NO178704B - DNA-sekvens som koder for protein med IRF-1-aktivitet, ekspresjonsvektor inneholdende denne, anvendelse av IRF-1 for å öke ekspresjon, vertscelle transformert med ekspresjonsvektoren, og protein med IRF-1-aktivitet - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en DNA-sekvens som koder for et protein med interferoii-regulerende faktor-1 (IRF-1)-aktivitet, en ekspresjonsvektor inneholdende den, en verts-celle transformert med ekspresjonsvektoren, anvendelse av IRF-1 for å øke ekspresjonen av et ønsket målgen for å oppnå et høyere utbytte av det tilhørende målproteinet, og et protein med IRF-l-aktivitet.

Ekspresjonsvektoren innbefatter et promotor-område av genet for nevnte protein innbefattende et bindingssete for det IRF-l-aktive molekyl. Det IRF-l-aktive protein fremstilles ved dyrking av egnede vertsceller transformert ved DNA-molekylene.

Transkripsjon av gener i pattedyrsceller reguleres ved komplekse mekanismer hvor vekselvirkninger mellom de regulerende DNA-sekvenser med trans-virkende DNA-bindende proteiner spiller en sentral rolle. Når det gjelder reguleringen av transkripsjon, representerer gener som koder for interferoner (IFN'er), et trekk som er felles for mange av cytokin-genene; transkripsjon av disse gener induseres på en forbigående måte etter forskjellige ekstracellulære signaler. Det er blitt vel dokumentert at transkripsjon av genene for IFN-a og IFN-/3 effektivt induseres ved virus i mange forskjellige celler, mens transkripsjonen av genet som koder for IFN-T, induseres i T-lymfocytter (T-celler) etter mitogen stimulering (for redegjørelse, se Weissmann og Weber, 1986; Taniguchi, 1988).

IFN-/ 3, et cytokin som opprinnelig ble identifisert på grunn av sin sterke antivirus-aktivitet, viser seg også å spille en avgjørende rolle ved regulering av cellevekst og - differensiering. Med hensyn til dette viser det seg at mange av cytokinene såsom kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) (Moore et al., 1984; Warren og Ralf, 1986; Resnitzky et al., 1986), tumornekrosefaktor (TNF) (Onozaki et al., 1988), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) (Zullo et al., 1985) og IFN'er (Kohase et al., 1987), i tillegg til virus og poly(rl):poly(rC), som er de velkjente induksjons-midler for IFN-/3-gen, også induserer IFN-/3 i visse celler, hvilket antyder at de kan overføre liknende eller identiske signaler i

målcellene.

IFN-Ø-gen-induksjonen ved virus og poly(rl):poly(rC) har vist seg å skje på det transkripsjonene nivå (Raji og Pitha, 1983; Ohno og Taniguchi, 1983; Dinter et al., 1983; Zinn et al., 1983). Således er cis-virkende DNA-sekvenser som virker som innførbare forsterkningsmidler, blitt identifisert inne i det 5'-flankerende område på det humane IFN-j8-gen (Fujita et al., 1985, 1987; Goodbourn et al., 1985; Dinter og Hauser,

1987). Det innførbare forsterkningsområde (d.v.s. fra -65 til -105 med hensyn til CAP-setet) inneholder repetitive heksanukleotid-enheter, hvorav noen faktisk fungerer ved den induserte aktivering av transkripsjon når de multimeriseres (Fujita et

al., 1987). Det er i pattedyrsceller såsom muse-L929-celler og humane celler, identifisert en faktor, IRF-1, som spesifikt bindes til IFN-/3-regulatorsekvensene, såvel som de funksjonelle, repeterte heksanukleotid-sekvenser; (AAGTGA)4. Det er funnet at IRF-1 spiller en vesentlig rolle ved virus-indusert aktivering av IFN-/3-gen-transkripsjon ved at den vekselvirker med de identifiserte cis-e.lementer.

I henhold til denne oppfinnelse tilveiebringes et rekombinant DNA-molekyl som inneholder en sekvens som koder for et protein med aktivitet som interferon-regulerende faktor-1 (IRF-1) som angitt i fig 4A og 8, og eventuelt en promoter-region som angitt i fig 7A.

DNA-molekylet koder fortrinnsvis for, eller kan hybri-diseres til DNA-molekylet som koder for human IRF-1 eller muse-IRF-1.

DNA-molekylet er fortrinnsvis ett som koder for et protein som bindes til den repeterte oligomersekvens AAGTGA og de regulerende oppstrøms-elementer på det humane IFN-/3-gen.

DNA-molekylet kan innbefatte et promotorområde som er konstitutivt eller induserbart, for eksempel virus-induserbart f.eks. ved Newcastle-sykdomsvirus, eller induserbart ved mitogen stimulering f.eks. under anvendelse av Concanavalin A.

Et foretrukket DNA-molekyl (som koder for human IRF-1) er karakterisert ved et strukturelt gen med formel I nedenfor:

Formel I

eller en degenerert variant av dette.

DNA-molekylet kan for eksempel karakteriseres ved et strukturelt gen med formelen definert ovenfor og oppstøms og nedstrøms flankerende sekvenser som er innbefattet innenfor følgende formel II:

Formel II

eller en degenerert variant derav.

Et annet foretrukket DNA-molekyl (som koder for muse-IRF-1) er karakterisert ved et strukturelt gen med følgende formel

III:

Formel III

eller en degenerert variant derav.

Et slikt DNA-molekyl som nevnt i ovenstående avsnitt, kan for eksempel karakteriseres ved et strukturelt gen med formelen som er definert ovenfor og oppstrøms og nedstrøms flankerende sekvenser som innbefattes innenfor følgende formel IV:

Formel IV

eller en degenerert variant derav.

DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen som koder for proteiner med IRF-l-aktivitet, innbefatter DNA-sekvenser fra en eukaryot kilde såsom, ikke bare menneske og mus, men også f.eks. kylling, frosk og gjærsopp, som hybridiserer med DNA-sekvensene hos de ovenstående humane eller muse-IRF-1 (Fig. I - IV) og som koder for et protein med IRF-l-aktivitet.

Et slikt cDNA-molekyl som hybridiserer til cDNA for muse-IRF-1 som definert på Fig. 4A, er oppført nedenfor i formel Illa.

Formel Illa

eller er en degenerert variant derav.

Dette DNA-molekyl- kan for eksempel karakteriseres ved et strukturelt gen med formelen som er definert ovenfor og oppstrøms og nedstrøms flankerende sekvenser som innbefattes i følgende formel IVa.

eller en degenerert variant derav.

Nedenfor beskrives isolering av cDNA-molekyler fra humane celler og museceller som koder for human og muse-IRF-1, og fra museceller og gjærceller som hybridiserer henholdsvis til cDNA for muse-IRF-l og human IRF-1.

Det rekombinante DNA-molekyl kan også inneholde en promotor- og regulerings-sekvens som innbefattes i følgende formel V:

Formel V

eller en degenerert variant derav.

Det rekombinante DNA-molekyl "kan også utformes for ekspresjon av et farmasøytisk aktivt protein såsom f.eks. en cytokin- eller plasminogen-aktivator, og vil i denne form inneholde fortrinnsvis et strukturelt gen for et ønsket farma-søytisk aktivt protein som er operabelt bundet til et promotor-område på genet for nevnte protein innbefattende et bindingssete for det IRF-l-aktive molekyl.

