KR100193005B1 - 소마토트로핀 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소마토트로핀의 알파나선 1에서의 아미노산 변화만을 가지거나 알파나선 3 및/또는 알파나선 2 영역에서의 돌연변이와 조합한 소마토트로핀 유사체, 플러스 소마토트로핀의 천연 아미노산 서열에서 다른 변화를 갖는 조합물에 관한 것이다. 결과생성되는 유사체는 생물학적 활성을 유지하는 한편, 지속 방출 배합물에 배합하기 적당하다. 또한, 단백질 및/또는 폴리펩티드를 암호하는 DNA상에 부위조종 돌연변이 유발을 수행하는 방법도 제공된다.
Description
제1도는 재조합체 돼지 소마토트로핀(recombinant procine somato-tropin ; rpST) DNA의 제한지도이다.
제2도는 플라스미드 pEFF-902의 구조 및 제한지도이다.
제3도는 pGHGEM3Z의 구조 및 부분적인 제한지도이다.
제4도는 이. 콜리에서 rpST 돌연변이 및 발현의 재구성을 위한 발현 벡터이다.
제5도는 효모 발현 플라스미드 YEp352-pST-I122L의 구조이다.
본 발명은 소마토트로핀의 알파나선 1에서의 아미노산 변화만을 갖거나 또는 알파나선 3 및/또는 알파나선 2 부분에서의 돌연변이와 조합된 소마토트로핀 유사체, 및 재조합으로 제조된 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 영역뿐 아니라 알파나선 1에서 변화를 생성하는 방법에 관한 것이다. 외래 소마토트로핀의 투여는 여러가지 동물, 특히 어류 종류뿐 아니라 돼지같은 가축의 성장 기능을 유의 증가시킨다. 특히 가축에서 이 성장증진은 보통 지방 감소와 동반되는 근육 덩어리 부착의 증가로 보다 크고 기름기가 적은 동물을 생기게함을 특징으로 한다. 또한 외래 소마토트로핀을 받은 동물의 사육효율은, 체중증진의 증가 및 동반하는 사료소비의 감소로 인해 유의 개선된다.
소마토트로핀의 외래 투여는 매일 주사와 같은 몇몇 방법으로 실현된다. 그러나, 특정한 경우에 다른 투여 경로가 적절할 수 있다. 예컨대, 한정된 시간동안에 소마토트로핀의 지속적 방출을 하게하는 삽입장치가 특정한 가축을 다룰 때 도움이 될 수 있다. 보다 바람직한 투여경로는 한정된 기간동안 지속적 방출을 하게하는 삽입장치에 의한 것이다. 상기 장치는 소마토트로핀 대량을 매우 고농도(약 500㎎/㎖)로 함유할 것이다. 또한, 높은 용해도를 가지며, 불용성이고 생물학적으로 불활성인 응집체를 형성하는 경향이 낮은 소마토트로핀 분자가 상기 운반 용도에 필요하다.
소마토트로핀은 모여서 α나선 다발을 형성하는 4개의 α나선을 함유한다(Abdel-Meguid 일동, 1987). 대표적으로, 이 구조의 중심으로 돌출되는 아미노산 부사슬은 비극성, 소수성이고 다발의 중앙으로 극성용매(물 또는 염수같은)의 침투를 배제시키기 위하여 매우 빈틈없이 서로 메워진다. 일차 서열에 있어서 돼지 소마토트로핀과 관련된 소의 소마토트로핀의 경우에, 1㎎/㎖ 초과의 단백질 농도 하에서 α나선 3의 소수면(아미노산 잔기 tyrum 내지 leu127)의 노출은, 응집체 형성에서 핵이 되는 것으로 가설이 세워진 연합 중간체의 형성을 촉진한다(Brems 일동 1986 Brems, 1988). 이 연합 중간체는 수개의 개별적인 소마토트로핀 분자로 부터 이 α나선의 교대의 패킹배열을 나타낼 수 있어, 이 나선의 소수면이 수성 환경으로부터 재격리되는 다량체 구조를 생성한다. 연합 중간체의 형성은 α나선 3을 함유하는 단백질 단편을 과량으로 첨가하여 차단시킬 수 있다(Brems 일동, 1986). 더욱이, 위치 112에서 리신을 로이신으로 대체시킴으로써, 이 나선의 소수면을 확장시켜 연합 중간체를 형성하는 경향을 크게 증진시킨다(Brems, 1988).
본 발명은 소마토트로핀의 α나선 3영역을 변경시킴에 의한 소마토트로핀의 낮은 용해도 문제점을 제기한다. 상세하게는, 시험관내에서 증진된 용액 안정성을 갖는 돼지의 소마토트로핀의 α나선 3의 부위조종 돌연변이유발에 의해서 조성된다. 소수와 친수면은 모두 돌연변이 유발의 목표이다. 최근에 소의 소마토트로핀의 α나선 3영역에서 부위조종 돌연변이체 소마토트로핀을 발현하는 유전자전환 생쥐의 억제된 성장을 초래하여, 이 결과는 α나선 3영역이 생물학적 활성을 유지할 수 있는데 중요한 영역임을 시사한다(Chen 일동, 1990).
또한, α나선 3돌연변이는, 적절한 곳에서, 나선 1 또는 나선 2 영역에서 돌연변이와, 그리고 시스테인을 암호하는 DNA가 알라닌 또는 글루탐산을 암호하는 DNA로 대체된, 위치 183과 191에서 시스테인 암호 DNA의 중복 돌연변이와 조합된다. 위치 183과 191에서 중복 돌연변이는 EP355460에서 설명된다. 여기에서 개시된 돌연변이의 사용을 통하여, 증진된 용해도(안정성) 및 이로써 지속 방출을 위해 증진된 성질을 갖는 소마토트로핀이 제공된다. 돼지 소마토트로핀이 지속적 방출형태에서 특히 유용하고, 그것으로써 주요한 관심사가 되는 소마토트로핀이다.
본 발명의 돌연변이의 특히 유용한 예는 돌연변이 I122L이고, 이때 α나선 3의 위치 122에서 이소로이신이 로이신으로 대체된다. 시스테인이 알라닌으로 대체되는 위치 183과 191에서의 다른 돌연변이와의 조합으로, 단백질의 하나의 트립토판 잔기의 전이온도의 유의 증가가 얻어진다. 전이온도는 단백질의 열안정성의 척도이다. 가장 적절한 돌연변이중 하나에서, 증진된 용액 안정성은 I122L 돌연변이 물이, 위치 183과 191에서 시스테인 암호 DNA가 글루탐산을 암호하도록 변경된 돌연변이와 조합될 때 얻어진다. 다른 적절한 돌연변이에서는, 나선 1중복 돌연변이체 A6TS11R이, 아미노산 서열에서 위치 183과 191의 시스테인 암호 DNA가 글루탐산을 암호하도록 변경되는 돌연변이와 조합될 때 증진된 용액 안정성이 실현된다.
제1도 : 넓은 실선은 rpST DNA의 아미노산 암호부분을 나타내고, 가는 선은 5'과 3' 옆에 있는, 비암호 DNA 서열을 나타낸다. 부위조종 돌연변이 유발된 rpST 유전자 영역의 번호를 매기고 제한지도 아래에 나타내며, 여기에서 번호 1은 α나선 1을 암호하는 DNA를 나타내고, 번호 2는 α나선 2를 암호하는 DNA를 나타내고, 번호 3은 α나선 3을 암호하는 DNA를 나타내고 번호 4는 위치 183과 191에 존재하는 시스테인을 암호하는 DNA를 나타낸다. 지도 위의 글자는 여러가지 제한 엔도뉴 클레아제 제한 부위의 위치를 표시하며, RI=EcoRI, N=NdeI, B=BSSHII, S=SacI, X=XbaI, Sm=SmaI 및 H=HindIII.
제2도 : 이 플라스미드는 pBR322 복제 기시점(Ori) 및 암피실린 내성유전자, 박테리오파지 λ로부터의 λPL프로모터, cII 리보좀 결합부위 및 cI 억제유전자, 이. 콜리 rrnB 오페론으로부터 T1T2전사 종료암호, 프로모터없는 deo 조절영역으로부터의 60염기쌍 서열, 및 pGH로 표시된 rpST 유전자를 포함한다. 관련된 제한부위가 표시된다. rpST 함유 DNA는 EcoRI과 HindIII로 처리하여 이 플라스미드로부터 잘라내고 본문에서 설명되는 돌연변이유발 벡터 pGEM3z(f+)로 클로닝한다.
제3도 : 이 파지미드(phagemid)는 f1복제 기시점, pBR322복제 기시점(Ori) 및 암피실린 내성유전자, SP6 및 T7 프로모터, 박테리오파지 λ로부터의 1acZ 유전자 cII 리보좀 결합부위, 및 rpGH로 표시되는 rpST 유전자를 포함한다. 단일가닥 파지미드 DNA는 본문에서 설명되는 부위조종 돌연변이유발을 위한 주형으로서 사용된다.
제4도 : 세균 발현 플라스미드 pR0pST는 세균(이. 콜리)에서 재조합체 돼지 소마토트로핀의 생산에 사용된다. cII 리보좀 결합부위는 EcoRI과 NdeI 제한부위 사이에 위치한다. rpST를 위한 번역개시코돈은 NdeI 부위에 삽입되어 있다. 발현은 λPL프로모터에 의해 가동된다.
제5도 : 이 플라스미드는 YEp352의 유도체이고, 발현이 에스. 세레비시아(S. cerevisiae)로부터의 유발성 GAL1/GAL10 프로모터에 의해 가동되는 rpST 돌연변이물, I122L을 함유한다. 3' 번역안된 DNA는 효모 STE7 유전자로부터 유래된다. 2㎛ 요소는 효모에서의 플라스미드 복제를 지원하고, URA3은 효모에서 형질전환체 선택을 위한 선택성 표식자를 제공한다. 또한 이 플라스미드는 복제의 pBR322 기시점(나타내지 않음)과 암피실린 내성 유전자를 보유한다.
본 발명은 소마토트로핀 분자의 α나선 1영역에서의 아미노산 변화만을 갖거나, 알파나선 3 및/또는 α나선 2영역에서의 돌연변이와 조합한 소마토트로핀(들)에 관한 것이다. 또한, 소마토트로핀 분자에서 다른 돌연변이도 본 발명의 나선 돌연변이물과 조합될 수 있다. 결과 생성된 소마토트로핀은 본래 형태의 소마토트로핀보다 안정(가용성)하고 상기 소마토트로핀의 지속적 방출 배합물로서 배합될 때 생물학적 활성을 유지한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 소마토트로핀은 사람, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 어류 및 조류의 소마토트로핀을 포함한다. 또한, 용어 소마토트로핀은 본래의 소마토트로핀 분자의 다른 부분에서의 삭제, 첨가 및 변경을 포괄한다. 예컨대, 상기 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기 1개 내지 4개가 아르기닌, 리신, 아스파라기닌산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 쓰레오닌 또는 프롤린인, 아미노산들로부터 따로따로 선택되는 1개 내지 4개 아미노산 잔기에 의해 대체된, 또는 4개 시스테인 모두가 시스테인산으로 전환된, 변형된(치환된 또는 제거된 시스테인)또는 유도체화된 소마토트로핀.
그러므로 본 발명의 목적은 본래 형태의 분자보다 가용성이므로, 바람직하게는 지속적 방출 배합물에 배합될 때 생물학적으로 유효한 신규의 소마토트로핀을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 재조합으로 생성된 다른 폴리펩티드 및/또는 단백질 뿐아니라, 본 발명의 소마토트로핀을 제조하기 위한 부위조종ㄹ 돌연변이유발 기술을 제공하는 것이다.
상기 및 본 발명의 부가적 목적은 본 발명의 하기 상세한 설명에 의해 명백할 것이다.
본 특허출원과 관련하여 기탁된 플라스미드, DNA 서열 및 미생물은, 이와달리 지정되는 곳을 제외하고는, 뉴저어지주, 프린스톤(Princeton, New Jersey)에 소재한 American Cyanamid Company's culture collection 에 기탁되며 부다페스트 조약에 따라 미합중국 메릴렌드주 20952 록빌리시(Rockville, Maryland 20952, U. S. A.)에 있는 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된다.
상기에서 언급한 DNA 균주는 1988년 8월 23일에 ATCC에 기탁하였다. 이들은 pGEMpST-SX(ATCC 번호 40482), pR0211(ATCC 번호 40483) 및 pEFF-902(ATCC 번호 40484)이다[89년 특허출원 제12010호에 기탁증명서를 제출하였음]. 이들 DNA는 임의의 적절한 발현시스템내로 삽입하여 본 발명의 소마토트로핀 또는 이의 돌연변이물을 얻을 수 있음을 당분야의 당업자는 알 수 있다.
또한 본 발명의 신규한 동물 소마토트로핀의 몇몇을 발현하는 이. 콜리 K12 세균균주는 1988년 8월 23일에 ATCC에 기탁하였다. 세균균주는 이. 콜리 균주 1655(ATCC 번호 67762), 1655/pR0pSTA34(ATCC 번호 67763), 1655/pR0pSTE34(ATCC 번호 67764), 1655/pR0pST(ATCC 번호 67765), 4200(ATCC 번호 67766), 4200/pR0pSTA34(ATCC 번호 67767), 4200/pR0pSTE34(ATCC 번호 67768), 420/pR0pST(ATCC 번호 67769), 4255(ATCC 번호 67770), 4255/pR0pSTA34(ATCC 번호 67771), 4255/pR0pSTE34(ATCC 번호 67772), 4255/pR0pST(ATCC 번호 67773) 및 4300(ATCC 번호 67774)를 포함한다[89년 특허출원 제12010호에 기탁 증명서를 제출하였음].
또한 하기 이. 콜리 K12 세균균주는 1990년 9월 21일에 ATCC에 기탁하였다. 이들은 pR0pST-SXE-Q21HH22R(ATCC 68410), pR0pST-SXE-G121A(ATCC 64811), pR0pST-SXE-A6TS11R(ATCC 68412), pR0pST-SXA-S81, 87L+I122L(ATCC 68413), pR0pST-SXA-S81, 87L(ATCC 68414), pR0pST-SXA-L82, 84Q+L115K(ATCC 68415), pR0pST-SXA-L82, 84Q(ATCC 68416), pR0pST-SXE-I122L(ATCC 68417), pR0pST-SXA-I122L(ATCC 68418), pST-SX(ATCC 68419), pR0pST-SXA-L118E(ATCC 68420), pR0pST-SXA-E119LQ123L(ATCC 68421), pR0pST-SXA-I122E(ATCC 68422), pR0pST-SXA-M126A(ATCC 68423) 및 pR0pST-SXE-A6TS11R+I122L(ATCC 68424)를 포함한다.
본 발명의 동물 소마토트로핀은 부위조종 돌연변이유발에 의해 제공되나, 펩티드 및/또는 단백질을 화학적으로 합성하는 것과 같은 다른 방법이 상기 소마토트로핀을 생성하는데 사용될 수 있다. 특정한 한정부위에서 클론된 DNA 단편의 DNA 서열의 번경을 위해 현재 이용되는 기술은 그 DNA의 단일가닥 형태의 생산을 필요로한다. 올리고뉴클레오티드가 잘못 짝짓기하는 영역을 그 안에 함유하는 것을 제외하고는, 단일 가닥 DNA 가 그 DNA 일부에 상보인 합성 올리고뉴클레오티드에 어닐링된다. 잘못짝짓기 영역은 보통 올리고뉴클레오티드의 중앙부분에 위치한다. 몇몇 경우에, 또한 올리고뉴클레오티드는 돌연변이물(들) 부위에 또는 부근에 제한 엔도뉴클레아제 인식부위를 함유한다. 그런다음 어닐링된 혼합물은 T4 DNA 리가제(ligase) 및 아데노신 5' 트리포스페이트의 존재 하에서 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I, 큰 단편 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스 페이트의 첨가에 의해서 이중가닥으로 되며 공유적으로 밀접하게 된다. 그런 다음 이중가닥 DNA는 잘못짝짓기된 DNA 영역을 수복하고 복제하는 적절한 이. 콜리 균주내로 형질전환된다.
두 집단의 클론이 얻어진다. 어느 가닥이 수복합성을 위한 주형으로서 선택되는 가에 따라서, 클론은 야생형 또는 변경된(돌연변이된)서열을 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 서열에 해당하는 것이, 돌연변이된 서열을 함유하는 클론은 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드와의 교잡에 의해 선택된다. 올리고뉴클레오티드와 야생형 서열 사이의 잘못짝짓기로 인해, 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 서열을 갖는 클론에 보다 안정하게 결합된다. 그러므로 적절한 온도에서 항온정치는 야생형과 돌연변이된 클론을 구별한다. 올리고뉴클레오티드 또한 제한 엔도뉴클레아제 절개부위를 갖는 경우에, 동계의 제한 엔도뉴클레아제에 의한 후보물 클론의 소화는, 돌연변이된 서열을 가지는 클론을 드러내며 야생형과 돌연변이된 클론을 구별하는 다른 방법을 제공한다. 그런다음 확인된 클론내의 변경물은 관련 영역의 DNA 서열화에 의해 확인된다.
원하는 돌연변이물(들)을 갖는 플라스미드 클론의 제한단편은 세균 또는 효모에서, 그러나 양쪽 모두에서는 아닌, 돌연변이체 유전자 생성물을 발현하는데 적당한 발현 플라스미드내로 재구성된다. 이 재구성은 표준 서브클로닝방법에 의해 수행된다.
하기 논의에서, 재조합체 돼지 소마토트로핀은 본 발명의 변형된 재조합체 소마토트로핀의 대표로서 선택되며 방법은 이들의 제조를 위해 사용된다. 또한, 하기 설명 및 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며 제한하는 것이 아니다.
재조합체 돼지 소마토트로핀의 DNA 및 아미노산 서열은 하기에서 제공된다. 가장 적절한 재조합체 돼지 소마토트로핀은 193 아미노산의 폴리펩티드 서열이며, 여기에서 NH2말단은 변형되어, 뇌하수체 유래 돼지 소마토트로핀의 몇몇 성숙된 형태에서 발견되는 3개의 부가 아미노산(met, asp, gln) 및 첫번째 아미노산(ala)의 삭제를 포함한다. 그러나 NH2말단에서 삭제, 이의 첨가, 및/또는 COOH 말단에서 삭제 및/또는 첨가와 같이, 그의 다른 유도체 뿐 아니라 191 아미노산 PST가 본 발명의 일부를 형성함을 의미한다.
재조합체 pST : NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala-185 아미노산-ala-phe-COOH
뇌하수체 pST : NH2-ala-phe-pro-ala-185 아미노산-ala-phe-COOH
이 변형은 재조합체 pST 단백질에서 2개의 부가적 아미노산의 순증가를 초래하며 EP355460에서 설명된다. 재조합체 돼지 소마토트로핀의 돌연변이된 유도체의 설명에서 사용되는 번호 시스템은 이 부가적 증가를 반영하며, 당분야의 당업자에 의해 쉽게 적용된다.
[pGEMpST-SX DNA의 구성]
단일가닥 pGEMpST-SX DNA는 모든 돌연변이유발 반응을 위한 주형 DNA이고, pGHGEM3Z DNA로부터 부위조종 돌연변이유발에 의해서 제조된다. pGHGEM3Z를 생성하는, 돼지 소마토트로핀(rpST) 유전자의 파지미드 pGEM-3z(f+)로의 클로닝은 하기의 일반적인 방법에 의해 실현된다. pGHGEM3Z 돼지 소마토트로핀(rpST) 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소 EcoRI 과 HindIII로 절개하여 세균의 발현 플라스미드 pEFF-902로 부터 분리한다(제1도). 그런다음 rpST 유전자 함유 단편을 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. 이중가닥 파지미드 DNA pGEM-3z(f+)를 EcoRI과 HindIII로 소화시키고, 송아지 장내 EcoRI 알칼리 포스파타제로 처리하고 큰 단편을 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. 그런다음 2개의 정제된 단편을 함께 혼합하고 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 혼합물을 박테리아내로 형질전환시키고 수개의 결과생성된 집락을 증식시킨다. 플라스미드 DNA는 표준 알칼리 용해법으로 제조하고 구조는 적절한 제한 효소로 소화시켜 결정한다. 예상된 단편을 갖는 클론을 분리하고 pGHGEM3Z라 명명한다.
[pGEMpST-SX]
이 돌연변이의 목적은 α나선 2를 암호하는 DNA 서열이 SacI 제한부 위에 의해 5'쪽에서(DNA 암호영역의 위치 225-230으로부터) 및 XbaI 제한부위에 의해 3'쪽에서(위치 285-290으로부터) 경계를 긋는 rpST DNA 서열을 생성하는 것이다. DNA 서열에서 이들 변경은 rpST 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 이들 제한 엔도뉴클레아제 절개부위의 존재는 나선 2 카셋트의 생성을 나타내므로, 나선 2 암호 DNA에서 돌연변이는 나선 3 암호 DNA에서의 적절한 돌연변이와 편리하고 빠르게 조합될 수 있다.
합성 올리고뉴클레오티드 SacI293과 XbaI353의 DNA 서열은 표 1에서 설명한다. 단일가닥 pGHGEM3Z DNA는 돌연변이유발을 위한 기질이고 표준 원안에 의해서 정제 파지로부터 제조된다. 이 DNA 200ng을 SacI293과 XbaI353 각각 100ng과 혼합하는데, 이들 모두는 5' 말단에서 아데노신 5'트리포스페이트와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 인산화한다. 혼합물은 1X 어닐링 완충액(1X 어닐링 완충액은 75mM KCl과 5mM Tris-Cl, pH 8.0 임)내에 총 부피 10㎕로 함유된다. 혼합물을 65℃에서 7분동안 가열한 후 실온(RT)에서 10분 정치시킨다. 이 절차는 올리고뉴클레오티드가 단일가닥 기질(주형) DNA에 어닐링되게 한다. 어닐링된 분자는 22㎕ H2O, 1㎕ 20mM ATP, T4 DNA 리가아제 및 DNA 폴리머라제 I 큰단편 각각 2 유니트(유니트 정의, New England Biolabs catalogue 참조, 1989), 20㎕ 20X dNTP'S(4개의 데옥시리보뉴클레오티드 5'트리포스페이트 각각 2mM 농도의 혼합물) 및 4㎕ 10X 충전 완충액(1X 충전 완충액은 27.5mM Tris-Cl, pH 7.5, 15mM MgCl2, 2mM DTT 임)을 첨가하여 연장시키고 공유적으로 밀접한 이중가닥 DNA로 전환시킨다. 실온(RT)에서 1시간 정치 후, 반응물의 반을 표준 원안에 의해 HB101 수용세포에 투입한다. 37℃에서 하룻밤 정치후 단일 집락이 나타난다. 플라스미드 DNA는 표준방법에 의해 24집락으로부터 제조되고, SacI과 XbaI으로, 따로따로 반응시켜 소화한다. SacI293과 XbaI353 올리고뉴클레오티드 모두가 rpST 유전자내에 가입된 것을 나타내는, 두 제한부위를 모두 함유하는 플라스미드 DNA는 전술한 바와같이 HB101 수용세포로 도입시켜 부가적으로 정제한다. 플라스미드 DNA를 제조하고 SacI 과 XbaI으로 따로따로 반응으로 소화시켜 플라스미드 DNA 에서 각각의 제한부위의 존재를 입증한 다음, rpST DNA의 관련 영역의 DNA 서열분석으로 확인한다.
[나선 1, 2 또는 3에서의 돌연변이의 합성]
pGEMpST-SX에서 rpST 유전자의 돌연변이유발은 후술되는 바와같이 실현된다. 돌연변이유발 프로그램의 목표는 응집되는 경향이 감소된 rpST 분자를 단백질 고농도(100㎎/㎖)로 생성하는 것이다. 촛점은 나선 3의 소수면인, 아미노산 잔기 112로부터 129까지이고 이것은 응집반응(Brems 일동, 1986)의 개시에서 중요하리라 생각된다. 여기에서 사용되는 rpST 유전자는 아미노 말단에서 부가의 2 아미노산을 암호하기 때문에, 아미노산 잔기의 총수는, 뇌하수체 유래 소 및 돼지의 소마토트로핀에서 발견되는 191 잔기에 반해, 193이다. 잔기 112 내지 129는 소의 소마토트로핀의 잔기 110 내지 127(Abdel-Meguid 일동, 1987)에 상응한다. 돌연변이유발의 타게트인 분자의 다른 영역은 나선 2의 잔기 81 내지 87, 나선 3 및 나선 1의 친수면인 잔기 6 내지 11 이다. 조합적 돌연변이체는 돌연변이유발의 부가적 회수에 의해, 또는 관련 영역의 서브클로닝에 의해 생성된다. L118E 돌연변이물과 모든 다른것들의 예를 얻기위해 사용되는 기본적 원안은 하기에서 설명된다. 기본적인 원안에서의 변이는 적절한 예에서 설명된다.
단일가닥 기질 pGEMpST-SX DNA의 제조는 pGHGEM3Z에 관해 설명한 바와 똑같다. 돌연변이물 L118E, L116의 구성에서 사용되는 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 표 I에서 나타내고 SacI 293에 관해 설명한 바와같이 5' 말단에서 인산화한다. 어니일링 및 충전 반응은 또한 pGHGEM3Z의 SacI 293 돌연변이유발을 위해 설명한 것과 똑같다. 반응 혼합물의 반을 HB101 수용세포에 도입시키고 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 결과생성된 집락을 니트로셀롤로오즈 필터로 옮기고 표준 방법으로 교잡시키기 위해 처리한다. E116 올리고뉴클레오티드는 또한 돌연변이물 검출을 위해 사용된다. 그것은 γ- P-ATP와 폴리뉴클레오티드 키나제로 5' 말단에서 방사선 표지된다. 교잡은 5XSSX(1XSSX는, 0.15M 염화나트륨, 0.015M 시트르산 나트륨 pH 7.0임), 1X Denhardt's(Ficoll, 소혈청 알부민, 폴리비닐 피롤리돈 각각 0.02%(w/v)), 150㎍/㎖ 효모 tRNA 및 방사선 표지된 표지자에서 37℃로 하루밤 동안이다.
교잡 후, 필터를 5XSSC에서 적어도 30분 동안 37℃에서 세척한 후 바람직한 온도로 TAC(TAC은 3M 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 50mM(tris)[하이드로메틸] 아미노메탄 pH 8.0, 1mM EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산), 0.1%(w/v)나트륨 도데실 설페이드임)에서 2번 30분 세척한다. 이 나중 세척의 정치온도는, E116 오리고뉴클레오티드가 완전히 상보적인 클론에만 교잡되므로, 특이성을 결정한다. E116 올리고뉴클레오티드의 경우, 온도는 59.0℃이다. X 선 필름에 노출후, E116에 완전히 상보적인 클론만이 관찰된다. 플라스미드 DNA는 양성으로 표시된 클론 수개로 부터 제조되고, HB101로 재도입시키고 전술한 바와같이 선별한다. 수개의 양성물로 부터의 플라스미드 DNA가 이 두번째 선별 순회로 부터 제조되고 DNA 서열 분석에 의해 조사된다. L118E 돌연변이물을 함유하는 것들이 명확하게 확인된다. 이 돌연변이를 보유한 플라스미드는 pGEMpST-SX-L118E라고 명시한다.
L118E 돌연변이물을 함유한 결과생성된 rpST 유전자 클론은 2개의 발현 벡터, pR0pST-SX 및 pR0pST-SXA 각각에 옮기고, 이들의 구성을 설명한다. 이 구성의 목적은 전술한 SacI과 XbaI 제한부위의 존재에 의해 한정된 나선 2 카셋트 함유 rpST유전자를, 이. 콜리 내의 rpST 유전자의 발현을 위해 고안된 플라스미드 벡터로 도입시키는 것이다. 부가적인 목적은 본 발명에서 설명된 돌연변이물을 2개의 상이한 rpST 유전 배경각각에 도입시키는 것이다. 하나는 위치 183과 191에 2개 시스테인 잔기 각각이 존재하는 천연물(야생형)이다. 다른 rpST 유전자는 동일 위치에서 시스테인 대신 알라닌을 암호하고 EP0 355460에서 설명된다. 플라스미드 pR0pSTA 34(제4도)는 발현 플라스미드 pR0211 내로 클론되는 EcoRI/HindIII 단편을 함유한다. 이 EcoRI/HindIII 단편은 변경된 rpST 유전자를 보유하고, 위치 183과 191에서 시스테인을 암호하는 DNA은 이 위치에서 알라닌 암호 DNA로 돌연변이 되었다. 따라서 그것은 ala, ala 돌연변이물을 보유한다. 플라스미드 pR0pSTA 34는 한 반응 혼합물에서 EcoRI과 HindIII로 소화되고 다른 것에서는 EcoRI과 SmaI으로 소화된다. 큰, 벡터 함유 단편은 각 반응물로 부터 아가로 오스 겔 전기영동에 의해서 정제된다. 그렇지 않으면 야생형 rpST 배경에서 나선 2카셋트를 함유하는 플라스미드 pR0pST-SX는 pGEMpST-SX로 부터의 정제된 EcoRI/HindIII 단편의 연결에 의해 생성된다. 연결 혼합물을 세균균주 N99cI 내로 도입시킨다. 이 균주에서, rpST 발현은 λPL 프로모터에 의해 작동되고, 야생형 λ 억제체의 존재에 의해 방해된다. 원하는 구성을 갖는 결과생성된 플라스미드 클론은 적절한 제한효소로 소화시켜 확인한다. 돌연변이된 rpST 유전자내에 나선 2 카셋트를 함유하는 플라스미드 pR0pST-SXA는, pR0pSTA 34로 부터의 정제된 EcoRI/SmaI 벡터단편을 pGEMpST-SX로 부터의 정제된 EcoRI/SmaI 단편과 연결시켜 생성된다. 연결 혼합물을 세균균주 N99cI에 도입시키고, 결과생성된 플라스미드 클론을 관련된 제한 효소로 소화시켜 분석하여 원하는 플라스미드 클론을 확인한다.
L118E 돌연변이물은 한 셋트의 반응에서 EcoRI과 HindIII로, 다른 셋트의 반응에서는 EcoRI과 SmaI로 pGEMpST-SX-L118E DNA를 절개하여 발현 플라스미드 pR0pST-SX와 pR0pST-SXA내로 도입시킨다. 각 반응 혼합물로부터의 작은, rpST-보유 단편은 L118E 돌연변이물을 함유하며 아가로오스겔 전기영동으로 정제한다. 플라스미드 pR0pST-SX는 EcoRI과 HindIII로 제한하고, 큰 벡터보유단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 정제한다. 이 단편을 pGEMpST-SX-L118E 로부터의 정제된 EcoRI/HindIII 단편과 연결하여, 플라스미드 pR0pST-SX-L118E를 생성한다. 연결 혼합물을, 온도 감수성 λ억제체를 갖는 발현 균주 4300 내로 형질전환시킨다. 이들 균주에서, rpST 발현은 온도에 달려있다. 42℃에서 λ억제체는 불활성이어서, λP프로모터로 부터 발현을 하게 한다.
pR0pST-SX-L118E 플라스미드를 갖는 세균 집락은 42℃(λ억제체에 대해 비허용 온도)에서 rpST 단백질을 생성하는 능력에 의해 확인된다. 플라스미드 pR0pST-SXA는 EcoRI과 SmaI 모두로 제한되고, 큰 벡터 단편은 아가로오스겔 전기영동으로 정제된다. 이 단편은 pGEMpST-SX-L118E로 부터의 정제된 EcoRI/SmaI 단편과 연결하여, 플라스미드 pR0pST-SXA-L1183를 생성한다. 연결 혼합물을 발현 균주 4300내로 형질전환시키고, pR0pST-SXA-L118E 플라스미드를 가진 세균 집락은 42℃에서 rpST 단백질을 생상하는 능력에 의해 확인된다.
[실시예 1]
[2개 합성 올리고뉴클레오티드를 동시에 사용하는 나선 2 카셋트의 생성]
이 돌연변이유발의 목표는 α나선 2를 암호하는 DNA 서열이 SacI 제한부위에 의해 5' 쪽(DNA 암호영역의 위치 225-230으로 부터) 및 XbaI 제한부위에 의해 3'쪽(위치 285-290으로 부터)에서 경계를 짓는 rpST DNA 서열을 생성하는 것이다. DNA 서열에서 이들 변경은 rpST의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 이 제한 엔도뉴클레아제 절개부위의 존재는 나선 2 카셋트의 생성을 나타내어, 나선 2 암호 DNA 에서 돌연변이는 나선 3 암호 DNA 에서의 적절한 돌연변이와 편리하게 및 빠르게 조합된다. pGEMpST-SX의 구성은 전술한 바와같다.
[실시예 2]
[돌연변이유발 올리고뉴클레오티드로 α나선을 안정화하는 친수성 아미노산으로 나선 3의 소수성 아미노산 치환]
이 돌연변이 종류의 일원은 돌연변이물 L118E, L115K, L115KL118E 및 L118EI122K을 포함한다. 돌연변이물은 기본적 원안으로 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 생성된다. 이들 돌연변이물을 보유하는 결과생성된 플라스미드는 각각 pGEMpST-SX-L118E, pGEMpST-SX-L115K, pGEMpST-SX-L115KL118E 및 pGEMpST-SX-L118EI122K로 명시된다. 표 I에서 나타낸 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 K113은 돌연변이유발과 교잡반응 모두에서 사용되는 것을 제외하고는, rpST에서 L115K 돌연변이물의 생성은 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 115에서 로이신에 관한 코돈 CTG로 부터, 리신을 암호하는 AAG로 변화시킨다.
rpST에서 L115KL118E 돌연변이물의 생성은, 표 I에서 나타낸 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 K113E116이 돌연변이유발 반응에서 사용되고, 표 I에서 나타낸 올리고뉴클레오티드 K113E116D가 교잡반응에서 사용되는 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. K113E116 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 115에서 로이신에 관한 코돈 CTG로 부터, 리신을 암호하는 AAG로 변화시키고, 118에서 로이신 코돈 CTG로 부터, 글루탐산을 암호하는 GAG로 변화시킨다. 따라서 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열에서 중복 돌연변이물을 생성한다.
rpST에서 L118EI122K 돌연변이물의 생성은, 표 I에서 나타낸 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 E116I120을 교잡반응에서 사용하는 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. E116K120 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 118에서 로이신에 관한 코돈은 CTG로 부터, 글루탐산을 암호하는 GAG로 변화시키고, 120에서 이소로이신 코돈은 ATG로 부터 리신을 암호하는 AAG로 변화시킨다. 따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열에서 중복 돌연변이물을 생성한다.
[실시예 3]
[돌연변이유발 올리고뉴클레오티드로, 나선 3의 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환]
이 돌연변이물 종류의 일원은 I112E, L118T, L118K 및 L115E를 포함한다. 이들 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 각각 pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-L118T, pGEMpST-SX-L118K 및 pGEMpST-SX-L115E로 명시된다. 이들 돌연변이물의 구성은, 서열이 표 I에서 나타난 올리고뉴클레오티드를 돌연변이유발과 교잡반응 모두에서 사용한 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행한다.
돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 E120은 돌연변이물 I122E(표 I)의 구성에서 사용된다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 122에서 이소로이신에 관한 코돈이 ATC로 부터, 글루탐산을 암호하는 GAG로 전환되도록 한다. E120 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용되고, 니트로셀룰로오즈 필터가 TAC 완충액에서 56℃로 정치되는 것을 제외하고는, 다른 모든 점은 L118E에 관해 전술한 것과 동일하다. 돌연변이물 L118T의 구성은, 돌연변이유발과 교잡 반응 모두에서 사용되는 올리고뉴클레오티드가 L118T(표 I)인 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 것과 똑같이 수행된다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 118에서 로이신에 관한 코돈이 CTG로 부터, 쓰레오닌을 암호하는 ACT로 전환되도록 한다. 원하는 돌연변이물을 함유하는 플라스미드는, 니트로셀룰로오즈 필터가 TAC 완충액에서 56℃로 정치된 후에 비돌연변이물 보유 플라스미드로부터 구별된다.
rpST에서 L115E 돌연변이물의 생성은 표 I에서 나타낸 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 E113EHDQ116이 돌연변이유발 반응에서 사용되고 표 I에서 나타낸 올리고뉴클레오티드 E113D는 교잡반응에서 사용되는 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다.
E113EHDQ116 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 115에서 로이신에 관한 코돈 CTG로 부터, 글루탐산을 암호하는 GAG로 변화시키고, 118에서 로이신 코돈은 CTG로 부터, 글루탐산을 암호하는 GAG, 아스파르트산을 암호하는 GAC, 히스티딘을 암호하는 CAC, 또는 글루타민을 암호하는 CAG로 변화되도록 한다. 위치 118에서 일어나는 여러가지 돌연변이 변화는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 합성동안 생성된 4개 올리고뉴클레오티드의 혼합물인 사실로 기인된다. E113D 방사선 표지된 교잡 표지자에 교잡하는 결과생성된 플라스미드 클론의 DNA 서열화는 이들이 L115E 돌연변이물을 함유하나, 위치 118에서 임의의 4개 가능한 돌연변이물을 갖지 않음을 나타낸다. 따라서, 이 돌연변이유발은 위치 115에서 단 하나의 돌연변이물을 생성한다.
rpST에서 L118K 돌연변이물의 생성은, 서열을 표 I에서 나타낸 돌연변이유발올리고뉴클레오티드 L118TK가 사용되는 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. L118TK 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 118에서 로이신에 관한 코돈이 CTG로 부터, 리신을 암호하는 AAG로, 또는 CTG로 부터 쓰레오닌을 암호하는 CAG로 변화시킨다. 위치 118에서 일어나는 돌연변이 변화에 관한 여러가지 가능성은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 합성동안 생성된 2개 올리고뉴클레오티드의 혼합물인 사실로 기인된다. L118TK 방사선 표지된 교잡 표지자와 교잡하는 결과생성된 플라스미드 클론의 DNA 서열화는 이들이 L115 돌연변이물을 함유하고, 어떤 것도 위치 118에서 다른 가능한 돌연변이물, L118T를 보유하지 않음을 나타낸다. 따라서, 이 돌연변이유발은 위치 118에서 하나의 돌연변이물을 생성한다.
[실시예 4]
[돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용하여 소수성 아미노산으로 나선 3의 친수성 아미노산을 치환]
이 돌연변이 종류의 하나의 일원은 중복 돌연변이체 E119LQ123L 이다. DNA 서열분석으로 확인된,이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 pGEMpST-SX-E119LQ123L 이다. 이 중복 돌연변이체 rpST 유전자의 구성은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 L117, 121이 사용되는 것(표 I)을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 같이 수행된다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열을 변경시켜 글루탐산을 암호하는 DNA가 GAG로 부터 로이신을 암호하는 CTG로 변화되고, 위치 123에서 글루타민을 암호하는 DNA는 CAG로 부터 로이신을 암호하는 CTG로 변화시킨다. 서열이 표 I에 나타난 Leu 117121D는 교잡반응에서 방사선 표지된 표지자로서 사용되는 한편, 돌연변이유발 반응은 이 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 이 돌연변이물의 구성에서 사용되는 모든 방법은, 니트로셀룰로오즈 필터를 TAC에서 58℃로 정치하여 돌연변이물 보유 플라스미드를 검출하는 것을 제외하고는, L118E에 관해 전술한 바와 같다.
[실시예 5]
[작은 부사슬을 가진 비극성 아미노산으로, 나선 3의 큰 부사슬을 가진 비극성 아미노산을 치환]
이 돌연변이물 종류의 일원은 L115A, L118A 및 M126A를 포함한다. 이들 돌연변이물 보유 플라스미드는 각각 pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-L118A 및 pGEMpST-SX-M126A로 명시된다. 이들 돌연변이물의 구성은 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 및, 필요하면, TAC 세척 온도를 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다.
돌연변이물 L115A의 구성에서 사용된 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 표 I에 나타낸다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자 서열을 변경시켜 위치 115에서 로이신에 관한 코돈이 CTG로 부터 알라닌을 암호하는 GCG로 전환되도록 한다. L115 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용된다. 원하는 돌연변이물을 함유하는 플라스미드는 니트로셀룰로오즈 필터를 TAC 완충액에서 56℃로 정치시킨 후 비돌연변이물 보유 플라스미드와 구별된다.
rpST에서 L118A 돌연변이물의 생성은, 돌연변이 유발과 교잡/선별반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가, 서열이 표 I에 나타난 L118A인 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 것과 똑같이 수행된다. L118A 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 118에서 로이신에 관한 코돈이 CTG로 부터, 알라닌을 암호하는 GCG로 변화되도록 한다. 돌연변이물 보유 플라스미드는 TAC 완충액에서 56℃로 니트로셀룰로오스를 정치시켜 검출된다. DNA 서열분석에 의해 확인된, 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-L118A로 명시된다.
rpST에서 M126A 돌연변이물의 생성은, 돌연변이유발 및 교잡/선별반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 서열이 표 I에 나타난 A124-2인 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. A124-2 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 126에서 메티오닌에 관한 코돈이 ATG로 부터 알라닌을 암호하는 GCA로 변화하도록 한다. 돌연변이물 보유 플라스미드는 니트로셀룰로오스 필터를 TAC 완충액에서 56℃로 정치시켜 검출한다. DNA 서열분석으로 확인된, 이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 pGEMpST-SX-M126A로 명시된다.
[실시예 6]
[로이신으로 이소로이신 122를 치환]
이 돌연변이물 종류의 일원은 I122L, I122LL118A 및 I122LM126A를 포함한다. 이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 각각, pGEMpST-SX-I112L, pGEMpST-SX-I112LL118A 및 pGEMpST-SX-I122LM126A로 명시된다.
이 돌여변이물의 구성은 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 및, 필요하면, TAC 세척 온도를 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다.
돌연변이물 I122L, L120-3의 구성에서 사용되는 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 표 I에서 나타낸다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자 서열을 변경시켜 위치 122에서 이소로이신에 관한 코돈이 ATC로 부터 로이신을 암호하는 CTG로 전환되게 한다. L120-3 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용된다. 원하는 돌연변이물을 함유하는 플라스미드는 니트로셀룰로오즈 필터가 TAC 완충액에서 56℃로 정치된 후 비돌연변이물 보유 플라스미드와 구별된다.
rpST에서 I122LL1118A 돌연변이의 생성은, 돌연변이유발 및 교잡/선별 반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 L118A이고, 돌연변이 유발을 위해 사용되는 주형 DNA는 pGEMpST-SX-I122L인 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. 주형 DNA는 pGEMpST-SX DNA에 관해 설명한 바와 똑같이 제조된다. 돌연변이물 보유 플라스미드는 니트로셀룰로오즈 필터를 TAC 완충액에서 56℃로 정치시켜 검출한다. DNA 서열 분석으로 확인되는 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-L118AI122L로 명시된다. rpST에서 I122LM126A 돌연변이물의 생성은 돌연변이유발 및 교잡/선별반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 A124-2이고, 돌연변이유발을 위해 사용되는 주형 DNA는 pGEMpST-SX-I122L 인 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. 주형 DNA는 pGEMpST-SX DNA에 관해 설명한 바와 똑같이 제조된다. 돌연변이물 보유 플라스미드는 니트로 셀룰로오스 필터를 TAC 완충액에서 56℃로 정치하여 검출한다. DNA 서열분석으로 확인된, 이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 pGEMpST-SX-I122LM126A로 명시된다.
[실시예 7]
[나선 3의 친수면에서 아미노산 잔기의 치환]
이 돌연변이물 종류의 일원은 G121A, K114R, 및 K116R을 포함한다. 이들 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 각각 pGEMpST-SX-G121A, pGEMpST-SX-K114R 및 pGEMpST-SX-K116R로 명시된다. 이들 돌연변이물의 구성은, 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 및, 필요하면, TAC 세척온도를 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다.
돌연변이물 G121A, G121A/XmnI의 구성에서 유용한 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 표 I에서 나타낸다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 121에서 글리신에 관한 코돈이 GGC로 부터 알라닌을 암호하는 GCT로 전환되도록 한다. 이 올리고뉴클레오티드는 또한 rpST DNA서열과 상이하여, XmnI 제한 인식 부위(5'-GAAGCTATTC-3')는 rpST DNA 서열로 가입된다. G121A 돌연변이물을 제외하고는, 부가의 뉴클레오티드 변화는 rpST 단백질의 아미노산 서열 변화를 초래하지 않는다. G121A/XmnI 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용되고, 모든 다른 면에서는 전술한 것과 동일하다. 후보물 돌연변이물-보유 클론은 니트로셀룰로오즈 필터를 TAC 완충액에서 57.5℃로 정치하고, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 G121A 돌연변이물의 존재에 특징적인 XmnI 부위의 획득을 조사함으로써 검출된다. DNA 서열분석에 의해 수행된, 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-G121A로 명시된다.
rpST에서 K114R 돌연변이의 생성은, 돌연변이유발 및 교잡/선별 반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가, 표 I에서 서열이 나타난 K114R/AccI 인 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. K114R/AccI 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 114에서 리신에 관한 코돈이 AAG로 부터 아르기닌을 암호하는 CGT로 변화되도록 한다. 또한 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열과 상이하여, AccI 제한인식부위(5'-GTATAC-3')가 rpST DNA 서열로 가입된다. K114R 돌연변이물을 제외하고는, 부가적인 뉴클레오티드 변화가 rpST 단백질의 아미노산 서열 변화를 초래하지 않는다. G121A와 같이, 추정되는 돌연변이물 보유 클론은 니트로셀룰로오스 필터를 TAC 완충액에서 57.5℃로 정치하여 검출하고, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 K114R 돌연변이물의 존재에 특징적인 새로운 AccI 제한 부위의 획득을 조사한다. DNA 서열 분석으로 확인된, 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-K114R로 명시된다.
rpST에서 K116R 돌연변이물의 생성은, 돌연변이유발 및 교잡/선별반응 모두에서 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가, 서열이 표 I에 나타난 K116R/BalII인 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. K116R/BalII 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 116에서 리신에 관한 코돈이 AAG로 부터, 아르기닌을 암호하는 CGA로 변화되도록 한다. 또한 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열과 상이하여, BglII 제한인식부위(5'-AGATCT-3')가 뉴클레오티드 서열의 위치 342-347로부터 rpST DNA 서열로 가입되도록 한다. K116R 돌연변이물을 제외하고는, 부가의 뉴클레오티드 변화가 rpST 단백질의 아미노산 서열 변화를 초래하지 않는다. G121A와 같이, 추정상의 돌연변이물 보유 클론은 니트로셀룰로오스 필터를 TAC에서 57.5℃로 정치시켜 검출하고 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 K116R 돌연변이물의 존재에 특징적인 새로운 BalII 제한부위의 획득에 관해 조사한다. DNA 서열분석에 의해 확인된, 이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 pGEMpST-SX-K116R로 명시된다.
[실시예 8]
[2개의 합성 올리고뉴크레오티드를 동시에 사용하여 소수성 아미노산 잔기로 나선 2의 친수성 아미노산을 치환]
이 돌연변이물 종류의 일원은 중복 돌연변이물 S81,87L이다. DNA 서열분석으로 확인된, 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-S81, 87L로 명시된다. 중복 돌연변이체 S81, 87L의 구성에서 사용되는 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드, S81L 및 S87L의 DNA 서열은 표 I에 나타낸다. S81L 및 S87L올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 81과 87에서 각각 세린에 관한 코돈이 TCG로 부터, 로이신을 암호하는 TTG로 전환되도록 한다. 이 중복 돌연변이체 rpST 유전자의 구성은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 모두가 돌연변이유발 반응에서 동시에 사용되는 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같다. S81L 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡 반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용되고, 필터가 TAC 완충액에서 54℃로 세척되는 것을 제외하고는 모든 다른 면이 L118E에 관해 설명한 것과 동일하다. 추정상의 양성 돌연변이물-보유 플라스미드 클론을 갖는 세균의 형질전환체를 선택하고, 니트로셀룰로오스 필터로 옮기고 교잡 처리한다. 이 두번째 선별순회에서, S87L 올리고뉴클레오티드는 방사선 표지된 표지자로서 사용되고 필터는 TAC 완충액에서 54℃로 세척된다.
[실시예 9]
[친수성 아미노산 잔기로 나선 2의 소수성 아미노산 잔기를 치환]
이 돌연변이물 종류의 하나의 일원은 중복 돌연변이물, L82, 84Q이다. DNA 서열분석으로 확인된 이 돌연변이물 보유 플라스미드는 pGEMpST-SX-L82, 84Q로 명시된다. 돌연변이물 L82, 84Q의 구성에서 사용되는 합성 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 Q8082이고 표 I에서 나타낸다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 82와 84에서 로이신에 관한 코돈이 각각 CTG 및 CTC로 부터 글루타민을 암호하는 CAG로 전환되도록 한다. 돌연변이물 보유 플라스미드는 니트로셀룰로오스 필터를 58℃의 TAC 완충액에서 정치시켜 검출한다.
[실시예 10]
[나선 2 및 나선 3 조합 돌연변이물의 구성]
나선 3의 소수면의 소수 특성을 보유하거나(I122L, M126A) 증가시키는 (E119LQ123L) 수개의 나선 3 돌연변이물, I122L, M126A, 및 E119LQ123L은 하기 서브클로닝 반응에 의해서 소수성 나선 2 중복 돌연변이물 S81, 87L과 조합한다. 플라스미드 pGEMpST-SX-S81, 87L은 XbaI과 ECoRI으로 제한시킨다. 작은 단편은 아가로오스겔 전기영동으로 정제하고 S81, 87L 돌연변이물을 함유한다. 플라스미드 pR0pST-SXA-I122L은 또한 XbaI과 EcoRI 순서로 제한하고, 유사하게 큰 단편을 정제한다. 큰 단편은 pR0pST 발현벡터 성분 및 pST 돌연변이물 I122L 및 위치 183과 191에서 시스테인의 알라닌으로의 치환물을 보유한다. 이 큰 단편 및 작은 S81, 87L 단편은 T4 DNA 리가아제와 ATP의 존재 하에 연결시킨다. 반응 혼합물의 반을, CaCl로 처리하여 수용체로 만든 발현 균주 4300내로 도입된다. 형질 전환된 세포를 30℃에서 하룻밤 배양한다. 플라스미드 보유 세포를 실시예 12에서 설명한 바와 같이 pST 발현에 관해 분석하고 이 나선 2/나선 3 조합물을 함유하는 플라스미드는 pR0pST-SXA-S81, 87L+I122L로 명시된다.
pR0pST-SXA-M126A와 pR0pST-SXA-E119LQ123L이 각각 pR0pST-SXA-S81, 87L+M126와 pR0pST-SXA-E119LQ123L을 생성하기 위한 발현 벡터성분 및 나선 3 돌연변이물(들)의 공급원으로서 사용되는 것을 제외하고는, 조합 돌연변이물 pR0pST-SXA-S81, 87L+M126A 및 pR0pST-SXA-S81, 87L+E119LQ123L은 pR0pST-SXA-S81, 87L+I122L에 관해 설명한 바와 똑같이 구성된다.
돌연변이체 나선 2DNA의 공급원이 pGEMpST-SXA-82,84Q이고 나선 3돌연변이물 L115K의 공급원이 pR0pST-SXA-L115K인 것을 제외하고는, 나선 2중복 돌연변이물 L82,84Q는 S81,87L+I122L에 관해 설명한 바와 똑같이 나선 3 돌연변이물 L115K와 조합된다. 이 조합을 함유하는 플라스미드는 pR0pST-SXA-L82, 84Q+L115K로 명시한다.
[실시예 11]
[돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용하여 나선 1내에 또는 부근의 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환]
이 돌연변이의 목적은 rpST의 NH말단부분에서 발견되는 소수성 아미노산 잔기를, 사람 성장 호르몬의 동일한 상대적 위치에 존재하는 친수성 아미노산 잔기로 대체하는 것이다.
이 돌연변이 종류의 일원은 rpST 중복 돌연변이물 Q21HH22R, 중복 돌연변이물 S11RA14D 및 단일 돌연변이물 A6T 및 A14D를 포함한다. 이들 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 DNA 서열분석에 의해 확인되며 각각, pGEMpST-SX-Q21HH22R, pGEMpST-SX-S11RA14D, pGEMpST-SX-A6T 및 pGEMpST-SX-A14D로 명시된다. 이들 돌연변이물의 구성은 사용되는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드, TAC완충액에서 니트로셀룰로오스 필터의 정치온도, 및 적절하면, 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 양성의, 돌연변이물 보유 플라스미드에 관한 부가의 선별을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다.
중복 돌연변이물 Q21HH22R, Q21HH22R/ClaI의 구성에서 사용되는 합성돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 표 I에 나타낸다. 이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자의 서열을 변경시켜 위치 21에서 글루타민에 관한 코돈이 CAG로부터, 히드티딘을 암호하는 CAT로 전환되고 위치 22에서 히스티딘이 CAC로부터, 아르기닌을 암호하는 CGA로 전환되도록 한다. 이들 돌연변이물에 포함된 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 절개부위(5'-ATCGAT-3')는 변경된 rpST 유전자에 유일하다. Q21HH22R/ClaI 올리고뉴클레오티드는 또한 교잡 반응에서 방사선 표지된 검출 표지자로서 사용되고, 모든 다른 면은 전술한 것과 동일하다. 이 돌연변이의 구성에서 사용되는 모든 방법은, 필터를 56℃, TAC 완충액에서 세척하는 것을 제외하고는, L118E에 관해 전술한 바와 같다. 또한, 후보물 돌연변이물-보유 클론은 ClaI 부위의 획득에 관해 조사하는데, ClaI 부위는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 Q21HH22R 중복 돌연변이물의 존재에 특징적이다.
rpST에서 A6T 돌연변이의 생성은, 표 I에 나타낸 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 A6T가 돌연변이유발과 교잡반응 모두에서 사용되는 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. A6T 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 6에서 알라닌에 관한 코돈이 GCC로부터, 쓰레오닌을 암호하는 ACC로 전환되게 한다. 교잡후, 세균 함유 니트로셀룰로오스 필터를 52℃, TAC 완충액에서 세척한다.
S11RA14D 중복 돌연변이의 생성은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 S11RA14D/SalI이 돌연변이유발 및 교잡반응 모두에서 사용되고, 니트로셀룰로오즈 필터가 64℃, TAC 완충액에서 세척되는 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. S11RA14D/SalI 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 11에서 세린코돈이 AGC로부터, 아르기닌을 암호하는 CGA로 전환되고, 위치 14에서 알라닌 코돈이 GCC로부터, 아스파르트산을 암호하는 GAC로 전환되도록 한다. 또한 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열과 상이하여 SalI 제한인식부위(5'-GTCGAC-3')가 뉴클레오티드 서열의 위치 29-34로부터 rpST DNA 서열로 가입되게 한다. S11R 및 A14D 돌연변이물의 경우를 제외하고는, 부가의 뉴클레오티드 변화가 rpST 단백질의 아미노산 서열 변화를 나타내지 않는다. 추정상의 돌연변이물 보유 클론은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 S11RA14D 중복 돌연변이물의 존재에 특징적인, 새로운 SalI 제한 부위의 획득에 관해 조사한다.
A14D 단일 돌연변이의 생성은, 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드 A14D/Hind III가 돌연변이유발과 교잡반응 모두에서 사용되는 것을 제외하고는, L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. A14D/Hind III 올리고뉴클레오티드는 rpST 서열을 변경시켜 위치 14에서 알라닌 코돈이 GCC로 부터, 아스파르트산을 암호하는 GAC로 전환되게 한다. 또한 이 올리고뉴클레오티드는 rpST DNA 서열과 상이하여 Hind III 제한인식부위(5'-AAGCTT-3')가 뉴클레오티드 서열의 위치 30-35로부터 rpST DNA 서열내로 가입된다. A14D 돌연변이물의 경우를 제외하고는, 부가의 뉴클레오티드 변화가 rpST 단백질의 아미노산 서열 변화를 나타내지 않는다. 추정상의 돌연변이물 보유 클론은 62℃, TAC 완충액에서 니트로셀룰로오스 필터를 정치하여 검출하고, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드에 존재하므로 플라스미드 클론에서 A14D 돌연변이물의 존재에 특징적인 새로운 Hind III 제한부위의 획득을 조사한다.
[실시예 12]
[pST 돌연변이물을 적절한 세균 발현 플라스미드로 재구성]
변경된(돌연변이물 보유) 클론은 pR0pST, pR0pSTA 34 및 pR0pSTE 34로 명시되는, 세균발현 플라스미드 pR0211의 유도체(EP0173280 특허출원에서 설명됨)내로 재구성된다. 플라스미드 pR0pST는 발현벡터 pR0211내로 클론되는 pST DNA를 함유하고 위치 183과 191에서 시스테인 암호 DNA를 함유한다. pR0pSTA 34는 알라닌 암호 DNA를 함유하고 pR0STE 34는 이들 위치에서 글루탐산 암호 DNA를 함유한다. pGEMpST 변경된 클론은 EcoRI과 SmaI으로 소화시키고 작은 pST 돌연변이물 보유 단편을 분리한다. pR0pSTA 34 DNA는 유사하게 처리하고, 큰 벡터 함유 DNA 단편을 분리한다. 이 정제된 단편을 T4 DNA 리가아제로 서로 연결시키고 적절한 세균균주 예컨대 4300 내로 형질전환 한다. 이 균주는 온도 감수성 λ억제체(cI )를 함유하여, λP프로모터로부터의 발현은 30℃에서 방해되나, 억제체가 불활성화되는 온도인 42℃에서 허용된다. 변경된 pGEMpST DNA 단편의 pR0pSTE 34 DNA 내로의 도입은 pR0STA 34에 관해 설명한 바와 똑같이 수행된다. 변경된 pGEMpST DNA 단편의 pR0pST 내로의 도입은, pGEMpST와 pR0pSTA 34 플라스미드가 모두 EcoRI과 Hind III로 소화되는 것을 제외하고는, pR0pSTA 34에 관해 설명한 것과 동일하다. 표 II는 돌연변이된 pST유전자가 도입되는 세균발현 플라스미드를 기재한다. pST 돌연변이물 A6T, S11RA14D 및 Q21HH22R은 pR0pSTE 34에 관해 설명한 바와 같이 pR0pSTE 34유도체 내로 도입된다. 이 유도체, pR0pSTE 34 TT는 이. 콜릭 rrnB 오페론(리보좀 RNA B 오페론)으로부터의 전사종료암호 TT를 함유하는, pST 암호 DNA의 3' 말단에서 약 1kb Hind III 단편을 함유한다.
[실시예 13]
[나선 1 조합 돌연변이체 A6TS11R+E34 및 P8TS11R+E34의 구성]
위치 6에서 알라닌이 쓰레오닌으로 대체되고 위치 11에서 세린이 아르기닌으로 대체된 중복 돌연변이물 A6TS11R은, 위치 183과 191에서 시스테인을 암호하는 DNA를 글루탐산으로 대체한 E34 돌연변이물(EP355460에서 설명됨)과 조합한다. 그러므로 결과생성된 rpST 유전자는 rpST DNA의 NH-(A6TS11R)과 COOH-암호영역(E34) 모두에서 돌연변이물을 함유한다. 결과 생성된 플라스미드는 pR0pSTE-A6TS11R로 명시된다. A6TS11R 돌연변이을 함유하는, pML/pGH14로부터의 변경된, 작은 rpST 함유 EcoRI/SmaI 단편은 플라스미드 pR0pSTE-TT로부터의 EcoRI/SmaI 큰 단편에 연결된다. 이 후자의 플라스미드는 pST 발현 플라스미드이고, 이것은 또한 rpST 암호 DNA의 3' 말단에 이. 콜리 rrnB 오페론으로부터의 강한 전사 종료암호(TT)를 함유한다.
위치 8에서 프롤린 암호 DNA가 돌연변이되어 쓰레오닌을 암호하고 세린 암호 DNA가 돌연변이되어 아르기닌을 암호하는, 다른 중복 돌연변이물, P8TS11R은, 위치 183과 191에서 시스테인을 암호하는 DNA가 글루탐산으로 대체된 E34 돌연변이물(EP355460에서 설명됨)과 조합된다. 그러므로 결과 생성된 rpST 유전자는 rpST DNA의 NH-(P8TS11R)과 COOH-암호영역(E34) 모두에 돌연변이물을 함유한다. 결과생성된 플라스미드는 pR0pSTE-P8TS11R로 명시된다. 동일한 전력이, P8TS11R 중복 돌연변이물을 함유하는 플라스미드 pML/pGH18이 변경된 rpST DNA의 공급원으로서 사용되는 것을 제외하고는, pR0pSTE-A6TS11R에서와 같이 pR0pSTE-P8TS11R의 구성에서 사용된다.
[A6TS11R과 I122L+E 34 및 P8TS11R+I112L+E 34]
전술한 I122L 나선 3 돌연변이물을 두 나선 1 돌연변이물, A6TS11R 및 P8TS11R 및 E34 돌연변이물 각각과 조합한다. 결과생성된 플라스미드는 각각, pR0pST-SXE-A6TS11R+I122L 및 pML/pGH18-SXE-I122L로 명시된다. pR0pST-SXE-A6TS11R+I122L은 작은 I122L 함유 BssH II/Hind III 단편을, pR0pSTE-A6TS11R 로부터 정제한 큰 Bss H II/Hind III 단편과 연결시킴으로써 구성된다. 이 결과생성된 플라스미드는 전술한 나선 2 암호 DNA의 5'과 3' 말단 옆에 있으나 TT전사 종료암호를 함유하지 않는 SacI과 Xba I 제한부위에 의해 한정된, 나선 2 카셋트를 함유한다. 플라스미드 pML/pGH18-SXE-I122L는 플라스티드 pML/pGH18이 P8TS11R 중복 돌연변이물을 보유하는, 큰 단편의 공급원으로서 사용되는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 구성된다. 이 변경된 플라스미드는 TT전사 종료암호를 함유하지 않으나, 나선 2 카셋트를 보유한다.
[실시예 14]
[변형된 재조합체 소마토트로핀의 안정성 윤곽]
안정성 윤곽을 결정하기 위해 설명되는 방법은 하기와 같다. 인산염 완충 식염수 pH 7.4(증류수 1000㎖에 용해된 NaHPOHO 3.45g, NaHPO3.55g, NaCl 9.50g)에서 재조합체(동물) 소마토트로핀 유도체의 농축용액(100㎎/㎖ 까지)이 제조된다. 이것은 밀리포어 살균 Millex-0.22㎛ 필터 유니트를 통해 여과시키고 0.1㎖ 부분표본을 시험관 안에 넣는다. 이들을 43℃ 오븐에 넣고 필요한 간격으로 제거한다. 그런다음 내용물을 인산염 완충 식염수로 희석한다. 상징액은 HPLC에 의해 단량체 및 이량체 함량에 관해 조사한다. 질량 평형을 수행한다. 임의의 침전 물질을 기록한다. 결과를 초기 농도와 비교하고 안정성 윤곽을 기록한다.
대신으로, pH 7.4에서 불량한 용해도를 나타내는 소마토트로핀 유도체를 덜 적절한 pH(4-10)에서 용해시키거나 현탁액으로서 평가한다.
변경된 rpST 단백질에 관한 용액 안정성 연구 결과를 표 III에 요약한다.
[실시예 15]
[재조합체(동물) 소마토트로핀 유도체를 받은 동물의 성장 증진을 측정하기 위한 하수체절제된 쥐의 시험방법]
동물의 성장율을 변경시키는 본 발명의 재조합체 동물 소마토트로핀 유도체의 효율은 하수체 절제된(hypox) 쥐의 분석을 이용하여 결정한다. 하수체 절제된 쥐는 자신의 소마토트로핀을 생산하지 않으며 주입된 소마토트로핀에 대한 감수성이 있다. 측정된 반응은 10일과 같은 기간에 걸친 성장이고 매 시행에 포함된 rpST 양성 대조표준의 생물학적 활성%로서 표 IV에 나타낸다.
a. 하수체 절제된 쥐의 결과는 양성 대조표준으로서 사용되는 rpST 표준물의 활성%로 나타낸다.
b. RRA-간 방사선-수용체 분석결과는 rpST 표준물로 관찰된 활성%로서 나타낸다.
nd : 측정안됨.
한번 이상의 측정이 수행되는 때는, 평균을 나타내고, 측정 횟수를 괄호안에 나타낸다.
[실시예 16]
[시험관에서 소마토트로핀 수용체 결합하는 변경된 재조합체 소마토트로핀의 능력을 측정하기 위한 간의 방사선-수용체 조사]
시험관내 방사선 수용체 조사는 정제된 간막으로 부터의 소마토트로핀 수용체와의 결합에 있어서 I-rpST와 경쟁하는 본 발며의 재조합체 소마토트로핀의 능력을 평가하기 위해 사용된다. 이들 분석의 결과는 rpST 결합%로 나타내고 표 IV에 표시한다.
[실시예 17]
[rpST 돌연변이체 I122L+E34로 수행되는 질소 평형 실험]
I122L 돌연변이물을 보유하는 변경된 rpST 단백질의 생물학적 활성을 생체내에서 평가하기 위해서, 질소 평형 연구를 EP355460에서 설명된 바와 같이 수행된다. 성장하는 돼지에 pST를 피하 투여하여 주로 근육으로서, 체내에 부착되는 단백질의 양을 증가시킨다. 질소 평형시험의 사용은 동물에 침적된 단백질 양의 변화의 척도를 제공한다. 단백질은 고정된 양의 질소를 함유하므로, 질소에 관해 가축사료와 배설물을 분석하는 것은 단백질 침적상태의 정확한 견적을 제공한다. 따라서 질소 평형은 사료에서 소비된 질소량과 뇨 및 배설물에서 배출된 양의 측정이고 보유된(침적된) 양은 그 차이에 의해 계산된다. 질소 보유는 소화된 질소량(소비된 질소-배설된 질소)의 백분율로서 보유되는 질소량으로서 가장 정확하게 견적된다. 이 연구에서, 위치 183과 191에서 시스테인 잔기 또는 rpST I122L 변이물은 글루탐산으로 대체된다. 이 분석결과는 rpST 대조표준에 비교한 변경된 rpST 분자의 충분한 생물학적 활성을 입증한다.
[실시예 18]
[형광 분광분석법을 사용하여 열안전성의 측정]
변경된 rpST의 열안정성은 온도의 함수로서 내재하는 트립토판 형광을 측정하여 추론된다. rpST 분자는 하나의 트립토판 잔기를 함유하고, 이의 내재하는 형광은 천연상태에서 거의 꺼져있다. 온도 증가 또는 pH 감소는 형광에있어 특징적 증가를 일으키고, 이것은 아마도 그렇지 않으면 묻히는 트립토판 잔기의 적어도 바로 근방에서 구조의 손실로 기인된다.
형광의 용융 분포대 온도증가는 S자형 곡선을 나타내고, 여기에서 형광은 주어진 rpST 유도체에 특징적인 온도까지는 꺼져있다. 그런다음 상당히 좁은 온도 범위에 걸쳐서 형광의 급속한 증가가 잇달아 일어난다. 형광에서 이 증가의 중간 지점을 한정하는 온도를 T으로 명시하며 단백질의 열안정성의 반영이다. 본 발명의 rpST의 T은 295㎚가 여기 파장으로서 사용되고 방사형광은 355㎚ 차단 필터를 사용하여 판독하는 것을 제외하고는 1966년, Burger 일동의 방법으로 측정한다. 본 발명의 rpST의 T은 표 IV에서 요약한다. 이 데이타는 I122L에 관해 79℃의 T으로 현저한 증가를 나타낸다.
[실시예 19]
[폴리머라제 연쇄 반응 방법에 의한 I122L 돌연변이물의 생성]
I122L 돌연변이물은 Sarkar 및 Sommer(1990)에 의해 설명된 폴리머라제 연쇄반응 기술의 적용을 이용한 부위조종 돌연변이에 의하여 rpST유전자에 도입시킨다. 사용된 3개 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표 I에 기재하고 올리고뉴클레오티드 SacI293, L120-3 및 PvuII634를 포함한다. 플라스미드 pGEMpST-SX로 부터의 rpST 유전자 함유 EcoRI/Hind III 단편이 주형으로서 사용된다. 폴리머라제 연쇄반응(이하 PCR이라 함)의 15회 순환은 제조업자가 상술한 바와같이 L120-3 및 PvuII634올리고뉴클레오티드 프라이머, dNTP's 및 Taq DNA 폴리머라제 각각 1μM로 1ng 주형 rpST DNA상에서 수행한다. 이 반응은 277 bp DNA 단편을 생성하고 I122L 돌연변이물을 함유한다. 이 단편은 아가로오스 겔 전기영동으로 정제하고 올리고뉴클레오티드 프라이머 SacI9293과 rpST 함유 EcoRI/Hind III 주형 단편을 조합하여 PCR 15회 부가 순환에서 PCR프라이머로서 사용된다. 결과생성된 36abp 단편은 제한 엔도뉴클레아제 SacI 과 PvuII로 절개하고 아가로오스 겔 전기영동으로 정제하고 크고 겔정제된, SacI/PvuII pGEMpST-SX DNA 단편에 연결한다. 연결 혼합물을 HB101 수용세포내로 형질전환된다. 결과생성된 형질전환체의 플라스미드 DNA는, 올리고뉴클레오티드 L120-3이 방사선 표지된 교잡 표지자로서 사용되고 단지 1회의 선별이 수행되는 것을 제외하고는 L118E에 관해 설명한 바와 똑같이 I122L 돌연변이의 존재에 관해 선별한다. I122L 돌연변이물의 존재 및 PCR 반응물에 의해 도입된 부가의 돌연변이물의 부재가 DNA 서열분석에 의해 확인된다. 이 돌연변이물을 보유하는 플라스미드는 pGEMpST-SX-I122L PCR로 명시한다.
[실시예 20]
[효모에서 발현하기 적당한 플라스미드내로 rpST 돌연변이물 I122L의 재구성]
효모, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서 I122L 돌연변이물 보유 rpST 유전자를 발현하기 위하여, rpST 암호 DNA는 이 효모로부터 유래된 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다. pR0pST-SEX-I122L로 부터의 작은 rpST 보유 NdeI/Hind III 단편의 끝은, 플라스미드가 NdeI과 HindIII로 절개된 후 이 DNA를 DNA 폴리머라제 I의 큰 클레노우(Klenow) 단편으로 처리하여 플러쉬한다. 이 단편을 겔 전기 영동으로 정제하고 플라스미드 YEp352-2의 큰 SalI/SphI 단편과 연결한다. 이 나중 단편의 말단을 S1 뉴클레아제로 처리하여 플러쉬한다. 이 플라스 미드는 YEp 352 유도체이고, 이것은 변형되어 분기하는 GAL1/GAL10 프로모터(Johnston and Davis, 1984)와, STE7 유전자(Teague, 일동, 1986)로 부터 유래된 3' 번역안된 영역을 부가적으로 갖는다. 결과 생성된 플라스미드는 YEp352-pST-I122l(제5도)로 명시한다.
효모에서 이 rpST 변이체의 발현은 우라실은 결여되고 유일한 탄소원으로서 2% 갈락토오즈를 함유하는 합성 완전 배지(Sherman, Fink and Hilks, 1986)에서 이 플라스미드로 형질전환된 효모세포를 30℃에서 수시간 동안 배양함으로써 실현되거나, rpST 유전자 최대유발 및 rpST 최대 생산을 실현하는데 필요하다. URA3 유전자에 돌연변이물을 보유하는 임의의 효모균주가 숙주로서 사용될 수 있지만, 프로테아제 생산이 결핍되고 BJ5457(유전자형 MATαpep4::HIS3 prb1-△trp1 ura3-52 leu2-△his3-△lys2-801 can1 GAL+)같은 GAL+인 효모 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 이 균주는 BJ5457로서, 캘리포니아 대학, Yeast Genetic Stock Center에 기탁된다.
Claims (11)
- 소마토트로핀의 알파나선 1 영역에서의 중복돌연변이에의해, 상기 소마토트로핀을 지속방출 배합물내 생물학적 활성을 유지하는 한편 상기 소마토트로핀의 천연 형태보다 가용성이 되게함으로 구성되며, 이때 상기 알파 나산 1 중복 돌연 변이물은 A6TS11R 또는 P8TS11R로 구성된 군으로 부터 선택되는 소마토트로핀.
- 제1항에 있어서, 소마토트로핀의 알파나선 3 영역에서의 돌연변이에 의해, 상기 소마토트로핀을 지속방출 배합물내 생물학적 활성을 유지하는 한편 상기 소마토트로핀의 천연 형태보다 가용성이 되게함으로 부가로 구성되며, 이때 상기 알파 나선 3 돌연변이물은 I122L인 소마토트로핀.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소마토트로핀내의 4개의 시스테인, 작은 고리에서 2개 및 큰 고리에서 2개중, 1개 이상은 아르기닌, 리신, 아스파라기닌산, 글루탐산, 아스파리기닌, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 쓰레오닌 또는 프롤린으로 구성된 군으로부터 개별적으로 선택된 아미노산에 의해 대체된 소마토트로핀.
- 제3항에 있어서, 상기 아미노산은 글루탐산 및 알라닌으로 구성된 군으로 부터 개별적으로 선택된 소마토트로핀.
- 제4항에 있어서, 위치 183과 191에서 시스테인은 글루탐산으로 대체된 소마토트로핀.
- 소마토트로핀의 알파나선 1 영역에서의 중복 돌연변이에 의해, 지속방출 배합물내 생물학적 활성을 유지하는 한편 상기 소마토트로핀의 천연 형태보다 가용성이 되게함으로 구성되며, 이때 상기 소마토트로핀내의 4개의 시스테인 아미노산 잔기들중 1개이상이 시스테인이외의 아미노산 잔기로 대체되는 소마토트로핀.
- 제6항에 있어서, 시스테인이외의 잔기가 아르기닌, 리신, 아스파라기닌산, 글루탐산, 아스파라기닌, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 쓰레오닌 및 프롤린으로 구성된 군으로 부터 개별적으로 선택된 소마토트로핀.
- 제7항에 있어서, 위치 183과 191에서 시스테인은 글루탐산으로 대체된 소마토트로핀.
- 제8항에 있어서, 위치 183과 191에서 시스테인은 알라닌으로 대체된 소마토트로핀.
- 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 소마토트로핀이 사람, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 어류 또는 조류 소마토트로핀인 소마토트로핀.
- 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 소마토트로핀이 met-asp-gln-des(ala) 돼지 소마토트로핀인 소마토트로핀.
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