JPS60501737A - 上皮成長因子のハイブリドｄｎａ合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 上皮成長因子のバイブリドＤＮＡ合成 上皮成長因子（ＥＧＦ　）は５３個のアミノ酸のポリペプチドであって、マウス 及びヒトにおいて特徴付けられている。このものは、種々の培養された細胞及び インーピボにおける細胞、例えば線紐芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞 及び表皮細胞のための強力なマイトジェンである。ＥＧＦはまた、胃酸分泌の強 力な阻害剤でもある。ＥＧＦは、それが説明できない程高レベルに存在する雄性 マウスの顎下腺から初めて単離された。

線ホモジネート中でＥＧＦは２分子のＥＧＦ　（Ｍｒ６０４．５）及び２分子の 結合蛋白質（Ｍｒ２９，３００）カリクレイン様アルギニンエンテロペプチダー ゼの７４，０００タルトンの複合体として見出される。マウス顎下腺ＥＧＦのア ミノ酸配列は決定されておシ、そしてカルボキン端延長部を有する大９０００ダ ルトン前１駆体が培養された顎下腺中に証明されている。

ヒトＥＧＦは、ウロがストロンと同一ではないとしても類似しており、そしてド デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ１゛ケ゛ル電気泳動において解離しな い２８，０００ダルトン及び３０，０００グルトンの大形２ として尿中にも見出される。

ＥＧＦ及び特に推定上のＥＧＦ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのい ずれを分離することも多くの理由により非常に困難である。ペプチドが豊富にあ る場合にもメンセンジャーＲＮＡの量は非常に少ない。

イン−ビトロ翻訳生成物の免疫沈澱法は、強い変性条件下においてさえ前駆体蛋 白質を検出しない。これはおそらく、前駆体のサイズが大きくそして／又は抗体 がそれに対して作られる天然蛋白質上の抗原決定基がマスクされているだめであ ろう。ＥＧＦの生理学的重要性の故に、ＥＧＦ及びＥＧＦポリペプチド前駆体を コードするＤＮＡ配列を得ることの可能性に実質的な興味が向けられている。さ らに、多数のホルモンは蛋白質分解的プロセシングにより大曲１駆体から生成す ることが知られているから、ＥＧＦ前駆体のｃＤＮＡ及び誘導されるアミノ酸配 列は隠れた今まで知られていないポリペゾヂドホルモン及び／又は成長因子を明 らかにするかもしれない。

従来技術の記載 パリテリオファーンλ中のヒトヶ９ツムｃＤＮＡライブラリーがＴＪａｗｎ等、 −ｈｙｂ（Ｃｅｌｌ　）（１９７８）二。

］、　］１５７−１１７４に記載されている。Ｓａｖａｇｅ等、ｂ−ナル・オブ ・ビオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、（１９７２）２４７：７６１２−７６２１は、マ３　待表 明ＧＯ−５０１７３７（２） ウスＥＧＦのアミノ酸配列を報告している。５ｐｏｒｎ等、サイエンス（５ｃｉ ｅｎｃｅ　）　（１９８３）　２１９°１３２９−２５８ニア］５５−７１６０ はトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ　）を記載している。特にＧｒａｙ等 、ネイチ呻乳動物ＥＧＦ　、そのポリペプチドゝ前駆体、及びＥＧＦをコードす るセグメントを含むＤＮＡ配列によってもコードされる多くの他のポリペプチド をコーｌ″′するＤＮＡ及びＲＮＡが提供される。このＤＮＡ配列Ｉ′ｉ哺乳動 物ＥＧＦ　Ｘ哺乳動物ＥＧＦの前駆体、及び結合している関連ポリペプチドの製 造のだめに使用することができる。放射性ラベルされた・・イブリダイゼーンヨ ンプローブを用いて、マウスＥＧＦ前１駆体をコードするメソセンジャーＲＮＡ が検出され、庁離され、そしてｃ　ＤＮＡの製造に使用される。このｃＤＮＡは 配列決定され、そして断片が、不適性（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ　）非相同バイブ リドが検出され得る条件下でのヒｌ−−ＤＮＡとのハイブリダゼーションのため に使用される。こうしてヒトＥＧＦ又はウロケ゛ストロン及び多数の関連ポリペ プチドを含む大前駆体ペプチドをコードするＤＮＡ配列が検出され、そして単離 される。

