の二本鎖ｃＤＮＡプ
ールを調製し、得られたｃＤＮＡプール中に含まれる各
ＤＮＡ断片の含量を均一化して含量均一化基準ｃＤＮＡ
プールを調製する工程、（２）互いに比較対照する複数
の生物試料について、各試料由来の二本鎖ｃＤＮＡプー
ルを調製する工程、及び（３）工程（１）で得られた含
量均一化基準ｃＤＮＡプール中から、工程（２）で得た
ｃＤＮＡプール中のＤＮＡ断片と会合したＤＮＡ断片を
除去する操作を行なうことにより、比較対照する複数試
料の各々について残存ｃＤＮＡプールを得る工程を含
むことを特徴とする複数試料間で発現量に差のある遺伝
子を探索する方法。
【請求項２】工程（３）において、残存ｃＤＮＡプー
ルから更に、工程（２）で得たｃＤＮＡプール中のＤＮ
Ａ断片と会合したＤＮＡ断片を除去して、新たな残存ｃ
ＤＮＡプールを得る操作を、必要に応じて繰り返すもの
である請求項１記載の方法。
【請求項３】工程（３）で得られた残存ｃＤＮＡプー
ル中のｃＤＮＡ断片の含量を比較し、比較対照する試料
由来の残存ｃＤＮＡプール間で含量に差の生じたｃＤＮ
Ａ断片を回収する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】工程（２）のｃＤＮＡプール中のＤＮＡ
が制限酵素により断片化されたものである請求項１記載
の方法。
【請求項５】工程（１）又は工程（２）のｃＤＮＡプ
ール中のＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプラ
イマーを会合させるためのアダプター配列をその両端に
付加したものである請求項１記載の方法。
【請求項６】請求項１〜５記載の方法に用いるための
キット。
【請求項７】プライマー及びアダプターからなる請求
項６記載のキット。
【請求項８】請求項１〜５記載の方法により得られる
新規なｃＤＮＡ、遺伝子、並びにそれらによってコード
されるポリペプチド。
【請求項９】配列番号２で示されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド、そのフラグメントまたはそれらのホ
モローグ。
【請求項１０】請求項９記載のポリペプチド、そのフ
ラグメントまたはそれらのホモローグをコードするＤＮ
Ａ。
【請求項１１】配列番号１の第４５４番目の塩基から
第３７２９番目までの塩基で示される塩基配列を有する
ＤＮＡまたはそのフラグメント。
【請求項１２】請求項１０または１１のいずれかの項
に記載のＤＮＡを含む複製又は発現プラスミド。
【請求項１３】請求項１２記載の複製又は発現プラス
ミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】請求項９記載のポリペプチド、そのフ
ラグメントまたはそれらのホモローグに対するモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１５】配列番号１の第４５４番目の塩基から
第３７２９番目までの塩基で示される塩基配列を有する
ＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡ。