PT99647A

PT99647A - Processo para a preparacao de somatotropinas com alteracoes na regiao de alfa- helice 3 na regiao de alfa-helice 2 suas combinacoes e combinacoes com outras mutacoes

Info

Publication number: PT99647A
Application number: PT99647A
Authority: PT
Inventors: Deborah Tardy Chaleff
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1992-10-30
Also published as: AU8829391A; ZA919452B; IL100170A0; KR920009414A; NZ240720A; IE914154A1; FI915655A; FI915655A0; JPH0570497A; EP0488279A3; CA2056564A1; HU913724D0; AU662492B2; HUT62328A; EP0488279A2; NO914720D0; TW205045B; NO914720L; US5310882A

Description

Antecedentes do Invento O presente invento diz respeito a análogos da somato-tropina com alterações nos aminoácidos na porção da alfa-hélice 3 e/ou alfa-hélice 2 das referidas somatotropinas e aos processos de produção das alterações na alfa-hélice 3, assim como noutras regiões, de polipéptidos ou proteínas recombinantemente produzidos. A administração de somatotropinas exógenas aumenta significativamente a capacidade de crescimento de uma variedade de animais, em particular animais domésticos tais como suínos, mas também espécies de peixes. Este aumento do crescimento nos animais domésticos, em particular, é normalmente caracterizado por um aumento no crescimento da massa muscular concomitante com uma diminuição na gordura, resultando em animais maiores e mais magros. A eficácia de alimentação dos animais que recebem somato-tropina exógena é também significativamente melhorada, resultando de um aumento no ganho de peso e de uma concomitante diminuição no consumo de alimentos. A administração exógena de somatotropina é realizada de várias formas, tal como injecções diárias. Contudo, em certos casos, podem ser preferidas outras vias de administração. Por exemplo, pode ser útil um dispositivo implantado que permita a libertação retarda de somatotropina durante um período de tempo definido, aquando do tratamento de certos animais domésticos. Uma via de administração mais desejável é através de um disposito implantado que permita a libertação retardada durante um período de tempo definido. Um tal dispositivo iria conter grandes quantidades de somatotropina em concentrações muito elevadas (ca 500 mg/ml). Além disso, é requerida para tais utilizações de distribuição uma molécula de somatotropina tendo uma elevada solubilidade e uma baixa tendência para formar agregados biologicamente inactivos, insolúveis. r 5

As somatotropinas contêm quatro α-Kélices que se reúnem para formar um feixe a-helicoidal (Abdel-Meguid et al., 1987). Tipicamente, as cadeias laterais de aminoãcidos que se projectam no núcleo desta estrutura são não polares, hidrofõbicas e fortemente ligadas umas às outras de forma a excluir a penetração de um solvente polar (tal como água ou solução salina) no centro do feixe. No caso da somatotropina de bovino, que está relaccionada com a somatotropina de porcino na sequência principal, a exposição da. face hidrofóbica da a-hélice 3 (dos resíduos de aminoáci-dos a leu127) sob concentrações de proteína em excesso de

1 mg/ml"promove a formação de "intermediários associativos", que têm a hipótese de ser um caso de nucleação na formação de agregado (Brems et al.. 1986; Brems, 1988). Estes intremediários associativos podem representar arranjos de ligação alternativos desta α-hélice de várias moléculas de somatotropina individuais, resultando numa estrutura multimérica na qual as faces hidrofóbi-.cas desta hélice são re-sequestradas do meio aquoso. A formação dos intermediários associativos pode ser bloqueada pela adição de um excesso de uma a-hélice 3 contendo um fragmento de proteína (Brems et al., 1986). Adicionalmente, a extensão da face hidrofóbica desta hélice, por substituição da lisina da posição 112 por leucina, exacerba muito a tendência para formar intermediários associativos (Brems, 1988). 0 presente invento trata o problema da baixa solubilidade das somatotropinas por alteração das regiões de a-hélice 3 das somatotropinas. As somatotropinas de porcino com aumentada estabilidade em solução in vitro são especificamente preparadas por mutagénese dirigida ao sítio da a-hélice 3. Quer as faces hidrofõbicas quer as faces hidrofílicas são alvos para mutagénese. As mutações dirigidas ao sítio, recentes, na região de a-hélice 3 da somatotropina de bovino resultaram num crescimento diminuído de ratinhos transgénicos que expressam a somatotropina -4- ι Ί

mutante, um resultado que sugere que a regiãò:de a-hélice 3 é uma região importante para a actividade biológica (Chen et al., 1990) .

Adicionalmente, as mutações de a-hélice 3 são combinadas, onde apropriado, com mutações nas regiões de hélice 1 ou hélice 2, e com duplas mutações no DNA que codifica a cisteína nas posições 183 e 191, onde o DNA que codifica a cisteína é substituído por ou DNA que codifica a alanina ou DNA que codifica o ácido glutâmico. As duplas mutações nas posições 183 e 191 são descritas na EP 355 460, aqui incorporada por referência. Através da utilização das mutações aqui descritas, são proporcionadas as somatotropinas com solubilidade (estabilidade) aumentada, e por consequência propriedades aumentadas para libertação retardada. A somatotropina de porcino é particularmente útil numa forma de libertação retardada e como tal é uma somatotropina de interesse primordial.

Um exemplo particularmente útil da presente mutação é a mutação I122L, na qual a isoleucina na posição 122 na a-hélice 3 é substituída por leucina. Em combinação com outras mutações nas posições 183 e 191, onde as cisteínas são substituídas por alanina, é obtido um aumento significativo na temperatura de transição do resíduo de triptofano único da proteína. A temperatura de transição é uma medida da estabilidade térmica da proteína. Numa das mutações mais preferidas, a estabilidade em solução, aumentada é obtida quando a mutação I122L é combinada com mutações nas quais os DNAs que codificam a cisteína nas posições 183 e 191 são alterados para codificar o ácido glutâmico.

Breve Descricao dos Desenhos FIGURA l: Mapa de restrição do DNA de somatotropina de porcino -5-

recombinante (rpST) . A linha cheia larga representa a porção que codifica aminoácidos do DNA de rpST; a linha mais fina representa a sequência de DNA não codificadora, de flanqueamento, 5' e 3'.

As regiões do gene rpST submetidas a mutagénese dirigida ao sítio estão numeradas e indicadas abaixo do mapa de restrição, em que o número 1 representa o DNA que codifica a α-hélice 1, o número 2 representa o DNA que codifica a a-hélice 2, o número 3 representa o DNA que codifica a a-hélice 3 e o número 4 representa o DNA que codifica as cistelnas presentes nas posições 183 e 191. As letras acima do mapa indicam a localização dos vários sítios de restrição das endonucleases de restrição, em que RI=EcoRI, N=NdeI, B=BssHII, S=SacI, X=XbaI, Sm=SmaI e H=HindIII. FIGURA 2: Estrutura e mapa de restrição do plasmídeo pEFF-902. Este plasmídeo contém a origem de replicação de pBR322 (Ori) e o gene de resistência à ampicilina, o promotor lambdaP,, o sítio de ligação ao ribossoma cll e o gene repressor cl do bacteriófago lambda, o terminador da transcrição T1T2 do operão rrnB de E. coli. uma sequência de 60 pares de bases da região reguladora deo sem promotores e o gene rpST indicado como pGH. São indicados os sítios de restrição importantes. O DNA que contém rpST é cortado deste plasmídeo por tratamento com EcoRI e HindIII e clonado no vector de mutagénese pGEM3z(f+) como descrito no texto. FIGURA 3: Estrutura e mapa de restrição parcial de pGHGEM3Z. Este fagemídeo contém a origem de replicação do DNA fl, a origem de replicação de pBR322 (Ori) e o gene de resistência à ampicilina, os promotores SP6 e T7, o sítio de ligação ao ribossoma cll do gene lacZ do bacteriófago lambda e o gene rpST, indicado como rpGH. O DNA de fagemídeo de cadeia simples é utilizado como a matriz para a mutagénese dirigida ao sítio como descrito no texto. FIGURA 4: 0 plasmídeo de expressão bacteriana'pEopST é utilizado na produção de somatotropinas de porcino, recombinantes em bactérias (E. colil. 0 sítio de ligação ao ribossoma cll esta localizado entre os sítios de restrição EcoRI e Ndel. 0 codão de iniciação da tradução para rpST está localizado no sítio Ndel. A expressão é guiada pelo promotor lambdaPL· FIGURA 5: Estrutura do plasmídeo de expressão em levedura YEp352—pST—1122L. Este plasmídeo é um derivado de YEp352 e contém a mutação rpST, 1122L, cuja expressão é guiada pelo promotor GAL1/GAL10 induzível de S.cerevisiae. O DNA não traduzido 3' é derivado do gene STE7 de levedura. 0 elemento de 2 jum suporta a replicação do plasmídeo na levedura e o URA3 proporciona um marcador seleccionável para a selecção de transformante em levedura. Este plasmídeo possui também a origem de replicação de pBR322 (não mostrada) e o gene de resistência à ampicilina.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento diz respeito a somatotropina(s) com alterações na sequência de aminoácidos nas regiões de a-hélice 3 e/ou a-hélice 2 da molécula de somatotropina. A somatotropina resultante é mais estável (solúvel) do que a forma nativa da somatotropina e mantém a actividade biológica quando formulada como uma formulação de libertação retardada da referida somatotropina. Mais especificamente, as somatotropinas do presente invento incluem somatotropinas humanas, de bovino, porcino, ovino, caprino, equino, peixe e ave. Além disso, o termo somatotropina inclui deleções, adições e alterações de outras porções da molécula de somatotropina nativa. Por exemplo, as somatotropinas modificadas (com cisteínas substituídas ou eliminadas) ou derivadas nas quais um a quatro dos resíduos de aminoácido cisteína da referida somatotropina são substituídos por um a quatro resíduos de aminoácidos, separadamente seleccionados a partir dos aminoácidos arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, alanina, glicina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, triptofano, tirosina, metionina, serina, treonina ou prolina; ou nas quais todas as quatro cisteínas são convertidas a ácido cisteíco.

Por consequência, é um objectivo do presente invento proporcionar novas somatotropinas que são mais solúveis do que a forma nativa da molécula e são assim biologicamente eficazes quando formuladas, preferivelmente em formulações de libertação retardada. É um objectivo adicional do presente invento proporcionar técnicas de mutagénese dirigida ao sítio para a preparação das somatotropinas. do presente invento, assim como de outros polipéptidos e/ou proteínas recombinantemente produzidos. Estes e outros objectivos do invento serão evidentes pela seguinte descrição detalhada do invento.

