JPH10155487A - アミノ酸配列と、このアミノ酸配列を有する 蛋白が結合するｄｎａ配列 - Google Patents
アミノ酸配列と、このアミノ酸配列を有する 蛋白が結合するｄｎａ配列Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 神経系細胞の分化決定遺伝子ｇｃｍの発現蛋
白の機能を明らかにすることにより、ｇｃｍ遺伝子およ
びその発現蛋白のより多様な産業上の利用を可能とする
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。 【解決手段】 動物の中枢神経系細胞の分化決定遺伝子
ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在する配列番号１の
アミノ酸配列と、このアミノ酸配列またはその一部を有
する蛋白またはペプチド、およびこの蛋白またはペプチ
ドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列であって、配列
番号２の塩基配列からなるＤＮＡ配列。
白の機能を明らかにすることにより、ｇｃｍ遺伝子およ
びその発現蛋白のより多様な産業上の利用を可能とする
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。 【解決手段】 動物の中枢神経系細胞の分化決定遺伝子
ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在する配列番号１の
アミノ酸配列と、このアミノ酸配列またはその一部を有
する蛋白またはペプチド、およびこの蛋白またはペプチ
ドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列であって、配列
番号２の塩基配列からなるＤＮＡ配列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、様々な動物の中
枢神経系細胞の分化決定遺伝子ｇｃｍが発現する蛋白に
共通して存在するアミノ酸配列と、このアミノ酸配列を
有する蛋白またはペプチド、並びにこの蛋白またはペプ
チドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列に関するもの
である。さらに詳しくは、この発明は、ヒトをはじめと
する様々な動物種における中枢神経系の形成機構および
その機能を探索するための研究材料として有用であり、
あるいは中枢神経系の構造的、機能的障害を原因とする
各種疾患の診断、治療の技術開発に有用な新規のＤＮＡ
結合蛋白のアミノ酸配列と、この蛋白が結合するゲノム
ＤＮＡ上の特異的配列に関するものである。
枢神経系細胞の分化決定遺伝子ｇｃｍが発現する蛋白に
共通して存在するアミノ酸配列と、このアミノ酸配列を
有する蛋白またはペプチド、並びにこの蛋白またはペプ
チドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列に関するもの
である。さらに詳しくは、この発明は、ヒトをはじめと
する様々な動物種における中枢神経系の形成機構および
その機能を探索するための研究材料として有用であり、
あるいは中枢神経系の構造的、機能的障害を原因とする
各種疾患の診断、治療の技術開発に有用な新規のＤＮＡ
結合蛋白のアミノ酸配列と、この蛋白が結合するゲノム
ＤＮＡ上の特異的配列に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】脳・中枢神経系は莫大な数の細胞からな
る巨大な情報処理装置と見なすことができるが、これを
構成する細胞は、ニューロンとグリア細胞の２種類に大
きくわけることができる。ニューロンはネットワークを
形成することにより情報処理において中心的な役割を果
たし、グリア細胞はネットワークの形成や機能を支える
とともに、ネットワークの損傷に対する修復の際にも重
要な役割を担っていると考えられている。そして、この
ような異なった役割を果たす２種類の細胞が正確に形成
されることが、情報処理装置として正常に機能するため
の必須の条件である。従って、神経発生における多様性
形成と分化決定のメカニズムを知ることは、複雑な神経
系の形成機構を明らかにし、その機能を探るうえで極め
て重要である。
る巨大な情報処理装置と見なすことができるが、これを
構成する細胞は、ニューロンとグリア細胞の２種類に大
きくわけることができる。ニューロンはネットワークを
形成することにより情報処理において中心的な役割を果
たし、グリア細胞はネットワークの形成や機能を支える
とともに、ネットワークの損傷に対する修復の際にも重
要な役割を担っていると考えられている。そして、この
ような異なった役割を果たす２種類の細胞が正確に形成
されることが、情報処理装置として正常に機能するため
の必須の条件である。従って、神経発生における多様性
形成と分化決定のメカニズムを知ることは、複雑な神経
系の形成機構を明らかにし、その機能を探るうえで極め
て重要である。
【０００３】従来より、ニューロンとグリアは共通の前
駆細胞（幹細胞）から生み出されることが多くの種で報
告されている。しかしながら、個々の幹細胞がどのよう
なメカニズムによってニューロンまたはグリアに分化す
るのかについては、これまでほとんど解明されていな
い。いくつかの分子がニューロン−グリア間の分化決定
に影響を及ぼすことが知られているが、分化決定にとっ
て必要十分であるとは示されていなかった。
駆細胞（幹細胞）から生み出されることが多くの種で報
告されている。しかしながら、個々の幹細胞がどのよう
なメカニズムによってニューロンまたはグリアに分化す
るのかについては、これまでほとんど解明されていな
い。いくつかの分子がニューロン−グリア間の分化決定
に影響を及ぼすことが知られているが、分化決定にとっ
て必要十分であるとは示されていなかった。
【０００４】ところで、ショウジョウバエは遺伝学の実
験材料として長い歴史をもつモデル動物である。このシ
ョウジョウバエを用いる最も大きな利点は、突然変異体
のスクリーニングによって、興味ある生物学的過程に関
与する未知遺伝子を迅速に同定できることにある。近年
になって、各種の抗体やｌａｃＺ遺伝子を用いた細胞マ
ーカーの作製、単一細胞への色素注入技術の確立などに
よって、中枢神経系の個々の細胞を判別し、その発生過
程を詳しく知ることができるようになってきている。こ
の結果、ショウジョウバエの中枢神経系は、神経系を構
成する細胞の発生および分化決定メカニズムの研究にお
いて優れたモデルとなりつつある。
験材料として長い歴史をもつモデル動物である。このシ
ョウジョウバエを用いる最も大きな利点は、突然変異体
のスクリーニングによって、興味ある生物学的過程に関
与する未知遺伝子を迅速に同定できることにある。近年
になって、各種の抗体やｌａｃＺ遺伝子を用いた細胞マ
ーカーの作製、単一細胞への色素注入技術の確立などに
よって、中枢神経系の個々の細胞を判別し、その発生過
程を詳しく知ることができるようになってきている。こ
の結果、ショウジョウバエの中枢神経系は、神経系を構
成する細胞の発生および分化決定メカニズムの研究にお
いて優れたモデルとなりつつある。
【０００５】ショウジョウバエの中枢神経系は、各体節
の片側あたり３０個の神経芽細胞から形成されている。
神経芽細胞は、幹細胞様の不等分裂を繰り返すことによ
ってニューロンとグリアの両方を生み出し、神経系の完
成までに各体節の片側あたり３００個程度のニューロン
と３０個程度のグリア細胞が作られる。３０個の神経芽
細胞の各々は、決まったタイミングで決まった位置に形
成され、個々の識別が可能なため、それぞれ名前が付さ
れている。さらに特定の神経芽細胞が生み出す細胞を追
跡すると、特定のニューロンとグリアが生じていること
も観察されている。従って、ショウジョウバエでは神経
系の個々の細胞の分化が遺伝的にほぼ完全に決定されて
いると考えられている。
の片側あたり３０個の神経芽細胞から形成されている。
神経芽細胞は、幹細胞様の不等分裂を繰り返すことによ
ってニューロンとグリアの両方を生み出し、神経系の完
成までに各体節の片側あたり３００個程度のニューロン
と３０個程度のグリア細胞が作られる。３０個の神経芽
細胞の各々は、決まったタイミングで決まった位置に形
成され、個々の識別が可能なため、それぞれ名前が付さ
れている。さらに特定の神経芽細胞が生み出す細胞を追
跡すると、特定のニューロンとグリアが生じていること
も観察されている。従って、ショウジョウバエでは神経
系の個々の細胞の分化が遺伝的にほぼ完全に決定されて
いると考えられている。
【０００６】この発明の発明者等は、このような神経系
の分化に関与する遺伝子の同定を目的として、ショウジ
ョウバエ突然変異体のスクリーニングを行った結果、グ
リア形成に異常を有する系統を得、これを glial cells
missing(gcm) と名付け、この変異体の原因遺伝子とし
てｇｃｍ遺伝子を特定した（Cell 82: 1025-1036, 199
5）。そして、この遺伝子ｇｃｍの変異は、グリアにな
るべき細胞をニューロンに分化させること、あるいは神
経芽細胞でｇｃｍ遺伝子を強制的に発現させるとニュー
ロンとなるべき細胞がグリアに分化することを確認し、
このｇｃｍ遺伝子がニューロン−グリア間の分化決定を
コントロールする遺伝子であることを示している。
の分化に関与する遺伝子の同定を目的として、ショウジ
ョウバエ突然変異体のスクリーニングを行った結果、グ
リア形成に異常を有する系統を得、これを glial cells
missing(gcm) と名付け、この変異体の原因遺伝子とし
てｇｃｍ遺伝子を特定した（Cell 82: 1025-1036, 199
5）。そして、この遺伝子ｇｃｍの変異は、グリアにな
るべき細胞をニューロンに分化させること、あるいは神
経芽細胞でｇｃｍ遺伝子を強制的に発現させるとニュー
ロンとなるべき細胞がグリアに分化することを確認し、
このｇｃｍ遺伝子がニューロン−グリア間の分化決定を
コントロールする遺伝子であることを示している。
【０００７】なお、このｇｃｍ遺伝子については、この
発明の発明者等以外にも３つのグループが独立に解析を
行い、上記の結論を支持する結果を得ている（Cell 82:
1013-1023, 1995; Genetics 139: 1663-1678, 1995; D
evelopment 122: 131-139, 1996: Cell 83: 671-674, 1
995; Neuton 15: 1219-1222, 1995)。
発明の発明者等以外にも３つのグループが独立に解析を
行い、上記の結論を支持する結果を得ている（Cell 82:
1013-1023, 1995; Genetics 139: 1663-1678, 1995; D
evelopment 122: 131-139, 1996: Cell 83: 671-674, 1
995; Neuton 15: 1219-1222, 1995)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のとおり、ｇｃｍ
遺伝子が神経系細胞の分化決定に重要な役割を果してい
ることは明らかにされたが、そのｃＤＮＡの塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列はデータベース上のどの蛋白
ともほとんど相同性を示さず、ｇｃｍ遺伝子が発現する
蛋白（ＧＣＭ）の機能は全く不明であった。
遺伝子が神経系細胞の分化決定に重要な役割を果してい
ることは明らかにされたが、そのｃＤＮＡの塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列はデータベース上のどの蛋白
ともほとんど相同性を示さず、ｇｃｍ遺伝子が発現する
蛋白（ＧＣＭ）の機能は全く不明であった。
【０００９】一般に特定遺伝子の機能を正確に理解する
ためには、その発現産物の生理活性を明らかにすること
が不可欠であり、ｇｃｍ遺伝子についてもその発現蛋白
の中枢神経系における役割を特定することは、中枢神経
系の形成機構を解明するためにも、また中枢神経系疾患
の診断、治療法の開発のためにも極めて重要である。こ
の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであ
って、神経系細胞の分化決定遺伝子ｇｃｍの発現蛋白の
機能を明らかにすることにより、ｇｃｍ遺伝子およびそ
の発現蛋白のより多様な産業上の利用を可能とするアミ
ノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供することを目的として
いる。
ためには、その発現産物の生理活性を明らかにすること
が不可欠であり、ｇｃｍ遺伝子についてもその発現蛋白
の中枢神経系における役割を特定することは、中枢神経
系の形成機構を解明するためにも、また中枢神経系疾患
の診断、治療法の開発のためにも極めて重要である。こ
の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであ
って、神経系細胞の分化決定遺伝子ｇｃｍの発現蛋白の
機能を明らかにすることにより、ｇｃｍ遺伝子およびそ
の発現蛋白のより多様な産業上の利用を可能とするアミ
ノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供することを目的として
いる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、動物の中枢神経系細胞の分化決
定遺伝子ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在する配列
番号１のアミノ酸配列を提供する。また、この発明は、
配列番号１のアミノ酸配列またはその一部を有する蛋白
またはペプチドを提供する。
を解決するものとして、動物の中枢神経系細胞の分化決
定遺伝子ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在する配列
番号１のアミノ酸配列を提供する。また、この発明は、
配列番号１のアミノ酸配列またはその一部を有する蛋白
またはペプチドを提供する。
【００１１】さらにこの発明は、上記の蛋白またはペプ
チドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列であって、配
列番号２の塩基配列またはその相同配列からなるＤＮＡ
配列と、このＤＮＡ配列を保持したベクターをも提供す
る。なお、配列番号１のアミノ酸配列においてＸａａは
任意のアミノ酸残基を示し、また配列番号２の塩基配列
においてＲはＡまたはＧを示す。
チドが結合する動物ゲノムＤＮＡ上の配列であって、配
列番号２の塩基配列またはその相同配列からなるＤＮＡ
配列と、このＤＮＡ配列を保持したベクターをも提供す
る。なお、配列番号１のアミノ酸配列においてＸａａは
任意のアミノ酸残基を示し、また配列番号２の塩基配列
においてＲはＡまたはＧを示す。
【００１２】これらのアミノ酸配列や、このアミノ酸配
列またはその一部を有する蛋白またはペプチド、さらに
はこの蛋白またはペプチドが結合するＤＮＡ配列は、ヒ
トをはじめとする様々な動物種における中枢神経系の形
成機構およびその機能を探索するための研究材料として
有用である。また、これらは中枢神経系の構造的、機能
的障害を原因とする各種疾患（例えば、グリア系脳腫瘍
など）の診断、治療に利用することができる。将来的に
は、新生児から少数分離した幼若グリア細胞を試験管内
で増殖培養して保存し、成長後に脳機能障害を発症した
場合には、保存細胞のｇｃｍ遺伝子を上記の蛋白やペプ
チドを用いて制御し、幼若グリア細胞をニューロン化し
て脳に戻すことによって機能修復を行うような「自己脳
細胞移植法」も可能になるものと期待される。
列またはその一部を有する蛋白またはペプチド、さらに
はこの蛋白またはペプチドが結合するＤＮＡ配列は、ヒ
トをはじめとする様々な動物種における中枢神経系の形
成機構およびその機能を探索するための研究材料として
有用である。また、これらは中枢神経系の構造的、機能
的障害を原因とする各種疾患（例えば、グリア系脳腫瘍
など）の診断、治療に利用することができる。将来的に
は、新生児から少数分離した幼若グリア細胞を試験管内
で増殖培養して保存し、成長後に脳機能障害を発症した
場合には、保存細胞のｇｃｍ遺伝子を上記の蛋白やペプ
チドを用いて制御し、幼若グリア細胞をニューロン化し
て脳に戻すことによって機能修復を行うような「自己脳
細胞移植法」も可能になるものと期待される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、この発明者等が行った実験
的研究に基づき、この発明のアミノ酸配列とＤＮＡ配列
について詳しく説明する。 （１）ＧＣＭのＤＮＡ結合活性の検討 ショウジョウバエのｇｃｍ遺伝子は、５０４個のアミノ
酸残基からなる蛋白をコードしているが、データベース
でのアミノ酸配列の検索では、この蛋白は核移行シグナ
ルを含む以外は既知の如何なるモチーフをも有していな
いことが明らかになった。このため、この蛋白ＧＣＭが
全く新しい核蛋白であることを確認した。さらに、この
蛋白は数多くの遺伝子の発現変化をもたらすことから、
最も単純な仮説として、ＧＣＭは直接ゲノムＤＮＡに結
合して標的遺伝子の発現をコントロールする転写調節因
子であるという可能性を想定した。そして、この可能性
を検討するため、ＧＣＭのＤＮＡ結合活性を調べた。
的研究に基づき、この発明のアミノ酸配列とＤＮＡ配列
について詳しく説明する。 （１）ＧＣＭのＤＮＡ結合活性の検討 ショウジョウバエのｇｃｍ遺伝子は、５０４個のアミノ
酸残基からなる蛋白をコードしているが、データベース
でのアミノ酸配列の検索では、この蛋白は核移行シグナ
ルを含む以外は既知の如何なるモチーフをも有していな
いことが明らかになった。このため、この蛋白ＧＣＭが
全く新しい核蛋白であることを確認した。さらに、この
蛋白は数多くの遺伝子の発現変化をもたらすことから、
最も単純な仮説として、ＧＣＭは直接ゲノムＤＮＡに結
合して標的遺伝子の発現をコントロールする転写調節因
子であるという可能性を想定した。そして、この可能性
を検討するため、ＧＣＭのＤＮＡ結合活性を調べた。
【００１４】ＧＣＭを結合させる対象として、ショウジ
ョウバエのｒｅｐｏ遺伝子の上流領域を選んだ。ｒｅｐ
ｏ遺伝子はＧＣＭ依存的にグリア細胞で発現するため、
ＧＣＭが転写調節因子であると仮定した場合、その標的
遺伝子の候補として相応しいと考えられるからである。 ａ）方法 ＧＣＭの種々の領域とマルトース結合蛋白（ＭＢＰ）と
の融合蛋白を大腸菌で発現させて作製し、ｒｅｐｏ遺伝
子のゲノム上流領域から調製した種々のＤＮＡ断片と結
合するか否かをゲルシフト法で調べた。融合蛋白の作製 ：融合蛋白は、蛋白融合・精製装置 (Ne
w England Biolabs)を用いて作製した。ｇｃｍ遺伝子の
様々な断片をＰＣＲ増幅し、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターに
挿入し、このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬ
ｙｓＳに導入して蛋白を発現させ、抽出・精製して融合
蛋白を作製した。コントロールとして使用したＭＢＰ−
ｌａｃＺαも同様にして作製した。各融合蛋白の構成は
図１Ａに示したとおりである。１はコントロール、２−
５が融合蛋白、６は正常なＧＣＭの模式図である。な
お、各構成図に付した数字は、ＧＣＭのアミノ酸残基の
位置を示している。ｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＤＮＡ断片の調製 ：ショウジ
ョウバエのゲノムライブラリーからｒｅｐｏ遺伝子を含
むクローンを単離し、その塩基配列を確認したのち、ｒ
ｅｐｏ遺伝子上流の約７ｋｂ領域を複数の制限酵素で切
断して６０−４６０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。ゲルシフトアッセイ ：公知の方法 (Cell 64: 439-446,
1991; EMBO J. 10: 2965-2973, 1991)に従い、約２００
ｎｇの各融合蛋白を、32Ｐで標識した１００ｂｐＤＮＡ
断片（図３Ａ−Ａ）と２５℃で３０分間インキュベート
したのち、４℃でポリアクリルアミドゲル電気泳動し
た。 ｂ）結果 ゲルシフトアッセイの結果は図１Ｂの電気泳動図に示し
たとおりである。各レーン番号は、図１Ａに構成を示し
た蛋白に対応しており、融合蛋白２（Ｎ２４３）および
４（Ｎ１８１）がｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＤＮＡ断片
と結合した（図中矢印Ｂ）。このことから、ＧＣＭがＤ
ＮＡ結合蛋白であることが確認されるとともに、ＧＣＭ
のアミノ末端の１８１番目アミノ酸までの領域にＤＮＡ
結合活性が存在することが明らかになった。また、この
１８１番目までのアミノ酸配列は如何なる既知の蛋白と
も相同性を示さないことから、新規なＤＮＡ結合ドメイ
ンであることも判明した。 （２）ＧＣＭが結合するＤＮＡ配列の検討 ＧＣＭのＤＮＡ結合ドメインが、特異的な配列を認識し
て結合するか否かを調べた。 ａ）方法 ゲルシフトアッセイ ：公知の方法 (Science 250: 1104-
1110, 1990; Cell 64: 459-470, 1991; Science 257: 1
951-1955, 1992; Cell 68: 283-302, 1992) に従い、配
列番号３および４の核酸配列にそれぞれ１５ｂｐのラン
ダム配列を挿入したオリゴムクレオチドをプローブと
し、融合蛋白Ｎ２４３とを反応させて上記と同様のゲル
シフトアッセイを行った。融合蛋白と結合したオリゴヌ
クレオチドを単離し、配列番号３および４の配列をプラ
イマーとしてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物と融合
蛋白とを再度ゲルシフトアッセイした。このサイクルを
３回繰り返し、最終的に得られたＰＣＲ産物の配列を決
定した。拮抗的アッセイ ：配列番号５および６に各々の塩基配列
を示した拮抗オリゴヌクレオチドと融合蛋白Ｎ２４３と
を予め反応させたのち、標識した２００ｂｐＤＮＡ断片
（図３Ａ−Ｂ）をプローブとしてＮ２４３とを反応さ
せ、上記と同様のゲルシフトアッセイをおこなった。 ｂ）結果 オリゴヌクレオチドと融合蛋白とのゲルシフトアッセ
イ、および蛋白に結合したオリゴヌクレオチドのＰＣＲ
増幅の３回の繰り返しにより、４８個のオリゴヌクレオ
チドが得られた。これらのうち、３８個は配列番号２に
示した共通の塩基配列を有していた。１１個は１塩基の
みが異なり、残りも２塩基が異なるだけであった。各塩
基の一致率は図２Ａに示したとおりであり、８７−１０
０％と高い一致率であることから、ＧＣＭは配列番号２
の塩基配列を認識してＤＮＡに結合することが明らかに
なった。
ョウバエのｒｅｐｏ遺伝子の上流領域を選んだ。ｒｅｐ
ｏ遺伝子はＧＣＭ依存的にグリア細胞で発現するため、
ＧＣＭが転写調節因子であると仮定した場合、その標的
遺伝子の候補として相応しいと考えられるからである。 ａ）方法 ＧＣＭの種々の領域とマルトース結合蛋白（ＭＢＰ）と
の融合蛋白を大腸菌で発現させて作製し、ｒｅｐｏ遺伝
子のゲノム上流領域から調製した種々のＤＮＡ断片と結
合するか否かをゲルシフト法で調べた。融合蛋白の作製 ：融合蛋白は、蛋白融合・精製装置 (Ne
w England Biolabs)を用いて作製した。ｇｃｍ遺伝子の
様々な断片をＰＣＲ増幅し、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターに
挿入し、このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬ
ｙｓＳに導入して蛋白を発現させ、抽出・精製して融合
蛋白を作製した。コントロールとして使用したＭＢＰ−
ｌａｃＺαも同様にして作製した。各融合蛋白の構成は
図１Ａに示したとおりである。１はコントロール、２−
５が融合蛋白、６は正常なＧＣＭの模式図である。な
お、各構成図に付した数字は、ＧＣＭのアミノ酸残基の
位置を示している。ｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＤＮＡ断片の調製 ：ショウジ
ョウバエのゲノムライブラリーからｒｅｐｏ遺伝子を含
むクローンを単離し、その塩基配列を確認したのち、ｒ
ｅｐｏ遺伝子上流の約７ｋｂ領域を複数の制限酵素で切
断して６０−４６０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。ゲルシフトアッセイ ：公知の方法 (Cell 64: 439-446,
1991; EMBO J. 10: 2965-2973, 1991)に従い、約２００
ｎｇの各融合蛋白を、32Ｐで標識した１００ｂｐＤＮＡ
断片（図３Ａ−Ａ）と２５℃で３０分間インキュベート
したのち、４℃でポリアクリルアミドゲル電気泳動し
た。 ｂ）結果 ゲルシフトアッセイの結果は図１Ｂの電気泳動図に示し
たとおりである。各レーン番号は、図１Ａに構成を示し
た蛋白に対応しており、融合蛋白２（Ｎ２４３）および
４（Ｎ１８１）がｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＤＮＡ断片
と結合した（図中矢印Ｂ）。このことから、ＧＣＭがＤ
ＮＡ結合蛋白であることが確認されるとともに、ＧＣＭ
のアミノ末端の１８１番目アミノ酸までの領域にＤＮＡ
結合活性が存在することが明らかになった。また、この
１８１番目までのアミノ酸配列は如何なる既知の蛋白と
も相同性を示さないことから、新規なＤＮＡ結合ドメイ
ンであることも判明した。 （２）ＧＣＭが結合するＤＮＡ配列の検討 ＧＣＭのＤＮＡ結合ドメインが、特異的な配列を認識し
て結合するか否かを調べた。 ａ）方法 ゲルシフトアッセイ ：公知の方法 (Science 250: 1104-
1110, 1990; Cell 64: 459-470, 1991; Science 257: 1
951-1955, 1992; Cell 68: 283-302, 1992) に従い、配
列番号３および４の核酸配列にそれぞれ１５ｂｐのラン
ダム配列を挿入したオリゴムクレオチドをプローブと
し、融合蛋白Ｎ２４３とを反応させて上記と同様のゲル
シフトアッセイを行った。融合蛋白と結合したオリゴヌ
クレオチドを単離し、配列番号３および４の配列をプラ
イマーとしてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物と融合
蛋白とを再度ゲルシフトアッセイした。このサイクルを
３回繰り返し、最終的に得られたＰＣＲ産物の配列を決
定した。拮抗的アッセイ ：配列番号５および６に各々の塩基配列
を示した拮抗オリゴヌクレオチドと融合蛋白Ｎ２４３と
を予め反応させたのち、標識した２００ｂｐＤＮＡ断片
（図３Ａ−Ｂ）をプローブとしてＮ２４３とを反応さ
せ、上記と同様のゲルシフトアッセイをおこなった。 ｂ）結果 オリゴヌクレオチドと融合蛋白とのゲルシフトアッセ
イ、および蛋白に結合したオリゴヌクレオチドのＰＣＲ
増幅の３回の繰り返しにより、４８個のオリゴヌクレオ
チドが得られた。これらのうち、３８個は配列番号２に
示した共通の塩基配列を有していた。１１個は１塩基の
みが異なり、残りも２塩基が異なるだけであった。各塩
基の一致率は図２Ａに示したとおりであり、８７−１０
０％と高い一致率であることから、ＧＣＭは配列番号２
の塩基配列を認識してＤＮＡに結合することが明らかに
なった。
【００１５】また、拮抗的アッセイの結果（図２Ｂ）か
らも、配列番号２がＧＣＭ結合配列であることが確かめ
られた。すなわち、配列番号２の配列を含む配列番号５
の拮抗的オリゴヌクレオチドと予め反応させた場合には
（図２Ｂ−ａ）、その濃度（1, 10, 100, 1000倍) に依
存してプローブとの結合性が消失するのに対し、配列番
号２の配列を含まない配列番号６を用いた場合にはプロ
ーブに対する拮抗作用は観察されなかった。 （３）ｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＧＣＭ結合部位の検討 ｒｅｐｏ遺伝子がＧＣＭの標的遺伝子であるとの仮定の
うえで、ゲノム上のｒｅｐｏ遺伝子上流領域にＧＣＭ結
合部位を探索した。
らも、配列番号２がＧＣＭ結合配列であることが確かめ
られた。すなわち、配列番号２の配列を含む配列番号５
の拮抗的オリゴヌクレオチドと予め反応させた場合には
（図２Ｂ−ａ）、その濃度（1, 10, 100, 1000倍) に依
存してプローブとの結合性が消失するのに対し、配列番
号２の配列を含まない配列番号６を用いた場合にはプロ
ーブに対する拮抗作用は観察されなかった。 （３）ｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＧＣＭ結合部位の検討 ｒｅｐｏ遺伝子がＧＣＭの標的遺伝子であるとの仮定の
うえで、ゲノム上のｒｅｐｏ遺伝子上流領域にＧＣＭ結
合部位を探索した。
【００１６】先ず、ｒｅｐｏ遺伝子上流の７ｋｂ領域か
ら切り出した２１個の非重複ＤＮＡ断片（図３Ａ：下段
横棒）と融合蛋白Ｎ２４３とによるゲルシフトアッセイ
を行い、蛋白の結合するＤＮＡ断片を特定した。その結
果、Ｎ２４３は８個のＤＮＡ断片（図３Ａ：下段の太い
横棒）と結合した。一方、Ｃ２６１はいずれのＤＮＡ断
片とも結合しなかった。
ら切り出した２１個の非重複ＤＮＡ断片（図３Ａ：下段
横棒）と融合蛋白Ｎ２４３とによるゲルシフトアッセイ
を行い、蛋白の結合するＤＮＡ断片を特定した。その結
果、Ｎ２４３は８個のＤＮＡ断片（図３Ａ：下段の太い
横棒）と結合した。一方、Ｃ２６１はいずれのＤＮＡ断
片とも結合しなかった。
【００１７】次に、この７ｋｂ領域のＤＮＡ配列を調
べ、上流４ｋｂまでの領域に１１部位のＧＣＭ結合配列
（配列番号２）が存在することを見出しが、上流４−７
ｋｂにはこの結合配列は存在していなかった。これら１
１部位の配列は図３Ｂのとおりであり、８塩基中７個が
一致する配列をいずれか一方の鎖に有するものをＧＣＭ
結合部位としてカウントした。また、Ｎ２４３と結合し
た上記８個のＤＮＡ断片は、いずれも１以上のＧＣＭ結
合配列を含んでいた。
べ、上流４ｋｂまでの領域に１１部位のＧＣＭ結合配列
（配列番号２）が存在することを見出しが、上流４−７
ｋｂにはこの結合配列は存在していなかった。これら１
１部位の配列は図３Ｂのとおりであり、８塩基中７個が
一致する配列をいずれか一方の鎖に有するものをＧＣＭ
結合部位としてカウントした。また、Ｎ２４３と結合し
た上記８個のＤＮＡ断片は、いずれも１以上のＧＣＭ結
合配列を含んでいた。
【００１８】ｒｅｐｏ遺伝子の上流領域に、１１部位も
のＧＣＭ結合配列クラスターが存在することは、ＧＣＭ
が転写調節因子としてｒｅｐｏ遺伝子の発現を直接コン
トロールしていることを示唆している。 （４）異種動物におけるＧＣＭ共通配列の検討 ＧＣＭのＤＮＡ結合ドメインが進化の過程で保存されて
いるか否かを調べるため、哺乳動物の相同遺伝子を用
い、ショウジョウバエＧＣＭと比較した。
のＧＣＭ結合配列クラスターが存在することは、ＧＣＭ
が転写調節因子としてｒｅｐｏ遺伝子の発現を直接コン
トロールしていることを示唆している。 （４）異種動物におけるＧＣＭ共通配列の検討 ＧＣＭのＤＮＡ結合ドメインが進化の過程で保存されて
いるか否かを調べるため、哺乳動物の相同遺伝子を用
い、ショウジョウバエＧＣＭと比較した。
【００１９】ヒト遺伝子（ｈＧＣＭａ）はＥＳＴデータ
ベースから抽出したが、このデータベースの配列は不完
全であるため、５'-ＲＡＣＥ (rapid amplificatrion o
f cDNA ends)および３'-ＲＡＣＥ法により完全なコード
配列を作製した。また、ＧＣＭとｈＧＣＭａとの共通配
列を用いて、マウス遺伝子（ｍＧＣＭａおよびｍＧＣＭ
ｂ）を得た。ｍＧＣＭａはマウス胎盤ｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＡＮから逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により
作製し、ｍＧＣＭｂはマウス脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＡＮ
からＲＴ−ＰＣＲ法により作製した。
ベースから抽出したが、このデータベースの配列は不完
全であるため、５'-ＲＡＣＥ (rapid amplificatrion o
f cDNA ends)および３'-ＲＡＣＥ法により完全なコード
配列を作製した。また、ＧＣＭとｈＧＣＭａとの共通配
列を用いて、マウス遺伝子（ｍＧＣＭａおよびｍＧＣＭ
ｂ）を得た。ｍＧＣＭａはマウス胎盤ｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＡＮから逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により
作製し、ｍＧＣＭｂはマウス脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＡＮ
からＲＴ−ＰＣＲ法により作製した。
【００２０】これらのヒトおよびマウス遺伝子から推定
される蛋白のアミノ酸配列と、ＧＣＭ配列とを比較する
と、図４に示したとおり、アミノ末端の３分の１に高度
の保存された共通配列が存在することが見出された。こ
の共通配列（配列番号１）は進化の過程でも保存され続
けたモチーフであることは確実であり、これをｇｃｍモ
チーフと名付けた。しかも、このモチーフは、ＧＣＭの
ＤＮＡ結合ドメイン（１−１８１アミノ酸残基）にも対
応している。また、各配列を比較すると、このモチーフ
には、９−１０のアミノ酸残基が完全に一致した３領域
（図４：Ａ，Ｂ，Ｃ）や、７個の共通なシステイン、４
個の共通なヒスチジンの存在が認められた。なお、アミ
ノ末端におけるこのようなモチーフの存在とは対照的
に、カルボキシ末端には共通の配列は全く存在せず、他
の既知蛋白とも相同性は認められなかった。
される蛋白のアミノ酸配列と、ＧＣＭ配列とを比較する
と、図４に示したとおり、アミノ末端の３分の１に高度
の保存された共通配列が存在することが見出された。こ
の共通配列（配列番号１）は進化の過程でも保存され続
けたモチーフであることは確実であり、これをｇｃｍモ
チーフと名付けた。しかも、このモチーフは、ＧＣＭの
ＤＮＡ結合ドメイン（１−１８１アミノ酸残基）にも対
応している。また、各配列を比較すると、このモチーフ
には、９−１０のアミノ酸残基が完全に一致した３領域
（図４：Ａ，Ｂ，Ｃ）や、７個の共通なシステイン、４
個の共通なヒスチジンの存在が認められた。なお、アミ
ノ末端におけるこのようなモチーフの存在とは対照的
に、カルボキシ末端には共通の配列は全く存在せず、他
の既知蛋白とも相同性は認められなかった。
【００２１】さらに、ｈＧＣＭａの１７１番目アミノ酸
残基までのＤＮＡ断片を大腸菌で発現させ、この蛋白を
用いて上記と同様のゲルシフトアッセイおよび拮抗的ア
ッセイを行ったところ、ＧＣＭと同様の結果が得られ
た。これらの結果もまた、ｇｃｍモチーフが特異的ＤＮ
Ａ結合ドメインを含む配列であることを示している。さ
らにまた、マウス脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とす
るＲＴ−ＰＣＲ産物（ｍＧＣＭａ２）およびショウジョ
ウバエのゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物（ｄＧＣ
Ｍ２）にも、ｇｃｍモチーフの存在が確認されたことか
ら（図５）、ｇｃｍモチーフはあらゆる動物種に共通に
保存され、この配列を含む蛋白は新規なＤＮＡ結合蛋白
のファミリーを形成するものであることが示唆される。
残基までのＤＮＡ断片を大腸菌で発現させ、この蛋白を
用いて上記と同様のゲルシフトアッセイおよび拮抗的ア
ッセイを行ったところ、ＧＣＭと同様の結果が得られ
た。これらの結果もまた、ｇｃｍモチーフが特異的ＤＮ
Ａ結合ドメインを含む配列であることを示している。さ
らにまた、マウス脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とす
るＲＴ−ＰＣＲ産物（ｍＧＣＭａ２）およびショウジョ
ウバエのゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物（ｄＧＣ
Ｍ２）にも、ｇｃｍモチーフの存在が確認されたことか
ら（図５）、ｇｃｍモチーフはあらゆる動物種に共通に
保存され、この配列を含む蛋白は新規なＤＮＡ結合蛋白
のファミリーを形成するものであることが示唆される。
【００２２】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、様々な動物の中枢神経系細胞の分化決定遺伝子
ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在し、この蛋白のＤ
ＮＡ結合ドメインとして機能する特異的なアミノ酸配列
と、この蛋白が結合するＤＮＡ配列が提供される。これ
によって、ヒトの神経系形成の機構解明が進展するとと
もに、ｇｃｍ遺伝子やその発現蛋白、ペプチド等を用い
た脳機能疾患・脳腫瘍等の診断、治療法の開発に新たな
途が拓かれる。
よって、様々な動物の中枢神経系細胞の分化決定遺伝子
ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在し、この蛋白のＤ
ＮＡ結合ドメインとして機能する特異的なアミノ酸配列
と、この蛋白が結合するＤＮＡ配列が提供される。これ
によって、ヒトの神経系形成の機構解明が進展するとと
もに、ｇｃｍ遺伝子やその発現蛋白、ペプチド等を用い
た脳機能疾患・脳腫瘍等の診断、治療法の開発に新たな
途が拓かれる。
【００２３】
配列番号１ 配列の長さ：154 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 様々な種のＧＣＭ蛋白質に共通する配列の一部 配列 Trp Asp Ile Asn Asp Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Asp Xaa Phe Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Tyr 20 25 30 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa His Xaa Ser Xaa Trp Ala 35 40 45 Met Arg Asn Thr Asn Asn His Asn Xaa Xaa Ile Leu Lys Lys Ser 50 55 60 Cys Leu Gly Val Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Arg Pro Ala Ile Cys Asp Lys Ala Arg 80 85 90 Xaa Lys Gln Gln Xaa Lys Xaa Cys Pro Xaa Xaa Asn Cys Xaa Xaa 95 100 105 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Gly His Xaa Gly Xaa Pro Val 110 115 120 Thr Xaa Phe Trp Arg Xaa Asp Gly Xaa Xaa Ile Xaa Phe Gln Xaa 125 130 135 Lys Gly Xaa His Asp Xaa Pro Xaa Pro Glu Xaa Lys Xaa Xaa Xaa 140 145 150 Glu Xaa Arg Arg 154 配列番号２ 配列の長さ：８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 配列番号１のアミノ酸配列を含むＧＣＭ蛋白質が結合す
るＤＮＡ配列 配列 RCCCG CAT 8 配列番号３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA 20 配列番号４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTTT TCCCA GTCAC GACG 19 配列番号５ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA CCTAC CCGCA TTACG GGTTT TCCCA GTCAC 50 GACG 54 配列番号６ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA TATAC TAATT TGTTA GGTTT TCCCA GTCAC 50 GACG 54
るＤＮＡ配列 配列 RCCCG CAT 8 配列番号３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA 20 配列番号４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTTT TCCCA GTCAC GACG 19 配列番号５ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA CCTAC CCGCA TTACG GGTTT TCCCA GTCAC 50 GACG 54 配列番号６ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA TATAC TAATT TGTTA GGTTT TCCCA GTCAC 50 GACG 54
【図１】Ａはゲルシフトアッセイに用いたＧＣＭ融合蛋
白の構成図であり、Ｂはゲルシフトアッセイの結果を示
した電気泳動図である。
白の構成図であり、Ｂはゲルシフトアッセイの結果を示
した電気泳動図である。
【図２】ＡはＧＣＭ結合配列の一致率を示し、Ｂは拮抗
的アッセイの結果を示した電気泳動図である。
的アッセイの結果を示した電気泳動図である。
【図３】Ａはｒｅｐｏ遺伝子上流領域のＧＣＭ結合部位
を示し、Ｂはこれらの部位のＤＮＡ配列である。
を示し、Ｂはこれらの部位のＤＮＡ配列である。