具体的態様の記載 この発明に従えば、特にマウス及びヒトのＥＧＦをコードするセグメントを含む ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、並びにプロポリペプチド及びペプチド、特にＥＧＦの１ もしくは複数の生理的機能を有するペプチド、又は］もしくは複数の他のホルモ ンもしくは成長因子制御機能を有するペプチドを包含する、前記配列の発視生成 物が提供される。

注目のＤＮＡ配列は約６０塩基又は塩基対（ｂｐ　）がら約５０００塩基対（５ ｋｂｐ）−ｉでの範囲にわたる単鎖又は二重鎖であって、生理的に活性なポリペ プチドをコードする配列は一般に約６０　ｂｐから約］、０００ｂｐの範囲であ り、これはエクソンを含むであろう。

一般に、このＤＮＡ配列は、約２０アミノ酸〜約１０００アミノ酸のポリペプチ ドをコードするオープンリープインクフレーム（１又は複数のエクソンを含む） を有し、この配列はＥＧＦをコードするセグメントの外側に２　ｂｐ以上、通常 ５　ｂｐ以上、より一般的には１゜ｂｐ以上を含有するであろう。特に興味ある ポリペプチドは一般に約２０〜２５０アミノ酸、さらに一般には約２０〜］７５ アミノ酸、特に３０〜６ｏアミノ酸から成るであろう。

注目のポリペプチド又は成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、こ の発明において記載されるＤＮＡ配列中の任意の領域に位置することができる。

塩基性アミノ酸、す々わちアルギニン及びリシンに縁どられている配列が特に注 目さ、？１、さらに詳しくは第２の塩基性アミノ酸、又はアラニン、ロイシン、 アスパラギン酸もしくはグルタミン酸、もしくはこれらのアミドに結合している 場合が特に注目される。これらの配列の内、ＥＧＦと相同のアミノ酸配列を有す る今まで知られてい々いＥＧＦ様ポリペプチドが注目される。

この発明に従って得られるＤＮＡ配列は、次の実験割面によって得られた。

ＥＧＦ中に存在するアミノ酸配列をコードする配列を検出するだめの多数の放射 性標識ハイゾ１ノダイ士゛−ジョンプローブを用いて哺乳動物ｃ　ＤＮＡ又はケ ８ツムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。オリゴペプチドをコードする 種々の可能性ある冗長コドンに備えて多数のプローブを使用する。この方法にお いてはマウス顎下腺細胞からのｃＤＮＡライブラリーを探査した。プローブに強 く結合するプラスミ１゛を単離し、そして幾つかのオーパラツノするｃＤＮＡ挿 入部を配列決定する。マウスＥＧＦをコードするｃ　ＤＮＡは約４、８００塩基 を有する。マウスＥＧＦはヌクレオアト３２８　］、　−３４，４０±５により コードされ、オープンリ−６ ディングフレームが１２７１±５アミノ酸残基及び約１３０〜１・１０キロダル トン（ｋｄ　）　、特に約１３３ｋｄの蛋白質をコードする。

次（で、マウスｃＤＮＡを用いてヒトｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡバンクを探査す る。便利には、約５００〜１．５００１〕ｐの制限断片を用いる。特に、約１２ １３±５　ｂｐのと上Ｅｌ−見ヲー■断片を用いること７バできる。不適性非相 同バイブリドの検出を促進する条件下でハイマウスＥＧＦ　（５３アミノ酸）並 びにＥＧＦ部分より前の２８６アミノ酸及び後の６６アミノ酸をコードする。グ ローブとハイブリダイズするクローンを単離し、そしてヒトＤＮＡ挿入部を特徴 付ける。

一旦ＤＮＡ配列を単離した後、これを種々の方法で使用することができる。すな わち、全体的又は部分的な合成りＮＡ配列の調製のため、複製のため、あるいは メンセンジャーＲＮＡの調製のだめ、又はＥＧＦを含む前駆体蛋白質、この蛋白 質もしくはＥＧＦの断片、又は天然ＥＧＦのアミノ酸配列から１個又は複数個の アミノ酸、通常５個以下のアミノ酸が異なるＥＧＦの類似体の発現のために使用 することができる。

ｃＤＮＡ配列から得ることができる鍾々のＤＮＡ配列がポリペプチドのコードに おいて特に注目される。これらのＩ）ＮＡ配列を、ヒトＥＧＦの配列と共に、実 験の７　竹表明ＧＯ−５０１７３７（３） 部に記載する検討のだめの地図中に示す。注目のポリペプチド配列には、限定的 −〇はないが、それらのアミノ酸配列のＥＧＦとの相同性、特に幾つかのシステ ィン残基の位置関係に基いて同定された７種の今まで記載されていないＥＧＦ様 ポリペプチドが包含される。（実験の部中のダイヤグラムを参照のこと。）これ らの配列はしばしば塩基性アミノ酸に接している。

注目の蛋白質又はペゾチド、例えばＥＧＦ又はその相同物をコードする所望のＤ ＮＡ配列を単離した後、これを複製又は発現のために他のＤＮＡ配列と連結する ことができる。

注目のポリ（アミノ酸）をフードするＤＮＡ配列がそこで複製されそして／又は 発現され得る単細胞微生物、特に細菌及び菌類のだめの広範囲の種類のベクター を使用することができる。

まれる。便利なベクターはＲ６−５、Ｃｏ　ｌ　Ｅ　Ｉ　１酵母からの２μｍプ ラスミド、ＲＫプラスミド又はこれらに類似するものに由来する複製系が含まれ る。これら以外の複製系をウィルス又はファージ、例えばラムダ、５Ｖ５０等か ら誘導することができる。ある場合には、異る宿主において異る機能を発揮する ことができる２個の異る複製系を有することが望ましいであろう。／ヤトルベク ターと称されるこれらのベクターは、Ｅ、コリのだめの複製系及び一層高等な生 物、例えば酵母のだめの複製系を用い、これによって遺伝子の増幅又はクローニ ングを細菌中で達成するととができ、他方発現を高等生物中で適当なプロセシン グ、例えばグリコジル化を伴って達成することができる。

便利には、複製系と共に、対象ＤＮＡ配列を含有する１）ＮＡ構成物を宿主中に 維持するための述択又は選択圧をもたらす少々くとも１つのマーカーが含１れる 。便利なマーカーには殺生物耐４〈１、例えは抗性物質、重金属及び毒素に対す る耐性；栄養要求性宿主における補完；免疫性等が含まれる。上皮成長因子の生 理的性質を有するポリペプチドをコードする断ハを含有するＤＮＡ配列又は該配 列の断ハを、細菌及び酵母のごとき単細胞微生物中で複製するととができるりｆ コーニングベクター中で複製することができる。ＤＮＡはまた、注目のけポリペ プチドの発現のだめに発現ベクター中でも使用することができ、このポリペタ０ チドは哺乳動物特にマウス又はヒトのＥＧＦ、配列中に存在する他の生理的に活 性なポリペプチド、例えば他のホルモン又は成長因子、それらの断片又は１〜５ 個のアミノ酸を異にする類似体であってよい。

ＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームは大ポリヘプチドの産生を許容する 。この大ポリペフ０チドを種々の方法で処理することができる。種々のプロテア ーゼを単独で又は組み合わせて使用して大ポリペゾチドを部分的に消化すること ができる。代表的なエンドペプチダーゼにはトリプシン、ベゾシン、メンプラン ジペゾチダーゼ、エンドペプチダーゼ又はこれらに類似するものが含まれる。次 に、常用手段、例えばＥ過、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いて荷 電及び／又は分子量により、得られた断片を分離し、そして次に生理的活化につ いて試験することができる。マイトジェン又は分化調節剤として機能する成長因 子に特に関心が持たれる。

バイオアッセイによシ観察された活性に基いて種々の両分をさらに精製し、純粋 な因子を得ることができる。

この発明のＤＮＡ配列は種々の方法で使用することができる。断片は、宿主のケ ゛ツムＤＮＡ中の変異及び′又は欠失を検出するだめにケ゛ツムＤＮＡ中又はメ ツセンジー、−ＤＮＡ中の相補配列を検出するだめのプロ＝−プとして使用する ことができる。配列はその配列によりコードされたポリペプチドを発現するだめ に使１０ 用することができる。

次の例は限定的ではなく例示的に記載される。

ｃＤＮＡライブラリーを造成するだめに、６０日齢の雄性５ｗ１ｓｓ　−Ｗｅｂ ｓｔｅｒマウスの顎下腺から、ポリＡを含肩するＲＮＡを分離した。ｄＧｄＣテ ィリング技法〔Ｃｈ　ｉ　ｒｇｗｉ　ｎ等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ ｍｙｓｔｒｙ）を用いて’、ｃＤＮＡを調製Ｉ〜、そしてｐＢＲ３２２誘導体の たテＩ・ラザイクリン証ｊ性形質転換体をミクロタイターディノシ、、　＋−１ １−７Ｑ℃にて貯蔵した［　Ｇｅｒｇｅｎ　等、及びＢｕｒｋｅ　、前掲、（１ ９８１）９：２９８９−２９９８：］。

次に、係属中の出願第４５７．４．１．２号に記載されているようにして固相ホ スホラミデート法により第１ノコ゛ヌクｌ／オチドを合成し、そしてＢｅａｎｃ ａｇｅ及びＣａｍｔｈｃｒｓ　、デ１ゝラヘドロンルター（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎＬｅｔｔ、）（１９８］、）２２：１８５９−１８６２に記載されている方 法の変法である２０％アクリルアミドケゞル法により単離した。マウスＥＧＦの ｃＤＮＡのアミノ酸１７−２３をコートジする鎖に相補的なドデカマー（最後の ５７−ヌクレオチドが欠落している）を調製した。

フラクションは次の配列を有した。す々わち、１１番目のヌクレオチドを付加し た後２つのプールを用意し、一方はＡで終シそして他方はＧで終るようにし、そ して１７７番目ヌクレオチド゛を付加した後、これら２つのプールをさらに分け て１８８番目ヌクレオチドを付加し、今度はプールの内２つはＧて終るようにし 、そして他の２つのプールはＡで終るようにした。こうして合計４つの７０−ル を得だ。ここで、各プールは、３，６、及び９位において組成を異にする多数の エイコツマーを有した。

アミノ酸の遺伝イコードの冗長性のだめに特異のコドンの使用が不確定であるた め、異る配列が要求される。ポリヌクレオチドキナーゼ反応によシ、アデノシン ５′−（γ−５２ｐ）トリホスフェ−１−（ＩＣＮ、粗標品、７０００Ｃｉ／ｍ 　ｍｏｌ　、　ＩＣｉ　＝３．７　Ｘ　１０１０Ｂｑ　）を用いて合成オリゴヌ クレオチドをラベルした２ Ｃ−１−８Ｓｅｐ　−Ｐａｋ　（商標）カラム（ウォーターズ・アソシエーツ社 ）」二でのクロマトグラフィーにより、ラベルされたオリゴヌクレオチドを非導 入（γ３２ｐ）トリホスフェートから次のようにして分離した。粗ラベル混合物 をＳｅｐ　−Ｐａｋカートリツゾに適用しくディスポーサブルシリンジによる　 ）、次にカートリツジを２０ｍ１の水で洗浄して非導入アデノシン５′−（γ− ５２ｐ）トリホスフェートを溶出した。次に、放射性標識されたオリゴヌクレオ チドをメタノール０１Ｍトリエチルアンモニウムアセテ−ｔ・（ＰＨ７，３）（ ］　：　］　、Ｖ／′Ｖ）により溶出し、そして溶出液を蒸発乾固した。プロー ブの比活性は１０８〜］、、　０９ｃｐ１１１／μｇのオーダーであった０ 形質転換体をワットマン５４１Ｆ紙上で増殖せしめ、クロラムフェニコールと共 にその場で７０ラスミドを増幅し、そしてＤＮＡを沖紙上に固定した（Ｇｅｒｇ ｅｎ等、前掲）。３２ｐ末端ラベルグローブを用いてライブラリーを検索した。