Os plasmídeos, sequências de DNA e microorganismos depositados em relacção ao presente Pedido de Patente, excepto onde especificado em contrário, estão depositados na American Cyanamid Company's Culture Collection mantida em Princeton, New Jersey e estão depositados de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, Maryland 20952, E.U.A..

As estirpes de DNA acima referidas foram depositadas na ATCC a 23 de Agosto de 1988. Elas são: pGEMpST-SX (número ATCC 40482), pR02ll (número ATCC 40483) e pEFF-902 (número ATCC 40484). Aqueles peritos na arte reconhecem que estes DNAs podem ser inseridos em qualquer sistema de expressão apropriado para se obterem as somatotropinas do invento ou suas mutações.

As estirpes bacterianas de E. coli K12 que expressam algumas das novas somatotropinas animais do presente invento foram também depositadas na ATCC a 23 de Agosto de 1988. As estirpes bacterianas incluem a estirpe de E. coli 1655 (número ATCC 67762), 1655/pROpSTA34 (número ATCC 67763), 1655/pROpSTE34 (número ATCC 67764), 1655/pROpST (número ATCC 67765), 4200 (número ATCC 67766), 4200/pROpSTA34 (número ATCC 67767), 4200/-pROpSTE34 (número ATCC 67768), 4200/pROpST (número ATCC 67769), 4255 (número ATCC 67770), 4255/pROpSTA34 (número ATCC 67771), 4255/pROpSTE34 (número ATCC 67772), 4255/pROpST (número ATCC 67773) e 4300 (número ATCC 67774).

As estirpes bacterianas de E. coli K12 seguintes foram também depositadas na ATCC a 21 de Setembro de 1990. Estas incluem: pROpST-SXE-Q21HH22R (ATCC 68410), pROpST-SXE-G121A (ATCC 64811), pR0pST-SXE-A6TS1IR (ATCC 68412), pROpST-SXA-S81,87L + I122L (ATCC 68413), pROpST-SXA-S81,87L (ATCC 68414), pROpST-SXA-L82, 84Q + L115K (ATCC 68415), pROpST-SXA-L82,84Q (ATCC 68416), -9-

\ ’ pROpST-SXE-I122L (ATCC 68417), pR0pST-SXA-I122L. ;(ATCC 68418), pST-SX (ATCC 68419), pR0pST-SXA-L118E (ATCC 68420), pROpST-SXA--E119LQ123L (ATCC 68421), pROpST-SXA-I122E (ATCC 68422), pROpST--SXA-M126A (ATCC 68423) e pROpST-SXE-A6TSHR + I122L (ATCC 68424).

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO

As somatotropinas animais do presente invento são proporcionadas por mutagénese dirigida ao sitio, mas podem ser empregues outros meios tais como a síntese química dos péptidos e/ou proteínas, na produção das referidas somatotropinas. As técnicas presentemente utilizadas para a alteração da sequência de DNA de um segmento clonado de DNA num sítio definido específico requerem a produção de uma forma de cadeia simples daquele DNA. O DNA de cadeia simples é desnaturado/renaturado a um oligonucleótido sintético que é complementar de uma porção daquele DNA com a excepção de que o DNA contém nele uma região de mau emparelhamento. A região de mau emparelhamento está normalmente localizada na porção central do oligonucleótido. Nalguns casos, o oligonucleótido contém também um sítio de recomhecimento da endonuclease de restrição no ou próximo do sítio da(s) mutação-iões) . A mistura desnaturada/naturada é então convertida em cadeia dupla e covalentemente fechada pela adição de DNA polimera-se I de E. coli. fragmento grande e desoxinucleótido-trifosfatos na presença de DNA-ligase T4 e adenosina-5'-trifosfato. O DNA de cadeia dupla é então transformado numa estirpe E. coli apropriada onde a região de mau emparelhamento do DNA é reparada e replicada. São obtidas duas populações de clones. Dependendo da cadeia que é escolhida como a matriz para a síntese de reparação, um clone contém ou a sequência de tipo selvagem ou a sequência alterada (mutada). Os clones que contêm a sequência-mutada, a qual corresponde à sequência do oligonucleótido, são selecciona-dos por hibridação ao oligonucleótido radioactivamente marcado. 0 oligonucleótido radioactivamente marcado ê mais estavelmente ligado aos clones que contêm a sequência mutada, devido ao mau emparelhamento entre o oligonucleótido e a sequência de tipo selvagem. Por consequência, a incubação a uma temperatura apropriada faz a descriminação entre clones de tipo selvagem e clones mutados. Nos casos em que o oligonucleótido contém também um sítio de clivagem da endonuclease de restrição, a digestão dos clones candidatos com a endonuclease de restrição cognatas revela clones que contêm a sequência mutada e proporciona um outro meio de discriminação entre os clones de tipo selvagem e os clones mutados. As alterações nos clones identificados são então confirmadas por sequenciação do DNA das regiões importantes.

Os fragmentos de restrição de clones de plasmídeo contendo a(s) mutação(ões) desejadas são reconstruídos em plasmí-deos de expressão adequados para a expressão do produto de gene mutante quer em bactérias quer em leveduras, mas não em ambas. Esta reconstrução é alcançada por procedimentos padrão de subclo-nagem.

Nas discussões seguintes, a somatotropina de porcino recombinante é seleccionada como representativa das somatotropi-nas recombinantes modificadas do presente invento e dos processos empregues na sua preparação. Além disso, a descrição e os exemplos seguintes são ilustrativos do presente invento e não limitados a ele. 0 DNA e a sequência de aminoácidos da somatotropina de porcino recombinante são fornecidos abaixo. A somatotropina de porcino recombinante mais preferida é uma sequência de -11-

polipéptido de 193 aminoácidos, na qual o terminal .NH foi modificado para incluir 3 aminoácidos adicionais (met, asp, gin) e uma delecção do primeiro aminoãcido (ala) encontrada nalgumas formas maduras de somatotropina de porcino derivada da pituitária. Contudo, as PST de 191 aminoácidos assim como os seus outros derivados, tais como delecções no terminal NH2, suas adições e/ou delecções e/ou adições no terminal COOH destinam-se a fazer parte do presente invento.

pST recombinante: NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala-185

aminoacidos-ala-phe-COOH pST da pituitária: NH2-ala-phe-pro-ala-185

aminoácidos-ala-phe-COOH

Esta modificação resulta num aumento real de dois aminoácidos adicionais na proteína pST recombinante e está descrita na EP 355460. O sistema de numeração empregue na descrição dos derivados mutados da somatotropina de porcino recombinante reflete este aumento adicional e é facilmente aplicado por qualquer executante perito na arte.

J

Somatotropina de Porcino recombi.nante ATG GAT CAA TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA TTT GCC AAC 45

Met Asp Gin Phe Pro Ala Het Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn 15 10 15 GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC 90

Ala Vai Leu Arg Ala Gin His Leu His Gin Leu Ala Ala Asp Thr 20 25 30 TAC AAG GAG TTT GAG CGC GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC 135

Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Ala Tyr lie Pro Glu Gly Gin Arg Tyr 35 30 35 TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC 180

Ser Ile Gin Asn Ala Gin Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile 50 55 60 CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA TCG GAC GTG 225

Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu 'Ala Gin Gin Arg Ser Asp Vai 65 70 75 GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTC GGG 270

Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gin Ser Trp Leu Gly 80 85 90 CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTT 315

Pro Vai Gin Phe Leu Ser Arg Vai Phe Thr Asn Ser Leu Vai Phe 95 100 105 GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG 360

Gly Thr Ser Asp Arg Vai Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu 110 115 120 GGC ATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG 405

Gly Ile Gin Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 125 130 135 GCA GGA CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACA AAC 450

Ala Gly Gin Ile Leu Lys Gin Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn 140 145 150 TTG CGC AGT GAT GAC GCG CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC 495

Leu Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser 155 160 165 TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC 540

Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Vai 170 175 180 ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC TTC 579

Het Lys Cys Arg Arg Phe'Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe 185 190

Construção do DNA pGEMpST-SX 0 DNA pGEMpST-SX de cadeia simples é o DNA matriz para todas as reacções de mutagénese e é preparado a partir do DNA pGHGEM3Z por mutagénese dirigida ao sítio. A clonagem do gene da somatotropina de porcino (rpST) no fagemídeo pGEM-3z(f+), resultando em pGHGEM3Z, é realizada pelo procedimento geral seguinte. Um fragmento de DNA contendo o gene da somatotropina de porcino PGHGEM3Z (rpST) é isolado a partir do plasmídeo de expressão bacteriana pEFF-902 por clivagem com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII (Figura 1) . O fragmento contendo o gene da rpST ê então purificado por electroforese em gel de agarose. O DNA de fagemídeo de cadeia dupla pGEM-3z(f+) é digerido com EcoRI e HindIII, tratado com fosfatase alcalina de EcoRI de intestino de vitelo e o fragmento grande purificado por electroforese em gel de agarose. Os dois fragmentos purificados são então.misturados e ligados com DNA-ligase T4. a mistura é transformada em bactérias e cresceram várias colónias resultantes. O DNA plasmídico é preparado por um processo padrão de lise alcalina e a estrutura determinada por digestão com enzimas de restrição apropriadas. Isolou-se um clone que continha os fragmentos esperados e designou-se por pGHGEM3Z.

PGEMpST-SX 0 objectivo desta mutagénese é o de criar uma sequência de DNA de rpST na qual a sequência do DNA que codifica a a-hélice 2 está ligada no lado 5' (das posições 225-230 do DNA que codifica a região) por um sítio de restrição de Saci e no lado 3' (das posições 285-290) por um sítio de restrição de Xbal. Estas alterações na sequência do DNA não alteram a sequência de aminoã-cidos da proteína rpST. A presença destes sítios de clivagem de endonuclease de restrição resulta na criação de= uma "cassete de hélice 2", de modo que as mutações no DNA que codifica a hélice 2 possam ser adequada e rapidamente combinadas com mutações apropriadas no DNA que codifica a hélice 3. A construção do pGEMpST-SX está descrita abaixo.

As sequências de DNA dos oligonucleótidos sintéticos Saci293 e XbaI353 estão descritas na Tabela 1. 0 DNA pGHGEM3G de cadeia simples é o substrato para a mutagénese e é preparado a partir do fago purificado por protocolos padrão. Misturam-se 2000 ng deste DNA com 100 ng de cada um dos oligonucleótidos SacT293 e XbaI353 os quais foram fosforilados nas suas extremidades 5' com adenosina-5'-trifosfato e polinucleótido-quinase T4. A mistura está contida num volume total de 10 μL em tampão de desnaturação-/renaturação IX (o tampão de desnaturação IX ê KC1 75 mM e Tris-Cl 5 mM, pH 8,0). A mistura é aquecida a 65°C durante 7 minutos seguidos por uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente (TA). Este procedimento permite aos oligonucleótidos desnaturar/renaturar ao DNA substrato de cadeia simples (matriz). As moléculas desnaturadas/renaturadas são estendidas e convertidas a DNA de cadeia dupla, covalentemente fechado pela adição de 22 jlíI de H^O, 1 μΐ de ATP 20 mM, 2 unidades de cada um de DNA-li-gase T4 e fragmento grande da DNA-polimerase I (para a definição de unidade, ver o catálogo New England Biolabs, 1989), 2 μΐ de dNTPs 20X (uma mistura dos quatro desoxirribonucleótido-5'-tri-fosfatos cada um a uma concentração de 2 mM) e 4 μΐ de tampão de "enchimento" 10X (o tampão de enchimento IX é Tris-Cl 27,5 mM, pH 7,5, MgC^ 15 mM, DTT 2 mM). Após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente (TA) metade da mistura reaccional é introduzida nas células competentes HB101 por um protocolo padrão. As colónias simples são evidentes após incubação durante a noite a 37°C. 0 DNA plasmídico é preparado por um procedimento padrão a partir de 24 colónias e digerido, em reacções separadas, com Saci -15-

e Xbal. 0 DNA plasmídico contendo os dois sítios.de restrição, que indicam a incorporação quer dos oligonucleótidos SacI293 quer dos oligonucleótidos XbaI353 no gene de rpST, são adicionalmente purificados por introdução em células competentes HB101 como previamente descrito. 0 DNA plasmídico é preparado e digerido em reacções separadas com Saci e Xbal para verificar a presença de cada sítio de restrição no DNA plasmídico, que é depois confirmada por análise da sequência de DNA das regiões importantes do DNA de rpST.

•sT

TABELA I

Nome OLTGONUCLEÓTIDOS MUTAGÊNICOS Sequência (5'-3') Mutação

Sac I 293 Xba I3 53 S3U SS7L 08082 Q8082D K 1 1 3 6116 K113E11Ó

Κ1 13E1160 E116K120 E 1 20 L120 - 3 Λ124-2 Ê113EHDQ1 16 E1130 L 1 1 5 A L 1 1 a A L118TK l 11 a r LI 17,121 Leul171210 Kl HR/Accl G 1 2 1 Λ/XmnI K116R/Bgltl AUD/HIndI I I A6T S11 RA140/Sal 021 HH22R/CUI

GACGTGGAGCTCCTGCGCTTCTCG

CAGTTCCTCTCTAGAGTCTTCACC

TGCGCTTCTTGCTGCTGC

TCATCCAGTTGTGGCTCG

TGCGCTTCTCGCAGCTGCAGAT

CCAGTCGTGG

TTCTCGCAGCTGCAGATCCAGT

CTACGAGAAGAAGAAGGACCTG

GCTGAAGGACGAGGAGGAGGGC

GTCTACGAGAAGAAGAAGGACG

AGGAGGAGGGCAT

AGAAGAAGAAGGACGAGGAGGA

AAGCTGAAGGACGAGGAGGAGG

GCAAGCAGGCCCTGATG

GGAGGAGGGCGAGCAGGCCCTG

GGAGGAGGGCCTGCAGGCCCTG

CAGGCCCTGGCACGGGAGCTGG CGCGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC(GC)

A(GC)GAGGAGGGCATCCAG

CGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC

CTACGAGAAGGCGAAGGACCTG

GCTGAAGGACGCGGAGGAGGGC

CTGAAGGACA(CA)AGAGGAGGGCAT

CTGAAGGACACTGAGGAGGGC

GAAGGACCTGCTGGAGGGCAT

CCTGGCCCTGATG

CCTGCTGGAGGGCATCCTGGCC

GACCGCGTATACGAGCGTCtGAAGGA

CTGGAGGAAGCTATTCAGGCCCTG

AGAAGCTGCGAGATCTGGAGGA

CCTTGTCAAGCTTATTTGACAACGCCG

TCAATTCCCAACCATGC

ATGCCCTTGAGTCGACTAT

TTGACAACGCC

CCGGGCCCATCGATTGCACCAA

Cassete Ho Helix 2 Cassete de Helix 2 S81,87L S 31,87L L 8 2,84 Q L82,84q Sonda de detecçao

L 1 1 5 K L 1 1 8 E

L115KL118E

K113E116 Sonda L118EI122K

1122E 1122L M1 26 A L11SE 111 SE Sonda de construção

L118K L 1 1 8 T

E1 19LQ123L

E119L0123L Sonda K1 1 4R G1 21 A K 1 1 6 R

Λ1 40 A6T

S1 1RA140 021 KH22R

Pvul1634

AGAAGGCAGAGCTGCTGTCCAC

I122L

P CR C\ ; -N* Síntese de Mutações nas Hélices 1, 2 ou 3 A mutagénese do gene rpST em pGEMpST-SX é realizada como descrito abaixo. O objectivo do programa de mutagénese é o de gerar uma molécula de rpST que tenha uma tendência diminuída para se agregar a elevadas concentrações de proteína (>100 mg/ml). 0 foco é a face hidrofóbica da hélice 3, dos resíduos de aminoácidos 112 a 129, que se pensa ser crítico na iniciação de uma reacção de agregação (Brems et al., 1986) . Porque o gene rpST aqui empregue codifica 2 aminoácidos adicionais no terminal amino, o número total de resíduos de aminoácidos é 193, em oposição aos 191 resíduos encontrados na somatotropina de bovino e porcino derivada da pituitária. Os resíduos 112 a 129 correspondem aos resíduos 110 a 127 da somatotropina de bovino (Abdel--Meguid et al.. 1987). Outras regiões da molécula que são alvo para mutagénese são a hélice 2, dos resíduos 81 a 87, a face hidrofílica da hélice 3 e hélice 1, dos resíduos 6 a 11. Os mutantes de combinação são gerados por adicionais voltas de mutagénese ou por subclonagem de regiões importantes. 0 protocolo básico utilizado para se obter a mutação L118E e os exemplos de todos os outros são a seguir descritos. As variações no protocolo básico estão descritas nos exemplos apropriados. A preparação do DNA pGEMpST-SX substrato de cadeia simples é precisamente como descrita para pGHGEM3Z. A sequência de DNA do oligonucleótido mutagénico sintético utilizado na construção da mutação L118E, E116, é mostrada na Tabela I e é fosforilada na sua extremidade 5' como descrito para SacI293. As reacções de desnaturação/renaturação e enchimento são também exactamente como descrito para a mutagénese de SacI293 de pGHGEM3Z. Após introdução de metade da mistura reaccional nas células competentes HB101 e incubação durante a noite a 37°C, as colónias resultantes são transferidas para filtros de nitrocelu-lose e processadas para hibridação por processos padrão. 0 oligonucleótido E116 é também utilizado para a detecção da mutação. Ele é radioactivamente marcado na extremidade 5' com Γ- P-ATP e polinucleótido-quinase. A hibridação é realizada durante a noite a 37°c em 5XSSC (1XSSC é cloreto de sódio 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M, pH 7,0), Denhardt IX (Ficoll, albumina de soro de bovino, polivinilpirrolidona cada um a 0,02% (p/v)), 150 μg/ml de tRNA de levedura e a sonda radiomarcada.

Após hibridação, os filtros são lavados durante, pelo menos, 30 minutos a 37°C em 5XSSC, seguido por duas lavagens de trinta minutos em TAC (TAC é cloreto de tetrametilamónio 3 M, (tris) [hidrometil]aminometano 50 mM pH 8,0, EDTA (ácido etileno-diaminatetra-acético) 1 mM, dodecilsulfato de sódio a 0,1% (p/v) â temperatura desejada. A temperatura de incubação desta última lavagem determina a especificidade, visto que o oligonucleótido E116 permanecerá hibridado só a clones completamente complementares. Para o oligonucleótido E116, a temperatura é de 59,0°C. Após exposição a película de raio-X, só são observados esses clones que são completamente complementares ao E116. O DNA plasmídico é preparado a partir de várias destas colónias de marcação positiva, reintroduzido em HB101 e analisado como aqui descrito acima. O DNA plasmídico de várias colónias positivas desta segunda volta de análise, é preparado e analisado por análise da sequência de DNA; aqueles contendo a mutação L118E são assim não ambiguamente identificados. 0 plasmídeo que possui esta mutação é designado por pGEMpST-SX-L118E.

Os clones do gene rpST resultantes contendo a mutação L118E são transferidos para cada um dos dois vectores de expressão, pROpST-SX e pROpST-SXA, cujas construções são descritas. 0 objectivo destas construções é o de introduzir o gene rpST contendo a cassete da hélice 2, definida pela'presença dos sítios de restrição Saci e Xbal previamente descritos, num vector plasmídico concebido para expressão do gene rpST em E. coli. Um objectivo adicional é o de introduzir as mutações descritas no presente invento em cada um dos dois diferentes antecedentes genéticos de rpST. Uma é natural (tipo selvagem) no que respeita a presença de cada um de dois resíduos cisteína nas posições 183 e 191. 0 outro gene rpST codifica alanina em vez da cisteína nas mesmas posições e está descrita na EPO 355460. O plasmídeo pROpSTA34 (Figura 4) contém um fragmento EcoRI/HindIII clonado no plasmídeo de expressão pR0211. Este fragmento EcoRI/HindIII transporta um gene rpST alterado, no qual o DNA que codifica as cisteínas nas posições 183 e 191 foi mutado para DNA que codifica alanina nestas posições. Transporta assim as mutações ala, ala. O plasmídeo pROpSTA34 é digerido com EcoRI e HindIII numa mistura reaccional e EcoRI e Smal noutra. 0 fragmento contendo vector, grande é purificado a partir de cada reacção por electroforese em gel de agarose. O plasmídeo pROpST-SX, que contém a cassete de hélice 2 no outro antecedente rpST de tipo selvagem, é gerado por ligação do fragmento EcoRI/HindIII purificado a partir de pGEMpST-SX. A mistura de ligação é introduzida na estirpe bacte-riana N99cl. Nesta estirpe, a expressão rpST é guiada pelo promotor lambdaPL e é impedida pela presença do repressor lambda de tipo selvagem. Os clones plasmídicos resultantes com a construção desejada são identificados por digestão com as enzimas de restrição apropriadas. 0 plasmídeo pROpST-SXA, que contém a cassete de hélice 2 no gene rpST mutado, é gerado a partir da ligação do fragmento de vector EcoRI/Smal purificado de pROpSTA34 com o fragmento EcoRI/Smal purificado de pGEMpST-SX. A mistura de ligação é introduzida na estirpe bacteriana N99cl, e os clones plasmídicos resultantes analisados por digestão com as enzimas de restrição importantes para identificar os clones plasmídicos desej ados. A mutação L118E é introduzida nos plásmideos de expressão pROpST-SX e pROpST-SXA por clivagem do DNA pGEMpST-SX-L118E com EcoRI e HindIII num conjunto de reacções, e EcoRI e Smal no outro conjunto de reacções. Os fragmentos que possuem rpST, pequenos de cada mistura reaccional contêm a mutação L118E e são purificados por electroforese em gel de agarose. O plasmideo pROpST-SX é restringido com EcoRI e HindIII, e o fragmento que possui o vector, grande é purificado por electroforese em gel de agarose. Este fragmento é ligado ao fragmento EcoRI/HindIII purificado de pGEMpST-SX-L118E, resultando no plasmideo pROpST-SX--L118E. A mistura de ligação é transformada na estirpe de expressão 4300, que transporta um repressor lambda sensível à temperatura. Nestas estirpes, a expressão rpST depende da temperatura. A 42°C o repressor lambda está inactivo, permitindo a expressão do promotor lambdaP-. As colónias bacterianas transportando o

Jj plasmideo pR0pST-SX-L118E são identificadas pela sua capacidade de produzir a proteína rpST a 42°C (a temperatura não permissiva para o promotor lambda). 0 plasmideo pROpST-SXA é restringido quer com EcoRI quer com Smal, e o fragmento de vector grande é purificado por electroforese em gel de agarose. Este fragmento é ligado ao fragmento EcoRI/Smal purificado de pGEMpST-SX-L118E, resultando no plasmideo pR0pST-SXA-L118E. A mistura de ligação é transformada na estirpe de expressão 4300, e as colónias bacterianas transportando o plasmideo pROpST-SXA-L118E são identificadas pela sua capacidade de produzir a proteína rpST a 42°C. EXEMPLO 1

Criação de uma "Cassete” de Hélice 2 Utilizando Simultaneamente dois Oliqonucleótidos Sintécticos 0 objectivo desta mutagénese é o de criar uma sequência

de DNA de rpST na qual a sequência de DNA que Codifica a a-hélice 2 está ligada no lado 5' (das posições 225-230 do DNA que codifica a região) por um sítio de restrição Saci e o lado 3' (das posições 285-290) por um sítio de restrição Xbal. Estas alterações na sequência do DNA não alteram a sequência de aminoácidos da rpST. A presença destes sítios de clivagem de endonuclease de restrição resulta na criação de uma "cassete de hélice 2", de modo que as mutações no DNA que codifica a hélice 2 sejam conveniente e rapidamente combinadas com as mutações apropriadas no DNA que codifica a hélice 3. A construção de pGEMpST-SX é como descrita acima. EXEMPLO 2

Substituição dos Aminoácidos Hidrofóbicos da Hélice 3 por Aminoácidos Hidrofílicos eme Estabilizam as α-Hélices com Oliqonucleôtidos Mutacénicos

Os membros desta classe de mutações incluem as mutações L118E, L115K, L115KL118E e L118EI122K. As mutações são produzidas precisamente como descrito para L118E no protocolo base. Os plasmídeos resultantes que possuem estas mutações são designados por pGEMpST-SX-L118E, pGEMpST-SX-L115K, pGEMpST-SX-L115KL118E e pGEMpST-sx-Lll8EIl22K, respectivamente. A produção da mutação L115K na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonu-cleótido mutagénico K113, representado na Tabela I é utilizado quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação. Este oligonucleótido altera a sequência da rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 115 é alterado de CTG para AAG que codifica a lisina. A produção da mutação L115KL118E na. rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico K113E116 representado na Tabela I é utilizado na reacção de mutagénese e o oligonucleótido K113E116D representado na Tabela I é utilizado na reacção de hibridação. 0 oligonucleótido K113E116 altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 115 § alterado de CTG para AAG que codifica a lisina, e o codão da leucina em 118 é alterado de CTG para GAG que codifica o ácido glutâmico. Este oligonucleótido cria assim uma dupla mutação na sequência do DNA da rpST. A produção da mutação L118EI122K na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico E116I120 representado na Tabela I é utilizado nas reacções de hibridação. 0 oligonucleótido E116K120 altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 118 é alterado de CTG para GAG que codifica o ácido glutâmico, e o codão da isoleucina em 120 é alterado de ATC para AAG que codifica a lisina. Este oligonucleótido cria assim uma dupla mutação na sequência do DNA da rpST. EXEMPLO 3

Substituição dos Aminoácidos Hidrofóbicos na Hélice 3 por Aminoácidos Hidrofílicos com Oliaonucleótidos Mutaqénicos

Os membros desta classe de mutações incluem X122E, L118T, L118K e L115E. Os plasmídeos que possuem estas mutações são designados por pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-L118T, pGEMpST--SX-L118K e pGEMpST-SX-L115E, respectivamente. A construção destas mutações é realizada precisamente como descrito para L118E, excepto para os oligonucleótidos utilizados quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação cujas sequências estão representadas na Tabela I. 0 oligonucleótido mutagénico E120 é utilizado na construção da mutação I122E (Tabela I). Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a isoleucina na posição 122 é convertido de ATC para GAG que codifica o ácido glutâmico. 0 oligonucleótido E120 é também utilizado como a sonda de detecção rádio-marcada nas reacções de hibridação, que em todos os outros aspectos é idêntico àqueles descritos acima para L118E, com a excepção de que os filtros de nitrocelulose são incubados em tampão TAC a 56°C. A construção da mutação L118T é realizada precisamente como descrito para L118E com a excepção de que o oligonucleótido utilizado quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação é L118T (Tabela I). Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 118 é convertido de CTG para ACT que codifica a treonina. Os plasmídeos contendo a mutação desejada são distinguidos dos plasmideos não possuidores da mutação após os filtros de nitrocelulose serem incubados em tampão TAC a 56°C. A produção da mutação L115E na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico E113EHDQ116, representado na Tabela I, é utilizado na reacção de mutagénese e o oligonucleótido E113D, representado na Tabela I, é utilizado nas reacções de hibridação. 0 oligonucleótido E113EHDQ116 altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 115 ê alterado de CTG para GAG que codifica o ácido glutâmico, e o codão da leucina em 118 é alterado de CTG para GAG, que codifica o ácido glutâmico, GAG, que codifica o ácido glutâmico, GAC, que codifica o ácido aspárti-co, CAC, que codifica a histidina ou CAG, que codifica a glutamina "\ / A variedade de alterações mutacionais quê ocorre na posição 118 é devida ao facto de o oligonucleõtido mutagénico ser uma mistura de quatro oligonucleótidos, produzidos durante a síntese do oligonucleõtido. A sequenciação do DNA dos clones plasmídicos resultantes que hibridam na sonda de hibridação rãdio-marcada E113D revela que eles contêm a mutação L115E, mas nenhum possui qualquer uma das quatro possíveis mutações na posição 118. Assim, esta mutagénese resulta numa só mutação simples na posição 115. A produção da mutação L118K na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que é utilizado o oligonucleótido mutagénico L118TK, cuja sequência está representada na Tabela I. 0 oligonucleõtido L118TK altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a Leucina na posição 118 é alterado de CTG para AAG que codifica a lisina ou de CTG para CAG, que codifica a treonina. As várias possibilidades para as alterações mutacionais que surgem na posição 118 são devidas ao facto de o oligonucleótido mutagénico ser uma mistura de dois oligonucleótidos, produzidos durante a síntese do oligonucleõtido. A sequenciação do DNA dos clones plasmídicos resultantes que hibridam na sonda de hibridação rãdio-marcada L118TK revela que eles contêm a mutação L115K, e nenhum possui as outras mutações possíveis, L118T, na posição 118. Assim, esta mutagénese resulta numa mutação simples na posição 118. EXEMPLO 4

Substituição deos Aminoácidos Hidrofílicos na Hélice 3 por Aminoacidos Hidrofílicos Utilizando um Oligonucleótido Mutagénico O membro simples desta classe de mutações é o mutante duplo, E119LQ123L. 0 plasmídeo que possui est$ .mutação, confirmado por análise da sequência do DNA, é pGEMpST-SX-E119LQ123L. A construção deste gene rpST mutante duplo é realizada como descrito para L118E com a excepção de ser utilizado que o oligonucleóti-do mutagénico L117,121 (Tabela I). Este oligonucleótido altera a sequência do DNA da rpST de tal modo que o DNA que codifica o ácido glutâmico ê alterado de GAG para CTG, que codifica a leucina, e o DNA que codifica a glutamina na posição 123 é alterado de CAG para CTG que codifica a leucina. A reacção de mutagénese utiliza este oligonucleótido, enquanto que o Leull7121D, cuja sequência está representada na Tabela I, é utilizado como a sonda rádio-marcada nas reacções de hibridação. Todos os procedimentos utilizados na construção desta mutação são como previamente descritos para L118E, com a excepção de que os filtros de nitrocelulose são incubados em TAC a 58°C para detec-tar os plasmídeos possuidores da mutação. EXEMPLO 5

Substituição dos Aminoácidos não Polares com Cadeias Laterais Grandes na Hélice 3 por Aminoácidos não Polares com Cadeias Laterais Pecruenas

Os membros desta classe de mutações incluem L115A, L118A e M126A. Os plasmídeos que possuem estas mutações são designados por pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-L118A e pGEMpST-SX--M126A, respectivamente. A construção destas mutações é realizada precisamente como descrito para L118E excepto para os oligonucleó-tidos mutagénicos empregues e, se necessário, para a temperatura de lavagem em TAC. A sequência do DNA do oligonucleótido mutagénico sintéctico utilizado na construção da mutação L115A, L115A está representada na Tabela I. Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 115 é convertido de CTG para GCG que codifica a alanina. 0 oligonucleótido L115A é também utilizado como a sonda de detecção radio-marcada nas reacções de hibridação. Os plasmídeos contendo a mutação desejada destinguem-se dos plasmídeos que não possuem mutações após os filtros de nitrocelulose serem incubados em tampão TAC a 56°C. A produção da mutação L118A na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico empregue quer nas reacções de mutagé-nese quer nas reacções de hibridação/análise é L118A, cuja sequência está representada na Tabela I. 0 oligonucleótido L118A altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a leucina na posição 118 é alterado de CTG para GCG que codifica a alanina. Os plasmídeos que possuem a mutação são detectados por incubação da nitrocelulose em tampão TAC a 56°C. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-L118A. A produção da mutação M126A na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico' empregue quer nas reacções de mutagéne-se quer nas reacções de hibridação/anãlise é A124-2, cuja sequência está representada na Tabela I. O oligonucleótido A124-2 altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a metionina na posição 126 é alterado de ATG para GCA que codifica a alanina. Os plasmídeos que possuem a mutação são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 56°C. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-M126A. -27-

EXEMPLO 6

Substituição da Isoleucina 122 por Leucina

Os membros desta classe de mutações incluem I122L, I122LL118A e I122LM126A. Os plasmídeos que possuem estas mutações são designados por pGEMpST-SX-I122L, pGEMpST-SX-I122LL118A e pGEMpST-SX-I122LM126A, respectivamente. A construção destas mutações é realizada precisamente como descrito para L118E ^ excepto para os oligonucleótidos mutagénicos empregues e, se necessário, para a temperatura de lavagem em TAC. A sequência do DNA do oligonucleótido mutagénico sintéctico utilizado na construção da mutação I122L, L120-3 está representada na Tabela I. Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a isoleucina na posição 122 é convertido de ATC para CTG que codifica a leucina. O oligonucleótido L120-3 é também utilizado como a sonda de detec-ção radio-marcada nas reacções de hibridação. Os plasmídeos contendo a mutação desejada destinguem-se dos plasmídeos que não possuem mutações após os filtros de nitrocelulose serem incubados em tampão TAC a 56°C.

I A produção da mutação I122LL118A na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico empregue quer nas reacções de mutagéne-se quer nas reacções de hibridação/análise é L118A, e o DNA matriz utilizado para mutagénese é o pGEMpST-SX-I122L. 0 DNA matriz é preparado precisamente como descrito para o DNA pGEMpST-SX. Os plasmídeos que possuem a mutação são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 56°C.

0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-*SX-L118AI122L. A produção da mutação I122LM126A na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico empregue quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação/análise é A124-2, e o DNA matriz utilizado para mutagénese é o pGEMpST-SX-I122L. O DNA matriz ê preparado precisamente como descrito para o DNA pGEMpST-SX. os plasmídeos que possuem a mutação são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 56 °C. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-I12 2LM12 6A. EXEMPLO 7

Substituição dos Resíduos de Aminoácidos na Superfície Hidrofílica de Hélice 3

Os membros desta classe de mutações incluem G121A, K114R, e K116R. Os plasmídeos que possuem estas mutações são designados por pGEMpST-SX-G121A, pGEMpST-SX-K114R e pGEMpST-SX--K116R, respectivamente. A construção destas mutações é realizada precisamente como descrito para L118E excepto para os oligonucleó-tidos mutagénicos empregues e, se necessário, para a temperatura de lavagem em TAC. A sequência de DNA do oligonucleótido mutagénico sintêctico útil na construção da mutação G121A, G121A/XmnI está representada na Tabela I. Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a glicina na posição 121 é convertido de GGC para GCT que codifica a alanina. Este oligonucleótido também difere da sequência do DNA da rpST de tal modo que um sítio de reconhecimento de restrição Xmnl (5'-GAAGCTATTC-3') seja incorporado na sequência do DNA da rpST. Excepto para a mutação G121A, as alterações adicionais no nucleótido não resultara em alterações na sequência de aminoácidos da proteína rpST. 0 oligonucleótido G121A/XmnI é também utilizado como a sonda de detecção radio-marcada nas reacções de hibrida-ção, que em todos os outros aspectos é idêntico àqueles descritos acima. Os clones que possuem a mutação, candidatos são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 57,5°C e por ensaio quanto à aquisição de um sítio Xmnl, que está presente no oligonucleótido mutagênico e é, por conseguinte, diagnóstico da presença da mutação G121A no clone plasmídico. O plasmídeo que possui esta mutação, confirmada por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-G121A. A produção da mutação K114R na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagênico empregue quer nas reacções de mutagé-nese quer nas reacções de hibridação/análise é K114R/AccI, cuja sequência está representada na Tabela I. 0 oligonucleótido K114R/AccI altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a lisina na posição 114 é alterado de AAG para CGT que codifica a arginina. Este oligonucleótido também difere da sequência do DNA da rpST de tal modo que um sítio de reconhecimento de restrição (5'-GTATAC-3') seja incorporado na sequência do DNA da rpST. Excepto para a mutação K114R, as alterações adicionais no nucleótido não resultam em alterações na sequência de aminoácidos da proteína rpST. Como para G121A, os clones que possuem a mutação, putativos são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 57,5°C e examinados quanto à aquisição de um novo sítio de restrição Accl que está presente no oligonucleótido mutagênico e é por conseguinte diagnóstico da presença da mutação K114R no clone plasmídico. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-K114R. A produção da mutação K116R na rpST ê-realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonu-cleótido mutagánico empregue quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação/análise é K116R/BgiII cuja sequência está representada na Tabela I. O oligonucleótido K116R/BglII altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a lisina na posição 116 é alterado de AAG para CGA que codifica a arginina. Este oligonucleótido também difere da sequência do DNA da rpST de tal modo que um sítio de reconhecimento de restrição BglII (5'-AGATCT-3') seja incorporado na sequência do DNA da rpST nas posições 342-347 da sequência de nucleótido. Excepto para a mutação K116R, as alterações adicionais no nucleótido não resultam em alterações na sequência de aminoácidos da proteína rpST. como para G121A, os clones que possuem a mutação, putativos são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em TAC a 57,5°c e examinados quanto â aquisição de um novo sítio de restrição BglII que está presente no oligonucleótido mutagénico e é por conseguinte diagnóstico da presença da mutação K116R no clone plasmídico. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-K116R. EXEMPLO 8

Substituição dos Aminoácidos Hidrofílicos na Hélice 2 por Resíduos de Aminoácidos Hidrofóbicos Utilizando Simultaneamente Dois Oligonucleôtidos Sintéticos t

O membro desta classe de mutações é a dupla mutação, S81,87L. O plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, é designado por pGEMpST-SX-S8i,87L. A sequência de DNA dos oligonucleôtidos de mutagénicos sintéticos, S81L e S87L, utilizados na construção do duplo mutante S81,87L é dada na Tabela I. Os oligonucleôtidos S81L e S87L alteram a sequência do gene rpST de tal modo‘ que o codão para a serina nas posições 81 e 87, respectivamente, é convertido de TCG para TTG, que codifica a leucina. A construção deste gene rpST mutante, duplo é precisamente como descrita pára L118E com a excepção de que ambos os oligonucleótidos de mutação são utilizados simultaneamente na reacção de mutagénese. O oligonucleõtido S81L é também utilizado como a sonda de detecção radio-marcada nas reacções de hibridação, que em todos os outros aspectos é idêntico àqueles descritos para L118E, com a excepção de que os filtros são lavados em tampão TAC a 54°C. Os transformantes bacterianos que possuem os clones plasmídicos que possuem a mutação positiva, putativos, são seleccionados, transferidos para filtros de nitrocelulose e processados para hibridação. Nesta segunda volta de análise, o oligonucleõtido S87L é utilizado como a sonda radio-marcada; os filtros são lavados em tampão TAC a 54 °c. EXEMPLO 9

Substituição dos Resíduos de Aminoácidos Hidrofóbicos na Hélice 2 por Resíduos de Aminoácidos Hidrofilicos O único membro desta classe de mutações é a dupla mutação, L82,84Q. 0 plasmídeo que possui esta mutação, confirmado por análise da sequência de DNA, ê designado por pGEMpST-SX-L82,84Q. A sequência de DNA do oligonucleõtido mutagénico sintéctico utilizado na construção da mutação L82,84Q é Q8082 e é representada na Tabela I. Este oligonucleõtido altera a sequência do gene rpST de tal modo que os codões para a leucina nas posições 82 e 84, são convertidos de CTG e CTC, respectivamente, para CAG, que codifica a glutamina. Os plasmídeos que possuem a mutação são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 58°C. EXEMPLO 10

Construção das Mutações de Combinação de Hélice 2 e Hélice 3

As várias mutações de hélice 3, I122L, M126A, e E119LQ123L, que ou retêm (I122L, M126A) ou aumentam (E119LQ123L) o carácter hidrofõbico da superfície hidrofõbica da hélice 3 são combinadas com a dupla mutação da hélice 2 hidrofõbica, S81,87L pelas seguintes reacções de subclonagem. 0 plasmídeo pGEMpST-SX-S81,87L é restringido com XbaX e EcoRI. O fragmento pequeno ê purificado por electroforese em gel de agarose e contém a mutação S81,87L. 0 plasmídeo pROpST-SXA-I122L é também restringido sequencialmente com Xbal e EcoRI, e o fragmento grande é similarmente purificado. 0 fragmento grande possui os componentes do vector de expressão pROpST e as mutações pST IX22L e as substituições de cisteína por alanina nas posições 183 e 191. Este fragmento grande e o fragmento S81,87L pequeno são juntos na presença de DNA ligase T4 e ATP. Metade da mistura reaccional é introduzida na estirpe de expressão 4300, tornada competente por tratamento com CaC^. As células transformadas são cultivadas durante a noite a 30°C. As células que possuem o plasmídeo são ensaiadas para a expressão da pST como descrito no Exemplo 12; o plasmídeo contendo esta combinação hélice 2/hélice 3 é designado por pROpST-SXA-S81,87L+I122L.

As mutações de combinação pR0pST-SXA-S81,87L+M126A e pROpST-SXA-S81,87L+E119LQ123L são construídas precisamente como descrito para pROpST-SXA-S81,87L+I122L, com a excepção de que o pROpST-SXA-M126A e O pR0pST-SXA-E119LQ123L são utilizados como a fonte dos componentes de vector de expressão e da(s) mutação(ões) da hélice 3 para produzir pROpST-SXA-S81,87L+M126A e pROpST-SXA-E119LQ123L, respectivamente.

. .V \ / A dupla mutação da hélice 2 L82,84Q é combinada com a mutação da hélice 3 L115K exactamente como descrito para S81,87L+I122L com a excepção de que a fonte de DNA de hélice 2 mutante é pGEMpST-SXA-82,84Q e a fonte da mutação de hélice 3 L115K é pR0pST-SXA-L115K. O plasmídeo contendo esta combinação é designado por pROpST-SXA-L82,84Q+L115K. EXEMPLO 11

Substituição dos Aminoácidos Hidrofóbicos na ou Próximo da Hélice l por Aminoácidos Hidrofílicos Utilizando Qlicronucleótidos Mutaqénicos 0 objectivo destas mutações é o de substituir resíduos de aminoácidos hidrofóbicos encontrados na porção de terminal NH2 de rpST por resíduos de aminoácidos hidrofílicos que estão presentes na mesma posição relativa da hormona do crescimento humano.

Os membros desta classe de mutações incluem a dupla mutação rpST Q21HH22R, a dupla mutação S11RA14D e as mutações simples A6T e A14D. Os plasmídeos que possuem estas mutações são confirmados por análise da sequência de DNA e são designados por pGEMpST—SX—Q21HH22R, pGEMpST-SX-SHRA14D, pGEMpST-SX-A6T e pGEMpST-SX-A14D, respectivamente. A construção destas mutações é realizada precisamente como descrito para L118E excepto para os oligonucleótidos mutagénicos empregues, a temperatura de incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC, e uma análise adicional para plasmídeos que possuem a mutação, positivos por digestão com uma endonuclease de restrição apropriada, se e onde apropriado. -34- A sequência de DNA do oligonucleótido mutagénico sintéctico utilizado na construção da dupla mutação Q21HH22R, Q21HH22R/ClaI/ está representada na Tabela I. Este oligonucleótido altera a sequência do gene rpST de tal modo que o codão para a glutamina na posição 21 é convertido de CAG para CAT que codifica a histidina, e a histidina na posição 22 é convertida de CAC para CGA; que codifica a arginina. Incluído nestas mutações esta um sítio de clivagem de endonuclease de restrição Ciai (5'-ATCGAT-3'), que é único no gene rpST alterado. 0 oligonucleótido Q21HH22R/ClaI é também utilizado como a sonda de detecção radio-marcada nas reacções de hibridação, que em todos os outros aspectos é idêntico àqueles previamente descritos. Todos os procedimentos utilizados na construção desta mutação são como previamente descritos para L118E, com a excepção de que os filtros são lavados em tampão TAC a 56°C. Os clones que possuem a mutação, candidatos são também ensaiados quanto à aquisição de um sítio Ciai, que está presente no oligonucleótido mutagénico e é por conseguinte diagnóstico da presença da dupla mutação Q21HH22R no clone plasmídico.

A produção da mutação A6T na rpST é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico A6T, representado na Tabela I, é utilizado quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação. 0 oligonucleótido A6T altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a alanina na posição 6 é convertido de GCC para ACC que codifica a treonina. Subsequentemente á hibridação, os filtros de nitrocelulose contendo bactérias são lavados em tampão TAC a 52°c. A produção da dupla mutação S11RA14D é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico S11RA14D/Sall é utilizado quer nas -35-

reacções de mutagénese quer na reacção de hibridação, e de que os filtros de nitrocelulose são lavados em tampão TAC a 64°C. O oligonucleótido S11RA14D/Sall altera a sequência rpST de tal modo que o codão da serina na posição 11 é convertido de AGC para CGA que codifica a arginina, e o codão da alanina na posição 14 é convertido de GCC para GAC, que codifica o ácido aspãrtico. Este oligonucleótido também difere da sequência do DNA da rpST de tal modo que um sítio de reconhecimento de restrição Sall (5'-GTCGAC-3') é incorporado na sequência do DNA da rpST das posições 29-34 da sequência de nucleótidos. Excepto para as mutações S11R e A14D, as alterações adicionais no nucleótido não resultam em alterações na sequência de aminoãcidos da proteína rpST. Os clones que possuem a mutação, putativos são examinados quanto â aquisição de um novo sítio de restrição Sall que está presente no oligonucleótido mutagénico e é por conseguinte diagnóstico da presença da dupla mutação S11RA14D no clone plasmídico. A produção da mutação simples A14D é realizada precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que o oligonucleótido mutagénico A14D/Hindlll é utilizado quer nas reacções de mutagénese quer nas reacções de hibridação. O oligonucleótido Al4D/HindIII altera a sequência rpST de tal modo que o codão para a alanina na posição 14 é convertido de GCC para GAC que codifica o ácido aspãrtico. Este oligonucleótido também difere da sequência do DNA da rpST de tal modo que um sítio de reconhecimento de restrição HindIII (5'-AAGCTT-3') é incorporado na sequência do DNA da rpST nas posições 30-35 da sequência de nucleótido.

Excepto para a mutação A14D, as alterações adicionais no nucleótido não resultam em alterações na sequência de aminoácidos da proteína rpST. Os clones que possuem a mutação, putativos são detectados por incubação dos filtros de nitrocelulose em tampão TAC a 62°c e examinados quanto à aquisição de um novo sítio de restrição HindIII que está presente no oligonucleótido mutagénico e é por conseguinte diagnóstico da presença da mutação A14D no clone plasmídico. EXEMPLO 12

Reconstrução de Mutações pST em Plasmídeos de Expressão Bacteriana Apropriados

Os clones (que possuem a mutação) alterados são reconstruídos em derivados do plasmídeo de expressão bacteriana pR0211 (descrito no Pedido de Patente EP0173280 aqui incorporado por referência), designados por pROpST, pROpSTA34 e pR0pSTE34. O plasmídeo pROpST contém DNA de pST clonado no vector de expressão pR0211 e contém DNA que codifica a cisteína nas posições 183 e 191; o pROpSTA34 contém DNA que codifica a alanina e o pROpSTE34 contém DNA que codifica o ácido glutâmico nestas posições. Os clones alterados pGEMpST são digeridos com EcoRI e Smal e o fragmento que possui a mutação pST pequeno, isolado. 0 DNA pROpSTA34 é similarmente tratado, e o fragmento de DNA que contém o vector, grande, é isolado. Estes fragmentos purificados são ligados entre si com DNA ligase T4 e transformados numa estirpe bacteriana apropriada, por exemplo 4300. Esta estirpe contém um repressor S57 lambda sensível â temperatura (cl ), de tal modo que a expressão do promotor lambdaPT seja impedida a 30eC, mas permitida a 42°C, temperatura à qual o repressor é inactivado. A introdução dos fragmentos de DNA pGEMpST alterados no DNA pROpSTE34 é realizada precisamente como descrito para pROpSTA34. A introdução de fragmentos de DNA pGEMpST alterados em pROpST é idêntica àquela descrita para pROpSTA34, com a excepção de que quer o plasmídeo pGEMpST quer o plasmídeo pROpSTA34 são digeridos com EcoRI e HindIII. A Tabela II regista os plasmídeos de expressão bacteriana nos quais os genes pST mutados são introduzidos. As mutações pST A6T, S11RA14D e Q21HH22R são introduzidas num derivado de pROpSTE34 como descrito para pROpSTE34. Este derivado, pROpSTE34T^T2, contém um fragmento HindIII ca. lkb no terminal 3' do DNA que codifica pST, que contém o terminador de transcrição T1T2 do operão rrnB de E. coli (o operão B de RNA ribossómico).

V -38-

TABELA II CONSTRUÇÕES DO VECTOR DE EXPRESSÃO; CONSTITUIÇÃO DOS AMINOÁCIDOS NAS POSIÇÕES 183 E 191 -

Mutacao

Aminoâcido codificado em 183 e 191 cisteína_alanina ácido qlutâmico

I

I122L + + L115K + + L118E + + L115KL118E + + L118EI122K + + L115E + I122E + + L118T + L118K + E119LQ123L + + L115A + + L118A + + M126A + + L118AI122L + I122LM126A + + S81,87L + L82,84Q + S81,87L+E119LQ123L + " +I122L + " +M126A + L82,84Q+L115K + ++ +

A14D A6T S11RA14D Q21HH22R A6TS11R A6TS11R+I122L +* +* +* +* + ''Ή-*

P8TS11R+I122L + +

P8TS11R * Contém também a sequência terminadora de transcrição T-T_ do operão rrnB de E. coli. 1 2 EXEMPLO 13 CONSTRUÇÃO DE MUTANTES DE COMBINAÇÃO DE HÉLICE 1 A6TS11R+E34 E P8TS11R+E34 A dupla mutação A6TS11R, na qual a alanina na posição 6 é substituída por treonina e a serina na posição 11 é substituída por arginina, é combinada com as mutações E34 (descritas na EP355460), nas quais o DNA que codifica a cisteína nas posições 183 e 191 é substituido por ácido glutâmico. Por consequência, o gene rpST resultante contém mutações quer nas regiões que codificam NH2 (A6TS11R) quer nas regiões que codificam COOH (E34) do DNA da rpST. 0 plasmídeo resultante é designado por pR0pSTE-A6TSHR. 0 fragmento EcoRI/Smal que contêm rpST, pequeno, alterado, de pML/pGH14, que contém as mutações A6TS11R, é ligado ao fragmento EcoRI/Smal grande do plasmídeo pROpSTE-T^. Este último plasmídeo é o plasmídeo de expressão pST, que também contém o termina-dor de transcrição forte do operão rrnB de E. coli (T T ) no terminal 3' do DNA que codifica rpST.

Uma outra dupla mutação, P8TS11R, na qual o DNA que codifica a prolina na posição 8 é mutado para codificar a treonina, e o DNA que codifica a serina é mutado para codificar a arginina, é combinada com as mutações E34 (descritas na EP355460), nas quais o DNA que codifica a cisteína nas posições 183 e 191 é substituido por ácido glutâmico. Por consequência, o gene rpST resultante contém mutações quer nas regiões que codificam NH2 (P8TS11R) quer nas regiões que codificam COOH (E34) do DNA da rpST. O plasmídeo resultante é designado por pR0pSTE-P8TSHR. É utilizada a mesma estratégia na construção do pR0pSTE-P8TSHR que para o pR0pSTE-A6TSllR, com a excepção de que é utilizado o plasmídeo pML/pGH18, que contém a dupla mutação P8TS11R, como a fonte do DNA de rpST alterado. A6TS11R&I122L-KE34 E P8TS11R+I122L+E34 : A mutação de hélice 3 1122L descrita acima é combinada com cada uma das duas mutações de hélice 1, A6TS11R e P8TS11R e as mutações E34. Os plasmídeos resultantes são designados por pROpST-SXE-A6TSHR+I122L e pML/pGH18-SXE-I122L, respectivamente. 0 pROpST-SXE-A6TSHR+I122L é construído por ligação do fragmento BssHII/HindlII contendo I122L, pequeno com o fragmento BssHII-/HindlII grande purificado a partir do pR0pSTE-A6TSHR. Este plasmídeo resultante contêm a cassete de hélice 2, definida pelos sítios de restrição Saci e Xbal que flanqueiam as extremidades 5' e 3' do DNA que codifica a hélice 2, previamente descrito mas que não contém o terminador de transcrição T^T2 * ° P-*-asm^eo pML/pGH18--SXE-I122L é construído de uma maneira idêntica com a excepção de que é utilizado o plasmídeo pML/pGH18 como a fonte do fragmento grande, possuindo as duplas mutações P8TS11R. Este plasmídeo alterado não contêm o terminador de transcrição Ί^Ί^, e possui a cassete de hélice 2. EXEMPLO 14

PREFIS DE ESTABILIDADE DAS SOMATOTROPINAS RECOMBINANTES MODIFICADAS O procedimento descrito para determinar os perfis de estabilidade é como se segue. É preparada a solução concentrada do derivado de somatotropina (animal) recombinante (até lOOmg/ml) em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (NaH2P04H20 3,45 g, Na2HP04 3,55 g, NaCl 9,50 g dissolvidos em água destilada 1000 ml). Esta é filtrada através de uma unidade de filtração Millex de 0,22μιη, estéril, millipore e as aliquotas de 0,1 ml colocadas em tubos. Estes são colocados numa estufa a 43°C e removidos aos intervalos requeridos. Os conteúdos são então diluídos com -41-

solução salina tamponada com fosfato. 0 sobrenadante é ensaiado quanto ao conteúdo monómero e dímero por HPLC. É feito um balanço de massa. É registado qualquer material percipitado. Os resultados são comparados com as concentrações iniciais e é elaborado um prefil de estabilidade.

Alternativamente, um derivado de somatotropina exibindo fraca solubilidade a pH 7,4 é dissolvido a um pH menos preferido (4-10) ou é avaliado como uma suspensão.

J

Os resultados dos estudos de estabilidade em solução para as proteínas rpST alteradas estão sumariados na Tabela III.

TABELA III

SOLUBILIDADE DA PROTEÍNA MUTANTE roST IN VITRQ

Dias

Mutação_% Solúvel_Incubada a 43 °C A34 I122L+A34 E34 I122L+E34 A6TS11R+E34 P8TS11R+E34 A6T S11R+I122L+E3 4 P8TS11R+I122L+E34 L118K+A34 E119LQ123L+A34 L115A+A34 L118A+A34 M126A+A34 L118AI122L+A34 I122LM126A+A34 S81,87L+A34 S81,87L+E119LQ123L+A34 S81,87L+I122L+A34 S81, 87L+M126A+A34 32 14 44 14 70,0(3) 14 67 17 62,0(2) 14 66,3(3) 17 68,5(2) 14 62 14 36 14 2 14 0 3 0 3 0 3 10 7 18 3 2 7 22 (2) 19 0 3 0 7 8 7 0 3 A percentagem de solubilidade é expressa como a fracção do remanescente em solução, total, x 100. (Ver Exemplo 14). Onde for feita mais do que uma determinação, é apresentada uma % de solubilidade média e o número de determinações independentes é dada em parêntesis. Os mutantes rpST estão presentes quer nos antecedentes A34 quer nos E34. A rpST A34 contém alanina, em vez de cisteína, nas posições 183 e 191. A rpST E34 contém glutamato em vez de cisteina nas posições 183 e 191. EXEMPLO 15

0 PROCESSO DE TESTE EM RATAZANAS HYPOX PARA DETERMINAR O AUMENTO DE CRESCIMENTO DE ANIMAIS QUE RECEBEM O DERIVADO DE SOMATOTROPINA (ANIMAL) RECOMBINANTE A eficácia dos derivados de somatotropina animal recombinante do presente invento para alterar a taxa de crescimento de animais é determinada utilizando o ensaio em ratazanas hipofissectomizadas (hypox). A ratazana hipofissectomizada não produz a sua própria somatotropina e é sensível à somatotropina injectada. A resposta medida cresce durante um período de tempo tal como 10 dias e é apresentada na Tabela IV como percentagem da actividade biológica do controlo positivo de rpST, que é incluído em todas as experiências.

TABELA IV

DADOS BIOLÓGICOS (RATAZANAS HYPOX, RRA) E ESTABILIDADE TÉRMICA PARA PROTEÍNAS MUTANTES rpST

Mutação iões) Ratazana Hvooxa RRAb T. . A34 112,8 173,5 -(Ttrr— nd I122L+A34 97,4 225,8 79 E34 90,52(5) 51,4(7) 62,0(6) I122L+E34 66,66(5) 80,28(5) 62,67(5) L115K 0,3 1,2 >83 L115K+E34 0,8 0,9 79 L118K 1,8 43,9 36 E119LQ123L 33,8 80,2 49 L115A 88,6 163 50 L118A 64(3) 49,5 57 M126A 100 122 55 L118AI122L 38,9 57,9 56 I122LM126A 66,25(2) 82,55(2) 63 S81,87L 46,9 194 40 S81,87L+E119LQ123L 40,4 177,9 38 S81,87L+I122L 71,3 165 47 S81,87L+M126A 79,7 186 47 L82,84Q 9,7(2) 3,4 nenhuma observada K114R+E34 121,3 53,2 62 A6TS11R+E34 80,7(4) 135,0(4) 64,0(4) P8TS11R+E34 129,7 78,5 65 A6TS11R+I122L+E34 116,7 112,8 61 P8TS11R+I122L+E34 127,9 89,3 64 cl ' ^

Os resultados da ratazana hypox são dados còmo percentagem da actividade da rpST padrão utilizada como controlo positivo. os resultados do ensaio de radio-receptor do fígado RRA são dados como percentagem da actividade observada com a rpST padrão, nd: não determinada

Onde for feita ma is do que uma determinação, é dada uma média, com o número de determinações dadas em parêntesis. EXEMPLO 16

ENSAIO DE RADIO-RECEPTOR DO FÍGADO PARA A DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE ALTERADA SE LIGAR AO RECEPTOR DE SOMATOTROPINA IN VITRO

Um ensaio de radio-receptor in vitro é empregue para avaliar a capacidade das somatotropinas recombinantes do presente . . 125 invento para competir com Ι-rpST na ligação ao receptor de somatotropina das membranas de fígado purificadas. Os resultados destes ensaios são dados como percentagem da ligação rpST e são apresentados na Tabela IV. EXEMPLO 17 EXPERIÊNCIAS DO EQUILÍBRIO DE AZOTO CONDUZIDAS EM rpST MUTANTE I122L+E34

Para avaliar a actividade biológica das proteínas rpST alteradas que possuem a mutação I122L in vivo, é conduzido um estudo de equilíbrio de azoto como descrito na EP355460. A administração subcutânea de pST a porcos em crescimento aumenta a quantidade de proteína depositada no corpo, principalmente como músculo. A utilização de um teste de equilíbrio de azoto proporciona uma medida da mudança na quantidade de proteína depositada -46-

por um animal. Uma vez que a proteína contém uma quantidade fixa de azoto, a análise de substâncias alimentares e excrementos quanto ao azoto proporciona uma estimativa exacta do estado de depósito de proteína. Assim, o equilíbrio de azoto é tuna medida da quantidade de azoto consumido na alimentação e a quantidade excretada na urina e fezes com a quantidade retida (depositada) calculada pela diferença. A retenção de azoto é mais precisamente calculada como a quantidade de azoto retido como uma percentagem da quantidade de azoto digerido (azoto consumido menos azoto nas fezes). Neste estudo, os resíduos de cisteína nas posições 183 e 191 ou a variante rpST I122L foram substituídos por ácido glutâmi-co. Os resultados desta análise demonstram a actividade biológica completa da molécula rpST alterada relativamente à rpST de controlo. EXEMPLO 18

DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TÉRMICA UTILIZANDO ESPEC-TROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA A estabilidade térmica da rpST alterada é deduzida da medição da fluorescência intrínseca do triptofano como uma função da temperatura. A molécula rpST contém um único resíduo triptofano, cuja fluorescência intrínseca é severamente apagada no "estado nativo". 0 aumento da temperatura, ou a diminuição do pH, causa um aumento característico na fluorescência, que é devido, presumivelmente, a uma perda de estrutura pelo menos na vizinhança imediata do resíduo de triptofano de outro modo enterrado "buried". Um "perfil de fusão" de fluorescência versus aumento de temperatura revela uma curva sigmoidal, em que a fluorescência permanece extinta até uma temperatura que é característica para um dado derivado rpST. Segue-se então um aumento rápido na fluorescência durante um intervalo de temperatura relativamente -47-

estreito. A temperatura que define o ponto médio deste aumento na fluorescência é designada por e é um reflexo da estabilidade térmica da proteína. A da rpST do presente invento é deter minada pelo processo de Burger, et al. 1966, com a excepção de que ê utilizado 295 nm como o comprimento de onda de excitação e a emissão de fluorescência é lida utilizando um filtro "cut off" I de 355 nm. A T^ da rpST do presente invento está sumariada na

Tabela IV. Estes dados revelam um aumento marcado na T, . de 79°C (m) para I122L. ) EXEMPLO 19

Produção da Mutação 1122L pelo Processo de Reaccão em Cadeia de Polimerase

J A mutação 1122L é introduzida no gene rpST por mutagê-nese dirigida ao sítio utilizando uma aplicação de tecnologia de reacção em cadeia de polimerase como descrito por Sarkar e Sommer 1990, aqui incorporada por referência. Os três iniciadores dos oligonucleótidos utilizados são representados na Tabela I e incluem os oligonucleótidos Sacl293, L120-3 e PvuII634. O fragmento EcoRI/HindIII contendo o gene rpST do plasmídeo pGEMpST-SX é utilizado como a matriz. São realizados quinze ciclos de reacção em cadeia de polimerase (em seguida referidos como PCR) em l ng de DNA de rpST matriz com 1 juM de cada um dos iniciadores dos oligonucleótidos L120-3 e PvuII634, dNTPs e DNA polimerase Tag, como especificado pelo fabricante. Esta reacção resulta num fragmento de DNA de 227 pb, que contêm a mutação I122L. Este fragmento é purificado por electroforese em gel de agarose e é utilizado como um iniciador de PCR em combinação com o iniciador do oligonucleótido SacI293 e o fragmento matriz EcoRI/HindIII contendo rpST em 15 ciclos adicionais de PCR. O fragmento de 361 pb resultante é clivado com endonucleases de restrição Saci e : Λ' -

PvuII, purificado por electroforese em gel'de agarose e ligado no fragmento grande de DNA SacI/PvuII pGEMpST-SX, purificado em gel. A mistura de ligação é transformada em células competentes HB101. 0 DNA plasmídico dos transformantes resultantes é analisado quanto à presença da mutação I122L precisamente como descrito para L118E, com a excepção de que é utilizado o oligonucleótido L120-3 como a sonda de hibridação radio-marcada e só é realizada uma volta de análise. A presença da mutação I122L e a ausência de mutações adicionais introduzidas pelas reacções PCR é confirmada por análise da sequência de DNA. 0 plasmídeo que possui esta mutação é designado por pGEMpST-SX-I122LpcR. EXEMPLO 20

Reconstrução da Mutação rpST 1122L num Plasmídeo Adequado oara Expressão em Levedura

De modo a expressar o gene rpST que possui a mutação I122L na levedura, Saccharomvces cerevisiae. o DNA que codifica a rpST deve ser ligado operativamente a uma sequência promotora derivada desta levedura. As extremidades do fragmento NedI/HindIII que possui rpST, pequeno de pROpST-SXE-I122L são niveladas por tratamento deste DNA com o fragmento Klenow grande de DNA poli-merase I após o plasmídeo ser clivado com Ndel e HindIII. Este fragmento é purificado por electroforese em gel e ligado ao fragmento Sall/Sphl grande do plasmídeo YEp352-2. As extremidades deste último fragmento são niveladas por tratamento com nuclease Sl. Este plasmídeo é um derivado YEp352, que foi modificado para conter adicionalmente o promotor GAL1/GAL10 divergente (Johnston e Davis, 1984), e a região não traduzida 3' derivada do gene STE7 (Teague, et al. 1986) . 0 plasmídeo resultante é designado por YEp352-pST-I122L (Figura 5). -49-

A expressão desta variante rpST em ^levedura é realizada por cultura de células de levedura transformadas com este plasmí-deo num meio completo sintético (Sherman, Fink e Hilks, 1986), que carece de uracilo e contém galactose a 2% como a único fonte de carbono a 30°C durante várias horas, ou sempre que necessário para realizar indução da gene rpST e a produção de rpST, máximas. Embora, qualquer estirpe de levedura que possua uma mutação no gene URA3 possa ser utilizada como o hospedeira, é preferível empregar uma estirpe de levedura que seja deficiente na produção de protease e seja GAL+, tal como BJ5457 (genotipo MATa pep4::HIS3 prbl-/\ trpl ura3-52 leu2-/\ his3-/\ lys2-801 canl GAL+). Esta estirpe está depositada no Yeast Genetic stock Center, University of Califórnia, como BJ5457.

J

V

Bibliografia 1. Abdel-Meguid et_al. (1987)., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84/ 6434-6437 2. Brems, Biochemistrv 27. 4541-4546 (1988). 3. Brems et al. (1986), Biochemistrv 25. 6539-6543. 4. Brems et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84, 3367-3371. 5. Burger, H.G., Edelhoch, H. e Condliffe, P.G., (1966) Endocrinoloay 78f 98-102. 6. Chen, W.Y. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 87, 5061-5065. 7. Johnston e Davis, (1984) Molecular and Cellular Biologv 4. 1440-1448. 8. Sarkar e Sommer, Biotechnigues 8. 404-407 (1990). 9. Teague et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 83., 7371-7375. 10. Sherman, F., Fink, G. R. e Hicks, J. B., (1986) "Laboratory Course Manual for methods in yeast geneties", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY pags.163-168. 51-

Listagem da Sequência (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID P: : 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 193 (B) TIPO: ácido nucleico

(C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (iii) HIPOTÉTICO: (ÍV) ANTI-SENSO: (v) TIPO DE FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: (B) ESTIRPE: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: (D) FASE DE DESENVOLVIMENTO: (E) HAPLOTIPO: 52-

(F) TIPO DE TECIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINHA DE CÉLULAS: (I) ORGANELO:

(vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONE: (VÍii) POSIÇÃO NO GENOMA: (A) CROMOSSOMA/SEGMENTO:· (B) POSIÇÃO NO MAPA: (C) UNIDADES:

(IX) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: (B) LOCALIZAÇÃO: (C) PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO: (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: -53- (A) AUTORES: (B) TÍTULO: (C) JORNAL: (D) VOLUME:

(E) REVISTA: (F) PÁGINAS: (G) DATA: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: (I) DATA DO REQUERIMENTO: (J) DATA DA PUBLICAÇÃO: (K) RESlDUOS IMPORTANTES:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NS: 1:

J

J -54-

ATG GAT CAA TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA . , 36 Met Asp Gin Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu 1 5 10 TTT GCC AAC GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC 72 Phe Ala Asn Ala Vai Leu Arg Ala Gin His Leu His 15 20 CAA CTG GCT GCC GAC ACC TAC AAG GAG TTT GAG CGC 108 Gin Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys GlU Phe Glu Arg 25 30 35 GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC TCC ATC CAG 144 Ala Tyr Ile Pro Glu Gly Gin Arg Tyr Ser Ile Gin 40 45 AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC 180 Asn Ala Gin Ala Ala Phe Cys Phe Ser GlU Thr Ile 50 55 60 CCG GCC ccc ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA 216 Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gin Gin Arg 65 70 TCG GAC GTG GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC 252 Ser Asp Vai Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu -75 80 ATC CAG TCG TGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC 288 Ile Gin Ser Trp Leu Gly Pro Vai Gin Phe Leu Ser 85 90 95 AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTT GGC ACC TCA 324 Arg Vai Phe Thr Asn Ser Leu Vai Phe Gly Thr Ser 100 • 105

-55- ι )

GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG Asp Arg Vai Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu 110 115 120 GGC ATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC Gly Ile Gin Ala Lgu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly 125 130 AGC CCC CGG GCA GGA CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC Ser Pro Arg Ala Gly Gin Ile Leu Lys Gin Thr Tyr 135 140 GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT GAT GAC GCG Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp Ala 145 150 155 CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 160 165 AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Vai 170 175 180 576 ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC Met Lys Cys Arg Arg Phe Vai Glu Ser Ser Cys Ala 185 190

TTC

Phe 579

Claims

-N Reivindicações lâ. - Processo para a preparação de uma somatotropina, caracterizado por se proceder a uma mutação da referida somatotropina na região de alfa-hélice 3, tornando assim a referida somatotropina mais solúvel do que a forma nativa da referida somatotropina, mantendo ainda a actividade biológica numa formulação de libertação retardada. 2a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina humana, de bovino, porcino, ovino, caprino, equino, peixe ou ave. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida mutação da alfa-hélice 3 compreender: I122L, L115E, L115K, L115KL118E, L118E, L118T, L118K, L118EI122K, I122E, E119LQ123L, M126A, L118A, G121A, K114R, K116R, I122LM126A OU I122LL118A. 4â. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida mutação da alfa-hélice 3 ser I122L.
53. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina de porcino ou bovino.
63. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina de porcino.
73. - Processo para a preparação de uma somatotropina caracterizado por se proceder a uma mutação da referida ν; somatotropina na região de alfa-hélice 2, tornando assim a referida somatotropina mais solúvel do que a forma nativa da referida somatotropina, mantendo ainda a actividade biológica numa formulação de libertação retardada. 8â. - Processo de acordo com a reivindicação 7, carácter izado por a referida somatotropina ser somatotropina humana, de bovino, porcino, ovino, caprino, equino, peixe ou ave. 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 8, carac-terizado por a referida mutação da alfa-hélice 2 ser S81,87L ou L82,84Q. 10s. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina de porcino ou bovino. lia. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina de porcino. 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder adicionalmente a uma mutação da referida somatotropina na região de alfa-hélice 2. 13â. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina humana, de bovino, porcino, ovino, caprino, equino, peixe ou ave. 14a. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida mutação da alfa-helice 2 ser S81,87L ou L82,84Q. 15a. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida mutação da alfa-hélice 3 compreender: I122L, L115E, L115K, L115KL118E, L118E, L118T, L118K, L118EI122K, I122E, E119LQ123L, M126A, L118A, G121A, K114R, K116R, I122LM126A ou I122LL118A. 16a. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida mutação da alfa-hélice 3 ser 1122L. 17a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as cisteínas nas posições 183 e 191 serem substituídas por ácido glutâmico. 18a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por das quatro (4) cisteínas, duas na ansa pequena e duas na ansa grande, pelo menos uma (l) ser eliminada. 19â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por as quatro cisteínas serem modificadas para ácido cisteico. 20a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por as cisteínas nas posições 183 e 191 serem substituídas por ácido glutâmico. 21a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por das quatro (4) cisteínas, duas na ansada pequena e duas na ansa grande, pelo menos uma (1) ser eliminada. 22â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por as quatro cisteínas serem modificadas para ácido cisteico. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por as cisteínas nas posições 183 e 191 serem substituídas por ácidos glutâmicos. 24â. - Processo de acordo com a reivindicação 7f caracterizada por das quatro (4) cisteínas, duas na ansa pequena e duas na ansa grande, pelo menos uma (1) ser eliminada.
253. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por as quatro cisteínas serem modificadas para ácido cisteico. 263. - processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por as cisteínas nas posições 183 e 191 serem substituídas por ácidos glutâmicos.
273. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por das quatro (4) cisteínas, duas na laçada pequena e duas na laçada grande, pelo menos uma (1) ser eliminada.
283. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por as quatro cisteínas serem modificadas para ácido cisteico.
293. - Processo de realização da mutagénese dirigida ao sítio numa proteína ou polipéptido recombinantemente derivado, caracterizado por compreender: a clonagem de um segmento de DNA por produção de um DNA de cadeia simples desnaturado/renaturado a um oligonucleõtido sintético que é complementar de uma porção do referido DNA e em que o referido oligonucleõtido contém uma região de mau emparelhamento do referido DNA; a preparação do referido DNA de cadeia dupla; a transformação do referido DNA de cadeia dupla num hospedeiro apropriado para poloriização; a selecção das sequências mutadas que correspondem â referida hibridação do oligonucleótido; a reconstrução das referidas sequências seleccionadas em plasmídeos de expressão; e a expressão da referida proteína ou polipéptido recombinantemente derivado, resultante. 30a. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o referido oligonucleótido conter um sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição próximo do sítio da referida mutação. 31â. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por os referidos clones contendo os sítios de reconhecimento da endonuclease serem digeridos com a endonuclease de restrição desejada. 32a. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a referida proteína ou polipéptido recombinantemente derivado ser uma somatotropina. 33a. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina humana, de bovino, porcino, ovino, caprino, equino, peixe ou ave.
343. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido oligonucleótido ser SacI293, Xbal353, S81L, S87L, Q8082, K113, E116, K113E116, E116K120, E120, L120-3, -61- Α124-2, E113EHDQ116, E113D, L115A, L118A, L118TK, L118T, L117,121, Leull7121D, K114R/AccI, G121A/XmnI, K116R/BglII, A14D/HindIII, A6T, S11RA14D/Sal, Q21HH22R/ClaI ou PVUII634. Lisboa, 29 de Novembro de 1991

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.» 1200 LISBOA