Således kan et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen omfatte en DNA-sekvens som definert ovenfor, og et strukturelt gen for et ønsket farmasøytisk aktivt protein under kontroll av det IRF-l-aktive protein kodet for ved nevnte DNA-sekvens. I et slikt rekombinant DNA-molekyl er genet som koder for det IRF-l-aktive molekyl, fortrinnsvis under kontroll av en konstitutiv promotor eller mest foretrukket en induserbar promotor. Genet for det ønskede farmasøytisk aktive protein vil fortrinnsvis innbefatte et IRF-bindingssete som inneholder repetitive AAGTGA-sekvenser.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også en vertscelle, f.eks. en bakteriecelle, f.eks. E. coli, eller en gjærcelle eller pattedyrscelle, f.eks. en CHO-celle eller en musecelle, f.eks. L929, transformert med et rekombinant DNA-molekyl som definert ovenfor. Vertscellen vil ideelt være valgt fra en cellelinje som ikke har noe, eller hovedsakelig ikke har noe, nivå av endogen IRF-l-aktivitet.

For dannelsen av et farmasøytisk aktivt protein, kan en vertscelle alternativt transformeres ved et første DNA-molekyl som inneholder en sekvens som koder for et protein med aktivitet som en IRF-1, og ved et andre separat DNA-molekyl som inneholder et gen som koder for et ønsket, farmasøytisk aktivt protein under kontroll av det IRF-l-aktive protein som kodes for ved dét første DNA-molekyl. Fortrinnsvis innbefatter det første DNA-molekyl som koder for det IRF-l-aktive molekyl, en konstitutiv promotor eller mest foretrukket en induserbar promotor-sekvens som er operabelt bundet til genet som koder for den IRF-l-aktive forbindelse. Det annet DNA-molekyl innbefatter dessuten fortrinnsvis et bindingssete for det IRF-l-aktive protein som inneholder repetitive AAGTGA-sekvenser.

Det IRF-l-aktive protein eller det farmasøytisk aktive protein kan dannes ved dyrkning av den transformerte celle og isolering av det dannede protein på vanlig måte.

Vertscellene induseres ved behandling på en måte som er hensiktsmessig for promotoren som er operabelt bundet til genet som koder for IRF-1, som omtalt nedenfor.

Oppfinnelsen omfatter også et protein med IRF-l-aktivitet, som fås ved dyrkning av en vert transformert med et DNA-molekyl som definert ovenfor.

Et foretrukket protein med IRF-l-aktivitet har formelen

VI:

Formel VI

Et annet foretrukket protein med IRF-l-aktivitet har formelen VII:

Formel vu

Enda et annet foretrukket protein, som kodes for ved cDNA-sekvensen ifølge formel Illa, har formelen VIII.

Formel viIi

Nedenfor er beskrevet molekylær kloning og karakterisering av muse- og humane cDNA som koder for DNA-bindingsproteiner med IRF-l-aktivitet.

En bemerkelsesverdig sekvens-konservering vil kunne sees mellom muse- og de humane IRF-l-molekyler, som vist ved analysen av de klonede cDNA-molekyler. Videre er ekspresjon av genet som koder for IRF-1, vist å induseres ved Newcastle-sykdomsvirus (NDV) og Concanavalin A (ConA) i henholdsvis muse-L929-celler og milt-lymfocytter.

1. Kloning og ekspresjon av IRF- 1- DNA i E. coli

A. Poly(A)<+->RNA ble isolert fra ikke-induserte muse-L929-celler og anvendt for syntetisering av cDNA (idet man fulgte fremgangsmåten ifølge Aruffo og Seed, 1987). Den resulterende cDNA ble så klonet i en EcoRI-spaltet Xgtll-vektor og et cDNA-bibliotek konstruert i henhold til standard-fremgangsmåten ifølge Huynh et al., 1985, under anvendelse av E. coli Y1090 som verts-stammen.

Det resulterende Xgtll-bibliotek ble så undersøkt under anvendelse av den multimeriserte (4 ganger) AAGTGA-sekvens (i det følgende omtalt som Cl-oligomeren; Fujita et al., 1987) som probe.

Ved denne undersøkelses-fremgangsmåte ble E. coli Y1090, infisert med de rekombinante Xgtll-fag, utplatet på firkantede plater på 10 x 13 cm. Platene ble så inkubert ved 12°C i 4-5 timer hvoretter 20.000 plakk pr. plate Var synlige.

Membranfiltre for undersøkelse var enten nylon-(Nytran; Schleicher & Schnell) eller nitrocellulose-(Schleicher & Schnell)-membraner. Filtrene ble nedsenket i 10 mM IPTG (for induksjon av lacZ-genekspresjon i de hensiktsmessige fag-plakk) og lufttørket, og deretter lagt over platene og inkubert ved 37°C i 2V4 time. Plakk vil bare danne et protein kodet ved cDNA hvis cDNA er i leseramme med lacZ-genet.

Filtrene ble så fjernet og nedkjølt ved 4°C i 20 minutter og uten tørking underkastet undersøkelse.

Membranfiltrene ble så preparert for analyse som følger: Kjerne-ekstrakt ble fremstilt fra muse-L929-celler og ble "spottet" (i en mengde som svarte til ca. 10 /xg protein) på membranene.

Før bevirkning av DNA-binding, ble det anvendt en bindingsbuffer som besto av 10 mM Hepes, pH 7,5, 5,0 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA og 5% glycerol. 5% ikke-fet pulvermelk (Yukijurishi Inc.) ble tilsatt til bufferen, og filtrene ble inkubert i blandingen i 1 time ved 4°C og deretter skyllet i 1 minutt i samme buffer, men som ikke inneholdt noen pulvermelk.

Filtrene ble så inkubert i bindingsbuffer (1 ml) som inneholdt 350 fxg/ml laksespermie-DNA med gjennom-snittlig lengde ca. 300 bp og <32>P-merket probe-Cl-oligomer-DNA (IO<6> cpm/ml; spesifikk aktivitet 2 000 cpm/f mol) (se Fujita et al., 1987). Probe-DNA ble endemerket ved den 5'-terminale ende [*y-<32>P]ATP under anvendelse av T4-kinase.

Etter bindingen ble filtrene vasket ved romtempera-tur med bindingsbufferen i 1-2 timer (10 ml filter), og bindingsbufferen ble skiftet flere ganger under denne operasjon. Filtrene ble så lufttørket og underkastet autoradiografi. Ved denne analyse ga nylon-membranene, men ikke nitrocellulosemembranene, et positivt signal som ble spesifikt inhibert ved inkorporering av overskudd av umerket Cl-oligomer.

Ca. 1,4 x IO<6> rekombinanter ble undersøkt på denne måte. Blant de 32 positive fag-kloner identifisert ved den første undersøkelse, ble én kløn (betegnet XL28-8) funnet å bindes gjentatte ganger med probe-DNA i etter-følgende undersøkelsesrunder. 2. Dannelse og rensning av protein i transfektert E. coli Lysogene bakteriekloner ble fremstilt ved transfeksjon av E. coli Y1089 med XL28-8. Over-natten-lysogener som omfattet XL28-8, ble så utsådd med 1% i 400 ml L-bul-jong. Bakteriene ble dyrket ved 31°C inntil OD60o ble 1. Temperaturen ble så forandret til 42°C i 20 minutter. IPTG ble så tilsatt til 10 mM, og etter inkubering ved 38°C i ytterligere 20 minutter, ble kulturene hurtig pelletert og suspendert i 10 ml Lyse-buffer som består av 20 mM Hepes pH 7,9, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 0,1 mM DTT, 10% glycerol, 0,5 mM fenyl-metyonylsulfonylfluorid (PMSF) , 1 Mg/ml pepstatin A,

1 /xg/ml leupeptin, 500 mM L-I-tosylamid-2-fenyletylklor-metylbenzamidin, 10 mM natriummolybdat, 2 mM natriumpyro-fosfat og 2 mM natriumortovanadat. Cellesuspensjoner ble underkastet tre hurtige fryse-tine-sykluser og deretter sentrifugert ved 3 0 000 rpm i 1 time ved 4°C under anven-deise av en rotor av typen Beckman 50 Ti. Supernatanten ble anvendt enten direkte for" en gel-retardasjonsanalyse (se nedenfor) eller ble renset videre.

