FI104489B - Sian somatotropiineja, joissa on kaksoismutaatio alfakierteen 1 alueella - Google Patents

Description

x 104489

Sian somatotropiinej a, joissa on kaksoismutaatio alfakierteen 1 alueella

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö liittyy sian somatotropiinianalogei- hin, jotka sisältävät alfakierteessä 1 olevia aminohappo-muutoksia, jotka esiintyvät yksinään tai yhdessä mainittujen somatotropiinien alfakierre 3- ja/tai alfakierre 2 -osassa olevien aminohappomuutosten kanssa. Kuvataan myös 10 menetelmiä muutosten aikaansaamiseksi alfakierteeseen 1 ja muihin yhdistelmä-DNA-menetelmillä tuotettuihin polypepti-deihin tai proteiineihin. Eksogeenisten somatotropiinien antaminen tehostaa huomattavasti useiden eri eläinten, erityisesti kotieläinten, kuten sikojen, mutta myöskin 15 kalalajien kasvua. Erityisesti tälle kotieläinten kasvun tehostumiselle on yleensä ominaista yhtä aikaa lihasmassan lisääntymisen kanssa tapahtuva rasvan väheneminen, mistä on tuloksena suurempia ja vähärasvaisempia eläimiä. Ekso-geenistä somatotropiinia saavien eläinten rehunkäytön te-20 hokkuus paranee merkittävästi, jonka tuloksena paino lisääntyy samalla kun rehua kuluu vähemmän.

Somatotropiinia annetaan ulkoisesti usein eri tavoin, kuten antamalla sitä päivittäin ruiskeina. Tietyissä tapauksissa on kuitenkin edullista käyttää muita antotapo-| 25 ja. Tiettyjä kotieläimiä käsiteltäessä voidaan ottaa avuk si esimerkiksi eläimeen asetettava väline, josta somatotropiinia vapautuu jatkuvasti määrätyn ajan kuluessa. Melko haluttu annostelutie on käyttää eläimeen asetettua välinettä, josta ainetta vapautuu jatkuvasti määrätyn ajan 30 kuluessa. Tällainen laite voisi sisältää suuria somato-tropiinimääriä hyvin suurissa konsentraatioissa (noin 500 mg/ml). Näitä antotapoja käytettäessä vaaditaan vielä somatotropiinimolekyyliä, jonka liukoisuus on hyvä ja jonka pyrkimys muodostaa liukenemattomia, biologisesti inak-35 tiivisia yhteenkeraytyrniä on pieni.

2 104489

Somatotropiinit sisältävät neljä alfakierrettä, jotka muodostavat keskenään alfakierteistä muodostuneen ryhmän (Abdel-Mequid et ai., 1987). Tämän rakenteen keskustaan suuntautuneet aminohappojen sivuketjut ovat tyy-5 pillisesti poolittomia, hydrofobisia ja tiiviisti yhteen-pakkautuneita, jotta poolinen liuotin (kuten vesi tai fysiologinen suolaliuos) ei pääsisi kierreryhmän keskustaan. Primääriseltä jaksoltaan sian somatotropiinia muistuttavan naudan somatotropiinin tapauksessa alfakierteen 3 hydrofo-10 bisen puolen (aminohapporyhmät tyr110 - leu127) altistaminen konsentraation 1 mg/ml ylittäville proteiinikonsentraati-oille edistää "assosiatiivisten välituotteiden" muodostusta, jonka esitetyn hypoteesin mukaan ajatellaan olevan yhteenkeräytymien muodostumisessa toimiva nukleaatiotapah-15 tuma (Brems, et ai., 1986, Brems, 1988). Nämä assosiatiiviset välituotteet voivat edustaa useista yksittäisistä somatotropiinimolekyyleistä peräisin olevan a-kierteen vaihtoehtoisella tavalla tapahtuvia pakkautumis-muotoja, joista on tuloksena multimeerinen rakenne, jossa 20 tämän kierteen hydrofobiset pinnat erottuvat pois vesipitoisesta ympäristöstä. Assosiatiivisten välituotteiden muodostuminen voidaan ehkäistä lisäämällä ylimäärin alfa-kierrettä 3 sisältävää proteiinifragmenttia (Brems, et ai.

(1986). Kierteen hydrofobisen pinnan pidentäminen korvaa-• 25 maila asemassa 112 oleva lysiini leusiinilla vahvistaa lisäksi pyrkimystä assosiatiivisten välituotteiden muodostumiseen (Brems, 1988).

Somatotropiinien vähäisen liukoisuuden muodostamaa ongelmaa on tässä yritetty ratkaista muuttamalla somatot-30 ropiinien a-kierteeseen 3 kuuluvia alueita. Tarkemmin sanottuna on valmistettu sellaisia sian somatotropiineja, joiden pysyvyys liuoksessa in vitro -olosuhteissa on parantunut, käyttämällä tähän a-kierteen 3 kohdemutagenee-sia. Mutageneesi kohdistetaan sekä hydrofobisiin että hyd-35 rofiilisiin pintoihin. Vähän aikaa sitten on saatu tulok- 3 104489 siä kokeista, joissa naudan somatotropiinin okierteen 3 alueelle aiheutetuista kohdemutaatioista oli seurauksena mutatoitua somatotropiinia ilmentävien transgeenisten hiirten kasvun estyminen, joka tulos viittaa siihen, että 5 a-kierteen 3 alue on tärkeä biologiselle aktiivisuudelle (Chen et ai., 1990).

Tarvittaessa yhdistetään lisäksi a-kierteessä 3 olevat mutaatiot kierteen 1 tai kierteen 2 alueisiin ja kysteiiniä asemissa 183 ja 191 koodaavaan DNA:hän valmis-10 tettuihin kaksoismutaatioihin, joissa kysteiiniä koodaava DNA korvataan joko alaniinia tai glutamiinihappoa koodaa-valla DNA:11a. Asemissa 183 ja 191 olevat kaksoismutaatiot kuvataan EP 355 460:ssa, joka liitetään tähän hakemukseen siihen oikeutettujen säädösten mukaisesti. Tässä patentti-15 hakemusjulkaisussa kuvattuja mutaatioita käyttämällä saadaan somatotropiineja, joiden liukoisuus (pysyvyys) on parantunut ja siten niiden ominaisuudet jatkuvan vapautumisen kannalta ovat parantuneet. Sian somatotropiini on erityisen käyttökelpoinen jatkuvasti vapautuvassa muodos-20 sa, ja se on tässä muodossaan kiinnostavin somatotropiini.

Erityisen käyttökelpoinen esimerkki käsiteltävistä mutaatioista on mutaatio I122L, jossa a-kierteen 3 asemassa 122 oleva isoleusiini on korvattu leusiinilla. Yhdessä muiden asemissa 183 ja 191 olevien mutaatioiden kanssa, ; 25 joissa kysteiinit on korvattu alaniinilla, saadaan tämän proteiinin ainoan tryptofääniryhmän transitiolämpötila nousemaan merkittävästi. Transitiolämpötila on proteiinin lämmönkestävyyttä kuvaava suure. Pysyvyys liuoksessa saadaan yhdessä edullisimmista mutaatioista parantumaan, kun 30 I122L-mutaatio yhdistetään mutaatioihin, joissa asemissa 183 ja 191 oleva kysteiiniä koodaava DNA muutetaan gluta-miinihappoa koodaavaksi. Toisen edullisen mutaation yhteydessä saadaan pysyvyys liuoksessa parantumaan, kun kierteen 1 kaksoismutaatio A6TS11R yhdistetään mutaatioi-35 den kanssa, joissa asemissa 183 ja 191 oleva kysteiiniä » 4 104489 koodaava DNA on muutettu glutamiinihappoa koodaavaksi DNA:ksi.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 sian yhdistelmä-somatotropiinin (rpST) 5 DNA:n restriktiokartta. Pitkä yhtenäinen viiva kuvaa rpST- DNA:n aminohappoja koodaavaa osaa, ohut viiva kuvaa tämän osan viereisiä 5'- ja 3'-puoleisia DNA-jaksoja, joihin ei sisälly koodaavia alueita. rpST-geenin alueet, joille suoritettiin kohdemutageneesi, on numeroitu ja nämä numerot 10 on merkitty restriktiokartan alapuolelle, jossa numero 1 edustaa DNA:ta, joka koodaan α-kierrettä 1, numero 2 edustaa DNA:ta, joka koodaa a-kierrettä 2, numero 3 edustaa DNA:ta, joka koodaa a-kierrettä 3 ja numero 4 edustaa DNA:ta, joka koodaa asemissa 183 ja 191 esiintyviä kyste-15 iinejä. Kartan yläpuolella olevat kirjaimet viittaavat eri restriktioendonukleaasientsyymien restriktiokohtien sijaintipaikkoihin, jossa Rl = EcoRI, N = Ndel, B = BssHII, S = SacI, X = Xbal, Sm = Smal ja H = Hindlll.

Kuvio 2 plasmidin pEFF-902 rakenne ja restriktio-20 kartta. Plasmidi sisältää pBR322:n replikaation alkukohdan (Ori) ja ampisilliiniresistenssigeenin, bakteriofaagi lambda:sta peräisin olevan lambdaPL-promoottorin, ribosomin sitoutumiskohdan dl ja repressorigeenin cl, E. colin rrnB-operonista peräisin olevan T1T2-transkriptioterminaat-. ; 25 torin, deon säätelyalueelta peräisin olevan 60 emäsparin suuruisen jakson, jossa ei ole promoottoreja, ja rpST-gee-nin, josta käytetään nimitystä pGH. Asiaankuuluvat rest-riktiokohdat on merkitty. rpST:tä sisältävä DNA irrotetaan tästä plasmidista käsittelemällä EcoRI:11a ja Hind-30 III:11a ja kloonataan mutageneesivektoriin PGEM3z(f+) pa-"· tenttikuvauksessa kuvattavalla tavalla.

Kuvio 3 pGHGEM3Z:n rakenne ja osittainen restriktiokartta. Fagimidi sisältää fl:n DNA:n replikaation alkukohdan, pBR322:n replikaation alkukohdan (Ori) ja ampisil-35 liiniresistenssigeenin, SP6- ja T7-promoottorit, IacZ-gee- s 104489 nin, bakteriofaagi lambda:sta peräisin olevan ribosomia sitovan kohdan clI ja rpST-geenin, jolle on annettu nimitys rpGH. Yksinauhaista fagimidi-DNA:ta käytetään temp-laattina kohdemutageneesissä patenttikuvauksessa kuvatta-5 valla tavalla.

Kuvio 4 bakteeriperäistä ilmentämisplasmidia pROpST käytetään sian yhdistelmä-somatotropiinien tuottamiseen bakteereissa (E. coli). Ribosomia sitova cll-kohta sijaitsee EcoRI- ja Ndel-restriktiokohtien välissä. rpST:n 10 translaation aloituskodoni sisältyy Ndel-kohtaaan. Ilmentymistä ohjaa lambdaPL-promoottori.

Kuvio 5 hiivan ilmentämisplasmidin YEp352-pST-I122L rakenne. Plasmidi on YEp352:n johdannainen ja se sisältää rpST-mutaation I122L, jonka ilmentymistä ohjaa S. cere-15 visiaesta peräisin oleva indusoituva GALl/GALlO-promootto-ri. 3'-suunnassa oleva translaatioon osallistumaton DNA on peräisin hiivan STE7-geenistä. 2 μπι -elementti ylläpitää plasmidin replikaatiota hiivassa, ja URA3:sta saadaan se-lektoiva markkeri hiivassa tapahtuvaa transformanttien 20 selektiota varten. Tässä plasmidissa on myös pBR322:n rep-likaation alkukohta (tätä ei ole esitetty) ja ampisil-liiniresistenssigeeni.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö liittyy somatotropiiniin (-neihin), . 25 johon (joihin) sisältyy somatotropiinimolekyylin a-kier- teen 1 alueella olevia aminohappojaksomuutoksia, jotka esiintyvät sellaisenaan tai yhdessä alfakierteen 3 ja/tai a-kierteen 2 alueilla olevien mutaatioiden kanssa. Muita somatotropiinimolekyylissä olevia mutaatioita voidaan li-30 säksi yhdistää tässä käsiteltävänä olevien kierteiden mu-·. taatioihin. Keksinnön mukaiselle somatotropiinille on tun nusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Tuloksena olevasta somatotropiinistä tulee somatotropiinin natiivia muotoa pysyvämpi (liukoisempi) ja se säilyttää 35 biologisen aktiivisuutensa mainitun somatotropiinin jatku- « β 104489 vasti vapautuvaksi formulaatioksi formuloituna. Tarkemmin sanottuna tämän keksinnön mukaisiin somatotropiineihin kuuluvat sian somatotropiinit. Termi somatotropiini kattaa lisäksi natiivin somatotropiinimolekyylin muihin osiin 5 tehdyt deleetiot, lisäykset ja muut muutokset. Esimerkkeinä näistä ovat modifioidut (kysteiinit, jotka on substitu-oitu tai poistettu) tai johdannaisia sisältävät somatotropiinit, joissa mainitun somatotropiinin 1-4 kyste-iinihapporyhmää on korvattu 1-4 aminohapporyhmällä, jot-10 ka kukin erikseen ovat aminohapot arginiini, lysiini, as-paragiinihappo, glutamiinihappo, asparagiini, glutamiini, histidiini, alaniini, glysiini, isoleusiini, leusiini, väliini, fenyylialaniini, tryptofaani, tyrosiini, me-tioniini, seriini, freoniini tai proliini, tai joissa 15 kaikki 4 kysteiiniä on muutettu kysteiinihapoksi.

Tämän keksinnön kohteena on edellä olevan esityksen perusteella tarjota käyttöön uusia somatotropiineja, jotka ovat liukoisempia kuin tämän molekyylin luonnosta peräisin oleva muoto ja ne ovat siten biologisesti tehokkaita for-20 muloituina edullisesti jatkuvasti vapauttavina formulaati-oina. Tässä kuvataan lisäksi kohdemutageneesimenetelmiä tämän keksinnön mukaisten somatotropiinien valmistamiseksi sekä muiden yhdistelmä-DNA-menetelmillä tuotettujen poly-peptidien ja/tai proteiinien valmistamiseksi. Keksintöä 25 esitetään tarkemmin seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa .

Tämän patenttihakemuksen yhteydessä talletetut plasmidit, DNA-jaksot ja mikro-organismit on talletettu, ellei toisin ole erityisesti mainittu, American Cyanamid 30 Company -yhtiön kantakokoelmaan, jota ylläpidetään Prince-\ tonissa, New Jerseyssä, ja jotka on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland 20 952, U.S.A.

a a 104489 7

Edellä kuvatut DNA-kannat talletettiin ATCC-talletuslaitokseen 23.8.1988. Ne ovat pGEMpST-SX (ATCC nro 40 482), pR0211 (ATCC nro 40 483) ja pEFF-902 (ATCC nro 40 484) . Alan ammattimiehet ymmärtävät, että nämä DNA:t 5 voidaan liittää mihin tahansa ilmentämissysteemiin tämän keksinnön mukaisten somatotropiinien tai sen mutaatioiden aikaansaamiseksi.

E. coli K12 -bakteerikantoja, jotka ilmentävät joitakin näistä uusista eläinten somatotropiineista, talle-10 tettiin myös ATCC-talletuslaitokseen 23.8.1988. Näihin bakteerikantoihin kuuluvat E. coli -kanta 1 655 (ATCC nro 67 762), 1 655/pROpSTA34 (ATCC nro 67 763), 1655/pROpSTE34 (ATCC nro 67 764), 1 655/pROpST (ATCC nro 67 765), 4 200 (ATCC nro 67 766) , 4 200/pROpSTA34 (ATCC nro 67 767) , 15 4 2 0 0/pROpSTE34 (ATCC nro 67 768), 4 200/pROpST (ATCC nro

67 769) , 4 255 (ATCC nro 67 770) , 4 255/pROpSTA34 (ATCC

nro 67 771, 4 255/pROpSTE34 (ATCC nro 67 772), 4 255/ pROpST (ATCC nro 67 773) ja 4 300 (ATCC nro 67 774).

ATCC-talletuslaitokseen talletettiin myös 21.9.1990 20 seuraavat E. coli K12 -bakteerikannat. Näihin kuuluvat

pROpST-SXE-Q21HH22R (ATCC 68 410), pROpST-SXE-G12IA (ATCC

68 411), pROpST-SXE-A6TS11R (ATCC 68412), pROpST-SXA-S81,

87L + I122L (ATCC 68 413), pROpST-SXA-S81,87L (ATCC

68 414), pROpST-SXA-L82,84Q + L115K (ATCC 68 415), pROpST- 25 SXA-L82, 84Q (ATCC 68 416), pROpST-SXE-I122L (ATCC 68 417), pROpST-SXA-I122L (ATCC 68 418), PST-SX (ATCC 68 419) , pROpST-SXA-L118E (ATCC 68 420) , pROpST-SXA-E119LQ123L (ATCC 68 421), pROpST-SXA-I122E (ATCC 68 422), pROpST-SXA-M126A (ATCC 68 423) ja pROpST-SXE-A6TSHR + 30 I122L (ATCC 68 424).

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön mukaisia sian somatotropiineja saadaan kohdemutageneesia käyttäen, mutta mainittujen somatotropiinien tuottamiseen voidaan käyttää myös muita kei-35 noja, kuten peptidien ja/tai proteiinien kemiallista 8 104489 synteesiä. Nykyisin käytetyt keinot DNA:n kloonatun segmentin DNA-sekvenssin muuttamiseen tietyssä erityisessä kohdassa vaatii sitä, että tuotetaan tämän DNA:n yksi-nauhainen muoto. Yksinauhainen DNA liitetään pituussuun-5 nassa synteettiseen oligonukleotidiin, joka on komplementaarinen tämän DNA-osan suhteen, paitsi että tämä oligo-nukleotidi sisältää itsessään alueen, joka ei ole yhteensopiva vastinosansa kanssa. Tämä yhteensopimaton alue sijaitsee tavallisesti oligonukleotidin keskiosassa. Joissa-10 kin tapauksissa oligonukleotidi sisältää myös mutaatio-(ide)n kohdalla tai tämän lähellä olevan restriktioendonu-kleaasin tunnistuskohdan. Pituussuunnassa yhteen liitettyjen nauhojen muodostama seos tehdään tämän jälkeen kaksi-nauhaiseksi ja suljetaan kovalenttisesti lisäämällä tähän 15 E. Colin DNA-polymeraasi I:n suurta fragmenttia ja deoksi-nukleotiditrifosfaatteja T4-DNA-ligaasin ja adenosiisini-5'-trifosfaatin läsnäollessa. Kaksinauhainen DNA transformoidaan tämän jälkeen sopivaan E. coli -kantaan, jossa yhteensopimattomuuden sisältävä DNA-alue korjataan ja rep-20 likoidaan.

Saadaan kaksi kloonipopulaatiota. Riippuen siitä, kumpi nauhoista tulee valituksi korjaussynteesissä käytettäväksi templaatiksi, klooni sisältää joko villityyppi-sen tai muunnetun (mutatoidun) jakson. Kloonit, jotka si-.· 25 sältävät oligonukleotidijaksoa vastaavan mutatoidun jak son, valikoidaan hybridisoimalla ne radioaktiivisella leimalla varustettuun oligonukleotidiin. Oligonukleotidin ja villityyppisen jakson välisestä epäsopivuudesta johtuen radioaktiivisella leimalla varustettu oligonukleotidi si-30 toutuu pysyvämmin klooneihin, jotka sisältävät mutatoidun jakson. Villityyppiset ja mutatoidut kloonit voidaan tämän vuoksi erottaa toisistaan sopivassa lämpötilassa suorite tulla inkuboinnilla. Niissä tapauksissa, joissa oligonukleotidi sisältää myös restriktioendonukleaasin katkaisu-35 kohdan, ehdokkaana olevien kloonien pilkkominen sopivalla • 9 104489 restriktioendonukleaasilla paljastaa ne kloonit, jotka sisältävät mutatoidun jakson ja tästä saadaan toinen keino villityyppisten ja mutatoitujen kloonien erottelemiseen toisistaan. Tunnistetuissa klooneissa olevat muutokset 5 vahvistetaan tämän jälkeen sekvenssoimalla asiaankuuluvien alueiden DNA.

Halutun mutaation ja haluttuja mutaatioita sisältävien plasmidikloonien restriktiofragmentit rekonstruoidaan ilmentämisplasmideihin, jotka sopivat mutanttigeenin tuot-10 teen ilmentämiseen joko bakteereissa tai hiivoissa, muttei molemmissa näistä. Rekonstruktio suoritetaan tavallisilla j atkokloonausmenetelmillä.

Seuraavissa tarkasteluissa käytetty yhdistelmä-so-matotropiini on valittu edustamaan tämän keksinnön mukai-15 siä yhdistelmä-somatotropiineja ja niiden valmistuksessa käytettyjä menetelmiä. Seuraava kuvaus ja esimerkit ovat tätä keksintöä kuvaavia, eivätkä sitä rajoittavia.

Sian yhdistelmä-somatotropiinin DNA- ja aminohappo-jaksot esitetään jäljempänä. Edullisin sian yhdistelmä-20 somatotropiini on 193 aminohaposta koostuva polypeptidi- jakso, jossa NH2-terminaalinen osa on modifioitu siten, että siihen kuuluu lisäksi mukaan kolme muuta aminohappoa (met, asp, gin) ja ensimmäisen aminohapon (ala) deleetio, joka esiintyy joissakin aivolisäkkeestä peräisin olevan .· 25 sian somatotropiinien kypsissä muodoissa. Tarkoituksena on kuitenkin, että 191 aminohapon suuruinen PST sekä tämän muut johdannaiset, kuten NH2-terminaalisessa päässä olevat deleetiot, tähän tehdyt lisäykset ja/tai deleetiot ja/tai lisäykset C00H-terminaaliseen päähän, muodostavat osan 30 tätä keksintöä.

Yhdistelmä-pST: NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala-185 ami-

nohappoa-ala-phe-COOH

AivolisäkkeenpST: NH2-ala-phe-pro-ala-185 aminohap-35 poa-ala-phe-COOH

10 104489 Tästä modifikaatiosta on tuloksena yhdistelmä-pST-proteiinien aminohappojen nettolisääntyminen kahdella aminohapolla ja se on kuvattu EP-patenttihakemusjulkaisussa 355 460. Sian yhdistelmä-somatotropiinin mutagenisoitu-5 jen johdannaisten numerointijärjestelmä, jota käytetään patenttikuvauksessa, heijastaa tätä uutta lisäystä ja se on helposti kenen tahansa alan ammattimiehen käytettävissä. 1 ·

Sian yhdistelmä-somatotropiini 104489 11 A T 6 CAT CAA TTC CCA CCC ATG CCC TTG TCC AGC CIA TTT GCC AAC 45

Met Acp Gin Ph· Pro AI· N«t Pro lau Ser S«r l«u Ph· AI· A1n _ 1 5 10 15 5 GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC 90

Ala V·l l«u Arg Ala Gin Nit L«U Hi· Gin l«u AI· Ala A«p Thr 20 25 30 TAC A A G GAG TTT GAG CGC GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC 135

Tyr Ly· Glu Ph· Glu Arg Ala Tyr II· Pro Glu Gly Gin Arg Tyr 10 35 30 35 TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC 180 S·r II· Gin A > n Ala Gin Ala Ala Pha Cya Pha Sar Glu Thr II· 50 55 60 CCG GCC CCC A C G G G C AAG G A C GAG GCC CAG CAG AGA TCG G A C GTG 225

Pro Ala Pro Thr Gly ly· Α·ρ Glu At· Gin Gin Arg Sar Α·ρ Vai 15 65 70 75 GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG TCG T G G CTC G G G 270 Glu lau L au Arg Ph· S1r L«u Lau Lau II· Gin Sar Trp Lau Gly BO 85 90 CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG CTC TTC ACC AAC AGC CTC GTG TTT 315 20 Pro Vai Gin Ph· L»u S1r Arg Vai Ph· Thr Α·η S1r Lau Vai Ph· 95 100 105 CGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG 360

Gly Thr S1r A«p Arg Vai Tyr Glu Ly· Lau Ly· A»p Lau Glu Glu 110 115 120 GCC ATC CAG GCC CTG ATG CCG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG 405 . 25 cty cln teu Met Arg Glu Lau Glu Asp Gly Sar Pro Arg 125 130 135 GCA GGA CAG ATC CTC AAG C A A ACC TAC GAC A A A TTT CAC ACA AAC 450

Ala Gly Gin II· L1u Ly» Gin Thr Tyr Asp Ly· Ph· Α·ρ Thr Α·η 140 145 150 30 TTG CGC A G T GAT GAC GCC CTG CTI AAG AAC TAC G G G CTG CTC TCC 495 L«u Arg S«r Asp Α·ρ Ala 1·υ Lau ly» A»n Tyr Gly Lau L1u S«r 155 160 165 TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC 540

Cy» Ph· ly» Ly1 1»P L1u Hl» Ly1 AI» Glu Thr Tyr L«u Arg Vai 170 175 180 ATG AAG TGT CGC CCC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC TTC 579 M1t Ly1 Cy» Arg Arg Ph· Vai Glu Ser S«r Cy1 Ala Pha ISO 110 12 104489 pGEMpST-SX:n DNA:n konstruktio

Yksinauhainen pGEMpST-SX-DNA on kaikkien muta-geneesireaktioiden templaatti-DNA ja se valmistetaan PGHGEM3Z-DNA:sta kohdemutageneesilla. Sian somatotropiini 5 (rpST) -geenin kloonaus fagimidiin pGEM-3z(f+), josta on tuloksena pGHGEM3Z, suoritetaan seuraavalla yleisellä menetelmällä. DNA-fragmentti, joka sisältää pGHGEM3Z:n sian somatotropiini (rpST) -geenin, eristetään bakteeriperäisestä ilmentämisplasmidista pEFF-902 pilkkomalla restrik-10 tioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll (kuvio 1). rpST-geenin sisältävä fragmentti puhdistetaan tämän jälkeen agaroosi-geelielektroforeesilla. Kaksinauhainen fagimidi-DNA pGEM-3z(f+) pilkotaan EcoRI:11a ja HindIII:lla, käsitellään vasikan suolen EcoRI alkalisella fosfataasilla ja suuri 15 fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla. Nämä kaksi puhdistettua fragmenttia sekoitetaan keskenään ja liitetään T4-DNA-ligaasilla. Seos transformoidaan bakteereihin ja kasvatetaan useita näin saatuja pesäkkeitä. Plasmidi-DNA valmistetaan tavallisella alkalihajoitusmene-20 telmällä ja sen rakenne määritetään sopivilla restriktio-entsyymeillä pilkkomalla. Eristetään odotetut fragmentit sisältävä klooni, jolle annetaan nimitys pGHGEM3Z.

pGEMpST-SX

Mutageneesin tarkoituksena on muodostaa rpST-DNA-.: 25 jakso, jossa a-kierrettä 2 koodaavaa DNA-jaksoa rajoittaa 5'-puolelta (DNA:n koodaavalla alueella olevista asemista 225 - 230) Sacl-restriktiokohta ja 3'-puolelta (asemista 285 - 290) Xbal-restriktiokohta. Nämä DNA-jaksoon tehdyt muutokset eivät muuta rpST-proteiinin aminohappojaksoa. 30 Näiden restriktioendonukleaasin pilkkomiskohtien esiinty misestä on tuloksena se, että muodostuu "kierre 2 -kasetti" siten, että kierrettä 2 koodaava DNA voidaan helposti ja nopeasti yhdistää sopiviin kierrettä 3 koodaavassa DNAissa oleviin mutaatioihin. Seuraavana kuvataan pGEMpST-35 SX:n konstruktio.

104489 13

Synteettisten oligonukleotidien Sacl293 ja XbaI353 DNA-jaksot kuvataan taulukossa 1. Yksinauhainen pGHGEM3Z-DNA on mutageneesin kohteena oleva nauha ja se valmistetaan puhdistetusta faagista tavanomaisilla menetelmillä.

5 Sekoitetaan keskenään 2 000 ng tätä DNA:ta ja 100 ng kumpaakin oligonukleotideista SacI293 ja XbaI353, jotka on fosforyloitu 5'-terminaalisista päistään adenosiini-5'-trifosfaatilla ja T4-polynukleotidikinaasilla. Tämä seos on 10 μ1:η kokonaistilavuudessa lX-liittämispuskurissa 10 (ΙΧ-liittämispuskuri on 75 mM KC1 ja 5 mM Tris-Cl, pH

8,0). Seosta kuumennetaan 65 °C:ssa 7 minuuttia, jonka jälkeen sitä inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämmössä (RT). Tällä menetelmällä oligonukleotidit saadaan liittymään pituussuunnassaan yksinauhaiseen substraatti (temp-15 laatti) -DNA:hän. Toisiinsa liittyneet molekyylit pidennetään ja muutetaan kovalenttisesti suljetuksi kaksinauhai-seksi DNA:ksi lisäämällä 22 μΐ H20:ta, 1 μΐ 20 mM ATP:ta, 2 yksikköä sekä T4-DNA-ligaasia että DNA-polymeraasi I:n suurta fragmenttia (yksikön määritelmä on esitetty New 20 England Biolabs -yhtiön vuoden 1989 tuoteluettelossa), 2 μΐ 20X dNTP-molekyylejä (neljän deoksiribonukleotidi-5'-trifosfaatin seos, joiden kunkin konsentraatio on noin 2 mM) ja 4 μΐ 10X "täyttö" puskuria (IX täyttöpuskuri on 27,5 mM Tris-Cl, pH 7.5, 15 mM MgCl2, 2 mM DTT). Kun reak-,· 25 tioseosta on inkuboitu tunti huoneenlämmössä (RT), puolet siitä yhdistetään kompetentteihin HB101-soluihin vakiome-netelmää käyttäen. Yksittäisiä pesäkkeitä ilmaantuu yön yli 37 °C:ssa suoritetun inkuboinnin jälkeen. Plasmidi-DNA valmistetaan vakiomenetelmällä 24 pesäkkeestä ja pil-30 kotaan erillisissä reaktioseoksissa Sacl:lla ja Xbal:lla. Ne plasmidi-DNA:t, jotka sisältävät molemmat restriktio-kohdat, mikä viittaa siihen, että kumpikin oligonukleotideista Sacl293 ja Xbal353 on liittynyt rpST-geeniin, puhdistetaan edelleen viemällä ne kompetentteihin HB101-so-35 luihin aiemmin kuvatulla tavalla. Tämän jälkeen valmis- • 14 104489 tetaan plasmidi-DNA ja tämä pilkotaan erillisissä reaktio-seoksissa Sacl:lla ja Xbal:lla, jotta voitaisiin varmistaa kummankin restriktiokohdan esiintyminen plasmidi-DNA:ssa ja tulos varmistetaan sitten analysoimalla DNA-sekvenssi 5 rpST-DNA:n asiaankuuluvista alueista.

Taulukko I

Mutageeniset oligonukleotidit

Nimitys Sekvenssi (5' -3') Mutaatio s·cl 293 gacgtggagctcctgcgcttctcg kierre 2 kasetti xb·13S3 cagttcctctctagagtcttcacc kierre 2 kasetti

S 81L TGCGCTTCT TGCTGCIGC S81.87L

S 8 71 TCATCCAGTTGTGGCTCG S81.87L

08082 TGCGCTTCTCGCAGCTGCAGAT 182,840

CCAGTCGTGG

080820 ttctcgcagctgcagatccagt 182,840 havaitsemis koetin 15 K 113 CT ACGAGAAGAAGAAGGACCT G l11 s k

E 1 16 GCTGAAGGACGAGGAGGAGGGC L118 E

K 1 13 E 1 t 6 GTCTACGAGAAGAAGAAGGACG LMSKL118E

AGGAGGAGGGCA T

K 1 1 3 E 1 1 60 AGAAGAAGAAGGACGAGGAGGA K113EU6 koetin

εη6Κ120 AAGCT GAAGGACGAGGAGGAGG L118EM22K

20 GCAAGCAGGCCCTGATG

E 1 2 0 GGAGGAGGGCGAGCAGGCCCTG I 1 2 2 e L 1 2 0 · 3 GGAGGAGGGCCTGCAGGCCC1G 11221

A 124 · 2 CAGGCCCTGGCACGGGAGCTGG N126A

E113EHD0116 CGCGTCTACGAGAACGAGA AGGAC(GC) L115E

A(GC ) GAGGAGGGCATCC AG

E 1 1 3D CCTCTACGAGAAGGAGAAGGAC L115E konstruktio koetin

25 LIISA CT ACGAGAAGGCGAAGGACCTG

, LIISA GCTG AAGGACGCG GAGCAGGGC

L 1 1 8 T K CTG AAGGACA(CA ) AGAGGAGGGCAT L1 3 8 K

L 1 1 8 T CTGAAGGACACTGAGGAGGCC L116T

L 1 1 7 , 1 21 GAAGGACCTGCTGGAGGGCAT E119LQ123L

CCTGGCCCTGATG

Lcul 171210 CCTGCTGGAGGGCATCCTGGCC E 11 9LO 123L koetin

K114R/Accl GACCGCGTATACG A GCGTCTGAA GGA K114R

30 G121A/Xnn| CTGG A G GA A GCTATTCA GGCCCTG G 1 2 1 A

K 1 1 6R/8 g 1 I 1 A GAAGCTGCG AGATCTG GAGGA (116«

A 1 4 D / H 1 nd 1 I I C C T T G T C A A G C T T A I T T G A C A A C G C C G AUO

A6T TCAATTCCCAACCATGC A6T

SURAHD/Sll ATGCCCTTGAGTCGACTAT

TTGACAACGCC S 1 1 RA 1 40

Q21MH22R/CIat CCGGGCCCATCG A 1TGCACCAA 021HH22R

P v uI 1 6 3 4 AGAAGGCAGAGCTGCTGTCCAC I 12 2 L

PC K

30 « 104489 15

Mutaatioiden synteesi kierteisiin 1, 2 tai 3 pGEMpST-SX:ssa olevan rpST-geenin mutageneesi suoritetaan seuraavan kuvauksen mukaisesti. Mutageneesiohjel-man tarkoituksena on muodostaa rpST-molekyyli, jonka tai-5 pumus yhteenkeräytymien muodostamiseen suurissa proteiini-konsentraatioissa (> 100 mg/ml) on vähentynyt. Tämän kohteena on kierteen 3 aminohapporyhmästä 112 aminohapporyh-mään 129 ulottuva hydrofobinen pinta, jonka uskotaan olevan ratkaisevana tekijänä yhteenkeräytymisreaktion käyn-10 nistymiselle (Brems et ai., 1986). Koska tässä käytetty rpST-geeni koodaa aminoterminaalisessa päässään kahta ylimääräistä aminohappoa, aminohapporyhmien kokonaismäärä on 193, kun taas naudan ja sian aivolisäkkeestä peräisin olevassa somatotropiinissa esiintyy 191 ryhmää. Ryhmät 112 -15 129 vastaavat naudan somatotropiinin ryhmiä 110 - 127 (Ab- del-Mequid et ai., 1987). Muita mutageneesikohteina olevia molekyylin kohtia ovat kierre 2, ryhmät 81 - 87, kierteen 3 ja kierteen 1 hydrofiilinen pinta, ryhmät 6 - 11. Mu-tanttien yhdistelmä muodostetaan uusilla mutageneesikier-20 roksilla tai asiaankuuluvien alueiden jatkokloonauksella.

Seuraavassa esitetään kuvaus käytetystä perusmenetelmästä L118E-mutaation aikaansaamiseksi ja esimerkkejä kaikista muista. Perusmenetelmään tehtyjä muunnelmia kuvataan asiaankuuluvissa esimerkeissä.

ϊ 25 Yksinauhaisen substraatti-pGEMpST-SX-DNA:n valmis tus vastaa tarkalleen pGHGEM3Z:n osalta esitettyä kuvausta. Mutaation L118E konstruktiossa käytetyn synteettisen mutageenisen oligonukleotidin E116 DNA-jakso esitetään taulukossa 1 ja se fosforyloidaan 5'-päästään Sacl293:n 30 tapauksessa kuvatulla tavalla. Pituussuunnassa tapahtuvaan *: liittämiseen ja täyttämiseen käytettävät reaktiot ovat myös tarkalleen samanlaisia kuin mitä on kuvattu pGHGEM3Z:n Sacl293-mutageneesin osalta. Kun puolet reaktioseoksesta on tuotu kompetenttien HBlOl-solujen yh-35 teyteen ja näitä on inkuboitu 37 °C:ssa, tuloksena olevat 1β 104489 pesäkkeet siirretään nitroselluloosasuodattimille ja hyb-ridisointikäsittelyt suoritetaan vakiomenetelmillä. E116-oligonukleotidia käytetään myös mutaation havaitsemiseen. Se varustetaan radioaktiivisella leimalla 5'-päästään 5 käyttäen gamma-32P-ATP:ta ja polynukleotidikinaasia. Hybri-disointi suoritetaan yön yli 37 °C:ssa ja siinä käytetään 5XSSC:tä (1XSSC on 0,15 M natriumkloridi ja 0,015 M natriumsitraatti ja sen pH on 7,0), IX Denhardtin liuosta (Ficoll, naudan seerumialbumiini ja polyvinyylipyrrolido-10 ni, kutakin (0,02 paino-%), 150 pg/ml hiivan tRNA:ta ja radioaktiivisella leimalla varustettua koetinta.

Hybridisoinnin jälkeen suodattimia pestään ainakin 30 minuuttia 37 °C:ssa 5XSSC:ssa, jonka jälkeen suoritetaan kaksi 30 minuutin pituista pesua TAC:ssa (TAC:n koos-15 tumus on 3 M tetrametyyliammoniumkloridi, 50 mM [tris] [hydrometyyli]aminometaani, pH 8,0, 1 mM EDTA [etyleenidi-amiinitetraetikkahappo], 0/1 paino-%:nen natriumdodekyy- lisulfaatti), jotka suoritetaan halutussa lämpötilassa. Viimeisen pesun inkubointi määrää spesifisyyden, sillä 20 E116-oligonukleotidi pysyy hybridisoituna ainoastaan täysin komlementaarisiin klooneihin. Ell6-oligonukleotidin osalta lämpötila 59,0 °C. Röntgenfilmille tehdyn velotuksen jälkeen havaitaan ainoastaan ne kloonit, jotka ovat E116:n suhteen täysin komplementaarisia. Plasmidi-DNA val-25 mistetaan useista tällaisista positiivisista testattavista pesäkkeistä, ne siirretään takaisin HBl01:een ja seulotaan edellä kuvatulla tavalla. Tästä toisesta seulontakierrok-sesta saaduista useista positiivisista tapauksista valmistetaan plasmidi-DNA:t, joiden DNA-jakso analysoidaan; 30 L118E:n sisältävien plasmidien tunnistus voi siten tapah tua yksiselitteisesti. Tämän mutaation sisältävälle plas-

• I

midille annetaan nimitys pGEMpST-SX-L118E.

Tuloksena olevat L118E-mutaation sisältävät rpST-geenin kloonit siirretään kukin erikseen kahteen ilmentä-35 misvektoriin, pROpST-SX:ään ja pROpST-SXA:aan, joiden 104489 17 konstruktiot kuvataan. Näiden konstruktioiden tarkoituksena on tuoda aiemmin kuvattujen Sacl- ja Xbal -restriktio-kohtien rajoittama kierre 2 -kasetin sisältämä rpST-geeni plasmidivektoriin, joka on suunniteltu rpST-geenin ilmen-5 tämiseen E. colissa. Toisena tarkoituksena on tuoda tässä keksinnössä kuvatut mutaatiot kumpaankin kahdesta geneettisesti erilaisesta rpST-taustasta. Toinen näistä on luonnollinen (villityyppinen) kummankin asemissa 183 ja 191 esiintyvän kysteiinin suhteen. Toinen rpST-geeni koodaa 10 näissä samoissa asemissa olevan kysteiinin tilalla alanii-nia ja se on kuvattu EPO-patenttijulkaisussa 355 460. Plasmidi pROpSTA34 (kuvio 4) sisältää EcoRI/Hindlll-frag-mentin, joka on kloonattu ilmentämisplasmidiin pR0211. Tässä EcoRI/Hindlll-fragmentissa on muunnettu rpST-geeni, 15 jossa asemissa 183 ja 191 olevia kysteiinejä koodaava DNA on mutatoitu näissä asemissa alaniinia koodaavaksi DNA:ksi. Siinä on siten ala, ala -mutaatiot. Yhdessä reak-tioseoksessa plasmidi pR0pSTA34 pilkotaan EcoRI:lla ja HindIII:lla ja toisessa EcoRIilla ja Smalrlla. Vektorin 20 sisältävä suuri fragmentti puhdistetaan kummastakin reak-tioseoksesta agaroosigeelielektroforeesilla. Plasmidi pROpST-SX, joka sisältää kierre 2 -kasetin muilta osiltaan villityyppisessä rpST-taustassa, muodostetaan suorittamalla ligaatio pGEMpST-SX:stä saadulle puhdistetulle 25 EcoRI/Hindlll-fragmentille. Ligaatioseos viedään bakteerikantaan N99cl. Tässä kannassa lambda PL -promoottorin ohjaaman rpST:n ilmentymisen estää siinä oleva villityyppinen lambda-repressori. Ne tuloksena olevat plasmidikloo-nit, joissa on haluttu konstruktio, tunnistetaan pilkko-30 maila sopivilla restriktioentsyymeillä. Plasmidi pROpST-SXA, joka sisältää mutatoidussa rpST-geenissä olevan kierre 2 -kasetin, muodostetaan liittämällä ligaasilla pROpST-A34:sta saatu puhdistettu EcoRI/Smal-vektorifragmentti puhdistettuun pGEMpST-SX:sta saatuun EcoRI/Smal-fragment-35 tiin. Ligaatioseos tuodaan bakteerikantaan N99cl, ja tu- 104489 18 lokseksi saadut plasmidikloonit analysoidaan haluttujen plasmidikloonien tunnistamiseksi asianmukaisilla restrik-tioentsyymeillä pilkkomalla.

Mutaatio L118E tuodaan ilmentämisplasmideihin 5 pROpST-SX ja pROpST-SXA pilkkomalla yhdessä reaktioiden ryhmässä pGEMpST-SX-Lll8E-DNA EcoRI:lla ja Hindlllrlla ja toisessa reaktioiden ryhmässä EcoRI:11a ja Smalrlla. Kustakin näistä reaktioseoksista saadut rpSTrn sisältävät pienet fragmentit sisältävät Lll8E-mutaation ja ne puhdis-10 tetaan agaroosigeelielektroforeesilla. Plasmidi pROpST-SX käsitellään restriktioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll, ja vektorin sisältävä suuri fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla. Fragmentti liitetään ligaasilla pGEMpST-SX-L118E:sta saatuun puhdistettuun EcoRI/Hindlll-15 fragmenttiin, josta saadaan tulokseksi plasmidi pROpST-

SX-L118E. Ligaatioseos transformoidaan ilmentämiskantaan 4 300, jossa on lämpöherkkä lambda-repressori. Näissä kannoissa rpST:n ilmentyminen riippuu lämpötilasta. Lambda-repressori on inaktiivinen 42 °C:ssa, joka sallii ilmenty-20 misen lambdaPL-promoottorista. Plasmidin pR0pST-SX-L118E

sisältävät bakteeripesäkkeet tunnistetaan niiden kyvystä tuottaa rpST-proteiinia 42 °C:ssa (lambda-repressorin toiminnalle epäsuotuisa lämpötila). Plasmidi pROpST-SXA käsitellään sekä EcoRI- että Smal-restriktioentsyymillä ja :* 25 vektorin suuri fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielek troforeesilla. Fragmentti liitetään ligaasilla pGEMpST-SX-L118E:sta saatuun puhdistettuun EcoRI/Smal-fragmenttiin, josta tulokseksi saadaan plasmidi pROpST-SXA-L118E. Ligaatioseos transformoidaan ilmentämiskantaan 4 300 ja 30 pR0pST-SXA-L118E-plasmidin sisältävät bakteeripesäkkeet tunnistetaan niiden kyvystä tuottaa rpST-proteiinia 42 °C:ssa.

Esimerkki 1

Kierre 2 -"kasetin" muodostaminen kahta synteettis-35 tä oligonukleotidia samanaikaisesti käyttäen 19 104489

Mutageneesin tarkoituksena on muodostaa rpST-DNA-jakso, jossa α-kierrettä 2 koodaava DNA-jakso rajoittuu 5'-puolelta (koodaavan DNA-alueen asemista 225 - 230) Sa-cl-restriktiokohtaan ja 3'-puoleltaan (asemista 285 - 290) 5 Xbal-restriktiokohtaan. Nämä DNA-jaksoon tehdyt muutokset eivät muuta rpST:n aminohappojaksoa. Restriktioendonukle-aasin pilkkomiskohtien esiintymisestä on tuloksena "kierre 2 -kasetin" muodostuminen siten, että kierrettä 2 koodaa-vassa DNA:ssa olevat mutaatiot voidaan helposti ja nopeas-10 ti yhdistää sopiviin kierrettä 3 koodaavassa DNArssa oleviin mutaatioihin. pGEMpST-SX:n konstruktio on edellä kuvatun konstruktion mukainen.

Esimerkki 2

Kierteessä 3 olevien hydrofobisten aminohappojen 15 korvaus alfakierteitä stabiloivilla hydrofiilisilla aminohapoilla mutageenisia oligonukleotidejä käyttäen Tämän mutaatioluokan jäseniin kuuluvat mutaatiot L118E, L115K, L115KL118E ja L118EI122K. Mutaatiot muodos- 20 tetaan täsmälleen perusmenetelmässä L118E:n osalta kuvatulla tavalla. Nämä mutaatiot sisältäville plasmideille annetaan nimitykset pGEMpST-SX-L118E, pGEMpST-SX-L115K, pGEMpST-SX-L115KL118E ja pGEMpST-SX-L118EI122K, vastaavassa järjestyksessä mainittuna.

*: 25 rpST:ssa olevan L115K-mutaation muodostaminen teh dään täsmälleen samoin kuin Lll8E:n osalta on kuvattu, paitsi että taulukossa 1 esitettyä mutageenista oligonuk-leotidia K113 käytetään sekä mutageneesi- ja hybridisoin-tireaktioissa. Oligonukleotidi muuttaa rpST:n jaksoa 30 siten, että asemassa 115 oleva leusiinia koodaava kodoni muuttuu CTG:sta lysiiniä koodaavaksi AAGrksi.

rpSTrssa olevan L115KL118E-mutaation muodostaminen suoritetaan tarkalleen L118E:n tapauksessa kuvatulla tavalla, paitsi että mutageneesireaktiossa käytetään tau-35 lukossa 1 kuvattua mutageenista oligonukleotidia K113E116 20 1 0 4 4 8 9 ja hybridisointireaktiossa käytetään taulukossa 1 esitettyä oligonukleotidia K113E116D. Oligonukleotidi K113E116 muuttaa rpSTrn jaksoa siten, että asemassa 115 oleva leu-siinia vastaava kodoni muuttuu CTG:sta lysiiniä koodaavak-5 si AAGiksi ja asemassa 118 oleva leusiinikodoni muuttuu CTG:sta glutamiinihappoa koodaavaksi GAGrksi. Oligonukleotidi muodostaa siten rpST:n DNA-jaksossa olevan kaksois-mutaation.

L118EI122K-mutaation muodostaminen rpST:een suori-10 tetaan tarkalleen samoin kuin L118E:n tapauksessa, paitsi että hybridisointireaktioissa käytetään taulukossa 1 esitettyä mutageenista oligonukleotidia E116I120. Oligonukleotidi E116K120 muuttaa rpST:n jaksoa siten, että asemassa 118 olevaa leusiinia vastaava kodoni muuttuu CTG:sta glu-15 tamiinihappoa koodaavaksi GAG:ksi ja asemassa 120 oleva isoleusiini muuttuu ATC:sta lysiiniä koodaavaksi AAG:ksi. Oligonukleotidi muodostaa siten rpST:n DNA-jaksossa olevan kaksoismutaation.

Esimerkki 3 20 Kierteessä 3 olevien hydrofobisten aminohappojen korvaaminen hydrofiilisilla aminohapoilla mutageenisia oligonukleotideja käyttäen Tämän mutaatioluokan jäseniin kuuluvat I122E, L118T, L118K ja L115E. Plasmideille, joissa nämä mutaatiot 25 ovat, on annettu nimitykset pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-L118T, pGEMpST-SX-Ll18K ja PGEMpST-SX-L115E, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Näiden mutaatioiden konstruointi suoritetaan tarkalleen samoin kuin L118E:n tapauksessa on kuvattu, paitsi niiden oligonukletidien osalta, joita 30 käytetään sekä mutageneesi- että hybridisointireaktioissa ja joiden jaksot on esitetty taulukossa 1.

Mutaation I122E (taulukko 1) konstruktiossa käytetään mutageenista oligonukleotidia E120. Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 122 oleva 35 isoleusiinia vastaava kodoni muuttuu ATC:sta glutamiini- • 21 104489 happoa koodaavaksi GAG:ksi. Oligonukleotidia E120 käytetään myös radioaktiivisella leimalla varustettuna havait-semiskoettimena hybridisointireaktioissa, jotka ovat kaikilta muilta osiltaan identtisiä edellä L118E:n osalta 5 kuvattujen reaktioiden kanssa, paitsi että nitrosellu- loosasuodattimia inkuboidaan TAC-puskurissa 56 eC:ssa. Mutaation L118T konstruointi suoritetaan täsmälleen Lll8E:n osalta kuvatulla tavalla, paitsi että sekä mutageneesi-että hybridisointireaktioissa käytetty oligonukleotidi on 10 L118T (taulukko 1). Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 118 olevaa leusiinia vastaava kodoni muuttuu CTGrsta treoniinia koodaavaksi ACT:ksi. Halutun mutaation sisältävät plasmidit erotetaan mutaatiota sisältämättömistä plasmideista TAC-puskurissa 56 °C:ssa 15 suoritetun nitroselluloosasuodattimien inkuboinnin jäl keen.

rpST:ssa olevan L115E-mutaation muodostaminen suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n osalta on kuvattu, paitsi että mutageneesireaktiossa käytetään taulukossa 1 20 esitettyä oligonukleotidia E113EHDQ116 ja hybridisointireaktioissa käytetään taulukossa 1 esitettyä oligonukleotidia E113D. Oligonukleotidi E113EHDQ116 muuttaa rpST:n jaksoa siten, että asemassa 115 oleva leusiinia vastaava kodoni muuttuu CTG:sta glutamiinihappoa koodaavaksi 25 GAG:ksi ja asemassa 118 oleva leusiinikodoni muuttuu CTGrsta glutamiinihappoa koodaavaksi GAGiksi, glutamiinihappoa koodaavaksi GAG:ksi, asparagiinihappoa koodaavaksi GAC:ksi, histidiiniä koodaavaksi CACrksi tai glutamiinia koodaavaksi CAG:ksi. Asemassa 118 olevien mutaatiomuutos-30 ten runsaus johtuu siitä seikasta, että mutageeninen oligonukleotidi on neljän oligonukleotidin seos, joka on muodostunut oligonukleotidisynteesin aikana. Tuloksena olevien radioaktiivisella leimalla varustettuun hybridisointi-koettimeen E113D hybridisoituvien DNA-kloonien sekvens-35 soinnista ilmenee, että ne sisältävät L115E-mutaation, 104489 22 mutta yhdelläkään ei ole yhtään neljästä asemassa 118 olevasta mahdollisesta mutaatiosta. Tästä mutageneesistä on tuloksena ainoastaan yksi mutaatio asemassa 115.

rpSTissa olevan L118K-mutaation muodostaminen suo-5 ritetaan täsmälleen L118E:n osalta kuvatulla tavalla, paitsi että käytetään mutageenista oligonukleotidia L118TK, jonka jakso on esitetty taulukossa 1. L118TK-oli-gonukleotidi muuttaa rpST-jaksoa siten, että asemassa 118 oleva leusiinia vastaava kodoni muuttuu CTGrsta lysiiniä 10 koodaavaksi AAG:ksi tai CTG:sta treoniinia koodaavaksi CAGrksi. Useat mahdollisuudet asemassa 118 syntyviin mu-taatiomuutoksiin johtuvat siitä seikasta, että mutageeni-nen oligonukleotidi on kahden oligonukleotidin seos, joka on syntynyt oligonukleotidin synteesin aikana. Radioak-15 tiivisella leimalla varustettuun hybridisointikoettimeen L118TK hybridisoituvien plasmidikloonien DNA-sekvenssointi paljastaa, että ne sisältävät Lll5K-mutaation eikä yhdessäkään ole muita mahdollisia L118T-mutaatioita asemassa 118. Siten tästä mutageneesistä on tuloksena yksittäinen 20 mutaatio asemassa 118.

Esimerkki 4

Kierteessä 3 olevien hydrofiilisten aminohappojen korvaaminen hydrofobisilla aminohapoilla mutageenista oligonukleotidia käyttäen 25 Ainoa tämän mutaatioluokan jäsen on kaksoismutantti E119LQ123L. Tämän mutaation sisältävä plasmidi, jonka rakenne on vahvistettu DNA-sekvenssin analyysillä, on PGEMpST-SX-E119LQ123L. Tämän kaksinkertaisesti mutatoitu-neen rpST:n geenin konstruktio suoritetaan samoin kuin 30 L118E:n suhteen on kuvattu, paitsi että käytetään muta geenista oligonukleotidia L117,121 (taulukko 1). Oligonukleotidi muuttaa rpST:n DNA-jaksoa siten, että glutamiini-happoa koodaava DNA muuttuu GAG:sta leusiinia koodaavaksi CTG:ksi ja asemassa 123 oleva glutamiinia koodaava DNA 35 muuttuu CAG:sta leusiinia koodaavaksi CTG:ksi. Tätä oligo- « 23 1 0 4 4 8 9 nukleotidia käytetään mutageneesireaktiossa, kun taas Leul27121D:tä, jonka jakso on esitetty taulukossa 1, käytetään hybridisointireaktiossa radioaktiivisella leimalla varustettuna koettimena. Kaikki mutaation konstruoinnissa 5 käytetyt suoritustavat ovat L118E:n osalta aiemmin kuvattuja tapoja, paitsi että nitroselluloosasuodattimet inku-boidaan TAC:ssa 58 °C:ssa mutaation sisältävien plasmidien havaitsemiseksi.

Esimerkki 5 10 Kierteessä 3 olevien kookkaan sivuketjun sisältävi en poolittomien aminohappojen korvaaminen poolitto-milla aminohapoilla, joilla on pienet sivuketjut Tämän mutaatioluokan jäseniin kuuluvat L115A, L118A ja M126A. Plasmideille, joissa nämä mutaatiot ovat, on an-15 nettu nimitykset pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-L118A ja pGEMpST-SX-M126A, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Näiden mutaatioiden konstruointi suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n osalta on kuvattu, lukuunottamatta käytettyjä oligonukleotidejä ja tarvittaessa TAC:ssa käy-20 tettävää pesulämpötilaa.

Mutaation L115A konstruktiossa käytetyn synteettisen mutageenisen oligonukleotidin L115A DNA-jakso esitetään taulukossa 1. Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 115 olevaa leusiinia vastaava 25 kodoni muuttuu CTG:sta alaniinia koodaavaksi GCG:ksi. L115A-oligonukleotidia käytetään myös hybridisointireakti-oissa radioaktiivisella leimalla varustettuna koettimena. Halutun mutaation sisältävät plasmidit erotetaan mutaatioita sisältämättömistä plasmideista TAC-puskurissa 30 56 °C:ssa suoritetun nitroselluloosasuodattimien inkuboin- nin jälkeen. L118-mutaation muodostaminen RPST:een suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n suhteen on kuvattu, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulon-tareaktioissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on 35 L118A, jonka jakso on esitetty taulukossa 1. L118A-oligo- 104489 24 nukleotidi muuttaa rpSTrn jaksoa siten, että asemassa 118 oleva leusiinia vastaava kodoni muuttuu CTG:sta alaniinia koodaavaksi GCGrksi. Mutaatioita sisältävät plasmidit havaitaan inkuboimalla nitroselluloosaa TAC-puskurissa 5 56 °C:ssa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka vahvistetaan DNA-jakson analyysillä, annetaan nimitys pGEMpST-SX-LI18A.

M126A-mutaation muodostaminen rpST:een suoritetaan täsmälleen L118E:n suhteen kuvatulla tavalla, paitsi että 10 sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulontareaktioissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on A124-2, jonka sekvenssi esitetään taulukossa 1. A124-2 oligonukleotidi muuttaa rpSTrn jaksoa siten, että asemassa 126 oleva metioniinia vastaava kodoni muuttuu ATGrsta alaniinia koo-15 daavaksi GCArksi. Mutaatioita sisältävät plasmidit havaitaan inkuboimalla nitroselluloosasuodattimia TAC-puskurissa 56 °C:ssa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka on varmistettu DNA-sekvenssin analyysillä, annetaan nimitys pGEMpST-SX-M126A.

20 Esimerkki 6

Isoleusiini 122:n korvaaminen leusiinilla Mutaatioluokan jäseniin kuuluvat I122L, I122LL118A ja I122LM126A. Plasmideille, joissa nämä mutaatiot ovat, on annettu nimitykset pGEMpST-SX-I122L, pGEMpST-SX-I122LL-;* 25 118A ja pGEMpST-SX-I122LM126A, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Näiden mutaatioiden konstruointi suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n osalta on kuvattu, lukuunottamatta käytettyjä oligonukleotidejä ja tarvittaessa TACrssa käytettävää pesulämpötilaa.

30 Mutaation I122L konstruktiossa käytetyn synteettisen mutageenisen oligonukleotidin L120-3 DNA-jakso esitetään taulukossa 1. Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten että asemassa 122 olevaa isoleusiinia vastaava kodoni muuttuu ATC:stä leusiinia koodaavaksi CTG:ksi. 35 L120-3-oligonukleotidia käytetään myös hybridisointireak- 104489 25 tioissa radioaktiivisella leimalla varustettuna koettimena. Halutun mutaation sisältävät plasmidit erotetaan mutaatioita sisältämättömistä plasmideista TAC-puskurissa 56 °C:ssa suoritetun nitroselluloosasuodattimien inkuboin-5 nin jälkeen.

I122LL118A-mutaation muodostaminen rpSTrhen suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n suhteen on kuvattu, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulon-tareaktioissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on 10 L118A, ja mutageneesiin käytetty templaatti-DNA on pGEMp- ST-SX-I122L. Templaatti-DNA valmistetaan täsmälleen samoin kuin pGEMpST-SX-DNA:n osalta on kuvattu. Mutaatioita sisältävät plasmidit havaitaan inkuboimalla nitroselluloosa-suodattimia TAC-puskurissa 56 °C:ssa. Tämän mutaation si-15 sältävälle plasmidille, joka on varmistettu DNA-sekvens- sin analyysillä, annetaan nimitys pGEMpST-SX-L118AI122L. I122LM126A-mutaation muodostaminen rpSTrhen suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n suhteen on kuvattu, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulontareakti-20 oissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on A124-2, ja mutageneesiin käytetty templaatti-DNA on pGEMpST-SX-I122L. Templaatti-DNA valmistetaan täsmälleen samoin kuin pGEMp-ST-SX-DNA:n osalta on kuvattu. Mutaatioita sisältävät plasmidit havaitaan inkuboimalla nitroselluloosasuodatti-25 mia TAC-puskurissa 56 °C:ssa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka on varmistettu DNA-sekvenssin analyysillä, annetaan nimitys pGEMpST-SX-I122LM126A.

Esimerkki 7

Kierteen 3 hydrofiilisella pinnalla olevien 30 aminohapporyhmien korvaus Tämän mutaatioluokan jäseniin kuuluvat G121A, K114R ja K116R. Nämä mutaatiot sisältäville plasmideille on annettu nimitykset pGEMpST-SX-G12lA, pGEMpST-SX-K114R ja pGEMpST-SX-K116R, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. 35 Näiden mutaatioiden konstruointi suoritetaan täsmälleen 26 1 0 4 4 8 9 samoin kuin L118E:n osalta on kuvattu, lukuunottamatta käytettyjä oligonukleotidejä ja tarvittaessa TACrssa käytettävää pesulämpötilaa.

Mutaation G121A konstruktiossa käyttökelpoisen syn-5 teettisen mutageenisen oligonukleotidin G121A/XmnI DNA-jakso esitetään taulukossa 1. Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 121 olevaa gly-siiniä vastaava kodoni muuttuu GGC:stä alaniinia koodaa-vaksi GCT:ksi. Oligonukleotidi eroaa myös rpSTtn DNA-jak-10 sosta siten, että rpSTrn DNA-jaksoon muokataan Xmnl-rest-riktioentsyymin tunnistuskohta (5'-GAAGCTATTC-3'). G121A-mutaatiota lukuunottamatta ei muista nukleotidimuutoksista ole seurauksena rpST-proteiinin aminhappojakson muutoksia. G12lA/XmnI-oligonukleotidia käytetään myös hybridisointi-15 reaktioissa radioaktiivisella leimalla varustettuna koettimena, joka kaikissa muissa suhteissa on identtinen edellä kuvattujen oligonukleotidien suhteen. Ehdolla olevat mutaatioita sisältävät kloonit havaitaan inkuboimalla nit-roselluloosasuodattimia TAC-puskurissa 57,5 °C:ssa ja mää-20 rittämällä, mitkä niistä ovat saaneet Xmn-kohdan, joka esiintyy mutageenisessa oligonukleotidissa ja ilmaisee G12lA-mutaation esiintyvän plasmidikloonissa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka vahvistetaan analysoimalla sen DNA-sekvenssi, annetaan nimitys pGEMpST-SX-.* 25 G121A.

K114R-mutaation muodostaminen rpST:een suoritetaan täsmälleen L118E:n suhteen kuvatulla tavalla, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulontareaktioissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on K114R/AccI, jonka 30 sekvenssi esitetään taulukossa 1. K114R/AccI-oligonukleo-tidi muuttaa rpST:n jaksoa siten, että asemassa 114 oleva lysiiniä vastaava kodoni muuttuu AAG:sta arginiinia koo-daavaksi CGT:ksi. Oligonukleotidi eroaa myös rpST:n DNA-jaksosta siten, että rpST:n DNA-jaksoon muokataan Accl-35 restriktioentsyymin tunnistuskohta (5'-GTATAC-3’). K114R- « « 27 104489 mutaatiota lukuunottamatta ei muista nukleotidimuutoksista ole seurauksena rpST-proteiinin aminhappojakson muutoksia. Kuten G121A:n tapauksessa oli asianlaita, ehdolla olevat mutaatioita sisältävät kloonit havaitaan inkuboimalla nit-5 roselluloosasuodattimia TAC-puskurissa 57,5 °C:ssa ja niistä tutkitaan, mitkä niistä ovat saaneet uuden Accl-kohdan, joka esiintyy mutageenisessa oligonukleotidissa ja ilmaisee K114R-mutaation esiintyvän plasmidikloonissa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka vahvistetaan 10 analysoimalla sen DNA-sekvenssi, annetaan nimitys pGEMpST-SX-K114R.

K116R-mutaation muodostaminen rpST:hen suoritetaan täsmälleen L118E:n tapauksessa kuvatulla tavalla, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi/seulontareakti-15 oissa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on K116R/

Bglll, jonka sekvenssi esitetään taulukossa 1. K116R/

Bglll-oligonukleotidi muuttaa rpST:n jaksoa siten, että asemassa 116 oleva lysiiniä vastaava kodoni muuttuu AAG:sta arginiinia koodaavaksi CGT:ksi. Oligonukleotidi 20 eroaa myös rpST:n DNA-jaksosta siten, että rpST:n DNA-jaksoon muokataan Bglll-restriktioentsyymin tunnistuskohta (5'-AGATCT-3' ) nukleotidijakson asemista 342 - 347. K116R-mutaatiota lukuunottamatta ei muista nukleotidimuutoksista ole seurauksena rpST-proteiinin aminohappojakson muutok-·' 25 siä. Kuten G121A:n tapauksessa oli asianlaita, ehdolla olevat mutaatioita sisältävät kloonit havaitaan inkuboimalla nitroselluloosasuodattimia TAC-puskurissa 57,5 °C:ssa ja niistä tutkitaan, mitkä niistä ovat saaneet uuden Bglll-kohdan, joka esiintyy mutageenisessa oligonuk-30 leotidissa ja ilmaisee K116R-mutaation esiintyvän plasmidikloonissa. Tämän mutaation sisältävälle plasmidille, joka vahvistetaan analysoimalla sen DNA-sekvenssi, annetaan nimitys pGEMpST-SX-K116R.

« 28 104489

Esimerkki 8

Kierteessä 2 olevien hydrofiilisten aminohappojen korvaaminen hydrofobisilla aminohapporyhmillä käyttäen samanaikaisesti kahta synteettistä oligonuk-5 leotidia Tämän mutaatioluokan jäsen on kaksoismutaatio S81,87L. Plasmidille, joka on vahvistettu analysoimalla sen DNA-sekvenssi ja jossa tämä mutaatio on, on annettu nimitys pGEMpST-SX-S81,87L. Kaksoismutaation S81,87L 10 konstruktiossa käyttökelpoisten synteettisten mutageeni- sten oligonukleotidien S81L ja S87L DNA-jakso esitetään taulukossa 1. S81L- ja S87L-oligonukleotidit muuttavat rpST-geenin jaksoa siten, että asemissa 81 ja 87 olevaa seriiniä vastaavat kodonit muuttuvat TGC:stä leusiinia 15 koodaavaksi TTG:ksi. Tämän kaksoismutaation sisältävän rpST-geenin konstruktio tapahtuu täsmälleen samoin kuin L118E:n osalta on kuvattu, paitsi että kumpaakin oligonuk-leotidia käytetään mutageneesireaktiossa samanaikaisesti. S81L-oligonukleotidia käytetään myös radioaktiivisella 20 leimalla varustettuna koettimena hybridisointireaktioissa, jotka kaikissa muissa suhteissa ovat identtisiä L118E:n osalta kuvattujen tapausten suhteen, paitsi että suodattimet pestään TAC-puskurissa 54 °C:ssa. Selektoidaan otaksuttuja positiivisia mutaation omaavia plasmidiklooneja . . 25 sisältäviä bakteeritransformantteja, siirretään nämä nit- roselluloosasuodattimille ja käsitellään hybridisoinnin suorittamiseksi. Tässä toisessa seulontakierroksessa radioaktiivisena koettimena käytetään S87L-oligonukleoti-dia; fuodattimet pestään TAC-puskurissa 54 °C:ssa.

30 Esimerkki 9

Kierteessä 2 olevien hydrofobisten aminohapporyhmi- • .

en korvaaminen hydrofiilisilla aminohapporyhmillä Tämän mutaatioluokan yksi ainoa jäsen on kaksoismutaatio L82,84Q. Plasmidille, joka on vahvistettu analysoi-35 maila sen DNA-sekvenssi ja jossa tämä mutaatio on, on an- 104489 29 nettu nimitys pGEMpST-SX-L82,84Q. Mutaation L82,84Q konstruktiossa käytetyn synteettisen mutageenisen oligonukle-otidin Q8082 DNA-jakso esitetään taulukossa 1. Oligonuk-leotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemissa 82 5 ja 84 olevaa leusiinia vastaavat kodonit muuttuvat CTGrstä ja CTC:stä glutamiinia koodaavaksi CAG:ksi. Tämän mutaation sisältävät plasmidit havaitaan inkuboimalla nitrosellu-loosasuodattimia 58 °C:ssa.

Esimerkki 10 10 Kierteen 2 ja kierteen 3 yhdistelmämutaatioiden konstruktio

Useat kierteen 3 mutaatiot, I122L, M126A ja E119LQ123L, joissa kierteen 3 pinnan hydrofobinen luonne joko säilyy (I122L, M126A) tai lisääntyy (E119LQ123L) yh-15 distetään hydrofobisen kierteessä 2 olevan kaksoismutaati-on S81,87L kanssa seuraavilla jatkokloonausreaktioilla. PLasmidi pGEMpST-SX-S81,87L käsitellään restriktioendonuk-leaaseilla Xbal ja EcoRI. Pieni fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja tämä sisältää S81,87L-20 mutaation. Plasmidi pR0pST-SXA-I122L käsitellään myös peräkkäin Xbal:11a ja EcoRI:11a, ja tästä puhdistetaan samoin suuri fragmentti. Suuressa fragmentissa sijaitsevat pROpST-ilmentämisvektorin komponentit ja pST:n mutaation I122L ja asemissa 183 ja 191 olevat kysteiini-alaniini-. 25 substituutiot. Suuri fragmentti ja pieni S81,87L-fragment- ti liitetään T4-DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa. Puolet reaktioseoksesta tuodaan CaCl2-käsittelyllä kompetentiksi tehtyyn ilmentämiskantaan 4 300. Transformoituja soluja viljellään yön yli 30 °C:ssa. Plasmideja sisältävistä so-30 luista määritetään pST:n ilmentyminen esimerkissä 12 kuva-.· tulla tavalla, tämän kierre 2/kierre 3 -yhdistelmän sisäl tävälle plasmidille annetaan nimitys pR0pST-SXA-S81,87L+ I122L.

Yhdistelmämutaatiot pR0pST-SXA-S81,87L+M126A ja 35 pR0pST-SXA-S81,87L+E119LQ123L konstruoidaan täsmälleen sa- so 104489 moin kuin pR0pST-SXA-S81,87L+I122L, paitsi että ilmen-tämisvektorin komponenttien ja kierteen 3 mutaatioiden lähteenä pR0pST-SXA-S81,87L+M126A:n ja pROpST-SXA-E119LQ123L:n muodostamiseksi käytetään pROpST-SXA-M126A: ta 5 ja pROpST-SXA-E119LQ123L:ää, vastaavassa järjestyksessä mainittuna.

Kierteen 2 kaksoismutaatio L82,84Q yhdistetään kierteen 3 mutaation L115K kanssa tarkalleen samoin kuin S81,87L+I122L:n tapauksessa on kuvattu, paitsi että kier-10 teen 2 mutantti-DNA:n lähteenä on pGEMpST-SXA-82,84Q ja kierteen 3 mutaation. L115K, lähteenä on pR0pST-SXA-L115K. Tälle tämän yhdistelmän sisältävälle plasmidille annetaan nimitys pROpST-SXA-L82,84Q+L115K.

Esimerkki 11 15 Kierteessä 1 tai sen lähellä olevien hydrofobisten aminohappojen substituutio hydrofiilisillä aminohapoilla mutageenisia oligonukleotidejä käyttäen Näiden mutaatioiden tarkoituksena on korvata rpST:n NH2-terminaalisessa osassa esiintyvät hydrofobiset amino-20 happoryhmät, jotka esiintyvät ihmisen kasvuhormonin suhteellisesti vastaavissa asemissa.

Tämän mutaatioluokan jäseniin kuuluvat rpST-kak-soismutaatio Q21HH22R, kaksoismutaatio S11RA14D ja yksit-täismutaatiot A6T ja A14D. Nämä mutaatiot sisältävien . 25 plasmidien rakenne varmistetaan analysoimalla niiden DNA- sekvenssi ja niille annetaan nimitykset pGEMpST-SX-Q21HH22R, pGEMpST-SX-SHRA14D, pGEMpST-SX-A6T ja pGEMpST-SX-A14D, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Näiden mutaatioiden konstruktio suoritetaan täsmälleen samoin kuin 30 L118E:n tapauksessa on kuvattu, lukuunottamatta käytetty- jä mutageenisia oligonukleotidejä, TAC-puskuriliuoksessa olevien nitroselluloosasuodattimien inkubointilämpötilaa ja lisävaihetta, jossa mutaatioita sisältävien positiivisten plasmidien havaitsemiseksi suoritetaan seulonta 35 sopivilla restriktioentsyymeillä pilkkomalla niissä mah- 104489 31 dollisissa tapauksissa, joissa tämän käyttö on asianmukaista.

Kaksoismutaation Q21HH22R, Q21HH22R/ClaI:n konstruktiossa käytetyn synteettisen mutageenisen oligonukleo-5 tidin DNA-jakso on esitetty taulukossa 1. Oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 21 olevaa glutamiinia vastaava kodoni muuttuu CAG:sta histidiiniä koodaavaksi CATiksi, ja asemassa 22 oleva histidiini muuttuu CAC:sta arginiinia koodaavaksi CGAtksi. Näihin mutaa-10 tioihin sisältyy Clal-restriktioendonukleaasin pilkkomis-kohta (5'-ATCGAT-3'), joka esiintyy yhden ainoan kerran muutetussa rpST-geenissä. Q21HH22R/ClaI-oligonukleotidiä käytetään myös hybridisointireaktioissa radioaktiivisella leimalla varustettuna havaitsemiskoettimena, joka kaikilta 15 muilta osiltaan on täysin identtinen aiemmin kuvattujen tapauksien suhteen. Kaikki tämän mutaation konstruointiin käytetyt suoritusvaiheet ovat samoja kuin aiemmin L118E:n tapauksessa kuvatut vaiheet, paitsi että suodattimet pestään TAC-puskurissa 56 °C:ssa. Ehdolla olevista mutaation 20 sisältävistä klooneista määritetään myös se, ovatko ne saaneet Clal-kohdan, joka esiintyy mutageenisissa oligo-nukleotideissa ja joka siten merkitsee sitä, että plasmi-dikloonissa esiintyy Q21HH22R-kaksoismutaatio.

A6T-mutaation muodostaminen rpST:hen suoritetaan . 25 täsmälleen siten kuin L118E:n tapauksessa on kuvattu, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointireaktioissa käytetään taulukossa I esitettyä mutageenista oligonuk-leotidia A6T. A124-2 oligonukleotidi muuttaa rpSTrn jaksoa siten, että asemassa 6 oleva alaniinia vastaava kodoni 30 muuttuu GCCrstä treoniinia koodaavaksi ACCrksi. Bakteereja :. sisältävät nitroselluloosasuodattimet pestään hybridisoin- nin jälkeen TAC-puskurissa 52 °C:ssa.

SllRA14D-kaksoismutaation muodostaminen rpST:hen suoritetaan täsmälleen samoin kuin L118E:n suhteen on ku-35 vattu, paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointi- 32 1 0 4 4 8 9 reaktioissa käytetään mutageenista oligonukleotidiä S11RA14D/Sall ja että nitroselluloosasuodattimet pestään TAC-puskurissa 64 °C:ssa. SllRA14D/SalI-oligonukleotidi muuttaa rpST-geenin jaksoa siten, että asemassa 11 oleva 5 seriinikodoni muuttuu AGC:stä arginiinia koodaavaksi CGArksi, ja asemassa 14 oleva alaniinikodoni muuttuu GCC:stä asparagiinihappoa koodaavaksi GAC:ksi. Oligonukle-otidi eroaa myös rpST:n DNA-jaksosta siten, että rpST:n DNA-jaksoon muokataan Sall-restriktioentsyymin tunnistus-10 kohta (5'-GTCGAC-3') nukleotidijakson asemista 29 - 34. S11R- ja A14D-mutaatioita lukuunottamatta ei muista nukle-otidimuutoksista ole seurauksena rpST-proteiinin aminohap-pojakson muutoksia. Ehdolla olevista mutaatioita sisältävistä klooneista tutkitaan, mitkä niistä ovat saaneet uu-15 den Sall-restriktiokohdan, joka esiintyy mutageenisessa oligonukleotidissa ja joka siksi ilmaisee SllRA14D-kak-soismutaation esiintyvän plasmidikloonissa.

Yksittäisen A14D-mutaation muodostaminen suoritetaan täsmälleen L118E:n tapauksessa kuvatulla tavalla, 20 paitsi että sekä mutageneesi- että hybridisointireaktiois-sa käytetty mutageeninen oligonukleotidi on A14D/HindIII, A14D/HindlII-oligonukleotidi muuttaa rpST:n jaksoa siten, että asemassa 14 oleva alaniinikodoni muuttuu GCCistä asparagiinihappoa koodaavaksi GACrksi. Oligonukleotidi ero-. 25 aa myös rpST:n DNA-jaksosta siten, että rpST:n DNA-jaksoon muokataan HindiII-restriktioentsyymin tunnistuskohta (5'-AAGCTT-3’) nukleotidijakson asemista 30 - 35. A14D-mutaa-tiota lukuunottamatta ei muista nukleotidimuutoksista ole seurauksena rpST-proteiinin aminohappojakson muutoksia. 30 Ehdolla olevat mutaatioita sisältävät kloonit havaitaan V inkuboimalla nitroselluloosasuodattimia TAC-puskurissa 62 °C:ssa ja niistä tutkitaan, mitkä niistä ovat saaneet uuden Hindlll-kohdan, joka esiintyy mutageenisessa oligonukleotidissa ja ilmaisee siten A14D-mutaation esiintyvän 35 plasmidikloonissa.

33 104489

Esimerkki 12 pST-mutaatioiden rekonstruointi sopiviin bakteeriperäisiin ilmentämisplasmideihin

Muunnetut (mutaatioita sisältävät) kloonit rekonst-5 ruoidaan bakteeriperäisen ilmentämisplasmidin pR0211 (kuvattu patenttijulkaisussa EPO 173 280, joka on liitetty tähän patenttihakemusjulkaisuun tähän oikeuttavien säädösten nojalla) johdannaisiin, joille on annetut nimitykset pROpST, pROpSTA34 ja pR0pSTE34. Plasmidi pROpST sisältää 10 pST-DNA:n, joka on kloonattu ilmentämisvektoriin pR0211 ja tämä sisältää kysteiiniä koodaavan DNA:n asemissa 183 ja 191; näissä asemissa pR0pST34 sisältää alaniinia koodaavan DNA:n ja pROpSTE34 glutamiinihappoa koodaavan DNA:n. Muunnetut pGEMpST-kloonit pilkotaan EcoRI:lla ja Smal:lla ja 15 pST-mutaation sisältävä pieni fragmentti eristetään. pROpSTE34:n DNA käsitellään samoin ja tästä eristetään vektorin sisältävä suuri DNA-fragmentti. Nämä puhdistetut fragmentit liitetään yhteen T4-DNA-ligaaasilla ja transformoidaan sopivaan bakteerikantaan, esim. 4 300:aan. Kan-20 ta sisältää lämpöherkän lambda-repressorin (cl857 ), joten lambdaPL-promoottorista alkava ilmentyminen ei ole mahdollista 30 °C:ssa, mutta se tapahtuu 42 °C:ssa, jossa lämpötilassa repressori inaktivoituu. Muunnettujen pGEMpST-DNA-fragmenttien tuominen pR0pSTE34:n DNA:hän suoritetaan täs-25 mälleen samoin kuin pR0pSTA34 suhteen on kuvattu. Muunnettujen pGEMpST:n DNA-fragmenttien tuominen pROpSTE:een tapahtuu samoin kuin pR0pSTA34:n tapauksessa on kuvattu, paitsi että sekä pGEMpST- että pR0pSTE34-plasmidit pilkotaan EcoRI:lla ja HindIII:lla. Taulukossa 2 on lueteltu 30 bakteeriperäiset ilmentämisplasmidit, joihin mutaation ; sisältävät pST-geenit on tuotu. pST-mutaatiot A6T, S11RA- 14D ja Q21HH22R tuodaan pROpSTE34:n johdannaiseen pROpS-TE34:n tapauksessa kuvatulla tavalla. Tämä johdannainen, pROpSTE34T1T2, sisältää pST:tä koodaavan DNA:n 3'-terminaa-35 lisessa päässä sijaitsevan noin 1 ke:n suuruisen Hindin- 104489 34 fragmentin, joka sisältää E. colirn rrnB-operonista (ribo-somaalinen RNA B -operoni) peräisin olevan transkription terminaattorin TXT2.

Taulukko II

5 Ilmentämisvektorikonstruktiot: aminohappokoostumus asemissa 183 ja 191

Asemien 183 ja 191 koodaamat aminohapot Mutaatio Kysteiini Alaniini Glutamiinihappo I122L + + + 10 L115K + + + L118E + + L115KL118E + + L118EI122K + + L115E + 15 I122E + + L118T + L118K + E119LQ123L + + L115A + + 20 L118A + + M126A + + L118AI122L + I122LM126A + + + S81,87L + 25 L82,84Q + S81,87L+E119LQ123L + " + I122L + " + M126A + L82,84Q+L115K +

30 A14D

A6T +* S11RA14D +* Q21HH22R +* A6TS11R +* 35 A6TS11R+I122L + P8TS11R+I122L + .* P8TS11R + 104489 35 ♦Sisältää myös T^-transkriptioterminaattori jakson E. coli rrnB-operonista.

Esimerkki 13

Kierteen 1 yhdistelmämutanttien konstruktio 5 A6TS11R+E34 ja P8TS11R+E34

Kaksoismutaatio A6TS11R, jossa asemassa 6 oleva alaniini on korvattu treoniinilla ja asemassa 11 oleva se-riini arginiinilla, yhdistetään E34-mutaatioihin (kuvattu patenttijulkaisussa EP 355 460), joissa asemissa 183 ja 10 191 oleva kysteiiniä koodaava DNA on korvattu gluta- miinihapolla. Tuloksena oleva rpST-geeni sisältää tämän vuoksi mutaatioita, jotka sijaitsevat rpST-DNA:n sekä NH2-(A6TS11R) että COOH-puoleisilla koodaavilla alueilla (E34). Tulokseksi saadulle plasmidille annetaan nimitys 15 pROpSTE-AöTSIIR. pML/pGH14:sta peräisin oleva muunnettu, rpST:n sisältävä pieni EcoRI/Smal-fragmentti, joka sisältää AöTSllR-mutaatiot, liitetään plasmidista pROpSTETjT2 peräisin olevaan suureen EcoRI/Smal-fragmenttiin. Viimeksi mainittu on pST:n ilmentämisplasmidi, joka myös sisältää 20 rpSTitä koodaavan DNA:n 3'-terminaalisessa päässä olevan E. colin rrnB-operonin vahvan transkriptioterminaattorin (ΤΥΓ,).

Toinen kaksoismutaatio, P8TS11R, jossa asemassa 8 oleva proliinia koodaava DNA on mutatoitu koodaamaan treo- . 25 niiniä, ja seriiniä koodaava DNA on mutatoitu koodaamaan arginiinia, yhdistetään E34-mutaatioihin (kuvattu EP-pa-tenttijulkaisussa 350 460), joissa asemissa 183 ja 191 olevaa kysteiiniä koodaava DNA on korvattu glutamiiniha-polla. Tulokseksi saatu rpST-geeni sisältää tämän vuoksi 30 mutaatiot rpST-DNA:n sekä NH2- (P8TS11R) että COOH-termi-naalista osaa koodaavilla alueilla (E34). Tulokseksi saa- « « dulle plasmidille annetaan nimitys pR0pSTE-p8TSHR. pR0pSTE-p8TSHR:n konstruktiossa käytetään samaa strategiaa kuin pROpSTE-AöTSHR:n konstruktiossa, paitsi että * .

36 104489 muunnetun rpST-DNA:n suhteen käytetään plasmidia pML/ pGH18, joka sisältää p8TSHR-kaksoismutaation.

A6TS11R&I122L+E34 ja P8TS11R+I112L+E34

Edellä kuvattu kierteen 3 I112L-mutaatio yhdiste-5 tään kumpaankin kierteen 1 kahdesta mutaatiosta A6TS11R ja P8TS11R ja E34-mutaatioihin. Tulokseksi saaduille plasmi-deille annetaan nimitykset pROpST-SXE-A6TSHR+I122L ja pML/pGH18-SXE-I122L, vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Tulokseksi saatu plasmidi sisältää kierre 2 -kasetin, 10 jota rajoittavat kierrettä 2 koodaavan DNA:n 5’- ja 3'-päissä olevat Sacl- ja Xbal-restriktiokohdat, mutta joka ei sisällä T1T2-transkriptioterminaattoria. Plasmidi pML/ pGH18-SXE-I122L konstruoidaan samalla tavalla, paitsi että suuren fragmentin lähteenä käytetään plasmidia pML/pGH18, 15 joka sisältää P8TSllR-kaksoismutaatiot. Muunnettu plasmidi ei sisällä T1T2-transkriptioterminaattoria, eikä siinä ole kierre 2 -kasettia.

Esimerkki 14

Muunnettujen yhdistelmäsomatotropiinien pysyvyys-20 profiilit

Pysyvyysprofiilimääritysten suoritus voidaan kuvata seuraavasti. Valmistetaan yhdistelmä-(eläin)somatotropii-nijohdannaisen väkevä liuos (korkeintaan 100 mg/ml), joka on valmistettu fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suo- , , 25 laliuokseen, jonka pH on 7,4 (NaH2P04H20 3,45 g, Na2HP04 3,55 g, NaCl 9,50 g, jotka on liuotettu 1 000 ml:aan tislattua vettä). Tämä suodatetaan steriilin 0,22 pm:n Millex millipore-suodattimen läpi ja tästä viedään koeputkiin 0,1 ml:n suuruiset erät. Nämä viedään 43 °C:ssa olevaan 30 lämpökaappiin ja otetaan sieltä pois halutuin aikavälein.

·. Tämän jälkeen sisältö laimennetaan fosfaatilla puskuroi dulla fysiologisella suolaliuoksella. Supernatantin sisältämien monomeerien ja dimeerien määrä määritetään HPLCrta käyttäen. Lasketaan massatasapaino. Minkä tahansa saostu-35 neen materiaalin määrä merkitään muistiin. Tuloksia verra- • 104489 37 taan alkukonsentraatioihin ja laaditaan pysyvyysprofiilia kuvaava esitys.

Somatotropiinijohdannainen, jonka liukoisuus pH:ssa 7,4 on pieni, liuotetaan vaihtoehtoisesti edullisesta pH-5 arvosta poikkeavassa pH:ssa (4 - 10) tai se arvioidaan suspensiona.

Muunnettujen rpST-proteiinien osalta liuoksessa havaittavasta pysyvyydestä suoritettujen tutkimusten tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa lii.

104489 38

Taulukko III

rpST-mutanttiproteiinien liukoisuus in vitro

Inkubointi 5 43 °C:ssa

Mutaatio liukoisuus-% (päivää) A34 32 14 I122L+A34 44 14 10 E34 70,0(3) 14 67 17 I122L+E34 62,0(2) 14 66,3(3) 17 A6TS11R+E34 68,5(2) 14 15 P8TS11R+E34 62 14 A6TS11R+I122L+E34 36 14 P8TS11R+I122L+E34 2 14 L118K+A34 0 3 E119LQ123L+A34 0 3 20 L115A+A34 0 3 L118A+A34 10 7 M126A+A34 18 3 L118AI122L+A34 2 7 I122IM126A+A34 22(2) 19 25 S81,87L+A34 0 3 S81,87L+E119LQ123L+A34 0 7 S81,87L+I122L+A34, 8 7 S81,87L+M126A+A34 0 3

30 Liukoisuus-% ilmoitetaan liuokseen jääneen määrän suhteena kokonaismäärästä kerrottuna 100:11a (ks. esimerkki 14). Silloin kun on tehty useampi kuin yksi määritys, on esitetty keskimääräinen liukoisuus-% ja toisistaan riippumattomien määritysten määrä esitetty suluissa. rpST-mutantit 35 ovat joko A34- tai E34-taustassa. A34-rpST sisältää asemissa 183 ja 191 kysteiinin sijasta alaniinin. E34-rpST

104489 39 sisältää asemissa 183 ja 191 kysteiinin sijasta glutamaatin.

Esimerkki 15

Hypox-testimenetelmä rotissa yhdistelmä-(eläin)-5 somatotropiinijohdannaisia saavien eläinten kasvun tehostumisen määrittämiseksi Tämän keksinnön mukaisten yhdistelmä-eläinsomatot-ropiinijohdannaisten tehokkuus muuttaa eläinten kasvunopeutta määritetään käyttämällä määritystä rotissa, joilta 10 on poistettu aivolisäke (hypox-määritys). Rotta, jonka aivolisäke on poistettu, ei kykene itse tuottamaan somato-tropiinia ja se on herkkä ruiskeina annetulle somatotro-piinille. Mitattu vaste on tietyn ajan, kuten 10 päivän, kuluessa tapahtunut kasvu ja tämä on esitetty taulukossa 15 IV prosentteina jokaisessa kokeessa mukana olleen rpST-positiivisen kontrollin biologisesta aktiivisuudesta.

104489 40

Taulukko IV

Biologiset tulokset (HYPOX-rotta, RRA) ja rpST-mu-tanttiproteiinien lämpöstabiilisuus 5 Mutaatio(t) Hypox-rotta“ RRÄb T(-) (°C) A34 112,8 173,5 e.m.

I122L+A34 97,4 225,8 79 E34 90,52(5) 51,4(7) 10 62,0(6) I122L+E34 66,66(5) 80,28(5) 62,67(5) L115K 0,3 1,2 >83 L115K+E34 0,8 0,9 79 15 L118K 1,8 43,9 36 E119LQ123L 33,8 80,2 49 L115A 88,6 163 50 L118A 64(3) 49,5 57 M126A 100 122 55 20 L118AI122L 38,9 57,9 56 I122LM126A 66,25(2) 82,55(2) 63 S81,87L 46,9 194 40 S81,87L+E119LQ123L 40,4 177,9 38 S81,87L+I122L 71,3 165 47 ·. 25 S81,87L+M126A 79,7 186 47 L82,84Q 9,7(2) 3,4 ei ha vaittu yhtään K114R+E34 121,3 53,2 62 30 A6TS11R+E34 80,7(4) 135,0(4) 64,0(4) P8TS11R+E34 129,7 78,5 65 A6TS11R+I122L+E34 116,7 112,8 61 P8TS11R+I1221+E34 127,9 89,3 64 “Tulokset hypox-rotilla on esitetty prosentteina positivi-35 sena kontrollina käytetyn rpST-standardin aktiivisuudesta.

104489 41 bRRA - maksan radioreseptorimäääritystulokset on esitetty prosentteina rpST-standardia käyttäen havaitusta aktiivisuudesta.

e.m.: ei määritetty 5 Silloin kun on suoritettu useampia määrityksiä kuin 1, näistä on esitetty keskiarvo ja määritysten määrä on esitetty suluissa.

Esimerkki 16

Maksan radioreseptorimääritys, jolla määritetään 10 muunnetun yhdistelmä-somatotropiinin kyky sitoutua somatotropiinireseptoriin in vitro In vitro -olosuhteissa suoritettua radioreseptori-määritystä käytetään arvioimaan tämän keksinnön mukaisten yhdistelmä-somatotropiinien kyky kilpailla 125I-rpST:n 15 kanssa puhdistetuista maksamembraaneista peräisin olevaan somatotropiinireseptoriin. Näiden määritysten tulokset on ilmoitettu prosentteina rpST:n sitoutumisesta ja ne on esitetty taulukossa IV.

Esimerkki 17 20 rpST-mutantilla I122L+E34 suoritetut typpitasapai- nokokeet I122L-mutaation sisältämien muunnettujen rpST-pro-teiinien biologisen aktiivisuuden arvioimiseksi in vivo -olosuhteissa suoritetaan EP-patenttijulkaisussa 355 460 ·. 25 kuvatun tutkimuksen mukainen typpitasapainotutkimus. pST:n antaminen kasvaville sioille ihonalaisesti lisää ruumiiseen muodostuvan proteiinin määrää, joka pääasiassa on lihaskudosta. Koska proteiini sisältää vakiomäärän typpeä, voidaan eläimessä kulloinkin vallitseva proteiinin 30 muodostumistilanne arvioida tarkkaan analysoimalla typpi rehuista ja ulosteista. Typpitasapainolla mitataan siten rehuista saatavan ja virtsan ja lannan mukana poistuvan typen määrät ja eläimen pidättämä (kudoksiin liittynyt) määrä lasketaan näiden erotuksesta. Tarkin arvio typen pi-35 dätyksestä saadaan ilmoittamalla sulaneen typen prosentu- • 104489 42 aalinen osuus (ravinnosta saatu typpi, josta on vähennetty lannan typpi). Tässä tutkimuksessa rpST-H22L-variantin asemissa 183 ja 191 olevat kysteiiniryhmät korvattiin glu-tamiinihapolla. Tämän analyysin tulokset osoittavat, että 5 muunnetulla rpST-molekyylillä oli rpST-kontrolliin verrattuna täydellinen biologinen aktiivisuus.

Esimerkki 18 Lämpöstabiilisuuden määritys fluoresenssispektros-kopiaa käyttäen 10 Muunnetun rpST:n lämpöstabiilisuus päätellään läm pötilan funktiona mitatusta tryptofaanin ominaisfluore-senssista. rpST-molekyyli sisältää yhden tryptofääniryhmän, jonka ominaisfluoresenssi on natiivissa tilassa voimakkaasti vaimentunutta. Lämpötilan kohottaminen tai pH:n 15 laskeminen aiheuttaa luonteenomaisesti tapahtuvan fluoresenssin lisääntymisen, joka otaksuttavasti johtuu ainakin tämän muissa olosuhteissa molekyylin sisään jäävän tryptofaaniryhmän välittömässä läheisyydessä olevan rakenteen katoamisesta. "Sulamisprofiili", jota esittää fluo-20 resenssia nousevan lämpötilan funktiona, muodostaa sig-moidisen käyrän, jossa fluoresenssi pysyy vaimennettuna kunnes saavutetaan kullekin tietylle rpST-johdannaiselle ominainen lämpötila. Tämän jälkeen fluoresenssin havaitaan lisääntyvän jyrkähkösti melko kapealla lämpötila-alueella.

·. 25 Fluoresenssin lisäyksen keskikohdalla olevan lämpötilan lyhenteenä käytetään merkintää T(m) ja tämä kuvaa proteiinin lämpöstabiilisuutta. Tämän keksinnön mukaisen rpST:n T(m) määritetään Burger et al.':n ( 1966) menetelmällä, paitsi että viritysaallonpituutena käytetään 295 nm ja 30 emissiofluoresenssi luetaan käyttäen 355 nm: n rajasuoda- tinta. Tämän keksinnön mukaisen rpST:n T(m) on esitetty yhteenvetona taulukossa IV. Näistä tuloksista havaitaan T(m):n kohonneen huomattavasti ja että I122L:n osalta tämä on 79 °C.

43 104489

Esimerkki 19 I122L-mutaation muodostaminen polymeraasiket jureak- tiomenetelmällä I122L-mutaatio tuodaan rpST-geeniin kohdemutagenee-5 silla, jossa käytetään Sarkarin ja Sommerin, 1990, kuvaamaa polymeraasiketjureaktion sovellutusta, joka liitetään tähän patenttihakemusjulkaisuun tähän oikeuttavien säädösten nojalla. Käytetyt kolme oligonukleotidialuketta on lueteltu taulukossa I ja näihin kuuluvat oligonukleotidit 10 Sacl293, L120-3 ja PvuII634. Templaattina käytetään plas-midista pGEMpST-SX peräisin olevan rpST-geenin sisältävää EcoRI-Hindlll-fragmenttia. Polymeraasiketjureaktion (josta seuraavassa käytetään nimitystä PCR) annetaan tapahtua 15 syklin ajan siten, että reaktioseos koostuu 1 ng:sta rpST-15 DNA-templaattia, tämän kanssa käytetyistä oligonukleoti-dialukkeista L120-3 ja Pvull634, joiden kummankin annetaan reagoida erikseen 1 μΜ konsentraatiossa, dNTP-molekyyleis-tä ja Taq-DNA-polymeraasista valmistajan antamien ohjeiden mukaisesti. Tästä reaktiosta saadaan tulokseksi 277 ep:n 20 suuruinen I122L-mutaation sisältävä DNA-fragmentti. Fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja sitä käytetään PCR-alukkeena yhdessä oligonukleotidialukkeen Sacl293 ja rpST:n sisältävän EcoI-Hindlll-templaattifrag-mentin kanssa 15 uuden PCR-syklin ajan. Tukokseksi saatu .·, 25 361 ep:n suuruinen fragmentti pilkotaan restriktioendonuk- leaaseilla Sacl ja PvuII, puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja liitetään ligaasilla geelissä puhdistettuun suureen SacI/PvuII-pGEMpST-SX-DNA-fragmenttiin. Ligaatioseos transformoidaan kompetentteihin HBlOl-solui-30 hin. Tästä saatujen transformanttien plasmidi-DNA:sta seulotaan esiin I122L-mutaatio tarkalleen L118E:n tapauksessa kuvatulla tavalla, paitsi että radioaktiivisella leimalla varustettuna hybridisointikoettimena käytetään oligonukle-otidia L120-3 ja suoritetaan vain yksi seulontakierros. 35 I122L-mutaation esiintyminen ja PCR-reaktioissa syntynei- 104489 44 den muiden mutaatioiden puuttuminen varmistetaan DNA-sekvenssin analyysilla. Tämän mutaation sisältävälle plasmi-dille annetaan nimitys pGEMpST-SX-I122LPCR.

Esimerkki 20 5 rpST-mutaation I122L rekonstruktio hiivassa ilmentämiseen soveltuvaan plasmidiin I122L-mutaation sisältävän rpST-geenin ilmentämiseksi Saccharomyces cerevisiae -hiivassa on rpST:tä koo-daava DNA liitettävä toiminnallisesti tästä hiivasta 10 peräisin olevaan promoottorijaksoon. pROpST-SX-I122L:stä peräisin olevan rpST:n sisältävän pienen Ndel/Hindlll-fragmentin päät tasoitetaan käsittelemällä tätä DNA:ta DNA-polymeraasi I:n suurella Klenow-fragmentilla, jota ennen plasmidi on pilkottu Ndel:lla ja HindIII:lla. Tämä 15 fragmentti puhdistetaan geelielektroforeesilla ja plasmi-din suureen Sall/Sphl- fragmenttiin liitettynä se on YEp352-2. Viimeksi mainitun fragmentin päät tasoitetaan SI-nukleaasikäsittelyllä. Plasmidi on YEp352-johdannainen, joka on modifioitu siten, että se sisältää vielä divergen-20 tin GAL1/GAL10-promoottorin (Johnston ja Davis, 1984) ja STE7-geenistä peräisin olevan translaatioon osallistumattoman 3'-puoleisen alueen (Teaque, et ai. 1986). Tuloksena olevalle plasmidille annetaan nimitys YEp352-pST-I122L (kuvio 5).

25 Tämän rpST-variantin ilmentäminen hiivassa suorite taan viljelemällä tällä plasmidilla transformoituja hiiva-soluja synteettisessä täydellisessä kasvatusliuoksessa (Sherman, Fink ja Hilks, 1986) , josta puuttuu urasiili ja joka sisältää yksinomaisena hiililähteenä 2 % galaktoosia, 30 30 °C:ssa useiden tuntien ajan tai millä tahansa tavalla, jota on tarpeen käyttää rpST-geenin induktion ja rpST:n tuoton maksimoimiseksi. Vaikkakin isäntänä voidaan käyttää mitä tahansa hiivakantaa, jossa on URA3-geenissä oleva mutaatio, on edullista käyttää hiivakantaa, joka ei kykene 35 muodostamaan proteaaseja ja joka on GAL+, kuten BJ5457 • „ 104489 45 (genotyyppi ΜΑΤα pep4::HIS3 prbl-A trpl Ura3-52 Ieu2-A his3-A lys2-801 canl GAL+). Tämä kanta on talletettu talletuslaitokseen Yeast Genetic Stock Center, University of California, hakunumerolle BJ5457.

♦ 104489 46

Kirjallisuusluettelo 1. Abdel-Meguid et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, (1987) 6 434 - 6 437.

2. Brems, Biochemistry 27, (1988) 4 541 - 4 546.

5 3. Brems et al. , Biochemistry 25, (1986) 6 539 - 6 543 .

4. Brems et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, (1988) 3 367 - 3 371.

5. Burger, H.G., Edelhoch, H. ja Condliffe, P.G., En- 10 docrinology 78, (1966) 98 - 102.

6. Chen, W.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, (1990) 5 061 - 5 065 .

7. Johnston ja Davis, Molecular and Cellular Biology 4, (1984) 1 440 - 1 448.

15 8. Sarkar ja Sommer, Biotechniques 8, (1990) 404 - 407 .

9. Teague et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 83, (1986) 7 371 - 7 375.

10. Sherman, F. Fink, G.R. ja Hicks, J.B., "Laboratory 20 Course Material for Methods in Yeast Genetics" (1986) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 163 - 168.

«

Claims (7)

104489 47

1. Sian somatotropiini, tunnettu siitä, että se käsittää kaksoismutaation somatotropiinin alfa-5 kierteen 1 alueella, jolloin somatotropiinista tulee somatotropiinin natiivimuotoa liukoisemmaksi säilyttäen sen samalla biologisesti aktiivisena jatkuvasti vapauttavassa formulaatiossa, ja että kaksoismutaatio alfakierteen 1 alueella on A6TS11R tai P8TS11R.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää mutaation somatotropiinin alfakierteen 3 alueella, jolloin somatotropiinista tulee somatotropiinin natiivimuotoa liukoisemmaksi säilyttäen sen samalla biologisesti aktiivisena 15 jatkuvasti vapauttavassa formulaatiossa, ja että mutaatio on I122L.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että ainakin yksi (1) neljästä (4) kysteiinistä, joista kaksi sijaitsee pienes- 20 sä silmukassa ja kaksi suuressa silmukassa, on korvattu aminohapoilla, jotka kukin erikseen on valittu ryhmästä arginiini, lysiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, asparagiini, glutamiini, histidiini, alaniini, glysiini, isoleusiini, leusiini, väliini, fenyylialaniini, tryp-25 tofaani, tyrosiini, metioniini, seriini, treoniini ja proliini.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että aminohapot kukin erikseen on valittu ryhmästä glutamiinihappo ja alaniini.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että asemien 183 ja 191 kysteii-nit on korvattu glutamiinihapolla.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että se on sian met-asp-gln-35 des(ala)-somatotropiini. • · 48 104489

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen somatotropiini, tunnettu siitä, että se on sian met-asp-gln-des(ala)-somatotropiini. • « 104489 49