JPH0570497A - アルフア−ヘリツクス３領域、アルフア−ヘリツクス２領域の変化、およびそれらの組み合わせ、並びに他の変異との組み合わせを有する成長ホルモン - Google Patents
アルフア−ヘリツクス３領域、アルフア−ヘリツクス２領域の変化、およびそれらの組み合わせ、並びに他の変異との組み合わせを有する成長ホルモンInfo
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- JPH0570497A JPH0570497A JP3339492A JP33949291A JPH0570497A JP H0570497 A JPH0570497 A JP H0570497A JP 3339492 A JP3339492 A JP 3339492A JP 33949291 A JP33949291 A JP 33949291A JP H0570497 A JPH0570497 A JP H0570497A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
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-
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、この成長ホルモンのα−ヘリック
ス３領域中のアミノ酸変化、α−ヘリックス２領域中の
変化、それらの組み合わせ、並びに成長ホルモンの未変
性アミノ酸配列に対する他の変化との組み合わせ、を有
する成長ホルモン類似物に関する。 【構成】 この得られる類似物は、徐放調剤における調
合に関して安定性を示す一方、生物学的活性を維持して
いる。更に、蛋白質および／またはポリペプチド類をコ
ード化するＤＮＡに対して部位特異的変異誘発を行うた
めの方法も提供する。
ス３領域中のアミノ酸変化、α−ヘリックス２領域中の
変化、それらの組み合わせ、並びに成長ホルモンの未変
性アミノ酸配列に対する他の変化との組み合わせ、を有
する成長ホルモン類似物に関する。 【構成】 この得られる類似物は、徐放調剤における調
合に関して安定性を示す一方、生物学的活性を維持して
いる。更に、蛋白質および／またはポリペプチド類をコ
ード化するＤＮＡに対して部位特異的変異誘発を行うた
めの方法も提供する。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、この成長ホルモンのアルファ
−ヘリックス３および／またはアルファ−ヘリックス２
中のアミノ酸が変化した成長ホルモン（somatotropin）
類似物、そして組換え生産したポリペプチド類または蛋
白質の該アルファ−ヘリックス３中、並びに他の領域中
に変化を生じさせる方法に関する。外因性の成長ホルモ
ンを投与すると、有意に、種々の動物、特にブタの如き
蓄動物ばかりでなく、魚類もまた成長性能が上昇する。
蓄動物中のこの成長増強は、特に、脂肪を減少させるに
伴って、筋肉の量的付着成長の付随を上昇させ、その結
果として、より大きく脂肪の少ない動物を生じさせる。
外因性成長ホルモンを摂取した動物の食餌効果もまた有
意に改良され、これは、体重の増加およびそれに伴う食
餌消費の減少から生じる。
−ヘリックス３および／またはアルファ−ヘリックス２
中のアミノ酸が変化した成長ホルモン（somatotropin）
類似物、そして組換え生産したポリペプチド類または蛋
白質の該アルファ−ヘリックス３中、並びに他の領域中
に変化を生じさせる方法に関する。外因性の成長ホルモ
ンを投与すると、有意に、種々の動物、特にブタの如き
蓄動物ばかりでなく、魚類もまた成長性能が上昇する。
蓄動物中のこの成長増強は、特に、脂肪を減少させるに
伴って、筋肉の量的付着成長の付随を上昇させ、その結
果として、より大きく脂肪の少ない動物を生じさせる。
外因性成長ホルモンを摂取した動物の食餌効果もまた有
意に改良され、これは、体重の増加およびそれに伴う食
餌消費の減少から生じる。
【０００２】成長ホルモンの外因的投与は、日々の注射
の如き種々の方法で達成される。しかしながら、特定の
場合、他の投与ルートが好適であり得る。例えば、限ら
れた期間に渡って成長ホルモンを徐放させる移植された
考案物も、特定の蓄動物を処理する場合有益であり得
る。より望ましい投与ルートは、限られた期間での徐放
を可能にする移植された考案物を通して行うものであ
る。上記考案物は、非常に高濃度（計算値５００ｍｇ／
ｍＬ）の成長ホルモンを多量に含有している。更に、高
い溶解性を示しそして生物学的に不活性な不溶凝集物を
生じさせる傾向の低い成長ホルモン分子が、上記放出用
途にとって必要とされている。
の如き種々の方法で達成される。しかしながら、特定の
場合、他の投与ルートが好適であり得る。例えば、限ら
れた期間に渡って成長ホルモンを徐放させる移植された
考案物も、特定の蓄動物を処理する場合有益であり得
る。より望ましい投与ルートは、限られた期間での徐放
を可能にする移植された考案物を通して行うものであ
る。上記考案物は、非常に高濃度（計算値５００ｍｇ／
ｍＬ）の成長ホルモンを多量に含有している。更に、高
い溶解性を示しそして生物学的に不活性な不溶凝集物を
生じさせる傾向の低い成長ホルモン分子が、上記放出用
途にとって必要とされている。
【０００３】成長ホルモン類は、組み立てられてα−ら
せん束を形成している４つのα−ヘリックスを有してい
る（Abdel-Meguid他、１９８７）。典型的には、この構
造物のコアに突き出しているアミノ酸側鎖は、非極性お
よび疎水性であり、そして非常にしっかりと一緒に詰め
込まれており、極性溶媒（例えば水または食塩水）がこ
の束の中心に浸透するのを排除している。ウシの成長ホ
ルモン（これは第一次配列においてブタの成長ホルモン
と関係している）の場合、１ｍｇ／ｍＬ過剰の蛋白質濃
度下にα−ヘリックス３の疎水性面（アミノ酸残基ｔｙ
ｒ110〜ｌｅｕ127）を暴露すると、「会合性中間体」の
生成が促進され、これは、凝集体生成における核形成で
あると仮定されている（Brems他、１９８６；Brems、１
９８８）。このような会合性中間体は、個々のいくつか
の成長ホルモン分子からのこのα−ヘリックスに関する
交互充填配列を表していてもよく、そしてその結果、水
系の環境によりこのヘリックスの疎水面が再隔離されて
いる多量体構造が生じる。この会合性中間体の生成は、
蛋白質フラグメント含有α−ヘリックス３を過剰に添加
することによって阻害され得る（Brems他、１９８
６）。更に、位置１１２のリジンをロイシンに置き換え
ることでこのヘリックスの疎水面を拡張すると、会合性
中間体を生じる傾向が大きく悪化する（Brems、１９８
８）。
せん束を形成している４つのα−ヘリックスを有してい
る（Abdel-Meguid他、１９８７）。典型的には、この構
造物のコアに突き出しているアミノ酸側鎖は、非極性お
よび疎水性であり、そして非常にしっかりと一緒に詰め
込まれており、極性溶媒（例えば水または食塩水）がこ
の束の中心に浸透するのを排除している。ウシの成長ホ
ルモン（これは第一次配列においてブタの成長ホルモン
と関係している）の場合、１ｍｇ／ｍＬ過剰の蛋白質濃
度下にα−ヘリックス３の疎水性面（アミノ酸残基ｔｙ
ｒ110〜ｌｅｕ127）を暴露すると、「会合性中間体」の
生成が促進され、これは、凝集体生成における核形成で
あると仮定されている（Brems他、１９８６；Brems、１
９８８）。このような会合性中間体は、個々のいくつか
の成長ホルモン分子からのこのα−ヘリックスに関する
交互充填配列を表していてもよく、そしてその結果、水
系の環境によりこのヘリックスの疎水面が再隔離されて
いる多量体構造が生じる。この会合性中間体の生成は、
蛋白質フラグメント含有α−ヘリックス３を過剰に添加
することによって阻害され得る（Brems他、１９８
６）。更に、位置１１２のリジンをロイシンに置き換え
ることでこのヘリックスの疎水面を拡張すると、会合性
中間体を生じる傾向が大きく悪化する（Brems、１９８
８）。
【０００４】本発明は、成長ホルモン類（somatotropin
s）のα−ヘリックス３領域を変化させることにより成
長ホルモン類の低溶解性の課題を解決することにある。
詳細には、インビトロで増強された溶液安定性を示すブ
タの成長ホルモンを、α−ヘリックス３の部位特異的変
異誘発により製造する。疎水性および親水性面の両方が
変異誘発の標的となる。最近、ウシの成長ホルモンのα
−ヘリックス３領域中に部位特異的変異誘発を生じさせ
ることにより、変異体成長ホルモンを発現する形質転換
マウスの成長が抑制されたが、このことは、このα−ヘ
リックス３領域が生物学的活性に重要な領域であること
を示唆している（Chen他、１９９０）。加うるに、α−
ヘリックス３変異は、ヘリックス１もしくはヘリックス
２領域中の変異、そして位置１８３と１９１のシステイ
ンをコード化するＤＮＡ中に関する二重変異（ここで、
システインをコード化するＤＮＡが、アラニンもしくは
グルタミン酸のどちらかをコード化するＤＮＡで置き換
えられている）と組み合わされている。位置１８３と１
９１における二重変異はＥＰ３５５４６０（これはここ
では参照にいれられる）中に記述されている。ここに開
示する変異の使用を通して、増強された溶解性（安定
性）を有し、それにより徐放に関する特性が増強された
成長ホルモンを提供する。ブタの成長ホルモンは、特に
徐放形態において有益であり、そしてそれはそのまま、
第一位の興味が持たれている成長ホルモンである。
s）のα−ヘリックス３領域を変化させることにより成
長ホルモン類の低溶解性の課題を解決することにある。
詳細には、インビトロで増強された溶液安定性を示すブ
タの成長ホルモンを、α−ヘリックス３の部位特異的変
異誘発により製造する。疎水性および親水性面の両方が
変異誘発の標的となる。最近、ウシの成長ホルモンのα
−ヘリックス３領域中に部位特異的変異誘発を生じさせ
ることにより、変異体成長ホルモンを発現する形質転換
マウスの成長が抑制されたが、このことは、このα−ヘ
リックス３領域が生物学的活性に重要な領域であること
を示唆している（Chen他、１９９０）。加うるに、α−
ヘリックス３変異は、ヘリックス１もしくはヘリックス
２領域中の変異、そして位置１８３と１９１のシステイ
ンをコード化するＤＮＡ中に関する二重変異（ここで、
システインをコード化するＤＮＡが、アラニンもしくは
グルタミン酸のどちらかをコード化するＤＮＡで置き換
えられている）と組み合わされている。位置１８３と１
９１における二重変異はＥＰ３５５４６０（これはここ
では参照にいれられる）中に記述されている。ここに開
示する変異の使用を通して、増強された溶解性（安定
性）を有し、それにより徐放に関する特性が増強された
成長ホルモンを提供する。ブタの成長ホルモンは、特に
徐放形態において有益であり、そしてそれはそのまま、
第一位の興味が持たれている成長ホルモンである。
【０００５】本変異の特に有益な例は、α−ヘリックス
３中の位置１２２にあるイソロイシンがロイシンで置き
換えられている変異Ｉ１２２Ｌである。システインがア
ラニンで置き換えられているところの、位置１８３と１
９１における他の変異との組み合わせで、蛋白質の単一
トリプトファン残基の転移温度の有意な上昇が得られ
る。この転移温度は、該蛋白質の熱安定性の尺度であ
る。最も好適な変異の１つにおいて、位置１８３と１９
１にあるシステインをコード化するＤＮＡを変化させて
グルタミン酸をコード化するようにさせることから成る
変異を、該Ｉ１２２Ｌ変異と組み合わせたとき、増強さ
れた溶液安定性が得られる。
３中の位置１２２にあるイソロイシンがロイシンで置き
換えられている変異Ｉ１２２Ｌである。システインがア
ラニンで置き換えられているところの、位置１８３と１
９１における他の変異との組み合わせで、蛋白質の単一
トリプトファン残基の転移温度の有意な上昇が得られ
る。この転移温度は、該蛋白質の熱安定性の尺度であ
る。最も好適な変異の１つにおいて、位置１８３と１９
１にあるシステインをコード化するＤＮＡを変化させて
グルタミン酸をコード化するようにさせることから成る
変異を、該Ｉ１２２Ｌ変異と組み合わせたとき、増強さ
れた溶液安定性が得られる。
【０００６】
【発明の要約】本発明は、この成長ホルモン分子のα−
ヘリックス３および／または−ヘリックス２領域中のア
ミノ酸配列を変化させた成長ホルモン（類）に関する。
この得られる成長ホルモンは、未変性形態の該成長ホル
モンよりも安定（可溶）であり、そして上記成長ホルモ
ンの徐放調剤として調合したとき生物学的活性を維持し
ている。より詳細には、本発明の成長ホルモン類には、
ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類および鳥
類の成長ホルモンが含まれる。更に、この言葉成長ホル
モンには、この未変性の成長ホルモン分子の他の部分を
欠失、添加および変更させたものが含まれる。例えば、
修飾（システインが置換されているか或は消失した）も
しくは誘導成長ホルモン類（この成長ホルモンのシステ
インアミノ酸残基の１〜４個が個々に、アミノ酸類、即
ちアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン
酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニ
ン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニ
ン、セリン、トレオニンまたはプロリンから選択される
１〜４個のアミノ酸残基で置換されているか、或は４つ
のシステインの全てがシステイン酸に変換されてい
る）。
ヘリックス３および／または−ヘリックス２領域中のア
ミノ酸配列を変化させた成長ホルモン（類）に関する。
この得られる成長ホルモンは、未変性形態の該成長ホル
モンよりも安定（可溶）であり、そして上記成長ホルモ
ンの徐放調剤として調合したとき生物学的活性を維持し
ている。より詳細には、本発明の成長ホルモン類には、
ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類および鳥
類の成長ホルモンが含まれる。更に、この言葉成長ホル
モンには、この未変性の成長ホルモン分子の他の部分を
欠失、添加および変更させたものが含まれる。例えば、
修飾（システインが置換されているか或は消失した）も
しくは誘導成長ホルモン類（この成長ホルモンのシステ
インアミノ酸残基の１〜４個が個々に、アミノ酸類、即
ちアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン
酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニ
ン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニ
ン、セリン、トレオニンまたはプロリンから選択される
１〜４個のアミノ酸残基で置換されているか、或は４つ
のシステインの全てがシステイン酸に変換されてい
る）。
【０００７】従って、本発明の１つの目的は、未変性形
態の分子よりも可溶であり、従って、好適には徐放調剤
に調合されたとき、生物学的効果を示す新規な成長ホル
モン類を提供することにある。本発明の更に一層の目的
は、本発明の成長ホルモン類、並びに他の組換え生産さ
れたポリペプチド類および／または蛋白質、に関する製
造のための、部位特異的変異誘発技術を提供することに
ある。本発明のこれらのそして更に一層の目的は、以下
に示す本発明の詳細な記述によって明らかになるであろ
う。
態の分子よりも可溶であり、従って、好適には徐放調剤
に調合されたとき、生物学的効果を示す新規な成長ホル
モン類を提供することにある。本発明の更に一層の目的
は、本発明の成長ホルモン類、並びに他の組換え生産さ
れたポリペプチド類および／または蛋白質、に関する製
造のための、部位特異的変異誘発技術を提供することに
ある。本発明のこれらのそして更に一層の目的は、以下
に示す本発明の詳細な記述によって明らかになるであろ
う。
【０００８】相反するものに対して明記したものを除
き、本特許出願に関連して寄託したプラスミド類、ＤＮ
Ａ配列、および微生物は、Princeton、New Jerseyに維持
されているAmerican Cyanamid Companyの培養収集中に
保存されており、そしてブタペスト条約に従って、Amer
ican Type Culture Collection (ATCC）、Rockville、Ma
ryland ２０９５２、U.S.A.に寄託されている。
き、本特許出願に関連して寄託したプラスミド類、ＤＮ
Ａ配列、および微生物は、Princeton、New Jerseyに維持
されているAmerican Cyanamid Companyの培養収集中に
保存されており、そしてブタペスト条約に従って、Amer
ican Type Culture Collection (ATCC）、Rockville、Ma
ryland ２０９５２、U.S.A.に寄託されている。
【０００９】上に示したＤＮＡ株を、１９８８年８月２
３日付けでATCCに寄託した。これらは、
３日付けでATCCに寄託した。これらは、
【００１０】
【化１】
【００１１】である。本分野の技術者によって、本発明
の成長ホルモン類またはそれらの変異体を得るため、こ
れらのＤＮＡをいかなる適当な発現システムにも挿入さ
せ得ると理解される。
の成長ホルモン類またはそれらの変異体を得るため、こ
れらのＤＮＡをいかなる適当な発現システムにも挿入さ
せ得ると理解される。
【００１２】本発明の新規な動物性成長ホルモンのいく
つかのを発現する大腸菌Ｋ１２バクテリア株を、１９８
８年８月２３日付けでATCCに寄託した。これらのバクテ
リア株には、
つかのを発現する大腸菌Ｋ１２バクテリア株を、１９８
８年８月２３日付けでATCCに寄託した。これらのバクテ
リア株には、
【００１３】
【化２】
【００１４】が含まれる。
【００１５】以下に示す大腸菌Ｋ１２バクテリア株もま
た、１９９０年９月２１日付けでATCCに寄託した。これ
らには、
た、１９９０年９月２１日付けでATCCに寄託した。これ
らには、
【００１６】
【化３】
【００１７】が含まれる。
【００１８】
【発明の詳細な記述】本発明の動物性成長ホルモン類
は、部位特異的変異誘発により与えられるが、他の手
段、例えば該ペプチド類および／または蛋白質の化学的
合成も、上記成長ホルモン類の製造で用いられ得る。特
異的に限定された部位にあるＤＮＡのクローン化された
セグメントのＤＮＡ配列を変更するために現在用いられ
ている技術において、そのＤＮＡの一本鎖形態を製造す
ることが必要とされている。この一本鎖ＤＮＡを、その
ＤＮＡの一部に対して相補性を示す合成オリゴヌクレオ
チドにアニールする（該オリゴヌクレオチドがその中に
不適正領域を有している以外は）。この不適正領域は、
通常、該オリゴヌクレオチドの中心部分に存在してい
る。ある場合には、このオリゴヌクレオチドはまた、該
変異（類）部位に、或はその近くに制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を有する。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよ
びアデノシン５′トリホスフェートの存在下、大腸菌の
ＤＮＡポリメラーゼＩ、巨大フラグメントおよびデオキ
シヌクレオチドトリホスフェート類を添加することによ
り、該アニール混合物を、二重らせんにしそして共有結
合的に密封させる。その後、この二本鎖ＤＮＡを適当な
大腸菌株に形質転換し、ここで、このＤＮＡの不適正領
域が修復された後、複製される。
は、部位特異的変異誘発により与えられるが、他の手
段、例えば該ペプチド類および／または蛋白質の化学的
合成も、上記成長ホルモン類の製造で用いられ得る。特
異的に限定された部位にあるＤＮＡのクローン化された
セグメントのＤＮＡ配列を変更するために現在用いられ
ている技術において、そのＤＮＡの一本鎖形態を製造す
ることが必要とされている。この一本鎖ＤＮＡを、その
ＤＮＡの一部に対して相補性を示す合成オリゴヌクレオ
チドにアニールする（該オリゴヌクレオチドがその中に
不適正領域を有している以外は）。この不適正領域は、
通常、該オリゴヌクレオチドの中心部分に存在してい
る。ある場合には、このオリゴヌクレオチドはまた、該
変異（類）部位に、或はその近くに制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を有する。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよ
びアデノシン５′トリホスフェートの存在下、大腸菌の
ＤＮＡポリメラーゼＩ、巨大フラグメントおよびデオキ
シヌクレオチドトリホスフェート類を添加することによ
り、該アニール混合物を、二重らせんにしそして共有結
合的に密封させる。その後、この二本鎖ＤＮＡを適当な
大腸菌株に形質転換し、ここで、このＤＮＡの不適正領
域が修復された後、複製される。
【００１９】２つの集団から成るクローンが得られる。
修復合成のための鋳型としてどのストランドを選択する
かによって、クローンは、野生型もしくは変形された
（変異した）配列のどちらかを有する。変異した配列を
有するクローン、即ち該オリゴヌクレオチドの配列に相
当するものは、放射能活性で標識されたオリゴヌクレオ
チドに対して雑種形成することによって選択される。こ
の放射能標識されたオリゴヌクレオチドは、このオリゴ
ヌクレオチドと該野生型配列との間の不適正のため、そ
の変異した配列を有するクローンと、より安定に結合す
る。従って、適当な温度での培養により、野生型と変異
型クローンとが区別される。このオリゴヌクレオチドが
また、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有している場
合、同種の制限エンドヌクレアーゼを用いて候補クロー
ンを消化することで、その変異させた配列を有するクロ
ーンが確認され、そしてこれは、野生型と変異型クロー
ンとを区別するもう１つの手段を与える。次に、この同
定されたクローン中の変化を、その関係した領域のＤＮ
Ａ配列決定により確認する。
修復合成のための鋳型としてどのストランドを選択する
かによって、クローンは、野生型もしくは変形された
（変異した）配列のどちらかを有する。変異した配列を
有するクローン、即ち該オリゴヌクレオチドの配列に相
当するものは、放射能活性で標識されたオリゴヌクレオ
チドに対して雑種形成することによって選択される。こ
の放射能標識されたオリゴヌクレオチドは、このオリゴ
ヌクレオチドと該野生型配列との間の不適正のため、そ
の変異した配列を有するクローンと、より安定に結合す
る。従って、適当な温度での培養により、野生型と変異
型クローンとが区別される。このオリゴヌクレオチドが
また、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有している場
合、同種の制限エンドヌクレアーゼを用いて候補クロー
ンを消化することで、その変異させた配列を有するクロ
ーンが確認され、そしてこれは、野生型と変異型クロー
ンとを区別するもう１つの手段を与える。次に、この同
定されたクローン中の変化を、その関係した領域のＤＮ
Ａ配列決定により確認する。
【００２０】所望の変異（類）を有するプラスミドクロ
ーンの制限フラグメントを再構築することで、バクテリ
アか或は酵母の両方ではなく片方中で変異体の遺伝子生
産物を発現させるに適切な、発現プラスミド類を生じさ
せる。この再組み立ては、標準的副次クローン化操作に
より達成される。
ーンの制限フラグメントを再構築することで、バクテリ
アか或は酵母の両方ではなく片方中で変異体の遺伝子生
産物を発現させるに適切な、発現プラスミド類を生じさ
せる。この再組み立ては、標準的副次クローン化操作に
より達成される。
【００２１】以下の考察において、本発明の修飾された
組換え型成長ホルモン類、およびそれらの製造のために
用いる方法の代表的例として、組換え型のブタの成長ホ
ルモンを選択する。更に、以下に示す記述および実施例
は本発明を説明するためのものであり、それを制限する
ものではない。
組換え型成長ホルモン類、およびそれらの製造のために
用いる方法の代表的例として、組換え型のブタの成長ホ
ルモンを選択する。更に、以下に示す記述および実施例
は本発明を説明するためのものであり、それを制限する
ものではない。
【００２２】組換え型のブタの成長ホルモンに関するＤ
ＮＡおよびアミノ酸配列を以下に示す。最も好適な組換
え型ブタ成長ホルモンは、１９３個のアミノ酸から成る
ポリペプチド配列（ここで、ＮＨ2末端が３個の追加的
アミノ酸（ｍｅｔ、ａｓｐ、ｇｌｎ）を含むように修飾
されており、そしていくつかの成熟した形態の下垂体か
ら誘導されたブタの成長ホルモン中に見いだされる第一
アミノ酸（ａｌａ）が欠失している）である。しかしな
がら、１９１個のアミノ酸から成るＰＳＴ並びにそれら
の他の誘導体、例えばＮＨ2末端が欠失したもの、それ
に添加されたもの、そして／または、ＣＯＯＨ末端が欠
失および／またはそれに添加されたものは、本発明の一
部を成すものであると解釈される。
ＮＡおよびアミノ酸配列を以下に示す。最も好適な組換
え型ブタ成長ホルモンは、１９３個のアミノ酸から成る
ポリペプチド配列（ここで、ＮＨ2末端が３個の追加的
アミノ酸（ｍｅｔ、ａｓｐ、ｇｌｎ）を含むように修飾
されており、そしていくつかの成熟した形態の下垂体か
ら誘導されたブタの成長ホルモン中に見いだされる第一
アミノ酸（ａｌａ）が欠失している）である。しかしな
がら、１９１個のアミノ酸から成るＰＳＴ並びにそれら
の他の誘導体、例えばＮＨ2末端が欠失したもの、それ
に添加されたもの、そして／または、ＣＯＯＨ末端が欠
失および／またはそれに添加されたものは、本発明の一
部を成すものであると解釈される。
【００２３】組換え型ｐＳＴ： ＮＨ2−ｍｅｔ−ａｓ
ｐ−ｇｌｎ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｌａ−１８５個のアミ
ノ酸−ａｌａ−ｐｈｅ−ＣＯＯＨ 下垂体ｐＳＴ： ＮＨ2−ａｌａ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａ
ｌａ−１８５個のアミノ酸−ａｌａ−ｐｈｅ−ＣＯＯＨ この修飾の結果、該組換え型ｐＳＴ蛋白質中の２つの追
加的アミノ酸から成る正味の増加が生じ、これは、ＥＰ
３５５４６０中に記述されている。組換え型のブタの成
長ホルモンに関する変異誘発させた誘導体の記述で用い
た番号付けシステムは、この追加的増加を反映したもの
であり、そしてこれは、本分野のいかなる技術者によっ
ても容易に適用される。
ｐ−ｇｌｎ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｌａ−１８５個のアミ
ノ酸−ａｌａ−ｐｈｅ−ＣＯＯＨ 下垂体ｐＳＴ： ＮＨ2−ａｌａ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａ
ｌａ−１８５個のアミノ酸−ａｌａ−ｐｈｅ−ＣＯＯＨ この修飾の結果、該組換え型ｐＳＴ蛋白質中の２つの追
加的アミノ酸から成る正味の増加が生じ、これは、ＥＰ
３５５４６０中に記述されている。組換え型のブタの成
長ホルモンに関する変異誘発させた誘導体の記述で用い
た番号付けシステムは、この追加的増加を反映したもの
であり、そしてこれは、本分野のいかなる技術者によっ
ても容易に適用される。
【００２４】
【表１】
【００２５】ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ ＤＮＡの構築 一本鎖ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸＤＮＡは、全ての変異誘発
反応のための鋳型ＤＮＡであり、そしてこれは、部位特
異的変異誘発によりｐＧＨＧＥＭ３ＺＤＮＡから製造さ
れる。ファージミドｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）へのブタ成
長ホルモン（ｒｐＳＴ）遺伝子のクローン化は、結果と
してｐＧＨＧＥＭ３Ｚを生じるが、これは以下に示す一
般的操作によって達成される。制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩを用いて開裂させることにより、バク
テリアの発現プラスミドｐＥＦＦ−９０２から、該ｐＧ
ＨＧＥＭ３Ｚブタ成長ホルモン（ｒｐＳＴ）遺伝子含有
ＤＮＡフラグメントを単離する（図１）。その後、この
ｒｐＳＴ遺伝子含有フラグメントをアガロースゲル電気
泳動により精製する。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
を用いて二本鎖ファージミドＤＮＡのｐＧＥＭ−３ｚ
（ｆ＋）を消化させ、子牛の腸ＥｃｏＲＩアルカリ性ホ
スファターゼで処理した後、大きなフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で精製する。次に、これらの２つの
精製したフラグメントを一緒に混合した後、Ｔ４のＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させる。この混合物をバクテリ
アに形質転換した後、得られるいくつかのコロニーを増
殖させる。標準のアルカリ性溶解方法によりプラスミド
ＤＮＡを製造した後、適当な制限酵素を用いた消化によ
り構造を測定する。予想されたフラグメントを有するク
ローンを単離し、これをｐＧＨＧＥＭ３Ｚと表示する。
反応のための鋳型ＤＮＡであり、そしてこれは、部位特
異的変異誘発によりｐＧＨＧＥＭ３ＺＤＮＡから製造さ
れる。ファージミドｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）へのブタ成
長ホルモン（ｒｐＳＴ）遺伝子のクローン化は、結果と
してｐＧＨＧＥＭ３Ｚを生じるが、これは以下に示す一
般的操作によって達成される。制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩを用いて開裂させることにより、バク
テリアの発現プラスミドｐＥＦＦ−９０２から、該ｐＧ
ＨＧＥＭ３Ｚブタ成長ホルモン（ｒｐＳＴ）遺伝子含有
ＤＮＡフラグメントを単離する（図１）。その後、この
ｒｐＳＴ遺伝子含有フラグメントをアガロースゲル電気
泳動により精製する。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
を用いて二本鎖ファージミドＤＮＡのｐＧＥＭ−３ｚ
（ｆ＋）を消化させ、子牛の腸ＥｃｏＲＩアルカリ性ホ
スファターゼで処理した後、大きなフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で精製する。次に、これらの２つの
精製したフラグメントを一緒に混合した後、Ｔ４のＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させる。この混合物をバクテリ
アに形質転換した後、得られるいくつかのコロニーを増
殖させる。標準のアルカリ性溶解方法によりプラスミド
ＤＮＡを製造した後、適当な制限酵素を用いた消化によ
り構造を測定する。予想されたフラグメントを有するク
ローンを単離し、これをｐＧＨＧＥＭ３Ｚと表示する。
【００２６】ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ この変異誘発の目的は、α−ヘリックス２をコード化す
るＤＮＡ配列を、ＳａｃＩ制限部位により５′側（ＤＮ
Ａコード化領域の位置２２５〜２３０）に隣接させ、そ
してＸｂａＩ制限部位により３′側（位置２８５〜２９
０）に隣接させられているところの、ｒｐＳＴのＤＮＡ
配列を作り出すことである。このＤＮＡ配列に関するこ
れらの変更は、該ｒｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列を変化
させるものではない。これらの制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位が存在している結果、「ヘリックス２カセッ
ト」が作り出され、それにより、ヘリックス２コード化
ＤＮＡ中の変異と、ヘリックス３をコード化するＤＮＡ
中の適当な変異とが、便利にそして迅速に組み合わされ
得る。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸの組み立てを以下に記述す
る。
るＤＮＡ配列を、ＳａｃＩ制限部位により５′側（ＤＮ
Ａコード化領域の位置２２５〜２３０）に隣接させ、そ
してＸｂａＩ制限部位により３′側（位置２８５〜２９
０）に隣接させられているところの、ｒｐＳＴのＤＮＡ
配列を作り出すことである。このＤＮＡ配列に関するこ
れらの変更は、該ｒｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列を変化
させるものではない。これらの制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位が存在している結果、「ヘリックス２カセッ
ト」が作り出され、それにより、ヘリックス２コード化
ＤＮＡ中の変異と、ヘリックス３をコード化するＤＮＡ
中の適当な変異とが、便利にそして迅速に組み合わされ
得る。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸの組み立てを以下に記述す
る。
【００２７】合成オリゴヌクレオチドＳａｃＩ２９３お
よびＸｂａＩ３５３のＤＮＡ配列を表１に記述する。一
本鎖ｐＧＨＧＥＭ３ＺのＤＮＡは変異誘発のための基質
であり、そしてこれは、標準プロトコルにより精製され
たファージから製造される。このＤＮＡの２０００ｎｇ
を、ＳａｃＩ２９３およびＸｂａＩ３５３オリゴヌクレ
オチド類（これらの両方共、アデノシン５′トリホスフ
ェートおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
それらの５′末端がホスホリル化されている）の各々１
００ｎｇと混合する。１Ｘアニール化用緩衝液（１Ｘア
ニール化緩衝液は、７５ｍＭのＫＣｌと５ｍＭのトリス
−Ｃｌ、ｐＨ８．０である）中の全容積が１０μＬにな
るように該混合物を含有させる。この混合物を６５℃で
７分間加熱した後、室温（ＲＴ）で１０分間培養する。
この操作を行うことで、一本鎖基質（鋳型）ＤＮＡに該
オリゴヌクレオチドをアニールさせる。アニールさせた
分子を拡張した後、これを、２２μＬのＨ2Ｏ、１μＬ
の２０ｍＭ ＡＴＰ、各々２単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ巨大フラグメント（単
位の定義に関しては、New England Biolabsのカタロ
グ、１９８９を参照）、２μＬの２０Ｘ ｄＮＴＰ（各
々２ｍＭの濃度で４つのデオキシリボヌクレオチド５′
トリホスフェートから成る混合物）、並びに４μＬの１
０Ｘ「フィルイン」緩衝液（１Ｘフィルイン緩衝液は、
２７．５ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭの
ＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴである）を添加することに
より、共有結合的に密封された二本鎖ＤＮＡに変換す
る。標準プロトコルにより、室温（ＲＴ）で１時間培養
した後、この反応体の半分を受容能力のあるＨＢ１０１
細胞に導入する。３７℃で一晩培養した後、単一コロニ
ーが現れる。標準操作により、プラスミドＤＮＡを２４
個のコロニーから調製し、そして別々の反応で、Ｓａｃ
ＩおよびＸｂａＩを用いて消化させる。このＳａｃＩ２
９３およびＸｂａＩ３５３オリゴヌクレオチドの両方が
該ｒｐＳＴ遺伝子に組み込まていることが示されたとこ
ろの、両方の制限部位を有するプラスミドＤＮＡを、前
述した如き受容能力のあるＨＢ１０１細胞に導入するこ
とにより、更に一層の精製を行う。プラスミドＤＮＡを
調製した後、ＳａｃＩおよびＸｂａＩを用いた個々の反
応中で消化させることで、プラスミドＤＮＡ中の各々の
制限部位の存在を立証し、これを次に、該ｒｐＳＴのＤ
ＮＡの関係した領域をＤＮＡ配列決定分析することによ
り確認する。
よびＸｂａＩ３５３のＤＮＡ配列を表１に記述する。一
本鎖ｐＧＨＧＥＭ３ＺのＤＮＡは変異誘発のための基質
であり、そしてこれは、標準プロトコルにより精製され
たファージから製造される。このＤＮＡの２０００ｎｇ
を、ＳａｃＩ２９３およびＸｂａＩ３５３オリゴヌクレ
オチド類（これらの両方共、アデノシン５′トリホスフ
ェートおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
それらの５′末端がホスホリル化されている）の各々１
００ｎｇと混合する。１Ｘアニール化用緩衝液（１Ｘア
ニール化緩衝液は、７５ｍＭのＫＣｌと５ｍＭのトリス
−Ｃｌ、ｐＨ８．０である）中の全容積が１０μＬにな
るように該混合物を含有させる。この混合物を６５℃で
７分間加熱した後、室温（ＲＴ）で１０分間培養する。
この操作を行うことで、一本鎖基質（鋳型）ＤＮＡに該
オリゴヌクレオチドをアニールさせる。アニールさせた
分子を拡張した後、これを、２２μＬのＨ2Ｏ、１μＬ
の２０ｍＭ ＡＴＰ、各々２単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ巨大フラグメント（単
位の定義に関しては、New England Biolabsのカタロ
グ、１９８９を参照）、２μＬの２０Ｘ ｄＮＴＰ（各
々２ｍＭの濃度で４つのデオキシリボヌクレオチド５′
トリホスフェートから成る混合物）、並びに４μＬの１
０Ｘ「フィルイン」緩衝液（１Ｘフィルイン緩衝液は、
２７．５ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭの
ＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴである）を添加することに
より、共有結合的に密封された二本鎖ＤＮＡに変換す
る。標準プロトコルにより、室温（ＲＴ）で１時間培養
した後、この反応体の半分を受容能力のあるＨＢ１０１
細胞に導入する。３７℃で一晩培養した後、単一コロニ
ーが現れる。標準操作により、プラスミドＤＮＡを２４
個のコロニーから調製し、そして別々の反応で、Ｓａｃ
ＩおよびＸｂａＩを用いて消化させる。このＳａｃＩ２
９３およびＸｂａＩ３５３オリゴヌクレオチドの両方が
該ｒｐＳＴ遺伝子に組み込まていることが示されたとこ
ろの、両方の制限部位を有するプラスミドＤＮＡを、前
述した如き受容能力のあるＨＢ１０１細胞に導入するこ
とにより、更に一層の精製を行う。プラスミドＤＮＡを
調製した後、ＳａｃＩおよびＸｂａＩを用いた個々の反
応中で消化させることで、プラスミドＤＮＡ中の各々の
制限部位の存在を立証し、これを次に、該ｒｐＳＴのＤ
ＮＡの関係した領域をＤＮＡ配列決定分析することによ
り確認する。
【００２８】
【表２】
【００２９】ヘリックス１、２、または３中の変異に関
する合成 ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ中の該ｒｐＳＴ遺伝子の変異誘発
は以下に記述するようにして達成される。この変異誘発
プログラムの目的は、高蛋白質濃度（＞１００ｍｇ／ｍ
Ｌ）において減少した凝集傾向を有するｒｐＳＴ分子を
生じさせることである。この焦点は、凝集反応の開始に
おいて重要であると信じられているところの（Brems
他、１９８６）、アミノ酸残基１１２〜１２９のヘリッ
クス３の疎水性面である。ここで用いるｒｐＳＴ遺伝子
は、このアミノ末端の追加的２個のアミノ酸をコード化
するため、下垂体誘導ウシおよびブタ成長ホルモン中で
見いだされる１９１個から成る残基とは異なり、アミノ
酸残基の全体数は１９３である。残基１１２〜１２９
は、ウシ成長ホルモンの残基１１０〜１２７に相当して
いる（Abdel-Meguid他、 １９８７）。変異誘発の標的と
なるところの、この分子の他の領域は、残基８１〜８７
のヘリックス２、残基６〜１１であるところの、ヘリッ
クス３とヘリックス１との親水面である。追加的回数の
変異誘発、或は関係した領域を副次クローン化すること
により、組み合わされた変異体が生じる。Ｌ１１８Ｅ変
異および他の全ての標本を得るために用いる基本的プロ
トコルを以下に記述する。この基本的プロトコルに関す
る変法は、適当な実施例中に記述されている。
する合成 ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ中の該ｒｐＳＴ遺伝子の変異誘発
は以下に記述するようにして達成される。この変異誘発
プログラムの目的は、高蛋白質濃度（＞１００ｍｇ／ｍ
Ｌ）において減少した凝集傾向を有するｒｐＳＴ分子を
生じさせることである。この焦点は、凝集反応の開始に
おいて重要であると信じられているところの（Brems
他、１９８６）、アミノ酸残基１１２〜１２９のヘリッ
クス３の疎水性面である。ここで用いるｒｐＳＴ遺伝子
は、このアミノ末端の追加的２個のアミノ酸をコード化
するため、下垂体誘導ウシおよびブタ成長ホルモン中で
見いだされる１９１個から成る残基とは異なり、アミノ
酸残基の全体数は１９３である。残基１１２〜１２９
は、ウシ成長ホルモンの残基１１０〜１２７に相当して
いる（Abdel-Meguid他、 １９８７）。変異誘発の標的と
なるところの、この分子の他の領域は、残基８１〜８７
のヘリックス２、残基６〜１１であるところの、ヘリッ
クス３とヘリックス１との親水面である。追加的回数の
変異誘発、或は関係した領域を副次クローン化すること
により、組み合わされた変異体が生じる。Ｌ１１８Ｅ変
異および他の全ての標本を得るために用いる基本的プロ
トコルを以下に記述する。この基本的プロトコルに関す
る変法は、適当な実施例中に記述されている。
【００３０】一本鎖基質のｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ ＤＮ
Ａの製造は、ｐＧＨＧＥＭ３Ｚに関して記述したのと正
確に同じである。変異Ｌ１１８Ｅ、Ｅ１１６の構築で用
いる合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表
Ｉに表示し、そしてＳａｃＩ２９３に関して記述したよ
うに、その５′末端をホスホリル化する。アニール化お
よびフィルイン反応もまた、ｐＧＨＧＥＭ３ＺのＳａｃ
Ｉ２９３変異誘発に関して記述したのと全く同じであ
る。この反応混合物の半分を受容能力のあるＨＢ１０１
細胞に導入し、そして３７℃で一晩培養した後、得られ
るコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、そし
て標準方法による雑種形成のため処理する。このＥ１１
６オリゴヌクレオチドをまた、変異の検出のためにも用
いる。γ−32Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて、この５′末端を放射能標識する。５ＸＳＳ
Ｃ（１ＸＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．
０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１Ｘの
Denhardt's（各々０．０２％（ｗ／ｖ）のFicoll、ウシ
の血清アルブミン、ポリビニルピロリドン）、１５０μ
ｇ／ｍＬの酵母菌ｔＲＮＡおよび放射能標識したプロー
ブ中、雑種形成を３７℃で一晩行う。
Ａの製造は、ｐＧＨＧＥＭ３Ｚに関して記述したのと正
確に同じである。変異Ｌ１１８Ｅ、Ｅ１１６の構築で用
いる合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表
Ｉに表示し、そしてＳａｃＩ２９３に関して記述したよ
うに、その５′末端をホスホリル化する。アニール化お
よびフィルイン反応もまた、ｐＧＨＧＥＭ３ＺのＳａｃ
Ｉ２９３変異誘発に関して記述したのと全く同じであ
る。この反応混合物の半分を受容能力のあるＨＢ１０１
細胞に導入し、そして３７℃で一晩培養した後、得られ
るコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、そし
て標準方法による雑種形成のため処理する。このＥ１１
６オリゴヌクレオチドをまた、変異の検出のためにも用
いる。γ−32Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて、この５′末端を放射能標識する。５ＸＳＳ
Ｃ（１ＸＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．
０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１Ｘの
Denhardt's（各々０．０２％（ｗ／ｖ）のFicoll、ウシ
の血清アルブミン、ポリビニルピロリドン）、１５０μ
ｇ／ｍＬの酵母菌ｔＲＮＡおよび放射能標識したプロー
ブ中、雑種形成を３７℃で一晩行う。
【００３１】雑種形成後、このフィルターを、５ＸＳＳ
Ｃ中３７℃で少なくとも３０分間洗浄した後、ＴＡＣ
（ＴＡＣは、３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、５
０ｍＭの（トリス）［ヒドロメチル］アミノメタンｐＨ
８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢
酸）、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）中
２回、所望温度で３０分洗浄する。この後者の洗浄に関
する保温温度によって、特異性が測定され、該Ｅ１１６
オリゴヌクレオチドは、完全な相補性を示すクローンに
対してのみ雑種形成されたまま残存する。該Ｅ１１６オ
リゴヌクレオチドに関する温度は５９．０℃である。Ｘ
線フィルムに暴露した後、Ｅ１１６に対して完全な相補
性を示すクローンのみが観察される。陽性として数えら
れるこれらのコロニーのいくつかからプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＨＢ１０１に再び導入した後、上に記述した
ようにしてスクリーニングする。この２回目のスクリー
ニングで陽性を示すもののいくつかからプラスミドＤＮ
Ａを調製した後、ＤＮＡ配列決定分析により分析し、こ
のようにして、該Ｌ１１８Ｅ変異を有するものは明瞭に
同定される。この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭ
ｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅと表示する。
Ｃ中３７℃で少なくとも３０分間洗浄した後、ＴＡＣ
（ＴＡＣは、３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、５
０ｍＭの（トリス）［ヒドロメチル］アミノメタンｐＨ
８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢
酸）、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）中
２回、所望温度で３０分洗浄する。この後者の洗浄に関
する保温温度によって、特異性が測定され、該Ｅ１１６
オリゴヌクレオチドは、完全な相補性を示すクローンに
対してのみ雑種形成されたまま残存する。該Ｅ１１６オ
リゴヌクレオチドに関する温度は５９．０℃である。Ｘ
線フィルムに暴露した後、Ｅ１１６に対して完全な相補
性を示すクローンのみが観察される。陽性として数えら
れるこれらのコロニーのいくつかからプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＨＢ１０１に再び導入した後、上に記述した
ようにしてスクリーニングする。この２回目のスクリー
ニングで陽性を示すもののいくつかからプラスミドＤＮ
Ａを調製した後、ＤＮＡ配列決定分析により分析し、こ
のようにして、該Ｌ１１８Ｅ変異を有するものは明瞭に
同定される。この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭ
ｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅと表示する。
【００３２】該Ｌ１１８Ｅ変異を有するところの、得ら
れるｒｐＳＴ遺伝子クローンを、２つの発現ベクター、
ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸおよびｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ（これ
らの構築は記述されている）の各々に移入する。これら
の構築の目的は、前述した該ＳａｃＩおよびＸｂａＩ制
限部位を存在させることによって制限されたところの、
該ヘリックス２カセット含有ｒｐＳＴ遺伝子を、大腸菌
中でｒｐＳＴ遺伝子を発現させるように設計されたプラ
スミドベクターに導入することである。追加的目的は、
本発明中に記述する変異を２つの異なるｒｐＳＴ遺伝背
景の各々に導入することである。１つは、位置１８３と
１９１の２つのシステイン残基の各々の存在に関して、
天然（野生型）である。もう１つのｒｐＳＴ遺伝子は、
これらと同じ位置にあるシステインの代わりにアラニン
をコード化し、そしてこれは、ＥＰＯ ３５５４６０中
に記述されている。プラスミドｐＲＯｐＳＴＡ３４（図
４）は、発現プラスミドｐＲＯ２１１にクローン化され
たＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有してい
る。このＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、
変化したｒｐＳＴ遺伝子（この中で、位置１８３と１９
１のシステインをコード化するＤＮＡが、これらの位置
にあるアラニンをコード化するＤＮＡに変異されてい
る）を有している。従って、これはａｌａ、ａｌａ変異
を有している。１つの反応混合物中、ＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＲＯｐＳＴＡ３４
を消化させ、そしてもう１つの反応混合物中で、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩにより消化させる。ベクター含有大
型フラグメントを、アガロースゲル電気泳動により各々
の反応から精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸから精製し
たＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを連結させ
ることにより、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＸＳ（これ
は、他方、野生型ｒｐＳＴ背景中にヘリックス２カセッ
トを有する）を生じさせる。この連結反応混合物を、バ
クテリアの株Ｎ９９ｃＩに導入する。この株中、λＰＬ
プロモーターによりｒｐＳＴ発現が推進され、そして野
生型λ抑制因子が存在すると抑制される。所望の構成を
有するところの、得られるプラスミドクローンを、適当
な制限酵素で消化させることにより同定する。変異を受
けたｒｐＳＴ遺伝子中にヘリックス２カセットを有する
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸから精製されたＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメント
と、ｐＲＯｐＳＴＡ３４から精製されたＥｃｏＲＩ／Ｓ
ｍａＩベクターフラグメントとを連結させることにより
生じる。この連結反応混合物を、バクテリアの株Ｎ９９
ｃＩに導入し、そして得られるプラスミドクローンを、
関係する制限酵素で消化させることにより、所望のプラ
スミドクローンを同定する。
れるｒｐＳＴ遺伝子クローンを、２つの発現ベクター、
ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸおよびｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ（これ
らの構築は記述されている）の各々に移入する。これら
の構築の目的は、前述した該ＳａｃＩおよびＸｂａＩ制
限部位を存在させることによって制限されたところの、
該ヘリックス２カセット含有ｒｐＳＴ遺伝子を、大腸菌
中でｒｐＳＴ遺伝子を発現させるように設計されたプラ
スミドベクターに導入することである。追加的目的は、
本発明中に記述する変異を２つの異なるｒｐＳＴ遺伝背
景の各々に導入することである。１つは、位置１８３と
１９１の２つのシステイン残基の各々の存在に関して、
天然（野生型）である。もう１つのｒｐＳＴ遺伝子は、
これらと同じ位置にあるシステインの代わりにアラニン
をコード化し、そしてこれは、ＥＰＯ ３５５４６０中
に記述されている。プラスミドｐＲＯｐＳＴＡ３４（図
４）は、発現プラスミドｐＲＯ２１１にクローン化され
たＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有してい
る。このＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、
変化したｒｐＳＴ遺伝子（この中で、位置１８３と１９
１のシステインをコード化するＤＮＡが、これらの位置
にあるアラニンをコード化するＤＮＡに変異されてい
る）を有している。従って、これはａｌａ、ａｌａ変異
を有している。１つの反応混合物中、ＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＲＯｐＳＴＡ３４
を消化させ、そしてもう１つの反応混合物中で、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩにより消化させる。ベクター含有大
型フラグメントを、アガロースゲル電気泳動により各々
の反応から精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸから精製し
たＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを連結させ
ることにより、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＸＳ（これ
は、他方、野生型ｒｐＳＴ背景中にヘリックス２カセッ
トを有する）を生じさせる。この連結反応混合物を、バ
クテリアの株Ｎ９９ｃＩに導入する。この株中、λＰＬ
プロモーターによりｒｐＳＴ発現が推進され、そして野
生型λ抑制因子が存在すると抑制される。所望の構成を
有するところの、得られるプラスミドクローンを、適当
な制限酵素で消化させることにより同定する。変異を受
けたｒｐＳＴ遺伝子中にヘリックス２カセットを有する
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸから精製されたＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメント
と、ｐＲＯｐＳＴＡ３４から精製されたＥｃｏＲＩ／Ｓ
ｍａＩベクターフラグメントとを連結させることにより
生じる。この連結反応混合物を、バクテリアの株Ｎ９９
ｃＩに導入し、そして得られるプラスミドクローンを、
関係する制限酵素で消化させることにより、所望のプラ
スミドクローンを同定する。
【００３３】１組の反応中、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩを用いてｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＥのＤ
ＮＡを開裂させることにより、該Ｌ１１８Ｅ変異を発現
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸおよびｐＲＯｐＳＴ−Ｓ
ＸＡに導入し、そしてもう１組の反応では、ＥｃｏＲＩ
およびＳｍａＩを用いる。各々の反応混合物から得られ
るｒｐＳＴ含有小型フラグメントは、該Ｌ１１８Ｅ変異
を有しており、そしてこれらは、アガロースゲル電気泳
動で精製される。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用
いてプラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸを制限した後、アガ
ロースゲル電気泳動により、ベクターを含有している大
型フラグメントを精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１８Ｅから得られる精製ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを用いてこのフラグメントを連結させ、そ
の結果、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅが
得られる。この連結反応混合物を、発現株４３００（こ
れは温度に敏感なλ抑制因子を有する）に形質転換す
る。これらの株中でのｒｐＳＴ発現は温度に依存してい
る。４２℃でこのλ抑制因子を不活性にすることで、該
λＰLプロモーターからの発現を可能にする。このｐＲ
ＯｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅプラスミドを有するバクテ
リアのコロニーを、４２℃（該λ抑制因子のための非許
容温度）で該ｒｐＳＴ蛋白質を生産するところの、それ
らが有する能力により同定する。ＥｃｏＲＩおよびＳｍ
ａＩの両方を用いてプラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡを
制限した後、アガロースゲル電気泳動により大型ベクタ
ーフラグメントを精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１８Ｅから得られる精製ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグ
メントを用いてこのフラグメントを連結させ、その結
果、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ１１８Ｅが得
られる。この連結反応混合物を、発現株４３００に形質
転換した後、該ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ１１８Ｅプラ
スミドを有するバクテリアのコロニーを、４２℃で該ｒ
ｐＳＴ蛋白質を生産するところの、それらが有する能力
により同定する。
ＩＩＩを用いてｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＥのＤ
ＮＡを開裂させることにより、該Ｌ１１８Ｅ変異を発現
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸおよびｐＲＯｐＳＴ−Ｓ
ＸＡに導入し、そしてもう１組の反応では、ＥｃｏＲＩ
およびＳｍａＩを用いる。各々の反応混合物から得られ
るｒｐＳＴ含有小型フラグメントは、該Ｌ１１８Ｅ変異
を有しており、そしてこれらは、アガロースゲル電気泳
動で精製される。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用
いてプラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸを制限した後、アガ
ロースゲル電気泳動により、ベクターを含有している大
型フラグメントを精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１８Ｅから得られる精製ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを用いてこのフラグメントを連結させ、そ
の結果、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅが
得られる。この連結反応混合物を、発現株４３００（こ
れは温度に敏感なλ抑制因子を有する）に形質転換す
る。これらの株中でのｒｐＳＴ発現は温度に依存してい
る。４２℃でこのλ抑制因子を不活性にすることで、該
λＰLプロモーターからの発現を可能にする。このｐＲ
ＯｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅプラスミドを有するバクテ
リアのコロニーを、４２℃（該λ抑制因子のための非許
容温度）で該ｒｐＳＴ蛋白質を生産するところの、それ
らが有する能力により同定する。ＥｃｏＲＩおよびＳｍ
ａＩの両方を用いてプラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡを
制限した後、アガロースゲル電気泳動により大型ベクタ
ーフラグメントを精製する。ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１８Ｅから得られる精製ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグ
メントを用いてこのフラグメントを連結させ、その結
果、プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ１１８Ｅが得
られる。この連結反応混合物を、発現株４３００に形質
転換した後、該ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ１１８Ｅプラ
スミドを有するバクテリアのコロニーを、４２℃で該ｒ
ｐＳＴ蛋白質を生産するところの、それらが有する能力
により同定する。
【００３４】
【実施例】実施例１ ２つの合成オリゴヌクレオチドを同時に用いたヘリック
ス２「カセット」の製造 この変異誘発の目的は、α−ヘリックス２をコード化す
るＤＮＡ配列を、ＳａｃＩ制限部位により５′側（ＤＮ
Ａコード化領域の位置２２５〜２３０）に隣接させ、そ
してＸｂａＩ制限部位により３′側（位置２８５〜２９
０）に隣接させられているところの、ｒｐＳＴのＤＮＡ
配列を作り出すことである。このＤＮＡ配列に関するこ
れらの変更は、該ｒｐＳＴのアミノ酸配列を変化させる
ものではない。これらの制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位が存在している結果、「ヘリックス２カセット」が作
り出され、それにより、ヘリックス２コード化ＤＮＡ中
の変異と、ヘリックス３をコード化するＤＮＡ中の適当
な変異とが、便利にそして迅速に組み合わされる。ｐＧ
ＥＭｐＳＴ−ＳＸの組み立てを以下に記述する。
ス２「カセット」の製造 この変異誘発の目的は、α−ヘリックス２をコード化す
るＤＮＡ配列を、ＳａｃＩ制限部位により５′側（ＤＮ
Ａコード化領域の位置２２５〜２３０）に隣接させ、そ
してＸｂａＩ制限部位により３′側（位置２８５〜２９
０）に隣接させられているところの、ｒｐＳＴのＤＮＡ
配列を作り出すことである。このＤＮＡ配列に関するこ
れらの変更は、該ｒｐＳＴのアミノ酸配列を変化させる
ものではない。これらの制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位が存在している結果、「ヘリックス２カセット」が作
り出され、それにより、ヘリックス２コード化ＤＮＡ中
の変異と、ヘリックス３をコード化するＤＮＡ中の適当
な変異とが、便利にそして迅速に組み合わされる。ｐＧ
ＥＭｐＳＴ−ＳＸの組み立てを以下に記述する。
【００３５】実施例２ 変異誘発オリゴヌクレオチド類を用いたα−ヘリックス
を安定化させる親水性アミノ酸によるヘリックス３疎水
性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、変異Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、
Ｌ１１５ＫＬ１１８ＥおよびＬ１１８ＥＩ１２２Ｋが含
まれる。基本的プロトコルで、Ｌ１１８Ｅに関して記述
したのと全く同様に変異を生じさせる。これらの変異を
有するところの、得られるプラスミドを、それぞれｐＧ
ＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ
−Ｌ１１５Ｋ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１５ＫＬ１
１８ＥおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＥＩ１２
２Ｋと表示する。
を安定化させる親水性アミノ酸によるヘリックス３疎水
性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、変異Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、
Ｌ１１５ＫＬ１１８ＥおよびＬ１１８ＥＩ１２２Ｋが含
まれる。基本的プロトコルで、Ｌ１１８Ｅに関して記述
したのと全く同様に変異を生じさせる。これらの変異を
有するところの、得られるプラスミドを、それぞれｐＧ
ＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｅ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ
−Ｌ１１５Ｋ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１５ＫＬ１
１８ＥおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＥＩ１２
２Ｋと表示する。
【００３６】ｒｐＳＴ中でのＬ１１５Ｋ変異の発生は、
変異誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す
変異誘発オリゴヌクレオチドＫ１１３を用いる以外、Ｌ
１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化さ
せ、その結果、位置１１５のロイシンに関するコドン
が、ＣＴＧから、リジンをコード化するＡＡＧに変化す
る。
変異誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す
変異誘発オリゴヌクレオチドＫ１１３を用いる以外、Ｌ
１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化さ
せ、その結果、位置１１５のロイシンに関するコドン
が、ＣＴＧから、リジンをコード化するＡＡＧに変化す
る。
【００３７】ｒｐＳＴ中でのＬ１１５ＫＬ１１８Ｅ変異
の発生は、変異誘発反応において表Ｉに示す変異誘発オ
リゴヌクレオチドＫ１１３Ｅ１１６を用いそして雑種形
成反応において表Ｉに示すオリゴヌクレオチドＫ１１３
Ｅ１１６Ｄを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述した
のと全く同様にして達成される。このＫ１１３Ｅ１１６
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その
結果、位置１１５のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧ
から、リジンをコード化するＡＡＧに変化し、そして１
１８のロイシンコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸を
コード化するＧＡＧに変化する。従って、このオリゴヌ
クレオチドは該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に二重変異を生じ
させる。
の発生は、変異誘発反応において表Ｉに示す変異誘発オ
リゴヌクレオチドＫ１１３Ｅ１１６を用いそして雑種形
成反応において表Ｉに示すオリゴヌクレオチドＫ１１３
Ｅ１１６Ｄを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述した
のと全く同様にして達成される。このＫ１１３Ｅ１１６
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その
結果、位置１１５のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧ
から、リジンをコード化するＡＡＧに変化し、そして１
１８のロイシンコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸を
コード化するＧＡＧに変化する。従って、このオリゴヌ
クレオチドは該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に二重変異を生じ
させる。
【００３８】ｒｐＳＴ中でのＬ１１８ＥＩ１２２Ｋ変異
の発生は、雑種形成反応において表Ｉに示す変異誘発オ
リゴヌクレオチドＥ１１６Ｉ１２０を用いる以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。このＥ１１６Ｋ１２０オリゴヌクレオチドは該ｒｐ
ＳＴ配列を変化させ、その結果、位置１１８のロイシン
に関するコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸をコード
化するＧＡＧに変化し、そして１２０のイソロイシンコ
ドンが、ＡＴＣから、リジンをコード化するＡＡＧに変
化する。従って、このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ
のＤＮＡ配列に二重変異を生じさせる。
の発生は、雑種形成反応において表Ｉに示す変異誘発オ
リゴヌクレオチドＥ１１６Ｉ１２０を用いる以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。このＥ１１６Ｋ１２０オリゴヌクレオチドは該ｒｐ
ＳＴ配列を変化させ、その結果、位置１１８のロイシン
に関するコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸をコード
化するＧＡＧに変化し、そして１２０のイソロイシンコ
ドンが、ＡＴＣから、リジンをコード化するＡＡＧに変
化する。従って、このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ
のＤＮＡ配列に二重変異を生じさせる。
【００３９】実施例３ 変異誘発オリゴヌクレオチド類を用いた親水性アミノ酸
によるヘリックス３中の疎水性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、Ｉ１２２Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１
１８ＫおよびＬ１１５Ｅが含まれる。これらの変異を有
するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２
Ｅ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｔ、ｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｌ１１８ＫおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１５Ｅとそれぞれ表示する。これらの変異の構築は、
変異誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す
配列を有するオリゴヌクレオチド類を用いる以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして行う。
によるヘリックス３中の疎水性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、Ｉ１２２Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１
１８ＫおよびＬ１１５Ｅが含まれる。これらの変異を有
するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２
Ｅ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ｔ、ｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｌ１１８ＫおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ
１１５Ｅとそれぞれ表示する。これらの変異の構築は、
変異誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す
配列を有するオリゴヌクレオチド類を用いる以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして行う。
【００４０】変異Ｉ１２２Ｅの構築において変異誘発オ
リゴヌクレオチドＥ１２０を用いる（表Ｉ）。このオリ
ゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、
その結果、位置１２２のイソロイシンに関するコドン
が、ＡＴＣから、グルタミン酸をコード化するＧＡＧに
変換される。Ｅ１２０オリゴヌクレオチドもまた、雑種
形成反応における放射能標識した検出プローブとして使
用され、これは、ニトロセルロースフィルターをＴＡＣ
緩衝液中５６℃で培養する以外は、他の全ての点におい
てＬ１１８Ｅに関して上述したのと同じである。これら
の変異Ｌ１１８Ｔの構築は、変異誘発および雑種形成反
応の両方において用いるオリゴヌクレオチドがＬ１１８
Ｔである以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同
様にして行う（表Ｉ）。このオリゴヌクレオチドは該ｒ
ｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結果、位置１１８
のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧから、トレオニン
をコード化するＡＣＴに変換される。このニトロセルロ
ースフィルターをＴＡＣ緩衝液中５６℃で培養した後、
変異を有していないプラスミドから、所望の変異を有す
るプラスミドを区別する。
リゴヌクレオチドＥ１２０を用いる（表Ｉ）。このオリ
ゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、
その結果、位置１２２のイソロイシンに関するコドン
が、ＡＴＣから、グルタミン酸をコード化するＧＡＧに
変換される。Ｅ１２０オリゴヌクレオチドもまた、雑種
形成反応における放射能標識した検出プローブとして使
用され、これは、ニトロセルロースフィルターをＴＡＣ
緩衝液中５６℃で培養する以外は、他の全ての点におい
てＬ１１８Ｅに関して上述したのと同じである。これら
の変異Ｌ１１８Ｔの構築は、変異誘発および雑種形成反
応の両方において用いるオリゴヌクレオチドがＬ１１８
Ｔである以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同
様にして行う（表Ｉ）。このオリゴヌクレオチドは該ｒ
ｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結果、位置１１８
のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧから、トレオニン
をコード化するＡＣＴに変換される。このニトロセルロ
ースフィルターをＴＡＣ緩衝液中５６℃で培養した後、
変異を有していないプラスミドから、所望の変異を有す
るプラスミドを区別する。
【００４１】ｒｐＳＴ中でのＬ１１５Ｅ変異の発生は、
変異誘発反応において表Ｉに示す変異誘発オリゴヌクレ
オチドＥ１１３ＥＨＤＱ１１６を用いそして雑種形成反
応において表Ｉに示すオリゴヌクレオチドＥ１１３Ｄを
用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様
にして達成される。このＥ１１３ＥＨＤＱ１１６オリゴ
ヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結果、
位置１１５のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧから、
グルタミン酸をコード化するＧＡＧに変化し、そして１
１８のロイシンコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸を
コード化するＧＡＧ、グルタミン酸をコード化するＧＡ
Ｇ、アスパラギン酸をコード化するＧＡＣ、ヒスチジン
をコード化するＣＡＣ、或はグルタミンをコード化する
ＣＡＧに変化する。位置１１８で生じる種々の変異誘発
的変化は、この変異誘発オリゴヌクレオチドが該オリゴ
ヌクレオチド合成中に発生する４つのオリゴヌクレオチ
ド類から成る混合物であることによるものである。Ｅ１
１３Ｄの放射能標識された雑種形成プローブに対して雑
種形成するところの、得られるプラスミドクローンに関
するＤＮＡ配列決定の結果、それらはＬ１１５Ｅ変異を
含有しているが、位置１１８の４つの可能な変異のいず
れをも有していないことが確認されている。従って、こ
の変異誘発は、位置１１５にのみ単一変異を生じさせ
る。
変異誘発反応において表Ｉに示す変異誘発オリゴヌクレ
オチドＥ１１３ＥＨＤＱ１１６を用いそして雑種形成反
応において表Ｉに示すオリゴヌクレオチドＥ１１３Ｄを
用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様
にして達成される。このＥ１１３ＥＨＤＱ１１６オリゴ
ヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結果、
位置１１５のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧから、
グルタミン酸をコード化するＧＡＧに変化し、そして１
１８のロイシンコドンが、ＣＴＧから、グルタミン酸を
コード化するＧＡＧ、グルタミン酸をコード化するＧＡ
Ｇ、アスパラギン酸をコード化するＧＡＣ、ヒスチジン
をコード化するＣＡＣ、或はグルタミンをコード化する
ＣＡＧに変化する。位置１１８で生じる種々の変異誘発
的変化は、この変異誘発オリゴヌクレオチドが該オリゴ
ヌクレオチド合成中に発生する４つのオリゴヌクレオチ
ド類から成る混合物であることによるものである。Ｅ１
１３Ｄの放射能標識された雑種形成プローブに対して雑
種形成するところの、得られるプラスミドクローンに関
するＤＮＡ配列決定の結果、それらはＬ１１５Ｅ変異を
含有しているが、位置１１８の４つの可能な変異のいず
れをも有していないことが確認されている。従って、こ
の変異誘発は、位置１１５にのみ単一変異を生じさせ
る。
【００４２】ｒｐＳＴ中でのＬ１１８Ｋ変異の発生は、
表Ｉに示す配列を有する変異誘発オリゴヌクレオチドＬ
１１８ＴＫを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述した
のと全く同様にして達成される。このＬ１１８ＴＫオリ
ゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結
果、位置１１８のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧか
ら、リジンをコード化するＡＡＧ、或はＣＴＧから、ト
レオニンをコード化するＣＡＧに変化する。位置１１８
で生じる変異誘発的変化に関する種々の可能性は、この
変異誘発オリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチド合
成中に発生する２つのオリゴヌクレオチド類から成る混
合物であることによるものである。Ｌ１１８ＴＫ放射能
標識された雑種形成プローブに対して雑種形成するとこ
ろの、得られるプラスミドクローンに関するＤＮＡ配列
決定の結果、それらはＬ１１５Ｋ変異を含有している
が、これらのいずれも、位置１１８におけるもう１つの
可能な変異、即ちＬ１１８Ｔを有していないことが確認
されている。従って、この変異誘発は、位置１１８の単
一変異を生じさせる。
表Ｉに示す配列を有する変異誘発オリゴヌクレオチドＬ
１１８ＴＫを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述した
のと全く同様にして達成される。このＬ１１８ＴＫオリ
ゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結
果、位置１１８のロイシンに関するコドンが、ＣＴＧか
ら、リジンをコード化するＡＡＧ、或はＣＴＧから、ト
レオニンをコード化するＣＡＧに変化する。位置１１８
で生じる変異誘発的変化に関する種々の可能性は、この
変異誘発オリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチド合
成中に発生する２つのオリゴヌクレオチド類から成る混
合物であることによるものである。Ｌ１１８ＴＫ放射能
標識された雑種形成プローブに対して雑種形成するとこ
ろの、得られるプラスミドクローンに関するＤＮＡ配列
決定の結果、それらはＬ１１５Ｋ変異を含有している
が、これらのいずれも、位置１１８におけるもう１つの
可能な変異、即ちＬ１１８Ｔを有していないことが確認
されている。従って、この変異誘発は、位置１１８の単
一変異を生じさせる。
【００４３】実施例４ 変異誘発オリゴヌクレオチド類を用いた疎水性アミノ酸
によるヘリックス３中の親水性アミノ酸の置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＥ１１９ＬＱ１２
３Ｌである。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたと
ころの、この変異を有するプラスミドは、ｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌである。この二重変異
ｒｐＳＴ遺伝子の組み立ては、変異誘発オリゴヌクレオ
チドＬ１１７、１２１を用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関し
て記述したのと同様にして達成される（表Ｉ）。このオ
リゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列を変化さ
せ、その結果、グルタミン酸をコード化するＤＮＡが、
ＧＡＧから、ロイシンをコード化するＣＴＧに変化し、
そして位置１２３のグルタミンをコード化するＤＮＡ
が、ＣＡＧから、ロイシンをコード化するＣＴＧに変化
する。この変異誘発反応では該オリゴヌクレオチドを用
いるが、一方、表Ｉに示されている配列を有するＬｅｕ
１１７１２１Ｄは、雑種形成反応における放射能標識さ
れたプローブとして使用される。この変異の組み立てで
用いる操作の全ては、変異を有するプラスミドを検出す
るためＴＡＣ中５８℃で該ニトロセルロースフィルター
を培養する以外、Ｌ１１８Ｅに関して前述したのと同じ
である。
によるヘリックス３中の親水性アミノ酸の置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＥ１１９ＬＱ１２
３Ｌである。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたと
ころの、この変異を有するプラスミドは、ｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌである。この二重変異
ｒｐＳＴ遺伝子の組み立ては、変異誘発オリゴヌクレオ
チドＬ１１７、１２１を用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関し
て記述したのと同様にして達成される（表Ｉ）。このオ
リゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列を変化さ
せ、その結果、グルタミン酸をコード化するＤＮＡが、
ＧＡＧから、ロイシンをコード化するＣＴＧに変化し、
そして位置１２３のグルタミンをコード化するＤＮＡ
が、ＣＡＧから、ロイシンをコード化するＣＴＧに変化
する。この変異誘発反応では該オリゴヌクレオチドを用
いるが、一方、表Ｉに示されている配列を有するＬｅｕ
１１７１２１Ｄは、雑種形成反応における放射能標識さ
れたプローブとして使用される。この変異の組み立てで
用いる操作の全ては、変異を有するプラスミドを検出す
るためＴＡＣ中５８℃で該ニトロセルロースフィルター
を培養する以外、Ｌ１１８Ｅに関して前述したのと同じ
である。
【００４４】実施例５ 小さい側鎖を有する非極性アミノ酸によるヘリックス３
中の大きい側鎖を有する非極性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、Ｌ１１５Ａ、Ｌ１１８Ａおよび
Ｍ１２６Ａが含まれる。これらの変異を有するプラスミ
ド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１５Ａ、
ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＡおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｍ１２６Ａと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要
ならばＴＡＣ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述し
たのと全く同様にして行う。
中の大きい側鎖を有する非極性アミノ酸の置換 この変異種の１員には、Ｌ１１５Ａ、Ｌ１１８Ａおよび
Ｍ１２６Ａが含まれる。これらの変異を有するプラスミ
ド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１５Ａ、
ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８ＡおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｍ１２６Ａと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要
ならばＴＡＣ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述し
たのと全く同様にして行う。
【００４５】変異Ｌ１１５Ａ、Ｌ１１５Ａの構築で用い
る合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表Ｉ
に示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の
配列を変化させ、その結果、位置１１５のロイシンに関
するコドンが、ＣＴＧから、アラニンをコード化するＧ
ＣＧに変化する。このＬ１１５Ａオリゴヌクレオチドを
また、雑種形成反応における放射能標識された検出用プ
ローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃でニトロ
セルロースフィルターを培養した後、変異を有していな
いプラスミドから、所望の変異を有するプラスミドを区
別する。
る合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表Ｉ
に示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の
配列を変化させ、その結果、位置１１５のロイシンに関
するコドンが、ＣＴＧから、アラニンをコード化するＧ
ＣＧに変化する。このＬ１１５Ａオリゴヌクレオチドを
また、雑種形成反応における放射能標識された検出用プ
ローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃でニトロ
セルロースフィルターを培養した後、変異を有していな
いプラスミドから、所望の変異を有するプラスミドを区
別する。
【００４６】ｒｐＳＴ中でのＬ１１８Ａ変異の発生は、
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが、表Ｉに示す配列
を有するＬ１１８Ａである以外、Ｌ１１８Ｅに関して記
述したのと全く同様にして達成される。このＬ１１８Ａ
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴの配列を変化させ、そ
の結果、位置１１８のロイシンに関するコドンが、ＣＴ
Ｇから、アラニンをコード化するＧＣＧに変化する。Ｔ
ＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースを培養するこ
とにより、変異を有するプラスミドを検出する。ＤＮＡ
配列決定分析により立証されたこの変異を有するプラス
ミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ａと表示す
る。
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが、表Ｉに示す配列
を有するＬ１１８Ａである以外、Ｌ１１８Ｅに関して記
述したのと全く同様にして達成される。このＬ１１８Ａ
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴの配列を変化させ、そ
の結果、位置１１８のロイシンに関するコドンが、ＣＴ
Ｇから、アラニンをコード化するＧＣＧに変化する。Ｔ
ＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースを培養するこ
とにより、変異を有するプラスミドを検出する。ＤＮＡ
配列決定分析により立証されたこの変異を有するプラス
ミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ａと表示す
る。
【００４７】ｒｐＳＴ中でのＭ１２６Ａ変異の発生は、
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが、表Ｉに示す配列
を有するＡ１２４−２である以外、Ｌ１１８Ｅに関して
記述したのと全く同様にして達成される。このＡ１２４
−２オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴの配列を変化さ
せ、その結果、位置１２６のメチオニンに関するコドン
が、ＡＴＧから、アラニンをコード化するＧＣＡに変化
する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィ
ルターを培養することにより、変異を有するプラスミド
を検出する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの
変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｍ
１２６Ａと表示する。
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが、表Ｉに示す配列
を有するＡ１２４−２である以外、Ｌ１１８Ｅに関して
記述したのと全く同様にして達成される。このＡ１２４
−２オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴの配列を変化さ
せ、その結果、位置１２６のメチオニンに関するコドン
が、ＡＴＧから、アラニンをコード化するＧＣＡに変化
する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィ
ルターを培養することにより、変異を有するプラスミド
を検出する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの
変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｍ
１２６Ａと表示する。
【００４８】実施例６ ロイシンによるイソロイシン１２２の置換 この変異種の１員には、Ｉ１２２Ｌ、Ｉ１２２ＬＬ１１
８ＡおよびＩ１２２ＬＭ１２６Ａが含まれる。これらの
変異を有するプラスミド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ
−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２
ＬＬ１１８ＡおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌ
Ｍ１２６Ａと表示する。これらの変異の構築は、使用す
る変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要ならばＴＡ
Ｃ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く
同様にして行う。
８ＡおよびＩ１２２ＬＭ１２６Ａが含まれる。これらの
変異を有するプラスミド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ
−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２
ＬＬ１１８ＡおよびｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌ
Ｍ１２６Ａと表示する。これらの変異の構築は、使用す
る変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要ならばＴＡ
Ｃ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く
同様にして行う。
【００４９】変異Ｉ１２２Ｌ、Ｌ１２０−３の構築で用
いる合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表
Ｉに示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子
の配列を変化させ、その結果、位置１２２のイソロイシ
ンに関するコドンが、ＡＴＣから、ロイシンをコード化
するＣＴＧに変化する。このＬ１２０−３オリゴヌクレ
オチドをまた、雑種形成反応における放射能標識された
検出用プローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃
でニトロセルロースフィルターを培養した後、変異を有
していないプラスミドから、所望の変異を有するプラス
ミドを区別する。
いる合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表
Ｉに示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子
の配列を変化させ、その結果、位置１２２のイソロイシ
ンに関するコドンが、ＡＴＣから、ロイシンをコード化
するＣＴＧに変化する。このＬ１２０−３オリゴヌクレ
オチドをまた、雑種形成反応における放射能標識された
検出用プローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃
でニトロセルロースフィルターを培養した後、変異を有
していないプラスミドから、所望の変異を有するプラス
ミドを区別する。
【００５０】ｒｐＳＴ中でのＩ１２２ＬＬ１１８Ａ変異
の発生は、変異誘発および雑種形成／スクリーニング反
応の両方で用いる変異誘発オリゴヌクレオチドがＬ１１
８Ａであり、そして変異誘発のために用いる鋳型ＤＮＡ
がｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌである以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。この鋳型ＤＮＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸのＤＮＡ
に関して記述したのと全く同様にして製造される。ＴＡ
Ｃ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィルターを培
養することにより、変異を有するプラスミドを検出す
る。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの変異を有
するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ａ
Ｉ１２２Ｌと表示する。ｒｐＳＴ中でのＩ１２２ＬＭ１
２６Ａ変異の発生は、変異誘発および雑種形成／スクリ
ーニング反応の両方で用いる変異誘発オリゴヌクレオチ
ドがＡ１２４−２であり、そして変異誘発のために用い
る鋳型ＤＮＡがｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌであ
る以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にし
て達成される。この鋳型ＤＮＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
ＸのＤＮＡに関して記述したのと全く同様にして製造さ
れる。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィ
ルターを培養することにより、変異を有するプラスミド
を検出する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの
変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ
１２２ＬＭ１２６Ａと表示する。
の発生は、変異誘発および雑種形成／スクリーニング反
応の両方で用いる変異誘発オリゴヌクレオチドがＬ１１
８Ａであり、そして変異誘発のために用いる鋳型ＤＮＡ
がｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌである以外、Ｌ１
１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成され
る。この鋳型ＤＮＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸのＤＮＡ
に関して記述したのと全く同様にして製造される。ＴＡ
Ｃ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィルターを培
養することにより、変異を有するプラスミドを検出す
る。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの変異を有
するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｌ１１８Ａ
Ｉ１２２Ｌと表示する。ｒｐＳＴ中でのＩ１２２ＬＭ１
２６Ａ変異の発生は、変異誘発および雑種形成／スクリ
ーニング反応の両方で用いる変異誘発オリゴヌクレオチ
ドがＡ１２４−２であり、そして変異誘発のために用い
る鋳型ＤＮＡがｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ１２２Ｌであ
る以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にし
て達成される。この鋳型ＤＮＡは、ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
ＸのＤＮＡに関して記述したのと全く同様にして製造さ
れる。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該ニトロセルロースフィ
ルターを培養することにより、変異を有するプラスミド
を検出する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの
変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ
１２２ＬＭ１２６Ａと表示する。
【００５１】実施例７ ヘリックス３の親水性表面上のアミノ酸残基の置換 この変異種の１員には、Ｇ１２１Ａ、Ｋ１１４Ｒおよび
Ｋ１１６Ｒが含まれる。これらの変異を有するプラスミ
ド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｇ１２１Ａ、
ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｋ１１４ＲおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｋ１１６Ｒと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要
ならばＴＡＣ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述し
たのと全く同様にして行う。
Ｋ１１６Ｒが含まれる。これらの変異を有するプラスミ
ド類を、それぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｇ１２１Ａ、
ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｋ１１４ＲおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ｋ１１６Ｒと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド類そして必要
ならばＴＡＣ洗浄温度以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述し
たのと全く同様にして行う。
【００５２】変異Ｇ１２１Ａ、Ｇ１２１Ａ／ＸｍｎＩの
構築で有益な合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ
配列を表Ｉに示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳ
Ｔ遺伝子の配列を変化させ、その結果、位置１２１のグ
リシンに関するコドンが、ＧＧＣから、アラニンをコー
ド化するＧＣＴに変換される。このオリゴヌクレオチド
はまた、該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、そ
の結果、ＸｍｎＩ制限認識部位（５′−ＧＡＡＧＣＴＡ
ＴＴＣ−３′）が該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれ
る。該Ｇ１２１Ａ変異を除いて、この追加的なヌクレオ
チド変化は、該ｒｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する
変化をもたらさない。このＧ１２１Ａ／ＸｍｎＩオリゴ
ヌクレオチドをまた、雑種形成反応（これは、他の全て
の点で上述したのと同じである）における放射能標識さ
れた検出用プローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５
７．５℃で該ニトロセルロースフィルターを培養し、そ
してＸｍｎＩ部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチ
ド中に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中
の該Ｇ１２１Ａ変異の存在に対して特徴的である）の獲
得に関する分析を行うことにより、候補の変異含有クロ
ーンが検出される。ＤＮＡ配列決定分析により立証され
たこの変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
Ｘ−Ｇ１２１Ａと表示する。
構築で有益な合成変異誘発オリゴヌクレオチドのＤＮＡ
配列を表Ｉに示す。このオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳ
Ｔ遺伝子の配列を変化させ、その結果、位置１２１のグ
リシンに関するコドンが、ＧＧＣから、アラニンをコー
ド化するＧＣＴに変換される。このオリゴヌクレオチド
はまた、該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、そ
の結果、ＸｍｎＩ制限認識部位（５′−ＧＡＡＧＣＴＡ
ＴＴＣ−３′）が該ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれ
る。該Ｇ１２１Ａ変異を除いて、この追加的なヌクレオ
チド変化は、該ｒｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する
変化をもたらさない。このＧ１２１Ａ／ＸｍｎＩオリゴ
ヌクレオチドをまた、雑種形成反応（これは、他の全て
の点で上述したのと同じである）における放射能標識さ
れた検出用プローブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５
７．５℃で該ニトロセルロースフィルターを培養し、そ
してＸｍｎＩ部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチ
ド中に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中
の該Ｇ１２１Ａ変異の存在に対して特徴的である）の獲
得に関する分析を行うことにより、候補の変異含有クロ
ーンが検出される。ＤＮＡ配列決定分析により立証され
たこの変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
Ｘ−Ｇ１２１Ａと表示する。
【００５３】ｒｐＳＴ中でのＫ１１４Ｒ変異の発生は、
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが表Ｉに示す配列を
有するＫ１１４Ｒ／ＡｃｃＩである以外、Ｌ１１８Ｅに
関して記述したのと全く同様にして達成される。このＫ
１１４Ｒ／ＡｃｃＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配
列を変化させ、その結果、位置１１４のリジンに関する
コドンが、ＡＡＧから、アルギニンをコード化するＣＧ
Ｔに変化する。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ａｃｃ
Ｉ制限認識部位（５′−ＧＴＡＴＡＣ−３′）が該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｋ１１４Ｒ変異を
除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐＳＴ
蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさない。Ｇ
１２１Ａと同様、推定の変異含有クローンが、ＴＡＣ緩
衝液中５７．５℃で該ニトロセルロースフィルターを培
養することにより検出され、そして新しいＡｃｃＩ制限
部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中に存在し
ており、従ってこのプラスミドクローン中の該Ｋ１１４
Ｒ変異の存在に対して特徴的である）の獲得に関して検
査する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの変異
を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｋ１１
４Ｒと表示する。
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが表Ｉに示す配列を
有するＫ１１４Ｒ／ＡｃｃＩである以外、Ｌ１１８Ｅに
関して記述したのと全く同様にして達成される。このＫ
１１４Ｒ／ＡｃｃＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配
列を変化させ、その結果、位置１１４のリジンに関する
コドンが、ＡＡＧから、アルギニンをコード化するＣＧ
Ｔに変化する。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ａｃｃ
Ｉ制限認識部位（５′−ＧＴＡＴＡＣ−３′）が該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｋ１１４Ｒ変異を
除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐＳＴ
蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさない。Ｇ
１２１Ａと同様、推定の変異含有クローンが、ＴＡＣ緩
衝液中５７．５℃で該ニトロセルロースフィルターを培
養することにより検出され、そして新しいＡｃｃＩ制限
部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中に存在し
ており、従ってこのプラスミドクローン中の該Ｋ１１４
Ｒ変異の存在に対して特徴的である）の獲得に関して検
査する。ＤＮＡ配列決定分析により立証されたこの変異
を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｋ１１
４Ｒと表示する。
【００５４】ｒｐＳＴ中でのＫ１１６Ｒ変異の発生は、
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが表Ｉに示す配列を
有するＫ１１６Ｒ／Ｂｇ１ＩＩである以外、Ｌ１１８Ｅ
に関して記述したのと全く同様にして達成される。この
Ｋ１１６Ｒ／Ｂｇ１ＩＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳ
Ｔ配列を変化させ、その結果、位置１１６のリジンに関
するコドンが、ＡＡＧから、アルギニンをコード化する
ＣＧＡに変化する。このオリゴヌクレオチドはまた、該
ｒｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｂ
ｇ１ＩＩ制限認識部位（５′−ＡＧＡＴＣＴ−３′）
が、該ヌクレオチド配列の位置３４２〜３４７から成る
ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｋ１１６Ｒ変
異を除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐ
ＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさな
い。Ｇ１２１Ａと同様、推定の変異含有クローンが、Ｔ
ＡＣ緩衝液中５７．５℃で該ニトロセルロースフィルタ
ーを培養することにより検出され、そして新しいＢｇ１
ＩＩ制限部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中
に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中の該
Ｋ１１６Ｒ変異の存在に対して特徴的である）の獲得に
関して検査する。ＤＮＡ配列決定分析により立証された
この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ
−Ｋ１１６Ｒと表示する。
変異誘発および雑種形成／スクリーニング反応の両方で
用いる変異誘発オリゴヌクレオチドが表Ｉに示す配列を
有するＫ１１６Ｒ／Ｂｇ１ＩＩである以外、Ｌ１１８Ｅ
に関して記述したのと全く同様にして達成される。この
Ｋ１１６Ｒ／Ｂｇ１ＩＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳ
Ｔ配列を変化させ、その結果、位置１１６のリジンに関
するコドンが、ＡＡＧから、アルギニンをコード化する
ＣＧＡに変化する。このオリゴヌクレオチドはまた、該
ｒｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｂ
ｇ１ＩＩ制限認識部位（５′−ＡＧＡＴＣＴ−３′）
が、該ヌクレオチド配列の位置３４２〜３４７から成る
ｒｐＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｋ１１６Ｒ変
異を除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐ
ＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさな
い。Ｇ１２１Ａと同様、推定の変異含有クローンが、Ｔ
ＡＣ緩衝液中５７．５℃で該ニトロセルロースフィルタ
ーを培養することにより検出され、そして新しいＢｇ１
ＩＩ制限部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中
に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中の該
Ｋ１１６Ｒ変異の存在に対して特徴的である）の獲得に
関して検査する。ＤＮＡ配列決定分析により立証された
この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ
−Ｋ１１６Ｒと表示する。
【００５５】実施例８ ２つの合成オリゴヌクレオチド類を同時に用いた疎水性
アミノ酸残基によるヘリックス２中の親水性アミノ酸の
置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＳ８１，８７Ｌで
ある。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたところ
の、この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸ−Ｓ８１，８７Ｌと表示する。この二重変異体Ｓ８
１，８７Ｌの組み立てで用いる合成変異誘発オリゴヌク
レオチド類、即ちＳ８１ＬおよびＳ８７ＬのＤＮＡ配列
を表Ｉに示す。このＳ８１ＬおよびＳ８７Ｌオリゴヌク
レオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結
果、位置８１と８７それぞれのセリンに関するコドン
が、ＴＣＧから、ロイシンをコード化するＴＴＧに変換
される。この二重変異体ｒｐＳＴ遺伝子の組み立ては、
該変異誘発オリゴヌクレオチド類の両方をその変異誘発
反応において同時に用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記
述したのと全く同じである。このＳ８１Ｌオリゴヌクレ
オチドは、雑種形成反応（これは、このフィルターをＴ
ＡＣ緩衝液中５４℃で洗浄する以外は、Ｌ１１８Ｅに関
して記述したものを除く全ての点で同一である）におけ
る放射能標識された検出用プローブとしても使用する。
推定の陽性変異を有するプラスミドクローンを持ってい
るバクテリアの形質転換体を選択し、ニトロセルロース
フィルターに移入した後、雑種形成のための処理を行
う。この２回目のスクリーニングで、該Ｓ８７Ｌオリゴ
ヌクレオチドを、放射能標識したプローブとして用い、
そしてフィルターをＴＡＣ緩衝液中５４℃で洗浄する。
アミノ酸残基によるヘリックス２中の親水性アミノ酸の
置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＳ８１，８７Ｌで
ある。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたところ
の、この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸ−Ｓ８１，８７Ｌと表示する。この二重変異体Ｓ８
１，８７Ｌの組み立てで用いる合成変異誘発オリゴヌク
レオチド類、即ちＳ８１ＬおよびＳ８７ＬのＤＮＡ配列
を表Ｉに示す。このＳ８１ＬおよびＳ８７Ｌオリゴヌク
レオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結
果、位置８１と８７それぞれのセリンに関するコドン
が、ＴＣＧから、ロイシンをコード化するＴＴＧに変換
される。この二重変異体ｒｐＳＴ遺伝子の組み立ては、
該変異誘発オリゴヌクレオチド類の両方をその変異誘発
反応において同時に用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関して記
述したのと全く同じである。このＳ８１Ｌオリゴヌクレ
オチドは、雑種形成反応（これは、このフィルターをＴ
ＡＣ緩衝液中５４℃で洗浄する以外は、Ｌ１１８Ｅに関
して記述したものを除く全ての点で同一である）におけ
る放射能標識された検出用プローブとしても使用する。
推定の陽性変異を有するプラスミドクローンを持ってい
るバクテリアの形質転換体を選択し、ニトロセルロース
フィルターに移入した後、雑種形成のための処理を行
う。この２回目のスクリーニングで、該Ｓ８７Ｌオリゴ
ヌクレオチドを、放射能標識したプローブとして用い、
そしてフィルターをＴＡＣ緩衝液中５４℃で洗浄する。
【００５６】実施例９ 親水性アミノ酸残基によるヘリックス２中の疎水性アミ
ノ酸残基の置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＬ８２，８４Ｑで
ある。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたところ
の、この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸ−Ｌ８２，８４Ｑと表示する。変異Ｌ８２，８４Ｑ
の構築で用いる合成変異誘発オリゴヌクレオチド類のＤ
ＮＡ配列はＱ８０８２であり、これを表Ｉに示す。この
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化さ
せ、その結果、位置８２と８４のロイシンに関するコド
ンが、各々、ＣＴＧおよびＣＴＣそれぞれから、グルタ
ミンをコード化するＣＡＧに変換される。ＴＡＣ緩衝液
中５８℃で該ニトロセルロースフィルターを培養するこ
とにより、変異含有プラスミドを検出する。
ノ酸残基の置換 この変異種の１員は、二重変異、即ちＬ８２，８４Ｑで
ある。ＤＮＡ配列決定分析によって確認されたところ
の、この変異を有するプラスミドを、ｐＧＥＭｐＳＴ−
ＳＸ−Ｌ８２，８４Ｑと表示する。変異Ｌ８２，８４Ｑ
の構築で用いる合成変異誘発オリゴヌクレオチド類のＤ
ＮＡ配列はＱ８０８２であり、これを表Ｉに示す。この
オリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化さ
せ、その結果、位置８２と８４のロイシンに関するコド
ンが、各々、ＣＴＧおよびＣＴＣそれぞれから、グルタ
ミンをコード化するＣＡＧに変換される。ＴＡＣ緩衝液
中５８℃で該ニトロセルロースフィルターを培養するこ
とにより、変異含有プラスミドを検出する。
【００５７】実施例１０ ヘリックス２およびヘリックス３の組み合わされた変異
の構築 ヘリックス３の疎水性表面の疎水特性を維持しているか
（Ｉ１２２Ｌ、Ｍ１２６Ａ）、或はそれを上昇させる
（Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌ）ところの、いくつかのヘリッ
クス３変異、即ちＩ１２２Ｌ、Ｍ１２６ＡおよびＥ１１
９ＬＱ１２３Ｌを、次に示す副次クローン化反応によ
り、疎水性ヘリックス２二重変異Ｓ８１，８７Ｌと組み
合わせる。プラスミドｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｓ８１，
８７Ｌを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限する。この
小さいフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製
し、そしてこれは該Ｓ８１，８７Ｌ変異を有している。
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｉ１２２Ｌもまた、
連続してＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限した後、同様
にして、大きいフラグメントを精製する。この大型フラ
グメントは、ｐＲＯｐＳＴ発現ベクター成分およびｐＳ
Ｔ変異Ｉ１２２Ｌを有しており、そしてアラニン置換に
対するシステインを位置１８３および１９１に有してい
る。この大型フラグメントと小型のＳ８１，８７Ｌフラ
グメントとを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとＡＴＰの存在下
結合させる。ＣａＣｌ2で処理することにより受容能力
を与えた発現株４３００に、該反応混合物の半分を導入
する。形質転換された細胞を３０℃で一晩培養する。実
施例１２に記述したように、プラスミド含有細胞のｐＳ
Ｔ発現を分析し、このヘリックス２／ヘリックス３組み
合わせを有するプラスミドを、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−
Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２Ｌと表示する。
の構築 ヘリックス３の疎水性表面の疎水特性を維持しているか
（Ｉ１２２Ｌ、Ｍ１２６Ａ）、或はそれを上昇させる
（Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌ）ところの、いくつかのヘリッ
クス３変異、即ちＩ１２２Ｌ、Ｍ１２６ＡおよびＥ１１
９ＬＱ１２３Ｌを、次に示す副次クローン化反応によ
り、疎水性ヘリックス２二重変異Ｓ８１，８７Ｌと組み
合わせる。プラスミドｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｓ８１，
８７Ｌを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限する。この
小さいフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製
し、そしてこれは該Ｓ８１，８７Ｌ変異を有している。
プラスミドｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｉ１２２Ｌもまた、
連続してＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限した後、同様
にして、大きいフラグメントを精製する。この大型フラ
グメントは、ｐＲＯｐＳＴ発現ベクター成分およびｐＳ
Ｔ変異Ｉ１２２Ｌを有しており、そしてアラニン置換に
対するシステインを位置１８３および１９１に有してい
る。この大型フラグメントと小型のＳ８１，８７Ｌフラ
グメントとを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとＡＴＰの存在下
結合させる。ＣａＣｌ2で処理することにより受容能力
を与えた発現株４３００に、該反応混合物の半分を導入
する。形質転換された細胞を３０℃で一晩培養する。実
施例１２に記述したように、プラスミド含有細胞のｐＳ
Ｔ発現を分析し、このヘリックス２／ヘリックス３組み
合わせを有するプラスミドを、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−
Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２Ｌと表示する。
【００５８】発現ベクター成分の源としてｐＲＯｐＳＴ
−ＳＸＡ−Ｍ１２６ＡおよびｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｅ
１１９ＬＱ１２３Ｌを用い、そしてｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ
Ａ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｍ１２６ＡおよびｐＲＯｐＳＴ−
ＳＸＡ−Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌのそれぞれを発生させる
ためヘリックス３変異（類）を用いる以外、ｐＲＯｐＳ
Ｔ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２Ｌに関して記述
したのと全く同様にして、組み合わされた変異ｐＲＯｐ
ＳＴ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｍ１２６ＡおよびｐＲ
ＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｅ１１９ＬＱ１２
３Ｌを構築する。
−ＳＸＡ−Ｍ１２６ＡおよびｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｅ
１１９ＬＱ１２３Ｌを用い、そしてｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ
Ａ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｍ１２６ＡおよびｐＲＯｐＳＴ−
ＳＸＡ−Ｅ１１９ＬＱ１２３Ｌのそれぞれを発生させる
ためヘリックス３変異（類）を用いる以外、ｐＲＯｐＳ
Ｔ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２Ｌに関して記述
したのと全く同様にして、組み合わされた変異ｐＲＯｐ
ＳＴ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｍ１２６ＡおよびｐＲ
ＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｅ１１９ＬＱ１２
３Ｌを構築する。
【００５９】変異体ヘリックス２のＤＮＡの源がｐＧＥ
ＭｐＳＴ−ＳＸＡ−８２，８４Ｑであり、そしてヘリッ
クス３変異、即ちＬ１１５Ｋの源がｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ
Ａ−Ｌ１１５Ｋである以外、Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２
Ｌに関して記述したのと全く同様にして、ヘリックス２
の二重変異Ｌ８２，８４Ｑを該ヘリックス３変異Ｌ１１
５Ｋと組み合わせる。この組み合わせを有するプラスミ
ドを、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ８２，８４Ｑ＋Ｌ１１
５Ｋと表示する。
ＭｐＳＴ−ＳＸＡ−８２，８４Ｑであり、そしてヘリッ
クス３変異、即ちＬ１１５Ｋの源がｐＲＯｐＳＴ−ＳＸ
Ａ−Ｌ１１５Ｋである以外、Ｓ８１，８７Ｌ＋Ｉ１２２
Ｌに関して記述したのと全く同様にして、ヘリックス２
の二重変異Ｌ８２，８４Ｑを該ヘリックス３変異Ｌ１１
５Ｋと組み合わせる。この組み合わせを有するプラスミ
ドを、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＡ−Ｌ８２，８４Ｑ＋Ｌ１１
５Ｋと表示する。
【００６０】実施例１１ 変異誘発オリゴヌクレオチド類を用いた親水性アミノ酸
によるヘリックス１中もしくはその近くの疎水性アミノ
酸の置換 これらの変異の目的は、ｒｐＳＴのＮＨ2末端部分に見
いだされる疎水性アミノ酸残基を、ヒト成長ホルモン
の、同じ関係にある位置に存在している親水性アミノ酸
残基で置換することである。
によるヘリックス１中もしくはその近くの疎水性アミノ
酸の置換 これらの変異の目的は、ｒｐＳＴのＮＨ2末端部分に見
いだされる疎水性アミノ酸残基を、ヒト成長ホルモン
の、同じ関係にある位置に存在している親水性アミノ酸
残基で置換することである。
【００６１】この変異種の１員には、ｒｐＳＴの二重変
異Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ、二重変異Ｓ１１ＲＡ１４Ｄそして
単一変異Ａ６ＴおよびＡ１４Ｄが含まれる。これらの変
異を有するプラスミド類は、ＤＮＡ配列決定分析により
立証され、そしてそれぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｑ２
１ＨＨ２２Ｒ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｓ１１ＲＡ１４
Ｄ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ａ６ＴおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ａ１４Ｄと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド、ＴＡＣ緩衝
液中でのニトロセルロースフィルターの培養温度、そし
て適宜、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化す
ることによる陽性の変異含有プラスミドに関する追加的
スクリーニング以外は、Ｌ１１８Ｅに関して記述したの
と全く同様にして行う。
異Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ、二重変異Ｓ１１ＲＡ１４Ｄそして
単一変異Ａ６ＴおよびＡ１４Ｄが含まれる。これらの変
異を有するプラスミド類は、ＤＮＡ配列決定分析により
立証され、そしてそれぞれｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｑ２
１ＨＨ２２Ｒ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｓ１１ＲＡ１４
Ｄ、ｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ａ６ＴおよびｐＧＥＭｐＳ
Ｔ−ＳＸ−Ａ１４Ｄと表示する。これらの変異の構築
は、使用する変異誘発オリゴヌクレオチド、ＴＡＣ緩衝
液中でのニトロセルロースフィルターの培養温度、そし
て適宜、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化す
ることによる陽性の変異含有プラスミドに関する追加的
スクリーニング以外は、Ｌ１１８Ｅに関して記述したの
と全く同様にして行う。
【００６２】該二重変異Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ、Ｑ２１ＨＨ
２２Ｒ／ＣｌａＩの構築で用いる合成変異誘発オリゴヌ
クレオチドのＤＮＡ配列を表Ｉに示す。このオリゴヌク
レオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結
果、位置２１のグルタミンに関するコドンが、ＣＡＧか
ら、ヒスチジンをコード化するＣＡＴに変換され、そし
て位置２２のヒスチジンが、ＣＡＣから、アルギニンを
コード化するＣＧＡに変換される。これらの変異で埋め
込まれるものは、ＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂
部位（５′−ＡＴＣＧＡＴ−３′）（これは、その変更
されたｒｐＳＴ遺伝子に対して特徴的である）である。
このＱ２１ＨＨ２２Ｒ／ＣｌａＩオリゴヌクレオチドを
また、雑種形成反応（これは、他の全ての点で上述した
のと同じである）における放射能標識された検出用プロ
ーブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該フィル
ターを洗浄する以外、この変異の構築で用いた操作の全
てはＬ１１８Ｅに関して前述したのと同じである。ま
た、ＣｌａＩ部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチ
ド中に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中
の該Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ二重変異の存在に対して特徴的で
ある）の獲得に関して、候補の変異含有クローンを分析
する。
２２Ｒ／ＣｌａＩの構築で用いる合成変異誘発オリゴヌ
クレオチドのＤＮＡ配列を表Ｉに示す。このオリゴヌク
レオチドは該ｒｐＳＴ遺伝子の配列を変化させ、その結
果、位置２１のグルタミンに関するコドンが、ＣＡＧか
ら、ヒスチジンをコード化するＣＡＴに変換され、そし
て位置２２のヒスチジンが、ＣＡＣから、アルギニンを
コード化するＣＧＡに変換される。これらの変異で埋め
込まれるものは、ＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂
部位（５′−ＡＴＣＧＡＴ−３′）（これは、その変更
されたｒｐＳＴ遺伝子に対して特徴的である）である。
このＱ２１ＨＨ２２Ｒ／ＣｌａＩオリゴヌクレオチドを
また、雑種形成反応（これは、他の全ての点で上述した
のと同じである）における放射能標識された検出用プロ
ーブとして使用する。ＴＡＣ緩衝液中５６℃で該フィル
ターを洗浄する以外、この変異の構築で用いた操作の全
てはＬ１１８Ｅに関して前述したのと同じである。ま
た、ＣｌａＩ部位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチ
ド中に存在しており、従ってこのプラスミドクローン中
の該Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ二重変異の存在に対して特徴的で
ある）の獲得に関して、候補の変異含有クローンを分析
する。
【００６３】ｒｐＳＴ中でのＡ６Ｔ変異の発生は、変異
誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す変異
誘発オリゴヌクレオチドＡ６Ｔを用いる以外、Ｌ１１８
Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成される。こ
のＡ６Ｔオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化さ
せ、その結果、位置６のアラニンに関するコドンが、Ｇ
ＣＣから、トレオニンをコード化するＡＣＣに変換され
る。雑種形成に続いて、バクテリア含有ニトロセルロー
スフィルターを、ＴＡＣ緩衝液中５２℃で洗浄する。
誘発および雑種形成反応の両方において表Ｉに示す変異
誘発オリゴヌクレオチドＡ６Ｔを用いる以外、Ｌ１１８
Ｅに関して記述したのと全く同様にして達成される。こ
のＡ６Ｔオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化さ
せ、その結果、位置６のアラニンに関するコドンが、Ｇ
ＣＣから、トレオニンをコード化するＡＣＣに変換され
る。雑種形成に続いて、バクテリア含有ニトロセルロー
スフィルターを、ＴＡＣ緩衝液中５２℃で洗浄する。
【００６４】Ｓ１１ＲＡ１４Ｄ二重変異の発生は、変異
誘発および雑種形成反応の両方で変異誘発オリゴヌクレ
オチドＳ１１ＲＡ１４Ｄ／ＳａｌＩを用い、そして該セ
ルロースフィルターをＴＡＣ緩衝液中６４℃で洗浄する
以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして
達成される。このＳ１１ＲＡ１４Ｄ／ＳａｌＩオリゴヌ
クレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結果、位
置１１のセリンコドンが、ＡＧＣから、アルギニンをコ
ード化するＣＧＡに変換され、位置１４のアラニンコド
ンが、ＧＣＣから、アスパラギン酸をコード化するＧＡ
Ｃに変換される。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒ
ｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｓａ
ｌＩ制限認識部位（５′−ＧＴＣＧＡＣ−３′）が、該
ヌクレオチド配列の位置２９〜３４から成るｒｐＳＴの
ＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｓ１１ＲおよびＡ１４Ｄ
変異を除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒ
ｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさな
い。推定の変異含有クローンを、新しいＳａｌＩ制限部
位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中に存在して
おり、従ってこのプラスミドクローン中の該Ｓ１１ＲＡ
１４Ｄ二重変異の存在に対して特徴的である）の獲得に
関して検査する。
誘発および雑種形成反応の両方で変異誘発オリゴヌクレ
オチドＳ１１ＲＡ１４Ｄ／ＳａｌＩを用い、そして該セ
ルロースフィルターをＴＡＣ緩衝液中６４℃で洗浄する
以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全く同様にして
達成される。このＳ１１ＲＡ１４Ｄ／ＳａｌＩオリゴヌ
クレオチドは該ｒｐＳＴ配列を変化させ、その結果、位
置１１のセリンコドンが、ＡＧＣから、アルギニンをコ
ード化するＣＧＡに変換され、位置１４のアラニンコド
ンが、ＧＣＣから、アスパラギン酸をコード化するＧＡ
Ｃに変換される。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒ
ｐＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｓａ
ｌＩ制限認識部位（５′−ＧＴＣＧＡＣ−３′）が、該
ヌクレオチド配列の位置２９〜３４から成るｒｐＳＴの
ＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ｓ１１ＲおよびＡ１４Ｄ
変異を除いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒ
ｐＳＴ蛋白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさな
い。推定の変異含有クローンを、新しいＳａｌＩ制限部
位（これは、変異誘発オリゴヌクレオチド中に存在して
おり、従ってこのプラスミドクローン中の該Ｓ１１ＲＡ
１４Ｄ二重変異の存在に対して特徴的である）の獲得に
関して検査する。
【００６５】Ａ１４Ｄ単一変異の発生は、変異誘発およ
び雑種形成反応の両方で変異誘発オリゴヌクレオチドＡ
１４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関
して記述したのと全く同様にして達成される。このＡ１
４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ
配列を変化させ、その結果、位置１４のアラニンコドン
が、ＧＣＣから、アスパラギン酸をコード化するＧＡＣ
に変換される。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限認識部位（５′−ＡＡＧＣＴＴ−３′）
が、該ヌクレオチド配列の位置３０〜３５から成るｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ａ１４Ｄ変異を除
いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐＳＴ蛋
白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさない。推定
の変異含有クローンを、ＴＡＣ緩衝液中６２℃で該ニト
ロセルロースフィルターを培養することで検出し、そし
て新しいＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（これは、変異誘発オ
リゴヌクレオチド中に存在しており、従ってこのプラス
ミドクローン中の該Ａ１４Ｄ変異の存在に対して特徴的
である）の獲得に関して検査する。
び雑種形成反応の両方で変異誘発オリゴヌクレオチドＡ
１４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる以外、Ｌ１１８Ｅに関
して記述したのと全く同様にして達成される。このＡ１
４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドは該ｒｐＳＴ
配列を変化させ、その結果、位置１４のアラニンコドン
が、ＧＣＣから、アスパラギン酸をコード化するＧＡＣ
に変換される。このオリゴヌクレオチドはまた、該ｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列とは異なっており、その結果、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限認識部位（５′−ＡＡＧＣＴＴ−３′）
が、該ヌクレオチド配列の位置３０〜３５から成るｒｐ
ＳＴのＤＮＡ配列に組み込まれる。該Ａ１４Ｄ変異を除
いて、この追加的なヌクレオチド変化は、該ｒｐＳＴ蛋
白質のアミノ酸配列に関する変化をもたらさない。推定
の変異含有クローンを、ＴＡＣ緩衝液中６２℃で該ニト
ロセルロースフィルターを培養することで検出し、そし
て新しいＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（これは、変異誘発オ
リゴヌクレオチド中に存在しており、従ってこのプラス
ミドクローン中の該Ａ１４Ｄ変異の存在に対して特徴的
である）の獲得に関して検査する。
【００６６】実施例１２ 適当なバクテリア発現プラスミド類へのｐＳＴ変異類の
再構築 この変化させられた（変異を有する）クローンを、バク
テリアの発現プラスミドｐＲＯ２１１（ここでは参照に
いれられるＥＰＯ１７３２８０特許出願中に記述されて
いる）の誘導体に再構築し、これらをｐＲＯｐＳＴ、ｐ
ＲＯｐＳＴＡ３４およびｐＲＯｐＳＴＥ３４と表示す
る。プラスミドｐＲＯｐＳＴは、発現ベクターｐＲＯ２
１１にクローン化されたｐＳＴのＤＮＡを有しており、
そして位置１８３と１９１にシステインをコード化する
ＤＮＡを有しているが、これらの位置に、ｐＲＯｐＳＴ
Ａ３４は、アラニンをコード化するＤＮＡを有してお
り、そしてｐＲＯｐＳＴＥ３４はグルタミン酸をコード
化するＤＮＡを有している。このｐＧＥＭｐＳＴの変化
させたクローンを、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化さ
せた後、ｐＳＴの変異を有する小型のフラグメントを単
離する。ｐＲＯｐＳＴＡ３４のＤＮＡを同様にして処理
した後、ベクターを含有している大型のＤＮＡフラグメ
ントを単離する。これらの精製したフラグメント類を、
Ｔ４のＤＮＡリガーゼで一緒に連結させた後、適当なバ
クテリア株、例えば４３００に形質転換する。この株は
温度に敏感なλ抑制因子（ｃＩ857）を有しており、そ
の結果、このλＰLプロモーターからの発現は３０℃で
抑制されるが、４２℃（この温度で該抑制因子が不活性
化される）で許容される。ｐＲＯｐＳＴＥ３４のＤＮＡ
への、変化させたｐＧＥＭｐＳＴのＤＮＡフラグメント
の導入は、ｐＲＯｐＳＴＡ３４に関して記述したのと全
く同様にして達成される。ｐＲＯｐＳＴへの、変化させ
たｐＧＥＭｐＳＴのＤＮＡフラグメントの導入は、ｐＧ
ＥＭｐＳＴおよびｐＲＯｐＳＴＡ３４の両方のプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させる以
外、ｐＲＯｐＳＴＡ３４に関して記述したのと同じであ
る。表ＩＩに、変異させたｐＳＴ遺伝子を導入したバク
テリア発現プラスミドを列挙する。ｐＳＴ変異、即ちＡ
６Ｔ、Ｓ１１Ｒ１４ＤおよびＱ２１ＨＨ２２Ｒを、ｐＲ
ＯｐＳＴＥ３４に関して記述したのと同様、ｐＲＯｐＳ
ＴＥ３４の誘導体に導入する。この誘導体ｐＲＯｐＳＴ
Ｅ３４Ｔ1Ｔ2は、ｐＳＴをコード化するＤＮＡ（これ
は、大腸菌ｒｒｎＢオペロン（リボソームのＲＮＡのＢ
オペロン）からの転写ターミネーターＴ1Ｔ2を有してい
る）の３′末端に、計算値で１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントを有している。
再構築 この変化させられた（変異を有する）クローンを、バク
テリアの発現プラスミドｐＲＯ２１１（ここでは参照に
いれられるＥＰＯ１７３２８０特許出願中に記述されて
いる）の誘導体に再構築し、これらをｐＲＯｐＳＴ、ｐ
ＲＯｐＳＴＡ３４およびｐＲＯｐＳＴＥ３４と表示す
る。プラスミドｐＲＯｐＳＴは、発現ベクターｐＲＯ２
１１にクローン化されたｐＳＴのＤＮＡを有しており、
そして位置１８３と１９１にシステインをコード化する
ＤＮＡを有しているが、これらの位置に、ｐＲＯｐＳＴ
Ａ３４は、アラニンをコード化するＤＮＡを有してお
り、そしてｐＲＯｐＳＴＥ３４はグルタミン酸をコード
化するＤＮＡを有している。このｐＧＥＭｐＳＴの変化
させたクローンを、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化さ
せた後、ｐＳＴの変異を有する小型のフラグメントを単
離する。ｐＲＯｐＳＴＡ３４のＤＮＡを同様にして処理
した後、ベクターを含有している大型のＤＮＡフラグメ
ントを単離する。これらの精製したフラグメント類を、
Ｔ４のＤＮＡリガーゼで一緒に連結させた後、適当なバ
クテリア株、例えば４３００に形質転換する。この株は
温度に敏感なλ抑制因子（ｃＩ857）を有しており、そ
の結果、このλＰLプロモーターからの発現は３０℃で
抑制されるが、４２℃（この温度で該抑制因子が不活性
化される）で許容される。ｐＲＯｐＳＴＥ３４のＤＮＡ
への、変化させたｐＧＥＭｐＳＴのＤＮＡフラグメント
の導入は、ｐＲＯｐＳＴＡ３４に関して記述したのと全
く同様にして達成される。ｐＲＯｐＳＴへの、変化させ
たｐＧＥＭｐＳＴのＤＮＡフラグメントの導入は、ｐＧ
ＥＭｐＳＴおよびｐＲＯｐＳＴＡ３４の両方のプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させる以
外、ｐＲＯｐＳＴＡ３４に関して記述したのと同じであ
る。表ＩＩに、変異させたｐＳＴ遺伝子を導入したバク
テリア発現プラスミドを列挙する。ｐＳＴ変異、即ちＡ
６Ｔ、Ｓ１１Ｒ１４ＤおよびＱ２１ＨＨ２２Ｒを、ｐＲ
ＯｐＳＴＥ３４に関して記述したのと同様、ｐＲＯｐＳ
ＴＥ３４の誘導体に導入する。この誘導体ｐＲＯｐＳＴ
Ｅ３４Ｔ1Ｔ2は、ｐＳＴをコード化するＤＮＡ（これ
は、大腸菌ｒｒｎＢオペロン（リボソームのＲＮＡのＢ
オペロン）からの転写ターミネーターＴ1Ｔ2を有してい
る）の３′末端に、計算値で１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントを有している。
【００６７】
【表３】
【００６８】実施例１３ ヘリックス１の組み合わされた変異体Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋
Ｅ３４およびＰ８ＴＳ１１Ｒ＋Ｅ３４の構築 二重変異Ａ６ＴＳ１１Ｒ（ここでは、位置６のアラニン
がトレオニンで置換されており、そして位置１１のセリ
ンがアルギニンで置換されている）を、Ｅ３４変異（Ｅ
Ｐ３５５４６０中に記述）（ここでは、位置１８３と１
９１のＤＮＡコード化システインがグルタミン酸で置換
されている）と組み合わせる。従って、この得られるｒ
ｐＳＴ遺伝子は、該ｒｐＳＴのＤＮＡのＮＨ2−（Ａ６
ＴＳ１１Ｒ）およびＣＯＯＨ−コード化領域（Ｅ３４）
の両方に変異を有している。この得られるプラスミドを
ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒと表示する。この変異
させられたところの、ｒｐＳＴを含有している小型のＥ
ｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメント（該Ａ６ＴＳ１１Ｒ変
異類を有しているｐＭＬ／ｐＧＨ１４から得られる）
を、プラスミドｐＲＯｐＳＴＥ−Ｔ1Ｔ2から得られる大
型のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメントと結合させる。
この後者のプラスミドは、該ｐＳＴ発現プラスミド（こ
れはまた、該ｒｐＳＴコード化ＤＮＡの３′末端に、大
腸菌ｒｒｎＢオペロンからの強力な転写ターミネーター
（Ｔ1Ｔ2）を有している）である。
Ｅ３４およびＰ８ＴＳ１１Ｒ＋Ｅ３４の構築 二重変異Ａ６ＴＳ１１Ｒ（ここでは、位置６のアラニン
がトレオニンで置換されており、そして位置１１のセリ
ンがアルギニンで置換されている）を、Ｅ３４変異（Ｅ
Ｐ３５５４６０中に記述）（ここでは、位置１８３と１
９１のＤＮＡコード化システインがグルタミン酸で置換
されている）と組み合わせる。従って、この得られるｒ
ｐＳＴ遺伝子は、該ｒｐＳＴのＤＮＡのＮＨ2−（Ａ６
ＴＳ１１Ｒ）およびＣＯＯＨ−コード化領域（Ｅ３４）
の両方に変異を有している。この得られるプラスミドを
ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒと表示する。この変異
させられたところの、ｒｐＳＴを含有している小型のＥ
ｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメント（該Ａ６ＴＳ１１Ｒ変
異類を有しているｐＭＬ／ｐＧＨ１４から得られる）
を、プラスミドｐＲＯｐＳＴＥ−Ｔ1Ｔ2から得られる大
型のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメントと結合させる。
この後者のプラスミドは、該ｐＳＴ発現プラスミド（こ
れはまた、該ｒｐＳＴコード化ＤＮＡの３′末端に、大
腸菌ｒｒｎＢオペロンからの強力な転写ターミネーター
（Ｔ1Ｔ2）を有している）である。
【００６９】もう１つの二重変異Ｐ８ＴＳ１１Ｒ（ここ
では、位置８のプロリンコード化ＤＮＡがトレオニンを
コード化するように変異させられており、そしてセリン
コード化ＤＮＡがアルギニンをコード化するように変異
させられている）を、Ｅ３４変異（ＥＰ３５５４６０中
に記述）（ここでは、位置１８３と１９１のＤＮＡコー
ド化システインがグルタミン酸で置換されている）と組
み合わせる。従って、この得られるｒｐＳＴ遺伝子は、
該ｒｐＳＴのＤＮＡのＮＨ2−（Ｐ８ＴＳ１１Ｒ）およ
びＣＯＯＨ−コード化領域（Ｅ３４）の両方に変異を有
している。この得られるプラスミドをｐＲＯｐＳＴＥ−
Ｐ８ＴＳ１１Ｒと表示する。プラスミドｐＭＬ／ｐＧＨ
１８（これは、Ｐ８ＴＳ１１Ｒ二重変異を有している）
を、変化させるｒｐＳＴのＤＮＡ源として用いる以外、
ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ中と同じ方策を、ｐＲ
ＯｐＳＴＥ−Ｐ８ＴＳ１１Ｒの構築で用いる。
では、位置８のプロリンコード化ＤＮＡがトレオニンを
コード化するように変異させられており、そしてセリン
コード化ＤＮＡがアルギニンをコード化するように変異
させられている）を、Ｅ３４変異（ＥＰ３５５４６０中
に記述）（ここでは、位置１８３と１９１のＤＮＡコー
ド化システインがグルタミン酸で置換されている）と組
み合わせる。従って、この得られるｒｐＳＴ遺伝子は、
該ｒｐＳＴのＤＮＡのＮＨ2−（Ｐ８ＴＳ１１Ｒ）およ
びＣＯＯＨ−コード化領域（Ｅ３４）の両方に変異を有
している。この得られるプラスミドをｐＲＯｐＳＴＥ−
Ｐ８ＴＳ１１Ｒと表示する。プラスミドｐＭＬ／ｐＧＨ
１８（これは、Ｐ８ＴＳ１１Ｒ二重変異を有している）
を、変化させるｒｐＳＴのＤＮＡ源として用いる以外、
ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ中と同じ方策を、ｐＲ
ＯｐＳＴＥ−Ｐ８ＴＳ１１Ｒの構築で用いる。
【００７０】Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１１２Ｌ＋Ｅ３４およ
びＰ８ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１１２Ｌ＋Ｅ３４ 上述したＩ１１２Ｌのヘリックス３変異を、２つのヘリ
ックス１変異Ａ６ＴＳ１１ＲとＰ８ＴＳ１１ＲおよびＥ
３４変異の各々と組み合わせる。得られるプラスミドを
それぞれｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１
１２ＬおよびｐＭＬ／ｐＧＨ１８−ＳＸＥ−Ｉ１１２Ｌ
と表示する。Ｉ１１２Ｌ含有の小型ＢｓｓＨＩＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントと、ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ
１１Ｒから精製された大型のＢｓｓＨＩＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントとを結合させることによってｐＲＯｐ
ＳＴ−ＳＸＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１１２Ｌを構築す
る。この得られるプラスミドは、前述したヘリックス２
コード化ＤＮＡの５′および３′末端に隣接しているＳ
ａｃＩおよびＸｂａＩ制限部位によって限定されている
ヘリックス２カセットを有しているが、該Ｔ1Ｔ2転写タ
ーミネーターは有していない。Ｐ８ＴＳ１１Ｒ二重変異
を有する大型のフラグメント源としてプラスミドｐＭＬ
／ｐＧＨ１８を用いる以外は同じ様式で、プラスミドｐ
ＭＬ／ｐＧＨ１８−ＳＸＥ−Ｉ１１２Ｌを構築する。こ
の変化させられたプラスミドは該Ｔ1Ｔ2転写ターミネー
ターを有しておらず、そして該ヘリックス２カセットも
持っていない。
びＰ８ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１１２Ｌ＋Ｅ３４ 上述したＩ１１２Ｌのヘリックス３変異を、２つのヘリ
ックス１変異Ａ６ＴＳ１１ＲとＰ８ＴＳ１１ＲおよびＥ
３４変異の各々と組み合わせる。得られるプラスミドを
それぞれｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１
１２ＬおよびｐＭＬ／ｐＧＨ１８−ＳＸＥ−Ｉ１１２Ｌ
と表示する。Ｉ１１２Ｌ含有の小型ＢｓｓＨＩＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントと、ｐＲＯｐＳＴＥ−Ａ６ＴＳ
１１Ｒから精製された大型のＢｓｓＨＩＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントとを結合させることによってｐＲＯｐ
ＳＴ−ＳＸＥ−Ａ６ＴＳ１１Ｒ＋Ｉ１１２Ｌを構築す
る。この得られるプラスミドは、前述したヘリックス２
コード化ＤＮＡの５′および３′末端に隣接しているＳ
ａｃＩおよびＸｂａＩ制限部位によって限定されている
ヘリックス２カセットを有しているが、該Ｔ1Ｔ2転写タ
ーミネーターは有していない。Ｐ８ＴＳ１１Ｒ二重変異
を有する大型のフラグメント源としてプラスミドｐＭＬ
／ｐＧＨ１８を用いる以外は同じ様式で、プラスミドｐ
ＭＬ／ｐＧＨ１８−ＳＸＥ−Ｉ１１２Ｌを構築する。こ
の変化させられたプラスミドは該Ｔ1Ｔ2転写ターミネー
ターを有しておらず、そして該ヘリックス２カセットも
持っていない。
【００７１】実施例１４ 修飾された組換え型成長ホルモンの安定性概要 安定性の概要を測定するための方法は下記の通りであ
る。燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４（蒸留水１０００ｍＬ
中にＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ ３．４５ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4
３．５５ｇ、ＮａＣｌ ９．５０ｇを溶解）中の組換え
型（動物性）成長ホルモン誘導体（１００ｍｇ／ｍＬ以
下）の濃縮溶液を調製する。これをミリポアの無菌Mill
ex−０．２２μｍフィルター装置を通して濾過した後、
一定量０．１ｍＬを試験管に入れる。これらを４０℃の
オーブンに入れて、必要な間隔で取り出す。次に、この
内容物を燐酸塩緩衝食塩水で希釈する。この上澄み液
を、ＨＰＬＣでモノマーおよびダイマー含有量に関して
分析する。物質収支を取る。沈澱したいかなる材料も記
録する。結果を初期の濃度と比較することで、安定性の
概要を作成する。
る。燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４（蒸留水１０００ｍＬ
中にＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ ３．４５ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4
３．５５ｇ、ＮａＣｌ ９．５０ｇを溶解）中の組換え
型（動物性）成長ホルモン誘導体（１００ｍｇ／ｍＬ以
下）の濃縮溶液を調製する。これをミリポアの無菌Mill
ex−０．２２μｍフィルター装置を通して濾過した後、
一定量０．１ｍＬを試験管に入れる。これらを４０℃の
オーブンに入れて、必要な間隔で取り出す。次に、この
内容物を燐酸塩緩衝食塩水で希釈する。この上澄み液
を、ＨＰＬＣでモノマーおよびダイマー含有量に関して
分析する。物質収支を取る。沈澱したいかなる材料も記
録する。結果を初期の濃度と比較することで、安定性の
概要を作成する。
【００７２】代替として、ｐＨ７．４で低い溶解性を示
す成長ホルモン誘導体を、好ましくないｐＨ（４〜１
０）で溶解させるか、或は懸濁液として評価する。
す成長ホルモン誘導体を、好ましくないｐＨ（４〜１
０）で溶解させるか、或は懸濁液として評価する。
【００７３】変化させたｒｐＳＴ蛋白質に関する溶液安
定性試験の結果を表ＩＩＩに要約する。
定性試験の結果を表ＩＩＩに要約する。
【００７４】
【表４】
【００７５】溶解パーセントを、（溶液中に残存してい
る全体の画分）×１００として表す。（実施例１４参
照）。１回以上の測定を行った場合、平均溶解％で表
し、そして括弧内に個々の測定回数を示す。このｒｐＳ
Ｔ変異体は、Ａ３４もしくはＥ３４背景のどちらかに存
在している。Ａ３４のｒｐＳＴは、位置１８３と１９１
に、システインの代わりにアラニンを有している。Ｅ３
４のｒｐＳＴは、位置１８３と１９１に、システインの
代わりにグルタミン酸塩を有している。
る全体の画分）×１００として表す。（実施例１４参
照）。１回以上の測定を行った場合、平均溶解％で表
し、そして括弧内に個々の測定回数を示す。このｒｐＳ
Ｔ変異体は、Ａ３４もしくはＥ３４背景のどちらかに存
在している。Ａ３４のｒｐＳＴは、位置１８３と１９１
に、システインの代わりにアラニンを有している。Ｅ３
４のｒｐＳＴは、位置１８３と１９１に、システインの
代わりにグルタミン酸塩を有している。
【００７６】実施例１５ 組換え型（動物性）成長ホルモン誘導体を摂取した動物
の成長強化測定のためのハイポックス・ラット試験方法 動物の成長速度を変化させるための本発明の組換え型動
物性成長ホルモン誘導体の効果を、下垂体切除した（ハ
イポックス）ラット分析を用いて測定する。この下垂体
切除したラットは、それ自身の成長ホルモンを生産せ
ず、そして注射した成長ホルモンに対して敏感である。
測定する応答は、一定期間、例えば１０日間に渡る成長
であり、そしてこれらを、ｒｐＳＴの正の対照（これは
全て試行に含まれている）の生物学的活性パーセントと
して表ＩＶ中に表す。
の成長強化測定のためのハイポックス・ラット試験方法 動物の成長速度を変化させるための本発明の組換え型動
物性成長ホルモン誘導体の効果を、下垂体切除した（ハ
イポックス）ラット分析を用いて測定する。この下垂体
切除したラットは、それ自身の成長ホルモンを生産せ
ず、そして注射した成長ホルモンに対して敏感である。
測定する応答は、一定期間、例えば１０日間に渡る成長
であり、そしてこれらを、ｒｐＳＴの正の対照（これは
全て試行に含まれている）の生物学的活性パーセントと
して表ＩＶ中に表す。
【００７７】
【表５】
【００７８】実施例１６ 変化させた組換え型成長ホルモンが有するところの、イ
ンビトロで成長ホルモンレセプタに結合する能力を測定
するための肝臓放射受容体検定法 インビトロの放射受容体検定法を、本発明の組換え型成
長ホルモンが有するところの、精製した肝臓膜から得ら
れた成長ホルモン受容体との結合に対して125Ｉ−ｒｐ
ＳＴと競争する能力を評価するために用いる。これらの
評価の結果を、ｒｐＳＴ結合パーセントとして示し、そ
してこれらを表ＩＶに示す。
ンビトロで成長ホルモンレセプタに結合する能力を測定
するための肝臓放射受容体検定法 インビトロの放射受容体検定法を、本発明の組換え型成
長ホルモンが有するところの、精製した肝臓膜から得ら
れた成長ホルモン受容体との結合に対して125Ｉ−ｒｐ
ＳＴと競争する能力を評価するために用いる。これらの
評価の結果を、ｒｐＳＴ結合パーセントとして示し、そ
してこれらを表ＩＶに示す。
【００７９】実施例１７ ｒｐＳＴ変異体Ｉ１２２Ｌ＋Ｅ３４を用いて行った窒素
収支実験 このＩ１２２Ｌ変異を有する変化したｒｐＳＴ蛋白質の
生物学的活性をインビボで評価するため、ＥＰ３５５４
６０中に記述されているように、窒素収支実験を行う。
成長しているブタにｐＳＴを皮下投与すると、体内、主
に筋肉内に蓄積される蛋白質の量が上昇する。窒素収支
試験を使用することで、動物が蓄える蛋白質量の変化に
関する尺度が得られる。蛋白質は決まった量の窒素を含
有しているため、窒素に関して食餌および排出物を分析
することで、蛋白質の蓄積状態に関する正確な見積もり
が得られる。このように、窒素の収支は、餌中の消費さ
れた窒素の量そして尿およびふん中に排泄された量、並
びにその差から計算された保持（蓄積）量の尺度とな
る。窒素の保持を、消化された窒素量のパーセントとし
ての保持窒素量［（消費窒素）−（排出窒素）］として
正確に見積もる。この実験において、該ｒｐＳＴのＩ１
２２Ｌ変異体の位置１８３と１９１のシステイン残基を
グルタミン酸に置換した。この分析の結果、該ｒｐＳＴ
対照に比較して、この変化させたｒｐＳＴ分子は充分な
生物学的活性を示している。
収支実験 このＩ１２２Ｌ変異を有する変化したｒｐＳＴ蛋白質の
生物学的活性をインビボで評価するため、ＥＰ３５５４
６０中に記述されているように、窒素収支実験を行う。
成長しているブタにｐＳＴを皮下投与すると、体内、主
に筋肉内に蓄積される蛋白質の量が上昇する。窒素収支
試験を使用することで、動物が蓄える蛋白質量の変化に
関する尺度が得られる。蛋白質は決まった量の窒素を含
有しているため、窒素に関して食餌および排出物を分析
することで、蛋白質の蓄積状態に関する正確な見積もり
が得られる。このように、窒素の収支は、餌中の消費さ
れた窒素の量そして尿およびふん中に排泄された量、並
びにその差から計算された保持（蓄積）量の尺度とな
る。窒素の保持を、消化された窒素量のパーセントとし
ての保持窒素量［（消費窒素）−（排出窒素）］として
正確に見積もる。この実験において、該ｒｐＳＴのＩ１
２２Ｌ変異体の位置１８３と１９１のシステイン残基を
グルタミン酸に置換した。この分析の結果、該ｒｐＳＴ
対照に比較して、この変化させたｒｐＳＴ分子は充分な
生物学的活性を示している。
【００８０】実施例１８ 蛍光分光法を用いた熱安定性測定 変化させたｒｐＳＴの熱安定性は、温度の関数として、
固有のトリプトファン蛍光を測定することから推測され
る。このｒｐＳＴ分子は、「未変性状態」で激しく消光
させらる固有蛍光を有する単一トリプトファン残基を有
している。温度を上昇させるか、或はｐＨを低下させる
と、特徴的に蛍光の上昇が生じ、これは恐らくは、埋め
込まれているトリプトファン残基の少なくとも近隣で構
造の損失が生じるためであろう。温度上昇に対する蛍光
の「溶融図」によりＳ状曲線が得られ、ここでは、与え
られたｒｐＳＴ誘導体に特徴的な温度に到達するまで蛍
光は完全に消光されているままである。それに続いて、
比較的狭い温度範囲で、蛍光の鋭角な上昇が生じる。こ
の蛍光上昇の中間点の範囲を限定している温度をＴ(m)
と表示し、そしてこれは、蛋白質の熱安定性を反映して
いる。３５５ｎｍのカットオフフィルターを用いそして
励起波長および放出蛍光を読み取るため２９５ｎｍを用
いる以外、Burger他、１９６６の方法を用いて、本発明
のｒｐＳＴのＴ(m)を測定する。本発明のｒｐＳＴのＴ
(m)を表ＩＶに要約する。これらのデータは、Ｉ１２２
Ｌに関する７９℃のＴ(m)の顕著な上昇を示している。
固有のトリプトファン蛍光を測定することから推測され
る。このｒｐＳＴ分子は、「未変性状態」で激しく消光
させらる固有蛍光を有する単一トリプトファン残基を有
している。温度を上昇させるか、或はｐＨを低下させる
と、特徴的に蛍光の上昇が生じ、これは恐らくは、埋め
込まれているトリプトファン残基の少なくとも近隣で構
造の損失が生じるためであろう。温度上昇に対する蛍光
の「溶融図」によりＳ状曲線が得られ、ここでは、与え
られたｒｐＳＴ誘導体に特徴的な温度に到達するまで蛍
光は完全に消光されているままである。それに続いて、
比較的狭い温度範囲で、蛍光の鋭角な上昇が生じる。こ
の蛍光上昇の中間点の範囲を限定している温度をＴ(m)
と表示し、そしてこれは、蛋白質の熱安定性を反映して
いる。３５５ｎｍのカットオフフィルターを用いそして
励起波長および放出蛍光を読み取るため２９５ｎｍを用
いる以外、Burger他、１９６６の方法を用いて、本発明
のｒｐＳＴのＴ(m)を測定する。本発明のｒｐＳＴのＴ
(m)を表ＩＶに要約する。これらのデータは、Ｉ１２２
Ｌに関する７９℃のＴ(m)の顕著な上昇を示している。
【００８１】実施例１９ ポリメラーゼ鎖反応方法によるＩ１２２Ｌ変異の発生 SarkarおよびSommer（１９９０年）が記述したポリメラ
ーゼ鎖反応技術（ここでは参照にいれられる）の応用を
用い、部位特異的変異誘発により該Ｉ１２２Ｌ変異をｒ
ｐＳＴ遺伝子に導入する。使用する３つのオリゴヌクレ
オチドのプライマーを表Ｉに示し、そしてこれらにはＳ
ａｃＩ２９３、Ｌ１２０−３およびＰｖｕＩＩ６３４が
含まれる。プラスミドｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸから得られ
るｒｐＳＴ遺伝子含有ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントを鋳型として用いる。製造業者の指示に従っ
て、各々１μｍのＬ１２０−３およびＰｖｕＩＩ６３４
オリゴヌクレオチドプライマー、ｄＮＴＰおよびＴａｑ
のＤＮＡポリメラーゼを用いて、１５サイクルのポリメ
ラーゼ鎖反応（以降ＰＣＲと呼ぶ）を１ｎｇの鋳型ｒｐ
ＳＴのＤＮＡに対して行う。この反応の結果、２２７ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントが得られ、これは該Ｉ１２２Ｌ
変異を有している。アガロースゲル電気泳動によりこの
フラグメントを精製した後、追加的１５サイクルのＰＣ
Ｒで、オリゴヌクレオチドのプライマーＳａｃＩ２９３
およびｒｐＳＴ含有ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ鋳型フ
ラグメントと一緒に、ＰＣＲプライマーとして用いる。
得られる３６１ｂｐのフラグメントを、制限エンドヌク
レアーゼＳａｃＩおよびＰｖｕＩＩで開裂させ、アガロ
ースゲル電気泳動で精製した後、連結させて、ゲル精製
した大型のＳａｃＩ／ＰｖｕＩＩ ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
Ｘ ＤＮＡフラグメントを生じさせる。この連結反応混
合物を受容能力のあるＨＢ１０１細胞に形質転換する。
放射能標識した雑種形成用プローブとしてオリゴヌクレ
オチドＬ１２０−３を用い、そして１回のみのスクリー
ニングを行う以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全
く同様にして、該Ｉ１２２Ｌ変異の存在に関してその得
られる形質転換体のプラスミドＤＮＡをスクリーニング
する。このＩ１２２Ｌ変異が存在していること、そして
該ＰＣＲ反応によって導入された追加的変異が存在して
いないことを、ＤＮＡ配列決定分析により確認する。こ
の変異を有するプラスミドをｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ
１２２ＬPCRと表示する。
ーゼ鎖反応技術（ここでは参照にいれられる）の応用を
用い、部位特異的変異誘発により該Ｉ１２２Ｌ変異をｒ
ｐＳＴ遺伝子に導入する。使用する３つのオリゴヌクレ
オチドのプライマーを表Ｉに示し、そしてこれらにはＳ
ａｃＩ２９３、Ｌ１２０−３およびＰｖｕＩＩ６３４が
含まれる。プラスミドｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸから得られ
るｒｐＳＴ遺伝子含有ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントを鋳型として用いる。製造業者の指示に従っ
て、各々１μｍのＬ１２０−３およびＰｖｕＩＩ６３４
オリゴヌクレオチドプライマー、ｄＮＴＰおよびＴａｑ
のＤＮＡポリメラーゼを用いて、１５サイクルのポリメ
ラーゼ鎖反応（以降ＰＣＲと呼ぶ）を１ｎｇの鋳型ｒｐ
ＳＴのＤＮＡに対して行う。この反応の結果、２２７ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントが得られ、これは該Ｉ１２２Ｌ
変異を有している。アガロースゲル電気泳動によりこの
フラグメントを精製した後、追加的１５サイクルのＰＣ
Ｒで、オリゴヌクレオチドのプライマーＳａｃＩ２９３
およびｒｐＳＴ含有ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ鋳型フ
ラグメントと一緒に、ＰＣＲプライマーとして用いる。
得られる３６１ｂｐのフラグメントを、制限エンドヌク
レアーゼＳａｃＩおよびＰｖｕＩＩで開裂させ、アガロ
ースゲル電気泳動で精製した後、連結させて、ゲル精製
した大型のＳａｃＩ／ＰｖｕＩＩ ｐＧＥＭｐＳＴ−Ｓ
Ｘ ＤＮＡフラグメントを生じさせる。この連結反応混
合物を受容能力のあるＨＢ１０１細胞に形質転換する。
放射能標識した雑種形成用プローブとしてオリゴヌクレ
オチドＬ１２０−３を用い、そして１回のみのスクリー
ニングを行う以外、Ｌ１１８Ｅに関して記述したのと全
く同様にして、該Ｉ１２２Ｌ変異の存在に関してその得
られる形質転換体のプラスミドＤＮＡをスクリーニング
する。このＩ１２２Ｌ変異が存在していること、そして
該ＰＣＲ反応によって導入された追加的変異が存在して
いないことを、ＤＮＡ配列決定分析により確認する。こ
の変異を有するプラスミドをｐＧＥＭｐＳＴ−ＳＸ−Ｉ
１２２ＬPCRと表示する。
【００８２】実施例２０ 酵母菌中での発現に適切なプラスミドへのｒｐＳＴ変異
Ｉ１２２Ｌの再構築 酵母菌であるビール酵母菌（Saccharomyces cerevisia
e）中でＩ１２２Ｌ変異含有ｒｐＳＴ遺伝子を発現させ
るため、使用可能なように、この酵母菌から誘導される
プロモーター配列に該ｒｐＳＴコード化ＤＮＡを結合さ
せる必要がある。ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用い
てこのプラスミドを開裂させた後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大型クレノウフラグメントを用いてこのＤＮＡを処
理することにより、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｉ１２２Ｌ
から得られるｒｐＳＴを有する小型のＮｄｅＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントの末端を活性化する。このフラグ
メントをゲル電気泳動で精製した後、ＹＥｐ３５２−２
であるところの、プラスミドの大型ＳａｌＩ／ＳｐｈＩ
フラグメントと連結させる。この後者のフラグメントの
末端をＳ１ヌクレアーゼで処理することにより活性化す
る。このプラスミドはＹＥｐ３５２誘導体（これは修飾
されて、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター（John
stonおよびDavis、１９８４）、そしてＳＴＥ７遺伝子
（Teague他、１９８６）から誘導された３′未翻訳領域
を追加的に有している）である。この得られるプラスミ
ドをＹＥｐ３５２−ｐｓＴ−Ｉ１２２Ｌと表示する（図
５）。
Ｉ１２２Ｌの再構築 酵母菌であるビール酵母菌（Saccharomyces cerevisia
e）中でＩ１２２Ｌ変異含有ｒｐＳＴ遺伝子を発現させ
るため、使用可能なように、この酵母菌から誘導される
プロモーター配列に該ｒｐＳＴコード化ＤＮＡを結合さ
せる必要がある。ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用い
てこのプラスミドを開裂させた後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大型クレノウフラグメントを用いてこのＤＮＡを処
理することにより、ｐＲＯｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｉ１２２Ｌ
から得られるｒｐＳＴを有する小型のＮｄｅＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントの末端を活性化する。このフラグ
メントをゲル電気泳動で精製した後、ＹＥｐ３５２−２
であるところの、プラスミドの大型ＳａｌＩ／ＳｐｈＩ
フラグメントと連結させる。この後者のフラグメントの
末端をＳ１ヌクレアーゼで処理することにより活性化す
る。このプラスミドはＹＥｐ３５２誘導体（これは修飾
されて、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター（John
stonおよびDavis、１９８４）、そしてＳＴＥ７遺伝子
（Teague他、１９８６）から誘導された３′未翻訳領域
を追加的に有している）である。この得られるプラスミ
ドをＹＥｐ３５２−ｐｓＴ−Ｉ１２２Ｌと表示する（図
５）。
【００８３】酵母菌中でのこのｒｐＳＴ変異体の発現
は、このプラスミドを用いて形質転換した酵母菌細胞
を、ウラシルを含有せずそして単一炭素源として２％の
ガラクトースを含有している合成完全媒体（Sherman、 F
inkおよびHilks、１９８６）中、３０℃で数時間培養す
ることで達成されるか、さもなければ、最大限のｒｐＳ
Ｔ遺伝子誘発およびｒｐＳＴ生産を達成する必要があ
る。ＵＲＡ３遺伝子中の変異を有するいかなる酵母菌株
も宿主として使用できるが、プロテアーゼ生産が不足し
ておりそしてＢＪ５４５７（遺伝子型ＭＡＴα ｐｅｐ
４：：ＨＩＳ３ ｐｒｂ１−△ ｔｒｐ１ ｕｒａ３−５
２ ｌｅｕ２−△ ｈｉｓ３−△ ｌｙｓ２−８０１ ｃａ
ｎ１ ＧＡＬ＋）の如きＧＡＬ＋である酵母菌株を用い
るのが好適である。この株は、Yeast Genetic Stock Ce
nter、 University of CaliforniaにＢＪ５４５７として
寄託してある。
は、このプラスミドを用いて形質転換した酵母菌細胞
を、ウラシルを含有せずそして単一炭素源として２％の
ガラクトースを含有している合成完全媒体（Sherman、 F
inkおよびHilks、１９８６）中、３０℃で数時間培養す
ることで達成されるか、さもなければ、最大限のｒｐＳ
Ｔ遺伝子誘発およびｒｐＳＴ生産を達成する必要があ
る。ＵＲＡ３遺伝子中の変異を有するいかなる酵母菌株
も宿主として使用できるが、プロテアーゼ生産が不足し
ておりそしてＢＪ５４５７（遺伝子型ＭＡＴα ｐｅｐ
４：：ＨＩＳ３ ｐｒｂ１−△ ｔｒｐ１ ｕｒａ３−５
２ ｌｅｕ２−△ ｈｉｓ３−△ ｌｙｓ２−８０１ ｃａ
ｎ１ ＧＡＬ＋）の如きＧＡＬ＋である酵母菌株を用い
るのが好適である。この株は、Yeast Genetic Stock Ce
nter、 University of CaliforniaにＢＪ５４５７として
寄託してある。
【００８４】文献 １．Abdel-Meguid他、(１９８７）、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ８４、６４３４-６４３７。
Sci. USA ８４、６４３４-６４３７。
【００８５】２．Brems、 Biochemistry ２７、４５４１
-４５４６（１９８８）。
-４５４６（１９８８）。
【００８６】３．Brems他、（１９８６）、Biochemistr
y ２５、６５３９-６５４３ ４．Brems他、（１９８８）、Proc. Natl. Acad.Sci. U
SA ８４、３３６７-３３７１。
y ２５、６５３９-６５４３ ４．Brems他、（１９８８）、Proc. Natl. Acad.Sci. U
SA ８４、３３６７-３３７１。
【００８７】５．Burger, H.G.、 Edelhoch, H.およびCo
ndliffe, P.G.、（１９６６） Endocrinology ７８、９
８-１０２。
ndliffe, P.G.、（１９６６） Endocrinology ７８、９
８-１０２。
【００８８】６．Chen, W.Y.他、 （１９９０）、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA ８７、５０６１-５０６５。
Natl. Acad. Sci. USA ８７、５０６１-５０６５。
【００８９】７．JohnstonおよびDavis、（１９８４）M
oledular and Cellular Biology４、１４４０-１４４
８。
oledular and Cellular Biology４、１４４０-１４４
８。
【００９０】８．SarkarおよびSommer、 Biotechniques
８、４０４-４０７（１９９０）。
８、４０４-４０７（１９９０）。
【００９１】９．Teague他（１９８６）、 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ８３、７３７１-７３７５。
Acad. Sci. USA ８３、７３７１-７３７５。
【００９２】１０．Sherman, F.、 Fink, G.R.およびHic
ks, J.B. （１９８６）「酵母菌遺伝学における方法の
ための実験室過程マニュアル」（Laboratory Course Ma
nual for methods in Yeast genetics）、Cold Spring
Harbor Laboratory、 Cold Spring Harbor、 NY １６３-
１６８頁。
ks, J.B. （１９８６）「酵母菌遺伝学における方法の
ための実験室過程マニュアル」（Laboratory Course Ma
nual for methods in Yeast genetics）、Cold Spring
Harbor Laboratory、 Cold Spring Harbor、 NY １６３-
１６８頁。
【００９３】配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願者： Deborah Tardy Chaleff （ｉｉ）発明の名称： アルファ−ヘリックス３領域、
アルファ−ヘリックス２領域における変化、それらの組
み合わせ、並びに他の変異との組み合わせを有する成長
ホルモン類 （ｉｉｉ）配列の数： １ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）住所： Estelle J. Tsevdos、 American Cyanami
d Company （Ｂ）通り： １９３７ West Main Street、 P.O.Box
６０ （Ｃ）市： Stamford （Ｄ）州： Connecticut （Ｅ）国： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： 06904 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）媒体種類： フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ ＰＣ ＡＴ （Ｃ）作動システム： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア： IBMディスプレイライト４から
変換したASCII （ｖｉ）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先願出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人／代理人情報： （Ａ）名前： Tsevdos, Estelle J. （Ｂ）登録番号： ３１,１４５ （Ｃ）参照／処理予定事項番号： ３１,２９７-００ （ｉｘ）遠隔通信情報： （Ａ）電話： ２０３ ３２１ ２７５６ （Ｂ）テレファックス： ２０３ ３２１ ２９７１ （Ｃ）テレックス： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ： １９３ （Ｂ）種類： 核酸 （Ｃ）ストランド性： 単一 （Ｄ）トポロジー： 線状 （ｉｉ）分子の種類： （ｉｉｉ）仮説： （ｉｖ）アンチ−センス： （ｖ）フラグメントの種類： （ｖｉ）オリジナル源： （Ａ）有機体： （Ｂ）株： （Ｃ）個々の単離： （Ｄ）発生段階： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）細胞系： （Ｉ）小器官： （ｖｉｉ）直接源： （Ａ）収集： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムの位置： （Ａ）クロモゾーム／セグメント： （Ｂ）マップの位置： （Ｃ）単位： （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／鍵： （Ｂ）位置： （Ｃ）同定方法： （Ｄ）他の情報： （ｘ）公開情報： （Ａ）著者： （Ｂ）名称： （Ｃ）雑誌： （Ｄ）巻： （Ｅ）発行： （Ｆ）頁： （Ｇ）日付： （Ｈ）書類番号： （Ｉ）出願日： （Ｊ）公開日： （Ｋ）関係する他の情報： （ｘｉ）配列記述： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １：
アルファ−ヘリックス２領域における変化、それらの組
み合わせ、並びに他の変異との組み合わせを有する成長
ホルモン類 （ｉｉｉ）配列の数： １ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）住所： Estelle J. Tsevdos、 American Cyanami
d Company （Ｂ）通り： １９３７ West Main Street、 P.O.Box
６０ （Ｃ）市： Stamford （Ｄ）州： Connecticut （Ｅ）国： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： 06904 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）媒体種類： フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ ＰＣ ＡＴ （Ｃ）作動システム： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア： IBMディスプレイライト４から
変換したASCII （ｖｉ）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先願出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人／代理人情報： （Ａ）名前： Tsevdos, Estelle J. （Ｂ）登録番号： ３１,１４５ （Ｃ）参照／処理予定事項番号： ３１,２９７-００ （ｉｘ）遠隔通信情報： （Ａ）電話： ２０３ ３２１ ２７５６ （Ｂ）テレファックス： ２０３ ３２１ ２９７１ （Ｃ）テレックス： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ： １９３ （Ｂ）種類： 核酸 （Ｃ）ストランド性： 単一 （Ｄ）トポロジー： 線状 （ｉｉ）分子の種類： （ｉｉｉ）仮説： （ｉｖ）アンチ−センス： （ｖ）フラグメントの種類： （ｖｉ）オリジナル源： （Ａ）有機体： （Ｂ）株： （Ｃ）個々の単離： （Ｄ）発生段階： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）細胞系： （Ｉ）小器官： （ｖｉｉ）直接源： （Ａ）収集： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムの位置： （Ａ）クロモゾーム／セグメント： （Ｂ）マップの位置： （Ｃ）単位： （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／鍵： （Ｂ）位置： （Ｃ）同定方法： （Ｄ）他の情報： （ｘ）公開情報： （Ａ）著者： （Ｂ）名称： （Ｃ）雑誌： （Ｄ）巻： （Ｅ）発行： （Ｆ）頁： （Ｇ）日付： （Ｈ）書類番号： （Ｉ）出願日： （Ｊ）公開日： （Ｋ）関係する他の情報： （ｘｉ）配列記述： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １：
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。
ある。
【００９７】１． 成長ホルモンのアルファ−ヘリック
ス３領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤に
おける生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長
ホルモンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモン
（somatotropin）。
ス３領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤に
おける生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長
ホルモンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモン
（somatotropin）。
【００９８】２． 上記成長ホルモンがヒト、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホルモ
ンである第１項記載の成長ホルモン。
タ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホルモ
ンである第１項記載の成長ホルモン。
【００９９】３． 上記アルファ−ヘリックス３の変異
がＩ１２２Ｌ、Ｌ１１５Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、Ｌ１１５ＫＬ
１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１８Ｋ、Ｌ１
１８ＥＩ１２２Ｋ、Ｉ１２２Ｅ、Ｅ１１９ＬＱ１２３
Ｌ、Ｍ１２６Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１２１Ａ、Ｋ１１４
Ｒ、Ｋ１１６Ｒ、Ｉ１２２ＬＭ１２６ＡまたはＩ１２２
ＬＬ１１８Ａから成る第２項記載の成長ホルモン。
がＩ１２２Ｌ、Ｌ１１５Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、Ｌ１１５ＫＬ
１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１８Ｋ、Ｌ１
１８ＥＩ１２２Ｋ、Ｉ１２２Ｅ、Ｅ１１９ＬＱ１２３
Ｌ、Ｍ１２６Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１２１Ａ、Ｋ１１４
Ｒ、Ｋ１１６Ｒ、Ｉ１２２ＬＭ１２６ＡまたはＩ１２２
ＬＬ１１８Ａから成る第２項記載の成長ホルモン。
【０１００】４． 上記アルファ−ヘリックス３の変異
がＩ１２２Ｌである第３項記載の成長ホルモン。
がＩ１２２Ｌである第３項記載の成長ホルモン。
【０１０１】５． 上記成長ホルモンがブタまたはウシ
の成長ホルモンである第４項記載の成長ホルモン。
の成長ホルモンである第４項記載の成長ホルモン。
【０１０２】６． 上記成長ホルモンがブタの成長ホル
モンである第５項記載の成長ホルモン。
モンである第５項記載の成長ホルモン。
【０１０３】７． 成長ホルモンのアルファ−ヘリック
ス２領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤に
おける生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長
ホルモンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモ
ン。
ス２領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤に
おける生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長
ホルモンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモ
ン。
【０１０４】８． 上記成長ホルモンがヒト、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホルモ
ンである第７項記載の成長ホルモン。
タ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホルモ
ンである第７項記載の成長ホルモン。
【０１０５】９． 上記アルファ−ヘリックス２の変異
がＳ８１、８７ＬまたはＬ８２、８４Ｑである第８項記
載の成長ホルモン。
がＳ８１、８７ＬまたはＬ８２、８４Ｑである第８項記
載の成長ホルモン。
【０１０６】１０． 上記成長ホルモンがブタまたはウ
シの成長ホルモンである第９項記載の成長ホルモン。
シの成長ホルモンである第９項記載の成長ホルモン。
【０１０７】１１． 上記成長ホルモンがブタの成長ホ
ルモンである第１０項記載の成長ホルモン。
ルモンである第１０項記載の成長ホルモン。
【０１０８】１２． アルファ−ヘリックス２領域中の
上記成長ホルモンの変異を更に含む第１項記載の成長ホ
ルモン。
上記成長ホルモンの変異を更に含む第１項記載の成長ホ
ルモン。
【０１０９】１３． 上記成長ホルモンがヒト、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホル
モンである第１２項記載の成長ホルモン。
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホル
モンである第１２項記載の成長ホルモン。
【０１１０】１４． 上記アルファ−ヘリックス２の変
異がＳ８１、８７ＬまたはＬ８２、８４Ｑである第１３
項記載の成長ホルモン。
異がＳ８１、８７ＬまたはＬ８２、８４Ｑである第１３
項記載の成長ホルモン。
【０１１１】１５． 上記アルファ−ヘリックス３の変
異がＩ１２２Ｌ、Ｌ１１５Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、Ｌ１１５Ｋ
Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１８Ｋ、Ｌ
１１８ＥＩ１２２Ｋ、Ｉ１２２Ｅ、Ｅ１１９ＬＱ１２３
Ｌ、Ｍ１２６Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１２１Ａ、Ｋ１１４
Ｒ、Ｋ１１６Ｒ、Ｉ１２２ＬＭ１２６ＡまたはＩ１２２
ＬＬ１１８Ａから成る第１４項記載の成長ホルモン。
異がＩ１２２Ｌ、Ｌ１１５Ｅ、Ｌ１１５Ｋ、Ｌ１１５Ｋ
Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｅ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１８Ｋ、Ｌ
１１８ＥＩ１２２Ｋ、Ｉ１２２Ｅ、Ｅ１１９ＬＱ１２３
Ｌ、Ｍ１２６Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１２１Ａ、Ｋ１１４
Ｒ、Ｋ１１６Ｒ、Ｉ１２２ＬＭ１２６ＡまたはＩ１２２
ＬＬ１１８Ａから成る第１４項記載の成長ホルモン。
【０１１２】１６． 上記アルファ−ヘリックス３の変
異がＩ１２２Ｌである第１５項記載の成長ホルモン。
異がＩ１２２Ｌである第１５項記載の成長ホルモン。
【０１１３】１７． 位置１８３と１９１のシステイン
がグルタミン酸で置換されている第１項記載の成長ホル
モン。
がグルタミン酸で置換されている第１項記載の成長ホル
モン。
【０１１４】１８． ４個のシステイン、即ち小さいル
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第１項記載の成長ホルモン。
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第１項記載の成長ホルモン。
【０１１５】１９． ４個のシステインをシステイン酸
に変化させた第１項記載の成長ホルモン。
に変化させた第１項記載の成長ホルモン。
【０１１６】２０． 位置１８３と１９１のシステイン
がグルタミン酸で置換されている第４項記載の成長ホル
モン。
がグルタミン酸で置換されている第４項記載の成長ホル
モン。
【０１１７】２１． ４個のシステイン、即ち小さいル
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第４項記載の成長ホルモン。
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第４項記載の成長ホルモン。
【０１１８】２２． ４個のシステインをシステイン酸
に変化させた第４項記載の成長ホルモン。
に変化させた第４項記載の成長ホルモン。
【０１１９】２３． 位置１８３と１９１のシステイン
がグルタミン酸で置換されている第７項記載の成長ホル
モン。
がグルタミン酸で置換されている第７項記載の成長ホル
モン。
【０１２０】２４． ４個のシステイン、即ち小さいル
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第７項記載の成長ホルモン。
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第７項記載の成長ホルモン。
【０１２１】２５． ４個のシステインをシステイン酸
に変化させた第７項記載の成長ホルモン。
に変化させた第７項記載の成長ホルモン。
【０１２２】２６． 位置１８３と１９１のシステイン
がグルタミン酸で置換されている第１２項記載の成長ホ
ルモン。
がグルタミン酸で置換されている第１２項記載の成長ホ
ルモン。
【０１２３】２７． ４個のシステイン、即ち小さいル
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第１２項記載の成長ホルモ
ン。
ープ中の２つおよび大きいループ中の２つ、の中の少な
くとも１つが欠失している第１２項記載の成長ホルモ
ン。
【０１２４】２８． ４個のシステインをシステイン酸
に変化させた第１２項記載の成長ホルモン。
に変化させた第１２項記載の成長ホルモン。
【０１２５】２９． 合成オリゴヌクレオチド（これ
は、このＤＮＡの一部に相補性を示し、そして上記オリ
ゴヌクレオチドは上記ＤＮＡに対して不適正領域を有し
ている）にアニールされた一本鎖ＤＮＡを作り出すこと
でＤＮＡセグメントをクローン化し；上記ＤＮＡを２本
鎖にし；上記２本鎖ＤＮＡをクローン化用の適当な宿主
に形質転換し；上記オリゴヌクレオチド雑種形成に相当
する変異した配列を選択し；上記選択された配列を発現
プラスミドに再構築し；そして上記の得られる組換え誘
導された蛋白質もしくはポリペプチドを発現させる；こ
とから成る、組換え誘導された蛋白質もしくはポリペプ
チドに関して、部位特異的変異誘発を行うための方法。
は、このＤＮＡの一部に相補性を示し、そして上記オリ
ゴヌクレオチドは上記ＤＮＡに対して不適正領域を有し
ている）にアニールされた一本鎖ＤＮＡを作り出すこと
でＤＮＡセグメントをクローン化し；上記ＤＮＡを２本
鎖にし；上記２本鎖ＤＮＡをクローン化用の適当な宿主
に形質転換し；上記オリゴヌクレオチド雑種形成に相当
する変異した配列を選択し；上記選択された配列を発現
プラスミドに再構築し；そして上記の得られる組換え誘
導された蛋白質もしくはポリペプチドを発現させる；こ
とから成る、組換え誘導された蛋白質もしくはポリペプ
チドに関して、部位特異的変異誘発を行うための方法。
【０１２６】３０． 上記オリゴヌクレオチドが、上記
変異の部位に、或はその近くに制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を有する第２９項記載の方法。
変異の部位に、或はその近くに制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を有する第２９項記載の方法。
【０１２７】３１． 制限エンドヌクレアーゼ認識部位
を有する上記クローンを所望の制限エンドヌクレアーゼ
で消化させる第３０項記載の方法。
を有する上記クローンを所望の制限エンドヌクレアーゼ
で消化させる第３０項記載の方法。
【０１２８】３２． 上記組換え誘導された蛋白質もし
くはポリペプチドが成長ホルモンである第３１項記載の
方法。
くはポリペプチドが成長ホルモンである第３１項記載の
方法。
【０１２９】３３． 上記成長ホルモンがヒト、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホル
モンである第３２項記載の方法。
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、魚類または鳥類の成長ホル
モンである第３２項記載の方法。
【０１３０】３４． 上記オリゴヌクレオチドがＳａｃ
Ｉ２９３、Ｘｂａ１３５３、Ｓ８１Ｌ、Ｓ８７Ｌ、Ｑ８
０８２、Ｋ１１３、Ｅ１１６、Ｋ１１３Ｅ１１６、Ｅ１
１６Ｋ１２０、Ｅ１２０、Ｌ１２０−３、Ａ１２４−
２、Ｅ１１３ＥＨＤＱ１１６、Ｅ１１３Ｄ、Ｌ１１５
Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｌ１１８ＴＫ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１
７，１２１、Ｌｅｕ１１７１２１Ｄ、Ｋ１１４Ｒ／Ａｃ
ｃＩ、Ｇ１２１Ａ／ＸｍｎＩ、Ｋ１１６Ｒ／Ｂｇ１Ｉ
Ｉ、Ａ１４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ａ６Ｔ、Ｓ１１ＲＡ１
４Ｄ／Ｓａｌ、Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ／ＣｌａＩまたはＰｖ
ｕＩＩ６３４である第３３項記載の方法。
Ｉ２９３、Ｘｂａ１３５３、Ｓ８１Ｌ、Ｓ８７Ｌ、Ｑ８
０８２、Ｋ１１３、Ｅ１１６、Ｋ１１３Ｅ１１６、Ｅ１
１６Ｋ１２０、Ｅ１２０、Ｌ１２０−３、Ａ１２４−
２、Ｅ１１３ＥＨＤＱ１１６、Ｅ１１３Ｄ、Ｌ１１５
Ａ、Ｌ１１８Ａ、Ｌ１１８ＴＫ、Ｌ１１８Ｔ、Ｌ１１
７，１２１、Ｌｅｕ１１７１２１Ｄ、Ｋ１１４Ｒ／Ａｃ
ｃＩ、Ｇ１２１Ａ／ＸｍｎＩ、Ｋ１１６Ｒ／Ｂｇ１Ｉ
Ｉ、Ａ１４Ｄ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ａ６Ｔ、Ｓ１１ＲＡ１
４Ｄ／Ｓａｌ、Ｑ２１ＨＨ２２Ｒ／ＣｌａＩまたはＰｖ
ｕＩＩ６３４である第３３項記載の方法。
【図１】 組換え型ブタの成長ホルモン（ｒｐＳＴ）Ｄ
ＮＡの制限マップ。幅広い線は、ｒｐＳＴＤＮＡのアミ
ノ酸コード化部分を表しており、そして細い線は、５’
および３’の側面にある非コード化ＤＮＡ配列を表して
いる。部位特異的変異誘発を受けさせるｒｐＳＴ遺伝子
の領域を、この制限マップの下に記入した番号で示し、
そして番号１はα−ヘリックス１をコード化するＤＮＡ
を表し、番号２はα−ヘリックスをコード化するＤＮＡ
を表し、番号３はα−ヘリックス３をコード化するＤＮ
Ａを表し、そして番号４は、位置１８３と１９１に存在
しているシステインをコード化するＤＮＡを表してい
る。このマップの上部に示した文字は、種々の制限エン
ドヌクレアーゼの制限部位の位置を表しており、ここ
で、ＲＩ＝ＥｃｏＲＩ、Ｎ＝ＮｄｅＩ、Ｂ＝ＢｓｓＨＩ
Ｉ、Ｓ＝ＳａｃＩ、Ｘ＝ＸｂａＩ、Ｓｍ＝ＳｍａＩおよ
びＨ＝ＨｉｎｄＩＩＩである。
ＮＡの制限マップ。幅広い線は、ｒｐＳＴＤＮＡのアミ
ノ酸コード化部分を表しており、そして細い線は、５’
および３’の側面にある非コード化ＤＮＡ配列を表して
いる。部位特異的変異誘発を受けさせるｒｐＳＴ遺伝子
の領域を、この制限マップの下に記入した番号で示し、
そして番号１はα−ヘリックス１をコード化するＤＮＡ
を表し、番号２はα−ヘリックスをコード化するＤＮＡ
を表し、番号３はα−ヘリックス３をコード化するＤＮ
Ａを表し、そして番号４は、位置１８３と１９１に存在
しているシステインをコード化するＤＮＡを表してい
る。このマップの上部に示した文字は、種々の制限エン
ドヌクレアーゼの制限部位の位置を表しており、ここ
で、ＲＩ＝ＥｃｏＲＩ、Ｎ＝ＮｄｅＩ、Ｂ＝ＢｓｓＨＩ
Ｉ、Ｓ＝ＳａｃＩ、Ｘ＝ＸｂａＩ、Ｓｍ＝ＳｍａＩおよ
びＨ＝ＨｉｎｄＩＩＩである。
【図２】 プラスミドｐＥＦＦ−９０２の構造および制
限マップ。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点
（Ｏｒｉ）および耐アンピシリン遺伝子、バクテリオフ
ァージλからのλＰLプロモーター、ｃＩＩリボソーム
結合部位およびｃＩ抑制因子遺伝子、大腸菌（E. col
i）のｒｒｎＢオペロンからのＴ1Ｔ2転写ターミネータ
ー、プロモーター無しのデオ（deo）調節領域からの６
０個塩基対の配列、そしてｐＧＨとして表されるｒｐＳ
Ｔ遺伝子を有している。関係した制限部位が示されてい
る。本文中に記述するように、このプラスミドをＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理して該ｒｐＳＴ含有Ｄ
ＮＡを切除した後、誘発変異ベクターｐＧＥＭ３ｚ（ｆ
＋）にクローン化する。
限マップ。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点
（Ｏｒｉ）および耐アンピシリン遺伝子、バクテリオフ
ァージλからのλＰLプロモーター、ｃＩＩリボソーム
結合部位およびｃＩ抑制因子遺伝子、大腸菌（E. col
i）のｒｒｎＢオペロンからのＴ1Ｔ2転写ターミネータ
ー、プロモーター無しのデオ（deo）調節領域からの６
０個塩基対の配列、そしてｐＧＨとして表されるｒｐＳ
Ｔ遺伝子を有している。関係した制限部位が示されてい
る。本文中に記述するように、このプラスミドをＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理して該ｒｐＳＴ含有Ｄ
ＮＡを切除した後、誘発変異ベクターｐＧＥＭ３ｚ（ｆ
＋）にクローン化する。
【図３】 ｐＧＨＧＥＭ３Ｚの構造および部分的制限マ
ップ。このファージミドはｆ１ ＤＮＡ複製起点、ｐＢ
Ｒ３２２複製起点（Ｏｒｉ）および耐アンピシリン遺伝
子、ＳＰ６およびＴ７プロモーター、バクテリオファー
ジλからのｌａｃＺ遺伝子ｃＩＩリボソーム結合部位、
そしてｐＧＨとして表されるｒｐＳＴ遺伝子を有してい
る。本文中で記述するように、部位特異的変異誘発のた
めの鋳型として一本鎖ファージミドＤＮＡを用いる。
ップ。このファージミドはｆ１ ＤＮＡ複製起点、ｐＢ
Ｒ３２２複製起点（Ｏｒｉ）および耐アンピシリン遺伝
子、ＳＰ６およびＴ７プロモーター、バクテリオファー
ジλからのｌａｃＺ遺伝子ｃＩＩリボソーム結合部位、
そしてｐＧＨとして表されるｒｐＳＴ遺伝子を有してい
る。本文中で記述するように、部位特異的変異誘発のた
めの鋳型として一本鎖ファージミドＤＮＡを用いる。
【図４】 バクテリア（大腸菌）中で組換え型のウシの
成長遺伝子を製造するために、バクテリアの発現プラス
ミドｐＲＯｐＳＴを用いる。ｃＩＩリポソーム結合部位
は、ＥｃｏＲＩ制限部位とＮｄｅＩ制限部位との間に位
置している。ｒｐＳＴのための翻訳開始コドンは該Ｎｄ
ｅＩ部位に埋め込まれている。発現は該λＰLプロモー
ターによって推進される。
成長遺伝子を製造するために、バクテリアの発現プラス
ミドｐＲＯｐＳＴを用いる。ｃＩＩリポソーム結合部位
は、ＥｃｏＲＩ制限部位とＮｄｅＩ制限部位との間に位
置している。ｒｐＳＴのための翻訳開始コドンは該Ｎｄ
ｅＩ部位に埋め込まれている。発現は該λＰLプロモー
ターによって推進される。
【図５】 酵母の発現プラスミドＹＥｐ３５２−ｐＳＴ
−Ｉ１２２Ｌの構造。このプラスミドはＹＥｐ３５２の
誘導体であり、そしてこれは、ｒｐＳＴ変異、即ちＩ１
２２Ｌ（この発現は、ビール酵母菌（S. cerevisiae）
からの誘発性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターにより
推進される）を有している。この３’未翻訳ＤＮＡは、
酵母ＳＴＥ７遺伝子から誘導される。この２μｍの要素
は、酵母中でのプラスミド複製を支持し、そしてこのＵ
ＲＡ３は、酵母中での形質転換体選択のための選択可能
マーカーを与える。このプラスミドはまた、複製のｐＢ
Ｒ３２２起点（示されていない）および耐アンピシリン
遺伝子を有している。
−Ｉ１２２Ｌの構造。このプラスミドはＹＥｐ３５２の
誘導体であり、そしてこれは、ｒｐＳＴ変異、即ちＩ１
２２Ｌ（この発現は、ビール酵母菌（S. cerevisiae）
からの誘発性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターにより
推進される）を有している。この３’未翻訳ＤＮＡは、
酵母ＳＴＥ７遺伝子から誘導される。この２μｍの要素
は、酵母中でのプラスミド複製を支持し、そしてこのＵ
ＲＡ３は、酵母中での形質転換体選択のための選択可能
マーカーを与える。このプラスミドはまた、複製のｐＢ
Ｒ３２２起点（示されていない）および耐アンピシリン
遺伝子を有している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (3)
- 【請求項１】 成長ホルモンのアルファ−ヘリックス３
領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤におけ
る生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長ホル
モンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモン。 - 【請求項２】 成長ホルモンのアルファ−ヘリックス２
領域に変異を生じさせ、それによって、徐放調剤におけ
る生物学的活性を維持させながら未変性形態の成長ホル
モンよりも易溶性にすることから成る成長ホルモン。 - 【請求項３】 合成オリゴヌクレオチド（これは、この
ＤＮＡの一部に相補性を示し、そして上記オリゴヌクレ
オチドは上記ＤＮＡに対して不適正領域を有している）
にアニールされた一本鎖ＤＮＡを作り出すことでＤＮＡ
セグメントをクローン化し；上記ＤＮＡを２本鎖にし；
上記２本鎖ＤＮＡをクローン化用の適当な宿主に形質転
換し；上記オリゴヌクレオチド雑種形成に相当する変異
した配列を選択し；上記選択された配列を発現プラスミ
ドに再構築し；そして上記の得られる組換え誘導された
蛋白質もしくはポリペプチドを発現させる；ことから成
る、組換え誘導された蛋白質もしくはポリペプチドに関
して、部位特異的変異誘発を行うための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/621,197 US5310882A (en) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | Somatotropins with alterations in the α-helix 3 region |
| US621197 | 2000-07-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0570497A true JPH0570497A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=24489157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3339492A Pending JPH0570497A (ja) | 1990-11-30 | 1991-11-29 | アルフア−ヘリツクス３領域、アルフア−ヘリツクス２領域の変化、およびそれらの組み合わせ、並びに他の変異との組み合わせを有する成長ホルモン |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5310882A (ja) |
| EP (1) | EP0488279A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0570497A (ja) |
| KR (1) | KR920009414A (ja) |
| AU (1) | AU662492B2 (ja) |
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