NO301235B1

NO301235B1 - Svinesomatotropiner med en dobbeltmutasjon i <alfa>-heliks-1-regionen

Info

Publication number: NO301235B1
Application number: NO914724A
Authority: NO
Inventors: Meir Fischer; Michael Richard Lebens; Deborah Tardy Chaleff
Original assignee: Bio Technology General Corp; American Cyanamid Co
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1997-09-29
Also published as: KR100193005B1; HUT62327A; CA2056467A1; PT99648A; NO914724L; AU662493B2; KR920009413A; PT99648B; FI915654A0; FI104489B; IL100169A0; HU215947B; EP0496973B1; DE69128877D1; EP0496973A3; CA2056467C; SG49702A1; HU913723D0; IE914153A1; FI915654A

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse omhandler svinesoinatotropin med en dobbeltmutasjon i a-heliks-l-regionen. Tilførsel av eksogene (ytre) somatotropiner øker i betydelig grad veksten i en rekke dyrearter, mennesker er heri unntatt, spesielt husdyr som gris,

men også fiskearter i tillegg. Denne vekstøkning i spesielt husdyr-arter er vanligviskarakterisert veden økning i muskelmasse samtidig med en nedgang i fett, hvilket resulterer i større, magrere dyr. For-utnyttelsen til dyr som mottar ytre somatotropin blir også betydelig bedret, som et resultat av en økning i vekst og samtidig nedgang i for-forbruk.

Ytre tilførsel av somatotropin blir oppnådd på flere måter, slik som daglige injeksjoner. I visse tilfeller kan imidlertid andre tilførselsveier bli foretrukket. F.eks. en implantert gjenstand som tillater protrahert (langsom) frigjøring av somatotropin over et definert tidsrom kan være nyttig når bestemte husdyr behandles. En mer ønskelig tilførselsvei er via en implantert gjenstand som tillater langsom frigjøring over en definert tidsperiode. En slik gjenstand bør inneholde store mengder av somatotropin i meget høye konsentrasjoner (ca. 500 mg/ml). Videre kreves for slik tilførsel et somatotropinmolekyl som har en høy løselighet og en meget lav tendens til å lage uløselige, biologiske inaktive aggregater.

Somatotropiner inneholder fire a-helikser eller a-spiraler som samles slik at det dannes en a-spiralbunt (Abdel-Meguid et al., 1987). Det er typisk at aminosyre-sidekjeder som stikker ut mot det indre av denne strukturen er ikke-polare, hydrofobe og meget tett pakket sammen for å utelukke gjennomtrengning av et polart løsningsmiddel (slik som vann eller saltvann) inn i senteret av bunten. I tilfelle med husdyrsomatotropin, som er beslektet til grisesomatotropin i primærsekvensen, vil eksponering av den hydrofobe side av a-spiral- (fra aminosyrerestene tYr110

til leu127) med proteinkonsentrasjoner over 1 mg/ml fremme dannelsen av "bindingsdyktige mellomledd", som er foreslått å være en starthendelse i aggregatdannelsen (Brems et al., 1986; Brems, 1988). Disse bindingsdyktige mellomledd kan representere alterna-

tive pakkearrangement av denne a-spiral fra flere individuelle somatotropinmolekyler, hvilket resulterer i en multimer struktur hvor de hydrofobe flatene i denne spiral blir atskilt fra det vandige miljø. Dannelse av de bindingsdyktige mellomledd kan bli hindret ved tilsetting av et overskudd av et proteinfragment inneholdende a-spiral- (Brems et al., 1986). I tillegg, ved å utvide den hydrofobe delen av denne spiral, ved å erstatte lysin i posisjon 112 med leucin, vil tendensen til å danne bindingsdyktige mellomledd bli sterkt øket (Brems, 1988).

Den foreliggende oppfinnelse tar opp problemet med lav løse-lighet av svinesomatotropiner ved å endre a-spiral-l-regionen i somatotropinene. Spesifikt blir grisesomatotropiner med øket løsningsstabilitet in vitro laget ved hjelp av sete-spesifikk tilleggs-mutagenese i a-heliks-3. Både de hydrofobe og hydrofile sidene er mål for mutagenese. Nylig resulterte sete-spesifikke mutasjoner i a-spiral-3-regionen i storfesomatotropin i redusert vekst av transgene mus som uttrykker det muterte somatotropin, et resultat som antyder at a-spiral-3-området er et område som er viktig for å opprettholde biologisk aktivitet (Chen et al., 1990).

Mutasjonene beskrevet i EP 482 124 er i kveg-somatotropin, svinesomatotropin er kun nevnt og det er overhodet ingen beskrivelse av met-asp-gln-des(ala)-svine-somatotropin (kravene 10-12). Dessuten er de patentsøkte mutasjonene I122L såvel som alle dobbeltmutasjonene ikke foreslått i EP 482 124.

Foreliggende oppfinnelse omfatter svine-somatotropin, hvor cystein er erstattet, i kombinasjon med mutasjoner i alfa-heliks 1 og/eller alfa-heliks 3.

Den foreliggende oppfinnelse et svine-somatotropin omfattende en spesielt definert dobbeltmutasjon av somatotropinets alfa-heliks-l-region (A6TS11R eller P8TS11R) som derigjennom gjør somatotropinet mer løselig enn den native formen av nevnte somatotropin, mens den biologiske aktivitet opprettholdes. EP 355 460 hverken lærer eller foreslår et slikt somatotropin.

a-spiral-3-mutasjoner blir i tillegg kombinert, hvor det er passende, med mutasjoner i spiral-l-området, og med dobbelt-mutasjoner i DNA som koder for cystein i posisjonene 183 og 191, hvor DNA som koder for cystein blir erstattet med DNA som koder

for enten alanin eller glutaminsyre. Dobbelmutasjonene i posisjoner 183 og 191 er beskrevet i EP355460, og inntatt herved som referanse. Gjennom bruk av mutasjonene som er beskrevet her, blir somatotropinene laget med øket løselighet (stabilitet), og derved gitt bedrete egenskaper for langsom frigjøring. Grisesomatotropin er spesielt anvendbart i en langsom frigjøringsform, og som således er et somatotropin av primær interesse.

Et spesielt nyttig eksempel på den foreliggende mutasjon er mutasjon I122L, hvor isoleucin i posisjon 122 i a-spiral-3 er erstattet med leucin. I kombinasjon med andre mutasjoner i posisjon 183 og 191 hvor cysteinene er erstattet med alanin, blir en betydelig økning i overgangstemperaturen til proteinets enkle tryptofanrest oppnådd. Overgangstemperaturen er et mål for den termiske stabilitet til proteinet. I ett av de mest foretrukne mutasjonene blir øket løsningsstabilitet oppnådd når I122L-mutasjonen blir kombinert med mutasjoner der det cystein-kodende DNA i posisjoner 183 og 191 blir forandret til å kode for glutaminsyre. I en annen foretrukket mutasjon blir øket løsnings-stabilitet oppnådd når heliks-1 dobbeltmutanten A6TS11R blir kombinert med mutasjoner hvor det cystein-kodende DNA i posisjoner 183 og 191 i aminosyresekvensen blir forandret til å kode for glutaminsyre.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1: Restriksjonskart av rekombinant grisesomatotropin (rpST) DNA. Den brede helopptrukne linjen representerer aminosyre-kodende del av rpST DNA; den tynne linjen representerer 5' og 3' flankerende, ikke-kodende DNA-sekvens. Områder i rpST-genet gjenstand for sete-spesifikk mutagenese er nummerert og antydet under restriksjonskartet, hvor nr. 1 representerer DNA-kodende a-spiral-1, nummer 2 representerer DNA-kodende a-spiral-2,

nummer 3 representerer DNA-kodende a-spiral-3 og nummer 4 representerer DNA som koder for cysteinene tilstede i posisjonene 183 og 191. Bokstavene over kartet viser lokaliseringen av forskjellige restriksjons endonukleaserestriksjonsseter, hvor RI=EcoRI, N=NdeI, B=BssHII, S=SacI, X=XbaI, Sm=SmaI og H=HindIII.

Fig. 2: Struktur og restriksjonskart av plasmid pEFF-902. Dette plasmid inneholder pBR322 replikasjonsstart (Ori) og ampicillin-motstandsgen, yPT-promotoren, ell ribosomalt bindingssete og cl repressorgen fra bakteriofag lambda, t^T,, transkripsjonsterminatoren fra E. coli rrnB-operonet, et 60 basepar sekvens fra deo-regulatorisk region uten promotorer, og rpST-genet betegnet som pGH.

Relevante restriksjonsseter er vist. rpST-inneholdende DNA blir fjernet fra dette plasmid etter behandling med EcoRI og Hindlll og klonet inn i mutagenesevektor pGEM3z(f+) som beskrevet i teksten. Fig. 3: Struktur og delvis restriksjonskart av pGHGEM3Z. Dette fagmid inneholder fl DNA-replikasjonsstart, pBR322 replikasjonsstart (Ori) og ampicillinresistensgen, SP6 og T7 promotorer, lacZ-gen ell ribosomalt bindingssete fra bakteriofag A- og rpST-genet, betegnet rpGH. Enkeltkjedet fagmid DNA blir benyttet som templat for setespesifikk mutagenese som beskrevet i teksten. Fig. 4: Bakterie ekspresjonsplasmid pROpST blir benyttet for produksjon av rekombinant grisesomatotropiner i bakterier (E. coli). ell ribosom bindingssete er lokalisert mellom EcoRI og Ndel restriksjonssetene. Translasjons-startkodon for rpST er lokalisert i Ndel-setet. Ekspresjon blir kontrollert av APL-promotoren. Fig. 5: Strukturen til gjærekspresjonsplasmidet YEp352-pST-I122L. Dette plasmid er et derivat av YEp3 52 og inneholder rpST-mutasjonen, I122L, hvis ekspresjon blir kontrollert av den induserbare GALI/GALI0-promotoren fra S. cerevisiae. 3' ikke-translatert DNA stammer fra gjær STE7-genet. 2^m-elementet understøtter plasmidreplikasjon i gjær, og URA3 gir en seleksjons-markør for transformantseleksjon i gjær. Dette plasmid bærer også pBR322 start for replikasjon (ikke vist) og ampicillin motstands-genet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse omhander svinesomatotropin(er) med en dobbeltmutasjon i a-heliks-l-regionen, enten alene eller i kombinasjon med mutasjoner i a-heliks-3 regionen. Videre, andre mutasjoner i somatotropinmolekylet kan bli kombinert med de foreliggende spiral-mutasjonene. Det resulterende svinesomato-tropinet med en dobbeltmutasjon i alfa-heliks 1-regionen gjør som somatotropinet mer løselig enn den naturlige form av somatotropinet, mens den biologiske aktivitet opprettholdes i en vedvarende frigjøringsformulering, og hvor nevnte alfa-heliks 1 dobbeltmutasjon er valgt fra gruppen bestående av A6TS11R eller P8TS11R som beskrevet i beskrivelsen. Mer spesifikt, omfatter somatotropinene i tillegg en mutasjon av somatotropinet i alfa-heliks 3-regionen som derved gjør somatotropinet mer løselig enn den naturlige form av somatotropinet, mens den biologiske aktivitet opprettholdes i en vedvarende frigjøringsformulering, og hvor nevnte alfa-heliks-3-mutasjon er I122L som beskrevet i beskrivelsen. Videre, betegnelsen somatotropin omfatter fjernelser, tilføyelser og forandringer til andre deler av det naturlige somatotropinmolekyl. F.eks., modifiserte (substituerte eller fjernete cysteiner) eller derivatiserte somatotropiner hvor én til fire av cysteinaminosyrerestene av nevnte somatotropin er erstattet av fra én til fire aminosyrerester, valgt separat fra aminosyrene, arginin, lysin, asparaginsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin, histidin, alanin, glycin, isoleucin, leucin, valin, fenylalanin, tryptofan, tyrosin, metionin, serin, treonin eller prolin; eller hvor alle fire cysteiner blir overført til cysteinsyre.

Plasmider, DNA-sekvenser og mikroorganismer deponert i forbindelse med den foreliggende patentsøknad, bortsett fra der det motsatte er spesifisert, er deponert i American Cyanamid Companys kultursamling bevart i Priceton, New Jersey og er deponert ifølge Budapest Treaty hos American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland 20952, USA.

DNA-stammene som er referert til over ble deponert i ATCC 23. august 1988. De er pGEMpST-SC (ATCC-nummer 40482), pR0211 (ATCC nummer 40483) og pEFF-902 (ATCC nummer 40484). Det er anerkjent av de som er erfarne i feltet at disse DNA'er kan bli innsatt i ethvert passende ekspresjonssystem for å oppnå somatotropinene i oppfinnelsen eller mutasjoner av disse.

E. coli K12 bakteriestammer som uttrykker noen av de nye svine-somatotropinene ifølge foreliggende oppfinnelse ble også deponert i ATCC 23. august 1988. Bakteriestammene inkluderer E. coli stamme 1655 (ATCC nummer 67762), 1655/pROpSTA3 4 (ATCC nummer 67763), 1655/pROpSTE34 (ATCC nummer 67764), 1655/pROpST (ATCC nummer 67765), 4200 (ATCC nummer 67766), 4 2 00/pROpSTA34 (ATCC nummer 67767), 42 00/pROpSTE3 4 (ATCC nummer 67768), 420/pROpST (ATCC nummer 67769), 4255 (ATCC nummer 67770), 4255/pROpSTA34 (ATCC nummer 67771), 4255/pROpSTE34 (ATCC nummer 67772), 4255/pROpST (ATCC nummer 67773) og 4300 (ATCC nummer 67774).

De følgende E. coli K12 bakteriestammer ble også deponert i ATCC 21. september 1990. Disse omfatter pR0pST-SXE-Q21HH22R (ATT 68410) , pR0pST-SXE-G121A (ATCC 64811) , pR0pST-SXE-A6TSHR (ATT 68412), pR0pST-SXA-S81, 87L+ I122L (ATCC 68413), pROpST-SCA-S81,87L (ATCC 68414), pROpST-SXA-L82, 84Q + L115K (ATCC 68415), pROpST-SXA-L82, 84Q (ATCC 68416), pROpST-SXE-I122L (ATCC 68417), pROpST-SXA-I122L (ATCC 68418), pST-SX (ATCC 68419), pROpST-SXA-L118E (ATCC 68420), pROpST-SXA-E119LQ123L (ATCC 68421), pROpST-SXA-I122E (ATCC 68422), pROpST-SXA-M126A (ATCC 68423) og pROpST-SXE-A6TS11R + I122L (ATCC 68424).

Svinesomatotropinene i den foreliggende oppfinnelse blir laget ved sete-spesifikk mutagenese, men andre hjelpemidler slik som kjemisk syntese av peptider og/eller proteiner kan bli benyttet for å lage nevnte somatotropiner. Vanlig benyttete fremgangsmåter for å forandre DNA-sekvenser i et klonet segment av DNA på et spesifikt definert sete krever produksjon av enkeltkjedet form av det DNA. Det enkeltkjedete DNA blir bundet til et syntetisk oligonukleotid som er komplementær til en del av det DNA, bortsett fra at oligonukleotidet inneholder en region med feiltilpassing. Området med feiltilpassing er vanligvis lokalisert i den sentrale delen av oligonukleotidet. I noen tilfeller inneholder også oligonukleotidet et restriksjonsendonuklease gjenkjennelsessete ved eller nær området for mutasjonen(e). Den hybridiserte blandingen blir så gjort dobbeltkjedet og kovalent lukket ved hjelp av E. coli DNA-polymerase I, store fragment og deoksynukleotid trifosfater i nærvær av T4 DNA-ligase og adenosin 5' trifosfat. Det dobbeltkjedete DNA blir så transformert inn i en passende E. coli-stamme, hvor den feiltilpassete regionen i DNA blir parret og replikert.

To populasjoner av kloner blir oppnådd. Avhengig av hvilken tråd som blir valgt som templat for reparasjonssyntese, inneholder en klon enten villtypen eller den forandrete (muterte) sekvensen. Klonene som inneholder den muterte sekvensen, den som korrespon-derer til sekvensen i oligo-nukleotidet, blir valgt ved hybridisering til det radioaktivt-merkete oligonukleotidet. På grunn av feiltilpassing mellom oligonukleotidet og villtypesekvensen er det radioaktivt-merkete oligonukleotid mer stabilt bundet til klonene som inneholder den muterte sekvensen. Inkubasjon ved en passende temperatur skiller derfor mellom villtype og muterte kloner. I tilfeller hvor oligonukleotidet også inneholder et restriksjons endonuklease kløyvingssete, vil spalting av kandidatkloner med den passende restriksjonsendonuklease avsløre kloner som inneholder den muterte sekvensen og gir et ytterligere hjelpemiddel for å skille mellom villtype og muterte kloner. Forandringene i de identifiserte klonene blir bekreftet ved DNA-sekvensering av de relevante områdene.

Restriksjonsfragmenter av plasmidkloner som inneholder den (de) ønskete mutasjon(er) blir rekonstruert i ekspresjonsplasmider som egner seg for å produsere det muterte genproduktet i enten bakterier eller gjær, men ikke i begge. Denne rekonstruksjon blir oppnådd ved standard subklonings-fremgangsmåter.

DNA og aminosyresekvensen til rekombinant grisesomatotropin blir gitt her nedenfor. Det mest foretrukne rekombinante svinesomatotropin er en polypeptidsekvens på 193 aminosyrer, hvor NH2-enden er blitt modifisert til å inkludere 3 ytterligere aminosyrer (met, asp, gin) og en delesjon av første aminosyre (ala) funnet i noen modne former av grisesomatotropin fra hypofyse. Imidlertid er 193-aminosyrene PST såvel som andre derivater av denne, slik som fjernelser ved NH2~enden, til-føyelser her, og/eller fjernelser og/eller tilføyelser ved COOH-enden ment å danne en del av den foreliggende oppfinnelse.

Rekombinant pST: NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala-18 5 amino-syrer-ala-phe-COOH

Hypofyse-pST: NH2-ala-phe-pro-ala-185 aminosyrer-ala-phe-COOH

Denne modifikasjon resulterer i en netto øking på to ytterligere aminosyrer i det rekombinante pST-proteinet og er beskrevet i EP355460. Nummereringssystemet benyttet i beskrivelsen av de mutageniserte derivatene av rekombinant grisesomatotropin avspeiler denne ytterligere øking, og er lett å anvende av enhver fagmann i feltet.

Konstruksjon av pGEMpST- SC- DNA

Enkeltkjedet pGEMpST-SC-DNA er templat-DNA for alle mutagenesereaksjoner og blir laget fra pGHGEM3Z-DNA ved hjelp av sete-spesifikk mutagenese. Kloning av grisesomatotropin (rpST) genet i fagmidet pGEM-3z(f+), hvilket resulterer i pGHGEM3Z, blir oppnådd ved hjelp av den følgende generelle fremgangsmåte. Et DNA-fragment som inneholder pGHGEM3Z grisesomatotropin (rpST) genet blir isolert fra bakterie ekspresjonsplasmidet pEFF-902 ved spaltning med restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll (fig. 1). Det rpST-gen-inneholdende fragmentet blir så renset ved agarose gel-elektroforese. Dobbeltkjedet fagmid DNA pGEM-3z(f+) blir spaltet med EcoRI og Hindlll, behandlet med kalvetarm EcoRI alkalisk fosfatase og det store fragment renset ved agarose gelelektroforese. De to rensete fragmentene blir så blandet sammen og bundet sammen med T4 DNA-ligase. Blandingen blir så overført inn i bakterier og flere resulterende kolonier dyrket opp. Plasmid DNA blir laget ved en standard alkalisk lysemetode og strukturen bestemt ved spalting med passende restriksjons-enzymer. En klon blir isolert som inneholder de forventete fragmentene og blir betegnet pGHGEM3Z.

pGEMpST- SX

Målet for denne mutagenese er å lage en rpST DNA-sekvens hvor DNA-sekvensen som koder for a-spiral-2 blir bundet på 5'-siden (fra posisjonene 225-230 i den DNA-kodende regionen) ved et SacI restriksjonssete og 3'-siden (fra posisjonene 285-290) ved et Xbal restriksjonssete. Disse forandringene i DNA-sekvensen forandrer ikke aminosyresekvensen til rpST-proteinet. Tilstedeværelsen av disse reaksjons endonuklease klyvingssetene resulterer i dannelsen av en "spiral 2 kassett", slik at mutasjonene i spiral-2-kodende DNA kan bli greit og hurtig kombinert med passende mutasjoner i DNA som koder for spiral 3. Konstruksjonen pf pGEMpST-SX er beskrevet nedenfor.

DNA-sekvensene til de syntetiske oligonukleotidene SacI293 og XbaI353 er beskrevet i tabell 1. Enkeltkjedet pGHGEM3Z DNA er substratet for mutagenese og blir laget fra renset fag ved hjelp av standard fremgangsmåter. 2000 ng av dette DNA blir blandet med 100 ng hver av SacI293 og XbaI353 oligonukleotid, og begge disse har blitt fosforylert ved deres 5'-ender med adenosin 5'-trifosfat og T4 polynukleotid kinase. Blandingen blir oppbevart i et totalt volum på 10 fil i IX blandingsbuffer (IX blandings-buffer er 75 mM KC1 og 5 mM Tris-Cl, pH 8,0). Blandingen blir varmet opp til 65°C 1 7 minutter, etterfulgt av 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur (RT). Denne fremgangsmåte tillater oligonukleotidene å binde seg til det enkeltkjedete substrat (templat) DNA. Sammen-bundne molekyler blir forlenget og overført til kovalent lukket, dobbeltkj edet DNA ved tilsetning av 2 2/ul H20, 1 /il 2 0 mM ATP, 2 enheter hver av T4 DNA-ligase, og DNA-polymerase I store fragment (for enhetdefinisjon, se New England Biolabs-katalog, 1989) , 2 jul 20X dNTP'er (en blanding av de fire deoksyribo-nukleotid 5'-tri-fosfåtene hver i en konsentrasjon på 2 mM) og 4/ul 10X "fill in"-buffer (IX fill in-buffer er 27,5 mM Tris-Cl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 2 mM DTT). Etter en times inkuba-sjon ved romtemperatur (RT) blir halvparten av reaksjonen innført i HBlOl-kompetente celler ved standard fremgangsmåte. Enkeltkolonier er synlig etter over natts inkubasjon ved 37°C. Plasmid DNA blir laget ved standard fremgangsmåte fra 24 kolonier, og spaltet, i atskilte reaksjoner, med SacI og Xbal. Plasmid DNA'er som inneholder begge restriksjonssetene, som tydet på innbyggingen av både SacI293 og XbaI353 oligo-nukleotidene inn i rpST-genet, blir videre renset ved innføring inn i HBlOl-kompetente celler som beskrevet tidligere. Plasmid DNA blir laget og spaltet i atskilte reaksjoner med SacI og Xbal for å bekrefte tilstedeværelsen av hvert restriksjonssete i plasmid-DNA, som blir så bekreftet ved DNA sekvensanalyse av de relevante regioner i rpST DNA.

Syntese av mutasjoner i spiral 1. 2 eller 3

Mutagenese av rpST-genet i pGEMpST-SX blir oppnådd som beskrevet under. Målet for mutageneseprogrammet er å lage et rpST-molekyl som har en øket tendens til å aggregere ved høye proteinkonsentrasjoner (>100 mg/ml). I fokus er den hydrofobe del av spiral 3, fra aminosyrerestene 112 til omg med 129, som er trodd å være kritisk for å starte aggregeringsreaksjonen (Brems et al., 1986). Fordi rpST-genet som benyttes her koder for ytterligere to aminosyrer ved amino-enden, blir det totale antall aminosyrerester 193, i motsetning til de 191 restene funnet i storfe og svine-somatotropin fra hypofyse. Rester 112 til og med 129 korrespon-derer til restene 110 til og med 127 i storfesomatotropin (Abdel-Meguid et al., 1987). Andre områder av molekylet som er mål for mutagenese er spiral-2, fra restene 81 til og med 87, den hydrofile delen av spiral 3 og spiral 1 fra restene 6 til og med 11. Kombinasjonsmutanter blir laget ved ytterligere runder mutagenese, eller ved å subklone relevante områder. Basisprotokollen som ble benyttet for å oppnå L118E-mutasjonen og eksempler på alle andre er beskrevet heretter. Variasjoner i basisprotokollen er beskrevet i de passende eksemplene.

Tillagning av enkeltkjedet substrat pGEMpST-SX DNA blir utført nøyaktig som beskrevet for pGHGEM3Z. DNA-sekvensen i det syntetiske mutageniserende oligonukleotid benyttet i kon-struksjon av mutasjon L118E, E116, er vist i tabell I og er fosforylert i det 5'-ende som beskrevet for SacI293. Sammenbinding og "fill in<M->reaksjonene er også nøyaktig som beskrevet for SacI293-mutagenese av pGHGEM3Z. Etter innføring av halvparten av reaksjonsblandingen inn i HBlOl-kompetente celler og over natten inkubasjon ved 3 7°C, blir de resulterende koloniene overført til nitrocellulosefiltre og behandlet for hybridisering ved hjelp av standard fremgangsmåter. E116 oligonukleotidet blir også benyttet for påvisning av mutasjonen. Det blir radioaktivt merket i 5<1->enden med a- 32P-ATP og poly-nukleotidkinase. Hybridisering er over natt ved 37°C i 5XSSC (1XSSC er 0,15 M natriumklorid, 0,015 M natriumcistrat pH 7,0), IX Denhardts (0,02% hver v/v) Ficoll, storfeserumalbumin, polyvinylpyrrolidon), 150 ug/ ml gjær tRNA og den radioaktivt merkete "proben".

Etter hybridisering blir filtrene vasket i minst 30 minutter ved 37°C i 5XSSC, etterfulgt av to 3 0 minutters vasker i TAC (TAC er 3M tetrametylammoniumklorid, 50 mM (tris) [hydroksymetyl]-aminometan pH 8,0, 1 mM EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre), 0/1%

(w/v) dodecylsulfat) i den ønskete temperaturen. Inkubasjonstemperaturen i den siste vasken bestemmer spesifisiteten som E116 oligonukleotid vil forbli hybridisert bare til fullstendig komplementære kloner. For E116 oligonukleotidet er temperaturen 59,0°C. Etter eksponering av røntgenfilm, blir bare de klonene observert som er fullstendig komplementære til E116. Plasmid DNA ble laget fra flere av disse positive koloniene, ført tilbake inn i HB101 og undersøkt som beskrevet ovenfor. Plasmid DNA fra flere positive fra denne andre runde av undersøkelser blir laget og analysert ved DNA-sekvensanalyse; de som inneholder L118E-mutasjon er således utvilsomt identifisert. Plasmidet som har denne mutasjon blir betegnet pGEMpST-SX-L118E.

De resulterende rpST genklonene som inneholder L118E-mutasjonen blir overført til hver av to ekspresjonsvektorer, pROpST-SX og pROpST-SXA, hvis konstruksjoner er beskrevet. Formålet med disse konstruksjonene er å innføre rpST-genet som inneholder spiral-2-kassetten, definert ved nærværet a SacI og Xbal restriksjonssetene beskrevet tidligere, inn i en plasmid-vektor laget for ekspresjon av rpST-genet i E. coli. Et ytterligere mål er å innføre mutasjonene beskrevet i den foreliggende oppfinnelse inn i hver av de to forskjellige rpST-genetiske bakgrunnene. En er den naturlige (villtype) med hensyn til nærvær av hver av to cysteinrester i posisjonene 18 3 og 191. Det andre rpST-genet koder for alanin istedenfor cystein i disse samme posisjoner og er beskrevet i EPO 355460. Plasmid pROpSTA34 (fig.

4) inneholder et EcoRI/HindIII-fragment som er klonet inn i ekspresjonsplasmid pR0211. Dette EcoRI/HindIII-fragment bærer et forandret rpST-gen, der DNA som koder for cysteinene i posisjon 183 og 191 har blitt mutert til alanin-kodende DNA i disse posisjonene. Det bærer således ala, ala mutasjoner. Plasmid pROpSTA34 blir spaltet med EcoRI og Hindlll i én reaksjonsblanding og EcoRI og Smal i en annen. Det store, vektor-inneholdende fragment blir renset fra hver reaksjon ved hjelp av agarose gelelektroforese. Plasmid pROpST-SX, som inneholder spiral-2- kassetten i den på annen måte ville type rpST-bakgrunn, blir laget ved sammenbinding av det rensete EcoRI/HindIII-fragmentet fra pGEMpST-SX. Sammenbindingsbland-ingen blir innført i bakteriestamme N99cl. I denne stammen blir rpST-ekspresjonen kontrollert av A PL promotoren, og blir forhindret ved nærvær av villtype A repressoren. Resulterende plasmidkloner med den ønskete konstruksjon blir identifisert ved spalting med de passende restriksjonsenzymene. Plasmid pROpST-SXA, som inneholder spiral-2-kassetten i det muterte rpST-genet, blir laget ved sammenbinding av det rensete EcoRI/Smal-vektorfragmentet av pROpSTA34 til det rensete EcoRI/Smal-fragmentet fra pGEMpST-SX. Sammenbindings-blandingen blir innført i bakteriestamme N99cl, og de resulterende plasmidkloner analysert ved hjelp av spalting med de relevante restriksjonsenzymene for å identifisere de ønskete plasmidklonene.

L118E-mutasjonen blir innført i ekspresjonsplasmider pROpST-SX og pROpST-SXA ved å spalte pGEMpST-SX-L118E med EcoRI og Hindlll i ett sett reaksjoner, og EcoRI og Smal i en annen sett reaksjoner. De små, rpST-bærende fragmentene fra hver reaksjonsblanding inneholder L118E-mutasjonen og blir renset ved agarose-gel-elektroforese. Plasmid pROpST-SX blir spaltet med EcoRI og Hindlll og det store vektor-bærende fragment blir renset ved agarose gelelektroforese. Dette fragment blir bundet til det rensete EcoRI/HindIII-fragmentet fra pGEMpST-SX-L118E, hvilket resulterer i plasmid pR0pST-SX-L118E. Sammenbindings-blandingen blir transformert inn i ekspresjonsstamme 43 00 som bærer en temperaturfølsom A-repressor. I disse stammene, avhenger rpST-ekspresjon av temperatur. Ved 42°C er A-repressoren inaktiv, hvilket tillater ekspresjon fra A-PT-promotoren. Bakteriekolonier som bærer pROpST-SX-L118E-plasmidet blir identifisert ved deres evne til å lage rpST-proteinet ved 42°C (den ikke-permissive temperatur for A-repressoren). Plasmid pROpST-SXA blir spaltet med både EcoRI og Smal, og det store vektorfragmentet blir renset ved agarose gelelektroforese. Dette fragment blir bundet til det rensete EcoRI/Smal-fragmentet fra pGEMpST-SX-L118E, hvilket resulterer i plasmid pR0pST-SXA-L118E. Sammenbindingsblandingen blir transformert inn i ekspresjons-stamme 4 3 00, og bakterie-koloniene som bærer pR0ST-SXA-L118E-plasmidet blir identifisert ved sin evne til å produsere rpST-proteinet ved 42°C.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av en spiral- 2-" kassett" ved samtidig bruk av to syntetiske oligonukleotider

Målet for denne mutagenese er å lage en rpST DNA-sekvens hvor DNA-sekvensen som koder for a-spiral-2 er begrenset på 5'-siden (fra posisjonene 225-2 3 0 i den DNA-kodende region) av et SacI restriksjonssete og 3'-siden (fra posisjonene 285-290) av et Xbal restriksjonssete. Disse forandringene i DNA-sekvensen forandrer ikke aminosyresekvensen til rpST. Tilstedeværelsen av disse restriksjonsendonuklease spaltingsseter resulterer i dannelsen av en "spiral-2-kassett", slik at mutasjonene i spiral-2-kodende DNA blir greit og hurtig kombinert med passende mutasjoner i DNA som koder for spiral-3. Konstruksjonen av pGEMpST-SX er som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 2

Substitusjon av hydrofobe aminosyrer i spiral- 3 med hydrofile aminosyrer som stabiliserer g- spiralene med mutageniserende oligonukleotider

Medlemmene av denne mutasjonsklasse inkluderer mutasjoner L118E, L115K, L115KL118E og L118EI122K. Mutasjonene blir laget nøyaktig som beskrevet for L118E i utgangsprotokollen. De resulterende plasmidene som har disse mutasjonene blir betegnet henholdsvis pGEMpST-SX-L118E, pGEMpST-SX-L115K, pGEMpST-SX-L115KL118E og pGEMpST-SX-L118EI122K.

Konstruksjonen av L115K-mutasjon i rpST blir oppnådd nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid K113, vist i tabell I, blir benyttet både i mutagenesen og hybridiseringsreaksjonene. Dette oligonukleotid forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 115 blir forandret fra CTG til AAG som koder for lysin.

Dannelsen av L115KL118E-mutasjonen i rpST blir laget nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligo-nukleotid K113E116 vist i tabell I blir benyttet i mutagenese-reaksjonen og oligonukleotid K113E116D, vist i tabell I blir benyttet i hybridiseringsreaksjonen. K113E116 oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 115 blir forandret fra CTG til AAG som koder for lysin, og leucin-kodonet i posisjon 118 blir forandret fra CTG til GAG som koder for glutaminsyre. Dette oligonukleotid lager således en dobbeltmutasjon i rpST DNA-sekvensen.

Konstruksjonen av L118EI122K-mutasjonen i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid E116I120 vist i tbaell I blir benyttet i hybridiseringsreaksjonene. E116K120 oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 118 blir forandret fra CTG til GAG som koder for glutaminsyre, og isoleucin-kodon på 12 0 blir forandret fra ATC til AAG, som koder for lysin. Dette oligonukleotid lager således en dobbeltmutasjon i rpST DNA-sekvensen.

EKSEMPEL 3

Substitusjon av hydrofobe aminosyrer i spiral- 3 med hvdrofile aminosyrer med muta<g>eniserende oligonukleotider

Medlemmer av denne mutasjonsklasse inkluderer I122D, L118T, L118K og L115E. Plasmidene som har disse mutasjonene blir betegnet henholdsvis pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-L118T, pGEMpST-SX-L118K og pGEMpST-SX-L115E. Konstruksjon av disse mutasjoner blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at oligonukleotidene benyttet både i mutagenesen og hybridiseringsreaksjonene har sekvenser vist i tabell I.

Mutageniserende oligonukleotid E120 blir benyttet i konstruksjonen av mutasjon I122E (tabell I) . Dette oligo-nukleotid forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for isoleucin i posisjon 122 blir overført fra ATC til GAG som koder for glutammin-syre. E12 0 oligonukleotidet blir også benyttet som radio-merket deteksjonsprobe i hybridiseringsreaksjonene, som på alle andre måter er identiske til de beskrevet ovenfor for L118E, bortsett fra at nitrocellulosefiltrene blir inkubert med TAC-buffer ved 56°C. Konstruksjonen av mutasjon L118T blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at oligonukleotidet benyttet både i mutagenesen og hybridiserings-reaksjonene er L118T (tabell I). Dette oligonukleotid forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for leucin i posisjon 118 blir overført fra CTG til ACT som koder for treonin. Plasmider som inneholder den ønskete mutasjonen blir atskilt fra ikke-mutasjonsbærende plasmider etter at nitrocellulosefiltre blir inkubert i TAC-buffere ved 56"C.

Konstruksjonen av L115E-mutasjon i rpST blir gjort nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid E113EHDQ116 vist i tabell I blir benyttet i mutagenesereaksjonen og oligonukleotidet E113D, vist i tabell I, blir benyttet i hybridiseringsreaksjonene. E113EHDQ116 oligo-nukleotid forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 115 blir forandret fra CTG til GAG som koder for glutaminsyre, og leucin-kodon ved 118 blir forandret fra CTG til GAG, som koder for glutaminsyre, GAG, som koder for glutaminsyre, GAC som koder for aspartan, CAC, som koder for histidin elle GAC, som koder for glutamin. Variasjonen i mutasjonsendringer som opptrer i posisjon 118 skyldes det faktum at det mutageniserende oligonukleotid er en blanding av fire oligonukleotider, som er laget under syntesen av oligonukleotidet. DNA-sekvensering av de resulterende plasmidkloner som hybridiserer til E113D radio-merket hybridiserings-"probe" viser at de inneholder L115E-mutasjonen, man har ingen av de andre fire mulige mutasjonene i posisjon 118. Således resulterer denne mutagenese i bare én enkelt mutasjon i posisjon 115.

Konstruksjonen av L118K-mutasjonen i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligo-nukleotid L118TK, hvis sekvens er vist i tabell I, blir benyttet. L118TK oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 118 blir forandret fra CTG til AAG som koder for lysin eller fra CTG til CAG, som koder for treonin. De forskjellige mulighetene for mutasjons-forandringer som oppstår ved posisjon 118 skyldes det faktum at det mutageniserende oligonukleotid er en blanding av to oligo-nukleotider, som er laget under syntese av oligonukleotidet. DNA-sekvensering av de resulterende plasmidklonene som hybridiserer til L118TK radio-merket hybridisérings-probe viser at de inneholder L115K-mutasjonen, og ingen har de andre mulige mutasjonene, L118T, i posisjon 118. Således resulterer denne mutagenese i en enkelt mutasjon i posisjon 118.

EKSEMPEL 4

Substitusjon av hydrofobe aminosyrer i spiral- 3 med hydrofobe aminosyrer ved bruk av et mutageniserende oligonukleotid

Det enkelte medlem av denne mutasjonsklasse er dobbeltmutanten E119LQ123L. Plasmidet som har denne mutasjonen bekreftet ved DNA-sekvensanalyse er PGEMpST-SX-E119LQ123L. Konstruksjonen av dette dobbeltmuterte rpST-gen blir oppnådd som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid L117,121 blir benyttet (tabell I). Dette oligonukleotid forandrer rpST-DNA-sekvensen slik at DNA som koder for glutaminsyre blir forandret fra GAG til CTG, som koder for leucin, og DNA som koder for glutamin i posisjon 123 blir forandret fra CAG til CTG som koder for leucin. Mutagenese-reaksjonen benytter dette oligonukleotid, mens Leull7121D, hvis sekvens er vist i tabell I, blir benyttet som radio-merket "probe" i hybridiseringsreaksjonene. Alle fremgangsmåter benyttet i konstruksjon av denne mutasjon er som tidligere beskrevet for L118E, bortsett fra at nitrocellulosefiltrene blir inkubert i TAC ved 58°C for å påvise mutasjons-bærende plasmider.

EKSEMPEL 5

Substitusjon av ikke- polare aminosyrer som har store sidekjeder i spiral- 3 med ikke- polare aminosyrer som har små sidekjeder

Medlemmer av denne mutasjonsklassen inkluderer L115A, L118A og M126A. Plasmidene som har disse mutasjonene blir betegnet henholdsvis pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-L118A og pGEMpST-SX-M12 6A. Konstruksjonen av disse mutasjonene blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at de mutageniserende oligo-nukleotidene som blir benyttet, og hvis nødvendig, TAC-vasketemperaturen.

DNA-sekvensen til det syntetiske mutageniserende oligo-nukleotid benyttet i konstruksjonen av mutasjon L115A, L115A, er vist i tabell I. Dette oligonukleotid forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for leucin i posisjon 115 blir overført fra CTG til GCG som koder for alanin. L115A oligonukleotidet blir også benyttet som radiomerket påvisningsprobe i hybridiserings-reaksj onene. Plasmidene som inneholder den ønskete mutasjonen blir atskilt fra de ikke-mutasjonsbærende plasmider etter at nitro-cellulosef iltre er inkubert i TAC-buffere ved 56°C.

Konstruksjonen av L118A mutasjon i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet i både mutagenesen og hybridiserings/ påvisningsreaksjonene er L118A, hvis sekvens er vist i tabell I. L118A oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for leucin i posisjon 118 er forandret fra CTG til GCG som koder for alanin. Mutasjonsbærende plasmider blir påvist ved å inkubere nitrocellulosefiltre i TAC-buffer ved 56°C. Plasmidet som har denne mutasjon, bekreftet ved DNA sekvens-analyse, blir betegnet som pGEMpST-SX-L118A.

Konstruksjonen av M12 6A-mutasjonen i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet i både mutagenese og hybridiserings/ påvisningsreaksjonene er A124-2, hvis sekvens er vist i tabell I. A124-2 oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodonet for metionin i posisjon 126 blir forandret fra ATG til GCA som koder for alanin. Mutasjons-bærende plasmider blir påvist ved å inkubere nitrocellulose-filtrene i TAC-buffer ved 56°C. Plasmidet som har denne mutasjon, bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-ml2 6A.

EKSEMPEL 6

Substitusjon av isoleucin 122 med leucin

Medlemmene av denne mutasjonsklassen inkluderer I122L, I122LL118A og I122LM126A. Plasmidene som har disse mutasjonene blir betegnet henholdsvis pGEMpST-SX-I122L, pGEMpST-SX-I122LL118A og pGEMpST-SX-I122LM126A. Konstruksjonen av disse mutasjonene blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at de mutageniserende oligonukleotidene benyttet, og, hvis nødvendig, TAC-vasketemperaturen.

DNA-sekvensen i det syntetiske mutageniserende oligonukleotid benyttet i konstruksjonen av mutasjon I122L, L120-3, er vist i tabell I. Dette oligonukleotidet forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for isoleucin i posisjon 122 blir overført fra ATC til CTG som koder for leucin. L120-3 oligo-nukleotidet blir også benyttet som radiomerket påvisningsprobe i hybridiserings-reaksj onene. Plasmider som inneholder den ønskete mutasjon blir atskilt fra ikke-mutasjonsbærende plasmider etter at nitro-cellulosef iltre blir inkubert i TAC-buffer ved 56°C.

Konstruksjonen av I122LL118A i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet både i mutagenese og hybridiserings/- påvisningsreaksjonene er L118A, og templat-DNA benyttet for mutagenese er pGEMpST-SX-I122L. Templat-DNA blir laget nøyaktig som beskrevet for pGEMpST-SX DNA. Mutasjonsbærende plasmider blir påvist ved å inkubere nitrocellulosefiltrene i TAC-buffer ved 56°C. Plasmidet som har denne mutasjon, bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-L118AI122L. Konstruksjonen av I122LM126A mutasjon i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet i både mutagenesen og hybridisers/påvisningsreaksjonene er A124-2, og templat DNA benyttet for mutagenese er pGEMpST-SX-I122L. Templat-DNA blir laget nøyaktig som beskrevet for pGEMpST-SX DNA. Mutasjons-bærende plasmider blir påvist ved å inkubere nitrocellulose-f iltrene i TAC-buffer ved 56°C. Plasmidet som har denne mutasjon, bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-I122LM126A.

EKSEMPEL 7

Substitusjon av aminosvrerestene i den hvdrofile overflate i spiral- 3

Medlemmene av denne mutasjonsklasse inkluderer G121A, K114R og K116R. Plasmidene som har disse mutasjonene blir henholdsvis betegnet pGEMpST-SX-G121A, pGEMpST-SX-K114R og pGEMpST-SX-K116R. Konstruksjonen av disse mutasjonene blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at de mutageniserende oligo-nukleotidene benyttet, og, hvis nødvendig, TAC vasketemperaturen.

DNA-sekvensen til det syntetiske mutageniserende oligo-nukleotid som er anvendbar i konstruksjonen av mutasjon G121A, G121A/XmnI er vist i tabell I. Dette oligonukleotid forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for glycin i posisjon 121 blir forandret fra GGC til GCT som koder for alanin. Dette oligonukleotid atskiller seg også fra rpST DNA-sekvensen slik at XmnI restriksjonsgjenkjennelsessetet (5<1->GAAGCTATTC-3<1>) blir lokalisert i rpST DNA-sekvensen. Bortsett fra G121A-mutasjonen forandrer tilleggsnukleotidet ikke på resultatet med hensyn til aminosyresekvensen i rpST-proteinet. G121A/XmnI oligonukleotidet blir også benyttet som radiomerket påvisnings-"probe" i hybridiseringsreaksjonene, som på alle andre måter er identiske til dem beskrevet ovenfor. Mulige mutasjonsbærende kloner blir påvist ved å inkubere nitro-cellulosefiltrene i TAC-buffer ved 57,5°C og ved å undersøke for tilegnelsen av et Xmnl-sete, som er tilstede i det mutageniserende oligonukleotid og derfor er diagnostisk for G121A-mutasjonen i plasmidklonen. Plasmidet som har denne mutasjonen bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-G121A.

Konstruksjonen av K114R-mutasjonen i rpST blir gjort nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet i både mutagenese og hybridiserings/ påvisningsreaksjonene er K114R/AccI, hvis sekvens er vist i tabell I. K114R/AccI-oligonukleotidet endrer rpST-sekvensen til at kodon for lysin i posisjon 114 blir forandret fra AAG til CGT som koder for arginin. Dette oligonukleotid atskiller seg også fra rpST DNA-sekvensen slik at et AccI restriksjons-gjenkjennelsessete (5'-GTATAC-3') blir lokalisert i rpST DNA-sekvensen. Bortsett fra K114R-mutasjonen forandrer ikke tilleggsnukleotidet aminosyresekvensen i rpST-proteinet. Som G121A blir sannsynlige mutasjons-bærende kloner påvist ved inkubasjon av nitrocellulosefiltrene i TAC-buffer ved 57,5°C og undersøkt for tilegnelsen for et nytt AccI restriksjonssete som er tilstede i det mutageniserende oligo-nukleotid og derfor er diagnostisk for K114R-mutasjonen i plasmidklonen. Plasmidet som har denne mutasjonen bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet som pGEMpST-SX-K114R.

Konstruksjonen av K116R-mutasjonen i rpST blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid benyttet i både mutagenese og hybridiserings/ påvisningsreaksjonene er K116R/BglII, hvis sekvens er vist i tabell 1. K116R/BglII oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for lysin i posisjon 116 blir forandret fra AAG til CGA som koder for arginin. Dette oligonukleotid atskiller seg også fra rpST DNA-sekvensen slik at et Bglll restriksjons-gjenkjennelsessete (5<1->AGATCT-3<1>) blir lokalisert i rpST DNA-sekvensen fra posisjoner 342-347 i nukleotidsekvensen. Bortsett fra K116R-mutasjonen vil de ytterligere nukleotidforandringene ikke medføre forandringer i aminosyresekvensen i rpST-proteinet. Som G121A blir sannsynlige mutasjonsbærende kloner påvist ved inkubasjon av nitrocellulose-filtrene i TAC ved 57,5°C og undersøkt for tilegnelsen av et nytt Bglll restriksjonssete som er tilstede i det mutageni-serende oligonukleotid og er derfor diagnostisk for K116R-mutasjonen i plasmidklonen. Plasmidet som har denne mutasjonen bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-K116R.

• EKSEMPEL 8

Erstatning av hydrofile aminosyrer i spiral- 2 med hydrofobe amiosvrerester ved samtidig bruk av to syntetiske oligonukleotider

Medlemmet av denne mutasjonsklasse er dobbelmutasjonen, S81,87L. Plasmidet som har denne mutasjon, bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet pGEMpST-SX-S81,87L. DNA-sekvensen til de syntetiske mutageniserende oligonukleotidene, S81L og S87L, benyttet i konstruksjonen av dobbelmutanten S81,87L er gitt i tabell I. S81L og S87L oligonukleotidene forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for serin i posisjon 81 og 87 blir henholdsvis overført fra TCG til TTG, som koder for leucin. Konstruksjonen av dette dobbeltmuterte rpST-gen er nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at både de mutageniserende oligonukleotidene blir benyttet samtidig i mutagenesereaksjonen. S81L oligonukleotidet blir også benyttet som radio-merket påvisnings-"probe" i hybridiseringsreaksjonene, som på alle andre måter er identiske til de som er beskrevet i L118E, bortsett fra at filtrene blir vasket i TAC-buffer ved 54°C. Bakterietransformanter som har de sannsynlige positive mutasjonsbærende plasmidklonene blir valgt, overført til nitrocellulosefiltre og behandlet for hybridisering. I denne annen runde av undersøkelser blir S87L oligonukleotidet benyttet som radio-merket "probe"; filtrene blir vasket i TAC-buffer ved 54°C.

EKSEMPEL 9

Substitusjon av hydrofobe aminosyrerester i spiral- 2 med hydrofile aminosvrerester

Enkeltmedlemmet i denne mutasjonsklassen er dobbelt-mutasjonen L82,84Q. Plasmidet som har denne mutasjonen, bekreftet ved DNA sekvensanalyse, blir betegnet som pGEMpST-SX-L82,84Q. DNA-sekvensen i det syntetiske mutageniserende oligonukleotid benyttet i konstruksjonen av mutasjon L82,84Q er Q8082 og blir vist i tabell I. Dette oligonukleotid forandrer sekvensen til rpST-genet slik at kodonet for leucin i posisjon 82 og 84 blir hver overført fra henholdsvis CTG og CTC til GAC, som koder for glutamin. Mutasjons-bærende plasmider blir påvist ved inkubasjon av nitrocellulose-filtrene i TAC-buffer ved 58 "C.

EKSEMPEL 10

Konstruksjon av spiral- 2 oa spiral- 3 kombinasjonsmutasjoner

Flere spiral-3-mutasjoner, I122L, M126A og E119LQ123L, som enten bevarer (I122L, M126A), eller øker (E119LQ123L), blir den hydrofobe karakter av den hydrofobe overflate til spiral-3 kombinert med hydrofob spiral-2 dobbeltmutasjonen, S81,87L ved hjelp av de følgende subkloningsreaksjonene. Plasmid pGEMpST-SX-S81,87L blir spaltet med Xbal og EcoRI. Det lille fragment blir renset ved agarosegelelektroforese og inneholder S81,87L-mutasjonen. Plasmid pROpST-SXA-I122L blir også spaltet med Xbal og EcoRI etter hverandre, og det store fragmentet blir renset på samme måte. Det store fragmentet har pROpST ekspresjonsvektor-komponentene og pST-mutasjonene I122L og cysteinet til alanin-substitusjonene i posisjonene 183 og 191. Det store fragment og det lille S81,87L-fragmentet blir bundet i nærvær av T4 DNA-ligase og ATP. Halvparten av reaksjonsblandingen blir innført i ekspresjons-stammen 4300, gjort kompetent ved behandling med kalsiumklorid. Transformerte celler blir dyrket over natten ved 30°C. Plasmid-bærende celler blir undersøkt for pST-ekspresjon som beskrevet i eksempel 12; plasmid inneholdende denne spiral-2/spiral-3-kombinasjon blir betegnet pROpST-SXA-S81, 87L+H22L.

Kombinasjonsmutasjonene pROpST-SCA-S81, 87L+ M12 6A og pROpST-SXA-S81,87L+E119LQ123L blir konstruert nøyaktig som beskrevet for pROpST-SXA-S81,87L+I122L, bortsett fra at pROpST-SXA-M12 6A og pROpST-SXA-E119LQ123L blir benyttet som kilden for ekspresjons-vektorkomponentene og spiral-3-mutasjon(er) for å lage henholdsvis pROpST-SXA-S81,87L+M126A og pROpST-SXA-E119LQ123L.

Spiral-2 dobbeltmutasjonen L82,84Q blir kombinert med spiral-3-mutasjonen L115K nøyaktig som beskrevet for S81,87L+I122L, bortsett fra at kilden for mutert spiral-2 DNA er pGEMpST-SXA-82,84Q og kilden for spiral-3-mutasjon, L115K, er pR0pST-SXA-L115K. Plasmidet som inneholder denne kombinasjon blir betegnet pROpST-SXA-L82,84Q+L115K.

EKSEMPEL 11

Substitusjon av hydrofobe aminosyrer i eller nær spiral- 1 med hydrofile aminosyrer ved bruk av mutageniserende oligonukleotider

Målet for disse mutasjoner er å erstatte hydrofobe aminosyrerester funnet i NH2~endedelen til rpST med hydrofile aminosyrerester som er tilstede i den samme relative posisjon i humant veksthormon.

Medlemmer i denne mutasjonsklasse inkluderer rpST dobbelmutasjonen Q21HH22R, dobbelmutasjon S11RA14D og enkelmutasjonene A6T og A14D. Plasmider som har disse mutasjonene blir bekreftet ved DNA sekvensanalyse og blir betegnet henholdsvis pGEMpST-SX-Q21HH22R, pGEMpST-SX-SHRA14D, pGEMpST-SX-A6T og pGEMpST-SX-A14D. Konstruksjonen av disse mutasjoner blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra de mutageniserende oligo-nukleotidene benyttet, inkubasjonstemperaturen av nitrocellulose-filtrene i TAC-buffer og en ytterligere undersøkelse for positive, mutasjonsbærende plasmider ved spaltning med en passende restriksjonsendonuklease, hvis og hvor det passer.

DNA-sekvensen til det syntetiske mutageniserende oligo-nukleotid benyttet i konstruksjonen av dobbelmutasjonen Q21HH22R, Q21HH22R/ClaI er vist i tabell I. Dette oligonukleotid endrer sekvensen til rpST-genet slik at kodon for glutamin i posisjon 21 blir overført fra GAC til CAT som koder for histidin, og histidinet i posisjon 22 blir overført fra CAC til CGA, som koder for arginin. Innenfor disse mutasjoner er et Clal restriksjonsendonuklease kløyvingssete (5'-ATCGAT-3<1>) som er enkeltforekommende i det forandrete rpST-genet. Q21HH22R/ClaI-oligonukleotidet blir også benyttet som radio-merket påvisnings-"probe" i hybridiserings-reaksj onene, som på alle andre måter er identisk med de tidligere beskrevet. Alle disse fremgangsmåtene benyttet i konstruksjon av denne mutasjon er som tidligere beskrevet i L118E, bortsett fra at filtrene blir vasket i TAC-buffer ved 56°C. Også mulige mutasjons-bærende kloner blir undersøkt for tilegnelsen av et Clal-sete, som er tilstede i det mutageniserende oligonukleotidet og er derfor diagnostisk for Q21HH22R-dobbelmutasjonen i plasmidklonen.

Konstruksjonen av A6T-mutasjonen i rpST blir oppnådd nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligo-nukleotid A6T, vist i tabell I, blir benyttet i både mutagenese og hybridiseringsreaksjonene. A6T-oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at kodon for alanin i posisjon 6 blir overført fra GCC til ACC, som koder for treonin. Etter hybridisering blir de bakterie-inneholdende nitrocellulosefiltrene vasket i TAC-buffer ved 52°C.

Konstruksjonen av S11RA14D dobbelmutasjon blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligonukleotid S11RA14D/Sall blir benyttet i både mutagenese og hybridiseringsreaksjonene, og at nitrocellulosefiltrene blir vasket i TAC-buffer ved 64°C. SllRA14D/SalI-oligonukleotidet forandrer rpST-sekvensen slik at serinkodonet i posisjon 11 blir overført fra AGC til CGA, som koder for arginin, og alaninkodon i posisjon 14 blir overført fra GCC til GAC, som koder for aspartam. Dette oligonukleotidet atskiller seg også fra rpST DNA-sekvensen slik at Sali restriksjonsgjenkjennelsessetet (5'-GTCGAC-3') blir innebygget i rpST DNA-sekvensen fra posisjoner 29-34 i nukleotidsekvensen. Bortsett fra SUR og A14D-mutasjonene vil de ytterligere nukleotidforandringene ikke resultere i endringer i aminosyresekvensen i rpST-proteinet. Sannsynlige mutasjonsbærende kloner blir undersøkt for tilegnelsen av et nytt Sali restriksjonssete som er tilstede i det mutageniserende oligonukleotidet og blir derfor diagnostisk for S11RA14D dobbelmutasjonen i plasmidklonen.

Konstruksjonen av A14D enkelmutasjon blir utført nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at det mutageniserende oligo-nukleotidet A14D/HindIII blir benyttet i både mutagenesen og hybridiseringsreaksjonene. A14D/HindIII oligonukleotidet endrer rpST-sekvensen slik at alaninkodon i posisjon 14 blir overført fra GCC til GAC, som koder for asparaginsyre. Dette oligonukleotid varierer også fra rpST DNA-sekvensen slik at Hindlll restriksjonsgjenkjennelsessetet (5'-AAGCTT-3<1>) blir lokalisert i rpST DNA-sekvensen fra posisjoner 3 0-3 5 i nukleotidsekvensen. Bortsett fra A14D-mutasjonen, vil de ytterligere nukleotidforandringene ikke resultere i endringer i aminosyresekvensen i rpST-proteinet. Mulige mutasjonsbærende kloner blir påvist ved inkubasjon av nitrocellulosefiltrene i TAC-buffer ved 62°C og undersøkt for tilegnelsen for et nytt Hindlll restriksjonssete som er tilstede i det mutageniserende oligonukleotidet og er derfor diagnostisk for A14D-mutasjonen i plasmidklonen.

EKSEMPEL 12

Rekonstruksjon av pST- mutasjoner og innføring i passende bakterie-ekspresj onsplasmider

De forandrete (mutasjonsbærende) klonene blir rekonstruert for å fungere i bakterie-ekspresjonsplasmidet pR0211 (beskrevet i EPO173280 patentsøknad inntatt herved som referanse), og betegnet pROpST, pR0pSTA34 og pROpSTE34. Plasmid pROpST inne-holder pST DNA klonet i ekspresjonsvektor pR0211 og inneholder cystein-kodende DNA i posisjoner 183 og 191; pROpST34 inneholder alanin-kodende DNA og pROpSTE34 inneholder glutaminsyre-kodende DNA i disse posisjonene. pGEMpST-forandrete kloner blir spaltet med EcoRI og Smal og det lille pST mutasjonsbærende fragment isolert. pROpSTA34 DNA blir behandlet på samme måte, og det store vektor-inneholdende DNA-fragment blir isolert. Disse rensete fragmentene blir bundet sammen med T4 DNA-ligase og overført inn i en passende bakteriestamme, f.eks. 4300. Denne stamme inneholder en temperaturfølsom A-repressor, slik at ekspresjon fra A.PL~promoteren blir forhindret ved 3 0'C, men tillatt ved 42°C, ved hvilken tempratur repressoren blir inaktivert. Innføring av forandrete pGEMpST DNA-fragmenter i pROpSTE34 DNA blir oppnådd nøyaktig som beskrevet for pROpSTA34. Innføring av forandrete pGEMpST DNA-fragmenter inn i pROpST er identisk med den beskrevet for pROpSTA34, bortsett fra at både pGEMpST og pROpSTA34 plasmider blir spaltet med EcoRI og Hindlll. Tabell II opplister de bakterielle ekspresjons-plasmidene som har mottatt de muterte pST-genene. pST-mutasjondr A6T, S11RA14D og Q21HH22R blir innført inn i et derivat av pROpSTE34 som beskrevet for pROpSTE34. Dette derivat, pROpSTE34T1T2, inneholder et ca. 1 kb Hindlll-fragment ved 3'-enden av pST-kodende DNA, som inneholder transkripsjons-terminatoren T1T2fra E. coli rrnB-operonet (det ribosomale RNA B-operon).

EKSEMPEL 13

Konstruksjon av spiral- l- kombinasjonsmutantene A6TS11R+ E34 og P8TS11R+ E34

Dobbelmutasjon A6TS11R, hvorav alaninet i posisjon 6 blir erstattet med treonin, og serin i posisjon 11 er erstattet med arginin, blir kombinert med E34-mutasjonene (beskrevet i EP355460), hvor DNA som koder for cystein i posisjoner 183 og 191 blir erstattet med glutaminsyre. Det resulterende rpST-genet inneholder derfor mutasjoner i både NH2~(A6TS11R) og COOH-kodende regioner (E34) i rpST-DNA. Det resulterende plasmid blir betegnet pROpSTE-A6TS11R. Det forandrete, lille, rpST-inneholdende EcoRI/Smal-fragmentet fra pML/pGH14, som inneholder A6TSllR-mutasjonene, blir bundet til det store EcoRI/Smal-fragmentet fra plasmid pROpSTE-T1T2. Det sistnevnte plasmid er pST-ekspresjonsplasmidet som også inneholder den sterke transkripsjonsterminatoren fra E. coli rrnB-operonet ( T T2) ved 3•-enden i rpST-kodende DNA.

En annen dobbelmutasjon, p8TSHR, hvor prolin-kodende DNA i posisjon 8 blir mutert til å kode for treonin, og det serin-kodende DNA blir mutert til å kode for arginin blir kombinert med E34-mutasjonene (beskrevet i EP355460), hvor DNA som koder for cystein i posisjoner 183 og 191 blir erstattet med glutaminsyre. Det resulte-rende rpST-genet inneholder derfor mutasjoner i både NH2~

(P8TS11R) og COOH-kodende regioner (E34) i rpST-DNA. Det resulterende plasmid blir betegnet pR0pSTE-P8TSHR. Den samme strategi blir benyttet i konstruksjonen av pR0pSTE-P8TSHR som i pR0pSTE-A6TSHR, bortsett fra at plasmid pML/pGH18, som inneholder P8TS11R dobbelmutasjon blir benyttet som kilden for det forandrete rpST-DNA.

A6TS11R& I122L+ E34 og P8TS11R+ I112L+ E34

I112L-spiral-3-mutasjonen beskrevet ovenfor blir kombinert med hver av de to spiral-l-mutasjonene, A6TS11R og P8TS11R og E34-mutasjonene. De resulterende plasmidene blir betegnet henholdsvis pR0pST-SXE-A6TSHR+I122L og pML/pGH18-SXE-I122L. pROpST-SXE-A6TS11R+I122L blir konstruert ved å binde det lille I122L-inneholdende BssHII/HindIII-fragment med det store BssHII/Hindlll- fragment renset fra pR0pSTE-A6TSHR. Dette resulterende plasmid inneholder spiral-2-kassetten, definert av SacI og Xbal-restriksjonssetene som flankerer 5'- og 3'-enden til spiral-2-kodende DNA beskrevet tidligere, men som ikke inneholder T^^-transkripsjonsterminatoren. Plasmid pML/pGH18-SXE-I122L blir konstruert på en identisk måte, bortsett fra at plasmid pML/pGH18 blir benyttet som kilde for det store frag-mentet, som bærer P8TS11R dobbelmutasjonene. Dette forandrete plasmidet inneholder ikke T1T2~transkripsjonsterminatoren og har ikke spiral-2-kassetten.

EKSEMPEL 14

Stabilitetsprofiler av modifiserte rekombinante somatotropiner

Fremgangsmåten beskrevet for å bestemme stabilitets-profilene er som følger. Den konsentrerte løsningen av rekombinant (dyre) somatotropinderivat (opptil 100 mg/ml) i fosfatbuffret saltvann pH 7,4 (NaH2P04H20 3,45 g, Na2HPC>43,55 g, NaCl 9,50 g løst i destillert vann 1000 ml) blir laget. Væsken blir filtrert gjennom et millipor sterilt Millex-0,22 ixm filterenhet og 0,1 ml prøve plassert i rør. Disse blir plassert i en 43°C ovn og fjernet ved de ønskete intervallene. Inneholdende blir så fortynnet med fosfat-buf f ret saltvann. Supernatanten blir undersøkt for monomer- og dimerinnhold ved hjelp av HPLC. En massebalanse blir gjort. Alt utfelt materiale blir registrert. Resultatene blir sammenliknet med de første konsentrasjonene og en stabilitetsprofil laget.

Alternativt blir et somatotropinderivat som viser dårlig løselighet ved pH 7,4 løst opp ved en mindre foretrukket pH (4-10) eller blir evaluert som en suspensjon.

Resultatene av løsningsstabilitetsstudiene for de forandrete rpST-proteiner er oppsummert i tabell III.

Prosent løselighet er uttrykt som fraksjonen av det totale som forblir i løsning x 100 (se eksempel 14). Hvor fler enn én bestemmelse er utført, blir en gjennomsnittsprosentløselighet presentert, og antallet uavhengige bestemmelser gitt i parentes. rpST-mutanter er tilstede i enten A34 eller E34 bakgrunnene. A34 rpST inneholder alanin istedenfor cystein, i posisjoner 183 og 191. E34 rpST inneholder glutaminsyre istedenfor cystein i posisjoner 183 og 191.

EKSEMPEL 15

Hvpoks rottetestundersøkelse for å bestemme vekstøkninqen av dyr som mottar rekombinant ( svine) somatotropinforbindelser

Effektiviteten til de rekombinante svinesomatotropin-forbindelsen i den foreliggende oppfinnelse med hensyn til endring av veksthastigheten i dyr blir bestemt ved å benytte hypofysektomerte (hypox) rotteundersøkelser. De hypofysektomerte rottene lager ikke sitt eget somatotropin, og er følsomme for injisert somato tropin. Det målte resultat er vekst over en viss tidsperiode, slik som 10 dager og er presentert i tabell IV som prosent av den biologiske aktiviteten til den rpST-positive kontrollen, som er inkludert i hver undersøkelse.

Hvor flere enn én bestemmelse er gjort, blir et gjennomsnitt angitt med antallet bestemmelser vist i parentes.

EKSEMPEL 16

Lever radio- reseptormetode for å bestemme evnen til forandret rekombinant somatotropin til å binde til somatotropinreseptor in vitro

En in vitro radioreseptormetode blir benyttet for å vurdere evnen til de rekombinante svinesomatotropinene i den foreliggende oppfinnelse til å konkurrere med<125>I-rpST for binding til somatotropinreseptor fra rensete levermembraner. Resultatene av disse metodene er gitt som prosent rpST-binding og er vist i tabell IV.

EKSEMPEL 17

Nitrogenbalanse- eksperimenter utført med rpST- mutant I122L+ E34

For å evaluere biologisk aktivitet av endret rpST-proteiner som har I122L-mutasjonen in vivo, blir en nitrogen balansestudie utført som beskrevet i EP355460. Subkutan tilførsel av pST til voksende griser øker mengden protein avleiret i kroppen, primært som muskel. Bruken av en nitrogen balansetest gir et mål for forandring i mengde protein avleiret i et dyr. Siden protein inneholder en bestemt mengde nitrogen, vil analyse av for og ekskrementer for nitrogen gi et nøyaktig estimat av statur for proteinavleiring. Således er nitrogenbalanse et mål for mengden nitrogen opptatt fra foret og mengde utskilt i urin og avføring relatert til mengden beholdt (avleiret) ved differansen som kan beregnes. Nitrogenretensjon blir mest nøyaktig vurdert som mengde nitrogen tilbakeholdt som prosent av mengde nitrogen fordøyet (nitrogen inntatt minus avføringsnitrogen). I dette studiet har cysteinrestene i posisjoner 183 og 191 i rpST I122L-varianten blitt erstattet med glutaminsyre. Resultatene av denne analyse viser full biologisk aktivitet av det forandrete rpST-molekylet relativt til rpST-kontrollen.

EKSEMPEL 18

Bestemmelse av termisk stabilitet ved bruk av fluorescens-spektroskopi

Den termiske stabilitet til forandrer rpST blir undersøkt ved å måle den indre tryptofanfluorescens som en funksjon av temperatur. rpST-molekylet inneholder en enkel tryptofanrest, hvis indre fluorescens blir sterkt redusert i "naturlig tilstand". Økende temperatur, eller redusert pH, forårsaker en karakteristisk økning i fluorescens, som er sannsynligvis på grunn av et struktur-tap i det minste i det nære området til den vanligvis avsondrete tryptofanrest. En "smeltingsprofil" mellom fluorescens og økende temperatur avslører en sigmoidal kurve, hvor fluorescensen forblir redusert opptil en temperatur som er karakteristisk for en gitt rpST-forbindelse. En skarp øking i fluorescensen over et heller smalt temperaturområde følger så. Temperaturen som definerer midtpunktet i denne økingen i fluorescens er betegnet T(m)°9er et resultat av proteinets termiske stabilitet. T(. m), av rpST i den foreliggende oppfinnelse blir bestemt ved hjelp av fremgangsmåten til Burger et al, 1966, bortsett fra at 295 nm blir benyttet som eksitasjonsbølgelengde og emissjonsfluorescensen blir avlest ved bruk av et 355 nm avskjæringsfilter. T(m)av rpST i den foreliggende oppfinnelse er oppsummert i tabell IV. Disse resultatene viser en markert økning i T(m) på 79°C for I122L.

EKSEMPEL 19

Konstruksjon av I112L- mutasjonen ved hjelp av polymerase kj edereaksj onsmetoden

I122L-mutasjonen blir innført i rpST-genet ved sete-spesifikk mutagenese ved bruk av polymerase kjedereaksjons-teknologi som beskrevet av Sårkar og Sommer, 199 0, inntatt herved som referanse. De tre oligonukleotid-"primerne" som ble benyttet er oppført i tabell I og inkluderer oligonukleotidene SacI293, L120-3 og PvuII634. rpST gen-inneholdende EcoRI/HindIII-fragmentet fra plasmid pGEMpST-SX blir benyttet som templat. Femten cykler av polymerase kjedereaksjon (heretter referert til som PCR) blir utført på 1 ng templat rpST DNA med 1 mM hver av L120-3 og PvuII634 oligonukleotidprimere, dNTP'er og Taq DNA-polymerase, som spesifisert av produsenten. Denne reaksjonen resulterer i et 227 bp DNA-fragment, som inneholder I122L-mutasjonen. Dette fragment blir renset ved agarosegel-elektroforese og benyttet som en PCR-"primer" sammen med oligonukleotidprimeren SacI293 og rpST-inneholdende EcoRI/Hindlll-templatfragment i 15 ytterligere cykler av PCR. Det resulterende 361 bp fragment blir klyvet med restriksjons- endonukleasene SacI og PvuII, renset ved hjelp av agarosegel-elektroforese og ligert inn i det store gel-rensete, SacI/PvuII pGEMpST-SX DNA-fragment. Sammenbindingsblandingen blir overført inn i HB101-kompetente celler. Plasmid DNA i de resulterende transformantene blir undersøkt for tilstedeværelsen av I122L-mutasjonen nøyaktig som beskrevet for L118E, bortsett fra at oligonukleotid L120-3 blir benyttet som radiomerket hybridiserings-"probe<n>og bare én runde av undersøkelser blir utført. Tilstedeværelsen av I122L mutasjonen og fravær av ytterligere mutasjoner på grunn av PCR-reaksjonene blir bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. Plasmidet som har denne mutasjonen blir betegnet pGEMpST-SX-I122LpcR.

EKSEMPEL 20

Rekonstruksjon av rpST- mutasjon I122L og overføring til et plasmid som egner seg for produksjon i gjær

For å uttrykke I122L-mutasjonsbærende rpST-genet i gjæren, Saccharomyces cerevisiae, må rpST-kodende DNA bli operativt bundet til en promotorsekvens som stammer fra denne gjær. Endene til det lille rpST-bærende NdeI/HindIII-fragmentet fra pR0pST-SXE-I122L blir gjort likeendet ved hjelp av behandling av DNA med det store Klenow-fragmentet til DNA polymerase I etter at plasmidet er spaltet med Ndel og Hindlll. Dette fragment blir renset ved gel-elektrof orese og koblet med det store Sall/Sphl-fragment fra plasmid og betegnet YEp352-2. Endene til det sistnevnte fragmentet blir gjort likeendet ved behandling med Sl nuklease. Dette plasmid er en YEp352-forbindelse, som er blitt modifisert til å inneholde i tillegg den divergente GAL1/GAL10 promotor (Johnston og Davis, 1984), og 3<1->ikke-translatert område som stammer fra ST7-genet (Teague et al., 1986). Det resulterende plasmid blir betegnet YEp352-pST-I122L (fig. 5).

Ekspresjon av denne rpST-variant i gjær blir utført ved å dyrke gjærcellene transformert med dette plasmidet i et syntetisk komplett medium (Sherman, Fink og Hicks, 1986) som mangler uracil og inneholder 2% galaktose som den eneste karbonkilde ved 3 0°C i flere timer, eller hvor lenge som er nødvendig for å oppnå maksimal rpST geninduksjon og rpST-produksjon. Skjønt enhver gjærstamme som har en mutasjon i URA3-genet kan bli benyttet som vert, er det å foretrekke å benytte en gjærstamme som mangler proteaseproduksjon og er GAL+, slik som BJ5457 (genotype MATa pep4::HIS3 prbl-Å trip ura3-52 Ieu2-Å his-3-Å lys2-801 canl GAL+). Denne stamme er levert til Yeast Genetic Stock Center, University of California, BJ5457.

REFERANSE

1. Abdel-Meguid et al. (1987), Proe. Nati. Acad. Sei., USA 84, 6434-6437.

2. Brems (1988), Biochemistry 27, 4541-4546.

3. Brems et al. (1986), Biochemistry 25, 6539-6543.

4. Brems et al. (1988), Proe. Nati. Acad. Sei., USA 84, 3367-3371. 5. Burger, H.G., Edelhoch, H. og Condliffe, P.G. (1966),

Endocrinology 78, 98-102.

6. Chen, W.Y. et al. (1990), Proe. Nati. Acad. Sei USA 87, 5061-5065. 7. Johnston og Davis (1984), Molecular and Cellular Biology 4, 1440-1448.

8. Sårkar og Sommer (1990), Biotechniques 8, 404-407.

9. Teague et al. (1986), Proe. Nat. Acad. Sei USA 83, 7371-7375. 10. Sherman, F. Fink, G.R. og Hicks, J.B. (1986), "Laboratory Course Material for Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 163-168.

Claims

1. Svine-somatotropin,karakterisert vedat det omfatter en dobbeltmutasjon av somatotropinet i alfa-heliks 1-regionen som derved gjør somatotropinet mer løselig enn den naturlige form av somatotropinet, mens den biologiske aktivitet opprettholdes i en vedvarende frigjøringsformulering, og hvor nevnte alfa-heliks 1 dobbeltmutasjon er valgt fra gruppen bestående av A6TS11R eller P8TS11R som beskrevet i beskrivelsen.

2. Svine-somatotropin ifølge krav 1, karakterisert vedat det i tillegg omfatter en mutasjon av somatotropinet i alfa-heliks 3-regionen som derved gjør somatotropinet mer løselig enn den naturlige form av somatotropinet, mens den biologiske aktivitet opprettholdes i en vedvarende frigjøringsformulering, og hvor nevnte alfa-heliks 3 mutasjon er I122L som beskrevet i beskrivelsen.

3. Somatotropin ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat av de fire (4) cysteiner i somatotropinet, to i den lille sløyfen og to i den store sløyfen, er minst én (1) erstattet med aminosyrene som enkeltvis utvelges fra gruppen bestående av arginin, lysin, asparaginsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin, histidin, alanin, glycin, isoleucin, leucin, valin, fenylalanin, tryptofan, tyrosin, metionin, serin, treonin eller prolin.

4. Somatotropin ifølge krav 3,karakterisert vedat aminosyrene enkeltvis utvelges fra gruppen bestående av glutaminsyre eller alanin.

5. Somatotropin ifølge krav 4,karakterisert vedat cysteinene i posisjonene 183 og 191 erstattes med glutaminsyre.

6. Somatotropin ifølge krav 1,karakterisert vedat somtotropinet er met-asp-gln-des(ala) svine-somatotropin.

7. Somatotropin ifølge krav 2,karakterisert vedat somatotropinet er met-asp-gln-des(ala) svine-somatotropin.