【図４】ヒト、マウスおよびショウジョウバエのそれぞ
れのＧＣＭのアミノ酸配列である。
れのＧＣＭのアミノ酸配列である。
【図５】図４に加え、新たなマウスおよびショウジョウ
バエのＧＣＭの一部アミノ酸配列である。
バエのＧＣＭの一部アミノ酸配列である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ
Claims (4)
- 【請求項１】 動物の中枢神経系細胞の分化決定遺伝子
ｇｃｍが発現する蛋白に共通して存在する配列番号１の
アミノ酸配列。 - 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列またはその一
部を有する蛋白またはペプチド。 - 【請求項３】 請求項２の蛋白またはペプチドが結合す
る動物ゲノムＤＮＡ上の配列であって、配列番号２の塩
基配列またはその相同配列からなるＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 請求項３のＤＮＡ配列を保持したベクタ
ー。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8318285A JPH10155487A (ja) | 1996-11-28 | 1996-11-28 | アミノ酸配列と、このアミノ酸配列を有する 蛋白が結合するｄｎａ配列 |
| US08/980,068 US20020081718A1 (en) | 1996-11-28 | 1997-11-26 | Polypeptide, and a dna sequence to which a protein containing the polypetide binds |
| CA002217168A CA2217168A1 (en) | 1996-11-28 | 1997-11-28 | A polypeptide, and a dna sequence to which a protein containing the polypeptide binds |
| EP97309637A EP0855442A3 (en) | 1996-11-28 | 1997-11-28 | Central nervous system transcription regulator polypeptide and a DNA sequence to which a protein containing the polypeptide binds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8318285A JPH10155487A (ja) | 1996-11-28 | 1996-11-28 | アミノ酸配列と、このアミノ酸配列を有する 蛋白が結合するｄｎａ配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10155487A true JPH10155487A (ja) | 1998-06-16 |
Family
ID=18097507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8318285A Pending JPH10155487A (ja) | 1996-11-28 | 1996-11-28 | アミノ酸配列と、このアミノ酸配列を有する 蛋白が結合するｄｎａ配列 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020081718A1 (ja) |
| EP (1) | EP0855442A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10155487A (ja) |
| CA (1) | CA2217168A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7115410B1 (en) | 1999-02-10 | 2006-10-03 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
| GB2389182B (en) * | 1999-02-10 | 2004-02-04 | Elan Pharm Inc | Method of purifying b-secretase |
| CN1390232A (zh) | 1999-02-10 | 2003-01-08 | 艾兰制药公司 | 人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途 |
| US7514408B1 (en) | 1999-12-02 | 2009-04-07 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
-
1996
- 1996-11-28 JP JP8318285A patent/JPH10155487A/ja active Pending
-
1997
- 1997-11-26 US US08/980,068 patent/US20020081718A1/en not_active Abandoned
- 1997-11-28 EP EP97309637A patent/EP0855442A3/en not_active Withdrawn
- 1997-11-28 CA CA002217168A patent/CA2217168A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0855442A2 (en) | 1998-07-29 |
| CA2217168A1 (en) | 1998-05-28 |
| EP0855442A3 (en) | 1999-12-29 |
| US20020081718A1 (en) | 2002-06-27 |
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