同じＥ紙を反復使用して、ニックトランスレーションクローン化（！ＤＮＡ　Ｋ 　ヨｊｌ）　迫力０のスクリーニングを行った。

Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの方法によりｃＤＮＡ挿入部の自己列を決定した 。

３ 雄性及び雌性マウスの顎下腺からのグリオキ／ル化された全ＲＮＡを２係アガロ −スケ゛ル上で分離し、ニトロセルロースに移し、そしてＥＧＦのｃ　ＤＮＡ挿 入部ノ二ノクトランスレーンヨン５２ｐ−ラベルＰｓｔ　１−Ｐｓｔ　ｌ断片と ハイブリダイズさせた。洗浄した後、強化スクリーンを用いて一７０℃にてＲＮ Ａをオートラジオグラフ処理した。グリオキシル化Ｈｉｎｄｎｌλ断片及びφＸ 　１．７４　ＲＦ　Ｈａｅ　■消化ＤＮＡ断片をサイズマーカーとして使用した 。

５０００個の形質転換体をまずスクリーニングし、この場合、１２位及び１８位 にそれぞれヌクレオチドＧ及びＡを有するプールであるゾール４のフ０ロープを 用いて、１１個のクローンか強いシグナルをもたらした。それぞれヌクレオチド Ｇ及びＧを有するプール３を用いて、弱いがしかし明白に陽性のシグナルが得ら れた。プール１及び２は陽性シグナルをもたらさなかった。最大のクローンは］ 、８００ｂｐてあった。このクローンの末端制限断片及び他の断片を用いて、も との５０００個のコロニー及び７５００個の追加のコロニー（合泪］、　２．５ ００個）をスクリーニングし、そしてＥＧＦ配列を含有しない追加のオーバ１４ 一うップｃｌ）ＮＡ：１−７０ニーを得た。次に、これらのオーパーラ７ノプク ローンがｍＲＮＡの５′一端領域を欠いていることがＤＮＡ配列分析（後記参照 のこと）により決定されためで、ヌクレオチド＋１０３２−１０５］（後期の検 討のだめの地図を参照のこと）に相補的な次の配列： ３′−ＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＧＧＴＧＣＧＡＡＴ−５’を有するオリゴヌクレ オチドゾシイマーを用いて他のｃＤＮＡライブラリーを合成し、そしてこのライ ブラリーを上記のようにしてスクリーニングした。最初のライブラリー中のＣＤ ＮＡクローンが相対的に豊富であることは、との組織からのｆ　’）　ＡＦｍ　 ＲＮＡの約０２％がＥＧＦのｌＴｌＲＮＡであることを示唆する。

ｍＲＮＡ配列 マウスＥＧＦ　ｍ　ＲＮＡのサイズは、成雄性及び雌性腺からのｍ　ＲＮＡのナ サン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　）分析により２８゜リボゾームＲＮＡのサイズと同じ て約４８００塩基であると決定された。雄性線中のｍＲＮＡは、雌性線中に比べ て少なくとも１０倍豊富であった。オーツぐ−ラノプｆ　ルｃ　ＤＮＡクローン のヌクレオチド配列は、次の４７５０　ｂｐの配列を与えた。

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Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｊｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｃｒ　Ａｌａ　 Ａｓｎ　Ｇｕｙ　５ｅｒＣｙｓ　Ｈｊ、ｓ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　１−ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　［；ｌｕ　Ｐｒｏ　υａ ］、Ｌ−ｙｓ　八日ＣＬＩＵＵＵＧＣＣＩＩＣＡＧＡＡＧＧＡＧＵＧＧＧＵＵＡ ＡＡＧＣＡＧＧＩＪＧＡＣＣＣＣＡＵＧＣＵＣＩＪＧＵＣＡＡＣＣＣＣＬＩＧＡ ＡＵＡＡＡＵ［；ＡＵＧＵＧＡＩＪｃＣＵＵＵＵＧＣＬＩＡＵＧＡＵＡＵＡＣＬ ＩＧＣＣ八＾ＧＵＧＬＩＧＧＣＣＣＡＵＧＣＵＣＡＬＩＡＡＬＩＵＧＵＧＣＣへ ＩＵＣＵＧＡＡＩＪＵ［；ｔｌＧＡＵＡＡＡＩＪＵＡ［；Ｕ［；ＡＵＵＡＵＡＣ ＩＪ八Ｕ八ＡＡＡＡＵへＵへＩＩにＡＡＵＧＡＡＡＡＵＡＵＵＵＡＡＣＵＵＵＡ ＡＡＡＡＣＡＬＩＵＡＣＣＵＵＡＡｔＪＣＡＵＵＧＵＣＵＵＬＩＵＣＬＩＵＣＵ ＵｃＡＡｃｕｃｕｕｕｃｃｃＡｃｕｃＡＡＡＡｃｃｃｕｃＡ八ＬＩＵＣＩＩＧＣ ＵＧＵＬＩＵＣＣＡＵＡＧＡＡＵ　４６６１ｕｕｕｕＡＡｕｕｕＡｕｕｕｕＡＡ ｃＡｃ八ｕｃＡｃＡｕｕｃｕＡＡＡｃＡＡＡｕｕｃｃｕｕｃＡｕｕｕＡｕｕｕｕ ＡｕｃｃＵＡＡＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＡＵＣＡＣＣＣＵＡＡＡＧＣＡＵＣ Ａ　４７５０これは、マウスＥＧＦの正確な５３アミノ酸残基（ヌクレオチド３ ２８１−３４４ＯＬ翻訳開始コドンＡＵＧ　（ヌクレオチド３５４−３５６）、 及び終止コドンＴＡ、Ｇ　（ヌクレオチド４００５−４．００７　）を含む。１ ２１７アミノ酸残基及び約１３３　ｋｄの蛋白質をコードする配列にわたるオー プンリーディングフレーム。さらに、ＥＧＦ”に対するこれらのアミノ酸配列の 相同性、特に次に示ずこれらのンステイン残基の位置関係に基いて、７個の追加 のＥＧＦ様ポリペプチドが同定される。

４ ｕｈｃ：＋の一仁一コフフωσ〉、−〉、）−頓０Ｌｊｘω＜　、）　Ｊ　」Ｊ 　Ｊ　（（ｊφＣロー１＞Ｃ＞ｋＣＣツー０〕ψコ＞０ く〉０く口のく」　←＜　ｅＬ　ＬＩ　Ｊ　（ｊ　（ｊ　ｌ−１＋１−一の＋＠ 　＋　＋　ｆ　＋＠ω小−−二ω（ｃＬ＋１．Ｊ（ｊ　ＣｊＬｌ　トＨ＜」ｌ５ ｅｔｈ−４、−１０の−の〉、−色一一一田ωｆ （ｊ鎖の工く　ヒ　エく■（［ｊ　）　＜　１−１誹Ｕ　演習だξ÷５区明 １ベフ＞ωＣツー〉、−一１−＋＞＞ｐのａ＋＋＠−Ｈの　の−■ｆ　ｆ−ｎ− ■＞　」ｃｓ　＜　［ｊ　の　ωＣωヒヒ■０φ？ヨムけ　！口５４咋１足 月間！」　■　・・・・−ｍ＝・ ＯＵＯフメコフフ エωニー〇〇〇」 ［１暑　タ［、ｆｆ３．ｉ［ｌ１５ 女工　カ　０ ｌ−（ｊ　［ｊ　Ｌ　（」」口の＜＜〇−〕〕＋＠０ｃ−１０− ω　木　−−・・−・−ｍ＝ −１−（ｊ）乙（６）　）−１ヒＨ 汗　情　茨　４圓２コ」 堀　５　Ｒａ囲す属丁 ！ 国日コ屁ＩΣ ２６ 特に、７つの追加のＥＧＦ様、ｌ　ＩＪペプチドが同定される。組換ＤＮＡ技法 を用い、そしてポリペプヂド配列を、機能するエピゾーム要素中の適切なプロモ ーターから下流に挿入することにより、大ボリベゾチド及びその断片の製造のた めにＤＮＡ配列を使用することができる。次に、ニゲシーツ、要素を適当な宿主 に挿入して複製及び所望の７１）　波ブチドの発現を行うことができる。

理解を明確にするため説明又は例により前記の発明を幾分詳細に説明したが、添 付された請求の範囲の範囲内において幾つかの変化、変法を実施し得ることが明 らかであろう。

補正岩−の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和６０年３月５８ 特許庁長官　志　賀　学　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８４１０］、０５０ ２　発明の名称 上皮成長因子のバイブリドＤＮＡ合成 ３特許出願人 住所　アメリカ合衆国、カリフォルニア９４６０８．エミリーヒヮレ。

住所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル）小゛１請求の範囲 ｌ、、ＥＧＦをコードする部分を有し、そしてそれと読み相が整合する周縁コー ド領域の少なくとも部分を含むヒトＤＮＡ配列。

２　請求の範囲第１項のＤＮＡ配列の部分であシ、そしてＥＧＦ以外をコードす る配列を含む６０ヌクレオチド以上のＤＮＡ断片。

３、複製系及び請求の範囲第１項のＤＮＡ配列又は６０ヌクレオチド以上のその 断片を含んで成る機能的エピゾーム要素。

４．５０００より少なく１５９より多くの塩基対を有し、そしてヒ）　ＥＧＦの アミノ酸配列を含有する７リペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチドの５０ ％以上を含んで成るＤＮＡ配列。

５、　オープンリーディングフレーム内に約１０００ヌクレオチド以上を有する 請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列。

６　前記オープンリーディングフレームがＥＧＦをコードする前記配列の部分を 特徴とする請求の範囲第５項記載のＤＮＡ配列。

手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８４ン０１０５０ ２　発明の名称 上皮成長因子のバイブリドＤＮＡ合成 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　チロン　コーポレイション ４代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５　補正命令の日付 昭和６０年７月２３日（発送日） ６　補正の対象 ＋１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）願書の翻訳文 （３）委任状 （４）明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７　補正の内容 （１）　別紙の通り （２）別紙の通り （３）　別紙の通り （４）明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８　添付書類の目録 （１）特許法第１８４条の５第１ 項の規定による書面　１通 （２）願書の翻訳文　１通 （３）委任状及びその翻訳文　各１通 （４）明細書及び請求の範囲 の翻訳文　各１通 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ］、、ＥＧＦをコードする部分を有し、そしてそれと読み相が整合する周縁コー ド領域の少なくとも部分を含む哺乳動物ＤＮＡ配列。 ２　前記哺乳動物がマウスである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３　前記哺乳動物がヒトである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ４　請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列の部分であり、そしてＥＧＦ以外をコー ドする配列を含む少なくとも約６０ヌクレオチドのＤＮＡ断片。 ５　複製系及び請求の範囲第１項のＤＮＡ配列又は少すくとも６０ヌクレオチド のその断片を含んで成る機能的エピゾーム要素。 ６．５０００より少なくそして１５９より多くの塩基対を有し、そしでヒ）　Ｅ ＧＦのアミノ酸配列を含むポリ綬グチドをコードする遺伝子のヌクレオチドの少 なくとも５０係を含んで成るＤＮＡ配列。 ７　オーツ０ンリーデイングフレーム中に少なくとも１０００ヌクレオチドを有 する請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。 ８　前記オーシンリーディングフレームがＥＧＦ　ｉコードする前記配列の部分 を含む請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列。 浄書（内容に変更なＬつ　１