HU215947B - Eljárás alfa-hélix 1, vagy alfa-hélix 1 és alfa-hélix 3 régiójukban módosított szomatotropinok előállítására - Google Patents
Eljárás alfa-hélix 1, vagy alfa-hélix 1 és alfa-hélix 3 régiójukban módosított szomatotropinok előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU215947B HU215947B HU913723A HU372391A HU215947B HU 215947 B HU215947 B HU 215947B HU 913723 A HU913723 A HU 913723A HU 372391 A HU372391 A HU 372391A HU 215947 B HU215947 B HU 215947B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mutation
- rpst
- helix
- dna
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 9
- 230000004075 alteration Effects 0.000 title 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 192
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 21
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 19
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 19
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 19
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 19
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 19
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N Asp-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 80
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 99
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 90
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 68
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 48
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 48
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 28
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 17
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 17
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 10
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 102220220042 rs1060501784 Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 102200082905 rs35203747 Human genes 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 4
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000004106 carminic acid Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 2
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 2
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000617670 Escherichia coli K2 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102220465858 La-related protein 4_L15A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101150086611 Ste gene Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220505380 Ubiquitin thioesterase ZRANB1_M26A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010018600 ribonucleotide polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102220074265 rs180177184 Human genes 0.000 description 1
- 102200090386 rs864309504 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 101150080291 ste7 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Mold Materials And Core Materials (AREA)
- Battery Electrode And Active Subsutance (AREA)
- Secondary Cells (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Compositions Of Oxide Ceramics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
Abstract
A találmány szerinti helyirányítőtt műtagén eljárással előállítőttszőmatőtrőpin-analógők a natív szőmatőtrőpin a-hélix 1 régiójábankettős műtációt tartalmaznak, vagy az <F Symből">a-hélix 1 régiónkívül az a-hélix 3 régióban is tartalmaznak egyszeres műtációt, éskívánt esetben a natív aminősavszekvencia egyéb részében istartalmaznak megváltőzőt aminősavakat. A kapőtt analógők stabilak, ígynyújtőtt hatású készítményekben alkalmazhatók, űgyanakkőr megtartják anatív szőmatőtrőpin biőlógiai aktivitását. ŕ
Description
A találmány olyan új szomatotropin-analógok előállítására vonatkozik, amelyek csak α-hélix 1 régiójukban vagy a-hélix 3 régiójukban is más aminosav(ak)at tartalmaznak, mint a természetes szomatotropinok.
Exogén szomatotropin-adagolással különféle állatfajták, különösen a haszonállatok, például sertés, de bizonyos halfajták fejlődése is jelentősen fokozható. Az állatállomány e fokozott fejlődését rendszerint az izomtömeg-gyarapodás fokozódása jellemzi, a zsír egyidejű csökkenésével, amelynek következtében az állatok nagyobbak és soványabbak lesznek. Az exogén szomatotropinnal kezelt állatok takarmányhasznosítása is jelentősen fokozódik, ami a tömeggyarapodás növekedéséből és ezzel egyidejűleg a takarmányfogyasztás csökkenéséből adódik.
A szomatotropin exogén adagolása különféle módokon valósítható meg, például naponta injekciózással. Bizonyos esetekben azonban másféle adagolási módok előnyösek. Bizonyos állatok kezelésére célszerű lehet például egy beültetett eszköz, amely meghatározott időtartamon keresztül biztosítja a szomatotropin nyújtott felszabadulását. Az adagolás még előnyösebb módja olyan implantált eszközzel valósítható meg, amely meghatározott időtartamon keresztül nyújt lassú hatóanyagfelszabadulást. Az ilyen eszköz igen nagy mennyiségű szomatotropint tartalmazhat, igen nagy koncentrációban (mintegy 500 mg/ml). Az ilyen adagolási módhoz olyan szomatotropin-molekula szükséges, amelynek nagy az oldhatósága, és kevésbé hajlamos oldhatatlan, biológiailag inaktív aggregátumok képzésére.
A szomatotropinok négy α-hélixet tartalmaznak, amelyek együtt α-hélixköteget alkotnak. Ezek aminosavszekvenciáit is ismertették különböző fajok esetén [Abdel-Meguid és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6434-6437 (1987)]. A feltételezések szerint a fenti szerkezet magjában lévő aminosav-oldalláncok apolárosak, hidrofóbok és tömör elrendeződésűek, ezáltal megakadályozzák egy poláros oldószer (például víz vagy sóoldat) bejutását a köteg közepébe. A marha-szomatotropin esetében - amely elsődleges szekvenciáját tekintve a sertés-szomatotropinhoz hasonló - az O-hélix 3 hidrofób felületét (tyrn0-leui27aminosavmaradékok) 1 mg/ml-t meghaladó proteinkoncentrációnak kitéve előtérbe kerül az „asszociatív intermedierek” kialakulása, amely az aggregátumképződésben feltételezetten a magkialakulásnak egyik lépése [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986); és Brems, Biochemistry 27, 4541 -4546 (1988)]. Ezek az asszociatív intermedierek az egyes szomatotropin molekulákból származó α-hélixek multimer szerkezetet eredményező réteges burkolat elrendeződését képviselhetik, amelyben a fenti hélix hidrofób felületei a vizes környezettől elzáródnak. Az asszociatív intermedierek kialakulása ahélix 3-tartalmú proteinfragmens feleslegének hozzáadásával megakadályozható [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986)]. Továbbá, a fenti hélix hidrofób felületének növelése a 112-es helyzetű lizin leucinra való cseréjével erősen fokozza az asszociatív intermedierek kialakulásának tendenciáját [Brems, Biochemistry 27, 4541-4546 (1988)].
A találmány célja a natív szomatotropinnál jobban oldódó szomatotropinok előállítása volt, amelyek ugyanakkor oldatban stabilak, tehát nyújtott hatású készítményekben biológiai aktivitásukat megtartják. A kitűzött feladatot a találmány értelmében az a-hélix 1 régióban végrehajtott helyirányított mutációval oldottuk meg.
Az α-hélix 1 régióba bevezetett mutációk mellett kívánt esetben az a-hélix 3 régióba is bevezethetünk helyirányított mutációt, hogy oldatban in vitro stabilabb szomatotropinokat nyerjünk. A mutagenezis helye mind a hidrofób, mind a hidrofil felület lehet. Ismert ugyanis, hogy a marha-szomatotropin a-hélix 3 régiójában újabban végrehajtott helyirányított mutációk a mutáns szomatotropint expresszáló transzgén egerek növekedésgátlását eredményezték, amiből arra lehet következtetni, hogy az a-hélix 3 régió a biológiai aktivitás szempontjából fontos régió [Chen W. Y. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5061-5065 (1990)].
Ezenkívül kívánt esetben az α-hélix 1 régióban vagy az α-hélix 1 és a-hélix 3 régióban létrehozott mutációkat további mutációval kombinálhatjuk úgy, hogy a szomatotropin kis hurokjában lévő kettő, és nagy hurokjában lévő kettő, összesen négy ciszteinmaradék közül legalább egyet más aminosavmaradékkal helyettesítünk. Például a 183. és 191. helyzetű ciszteineket kódoló kodonok kettős mutációját hajtjuk végre, amikoris a cisztein kodonját az alanin vagy glutaminsav kodonjával helyettesítjük, hogy a kitűzött célnak megfelelő, azaz jobban oldódó, oldatban stabilabb, tehát nyújtott hatású készítményekben jobban alkalmazható sertésszomatotropint nyerjünk. A 183. és 191. helyzetben végrehajtott kettős mutációkat ismerteti az EP 355460 számú szabadalmi leírás. Az itt ismertetett mutációk alkalmazásával fokozott oldhatóságú (stabilitású) szomatotropinok állíthatók elő, amelyek ezáltal a nyújtott hatóanyag-felszabadulás szempontjából jobb tulajdonságokkal rendelkeznek. A sertés-szomatotropin különösen hasznos nyújtott hatóanyag-felszabadulást biztosító formában, ezért ez a szomatotropin áll az érdeklődés középpontjában.
A találmány szerinti mutációk különösen hasznos példája az I122L mutáció, amelyben az a-hélix 122. helyzetében lévő izoleucint leucinnal helyettesítjük. A 183. és 191. helyzetben végrehajtott mutációkkal kombinálva, amikoris a ciszteineket alaninnal helyettesítjük, jelentős növekedést érünk el a protein egyetlen triptofánmaradékának átmeneti hőmérsékletében. Az átmeneti hőmérséklet a protein hőstabilitásának mértéke. Az egyik legelőnyösebb mutációval fokozott oldatstabilitást érünk el akkor, ha az I122L mutációt olyan mutációkkal kombináljuk, amikor a ciszteinkodonokat a 183. és 191. helyzetben glutaminsav-kodonokkal helyettesítjük. Egy másik előnyös mutációval úgy érünk el fokozott oldatstabilitást, hogy az α-hélix 1-ben végrehajtott kettős A6TS11R vagy P8TS11R kettős mutációt olyan mutációkkal kombináljuk, amelyekben az aminosavszekvencia 183. és 191. helyzetében lévő ciszteinmaradékok kodonjait glutaminsav-kodonokra cseréljük.
HU 215 947 Β
Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük.
1. ábra: Rekombináns sertés-szomatotropin (rpST) DNS restrikciós térképe
A széles, megszakítás nélküli vonal a rpST DNS aminosav kódoló régióját jelenti; a keskeny vonal jelenti az 5’- és 3’-végen a nem kódoló DNSszekvenciát. A helyirányított mutagenezisnek alávetett rpST-gén régiókat beszámoztuk és megjelöltük a restrikciós térképen, 1 jelenti az α-hélix 1 -et kódoló DNS-t, 2 az α-hélix 2-t kódoló DNS-t, 3 az α-hélix 3-at kódoló DNS-t és 4 a 183. és 191. helyzetben (kis hurokban) lévő ciszteint kódoló DNS-t. A térkép feletti betűk jelölik a különféle restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek elhelyezkedését,
Rí jelentése EcoRi, N jelentése Ndel,
B jelentése BssHII, S jelentése SacI,
X jelentése Xbal, Sm jelentése Smal és
H jelentése Hindlll.
2. ábra: pEFF-902 plazmid szerkezete és restrikciós térképe
Ez a plazmid tartalmazza a pBR322 replikációs origót (Őri) és ampicillinrezisztencia gént, PL promotert, a lambda-bakteriofágból a cll riboszóma-kötőhelyet és a cl represszorgént, az E. coli rmB operonból a T|T2 transzkripciós terminátort, egy 60 bázispárból álló, promoterek nélküli szekvenciát a deo regulátor régióból és az rpST gént, amelynek rövidítése pGH. A megfelelő restrikciós helyeket megjelöltük. Az rpST-t tartalmazó DNS-t ebből a plazmidból vágjuk ki EcoRi és Hindlll restrikciós enzimekkel végzett kezeléssel, és pGEM3z (f+) mutagén vektorba klónozzuk az alábbiakban ismertetett módon.
3. ábra: pGHGEM3Z szerkezete és részleges restrikciós térképe
Ez a fagmid tartalmazza az fi DNS replikációs origót, a pBR322 replikációs origót (Őri) és ampicillinrezisztencia gént, az SP6 és T7 promotereket, a lambda-bakteriofágból a lacZ gén cll riboszóma kötőhelyet és az rpST gént, amelynek rövidítése rpGH. Egyszálú fagmid DNS-t alkalmazunk templátként a helyirányított mutagenezisben az alábbiakban ismertetett módon.
4. ábra: pROpST bakteriális expressziós vektor alkalmazása rekombináns sertés-szomatotropinok előállítására baktériumokban (E. coli)
A cll riboszóma-kötőhely az EcoRi és Ndel restrikciós helyek között helyezkedik el. Az rpST transzlációs iniciáló kodonja az Ndel helybe van beágyazva. Az expressziót a PL promoter segíti elő.
5. ábra: YEp352-pST-I122L élesztő expressziós plazmid szerkezete
Ez a plazmid a YEp352 származéka, és az I122L mutációt tartalmazza, amelynek expresszióját a S. cerevisiae-ből származó, indukálható GÁLI/GÁL 10 promoter segíti elő. A 3’ nem transzlatált DNS az élesztő STE génből származik. A 2 pm-es elem segíti a plazmidreplikációt élesztőben, és az URA3 szelektív markert szolgáltat a transzformáns kiválasztására élesztőben. A plazmid tartalmazza a pBR322 replikációs origót (nincs bejelölve), és az ampicillinrezisztencia gént is.
6. ábra: Rekombináns sertés-szomatotropin aminosavszekvenciája és a kódoló DNS-szekvencia.
A találmány tárgya tehát eljárás a sertésszomatotropin-molekula α-hélix 1 régiójában kettős mutációt és kívánt esetben a-hélix 3 régiójában egyes mutációt tartalmazó szomatotropinok előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított sertés-szomatotropin stabilabb (oldhatóbb), mint a szomatotropin natív formája, és biológiai aktivitását megtartja, ha a szomatotropint nyújtott hatóanyag-leadású készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti eljárással előállított szomatotropin előnyösen sertés-szomatotropin, de lehet humán-, marha-, juh-, kecske-, ló-, hal- és számyas-szomatotropin is. Szomatotropin alatt minden olyan szomatotropint értünk, amely a natív szomatotropin-molekula egyéb részeiben aminosavdeléciót, -addíciót vagy -cserét tartalmaz. Ilyenek például a módosított (szubsztituált vagy eliminált risztéinek) vagy derivatizált szomatotropinok, amelyekben a ciszteinmaradékok közül 1 -4 az alábbi aminosavakból származó maradék(ok)kal van(nak) helyettesítve: arginin, lizin, aszparaginsav, glutaminsav, aszparagin, glutamin, hisztidin, alanin, glicin, izoleucin, leucin, valin, fenilalanin, triptofán, tirozin, metionin, szerin, treonin vagy prolin; vagy amelyekben mind a négy risztéin ciszteinsawá van alakítva.
A találmány egyik célja tehát olyan új szomatotropinok előállítása volt, amelyek oldhatóbbak, mint a molekula natív formája, és így biológiailag hatásosak, ha gyógyászati készítménnyé, előnyösen nyújtott hatóanyag-leadású készítménnyé alakítjuk. A fenti célokat önmagában ismert helyirányított mutációs technikák alkalmazásával oldottuk meg. A találmány fenti és további céljai a leírás következő részeiből világosan kitűnnek.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott plazmidok, DNS-szekvenciák és mikroorganizmusok az American Cyanamid Company törzsgyűjteményében (Princeton, New Jersey), és a Budapesti Szerződés értelmében az American Type Culture Collection-ben (ATCC) (Rockville, Maryland 20952, USA) is letétbe vannak helyezve, ha azt másként nem jelezzük.
Az alábbi DNS-eket 1988. augusztus 23-án helyeztük letétbe az ATCC-ben: pGEMpST-SX (ATCC 40482), pRO211 (ATCC 40483) és pEFF-902 (ATCC 40484). Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy ezek a DNS-ek bármely megfelelő expressziós rendszerbe beépíthetők a találmány szerinti szomatotropinok vagy mutánsaik előállítására.
A találmány szerinti új állati szomatotropinok egy részét expresszáló E. coli KI2 baktériumtörzseket szintén 1988. augusztus 23-án helyeztük letétbe az ATCCben. Ezek a baktériumtörzsek az alábbiak: E. coli 1655 (ATCC 67762), 1655/pROpSTA34 (ATCC 67763) 1655/pROpSTE34 (ATCC 67764) k655/pROpST (ATCC 67765), 4200 (ATCC 67766), 4200/pROpSTA34
HU 215 947 Β (ATCC 67767), 4200/pROpSTE34 (ATCC 67768), 420/pROpST (ATCC 67769), 4255 (ATCC 67770), 4255/pROpST A34 (ATCC 67771), 4255/pROpSTE34 (ATCC 67772), 4255/pROpST (ATCC 67773) és 4300 (ATCC 67774).
Az alábbi E. coli KI2 törzseket szintén letétbe helyeztük az ATCC-nél 1990. szeptember 21-én: pROpST-SXE-Q21HH22R (ATCC 68410), pROpST-XSE-G121A (ATCC 68411), pROpST-SXE-A6TSl ÍR (ATCC 68412), pROpST-SXA-S81, 87L+I122L (ATCC 68413), pROpST-SXA-S81, 87L (ATCC 68414), pROpST-SXA-L82, 84Q+L115K (ATCC 68415), pROpST-SXA-L82, 84Q (ATCC 68416), pROpST-SXE-I122L (ATCC 68417), pROpST-SXE-I122L (ATCC 68418), pST-SX (ATCC 68419), pROpST-SXA-Ll 18E (ATCC 68420), pROpST-SXA-El 19LQ123L (ATCC 68421), pROpST-SXA-I122E (ATCC 68422), pROpST-SXA-M126A (ATCC 68423) és pROpST-SXE-A6TSllR+I122L (ATCC 68424).
A találmány szerinti eljárásban az állati szomatotropinokat helyirányított mutagenezissel állítjuk elő, de más módon is előállíthatjuk ezeket, például a peptidek és/vagy proteinek kémiai szintézisével. A DNS klónozott szegmensében lévő DNS-szekvencia megváltoztatásához egy meghatározott helyen a jelenleg alkalmazott technikák szerint elő kell állítani ennek a DNS-nek az egyszálú formáját. Az egyszálú DNS-t egy szintetikus oligonukleotidhoz kapcsoljuk, amely ennek a DNS-nek egy részével komplementer, azzal az eltéréssel, hogy az oligonukleotidban van hibás párosítású régió is. A nem odaillő régió rendszerint az oligonukleotid központi részében helyezkedik el. Bizonyos esetekben az oligonukleotid tartalmaz egy restrikciós endonukleáz-felismerőhelyet is a mutáció helyén vagy annak közelében. A kapcsolt elegyet ezután kettős szálúvá alakítjuk és E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmense és dezoxinukleotidtrifoszfát hozzáadásával, T4 DNS-ligáz és adenozin-5’foszfát jelenlétében kovalensen zárjuk. A kettős szálú DNS-t ezután megfelelő E. coli törzsbe transzformáljuk, amely a DNS hibás párosítású régióját kijavítja és a DNS-t replikálja.
Két klónpopulációt kapunk. Attól függően, hogy a javító (repair) szintézisben melyik szál szerepel templátként, a klón vagy a vad típust vagy a megváltozott (mutáns) szekvenciát tartalmazza. Az oligonukleotid szekvenciájának megfelelő mutánsszekvenciát tartalmazó kiónokat a radioaktívan jelzett oligonukleotidokkal való hibridizálással szelektáljuk. Az oligonukleotid és a vad típusú szekvencia közötti hibás párosodás következtében a radioaktívan jelzett oligonukleotidok stabilabban kötődnek a mutáns szekvenciát tartalmazó kiónokhoz. Ezért megfelelő hőmérsékleten végzett inkubálás segítségével a vad típusú és a mutáns kiónok megkülönböztethetőek. Abban az esetben, ha az oligonukleotid egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet is tartalmaz, a vizsgált kiónokat olyan endonukleázzal emésztve, amelyet ez a hely felismer, kiválaszthatjuk azokat a kiónokat, amelyek a mutáns szekvenciát tartalmazzák, ami újabb eszközt jelent a vad típusú és mutáns kiónok megkülönböztetésére. Az azonosított ki ónokban bekövetkezett változásokat ezután az érintett régiók DNS-szekvenálásával erősíthetjük meg.
A kívánt mutáció(ka)t tartalmazó plazmidklónok restrikciós fragmenseit ezután standard szubklónozási eljárásokkal expressziós plazmidokká alakítjuk, amelyek alkalmasak a mutáns géntermék expresszálására vagy baktériumban vagy élesztőben (de mindkettőben nem).
A találmány szerinti eljárással előállított módosított rekombináns szomatotropinok képviselőjeként a rekombináns sertés-szomatotropint (rpST), valamint az ennek előállítására szolgáló eljárást ismertetjük részletesen az alábbiakban, természetesen a korlátozás szándéka nélkül. Az ismertetés referenciaként tartalmaz olyan részeket is, amelyek nem tartoznak az oltalmi körbe.
A rekombináns sertés-szomatotropin aminosavszekvenciája és a kódoló DNS-szekvencia a 6. ábrán látható.
A legelőnyösebb rekombináns sertés-szomatotropin 193 aminosavat tartalmazó polipeptid, amelyben az aminoterminális úgy van módosítva, hogy 3 további aminosavat (met, asp, gin) tartalmaz, és a hipofízis eredetű sertés-szomatotropin bizonyos érett formáiban megtalálható első aminosav (ala) hiányzik. A találmány szerinti eljárással módosítható azonban a 191 aminosavból álló pST, valamint ennek egyéb származékai, például az NH2-végen végrehajtott delécióval vagy addícióval és/vagy a COOH-végen végrehajtott delécióval és/vagy addícióval nyert szomatotropinok is.
Rekombináns pST: NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala185 aminosav-ala-phe-COOH hipofízis pST: NH2-ala-phe-pro-ala-185 aminosav-alaphe-COOH
Ez a módosítás tisztán két aminosavval való növekedést jelent a rekombináns pST proteinben, és az EP 355460 számú szabadalmi leírásban van ismertetve. A rekombináns sertés-szomatotropin mutagén származékainak elnevezésére alkalmazott számozási rendszer tükrözi ezt a növekedést, és szakember számára könnyen alkalmazható.
pGEMpST—SX DNS előállítása
Az összes mutagenezis-reakcióban templát-DNS-ként használt egyszálú pGEMpST-SX DNS-t pGHGEM3Z DNS-ből állítjuk elő helyirányított mutagenezissel.
pGHGEM3Z
A sertés-szomatotropin (rpST) gént pGEM-3z (f+) fagmidban klónozva pGHGEM3Z-t kapunk az alábbi általános eljárás szerint. A sertés-szomatotropin (rpST) gént tartalmazó pGHGEM3Z DNS-fragmenst a pEFF-902 bakteriális expressziós plazmidból izoláljuk, EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel végzett hasítással (1. ábra). Az rpST-gént tartalmazó fragmenst ezután agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. A kettős szálú pGEM-3z (f+) fagmid-DNS-t EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, borjúból EcoRI lúgos foszfatázzal kezeljük és a nagy fragmenst agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. A két tisztított fragmenst ezután összekeverjük és T4 DNS-ligázzal ligáljuk. Az elegyet baktériumokba transzformálva számos telepet kapunk.
HU 215 947 Β
A plazmid DNS-t standard lúgos lizálással állítjuk elő és szerkezetét megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel határozzuk meg. A kívánt fragmenst tartalmazó kiónt izoláljuk és pGHGEM3Z-nek nevezzük.
pGEMpST-SX
Ezzel a mutációval célunk olyan rpST DNS-szekvencia előállítása volt, amelyben az Ó-hélix 2 régiót kódoló DNS-szekvencia az 5’-oldalon (a DNS kódoló régiójának 225-230. helyzete) egy Sacl restrikciós hellyel, és a 3’-oldalon (285-290. helyzet) egy Xbal restrikciós hellyel kapcsolódik. A DNS-szekvencia eme változásai nem változtatják meg az rpST protein aminosavszekvenciáját. A fenti restrikciós endonukleáz hasítási helyek jelenléte egy „hélix 2 kazettá”-t hoz létre, ezáltal az Óhélix 2-t kódoló DNS-ben bekövetkezett mutációk kényelmesen és gyorsan kombinálhatok az Ó-hélix 3-at kódoló DNS megfelelő mutációival. A pGEMpST-SX szerkesztését az alábbiakban ismertetjük.
A szintetikus SacI293 és XbaI353 oligonukleotidok DNS-szekvenciája az 1. táblázatban található. A mutagenezis szubsztrátja az egyszálú pGHGEM3Z DNS, amelyet tisztított fágból állítunk elő standard eljárásokkal. 2000 ng fenti DNS-t 100 ng SacI293 és 100 ng XbaI353 oligonukleotiddal elegyítünk, amelyeket 5'-végükön adenozin-5’-trifoszfáttal és T4 polinukleotidkinázzal foszforileztünk. Az elegyet 10 μΐ végtérfogatban tartalmazza az lx illesztő puffer (lx illesztő puffer összetétele: 75 mmol/1 KC1 és 5 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0). Az elegyet 65 °C-on 7 percen keresztül melegítjük, majd 10 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ez az eljárás lehetővé teszi azt, hogy az oligonukleotidok az egyszálú szubsztrát (templát) DNS-hez illeszkedjenek. A hozzáillesztett molekulákat betöltjük és kovalensen zárt, kettős szálú DNS-sé alakítjuk 22 μΐ H2O, Ιμΐ 20 mmol/1 koncentrációjú ATP, 2 egység T4 DNS-ligáz és 2 egység DNS-polimeráz I nagy fragmens [az egységek definíciója a New England Biolabs katalógusban (1989) található], 2 μΐ 20xdNTP (a négy dezoxiribonukleotid-5’-trifoszfát elegye, az egyes komponensek koncentrációja 2 mmol/1) és 4 μΐ 10χ „betöltő” puffer (1 χbetöltőpuffer összetétele: 27,5 mmol/1 TrisHCl, pH 7,5,15 mmol/1 MgCl2, 2 mmol/1 DTT). Az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd a reakcióelegy felét ismert módon HB101 kompetens sejtekbe visszük. 37 °C-on egy éjszakán keresztül tartó inkubálás után láthatóvá válnak az egyes telepek. 24 telepből ismert eljárással plazmid DNS-t állítunk elő, és külön-külön Sacl és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Azokat a plazmid DNS-eket, amelyek mindkét restrikciós helyet tartalmazzák - ami azt jelenti, hogy mind a SacI293, mind az XbaI353 oligonukleotid beépült az rpST génbe - HB101 kompetens sejtekbe való bevezetéssel a fent leírtak szerint tovább tisztítjuk. A plazmid DNS-t preparáljuk és a plazmid DNS-ben az egyes restrikciós helyek jelenlétének igazolására különkülön Sacl-gyel és Xbal-gyel emésztjük, majd az rpST DNS megfelelő régióinak DNS-szekvenciaanalízisével megerősítjük az eredményt.
1. táblázat: Mutagén oligonukleotidok
| Név | Szekvencia (5’-3’) | Mutáció |
| Sacl293 | GACGTGGAGCTCCTGCGCTTCTCG | hélix 2 kazetta |
| XbsI353 | CAGTTCCTCTCTAGAGTCTTCACC | hélix 2 kazetta |
| S81L | TGCGCTTCTTGCTGCTGC | S81,87L |
| S87L | TCATCCAGTTGTGGCTCG | S81.87L |
| Q8082 | TGCGCTTCTCGCAGCTGCAGAT CCAGTCGTGG | L82,84Q |
| Q8082D | TTCTCGCAGCTGCAGATGCAGT | L82, 84Q detektálási próba |
| KI 13 | CTACGAGAAGAAGAAGGACCTG | L115K |
| Ellő | GCTGAAGGACGAGGAGGAGGGC | L118E |
| K113E115 | GTCTACGAGAAGAAGAAGGACG AGGAGGAGGGCAT | L115KL118E |
| K113E116D | AGAAGAAGAAGGACGAGGAGGA | KI 13E116 próba |
| E116K120 | AAGCTGAAGGACGAGGAGGAGG GCAAGCAGGCCCTGATG | L118EI122K |
| E120 | GGAGGAGGGCGAGCAGGCCCTG | I112E |
| L120-3 | GGAGGAGGGCCTGCAGGCCCTG | I122L |
| A124-2 | CAGGCCCTGGCACGGGAGCTGG | Ml 26 A |
| E113EHD0116 | CGCGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC (GC) A (GC)GAGGAGGGCATCCAG | L115E |
| E113D | CGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC | L115E konstrukciós próba |
| L115A | CTACGAGAAGGCGAAGGACCTG | |
| L118A | GCTGAAGGACGCGGAGGAGGGC |
HU 215 947 Β
1. táblázat (folytatás)
| Ncv | Szekvencia (5’ - 3 ’) | Mutáció |
| L118TK | CTGAAGGACA (CA) AGAGGAGGGCAT | L118K |
| L118T | CTGAAGGACACTGAGGAGGGC | L118T |
| LI 17, 121 | GAAGGACCTGCTGGAGGGCAT CCTGGCCCTGATG | E119LQ123L |
| Leull7121D | CCTGCTGGAGGGCATCCTGGCC | El 19LQ123L próba |
| K114R/Accl | GACCGCGTATACGAGCGTCTGAAGGA | K114R |
| G121A/Xmnl | CTGGAGGAAGCTATTCAGGCCCTG | G121A |
| K116R/BglII | AGAAGCTGCGAGATCTGGAGGA | K116R |
| A14D/Hindlii | CCTTGTCAAGCTTATTTGACAACGCCG | A14D |
| A6T | TCAATTCCCAACCATGC | A6T |
| S11RA14D/Sal | ATGCCCTTGAGTCGACTAT TTGACAACGCC | S11RA14D |
| G21HH22R/C1AI | CCGGGCCCATCGATTGCACCAA | Q21HH22R |
| PvuI1634 | AGAAGGCAGAGCTGCTGTCCAC | I122Lpcr |
Mutációk előállítása az <J.-hélix 1 vagy 3 régióban
A pGEMpST-SX-ben lévő rpST gén mutagenezisét az alábbiak szerint végezzük. A mutagenezis célja olyan rpST-molekula előállítása, amely kevésbé hajlamos aggregálódásra nagy (>100 mg/ml) proteinkoncentrációk esetén. A célzott hely az a-hélix 3 régió hidrofób felülete, a 112-129. aminosavmaradékokat tartalmazó szakasz, amely feltételezetten kritikus az aggregálódási reakció kiváltásában [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986)]. Mivel az általunk alkalmazott rpST gén az aminoterminálison két további aminosav-kodont is tartalmaz, az aminosavmaradékok száma összesen 193, szemben a hipofízis eredetű marhaés sertés-szomatotropinban talált 191 aminosavmaradékkal. A 112-129. maradékok a marha-szomatotropin 110-127. maradékának felelnek meg [Abdel-Meguid és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 6434-6437 (1987)]. A mutagenezis egyéb célzott régiói a molekulában az a-hélix 3 hidrofil felülete és az α-hélix 1 6-11. aminosav maradéka. A kombinált mutánsokat több lépésben kivitelezett mutagenezissel, vagy a megfelelő régiók szubklónozásával állítjuk elő. Az alábbiakban ismertetjük az L118E mutáció végrehajtására szolgáló alapeljárást, és példaszerűen ismertetjük a többi mutáció létrehozását is. Az alapeljárás különféle módosításait a megfelelő példákban adjuk meg.
Az egyszálú pGEMpST-SX szubsztrát DNS-t ugyanúgy állítjuk elő, mint a pGHGEM3Z-t. Az LI 18E mutáció létrehozásában alkalmazott szintetikus mutagén oligonukleotidot - amelynek DNS-szekvenciáját (El 16) az 1. táblázat tartalmazza - az 5’-végen foszforilezzük, a SacI293-ra ismertetett módon. Az illesztési és betöltési reakciót is ugyanúgy hajtjuk végre, mint ahogy azt a pGHGEM3Z SacI293 mutagenezisére leírtuk. Miután a reakcióelegy felét HB101 kompetens sejtekbe bevittük és egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk, a kapott telepeket nitro-cellulóz-szűrőkre visszük át és standard módszerekkel elvégezzük a hibridizálást. Az 5’-végen x-32p-ATP-vel és polinukleotid-kinázzal radioaktívan jelzett Ellő oligonukleotidokat a mutáció detektálására is használjuk. A hibridizálást egy éjszakán keresztül 37 °C-on végezzük, 5xSSC-ben (lxSSC összetétele: 0,15 mól/1 nátrium-klorid, 0,015 mól/1 nátrium-citrát, pH 7,0), 1 χ Denhardt-oldat [0,02 vegyes% Ficoll, 0,02 vegyes% marhaszérum-albumin és 0,02 vegyes% poli(vinil-pirrolidon)j, 150 pg/ml élesztő-tRNS és a radioaktívan jelzett próba jelenlétében.
A hibridizálás befejezése után a szűrőket legalább 30 percen keresztül 37 °C-on 5 χ SSC-vel, majd kétszer 30 percen keresztül TAC-vel [TAC összetétele:
3 mól/tetrametil-ammónium-klorid, 50 mmol/1 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán pH 8,0, 1 mmol/1 EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), 0,1 vegyes% nátrium-dodecilszulfát] mossuk a kívánt hőmérsékleten. Az utóbbi mosás inkubációs hőmérséklete meghatározza a specifici40 tást, mivel az Ε116 oligonukleotid csak a teljesen komplementer kiónokkal marad hibridizál va. Az El 16 oligonukleotidok esetén a hőmérséklet 59,0 °C. Röntgenfilmes előhívással csak azok a kiónok válnak láthatóvá, amelyek az E116-tal teljesen komplementerek. Az így kapott több pozitív kiónból preparáljuk a plazmid-DNS-t, újra HB101 sejtekbe visszük, és a fent ismertetett módon újra alávetjük a szűrővizsgálatnak. A második szűrővizsgálat után pozitívnak bizonyult több kiónból preparáljuk a plazmid DNS-t, és szekvenciáját DNS50 szekvenciaanalízissel meghatározzuk; ily módon egyértelműen azonosítjuk az L118E mutációt tartalmazó DNS-eket. A fenti mutációt hordozó plazmidot pGEMpST—SX-L118E-nek nevezzük.
Az L118E mutációt tartalmazó rpST gén klóno55 kát kétféle expressziós vektorba, a pROpST-SX és pROpST-SXA vektorba transzformáljuk az alább ismertetett módon. Ezzel az a célunk, hogy a SacI és Xbal restrikciós helyekkel rendelkező a-hélix 2 kazettát tartalmazó rpST gént az rpST gén E. coliban való expresz60 szálására alkalmas plazmidvektorba beépítsük. Másik
HU 215 947 Β célunk az volt, hogy a találmány szerinti mutációkat az rpST két különböző genetikai hordozójába is beépítsük. Az egyik természetes (vad) típus, mivel a 183. és 191. helyzetű ciszteinmaradékok közül mindkettőt tartalmazza. A másik rpST gén alanint kódol cisztein helyett ugyanezekben a helyzetekben, és az EP 255 460 számú szabadalmi leírásban ismertetik. A pROpSTA34 plazmid (4. ábra) a pRO211 expressziós plazmidba klónozva tartalmaz egy EcoRI/HindlII fragmenst. Ez az EcoRI/HindlII fragmens egy mutáns rpST gént hordoz, amelyben a 183. és 191. helyzetű ciszteinek kodonjai ezekben a helyzetekben az alanin kodonjára vannak kicserélve. így ez a gén ala,ala mutációkat hordoz. A pROpSTA34 plazmidot egyik reakcióelegyben EcoRI-gyel és HindlII-mal, másik reakcióelegyben EcoRI-gyel és Smal-gyel emésztjük. A vektort tartalmazó nagy fragmenst mindkét reakcióelegyböl agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. Az a-hélix 2 kazettát egyébként vad típusú rpST génben tartalmazó pROpST-SX plazmidot a pGEMpST-SX-ből származó, tisztított EcoRI/HindlII fragmens ligálásával állítjuk elő. A ligációs elegyet N99cl baktériumtörzsbe visszük be. Ebben a törzsben a ÁPL promoter által hajtott rpSTexpressziót a vad típusú λ represszor jelenléte gátolja. A kívánt szerkezetű plazmidklónokat a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel azonosítjuk. A a-hélix 2 kazettát mutáns rpST génben tartalmazó pROpST-SXA plazmidot a pROpSTA34-ből tisztított EcoRI/Smal vektor fragmens és a pMEGpST-SX-ből tisztított EcoRI/Smal fragmens ligálásával állítjuk elő. A ligációs elegyet N99cl baktériumtörzsbe vezetjük és a kapott plazmidklónokat a megfelelő restrikciós enzimekkel emésztve azonosítjuk a kívánt plazmidklónokat.
Az LI 18E mutációt pROpST-SX és pROpST-SXA expressziós plazmidokba visszük be oly módon, hogy a pGEMpST-SX-Ll 18E DNS-t egyrészt EcoRI-gyel és HindlII-mal, másrészt EcoRI-gyel és Smal-gyel hasítjuk. Az egyes reakcióelegyekből származó, rpST-t hordozó kis fragmensek tartalmazzák az LI 18E mutációt, ezeket agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. A pROpST-SX plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk, és a vektort hordozó nagy fragmenst agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a fragmenst a pGEMpST-SX-Ll 18E-ből nyert, tisztított EcoRI/HindlII fragmenssel ligáivá kapjuk a pROpST-SX-L118E plazmidot. A ligációs elegyet hőmérséklet-érzékeny λ represszort tartalmazó 4300 expressziós törzsbe transzformáljuk. Ezekben a törzsekben az rpST expressziója a hőmérséklettől függ. 42 °C-on a λ represszor inaktív, így a ÁPL promoter általi expresszió végbemehet. A pROpST-SX-L118E plazmidot hordozó baktériumtelepeket 42 °C-on rpST proteint termelő képességük alapján azonosítjuk (amely hőmérsékleten a λ represszor nem működik). A pROpST-SXA plazmidot mind az EcoRI, mind az Smal restrikciós enzimmel emésztjük, és a vektor nagy fragmensét agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a fragmenst a pGEMpST-SX-L118E-ből nyert, tisztított EcoRI/Smal fragmenssel ligáljuk. A ligációs elegyet 4300 expressziós törzsbe transzformáljuk és a pROpST-SXA-Ll 18E plazmidot hordozó baktériumtelepeket 42 °C-on rpST proteint termelő képességük alapján azonosítjuk.
1. példa
Hidrofób aminosavak helyettesítése az a-hélix régióban a hélixet stabilizáló hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
Ezek a mutációk az alábbiak: L118E, L115K, L115K-L118E és L118EI122K. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi:
pGEMpST-SX-Ll 18E, pGEMpST-SX-Ll 15K, pGEMpST-SX-Ll 15KL118E és pGEMpST-SX-Ll 18EI122K.
Az rpST-ben az LI 15K mutációt az LI 18E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy a KI 13 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk mind a mutagén, mind a hibridizációs reakcióban. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg a rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol.
Az rpST-ben az L115KL118E mutációt az L118E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy a KI 13E116 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk a mutagén reakcióban, és a KI 13E116D oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) a hibridizációs reakcióban. A K113E116 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTGről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol, és a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol. Ez az oligonukleotid így kettős mutációt eredményez az rpST DNS-szekvenciában.
Az rpST-ben az L118EI122K mutációt az L118E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy az El 161120 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk a hibridizációs reakciókban. Az E116K120 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol, és az izoleucin kodonja a 120. helyzetben ATC-ről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol. Ez az oligonukleotid így kettős mutációt eredményez az rpST DNS-szekvenciában.
2. példa
Hidrofób aminosavak helyettesítése az a-hélix régióban hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
Ezek a mutációk az alábbiak: I122E, L118T,
L118K és L115E. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-Ll 18T, pGEMpST-SX-Ll 18K és pGEMpST-SX-Ll 15E. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a mutagén és hibridizációs reakciókban a megfelelő oligonukleotidokat alkal7
HU 215 947 Β mázzuk, amelyek szekvenciáját az 1. táblázatban ismertetjük.
Az I122E mutációt az El20 mutagén oligonukleotid (1. táblázat) alkalmazásával hozzuk létre. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az izoleucin kodonja a 122. helyzetben ATC-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol. Az El20 oligonukleotidot radioaktívan jelzett detektálási próbaként is alkalmazzuk a hibridizációs reakcióban, amely egyébként minden szempontból azonos az L118E-vel kapcsolatban leírtakkal, azzal az eltéréssel, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L118T mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakcióban L118T oligonukleotidot (1. táblázat) használunk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről ATC-re cserélődik, ami treonint kódol. A kívánt mutációt tartalmazó plazmidokat a mutációt nem hordozó plazmidoktól úgy különböztetjük meg, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L115E mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy a mutagén reakcióban E113EHDQ116 mutagén oligonukleotidot (1. táblázat), a hibridizációs reakcióban E113D oligonukleotidot (1. táblázat) használunk. Az E113EHDQ116 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről GAG-re változik, ami glutaminsavat kódol, és a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről glutaminsavat kódoló GAG-ra, aszparaginsavat kódoló GAC-re, hisztidint kódoló CAC-re vagy glutamint kódoló CAG-re változik. A 118. helyzetben bekövetkezett különféle mutációs változások annak következtében jönnek létre, hogy a mutagén oligonukleotid az oligonukleotid szintézise során keletkezett négy oligonukleotid elegye. Az El 13D radioaktívan jelzett próbával hibridizáló plazmidklónok DNS-szekvenciájának meghatározása azt mutatja, hogy ezek tartalmazzák az L115E mutációt, de egyetlen plazmid sem hordozza a 118. helyzet négy lehetséges mutációjának egyikét sem. így ez a mutációs eljárás egyetlen mutációt eredményez a 115. helyzetben.
Az L118K mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mutagén oligonukleotidként L118K oligonukleotidot (1. táblázat) használunk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről a lizint kódoló AAG-re vagy a treonint kódoló CAG-re cserélődik. A 118. helyzet különféle mutációs lehetőségei azért jöhetnek létre, mert a mutagén oligonukleotid az oligonukleotid szintézise során keletkezett két oligonukleotid elegye. Az Ll 18TK radioaktívan jelzett próbával hibridizáló plazmidklónok DNS-szekvenciájának meghatározása azt mutatja, hogy ezek tartalmazzák az Ll 15K mutációt, de egyetlen plazmid sem hordozza a 118. helyzet másik lehetséges mutációját, az Ll 18T-t. így ez a mutációs eljárás egyetlen mutációt eredményez a 118. helyzetben.
3. példa
Hidrofil aminosavak helyettesítése az a.-hélix régióban hidrofób aminosavakkal, mutagén oligonukleotid alkalmazásával Ebbe a mutációs csoportba egyetlen kettős mutáns tartozik, az E119LQ123K. A fenti mutációt hordozó plazmid - amelynek szerkezetét DNS-szekvenálással megerősítettük - a pGEMpST-SX-El 19LQ123L jelölésű plazmid. A fenti kettős mutációt hordozó rpST gént az Ll 18E mutációra leírtakkal azonos módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy az Ll 17, 121 mutagén oligonukleotidot (1. táblázat) alkalmazzuk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glutaminsav kodonja a 119. helyzetben GAG-ről CTG-re cserélődik, ami leucint kódol, és a glutamin kodonja a 123. helyzetben CAG-ről CTGre cserélődik, ami leucint kódol. A mutagén reakcióban ezt az oligonukleotidot alkalmazzuk, míg a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként a Leull7121D oligonukleotidot használjuk, amelynek szekvenciáját szintén az 1. táblázat tartalmazza.
A fenti mutáció előidézésére ugyanazokat az eljárásokat alkalmazzuk, mint amelyeket az L118E-vel kapcsolatban fent ismertettünk, azzal az eltéréssel, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket a mutációt hordozó plazmidok azonosítására TAC pufferrel 58 °C-on inkubáljuk.
4. példa
Az a.-hélix 3 nagy oldalláncú apoláros aminosavjainak helyettesítése kis oldalláncú apoláros aminosavakkal
Ezek a mutációk az alábbiak: L115A, L118A és M126A. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi:
pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-Ll 18A, pGEMpST-SX-M126A.
A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
Az L115 A mutáció létrehozására alkalmazott L115 A szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről az alanint kódoló GCG-re cserélődik. Az Ll 15A oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L118A mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban L118A oligonukleotidot alkalmazunk mutagén nukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tar8
HU 215 947 Β talmazza. Az LI 18A oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről az alanint kódoló GCG-re cserélődik. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-Ll 18A plazmidnak jelöljük.
Az Ml26A mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban A124-2 oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az A124-2 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a metionin kodonja a 126. helyzetben ATG-ről az alanint kódoló GCA-ra cserélődik. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-M126A plazmidnak jelöljük.
5. példa
A I22-es helyzetű izoleucin helyettesítése leucinnal
Ezek a mutációk az alábbiak: I122L, I122LL118A és I122LM126A. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi:
pGEMpST-SX-I122L, pGEMpST- SX-L122LL118A és pGEMpST- SX-1122LM126A.
A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
Az I122L mutáció létrehozására alkalmazott L1203 szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az izoleucin kodonja a 122. helyzetben ATC-ről a leucint kódoló CTG-re cserélődik. Az L120-3 oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az I122LL118A mutációt az rpST génben pontosan az LI 18E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban L118A oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, és a mutagenezisre templát DNS-ként pGEMpST-SX-I122L-t alkalmazunk. A templát DNS-t a pGEMpST-pST-SX DNS-re leírtak szerint állítjuk elő. A mutációt hordozó plazmidokat a nitro-cellulóz-szűrők TAC pufferben, 56 °C-on végzett inkubálásával detektáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük pGEMpST-SX-L 118AI122L plazmidnak jelöljük.
Az I122LM126A mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban A124-2 oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, és a mutagenezisre templát DNS-ként pGEMpST-SX-I122L-t alkalmazunk. A templát DNS-t a pGEMpST-pST-SX DNS-re leírtak szerint állítjuk elő. A mutációt hordozó plazmidokat a nitro-cellulóz-szűrők TAC pufferben, 56 °C-on végzett inkubálásával detektáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük pGEMpST-SX-Π 22LM126A plazmidnak jelöljük.
6. példa
Aminosavmaradékok helyettesítése az (t-hélix hidrofil felületén
Ezek a mutációk az alábbiak: G121A, K114R és KI 16R. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi:
pGEMpST-SX-G121A, pGEMpST-SX-Kl 14R és pGEMpST-SX-K116R.
A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
A G121A mutáció létrehozására alkalmazott G121A/XmnI szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glicin kodonja a 121. helyzetben GGC-ről az alanint kódoló GCT-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy XmnI restrikciós felismerési helyet (5’GAAGCTATTC-3’) is bevisz az rpST DNS szekvenciába. A G121A mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosavszekvenciájában. A G121A/XmnI oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk, a hibridizálást egyébként a fent ismertetett módon hajtjuk végre. A kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az XmnI hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidokban jelen van, és így a G121A mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük — pGEMpST- SX-G121A plazmidnak jelöljük.
A K114R mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban K114R/AccI oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. A KI 14R/AccI oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a lizin kodonja a 114. helyzetben AAG-ről az arginint kódoló CGT-re cserélődik. Ez az
HU 215 947 Β oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy Acél restrikciós felismerési helyet (5’-GTATAC-3’) is bevisz az rpST DNS szekvenciába. A KI 14R mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosavszekvenciájában. A G121 A-hoz hasonlóan a kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulózszűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az új Acél hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidokban jelen van, és így a KI 14R mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-K114R plazmidnak jelöljük.
A K116R mutációt az rpST génben pontosan az LI 18E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban KI 16R/BglII oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. A K116R/BglII oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a lizin kodonja a 116. helyzetben AAG-ről az arginint kódoló CGA-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy BglII restrikciós felismerési helyet (5’-AGATCT-3’) is bevisz az rpST DNS szekvenciába, a 342-347. helyzetbe. A K116R mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosavszekvenciájában. A G121 A-hoz hasonlóan a kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az új BG1II hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidokban jelen van, és így a KI 16R mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-K116R plazmidnak jelöljük.
7. példa
Hidrofób aminosavak helyettesítése az a-hélix régióban vagy annak közelében hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
A fenti mutációk célja az rpST aminoterminális részében található hidrofób aminosavmaradékok helyettesítése olyan hidrofil aminosavmaradékokkal, amelyek a humán növekedési hormonban hasonló relatív helyzetben vannak jelen.
Az rpST fenti mutációi az alábbiak: Q21HH22R kettős mutáció, SÍ 1RA14D kettős mutáció, illetve A6T és AMD szimpla mutációk. A fenti mutációkat hordozó plazmidokat - amelyek szerkezetét DNS-szekvenciaanalízissel megerősítettük pGEMpST-SX-Q21HH22R, pGEMpST-SX-SllRAMD, pGEMpST-SX-A6T és pGEMpST-SX-AMD plazmidnak jelöljük.
A fenti mutációkat az L118E mutációra leírtakkal azonos módon hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, a nitro-cellulóz-szűrők TAC pufferben való inkubálásának hőmérsékletétől és a pozitív, mutációt hordozó plazmidok kimutatására szolgáló szűrővizsgálatban az adott esetben alkalmazott restrikciós endonukleázos emésztésétől.
A Q21HH22R kettős mutáció létrehozására alkalmazott Q21HH22R/ClaI szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glutamin kodonja a 21. helyzetben CAG-ről a hisztidint kódoló CAT-re, és a hisztidin kodonja a 22. helyzetben CAC-ról az arginint kódoló CGA-ra cserélődik. A fenti mutánsokba be van ágyazva egy Call restrikciós endonukleáz hasítási hely (5’ATCGAT-3’) is, amely az egyetlen ilyen hely az rpST génben. A Q21HH22R/ClaI oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk, a hibridizálást egyébként a fent ismertetett módon hajtjuk végre. A fenti mutánst egyébként minden tekintetben az El 18E előállítására ismertetett módon hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy a szűrőket TAC pufferben 56 °C-on mossuk. A mutációt hordozó kiónok kimutatására a kiónokat a Clal hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így a Q21HH22R kettős mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
Az A6T mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban A6T oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az A6T oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST szekvenciáját, hogy az alanin kodonja a 6. helyzetben GCC-ről treonint kódoló ACCre cserélődik. A hibridizálást követően a baktériumot tartalmazó nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 52 °C-on mossuk.
A S11RA14D mutációt az rpST génben pontosan az LI 18E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban SÍ 1RA14D/SA1I mutagén oligonukleotidot alkalmazunk, és a nitro-cellulóz-szűrőket TAC pufferben 64 °C-on mossuk. Az SÍ 1RA14D/Sall oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a szerin kodonja all. helyzetben AGC-ről az arginint kódoló CGA-ra, és az alanin kodonja a 14. helyzetben GCC-ről az aszparaginsavat kódoló GAC-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy Sáli restrikciós felismerési helyet (5’-GTCGAC-3’) is bevisz az rpST DNS szekvencia 29-34. helyzetébe. Az SÍ ÍR és AMD mutációktól eltekintve a további nukleotidcserék nem okoznak változást az rpST protein aminosavszekvenciájában. A mutációt vélhetően hordozó kiónokat az új Sáli restrikciós hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, ami a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így az S11RA14D kettős mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
HU 215 947 Β
Az AMD mutációt az rpST génben pontosan az Ll 18E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban A14D/HindIII mutagén oligonukleotidot alkalmazunk. Az A14D/HindIII oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az alanin kodonja a 14. helyzetben GCC-ről az aszparaginsavat kódoló GAC-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy HindlII restrikciós felismerési helyet (5’-AAGCTT-3’) is bevisz az rpST DNS szekvencia 30-35. helyzetébe. Az AMD mutációtól eltekintve a további nukleotidcserék nem okoznak változást az rpST protein aminosavszekvenciájában. A vélhetően mutációt hordozó kiónokat úgy mutatjuk ki, hogy a nitro-cellulózszűrőket TAC-ben 62 °C-on inkubáljuk és az új HindlII restrikciós hely megszerzése szempontjából is vizsgáljuk, ami a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így az AMD mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
8. példa pST mutációk bevitele megfelelő bakteriális expressziós plazmidokba
A megváltozott (mutációt hordozó) kiónokat a pRO211 bakteriális expressziós plazmidban (173280 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett plazmid) rekonstruáljuk, amelyeket pROpST, pROpSTA34 és pROpSTE34 plazmidnak jelölünk.
A pROpST plazmid pST DNS-t tartalmaz a pRO211 expressziós vektorba klónozva, és ciszteinkodont tartalmaz a 183. és 191. helyzetben; a pROpSTA34 alaninkodont és a pROpSTE34 glutaminkodont tartalmaz ugyan5 ezen helyzetekben.
A pGEMpST mutánsklónokat EcoRI-gyel és Smalgyel emésztjük és a pST mutációt hordozó kis ffagmenst izoláljuk. A pROpSTA34 DNS-t hasonló módon kezeljük, és a vektort tartalmazó nagy DNS-ffagmenst izolál10 juk. Az így kapott tisztított fragmenseket T4 DNS-ligázzal összekötjük és megfelelő baktériumtörzsbe (például 4300-ba) transzformáljuk. Ez a törzs tartalmaz egy hőmérsékletérzékeny λ represszort (cl857), így a ÁPL promoter általi expresszió 30 °C-on gátolt, de 42 °C-on vég15 bemehet, mivel ezen a hőmérsékleten a represszor inaktiválódik. A mutáns pGEMpST DNS-fragmensek bevitelét a pROpSTE34 DNS-be pontosan a pROpSTA34-re leírt módon végezzük. A mutáns pGEMpST DNS-fragmensek bevitelét a pROpST DNS-be szintén a pROpSTA3420 re leírt módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy mind a pGEMpST, mind a pROpSTA34 plazmidot EcoRI-gyel és Hindlü-mal hasítjuk. A 2. táblázat tartalmazza azokat a bakteriális expressziós plazmidokat, amelyekbe a mutáns pST géneket bevittük. Az A6T, S11RA14D és
Q21HH22R pST mutánsokat egy pROpSTE34 származékba visszük be, a pROpSTE34-re ismertetett módon. Ez a származék a pRO-pSTE34T [T2, egy körülbelül 1 kb HindlII fragmenst tartalmaz a pST-t kódoló DNS 3’-végén, ami az E. coli rmB operon (riboszomális RNS B operon) TjT2 transzkripciós terminátorát tartalmazza.
2. táblázat
Expressziós vektorok aminosavkomponensei a 183. és 191. helyzetben
| Mutáció | 183. és 191. helyzetben kódolt aminosav | ||
| cisztein | alanin | glutaminsav | |
| I122L | + | + | + |
| L115K | + | + | + |
| L118E | + | + | |
| L115KL118E | + | + | |
| L118E1122K | + | ||
| L115E | + | ||
| 1122E | + | + | |
| L118T | + | ||
| L118K | + | ||
| E119LQ123L | + | + | |
| L115A | + | ||
| L118A | + | + | |
| M126A | + | + | |
| L118A1122L | |||
| 11221Μ126Α | + | + | + |
| S81.87L | + | ||
| L82, 84Q | + | ||
| S81,87L + E119LQ123L | + |
HU 215 947 Β
2. táblázat (folytatás)
| Mutáció | 183. és 191. helyzetben kódolt aminosav | ||
| cisztein | alanin | glutaminsav | |
| S81.87L + 1122L | + | ||
| S81.87L + M126A | + | ||
| L82, 84Q + L115K | + | ||
| A14D | |||
| A6T | + * | ||
| S11RA14D | + * | ||
| Q21HH22R | + * | ||
| A6TS11R | + * | ||
| A6TS11R + 1122L | + | ||
| P8TS11R + 1122L | + | ||
| P8TS11R | + |
* az E. coli rmB operon T|T, transzkripciós terminátor szekvenciáját is tartalmazza.
9. példa
A6T11R + E34 és P8TS1 IR + E34 Ó-hélix kombinációs mutánsok előállítása
Az A6TS1 ÍR kettős mutációt (amelyben a 6. helyzetű alanin treoninnal, és a 11. helyzetű szerin argininnel van helyettesítve) a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett E34 mutációval (amelyben a 183. és 191. helyzetű ciszteinkodonokat glutaminsavkodonok helyettesítik) kombináljuk. A kapott rpST gén ezért az rpST DNS-nek mind az aminoterminálist (A6TS1 ÍR), mind a karboxilterminálist kódoló régiójában (E34) tartalmaz mutációkat. A kapott plazmidot pROpSTE-A6TSl lR-nek jelöljük. A pML/pGH14-ből származó, megváltoztatott rpST-t tartalmazó kis EcoRI/Smal fragmenst - amely az A6TS1 ÍR mutációt tartalmazza - a pROpSTE-T,T2 nagy EcoRI/Smal fragmensével kapcsoljuk össze. Az utóbbi plazmid a pST expressziós plazmid, amely az rpST-t kódoló DNS 3’-végén egy erős transzkripciós terminátort is tartalmaz az E. coli rmB operonból (T,T2).
Egy másik kettős mutációt, a P8TS11 R-t (amelyben a
8. helyzetű prolin kodonja treoninkodonra, és a 11. helyzetű szerin kodonja argininkodonnal van helyettesítve) a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett E34 mutációval (amelyben a 183. és 191. helyzetű ciszteinkodonokat glutaminsav-kodonok helyettesítik) kombináljuk. A kapott rpST gén ezért az rpST DNS-nek mind az aminoterminálist (P8TS11R), mind a karboxilterminálist kódoló régiójában (E34) tartalmaz mutációkat. A kapott plazmidot pROpSTE-P8TSllR-nek jelöljük. A pROpSTE-P8TSl 1R előállítására ugyanazt a stratégiát alkalmazzuk, mint a pROpSTE-A6TSllR esetében, azzal az eltéréssel, hogy a p8TSl ÍR kettős mutációt tartalmazó pML/pGH 18 plazmidot alkalmazzuk megváltoztatott rpST DNS forrásként.
A6TS11R + I122L + E34 és P8TS11R+I112L + E34 mutációk
A fent ismertetett I122L Ó-hélix 3 mutációt mindkét, A6TS11R és P8T11R Ó-hélix 1 mutációval és az
E34 mutációval is kombináljuk. A kapott plazmidok jelölése: pROpST-SXE-A6TSl 1R+I122L, illetve pML/pGH18-SXE-I122L.
A pROpST-SXE-A6TSl 1R+I122L plazmid előállítására az I122L-t tartalmazó kis BssHII/HindlII fragmenst a pROpSTE-A6TSllR-ből tisztított nagy BssHII/HindlII fragmenssel kapcsoljuk össze. A kapott plazmid tartalmazza a SacI és Xbal restrikciós helyek30 kel definiált a-hélix 2 kazettát, amely restrikciós helyek az α-hélix 2-t kódoló DNS 5’- és 3’-végét határolják a fent ismertetett módon, de nem tartalmaz T,T2 transzkripciós terminátort.
A pML/pGH18-SXE-I122L plazmidot a fentiek szerint állítjuk elő azzal az eltéréssel, hogy a nagy fragmens fonásaként a P8TS1 ÍR kettős mutációt hordozó pML/pGH 18 plazmidot alkalmazzuk. Az így kapott plazmidmutáns nem tartalmaz T[T2 transzkripciós terminátort, viszont tartalmazza az a-hélix 2 kazettát.
10. példa
A módosított, rekombináns szomatotropinok stabilitási profilja
A stabilitási profil meghatározását az alábbiak sze45 rint végezzük. A rekombináns (állati) szomatotropinból koncentrált, 100 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,4), amelynek összetétele: 3,4 g NaH2PO4xH2O, 3,55 g Na2HPO4, 9,50 g NaCl, 1000 ml desztillált vízben oldva. Az oldatot MilliporeR steril Millex-0,22 pm szűrőegységen átszűrjük és 0,1 ml alikvotokat kémcsövekbe mérünk. A kémcsöveket 43 °C-os termosztátba helyezzük és meghatározott időpontokban onnan kivesszük. A kémcső tartalmát ekkor foszfáttal pufferolt sóoldattal hígítjuk. A felülúszóban HPLCeljárással meghatározzuk a monomer- és dimertartalmat. Tömegmérleget készítünk. A csapadékképződést feljegyezzük. Az eredményeket a kiindulási koncentrációkkal összehasonlítjuk és megállapítjuk a stabili60 tási profilt.
HU 215 947 Β
A pH 7,4 értéken kisebb oldhatósági! szomatotropinszármazékok oldását kevésbé előnyös pH-η (pH 4-10) is elvégezzük, vagy szuszpenzióként értékeljük ki.
A módosított rpST proteinek oldatban mutatott stabilitásának vizsgálati eredményeit a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat
Mutáns rpST proteinek oldhatósága in vitro
| Mutáció | Oldhatóság (%) | Inkubációs idő 43 °C-on (nap) |
| A34 | 32 | 14 |
| 1122L+A34 | 44 | 14 |
| E34 | 70,0 (3) 67 | 14 17 |
| 1122L+E34 | 62,0 (2) 66,3 (3) | 14 17 |
| A6TS11R+E34 | 68,5 (2) | 14 |
| P8TS11R+E34 | 62 | 14 |
| A6TS11R+ 1122L+E34 | 36 | 14 |
| P8T511R+1122L+E34 | 2 | 14 |
| L118K+A34 | 0 | 3 |
| El 19LQ123L+A34 | 0 | 3 |
| L115A+A34 | 0 | 3 |
| L118A+A34 | 10 | 7 |
| M126A+A34 | 18 | 3 |
| LI 18A1122L+A34 | 2 | 7 |
| 1122LM126A+A34 | 22 (2) | 19 |
| S81,87L+A34 | 0 | 3 |
| S81, 87L+E119LQ123L+A34 | 0 | 7 |
| S81, 87L+1122L+A34 | 8 | 7 |
| S81, 87L+M126A+A34 | 0 | 3 |
Oldhatóság = ólában maradt anyag χ 1θθ összes oldott anyag (lásd 14. példa). Ha egynél több meghatározást végzünk, az átlagos oldhatóságot tüntetjük fel, és az egymástól függetlenül végzett meghatározások számát zárójelben megadjuk. Az rpST mutánsok vagy A34-, vagy E34-alapúak. Az A34 rpST a 183. és 191. helyzetben alanint tartalmaz cisztein helyett, míg az E34 rpST a 183. és 191. helyzetben glutaminsavat tartalmaz cisztein helyett.
11. példa
Rekombináns (állati) szomatotropin-származékokkal kezelt állatok fejlődésének vizsgálata hipox patkányokon
A találmány szerinti rekombináns állati szomatotropinok hatását az állatok fejlődésének serkentésére hipofízisirtott (hipox, RRA) patkányon vizs50 gáljuk. A hipofízisirtott patkányban nem termelődik saját szomatotropin, és érzékeny a beinjektált szomatotropinra. A növekedési választ 10 napon ke45 resztül mérjük, és az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük, a minden egyes vizsgálatban pozitív kontrollként alkalmazott rpST biológiai aktivitásának %-ában.
12. példa
Máj-radioreceptor-vizsgálat a megváltoztatott, rekombináns szomatotropin szomatotropinreceptorokhoz való kötődésének vizsgálatára, in vitro
In vitro radioreceptor-vizsgálatot alkalmaztunk a találmány szerinti rekombináns szomatotropinok 125I-rpST-vel folytatott versengésének kimutatására a tisztított májmembránok szomatotropin-receptor kötőhelyeiért. A fenti vizsgálatok eredményeit az 4. táblá60 zatban közöljük.
HU 215 947 Β
4. táblázat
Hipox patkányon mért biológiai adatok és az rpST mutáns proteinek hőstabilitása
| Mutáció | RRA“ | RRAb | Tm(°C) |
| A34 | 112,8 | 173,5 | n. v. |
| 1122L+A34 | 97,4 | 225,8 | 79 |
| E34 | 90,52(5) | 51,4(7) | 62,0(6) |
| 1122L+E34 | 66,66(5) | 80,28(5) | 62,67(5) |
| L115K | 0,3 | 1,2 | >83 |
| L115K+E34 | 0,8 | 0,9 | 79 |
| L118K | 1,8 | 43,9 | 36 |
| E119LQ123L | 3,8 | 80,2 | 49 |
| L115A | 88,6 | 163 | 50 |
| L118A | 64(3) | 49,5 | 57 |
| M126A | 100 | 122 | 55 |
| L118AI122L | 38,9 | 57,9 | 56 |
| I122LM126A | 66,25 (2) | 82,55(2) | 63 |
| S81.87L | 46,9 | 194 | 40 |
| S81, 87L+E119LQ123L | 40,4 | 177,9 | 38 |
| S81,87L+I122L | 71,3 | 165 | 47 |
| S81,87L+M126A | 79,7 | 186 | 47 |
| L82, 84Q | 9,7(2) | 3,4 | n. v. |
| K114R+E34 | 121,3 | 53,2 | 62 |
| A6TS11R+E34 | 80,7(4) | 135,0(4) | 64,0(4) |
| P8TS11R+E34 | 129,7 | 78,5 | 65 |
| A6TS11R+I122L+E34 | 116,7 | 112,8 | 61 |
| P8TS11R+I122L+E34 | 127,9 | 89,3 | 64 |
RRAa a hipox patkányon mért eredményeket a pozitív kontrollként alkalmazott standard rpST aktivitásának %-ában adjuk meg
RRAb a máj-radioreceptor-vizsgálat eredményeit a standard rpST aktivitásának %-ában adjuk meg
n. v. nem határoztuk meg
Ha egynél több vizsgálatot végeztünk, az átlagot adtuk meg, és a meghatározások számát zárójelben feltüntettük.
13. példa
I122L+E34 mutáns rpST-vel végzett nitrogénmérleg-kísérletek
Az I122L mutációt hordozó rpST protein biológiai aktivitásának in vivő kiértékelésére nitrogénmérleg-kí- 50 sérletet végeztünk a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett módon. pST szubkután adagolása fejlődésben lévő sertéseknek növeli a testben, főleg az izmokban lerakodott protein mennyiségét. Nitrogénmérleg-vizsgálat alkalmazásával mérhető az állatban lerakodott protein mennyiségének változása. Mivel a protein meghatározott mennyiségű nitrogént tartalmaz, az elfogyasztott táplálék és a szervezetből kiürült anyagok nitrogéntartalmának meghatározásával pontosan kiszámítható a lerakodott protein mennyisége. így a nitrogénmérleg a visszatartott (lerakodott) protein mennyiségét adja meg a táplálékkal elfogyasztott nitrogén és a vizelettel és széklettel kiürült nitrogén mennyiségének különbségeként. A nitrogénvisszatartást legpontosab40 bán mint a visszatartott nitrogén mennyiségét adhatjuk meg, a megemésztett nitrogén (elfogyasztott nitrogén mínusz székletben lévő nitrogén) mennyiségének százalékában. Ebben a vizsgálatban a 183. és 191. helyzetű ciszteinek, vagy az rpST L122L mutáns glu45 taminsavval van helyettesítve. A fenti analízis eredményei a megváltoztatott rpST molekula teljes biológiai aktivitását bizonyítják az rpST kontrolihoz viszonyítva.
14. példa
Hőstabilitás meghatározása fluoreszcenciás spektroszkópia alkalmazásával A megváltozott rpST protein hőstabilitását úgy határozhatjuk meg, hogy mérjük az intrinsic triptofán 55 fluoreszcenciát a hőmérséklet függvényében. Az rpST molekula egyetlen triptofánmaradékot tartalmaz, amelynek intrinsic fluoreszcenciája natív állapotban szigorúan kioltódik. A hőmérséklet növelése vagy a pH csökkentése a fluoreszcencia jellegzetes növeke60 dését okozza, ami feltehetőleg a szerkezet felbomlásá14
HU 215 947 Β nak következtében jön létre, legalábbis az egyébként betemetett triptofánmaradék közvetlen közelében. A fluoreszcenciát a növekvő hőmérséklet függvényében ábrázolva szigmoid görbe formájában „olvadási profil”-t kapunk, amelyben a fluoreszcencia rejtve marad egy bizonyos hőmérsékletig, ami az adott rpST-re jellemző érték. Ezután a fluoreszcencia egy meglehetősen szűk hőmérséklet-tartományban élesen növekedik. A fenti fluoreszcencia-növekedés középpontjához tartozó hőmérsékletet (átmeneti hőmérséklet) Tm-nek jelöljük, és ez jellemző a protein hőstabilitására. A találmány szerinti rpSt Tm-jét Burger és munkatársai módszerével határozzuk meg [Burger H. G., Edelhoch H. és Condliffe P. G., Endocrinology 78, 98-102 (1966)], azzal az eltéréssel, hogy a gerjesztett hullámhosszként 295 nm-t alkalmazunk és az emissziós fluoreszcenciát 355 nm kizárásos szűrő alkalmazásával olvassuk le. A találmány szerinti rpST Tm értékeit a 4. táblázat tartalmazza. Ezen adatok szerint az I122L Tm-je erősen, 79 °Cra növekszik.
75. példa
I122L mutáció létrehozása polimeráz láncreakció módszerrel
Az I122L mutációt helyirányított mutagenezissel visszük be az rpST génbe, a Sarkar és Sommer által ismertetett polimeráz láncreakciós módszer alkalmazásával [Sarkar és Sommer, Biotechniques 8, 404-407 (1990)]. A három alkalmazott oligonukleotid primer, a SacI293, L120-3 és PvuII634 oligonukleotid szerkezete az 1. táblázatban látható. Templátként a pGEMpST-SX plazmidból származó rpST gént tartalmazó EcoRI/HindlII fragmenst használjuk. 15 polimeráz láncreakció ciklust (továbbiakban PRC) hajtunk végre 1 ng rpST DNS-templáton, 1 -1 pmol/l L120-3 és PvuII634 oligonukleotid printerrel, dNTPkkel és Tag oligonukleotid polimerázzal a gyártó előírásai szerint. A reakció eredményeként L122L mutációt tartalmazó 227 bp DNS-fragmenst kapunk. Ezt a fragmenst agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk és PRC printerként használjuk a SacI293 oligonukleotidprimerrel és az rpST-t tartalmazó EcoRI/HindlII templátfragmenssel kombinálva, egy újabb 15 ciklusból álló PRC-ben. A kapott, 361 bp fragmentumot Sacl és PvuII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk és gélen tisztított, nagy SacI/PvuII pGEMpST-SX DNS-fragmenshez ligáljuk. A ligációs elegyet HB101 kompetens sejtekbe transzformáljuk. A kapott transzformánsok plazmid DNS-ét az I122L mutáció jelenléte szempontjából vizsgáljuk, pontosan az L118E esetében ismertetett módon, azzal az eltéréssel, hogy radioaktívan jelzett hibridizációs próbaként L120-3 oligonukleotidot használunk, és a szűrővizsgálatot csak egyszer végezzük el. Az I122L mutáció jelenlétét és a PRC reakciókkal bevezetett további mutációk hiányát DNS-szekvenciaanalízissel erősítjük meg. A fenti mutációt hordozó plazmidot pGEMpST-SX-I122LPRCnek jelöljük.
16. példa
I122L rpSTmutáció létrehozása élesztőben expresszálható plazmidban
Az I122L mutációt hordozó rpST gén Saccharomyces cerevisiae élesztőgombában való expresszálására az rpST-t kódoló DNS-t élesztőből származó promoterhez kell működőképesen kötni. A pROpST-SXE-I122Lből származó, rpST-t hordozó kis Ndel/HindlII fragmens végeit a DNS polimeráz I nagy Klenowfragmensével való kezeléssel tesszük „ragadóssá”, miután a plazmidot Ndel-gyel és HindlII-mal hasítottuk. Ezt a fragmenst gélelektroforézissel tisztítjuk, és az YEp352-2-plazmid nagy Sall/Sphl ffagmensével kapcsoljuk. Az utóbbi fragmens végeit S1 nukleázos kezeléssel tesszük „tompává”. Ez a plazmid YEp352-származék, amely úgy van módosítva, hogy tartalmazza a divergens GÁLI/GAL 10 promotert [Johnston és Davis, Molecular and Cellular Biology 4, 1440-1448 (1984)], és az STE7 génből származó nem transzlatált 3'-régiót [Teague és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7371-7375 (1986)] is. A kapott plazmidot YEp352-pST-I122L plazmidnak (5. ábra) jelöljük.
A fenti mutáns rpST élesztőben való expreszszálására a fenti plazmiddal transzformált élesztősejteket uracil nélküli szintetikus komplett tápközegben tenyésztjük, amely egyetlen szénforrásként galaktózt tartalmaz [Sherman F„ Fink G. R. és Hicks J. B„ „Laboratory Course Manual fór Methods in Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 163-168. oldal (1986)], 30 °C-on, néhány órán keresztül, annyi ideig, hogy maximális rpST gén indukciót és rpST termelést éljünk el. Gazdasejtként minden olyan élesztősejt alkalmazható, amely az URA3 génben mutációt hordoz, előnyösen olyan élesztősejtet alkalmazunk, amely nem termel proteázt és GAL+, ilyen például a BJ5457 (MATcc pep4: :HIS3 prbl-δ trpl ura3-52 leu2δ his3-Ö lys2-801 canl GAL+ genotípus). Ezt a törzset BJ5457 számon helyeztük letétbe a Yeast Genetic Stock Center-ben (University of Califomia).
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás natív szomatotropinnál jobban oldódó, ugyanakkor nyújtott hatású készítményekben biológiai aktivitását megtartó sertés-szomatotropin előállítására, azzal jellemezve, hogy a sertés-szomatotropin alfa-hélix 1 régiójában A6TS1 ÍR vagy P8TS1 ÍR kettős mutációt hozunk létre.
- 2. Eljárás natív szomatotropinnál jobban oldódó, ugyanakkor nyújtott hatású készítményekben biológiai aktivitását megtartó sertés-szomatotropin előállítására, azzal jellemezve, hogy a sertés-szomatotropin alfa-hélix 3 régiójában I122L egyszeres mutációt, és alfa-hélix 1 régiójában A6TS11R vagy P8TS11R kettős mutációt hozunk létre.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sertés-szomatotropin kis hurokjában lévő kettő, és nagy hurokjában lévő kettő, összesen négy ciszteinmaradék közül legalább egyet arginin, lizin, asz15HU 215 947 Β paraginsav, glutaminsav, aszparagin, glutamin, hisztidin, alanin, glicin, izoleucin, leucin, valin, fenil-alanin, triptofán, tirozin, metionin, szerin, treonin és prolin közül egymástól függetlenül választott aminosavmaradékkal helyettesítünk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyettesítő aminosavmaradékként glutaminsavat vagy alanint alkalmazunk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 183. és 191. helyzetben lévő ciszteinmaradékot helyettesítjük glutaminsav-maradékkal.
- 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sertés-szomatotropin kis hurokjában lévő kettő, és nagy hurokjában lévő kettő, összesen négy ciszteinmaradék közül legalább egyet arginin, lizin, aszparaginsav, glutaminsav, aszparagin, glutamin, hisztidin, alanin, glicin, izoleucin, leucin, valin, fenil-alanin, triptofán, tirozin, metionin, szerin, treonin és prolin közül egymástól függetlenül választott aminosavmaradékkal helyettesítünk.5
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyettesítő aminosavmaradékként glutaminsavat vagy alanint alkalmazunk.
- 8. Az 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 183. és 191. helyzetben lévő ciszteinmaradékot10 helyettesítjük glutaminsav-maradékkal.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy met-asp-gln-dez(ala) sertés-szomatotropinban hozzuk létre a megfelelő mutációkat.
- 10. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 15 hogy met-asp-gln-dez(ala) sertés-szomatotropinban hozzuk létre a megfelelő mutációkat.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62165690A | 1990-11-30 | 1990-11-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU913723D0 HU913723D0 (en) | 1992-02-28 |
| HUT62327A HUT62327A (en) | 1993-04-28 |
| HU215947B true HU215947B (hu) | 1999-03-29 |
Family
ID=24491070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU913723A HU215947B (hu) | 1990-11-30 | 1991-11-29 | Eljárás alfa-hélix 1, vagy alfa-hélix 1 és alfa-hélix 3 régiójukban módosított szomatotropinok előállítására |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5548068A (hu) |
| EP (1) | EP0496973B1 (hu) |
| JP (1) | JPH05105634A (hu) |
| KR (1) | KR100193005B1 (hu) |
| AT (1) | ATE163045T1 (hu) |
| CA (1) | CA2056467C (hu) |
| DE (1) | DE69128877T2 (hu) |
| DK (1) | DK0496973T3 (hu) |
| ES (1) | ES2112847T3 (hu) |
| FI (1) | FI104489B (hu) |
| GR (1) | GR3026761T3 (hu) |
| HU (1) | HU215947B (hu) |
| IE (1) | IE914153A1 (hu) |
| IL (1) | IL100169A0 (hu) |
| NO (1) | NO301235B1 (hu) |
| NZ (2) | NZ240718A (hu) |
| PT (1) | PT99648B (hu) |
| SG (1) | SG49702A1 (hu) |
| TW (1) | TW198040B (hu) |
| ZA (1) | ZA919453B (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6006079A (en) * | 1997-06-13 | 1999-12-21 | Motorola, Inc. | Radio having a fast adapting direct conversion receiver |
| TR200504220T2 (tr) | 1998-12-17 | 2007-04-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem. |
| GB2384001B (en) * | 2001-12-14 | 2004-02-04 | Asterion Ltd | Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins |
| AU2003263552A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-29 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| KR20090083958A (ko) | 2006-10-20 | 2009-08-04 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 가용성 림프독소-베타-수용체를 이용한 탈수초성 장애의 치료 |
| US8338376B2 (en) | 2006-10-20 | 2012-12-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins |
| WO2012116203A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Water soluble membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
| US10373702B2 (en) | 2014-03-27 | 2019-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble trans-membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68929273T2 (de) * | 1988-08-24 | 2001-07-05 | American Cyanamid Co | Stabilisierung von Somatotropinen durch Modifikation von Cystein-Resten durch orts-spezifische Mutagenese oder chemische Derivatisierung |
| CA2345497A1 (en) * | 1988-10-28 | 1990-04-28 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants and method for forming growth hormone variants |
-
1991
- 1991-11-25 NZ NZ240718A patent/NZ240718A/en unknown
- 1991-11-25 NZ NZ260103A patent/NZ260103A/en unknown
- 1991-11-27 IL IL100169A patent/IL100169A0/xx unknown
- 1991-11-28 SG SG1996004237A patent/SG49702A1/en unknown
- 1991-11-28 DE DE69128877T patent/DE69128877T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-28 AT AT91120396T patent/ATE163045T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 EP EP91120396A patent/EP0496973B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 ES ES91120396T patent/ES2112847T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 DK DK91120396.6T patent/DK0496973T3/da active
- 1991-11-28 CA CA002056467A patent/CA2056467C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-29 HU HU913723A patent/HU215947B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-11-29 NO NO914724A patent/NO301235B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-11-29 JP JP3339516A patent/JPH05105634A/ja active Pending
- 1991-11-29 IE IE415391A patent/IE914153A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-11-29 PT PT99648A patent/PT99648B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-11-29 FI FI915654A patent/FI104489B/fi active
- 1991-11-29 ZA ZA919453A patent/ZA919453B/xx unknown
- 1991-11-30 KR KR1019910021901A patent/KR100193005B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-02-20 TW TW081101242A patent/TW198040B/zh active
-
1994
- 1994-12-23 US US08/363,982 patent/US5548068A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-30 GR GR980400960T patent/GR3026761T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW198040B (hu) | 1993-01-11 |
| EP0496973A3 (en) | 1993-02-24 |
| EP0496973A2 (en) | 1992-08-05 |
| NO914724D0 (no) | 1991-11-29 |
| FI915654A0 (fi) | 1991-11-29 |
| FI104489B (fi) | 2000-02-15 |
| NO914724L (no) | 1992-06-01 |
| US5548068A (en) | 1996-08-20 |
| AU8830091A (en) | 1992-06-04 |
| JPH05105634A (ja) | 1993-04-27 |
| ATE163045T1 (de) | 1998-02-15 |
| FI915654A (fi) | 1992-05-31 |
| PT99648A (pt) | 1992-10-30 |
| NO301235B1 (no) | 1997-09-29 |
| HUT62327A (en) | 1993-04-28 |
| NZ260103A (en) | 1996-10-28 |
| IL100169A0 (en) | 1992-08-18 |
| PT99648B (pt) | 1999-05-31 |
| KR920009413A (ko) | 1992-06-25 |
| EP0496973B1 (en) | 1998-02-04 |
| GR3026761T3 (en) | 1998-07-31 |
| SG49702A1 (en) | 1998-06-15 |
| DK0496973T3 (da) | 1998-05-04 |
| KR100193005B1 (ko) | 1999-06-15 |
| IE914153A1 (en) | 1992-06-03 |
| CA2056467C (en) | 1998-07-07 |
| DE69128877D1 (de) | 1998-03-12 |
| CA2056467A1 (en) | 1992-05-31 |
| HU913723D0 (en) | 1992-02-28 |
| NZ240718A (en) | 1996-10-28 |
| DE69128877T2 (de) | 1998-06-18 |
| ES2112847T3 (es) | 1998-04-16 |
| AU662493B2 (en) | 1995-09-07 |
| ZA919453B (en) | 1992-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0518587B1 (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| KR950014493B1 (ko) | 제조합 단백질의 개선된 활성화 방법 | |
| US5310882A (en) | Somatotropins with alterations in the α-helix 3 region | |
| IL81020A (en) | History of FSC-MG protein A method for making and using such proteins | |
| HU215947B (hu) | Eljárás alfa-hélix 1, vagy alfa-hélix 1 és alfa-hélix 3 régiójukban módosított szomatotropinok előállítására | |
| US5210028A (en) | Process for the production of unfused igf-ii protein in e. coli | |
| EP0510662A1 (en) | bFGF mutein and its production | |
| KR100554490B1 (ko) | 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도 | |
| IL91457A (en) | Variants of somatotropins and preparations containing those that increase growth and increase milk yield in mammals | |
| EP0319052B1 (en) | Mutant acidic fibroblast growth factor | |
| JPH05271279A (ja) | ヒト副甲状腺ホルモンムテインおよびその製造法 | |
| US4851349A (en) | Expression vectors encoding cardionatrin and cardiodilatin | |
| FI94867B (fi) | Menetelmä granulosyytti-makrofaagi-pesäkkeitä stimuloivan tekijän puhdistamiseksi | |
| JP2602628B2 (ja) | Ｓｍｃ様ポリペプチド及びその産生方法 | |
| NZ260176A (en) | Method for site directed mutagenesis on recombinantly derived polypeptide or protein and its application on somatotropin | |
| CA2240392C (en) | Multimer forms of interleukin-16 (il-16), process for the preparation and use thereof | |
| DE69929590T2 (de) | Vektoren zur kontrollierter expression von rekombinanten genen in prokaryontischen zellen | |
| JP2628883B2 (ja) | 魚類の成長ホルモン遺伝子、該遺伝子の組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含む徴生物、該徴生物による魚類の成長ホルモンの製法及び該成長ホルモンによる魚類の成育促進法 | |
| DE19535445A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von natriuretischen Peptiden über Streptavidin-Fusionsproteine | |
| DK166730B (da) | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |