TW205045B - - Google Patents

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五、發明説明（ Λ () Β6 .................Γ. (請先閲誚你兩之i!tv.al事項#塡寫本頁) 裝. 線- 經濟部屮央櫺準局Μ工消#合作杜印3i 發明背景 本發明 蟋旋3區 重姐體產 中產生變 種動物之 長加強p 伴随脂質 生長激素 加及伴随 生長激 然而在某 某種家畜 植入裝置 置，其可 是有闞生 及/或α 製之多肽 化之方法 生長情形 用家畜 減少*而 之動物， 飼料消耗 素之外源 些例子· 時，一種 長激素 —嫌旋 或蛋白 。外源 •特別 中之特 生成較 其飼料 上之減 投予可 其他投 可令生 將是有用的。一 類似物· 2區中有 質之α — 生長激素 是家畜動 別特擞在 大型而無 效率也顯 少。 以許多方 槩路徑可 長激素於 個更佳之 令於一定時間内持績釋出 (約500奄克/ 形成傾向之生長 性集结物。 高濃度之生長激素 溶解度及低不溶物 用法需生物上不活 生長激素含有4個α —螺旋，其 其·中在該生長激素α — 胺基酸的變化· Μ及在 螺旋3，Μ及其他區域 之投予可顯著地增加各 物如豬、也有魚。此生 於肌肉團塊之增大，並 脂肪之動物。接受外源 著地改進，由於播重增 法達成，如每天注射。 能較佳。例如，當處理 一定時間內持續釋出之 投槩路徑是利用植入裝 。此種裝置可含有大量 奄升）。再者，對具高 激素分子，對此種通送

Abdel-Mequid e t 核心之胺基酸側鐽 Μ排除極性溶劑（ 生長激素之例子中 在蛋白質湄度超過 姐合形成Ct 一螺旋束（ 型而言，突出至此结構 性且極緊密壓緊在一起 至束中心之港透。於牛 其在一级序列上與豬生長激素有闞* a 1, 1 987) ° 典 係非極性。疏水 如水或食鹽水） 1毫克/毫升下 一螺旋3區疏水性 本紙尺度边用中a S家楳iHCNSJlM規格（210x297公货） 3 20504b Λ 6 η 6 五、發明説明 經濟部中央櫺準局A工消费合作社印製 面之曝出 中間物# (Brems 可代表來 填排列， 再分開。 白霣片缉 伸長此螺 代，可大 )0 本發明 素低溶解 的突變作 可供突變 位置指令 入外來基 區是對生 1990) 〇 此外， (由胺 之形成 e t a 1 自許多 造成多 聯合中 之加入 旋之疏 大地加 藉著改 度之問 用來活 作用。 的突變 團老鼠 長活性 α —燦 區之突變* Μ及 雙重突變作用* 胺酸之DNA所取 於 ΕΡ 355460 · 變作用，可生成 基酸殘基tyr110至leu127)可促進Λ聯合 *其被假定於集结形.成上為一種成核作用 1986 ； Brems,1988)。這些聯合中間物· 個別生長激素分子之此α-螺旋之另一充 元结構，其中此螺旋之疏水面與水性環境 間物之形成可為過多的含α—螺旋3匾蛋 所阻斷（Breas, et al, 1986)。此外， 水面•藉第112位置之賴胺酸用白胺酸取 重形成聯合中間物之傾向（Brems, 1988 變生長激素α —螺旋3區而著手於生長激 題。特言之，Μα —螺旋3區之位置指令 體外加強豬之生長激素。疏水及親水面均 近來，在豬生長激素之α —螺旋3區上之 作用*可造成可表現突變型生長激素之導 生長上之遏止，由此结果推測α —螺旋3 十分重要的一個匾域（Chem et al, 旋3區之突變並加上適當時螺旋1區或2 第183及191位置編碼半觥胺酸DNA處之 此處編碼半胱胺之DN A為編碼丙胺酸或毅 代。於183及191位置之雙重突變作用述 在此列為本案參考。烴由此處所揭示之突 溶解度（安定性）加強之生長激素•由是

先 W) 讀 背 而 之 J主 意 事 項 m 寫 本一N 裝 訂 h紙张尺度边用中a Η家榀準（CNS) Ή規tM210x297公:《) η, r r 2 經濟部中央榀準灼A工消赀合作杜印5i 五、發明説明（3) 對持續之釋出有加強的特性。豬生長激素特&可Μ持續釋 出型式使用，且因此是最令人感興趣•之生長激素° 本突變作用一個特別有用的實例是突變作用I122L ·其 中在α —螺旋3區122位置之異白胺酸為白胺酸所取代。 加上第183及191位置的其他突變作用（比中半胱胺酸被 丙胺酸所取代），可得到在蛋白質單一色胺酸殘基轉變溫 度上顳著地Jt加。轉變溫度是蛋白霣熱安定性的一個棟準 T · 。於一個最佳之突變中，當II22L突變作用與第183及 191位置半胱胺酸煸碼DH A改變成編碼穀胺酸之突變作用 混合•可得加強的溶液安定性。 附圖之簡要說明 / 圖1 :重姐豬生長激素（rpST) DNA之限制興圓。寬的實 線代表編碼rpST DNA之胺基酸部份；细長線代表5’及3’二 側之未编碼DNA序列。接受位置指令突變作用之匾域搮上 數字·且示於限制輿圔下方，其中數字1表示煽碣α —螺 旋1區之DNA ·數字2表示編碼α—螺旋2匾之DNA ·數 字3表示編碼α —嫘旋3區，而數字4代表钃碼183及 191位置之半胱胺酸DNA 。輿圃上方的字母表示各種核酸 内切限制_之位置，其中RI=EcoRI 、N=NdeI、Β = BssHII、S=SacI、X = Xbal ' Sm = SmalM H = Hindlll 0 ' • ·； · 圖2 :質髑pEFF-902之結構及限制興圖。此質體含有 PBR322複製源（〇ri )及氨苄冑徽素抗性基團、啟動 -基圑、ell核糖體结合位置及cl遏止基團（來自噬菌體λ (請先閲讀货面，之注糸事項孙塥寫私貝) 裝- 線- 本紙張尺度边用中困Β家樣準(CNS)TM規格（210X297公龙） 5 A 6 Π6 經濟部屮央榀準而只工消费合作社印製 205045 五、發明説明（4 )，來自大腸桿菌rrnB操縱子之TiL轉錄作 自調控區而無啟動基團之60bp序•列，及 rpST基團。示出相闞之限制位置。M EcoRI 而自此質應中切出含r* p S T之D N A ·並如文中 突變作用載H PGEM32 ( f+ )。 圖3 : PGHGEM32之结構及部份限制輿画。此 DNA裡興源」pBR322複製源（Ori )及氨苄 圏，SP6及T7啟動基團，lacZ基團ell核糖 來自噬菌體λ)及rpST基團（命名為rpGH) 體DMA充作位置指令突變作用中之横板，如 圓4 :細菌表現質JgpROpST用於重姐體豬生 (大腸桿菌）中之產製。ell核糖《结合位 及Ndel限制位置之間。rpST之轉譯啟始密碼 Ndel位置中。表現由人卩|^啟動基團驅動。 圓 5 :酵母表現質S9YEp352—pST — I122L 體是YEp352之衍生物，且含rpST突變作用一 表現由釀酒酵母之可誘等的GAL1/GAL10所 譯DNA係衍生自酵母STE7基團。2 « m要件 母中複製•且URA3提供轉形细胞於酵母菌中 標記。此質雅也攜有PBR322複製源（未示出 素之抗性基團。 窃明蓼點 本發明是有闞生長激素•其在生長激素分 3區及/或α—螺旋2區中有胺基酸序列之 用终结子•來 命名為PGH之 及Hindll處理 所述地選殖至 質體含fl 青徽素抗性基 體结合位置（ 。單股噬菌質 文中所述。 長激素於细菌 置位在EcoRI 子包埋在 之结構。此質 I122L -，其 顆動。3’未轉 支持質體於酵 篩選之可篩選 )及氨苄青嫌 子之0[—燦旋 變化。生成之

Tk 先 閲 讀 背 而 之 «I · Ίΐ- 意 事 項 填 寫 本' 頁 本紙泜尺度边用中國Η家楳準(CNS)TM規怙（210X297公仗) 6 Λ 6 Π 6 20504b 五、發明説明（5) 生長激素較天然型式之生長激素更穏定（可溶），且當鎇 和成該生長激素之持續釋出調和物時·，仍保持有生物活性 。更特異地，本發明的生長激素包括人類、牛、豬、羊、_ 山羊、馬、魚及烏的生長激素。再者，所額f生長激素包括 天然生長激素分子其他部份之刪除、添加及變]b。例如， 經修飾（置換或消去半胱胺酸）或衍生化之生長激素•其 中該生長激篇的1至4個半胱胺酸胺基酸殘基分別被選自 下列之胺基酸1至4個殘基所取代*如精胺酸、賴胺酸、 天冬胺酸、毅胺酸、精胺酸、毅胺醚胺、姐胺酸、丙胺酸 、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺 酸、酪胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或脯肢酸；或 其中所有的4個半胱胺酸均轉化成磺基丙胺酸。 因此·本發明的一儸目的初是提出一種新穎的生長激素 ，其較分子之天然型式更為可溶*且因此調和時較好是持 續釋出綢和物會更具生物效力。本發明再一目的是提出製 作本發明生長激素之位置指令之突變作用技術，此外尚有 其他重姐產製之多肽及/或蛋白質。本發明這些及其他目 的烴由Μ下詳细說明將可更為明白。 與本茱相闞之質體、DHA序列及微生物•除了相反者均 貯置於美國氰胺公司培養物收集所•於Princeton, New Jersey，且依據Rockcille， Maryland 20952, USA美國棟 準菌棰收集所（ATCC)之布達佩斯條約來貯存。

上述之DNA種係於19 88年8月23日貯於ATCC。其係 pEGMpST - SX ( ATCC No.40482 ) » pR0211 ( ATCC (請先閲私？背而矣注意事項孙h本頁) 裝- 訂- 經濟部屮央梂肀灼員工消炸合作杜.''-pli Λ 6 Η 6 五、發明説明（6) Νο.40483)及 pEFF- 902 (ATCC Νο. 40484 )。精於此技 S人士了解，這些DNA可嵌入任何適·當的表現系中* Μ得 本發明之生長激素或其突變種。

可表現本發明新穎的動物生長激素之大腸桿菌Κ12细菌 菌株，也於1988年8月23日貯於ATCC。细菌菌株包括大腸 桿菌 1655 (ATCC No.67762 ) 。 1655/pR0pST34 (ATCC

No. 67763) -，1-655/ pR〇pSTE34 ( ATCC Ho. 67764 ) ·

1655/ pROpST ( ATCC Ho . 67767) ，4200 ( ATCC

No. 67766) · 4200/ pR0pSTA34 ( ATCC No .67767 )， 4200/ pR0pSTE34 ( ATCC No.67768 ) * 4200/ pROpST ( ATCC No.67769 ) · 4255 ( ATCC No.67770 ) * 4255/ pR0pSTA34 ( ATCC Ho.67771 ) ，’ 4255/ pR0pSTE34 ( ATCC No. 67772 ) ，4255/ pROpST ( ATCC No. 67773 )， 及 4300 (ATCC Ho.67774 )。 M下的大睡桿菌K12菌株也於1990年9月21日貯置於 ATCC° 這些包括 pROpST- SXE - Q21HH22R (ATCC 68410)

• pROpST- SXE - G121A ( ATCC 64811) * pROpST- SXE

-A6TS11R ( ATCC 68412) · pROpST- SXA -S81 * 87L 經濟部屮央標準·而α工消fi-合作；；1印(*.'14 先 閲 η 背 而 之 意 事 項 孙 本 1 + I122L ( ATCC 68413) ， pROpST- SXA - S81 ， 87L ( ATCC 68414) » pROpST- SXA - L82 ， 84Q + L115K (

ATCC 68415) ， pROpST- SXA - L82 · 84Q ( ATCC 68416 ) ， pROpST- SXE - I122L (ATCC 68417)， pROpST- SXA - I122L ( ATCC 68418) ， pROpST- SX-( ATCC 68419) ， pROpST- SXA -L118E ( ATCC 68420)， 太紙張尺度边用中a困家標準（CNS) T〇jm(21〇x297公及） 205045 五、發明説明（7) 經濟部十央#爭/·.? 工消价合作fi-卬^ 先 閲 1ft 背 而 .5 注 意 事 項 # ί Μ 裝 線 pROpST- SXA - E119LQ123L ( SXA - I122E ( ATCC 68422) ATCC 68423)及 pR〇PST- SXE ATCC 68424)。 發明詳钿說明 本發明的動物生長激素可由 但於產鹗生-長激素方面，可使 /或蛋白質。目前改變DNA選 的理用之技術需產生單股型式 成的寡核苷酸，其互補於部份 之寡核苷酸。不配對區通常位 某些例子中，寡核苷酸也包括 酸内切酶確認位置。回冷的混 閉合，係加入大腸桿菌DHA聚 二磷酸•並有T4 DNA連接酶及 再轉形至適當的大睡桿菌中· 再複製。 可得二群純系。依據被選用 何股*純糸可含有野生型或變 變序列之純糸，其相當於寡核 射活性檷記之寡核苷酸雜交。 間之不配對，烴放射標記之寡 有突變序列之纯系。在適當的 生型及突變之纯糸。若寡核苷 ATCC 68421) * pROpST- • pROpST- SXA - Μ12 6 A ( -A6TS11R + I122L ( 位置指令之突變作用生成， 用其他方法如化學合成肽及 殖Η段特異位置之DNA序列 之DNA 。單股DNA回冷至合 DNA除了其中有不配對區域 於寡核甘酸之中央部位。於 位於突變作用處或近處之核 合物再製成雙股•並共價地 合_1 ，大片段及去氧核苷 腺苷5’一三磷酸。雙股DNA 此中不配對的DNA區修補及 充作棋板以供修補合成的為 化（突變> 型序列。含有突 苷酸之序列，被選出以與放 由於寡核脊酸及野生型序列 核苷酸可更穩定地結合至含 溫度下共置·因此可分辨野 酸也含有核酸内切限制酶解 太紙張反度成扣中SS家標垛格⑵0x297公及) 205045 Λ 6 It 6 五、發明説明（8 ) 經濟部屮央榀孕X;员工消合作f£印：^ 離位置，則K同源之核酸内切限制酶水解候遵之纯糸則可 顯示具突變序列之純系，且提供分辨.野生型及突變純系之 另一方法。則之後在一定纯糸中之變化可由相陬區域之 DNA定序予以證實。 含欲求突變作用之質艄純糸之限制片段，可構築至表現 質體中以適合突變基因產物於细菌、或酵母、但非二者中 之表現。此J!l·築可K播準的繼代選殖步驟逹成。 於以下討論中•埋殖重姐豬生長激素充作本發明經修飾 重姐體生長激素之代表，以及其製備之方法。再者，以下 說明及實例用以說明而非限制本發明。 重姐體豬生長激素之DN A及胺基酸序列示於下文。最佳 的重姐體豬生長激素是193個胺基酸之多肽序列，其中胺 基末端烴修飾含有3個額外的胺基酸（net ，asp *gln )·Κ及見於某些由腦下垂體衍生之豬生長激素成热型式 中之第一胺基酸（ala >之缺失。然而*191個胺基酸之 pST Μ及其他的衍生物*如在胺基末端處之缺失·添加及 /或羧酸末端之黼除及/或添加’也欲形成本發明一部份 0 重姐體 P S T : Ν Η 2 — m e t — a s ρ — g 1 η — P h e — p r 〇 — ala — 185 個胺基酸—ala - phe — COOH 腦下垂體 pST ί N Η 2 — ala — phe — pro — ala — 185 個 胺基酸一 ala — phe — COOH 此變化造成重姐體pST蛋白質中二個額外胺基酸之淨増加 ，且如EP 355460中所述。應用於重姐體生長激素經突變 >····♦·♦·♦········· (請先閲餚背而之炷意事項木頁) 訂_ 本紙張尺度边用中® S家)ί準（CNS) ΤΊΑΛ格（210X297公及） 4^ Λ 6 Π 6 20504b 五、發明説明（9) 衍生物說明中之命名糸統•反映出此額外的增加，且可為 任意精於此技藝人士容易地應用。·

Tk 先 閲 背 而 注 噫 事 項 本 I 裝 玎 線 經濟部十央#準而A工消八：作汰卬^ 本M·法尺度边用中ffl S家標準（CNS) ΊΜ規格（210x297公及） 4-4- 9.ft5〇4〇_— 五、發明説明（id A6B6 重？§歷猪生長您素 ATC CAT CAA TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA TTT GCC AAC Met Asp Gin Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn t 5 10 _ 15 GCC CTG CTC CGG CCC CAG CAC CTC CAC CAA CTG CCT GCC GAC ACC A L a Val Leu A rg Ala Gin H i s Leu His Gin Leu Ala A1 a Asp Thr 20 25 30 TAC AAG GAG TTT GAG CGC GCC TAC ATC CCG GAG CGA CAG AGG TAC Tyr Lys Glu Phe Glu Ar9 Ala Tyr 1le Pro Glu Gly Gin Arg Tyr 35 30 35 TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC Ser lie Gin Asn A G l n Ala A1 a Phe Cys Phe Ser Glu Thr l L e 50 55 60 CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA TCG GAC GTG Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu A1 a Gin Gin Arg Ser Asp Val 65 70 75 GAG CTG CTG CCC TTC TCG CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTC GGG Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gin Ser T rp Leu Cly 80 85 90 90 135 180 225 270 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 CCC GTG CAG TTC CTC ACC AGG CTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTT Pro Val Gin Phe Leu Ser A rs Val Phe Thr Asn Ser leu Val Phe 95 1 00 1 05 GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAC GAC CTG CAC GAG Gly Thr Ser Asp Arg Va l Tyr Glu Lys L e^i L y s Asp Leu G i u Glu 110 1 15 120 GGC ATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG Gly lie Gin Ale Leu Met Arg Glu Leu G(u Asp Gly Ser Pro Arg 125 130 135 360 405 經 濟 部 中 央 標 準 局 貝 工 消 货 合 作 社 印 製

TTG CGC AGT Leu Arg Ser TGC TTC AAG Cys Phe Lys ATC AAG TGT Met Lys Cys GAT GAC CCG Asp Asp Ala 155 AAG GAC CTG Lys Asp Leu 1 70 CGC CGC TTC Arg Arg Phe 185 CTG CTT AAG Leu Leu lys CAC AAG GCT His Lys A l a GTC GAG AGC Val Glu Ser AAC TAC GGG Asn Tyr Gly 160 GAG ACA TAC Glu Thr Tyr 1 75 AGC TGT GCC Ser Cys Ala 190 CTG CTC TCC Leu Leu Ser 165 CTC CGG GTC leu Arg Val 180 TTC Phe

本紙張尺度逍用中國困家搮準(CNS)甲4規格(210X297公 12 Λ 6 Π 6 20504ο 五、發明説明（n) (請先閲请背而之Jj-意亊項再植r木頁) dGRMdST — SX ΠΜΑ，壇箱

單股的pGEHpST -SX DNA是所有突.變反應之棋板DNA ， 且係Μ位置指令之突變作用製備自PGHGEM3Z DNA。豬生長 激素（rpST)基因理殖至噬菌質BpGEM-3Z(f + )，生成 PGHGEH3Z -係以下列步思來達成的。含有PGHGEM3Z豬生長 激素.（rpST)基因之DNA片段，係W限制酶EcoRI及 HindllL解JI而分離自细菌表現質«pEFF— 902 (鼸1 ) 。含rpST基團之片段再K瓊脂糖凝膠®泳純化。雙股噬菌 質體 DNA pGEH-32 (f + ) MEcoRI 及Hindlll 水解，Μ牛 腸EcoRI鹼性磷酸酶處理•且大片段以瓊脂糖凝膠霣泳純 化。二個純化的片段再混合一起，並MT4 DN A連接酶連接 。混合物轉形至细菌•且可有許多生成之集落生長。質體 DNA以標準鹼溶解方法製備•且结構以缠當的限制_水解 而決定。分雄一個純糸，其含有欲期的片段*且命名為 PGHGEM3Z 〇 dGRMdST— SX 經濟部屮央標準局：^工消^合作社印奴 此突變作用之目的是生成一段rpST DNA序列，其中編碼 α —螺旋2區之DNA序列接界在「端（自DNA钃碼區之 225 - 230位置）接MSacI限制位置· Μ及3’端（28 5 — 290位置）接M Xbal限制位置。逭些於DNA序列上之變化 不會改變rpST蛋白質之胺基酸序列》逭些限制海解雜位置 之存在造成一個'"螺旋2區匣"之生成，如此於螺旋2區 編碼DN A中之突變作用可合宜且快速地與於螺旋3區编碼 -DNA中之適當突變作用混合。Pf pGEMpST— SX之構築示於 rs 衣紙張尺度边用中Η «家i?準(CNS) >ΡΊ規tM2〗(lx297公龙) 20C04b Λ 6 Π 6 五、發明説明 經濟部屮央標準而工消作合作杜印¾ 下0 合成的寡核苷酸SacI293及XbaI353之DNA序列述於表 1。單股的PGHGEH3Z DNA是突變作用之受質· Μ摞準策略 製備自鈍作之噬菌《。此DNA取2000奄微克與各1〇〇〇毫撤 克之SacI 293及Xbal 353寡核苷酸混合，二者均已用腺苷 5 ·三磷酸及T4聚核苷酸激酶於其5’蟠磷醢化。混合物含於 10微升之《8體積中•係於IX回冷拔衢液中（IX回冷嫒街液 是 75 BiTiCCl 及 5 mM Tris — HC1 ，pH 8.0)。此混合物 在65¾下加熱7分鐘，再置室溫下（RT) 10分鐘。此步驟 可令寡核苷酸回冷至單股的受質（棋板）DHA 。纆回冷之 分子再伸長及轉化成共價閉合之雙股DNA ，係加22微升 H2〇 *1微升20mMATP 、各2單位之T4DNA連接酶•及 DNA聚合_1大片段（關於單位之定義•見New England Biolabs 目錄，1989) ，2 微升 20X dNTP’s (4 種去脫核 糖核苷酸5’一磷酸之混合物•各為2·Μ)及4微升10X > 充垓"煖衝液（IX充填缓衝液是27.5 nM Tris-Cl，pH 7.5，15mMMgCU ，2mMDTT)。經室溫下 1 小時後· 一半的反應以檷準策略引入HB101勝任细胞。經37¾下培 育一定可清楚看見單一集落。質體DN A Μ摞準步驟製備自 24個集落•於各自反應中WSacI及Xbal水解。含二個限制 位置之質雅DNA ，其顯示SacI293及XbaI353寡核.苷酸均 纳入rpST基圑中*再引入HB101勝任细胞中（如前述）Μ 進一步纯化。霣flSDNAM各別反應製備及水解（SacI及 Xbal) ，K證實質體DNA中存在有各個限制位置，其再由 ih 先 m 背 而 之 Ts. 意 事 項 本 頁 裝 玎 線 14 太紙?t尺度边用.中a B家樣準（cN S) Ή規格（210 X 297公:ΰ：) 五、發明説明蚣3) A6 B6 rpST DNA相翮區域之DNA序列分析證實。m_1 席利 桀缪宴铉苷餘 席别（5 1 — 3，） 桀裝作用

Sac I293 Xbal353 S81L S871 QE0fi2 Q8082D

GACGTGGAGCTCCTGCCCTTCTCG CACTTCCTCTCTAGACTCTTCACC TCCGCTTCTTGCTGCTGC TCATCCAGTTGTGCCTCG TGCGCTTCTCGCAGCTGCAGAT CCAGTCGTGG TTCTCGCAGCTGCAGATCCAGT

Helix 2 E Helix 2 cassette S81,87L S81#87L L82#84〇 182,843 Μ Μ Θ it (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 13 E1 16 <1 13E1 16 經濟部中央標準局员工消費合作社印製

K113E1160 E1 16IC120 £120 L120-3 A124-2 El13EHDQ1 16 El 13D I115A L118A L118TK L1 1ST 1117,121 LeuU 71 21D K1 14R/AccI G121A/XmnI IC1 16R/Bg III

CTACGAGAAGAAGAAGGACCTG GCTGAAGGACGAGGAGGACGGC GTCTACGAGAAGAAGAA6GACG ACCACGAGGGCAT AGAAGAAGAAGGACGACGAGGA AAGCTGAAGGACGAGGAGGAGG GCAAGCAGGCCCTGATG GGAGGAGGGCGAGCA6GCCCTG GGAGGAGGGCCTGCAGGCCCTG CAGGCCCTGGCACGGGAGCTGG CGCGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC(GC) A(GC)GAGGAGGGCATCCAG CGTCTACCAGAACGAGAAGGAC CTACGAGAAGGCGAAGCACCTC GCTGAAGGACGCGGAGGAGGGC CTGAAGGACA(CA)AGAGGAGGGCAT CTGAACCACACTGAGGAGGGC GAAGGACCTGCTGGAGGGCAT CCTGGCCCTGATG CCTCCTGGAGGGCATCCTGGCC GACCGCGTATACGAGCGTCTGAAGGA CTGCAGGAAGCTATTCAGGCCCTG AGAAGCTCCGAGATCTCGAGGA

CCTTGTCAAGCTTATTTGACAACCCCC TCAATTCCCAACCATCC ATGCCCTTGAGTCGACTAT TTGACA, “ Q2 1 HH22R/C l a \ CCGGCCC ； :.CAA A14D/HincfI I I A6T S11RA14D/Sal

Pvul I 634

ACAAGGCAGAGCTCCTCTCCAC 本紙51尺度边用中B國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公«)

IU5K LI 18E L115KL118E K113E116 探金： LI 18E! 122IC I122E I 122L K126A L 1 15E

M15E 構築吊探針

Liisr L 1 1 8T El19LQ123L E119L0123L probe IM 14R G1 2U m 16s A 1 4D A6T S1 1RAUD 〇?1HH22F * 221 15 2〇5〇^° 經濟部屮央梂準局员工消费合作杜印製 五、發明説明（14) 旋 螺 於

成 完 般 述 下 如 可 成用 合作 之變 用突 作之 變因 突基 中.ST 區ΓΡ 3 中 或SX 2 I 突變作用程式之目的是產生一涸rpST分子，具有在高蛋白 質下（>100毫克/毫升）凝集傾向減低之作用》焦點所 在是螺旋3區之疏水面（由112至129胺基酸殘基>·咸 信其於放動凝集反應中具闞鐽性（Brems et al,1986)。 由於此處所應用之rpST基圑編碼二個額外的在胺基末端之 胺基酸*胺基酸殘基之總數是193 ，與見於衍自腦下垂體 之牛及豬生長激索之191個殘基相反。112至129殘基相 當於牛生長激素中110至127殘基（Abdel — Megind et al, 1987)。分子其他可充作突變作用標的之區域是81至 87號殘基之嫘旋2區·蠼旋3區及1區之親水面· 6至 11號殘基。以附加之突變製程，或IB代選殖相闞區域可產 生混合的突變種。用來獲得L Π 8E突變之基本策略及所有 其他的實例下文將加Μ描述。基本策略之變化述於通當實 例中0 - - 單股受質pGEMpST ~SX DHA之製備正如PGHGEM3Z—般。 用於突變L118E ，E116構第之合成的突變寡核苷酸DNA序 列示於表I ，且如SacI 293所述般在其5’端被磷醯化。回 冷及充填反應正如PGHGEM3Z之SacI293突變作用所述。待 一半的反應混合物引入HB101勝任钿胞•且於37 t：下培菏 一夜後，生成之集落轉移至硝化纖維濾膜，並進行標準方 法雑交之處理。Ε116塞核苷酸也用來偵測突變作用。其在 5’端以7 — 32Ρ -ΑΤΡ及聚核苷酸激酶放射活性地棟記。 先 閲 ifi 背 而 之 意 項 # A Ιί 本紙尺度边用中圉Η家標iMCNS) <f Ί規怙（2】0χ297公；¢) 20504ο Λ (ί Η 6 五、發明説明（15) 經濟部屮央標準灼β工消评合作杜印Μ 在 37υ、5XSSC (1XSSC 是 0.15Μ 氛化納，0.015Μ 檸檬酸 纳pH 7.0) 、IX登哈'瓦溶液（各0.02%的（m/v) Ficoll，牛血清白蛋白*聚乙烯吡咯啶嗣）·150微克/ 毫升酵母tRNA·及纆放射標記之探針中雜交一夜。 雜交後，濾膜於37t： · 5XSSC中至少洗30分，再於TAC 中（TAC是3M四甲氯化銨，50bM三羥甲基胺#甲烷pH8.0 ，：lmMEDTA(乙底酸）、0.1 % (w/v)硫酸十二酯納 )於欲求之溫度下30分鐘2次。後一洗滌之培育時間決定 専一性，因E11 6寡核苷酸可保持只與完成互補之纯系雜交 。闞於E116寡核苷酸*溫度為59.0Ό。於暍露X射嫌底片 後，只觀察到與E116完全互補之純糸。質體DH A製備自許 多此捶陽性計分之純系*再引入HB101中並如±地篩選。 由第二輪篩選中許多賜性純糸中獲得之質«DN A M DMA序 列分析製備及分析：因此含L118E突變作用者可明確地予 以鑑定。帶有此突變作用之質顧I命名為pGEMpST - SX-L118E 。 - 生成的含有L118E突變作用之rPST基因純糸轉移至二個 表現載中，pR〇pST-SX及pROpST-SXA ，其構第示於下。 逭些構第之目的是將含有螺旋2區匣之rpST基因（由先前 所述的SacI及Xbal限制位置之存在界定）引入可將rpST基 因表現於大腸桿菌中之質體戟體。另一目的是將本發明所 述之突變作用引入二個不同的rPST遺傳背景。一者在183 及191位置上二個胱胺酸殘基之存在上係圼天然的（野生 型）。另一 rpST基因在逭些相同的位置上是編碼丙胺酸而 本紙張尺度边用中《 a家樣準（CNS)下4規格（2】Π X 297公釐) 先 Μ 背 而 之 R 意 項 木 η Γ % Λ 6 Π 6 20504ο 五、發明説明 (16) 非半胱胺酸，且述於EPO 355460中。質體PR〇pSTA34 (圈 4)含有EcoPI /Hindlll片段，遘-殖至表現質應 PR0211中。此EcoPI /Hindlll片段撕有不同的rPST基因 ，其中在ί83及191位置兔编碼半胱胺酸之DNA巳突變成 编碼丙胺酸。因此其鶼有da ，ala突變作用。質Ϊ9 pR〇pSTA34於一俚反應混合物中MEcoRI及Hindlll水解 ，而於S —檲反應中MEcoRI及Sial水解。含載《的大Η 段各自自反應中Μ瓊脂耱凝膠霉泳纯化。含有螺旋2區Ε 於另一野生型rpST背景之質體pROpSTU -SX，係連接來自 pGEMpST -SX之經纯化的EcoRI /Hindlll片段而產生， 連接混合物引人细菌菌株H99CI中。於此菌株，rPST之表 現由APL啟動基因驅動，其由野生型λ抑制子之存在而避 免。生成之質體純系具有欲求之構第•由適當限制酶水解 可鑑定。於經突變r*PST基因中含有螺旋2區匣之質Η pROpST-SXA ·係由 pR0pSTA34 中經纯化之 EcORI/Smal 載 體片段加上pGEMpST -SX中烴纯化之EcORI /SmI片段而 成。連接混合物引入细菌菌株N99CI中•且生成之質體纯 糸以相關的限制酶水解分析Μ鑑定欲求之質體純糸。

L118E突變作用引入表現質體pR〇pST-SX及pROpST-SXA中，係以EcORI及Hindlll於一姐反應中，及EcORI 及Smal於另一姐反應中水解pGEMpST -SX-L118E DNA 。 、 *· < 來自每一反懕混合物中帶有rpST之小片段含有L118突變作 用•且可K瓊脂糖凝膠雷泳純化。質M pROpST- SXM -EcoR I及Hind III限制，且帶有載體之大片段Μ瓊脂糖凝 大紙張尺度逍用中家標準（CNS)T4規岱（210x297公及） (請先閲筇背而之*注意事項#^?本頁) 裝· 線- 經濟部屮央#準^卩工消^^作杜印驭 Λ 6 Η 6 20504^ 五、發明説明（17) 膠霣泳純化。此片段與來自pGEMpST - SX-L118E之經純 化的EcoRI /Hindlll片段連接•生.成質體pR〇pST-SX-L118E 。連接混合物轉形至表現株43 00，其攜有一俚溫慼 性λ抑制子。於這些菌株中·「pST之表現依溫度而定。於 42X；下· λ抑制子是非活性的•可自λ PL啟動基因中表現 。攜有细菌純糸之pROpST-SX - L118E質體由其於42TC下 產生rP?T蛋泊質之能力而鑑定（λ抑制子之非予准之溫度 υ )。質體pR〇pST-SXA MEcORI及Smal限制，且大的載Η 片段Κ瓊脂凝膠電泳纯化。此片段與來自pGEMpST - SX-L118E之經純化的EcoRI /Sial片段連接，生成質體 pR0pST_SXA -L118E 。連接混合物轉形至表現菌株 4300，且鶼有细菌集落之pROpST- SXA - L118E質《 K其 於42¾下產生rpST蛋白質之能力而鑑定。 奮例1 _ 囿蒔剌用二僴合成的寞核苷除皮牛成栊掄2麻 > 睜〃 此突變作用之目的是產生rpST DNA序列，其中编碼α -揉旋2區之DNA序列由SacI限制位置接界於5’端（DNA纗 碼區225 - 230位置）·且由Xbal限制位置接界於3 *端（ 285 — 290位置）。於DNA序列中的逭些變化不會改變 rpST之胺基酸序列。這些限制酶解離位置之存在生成一個 w螺旋2區甲〃，如此於螺旋2區編碼DNA中之突變作用 是合宜的且可快速地與螺旋3區DNA中之逋當突變作用混 合。pGEMpST -SX之構築述於上文。 - 奮例？· 本紙5lt尺度边用中a R家標iMCNS) ΤΊ规格（2丨0x297公犮） (請先閲餚背而之汰意事項再根^本頁) 裝- 線- 經濟部屮央標準劝β工消仰合作杜卬3| Λ 6 Η 6 205045 五、發明説明（；L8) 栊掄2區> 葙永桦防某除u[額7k桦防其》譬描，萁]>1空》 的寞按苷醻a宙n tg掄 . 此突變作用種類之成員包括突變作用L118E 、L115K 、 L115KL118E及L118EI122K。突變作用之產生和L118E中之 基本策路相同》生成之質體帶有這些突變作用者分別命名 為pGEMpST -SX-L118E ， pGEMpST —SX—L115K · pGEMpST - ^X- LU5KL118ES pGEHpST — SX — LU8ETI122K ° rpST中L115K突變作用之產生可如L118E —般，除了於 突變作用及雜交反應中係採用表I所示之突變寡核符酸 K113。此寡核苷酸改變rpST序列*故115位置中指等合成 白胺酸之密碼子由CTG換成編碼賴胺酸之AAG 。 rpST中L115KL118E突變作用之產生如L118E —般•除了 於突變反應中使用表I所示之突變寡核苷酸K113E116，且 表I所示之寡核苷酸K113E116D用於雑交反應。 K113E116寡核苷酸可改變艸51"序列，如此第115位置指等 合成白胺酸之密碼子由CTG換成編碼賴胺酸之AAG ·且 118位置之白胺酸密碼子由CTG換成編碼毅胺酸之CTG 。 此寡核苷酸因此於rpST DN A序列中產生一個雙重之突變作 用。 rpST中L118EI112K突變作用之產生如L118E —般，除了 表I所示之突變寡核苷酸E1丨611笔0用於雜交反應中。此 E116K120寡核苷酸可改變rPST序列，故第118位置指導合 成白胺酸之密碼子由CTG換成編碼穀胺酸之GAG ，且第 本紙張尺度边用中ffl Η家详準（C N S) T 4規怙（210 X 2 y 7公犮） (請先閲¾背而之U意事項#项(？本頁) 裝- 經濟部屮央槛準而Α工消frfr作杜印¾1 205045 Λ 6 Η 6 五、發明説明（19) 經濟邡屮央標平工消fr合作社卬ft'14 120位置之異白胺酸由ATC換成纗碼賴胺酸^AAG 。此寡 核苷酸因此於rpST DHA序列中產生一.涸雙重的突爱作用。 奮锎3 Μ空»的寞枋苷_，膊栊雎3區夕葙水袢昉某醻W親氷桦 胺某醚晋梅 此突變種類之成員包括I122E 、L118T 、L118K及 L115E。纗有.這些突變作用之質體分別命名為pGEMpST -SX- I122E * pGEMpST - SX— L118T ， pGEMpST - SX- L118K及pGEMpST —SX— L115E。這些突變作用之構築，如 L118E所述地進行，除了於突變作用及雜交反應中所使用 之寡核苷酸·其序列示於表I。 於讀變作用I122E之構第中使用突變寡核苷酸E120 (表 1)。此寡核苷酸可改變rpST基因之序列，如此第122位 置指導合成異白胺酸之密碣子由ATG轉化成編碼毅胺酸之 GAG »E120寡核苷酸於雑交反應中也充作放射標記之偵測 用探針，其在各方面均與L118E相同•除了硝化纖維濾膜 於56TC下共置於TAC緩衝液中。突變作用L118T之構築如 L118E所述，除了用於突變作用及雜交反應中之寡核苷酸 均是L118T (表I)。此寡核苷酸改變了 rpST基因之序列 ，如此第118位置指導合成白胺酸之密碼子由CTG轉化成 編碼蘇胺酸之ACT 。於硝化潘維濾膜於56 C之TAC緩衝液 中培菏後•含有欲求突變作用之質體可與含非突變之質體 分別。 於rpST中L115E突變作用之產生可如L118E所述地完成 (請先閲兌背而之，注意本項再艰(，本頁) 裝- 訂_ 線· 本紙張尺度逍用中S H SiiiMCNS) 怙（2丨0x297公犮） 205045 經濟部屮央榀準而Α工消价合作社印奴 五、發明説明feo) ，除了表I所示之突變寡核苷酸E113EHDQ116'用於突變反 應，且表I所示之寡核苷酸E113D用.於雜交反應。 E113EHDQ116寡核苷酸可改變rpST序列，如此第115位置 中指導合成白胺酸之密碼子由CTG轉化成煸碼毅胺酸之 GAG *且第118位置之白胺酸密碼子由CTG轉化成编碣毅 胺酸之GAG ·編碼天冬胺酸之GAC 、姐胺酸之CAC或毅胺 醢胺之CAG_。於118位置處突變變化之多樣性是由於突變 寡核苷酸是4個寡核苷酸之混合，於寡核苷酸合成中所生 成的。所生成的可與E113D放射棵記之雜交探針雑交之質 «純系，經DNA定序顯示其含有L115E突變作用·但無一 者在118位置上攜有4種可能突變中之任一種。因此•此 突變作用於115位置上生成單一的突變作用。 rpST中L118K突變作用之產生可如L118E般完成》除了 是使用表I所示之突變拐核苷酸L118TK。L118TK寡核苷酸 可改變rpST序列*如此第118位置指導合成白胺酸之密碼 子由CTG改變成騙碼賴胺酸之AAG ，或是編碼蘇胺酸之 CAG 。突變變化的各種可能性（始自第118位置）是由於 突變之寡核苷酸是二棰寡核苷酸之混合，係於寡核苷酸之 合成中所產生的。所得質體純糸之DN A定序，其中該純系 可與L118TK經放射標記之雜交探針雜交，顯示其含有 L115K突變作用，且無一者在第118位置上撝有其他可能 的突變作用L118T 。因此•此突變作用可在第118位置上 生成單一突變作用。 鸾俐4· (請先閲咪背而之U意事項#*^.本頁) 裝- 冬紙尺度边用中國S家棕準（CNS) ΤΊ規格（210X297公茇） 22 20504ο Λ 6 |{ 6 經濟部屮央榀準而Μ工消设合作杜印¾ 五、發明説明 ) 刹爾空雄的g铉苷路防某醏罾描《掄3區由少維 水桦腌某醚 . 此突變作用種類之單一成貝是雙重突變作用一 E119LQ123L。攜有此突變之霣體MDNA序列分析證實是 pGEMpST - SX- E119LQ113L。此雙重突變作用rpST基因之 構第可如L118E所述地完成，除了使用突變寡核苷酸 L117,l$l (袭i )。此寡核苷酸可改變rpST DNA序列•如 此緘碼毅胺酸之DNA由GAG改變成媚碼白胺酸之CTG ·及 於第123位置編碼穀胺酸之DHA由CAG改變成編碼白胺酸 之CTG 。突變作用利用此寡核苷酸，而序列示於表I中之 LeuUD121D充作雜交反應中之放射標記的探針。於此突變 作用構築中所採用的所有步《均如L118E所述，除了硝化 纖維膜係於58 TC下於TAC中共置，K偵測攜有突變作用之 質體。 窗锎R 非癍袢防某酪1>/轘掄：^底中夕十棚雄》非稼袢胺基_， W /1、椰嫌：》晋插作用 此突變作用種類之成員包括L115A 、L118A友H126A 。 攜有逋些突變作用之質體分別命名為卩^»^51'—3乂一 L115A ， pGEMpST —SX—L118A 及 pGEMpST -SX-M126A 。這些突變作用之構築如L118E所述•除了突變之寡核苷 酸及必要時之TAC洗滌溫度。 用於突變作用L115A構築之合成突變的寡核《酸示於表 -I 。此寡核苷酸可改變rpST基因之序列，如此於第115位 (請先閲背而之!A意事項本頁) 裝. 訂- 線- 尽紙張尺度边用中圉用家详;MCNS) (210X297公犮） 20504b

A 6 WQ 五、發明説明（22) 經濟部中央櫺準而只工消作合作社印製 置中编碼白胺酸之密礓子由CTG轉化成編碼丙胺酸之GCG 〇L115A寡核苷酸也充作雜交反應中之放射標記之偵測探 針。含欲求突變作用之質體於硝化纖維膜於561C之TAC級 銜液中共置後，可與帶非突變之霣體分別。 rpST中LU8A突變作用之產生可如L118E般逹成•除了 於突變及雑交/篩選反應中應用之突變寡核苷酸為L118A ，其序列示於表I。L118A可改變rpST序列，如此於第 118位置編碼白胺酸之密碼子由CTG改變成编碼丙胺酸之 GCG 。硝化纖维於56"C下於TAC嫒衡液中共置，可偵測煽 有突變作用之質«。擁有此突變作用之質體•由DHA序列 分析證》，命名為 pGEMpST — SX-L118A 。 rpST中H126A突變作用之產生如L118E所述•除了於突 變作用及雑交/篩選反懕中所懕用之突變寡核苷酸是 A124-2，其序列示於表I。A124-2寡核苷酸可改變rpST序 列*如此於126位置上指導合成甲硫胺酸之密碼子由ATG 變化成牖碼丙胺酸之GCA 。帶有突變作用之質體，經硝化 纖維於56 10下於TAC緩衝液中共置可偵測。攜此突變之質 體MDNA序列分析證實，命名為pGEMpST — SX—M126A 。 窖例fi 君白昉除1??.以ft防醚之詈梅作用 此突變作用之種類成員包括I122L ，I122LL118A及 I122LM126A。鶼有埴些突變作用之質埔分別命名為 pGEMpST -SX-I122L ，pGEMpST -SX-I122LL118A及 -pGEMpST -SX-I122LM126A。這些突變作用之構築可如 本紙張尺度边用中a Η家標率（CNS)肀4規怙（210X297公*) 2 4 (請先閲讀背而之注意事項洱填寫和1) 裝- Λ β Π 6

205C14D 五、發明説明（23) L118E般進行•除了所應用之突變寡核苷酸及必要時之 TAC洙滌溫度。 - 用於突變作用I122L構第之合成的突變寡核苷酸•其 DNA序列示於表I。此寡核苷酸可改變rPST基因之序列· 如此於第122位置指導合成異白胺酸之密碼子*由ATC轉 化成編碼白胺酸之CTG °L120-3寡核苷酸也充作放射檷記 之偵測探_針用於雜交反應中。含欲求突變作用之霣《與帶 非突變作用之質體可分別，係於硝化纖維濾膜於561C下與 TAC緩衡液中共置之後。 rpST中I122LL118A突變作用之產生，可如L118E所述， 除了應用於突變及雜交/篩選反應中之突變寡核脊酸是 L118A *且用於突變作用之棋板DNA是pGEMpST — SX- I122L 。棋板DHA之製備如pGEMpST - SX DNA。攏有突變 經濟部中央51準局A工消伢合作杜印3i 作用之質體藉硝化嫌維膜於5610下於TAC緩衝液中共置而 偵測。擄此突變作用之質體，由DNA序列分析證實*命名 為 pGEMpST -SX-L118AI122L。rpST 中 I122LM126A 之產生 如L118E般完成，除了應用於突變作用及雜交/篩選反應 中之突變寡核苷酸是A1 24-2*且用於突變作用中之横板 DNA 是 pGEMpST - SX-I122L 。棋板 DNA 之製镅如 pGEMpST — SX DN A—般。攜有突變作用之質Η由硝化孅維 •滅膜於56C之TAC锾衝液中共置而偵測。攜此突變作用之 霣體，由DNA序列分析證實，命名為pGEMpST - SX — 1122LM126A ° -啻例7 25 本虼張又度逍用中8 81家標準（以5)肀4規格（210><297公犮） Λ 6 Π 6 五、發明説明（24) 栊碓3區中想水抻而l·防某醸雄某乏W描作用

此突變作用種類中之成員包括G121A ，K114R及K116R 。擲有這些突變作用之質體分別命名為pGEMpST - SX — G121A ， pGEMpST -SX-K114R ·及 pGEMpST -SX- K116R 。這些突變作用之構第如L118E所述般進行，除了 所應用之突變寡核苷酸，及必要時之TAC洗滌時間。用於 突變作用G12_1A·構築中之合成的突變寡核苷酸，G121A/ T ·.

Xmnl*其DNA序列示於表I。此寡核苷酸可改變rpST基因 之序列•因此於第121位置上編碼甘胺酸之密碣子可由 GGC轉化成編碼丙胺酸之GCT 。此寡核苷酸也異於rpST DNA序列，如此XmnI限制確認位置（5’一GAAGCTATTC_ 經濟部屮央榣準而ex工消赀合作社印5i 3 1納入rpST DNA序列。除了 G121A突變作用，額外的核 苷酸變化不會造成rpST蛋白質胺基酸序列中之變化。 G121A / XmnI寡核苷酸也充作放射棟記之偵测探針•用於 雜交反應中，其在所有其他方面均與上述相同。擄有突變 作用之候選純系，藉硝化纖維滤膜於57.51C之TAC媛衡液 中共置而偵測，且進行XmnI位置獲得之分析，其係存在於 突變之寡核苷酸，且因此診斷質體純系中G121A突變作用 之存在。攜有此突變作用之質體，由DNA序列分析證實， 命名為 pGEMpST —SX—G121A 。 rpST中L114K突變作用之產生可如L118E所述般完成， 除了於突變作用及雜交/篩選反懕中所應用之突變寡核苷 酸是K114R / AccI，其序列示於表I °K114R / AccI寡核 -苷酸改變rpST序列•如此於第114位置指導合成賴胺酸之 本紙張尺度边用中8困家標準（(：阳）甲4規彷（2丨0乂297公;《：) 205045 Λ 6 Η6 五、發明説明（25) 經濟部屮央標準而A工消设合作社印製 密碼子由AAG變化成編碼精胺酸之CGT »此寡核苷酸也異 於rpST DNA序列，如此AccI限制位置.（5'—GTATAC-3’） 纳入rpST DHA序列中。除了 K114R突變作用•額外核苷酸 之變化不會造成rpST蛋白質胺基酸序列之變化。如同 G121A ·假想之擁突變純糸藉硝化纖維濾膜於57.51C之 TAC媛衢液中共置而偵測，並檢査存在於突變寡核苷酸中 新的AccI限制位置之獲得，因此診斷質β鈍系中K114R突 變作用之存在。钃有此突變作用之質體，由DHA序列分析 證實，且命名為pGEMpST -SX-K114R 。 rpST中K116R突爱作用之產生如L118E般獲得，除了於 突變作用及雜交/篩選反應中應用之突變寡核苷酸是序列 於表1中之K116R / Bglll cK116R / Bglll寡核苷酸可 改變rpST序列，如此於116位置之賴胺酸密礴子由AAG變 化成編碼精胺酸茗CGA 。此寡核苷酸也興於rpSTDHA序列 ，如此Bglll限制位置（5'—AGACCT-3')纳人rpST DNA序列，由第342 — 347位置之核苷酸序列。除了 K116R突變作用•額外的核苷酸之變化不會造成rpST蛋白 質胺基酸序列之變化。如同G121A ，攜有假想突變作用之 純系垤硝化纖維膜於57.5t：之TAC中共置而偵測，並檢査 存在於突麥寡核苷酸中新的Bglll限制位置之獲得•且因 此診斷K116R突變作用於質體純系中之存在。擄有此突變 作用之質體，由DNA序列分析證實，且命名為pGEMpST -SX- K116R ° -窗例ft (請先間請背而之注意事項#瑱寫扣S) 裝. 訂_ 本紙張尺度边用中國B家楳準(CNS) <P4規格（210x297公:《:) 27 205045 經濟部屮央橾準局员工消仲合作社印製 五、發明説明（26) 利用固蒔的二拥会成的寞核苷酴》1^葙水柹防某除瑰某署 描《掄2底中之缠水袢胺某酸 · 此突變作用種類之成員是雙重突變作用，S81,87L 。鶼 有此突變作用之質SSMDNA序列分析證實，命名為 pGEMpST -SX-S81，87L 。用於雙重突變81,87L構第之合 成的突變寡核苷酸S81L及S37L之DNA序列示於表I ° S81L及S$.7L寡核苷酸可改變rpST基因之序列*如此位81及 87中分別的絲胺酸密碼子可由TCG轉化成煸碼白胺酸之 TTG 。此雙重突變rpST基因之構築如L118E所述，除了二 涸突變寡核苷酸係同時用於突變反應中。S81L寡核苷酸也 充作雜交反應中之故射標記之偵測探針，其在各方面均和 L118E所述相同，除了濾膜是在54¾之TAC級銜液中洗滌 。選出鶼有假想的隈性突變作用質體純系之细菌轉形细胞 ，轉移至硝化級维濾膜並做雜交之處理修飾。於第二次篩 選時* WS87L寡核苷酸充作放射檷記之探針；濾膜於TAC 、54t：下洗滌。 g Μ 9 以親水件防某辞两某詈梅轘掄2區中之疏水抻昉某驗雜某 此突變作用種類之單一成員是雙重突變作用S82,84Q 。 擄有此突變作用之質體，由DNA序列證實，命名為 pGEMpST -SX—L82,84Q 。用於突變作用L82.84Q'構築之 合成的突變寡核苷酸是Q8082 ，且示於表I。此寡核苷酸 可改變rpST基因序列*如此於第82及84位置之白胺酸密碼 -子由分別的CTG及CTC 轉化成編碼穀胺醚酸之CAG 。攜有 (請先閲讀背而之注意事項#塡寫^貝) 裝. 訂_ 本紙张尺度边用中a國家樣準（CNS) T4規怙（210x297公釐） 28 A β Π 6 205045 五、發明説明（27) 突變作用之質體由硝化纖維濾膜於58t：之TAC緩》液中共 置而偵測。 * 啻例1 0 蟠旋2及3Έ诓会空择作用之嫌结 將許多螺旋3區之突變作用，I122L · Μ126Α及 E119LQ123L·其或保有（I122L ，Μ126Α )或增加（ E119LQ1?.3L)-.级旋3區疏水面之疏水特性，與Bl水性嫌旋 2區之雙簠突變作用，S81,87L ·Κ以下繼代選殖方法混 合。霣ISpGEMpST -SX-S81,87L MXbal 及 EcoRI 限制。 小片段Μ瓊脂糖凝膠電泳纯化，且含有S81,87L突變作用 。質體 pROpST- SXA - I122L 也.依序 K Xbal及 EcoRI 限制 ，並純化大的片段。大片段擄有pROpST表現載«姐份*及 183及191位置上pST突變作用I122L及半胱胺酸對丙胺 酸之置換作用。此大的片段，及小的S81,87L片段，於 T4 DNA連接》及ATP存在下連接。一半的反應混合物引入 表現株4300中，M CaCl2處理使勝任。經轉形的细胞於 30 1C下培育一夜。鶼有質體之细胞如實例12所述般分析 PST之表現；含有此螺旋2區/螺旋3匾姐合之質«命名 為 pR〇pST-SXA -S81.87L +I122L 。 混合突變作用 pR〇pST-SXA -S81.87L +M126A 及 pR〇pST-SXA -S81,87L +E119LQ123L之構築如 pROpST— SXA - S81，87L +I122L 所述，除了 KpROpST-SXA -M126A及pR〇pST-SXA -E119LQ123L充作表現載體姐份之 來源，及螺旋3區突變作用W分別產生pROpST— SXA - ik 先 閲 in 背 而 之 注 .色 項 # 寫 本、 η 裝 訂 經濟部中央標準局β工消费合作社印奴 本紙Λ尺度边用中S S家樣iMCNS)T4規怙（210x297公犮） 29 20504b 經濟部屮央#準扃员工消t\··合作杜印5i 五、發明説明fe8) S81.87L +M126A 及 pROpST-SXA -E119LQ123L。 鏍旋2區雙重突變作用L82,84Q + 5鏢旋3區突變作用 L115K之混合正如S81,87L + I122L所述·除了突變作用 螺旋2匾DNA之來源是pGEMpST —SXA — L82.84Q ，且鏍 旋3區突變作用（L115K )之來涯是pROpST-SXA -L115K 。含此姐合之質體命名為pROpST-SXA -L82,84Q + L115K 〇 一 Τ · 奮俐1 Ί 利用赛移宴枋苷酹htiB水件防某醻臂楢轘掄1麻或圻樣掄 1阪之》太袢防某》 這些突變作用的目的是Μ親水性胺基酸殘基（其存在於 人類生長激素之栢同相對位置）置換見於rpST胺基末端部 份之捸水性胺基酸殘基。 此突變作用種類成員包括「pST雙霣突變作用Q21HH22R， 雙重突變作用S11RA14D及單一突變作用A6T及A14D。鶼有 此突變之質體由DNA序列分析證實，且分別命名為

pGEMpST SX- Q21HH22R * pGEMpST— SX— SI 1RA14D * pGEMpST — A6T 及 pGEMpST — SX- A14D。這些突變作用之 構築如LI 18E中所述，除了所應用的突變寡核苷酸，硝化 孅維瞑於TAC媛衝液中之培育時間，及對搞有陳性突變作 用之質體以適當限制酶（若有且適當時）水解之附加篩選 用於雙重突變作用Q21HH22R，Q21HH22R/ClaI構築中所 •用之合成的突變寡核苷酸DNA序列示於表I 。此寡核苷酸 先 閲 請 背 而 之 注 意 事 項 填 % 本、 η 裝 線 本紙張尺度边用中B國家《iMCNS) T4規怙（210x2974*) 30 Λ 6 Π 6 五、發明説明（） 29 改變rpST基因之序列·如此第21位置毅胺醢胺之密碼子由 CAG轉化成纗碼姐胺酸之CAT ·且22位置之姐胺酸由CAC 轉化成蹁礞精胺酸之CGA 。包括在這些突變作用中的是核 酸内切限輒海解離位置（5’一ATCGAT—3’），其係烴改變 的rpST基因所特有的。Q21HH22R/ClaI寡核苷酸也充作雑 交反應中之烴放射棟記之偵測探針，其在其他方面均與先 前所述的相同.。·用於此突變作用構第的所有步》均如先前 L118E中所述，除了濾膜係於56T之TAC級街液中洗滌。 同時，攜有突變作用之候選鈍糸進行Clal位置獲得之分析 •其係存在於突變寡核苷酸中，且因此判斷霣體鈍系中 Q21HH22R雙重突變作用之存在。 rpST中A6T突變作用之產生如L118E所述般完成，除了 於突變及雜交反應中使用表I所示之突變寡核苷酸A6T 。 A6T寡核苷酸可改變rpST序列，如此第6位置丙胺酸之密 碼子由GCC轉化成編碼蘇胺酸之ACC 。接下去雜交*含细 菌之硝化纖維膜於52 1C之TAC緩衝液中洗滌。 經濟部中央標準屌CX工消费合作社印^ (請先閲讀背而之注意事項#填寫4"1 線· S11RA14D雙重突變作用之產生如L118E所述般完成，除 了於突變及雜交反應中使用突變的寡核苷酸SURA14D/ Sail，且硝化嫌维《膜於641C之TAC緩衝液中洗滌。 S11RA14D/Sall寡核苷酸可以改變rpST序列，如此第11位 弱胺酸之密碼子由AGC轉化成煽碼精胺酸之CGA ，且第 14位置的丙胺酸密碼子由GCC轉化成縝碼天冬胺酸之GAC 。此寡核苷酸也異於rpST DN A序列*如此Sa 1 I限制確認位 -置（5’一GTCGAC-3')纳人核苷酸序列29 - 34位置之 本紙il尺度边用中a困家楳毕（CNS) Ή規格（210x297公;it) 31 205045 五、發明説明（30) 經濟部屮央榣準局只工消ί\··合作杜印5i rpST DNA序列。除了 S11R及A14D突變作用，額外的核《酸 變化不會造成rpST蛋白霣胺基酸序列上之變化。檢査攘有 假想突變作用之鈍系期於新Sail限制位置之嫌得·其係存 在於突變寡核苷酸’且因此判斷質體纯糸中511|^140雙重 突變作用之存在。 A14D單一突變作用之產生如L118E般完成•除了於突變 作用及雑，交反醛中係使用突變的寡核甘馥A14D/ Hindi II 。A14D/HindIII寡核苷酸可改變rpST序列，如此於第 14位置之丙胺酸密碼子由GCC轉化成編碼天冬胺酸之GAC 。此寡核苷酸也異於rpST DKA序列，如此Hindlll限制_ 確認位置（5’一 AAGCTT— 3’）纳人核苷酸序列30- 35位置 之rpST DNA序列中。除了 A14D突變作用，額外的核苷酸變 化不會造成rpST蛋白質胺基酸序列上之變化。硝化鐵維» 膜培育於62C之TAC媛衝液中可偵測攜有假想的突變作用 之純糸，並檢査新Hindlll限制位置之獲得•其係存在於 突變寡核苷酸中，且因此判斷質體中A14D突變作用之存在 〇 啻例1 2 嫌箱DST空猫作用至_當的细Μ件表插皙鶼 經改變的（攜有突變作用）純糸構築至细菌性表現質體 PR0211之衍生物中（述於ΕΡ0173280專利案，在此列為參 考文獻）·命名為 pROpST、 pR〇pSTA34 及 pR0pSTE34 。質 體pROpST含有選殖至表現載HpR0211之pSTpHA ·且在第 -183及191位置上含有編碼半胱胺酸之DNA ; pR0pSTA34 (請先閲讀背而之注意事項#堝寫私1 裝- 本紙张尺度逍用中a B家標準(CNS) T4規格(2丨0X297公；《:) 32 20504ο Λ 6 Η 6 五、發明説明（31) 含有煽碼丙肢酸之DHA ·且pR0pSTE34含有煸碼毅胺酸之 DNA ，均在這些位置。pGEMpST經改變的鈍系K EcoRI及 Smal水解•並分離鶼突變作用之小PST片段。pR〇pSTA34 DN A類似地處理，並分離大的含載«之DHA片段》這些經 纯化的片段K T4 DN A連接酶連接在一起，並轉形至通當的 细菌菌株中*如4300。此菌株含有溫感λ抑制子（cl857 )·如此,.λ P_L啟動基围之表現於30t：時被阻止，但42tJ時 可行，此溫度下之抑制子被滅治。經改變的pGEMpST DHA 片段引人pR〇pSTE34 DNA中，如pR0pSTA34所述。繹改變 的pGEMpST DNA片段引人pROpST中如pR0pSTA34所述，除 了 pGEMpST 及 pR0pSTA34 質 *嫌均 JWEcoRI 及 Hindlll 水解 。表I示出细菌表現霣體，此中可引入經突變的pST基因 。PST 突變作用 A6T ，S11RA14D 及 Q21HH22R 引入 PR0PSTE34衍生物中，如pR0pSTE34所述。此衍生物一 pROpSTESGiTz ，含有一約 1 kb 之 Hindlll 片段位於 PST 編碼DNA之3’端，其中含有來自大腸桿菌rrnB探縱子之轉 錄作用终结子ΤαΤζ (核糖fliRNAB操級子）。 請 先 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 再 % 寫 本一\ η 裝 訂 經济部屮央櫺準局β工消#合作社印製 各紙张疋度边和中S租未標平(CNSjTi規IS(210x29/公龙） 33 10 ο 520

66 AB 五、發明説明（32) 表 I 表現齡鵂之楱築：於183及1Q1枋罾之胺某雔{1日命 於183及191傾磘 > 胺某酴 突磨作爾 半胱防酴 丙肱雔 毅防除 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

I122L L115K L118E L115KI418E-- L118EI122K L115E I122E L118T L118K E119LQ123L L115A L118A M12 6A L118AI122L I122LM126A S81,87L L82,84Q S81,87L+E119LQ123L "+ I122L "+ M126A L82,84Q+L115K A14D A6T S11RA14D Q21HH22R A6TS11R A6TS11R+H22L P8TS11R+I122L P8TS11R + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ★ + * + + + 来也含有未；自大腸桿菌「「nB搡縱子之f/T 2轉錄作用终结9 序列 g例I? 構築螳旋1琚^餌会李隹 本紙張尺度逍用中®租家標準甲4規格(210父297公龙） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 34 20504b Λ fi η 6 五、發明説明（33) 經濟部中央櫺準局κχ工消伢合作杜印製 A_6TS11R +E34 及 P8TS11R +Ρ!·?Α 雙重突變作用A6TS11R ，其中第6*位置之丙胺酸以蘇胺 酸取代，且第11位置之弱胺酸K精胺酸取代，將之與E34 突變作用（述於EP355460)混合，其中第183及191编碼 半胱胺酸之DNA Μ毅胺酸取代。因此生成的rPST基因於 rpST DNA之胺基（A6TS11R )及羧基末端（E34 )區域中 均含有考赛作用。生成的質體命名為pROpSTE - A6TS11R 。來自PML / PGH14之纆改變的含rPST小的EcoRI / Smal片段，含有A6TS11R突變作用，與來自質SfpROpSTE —Tih之大的EcoRI /Siial片段連接。此後•霣體是pST 表現質體，其在rpST—鏞碼DNA之3’端有來自大腸桿菌 rrnB操縱子（hh)強的轉錄终结子。 另一雙重突變，P8TS11R ·其中第8位置編碼脯胺酸之 DNA突變成編碣精胺酸*且編碼弱胺酸的DNA突變成傾碼 精胺酸，將之與E34突變作用混合（述於EP355460) ·其 中編碼半胱胺酸之DNA (於第183及191位置）K毅胺酸 取代。生成的rpST基因因此在rpST DNA之胺基末端（ P8TS11R )及羧基末端區域（E34 )均含有突變作用。生 成的質體命名為pROpSTE —P8TS11R 。相同的策略應用於 pROpSTE -P8TS11R 如 pROpSTE -A6TS11R 般築構 * 除了 質賭pML /pGH18 ，其含有P8TS11R雙重突變用來充作經 _ — «· 改變的rpST DNA之來源。 ARTS11R +T122L +K34 及 P8TS11R +I112L +E34 上述的I112L螺旋3區突變與二個螺旋1區突變中各自

ih 先 閲 請 背 而 X. 苯項 場 %本、 I 裝 玎 線 本紙Λ尺度边用中S Η家採準(CNS)T4規格（210X297公;tt) 35 20504b 經濟部屮央檑準杓只工消tv合作杜印31 五、發明説明（34) 琨合，A6TS11R及P8TS11R K及E34突變作用。生成之質 體分別命名為卩1?0?511-3乂£-厶6了51^? +11221及？》^/ PGH18 - SXE - I122L ° pROpST- SXE - A6TS11R + I122L之構築係將小的含I122L的BssHII/Hindlll片段 與純化自 pROpSTE — A6TS11R 之大的 BssHII/Hindlll 片 段連接。此生成之質應含有嫘旋2區匣，由SacI及Xbal限 制位置辱定-· ·其鄰接先前所述之螺旋2區繙碼D N A之5 ’及 3’端，但不含1'112轉錄作甩终结子。質艘1>»^/?01118 — SXE - I122L Μ相同方式淸第，除了以質艘PML /pGH18 充作大片段來源*攜有P8TS11R雙重突變作用。此改變的 質體不含hTs!轉錄作用终结子•且擄有螺旋2區匣。 富例1 4 铒你飽之簠la腰牛#潇寰夕眘宙袢蛤a 用來決定安定性之步嫌如下。製備於璘酸鹽級衝食鹽水 、口117.4(»<3112卩〇4112〇3.45克，1^2»1?043.55克， NaCl 9.50克，溶於蒸餾水中1000¾升）中之重姐體（動 物）生長激素衍生物（達100毫克/奄升）澴縮溶液。此 濾過millipore無菌之Millex — 0.22微米過滹單位，再將 每份0.1奄升置入管中。將之置43Ό烘箱且於一定間隔時 間下取出。内容物再K磷酸》緩衝之食鼸水稀釋。上清液 M HPLC分析單體及雙重含量。進行質體平衡。記錄任何沉 _ - 硃 澱之物質。结果與最初澹度比較，並考證安定性概括。 此外，在pH 7.4圼現不佳水溶性之生長激素衍生物，可 •於略佳pH (4 — 10)下溶解，或許估為懸浮液。 (請先閲請背而之注意事項孙填寫 本紙張尺度逍用中BIS家標毕（CNS)T4規格（210x297公；a：) 36 五、發明説明) A 6 B6 研究改變的rpST蛋白質，所得的溶液安定性结果綜合於 表 I 。 .’ 表 I n.pST突寒蛋白晳之话艏外滚觭庥 李寒作用_ A34 I122L+A34 E34 工 122L+I：34 A6TS11R+E34 P8TS11R+E34 31A6TS11R+I122L+E34 P8TS11R+I122L+E34 L118K+A34 E119LQ123L+A34 L115A+A34 L118A+A34 M126A+A34 L118AI122L+A34 工122LM126A+A34 S81f87L+A34 S81,87L+E119LQ123L+A34 S81,87L+I122L+A34· S 81,8 7 L+M12 6A+A3 4 M可溶件_ 43t下怯音 32 14 44 14 70.0(3) 14 67 17 62.0(2) 14 66.3(3) 17 68.5(2) 14 62 14 36 14 2 14 0 3 0 3 0 3 10 7 18 3 2 . 7 22(2) 19 0 3 0 7 8 7 0 3 請 先 閱 背 之 注 意 事 項 再 塡 寫 本 頁 裝 訂 線 經 濟 部 中 央 標 準 Μ 貝 工 消 作 社 印 製 百分溶解度Μ溶液中所留缌數Χ100之分數表示。（見實 例1 4 )。當進行·' —種κ上之決定時，示出溶解度之平.均％ ，且獨立決定之數字Κ括號括出。rpST突變存在於Α34或 E34背景。A34「pST含有丙胺酸，取代半胱胺酸，於第 1 83及1 9 1位置。E34 rpST含有穀胺醯胺取代半胱胺酸， k第1 8 3及1 9 1位置c 本紙張尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格(210XM7公理:) 37 2〇δ〇4，0 A 6 Β6 五、發明説明（） 36 g例1 5 捺噔電姐體（動物K生#潇宏折Φ物動物，wtn除番W去 Φ .鼠試驗法块宙茸Φ苒加雎作用 本發明重姐腹動物生長激素衍生物改费劻物生長速率之 效力利用切除腦下垂體老鼠分析法來決定。切除垂體之老 鼠不會產生其本身之生長激素，且對注射之生長激素敏感 。偵測之反應是生長約10天後，且M rpST陽性街照姐生物 τ · 活性之百分比表示於表IV中，此陽性對照姐係包括於每一 試驗中。 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· 線· 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中國Η家標準(CNS)甲4規格(2丨0父297公釐) 38 A 6 B6 五、發明説明)S_JSL·rpST突變蛋白質之生物數據（切除垂體 大鼠，RRA )及熱安定性 S-笔作用_切除垂髂士留· RR Ab

A3 4 I122L+A34 E34 工122L+E34 L115K L115K+E34 … 一 L118K E119LQ123L L115A L118A M12 6A L118AI122L I122LM126A S81.87L S81,87L+E119LQ123L S81/87L+I122L S81,87L+M126A L82,84Q 40 5 5 /fv /|\ 2 6 ) 8456388863 «········ /IV 27060013840866 19 9 •丨丨； 6 0 3 6 4 9 9 6 3 8 4 7 7 2 yf\ 5 9 2 9 3 7 2 K114R+E34 121.3 A6TS11R+E34 80.7(4) P8TS11R+E34 129.7 A6TS11R+I122L+E34 116.7 P8TS11R+I1221+E34 127.9 173.5 225.8 51.4(7) 80.28(5.)1.2 0.9 43.9 80,2 163 49.5 122 57.9 82.55(2) 194 177.9 165 186 3.4 53.2 135.0(4) 78·5112.8 89.3 nd 79 62.0(6) 62.67(5) >83 79 36 49 50 57 55 56 63 40 38 4 7 47none observe 4 /fv ο 2 4 5 14 6 6 6 6 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 11切除垂體大鼠K充作陽性對照组之rpST標準活性百分率表示。b RRA-肝放射性受體分析结果，以由rpST標準觀察所'得之 活性百分率示出。 nd :未決定當所進行之決定一種Μ上時，示出平均值，決定數字示於 本紙張尺度逍用中國S家標準(CNS)甲4規格(210X297公婕) 39 五、發明説明（ 387

括號内。 啻例Ifi · 肝协射勞艚分枏· Μ決宙洱改寒之電姐鵂生县激素活體外 结合S牛#满隶孕W之能力 應用活體外放射受體分析，Κ評估本發明重姐體生長激 素與12BI_rPST競爭與純化自肝细胞膜生長激素受體结合 之能力。這些分析结果Μ百分rpST结合示出，並示於表IV 窗例1 7 M roST^ m η 221. + Μ 4谁行之Μ平衡窖除 (請先間請背而之注意事項再塡窍本頁} 經濟部中央標準局只工消赀合作社印¾ 為評估改 活體内生物 生長中豬皮 主要成為肌 蛋白質量之 ，因此分析 正確的估計 之氮量及尿 存之量。氮 的百分比（ 183 及 191 毅胺酸取代 於rpST對照 奮例1 8 變之rpST蛋白質（其 活性，如PE355460所 下投予PST »可增加 肉）。氮平衡試驗之 變化提供测fi方法。 飼料及排泄物之氮， 。因此，氮平衡是一 液和糞便中分泌之量 滯留的最正確估計是 氮消耗減去糞便中之 位置之半胱胺酸殘基 。此研究之结果說明 姐之完全的生物活性 攜有I122L突變作用）之 述地進行氮平衡研究。對 體内儲存之蛋白質之量（ 使用，可對貯存於動物中 由於蛋白質含固定量之氮 可對蛋白質貯存狀況提供 棰偵测方法•飼料中消耗 *二者差異之估計即是貯 保留之氮量為消化之氮量 氮）。於此研究中，第 ，或rpST I122L變化已用 ，經變化之rpST分子相對 本紙张尺度遑用中SH家榣毕（CNS)甲4規格（2丨0X297公;«：) 40 Λ 6 Η 6 五、發明説明（39) 利用萑光来麽訏浓宙熟安宙抻 緵改變之rpST之熱安定性，由偵測為溫度函數關係之内 在色胺酸螢光而推論》rpST分子含有單一的色胺酸殘基， 其内在的螢光可於"天然狀況"下嚴重地被消光。溫度增 加、pH值降低•可造成螢光具特性地增加•其可能是由於 至少在另外包埋之色胺酸殘基緊鄰结構上有所喪失所致。 螢光對增溫度之*熔化概圖〃呈現S曲線，其中螢光保 持熄滅直到達到所給r*PST衍生物之典型溫度為止。之後確 保纆過一段相當窄的溫度範圍後螢光有鮮明的增加。界定 此螢光增加之中點溫度為Τ(π)*且反映出蛋白質之熱安定 性。本發明rpST之Τ(β)由Bnrger, et al 1966之方法決定 *除了以295奄微米為激發波長，且利用355毫微米阻斷 濾鏡讀出發射之螢光。本發明rpST之T(m)綜合於表IV。這 些數字顯示I122L在T(m)上有79t：顯著地增加。 啻俐1 9 W聚合睡_反鏖方法產牛Τ122Ι,空》作用 經濟部屮央櫺準局κχ工消坨合作杜印製 先 閲 背 而 之 注 意 事 項 孙 % 本， η 以位置指令突變作用，利用Sarkar及Sommer 1990所述 之聚合酶鍵反應技術（已列為本案參考），將I122L突變 作用引入rpST基因中。所使用的三個寡核苷酸引子列於表 I ，且包括寡核苷酸SacI293 ，1120-3及PvuII634。Μ來 自質體pGEMpST _SX之含rpST基因之EcoRI /Hindlll片 段為棋板。於1毫微克棋板rpST DN A上進行15個循環之聚 合酶鏈反應（於後稱之為PCR )，採用各1 之 L120-3及PvuII634寡核苷酸引子，dNTP及Taq DNA聚合_ 本紙張尺度边用中Η Β家標平(CNS) Ή規格(210x29·/公龙） 41 五、發明説明（40) 經濟部屮央榀準灼只工消费合作杜印^ ，如操作指示地進行。此反應可生成227 bp之DNA片段， 其含有I122L突變作用。此片段K瓊·脂糖凝腰電泳純化， 且充作PCR引子，加上寡核》酸引子Sac 1293 ，及含 rpST之EcoRI /Hindlll棋板片段於15儸額外的PCR循環 中。生成的361 bp片段K限制_SacI及PvuII解離•瓊脂 糖凝膠《泳鈍化》再連接成大的經凝謬纯化之Sac 1/ PvuII pGEMdST- - SX DHA片段。連接混合轉形至HB101勝 ▼ ·* 任细胞。生成之轉形细胞•其霣KDNA進行如L118E之 I122L突變作用存在之篩選•除了 K寡核苷酸L120-3·充作 放射檷記之雜交探針*且只進行一輪之篩選。PCR中 II22L突變作用之存在及額外突變作用之不存在•可由 DNA序列分析予Μ證實。攮有此突變作用之質體命名為 pGEMpST - SX- I122L PCR 〇 啻例20 rpST突寒作用T122L至gW^澧箱，诤_会於毡S中宪振 為於釀酒酵母中表現攜有II 22L突變作用之rpST基因， rpST編碼DNA需操作性鏈结至衍自此酵母之啟動基因序列 °pR〇pST-SXE -I122L 之撝有 rpST 之小 Ndel/Hindlll 片段末端於質體KNdel及Hindlll解離後* KDNA聚合酶 I之大的克林諾（KUnow)片段處理使呈平齊。片段Μ凝 膠電泳純化，再與ΥΕρ352-2質體之大的Sall/Sphl片段連 接。後一片段之末端MSI核酸酶處理使平齊。此質體是 YEp352 -衍生物，其經修飾可額外含有相異的GAL1/ GAL10 啟動基因（Johnston and Pavis· 1984)，及來自 (請先閲讀背而之注意事項孙填寫^頁) 裝- 訂 線· 本紙張尺度边用中a Η家標準（CNS) ΤΜ規格（2丨0X297公；tt) 42 20504b 五、發明説明（41) Λ 6 It 6 STE7基因之3 ’未 成之質體命名為 此/pST變棰於 母细胞培餐於合 H iIks ，1986) 源，於301C下數 生及rpSI產製.〇 何酵母菌株為宿 GAL +之酵母菌株 轉譯區域（Teague, et. al., 1986)生 YEp352 - pST - 1122丄（圖 5 )。 酵母中之表現，可將K此質體所轉形之酵 成的完全培養基中（Sherman * FinkS ，其缺乏腺胺酸且含2%半乳糖為唯一碳 小時，或總是必須達到最大之rpST基因誘 雖然可K在UR A3基因中攘有突變作用之任 主，然較好是應用缺乏蛋白_產製且是 ，如 BJ5457 (基因型 MATot pep4: HIS3 P r b 1 _ Δ trpl ura3 — 5 2 1 e u 2 _ Δ h i s 3 — Δ I y s 2 — 801 canl CAL+)。此菌株貯於加洲之酵母遺傳貯品中心 •編碼為BJ5457。 ih 先 間 讀 背 而 之 注 意 事 項 孙 填 寫 頁 經濟部中央橾準局EX工消费合作杜印5i 本《•張尺度边用中《困家標準^⑽丨卞^規怙口⑴乂四丫公龙) 43 A 6 B6 五、發明説明（42)

BIBLOGRAPHY 1. Abdel-Meguid et al. (1987)., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84. 6434-6437 i/2. Brems, Biochemistry 27. 4541-4546 (1988). 3. Brems et al. (1986), Biochemistry 25. 6539-6543. 4. Brems et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA M/ 3367-3371 . 5. Burger, H.G., Edelhoch, H. and Condiiffe, P.G.# (1966) Endocrinology 78, 98-102. 6. Chen, W.Y. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 5061-5065 . 7. Johnston and Davis, (1984) Molecular and Cellular Biolocrv 4., 1440-1448 . 8. Sarkar and Sommer, Biotechnlcrues 8, 404-407 (1990). 9· Teague et al (1986) , Proc. Nat. Acad. Sci USA 81, 7371-7375. 10· Sherman, F. , Fink, (3. β.. and Hicks, J. B., (1986) "Laboratory Course Manual for methods in yeast genetics," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ppl63-168. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中國a家標準(CNS)甲4規格(210父297公釐) 44 五、發明説明 (431 Λ fi Η (5 經濟部中央榣準局A工消伢合作杜印製 序列表 ⑴一般資料· " (i )申請人：Deborah Tardy Chaleff (ii)發明名稱：於α —螺旋3區，α —螺旋2區或同 時於二區中有改變，及同時结合其他變異之生長激素 (iii )序列數：1 (iv )相當之住址： (A)收信人：E s t e 1 1 e J . T s e v d o s , A m e「i c a η C y a n a m i d Company ©> 街：1937 Wes 0 ::Sa 晉根宵格桑容格 (E) 國家：美國 (F) I IP : 06904 (v )電腦可讀型式： (A)介質型式：F 1 o p p y D i s k ® 電腦：IBM PC AT - 〇操作糸統：MS— DOS O 軟體：ASCII 轉化自 IBM Displaywrite 4 (vi )目前之案件資料 (A)案號 ©檔期 · 〇分類： (vii)先前之案件資料： (A)名稱：Tsevdos, Estelle J. (請先閲讀背而之注在求項再项寫本頁) 裝. 訂- 本紙張尺度逍用中a困家標準（CNS) TH規格（210X297公¢) 45 Λ ii U 6 _ 五、發明説明（“ Θ註冊號：31 , 145 〇參考/備k數字：31,297-00 (ix )電聯資料： (A)電話：2 0 3 3 2 1 2 7 5 6 ® 電傳：203321 2971 〇電報 ⑵SEQIDN0 1之資料 (i )序列特性 ㈧長度：193 ©型式：核酸 〇股性：單股 〇拓撲學：線型 (ii )分子型式： (ffi )假設上： 經濟部屮央樣準局貝工消费合作杜印驭 物 離段 式式 體 分階 型型 : 機株別音性織胞 性式 有菌個發套姐细 ΜίΑ : \J/ \1/ \»/ \l- V). 意段頭 ABCDE FG 抗片源 \lx \—/ \—/ IVVV1 本紙5艮尺度逍用中國Η家標準（CNS) T4規格（210X297公；《：) 46 2〇r〇〇^6_ 五、發明説明 (¢5 ) 經濟部屮央榀準局C3:工消伢合作社印製

\ly Η /V 立> 基 /1\ /1- ix 特

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即 AB 因ABC 色 ABCD 物 ABCDEFGH 來 體 \ί/ \1/ \»/ \—/ 資 \I/ \1/ \J/ VI/ \1/ \J7 \/ )/ 落 段 置\置 株 位體位 胞器 糸之色圖位 细胞源庫純中染興單 ♦ (請先閲讀背而之注悫事項再填窍本頁) 索法料 碼 \ 方資 號 稱置定他 者題誌號號數期件期 名位鑑其料作標雜期專頁日文檔 訂- 線 本紙張尺度边用中a Η家楳準（CNS) T4規岱（210x297公及） 2〇5〇4b A6B6 五、發明説明（46) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (J )公告期 . (K )相關事項 (xi)序列說明：SEQ ID H0:1 ATG GAT CAA TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA 36 Met Asp Gin Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu 1 ，. 一 · 5 i〇 TTT GCC AAC GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC 72 Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg Ala Gin His Leu His 15 20 CAA CTG GCT GCC GAC ACC TAC AAG GAG TTT GAG CGC 108 Gin Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Arg 25 30 35 GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC TCC ATC CAG 144 Ala Tyr lie Pro Glu Gly G^n Arg Tyr Ser lie Gin 40 45 AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC 180 ( Asn Ala Gin Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr lie 50 55 60 CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA 216 Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gin Gin Arg 65 70 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝‘ 訂. 線- 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公*) 48 252 五、發明説明（47) TCG GAC GTG GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu 75 80 ATC CAG TCG TGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC lie Gin Ser Trp Leu Gly Pro Val Gin Phe Leu Ser 85 90 95 288 AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTT GGC ACC TCA Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr Ser 100 105 324 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp L&u Glu Glu 110 115 120 360 GGC ATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC Gly lie Gin Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly 125 130 396 AGC CCC CGG GCA GGA CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC Ser Pro Arg Ala Gly Gin lie Lys Gin Thr Tyr 135 140 432 GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT GAT GAC GCG Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp Ala 145 150 155 468 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Gys Phe Lys 160 165 AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val 170 175 180 504 540 本紙張尺度逍用中a國家樣準(CNS)甲4規格(210X297公;Ϊ) 49 五、發明説明（48) A 6 Β6 ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC Met Lys Cys Arg Arg Phe Val Glu S&r Ser Cys Ala 185 190 576 TTC Phe 579 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝· 訂_ 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公:¢) 50

Claims (1)

1. 六、申請專利範面 修％^^曰 褊充

   1- 一種於α —蠖旋3區中有突麥作用之生長激素，其中該 α—螺旋3區之突赛作用包括：I122L ，L115E ， LI 15K ， L115KL118E · L118E ， L118T * L118K ， L118EI122K > I122E ， E119LQ123L · M126A ， L118A > G121A * K114R ，K116R ，1122LΜ126A或 1122LL118A 〇 2- 根據申謫專利範圍第1項之生長激素，其中該生長激素 是人類、牛、豬、羊、山羊、馬、魚、或鳥類生長激素 3. 4. 5. a 根據申請専利範圍第1項之生長激素，其中該α —螺旋 3區之突麥作用是I122L 。 根據申請專利範圔第3項之生長激素，其中該生長激素 是豬或牛生長激素。 根據申請專利範圍第4項之生長激素•其中該生長激素 是豬生長激素。 一種於<?—螺旋2區有突變作用之生長激素，其中該α —螺旋2區之突變作用是S81，87L或I82.84Q 。 根據申誚専利範圃第6項之生長激素•其中該生芦激素 是人類、牛、豬、羊、山羊、馬、魚、或鳥類生長激素 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 8. 嫁潦邡中衣樣準扃印装 a 根據申請專利範圍第7項之生長激素，其中該生長激素 是豬或牛生長激素。 根據申請專利範園第8項之生長激素’其中該生長激素 是豬生長激素。 根據申請專利範圃第1項之生長激素•額外地包括該生 甲 4(210X297 公廣) D 4 ο 5 ο 2 7 7 7 7 A B c D 六、申請專利範® 長激素於CX —嫘旋2區之突雯作用。 U. 根據申請專利範圍第10項之生長激素，其中該生長激素 是人類、牛、豬、羊、山羊、馬、魚、或鳥類生長激素 〇 根據申請專利範圍第11項之生長激素，其中該α —螺旋 2區突變作用is81,87L或L82.84Q 。 13. 根據申請專利範圍第12項之生長激素，其中該α —嫘旋 3區突變作用是I122L 。 14. 根據申請專利範圍第1項之生長激素*其中於第183及 191位置之半胱胺酸Μ穀胺酸取代。 15. 根據申請專利範圍第1項之生長激素，其中4個半胱胺 酸中，2画於小環且2個於大環•至少1個被刪除。 16. 根據申請專利範圍第1項之生長激素，其中4個半胱胺 酸被修飾成磺基丙胺酸。 17. 根據申請專利範圍第3項之生長激素，其中於第183及 191位蕈之半胱胺酸被穀胺酸取代。 18· 根據申請專利範圍第3項之生長激素，其中4個半胱胺 酸，2個於小環且2個於大環，至少1個被刪除。 19. 根據申請専利範圍第3項之生長激素，其中4個半胱胺 酸被修飾成磺基丙胺酸。 2Q 根據申請專利範圍第6項之生長激素，其中於第183及 191位置之半胱胺酸被毅胺酸取代。 經濟邡中央橾準局印¾ ....................................h .............¾.. (請先閲讀背面之注意事項再滇窝本頁) •打· 2L 根據申請專利範圔第6項之生長激素，其中4個半胱胺 酸，2個在小環且2個在大環，至少1個是被刪除。 22 根據申請專利範圍第6項之生長激素，其中4偭半胱胺 甲 4(210X297 公;¥) 20504 ο Β7 C7 六、申請專利範面 酸被修飾成磺基丙胺酸。 23.根據申請專利範圍弟10項之生長激素，其中於第us及 191位置之半胱胺酸被毅胺酸取代。 ^· 根據申請專利範圍第1〇項之生長激素，其中4個半胱胺 酸，2個在小環且2個在大環，至少1個被刪除。 ^ 根據申請專利病園第1〇項之生長激素，其中4個半胱胺 酸被修飾成磺基丙胺酸。 26.—種於生長激素上進行位置指令之突荽怍用的方法，此 方法包括：賴產生一個回冷至合成寡核苷酸之單股DNA 以選殖DNA片段，該寡核苷酸是選自：SacI293 ， Xba 1 353 ，S81L > S87L > Q8082 ，ΚΙ 13 · Ε116- Κ113Ε116 > El16Κ120 * E120 · L120-3 · A124-2， E113EHDQ116 * E113D ， L115A ， L118A ， L118TK * L118T ， L117 ， 121 ， Leull7121D > K114R X keel « G121A /Xflinl，K116R /Bglll * A14D/HindIII ， A6T » S11RA14D/ Sal ，Q21HH22R/ C1 a I或 Pvu 1 1634， 其互補於該DHA之一部份•且其中該募核苷酸含有該 DHA未配對區域；使該DNA赛成雙股；將此雙股0A轉 形至逋當的宿主Μ成集落；選出與該寡核脊酸雜交之突 變序列；Μ通當核酸内切限制梅水解並將選出之序列構 築至表現質《中；表現該生成之重姐體衍生生長激素。 ....................................> .............装..............................#..........-..................# (請先聞讀背面之注意事項再滇寫本頁) 經淹邡中央標準扃印裝 人 是。 素素 激激 長長 生生 該類 中鳥 其或 f Λ 法魚 方、 之馬 項、 26羊 第山 圍、 範羊 利、 專豬 請、 申牛 據、 根類 27. 甲 4(210X297 公潘）