Videre rensning ble utført som følger:

Ca. 4 ml av supernatanten ble påsatt på poly(di-C):-poly(di-C)-kolonne med et sjiktvolum på 2 ml, og ekvilib-r rert med Lyse-buffer. Gjennomstrømningsmaterialet (4 ml) ble så påført på en DE 52-(Whatman)-kolonne med et sjiktvolum på 2 ml ekvilibrert med Buffer Z (25 mM Hepes, pH 7,8, 12,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20% glycerol, 0,1% NP-40, 0,5 mM PMSF). DNA-bindingsaktiviteten ble eluert med Buffer Z som inneholdt 0,1 M KC1. Eluatet (ca. 4 ml) ble ytterligere konsentrert under anvendelse av Centricon-10" (Amicon). Slutt-proteinkonsentrasjonen var 28 mg/ml. 3. Karakterisering av proteinproduktet fra klon XL28- 8:

(i) Gel- retardasionsanalyse

Lysogene bakterie-kloner som inneholdt XL28-8, ble fremstilt ved transfeksjon av E. coli Y1089 og ble indusert for ekspresjon av den klonede cDNA ved høye nivåer under anvendelse av fremgangsmåten ifølge Huynh et al., 1985. Lysogene kloner fremstilt og behandlet på samme måte med fagen som manglet cDNA-innskuddet (betegnet X6) ble anvendt som kontroll.

Ekstrakter som hvert inneholdt 3 /xg protein, ble fremstilt ut fra de induserte kulturer av Lysogenet (fire preparater betegnet XL28-8a, XL28-8b og X6a og X6b) .

Kjerneekstrakter (3 /zg protein) ble også fremstilt

ut fra muse-L929-celler.

Ekstraktene ble inkubert med 1 f.mol merket Cl-oligomer-probe som beskrevet ovenfor med en spesifikk aktivitet på 8 000 cpm/f.mol.

Hvert ekstrakt ble også underkastet konkurrerende analyse hvor en konkurrent-DNA ble tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner til inkuberingen.

Resultatene av analysen er vist på Fig. 1, hvor de forskjellige felter svarer til følgende:

Felt Ekstrakt

1 intet

2 X6a

3 X6b

4 X6b med 1 000 gangers molart overskudd av umerket Cl-oligomer 5 X6b med 1 000 gangers molart overskudd av umerket C5A-oligomer<* >6 XL28-8a 7 XL28-8b 8 XL28-8b med 1 000 gangers molart overskudd av umerket Cl-oligomer 9 XL28-8b med 1 000 gangers molart overskudd av umerket C5A-oligomer<*>

10 L929-celle

11 L929-celle med 1 000-gangers molart overskudd av umerket Cl-oligomer 12 L929-celle med 1 000-gangers molart overskudd av umerket C5A-oligomer<* > <*> C5A-oligomeren er beskrevet i Fujita et al., 1985, og er en 6 ganger repetert GAAA-sekvens.

Av Fig. 1 vil det fremgå at bundne prober er påvisbare i feltene 6, 7, 9, 10 og 12.

Som vist på Fig. 1, ga proteinekstrakter fra XL28-8-losygenene opphav til forskjøvne bånd (felt 6 og 7), hvis tilsynekomst ble inhibert ved overskudd av umerket Cl-oligomer-DNA, men ikke ved den samme mengde av C5A-oligomeren (felt 8 og 9).

I motsetning til XL28-8-avledede proteiner, ga ikke de proteiner som var fremstilt ut fra de induserte X 6-avledede lyso-gener, slike forskjøvne bånd (felt 2-5). De forskjøvne bånd kan sees å være meget lik båndene av den naturlige IRF-1 fra muse-L929-celler (felt 10 og 12). Slike forskjeller som finnes i de to sett av forskjøvne bånd, ansees for å være en følge av de forskjellige mengder proteiner som er bundet til probe-DNA.

Dessuten er det funnet at de forskjøvne bånd bare var påviselige med proteinene fra IPTG-induserte Y1089-celler transfektert med XL28-8.

(ii) DNase-" fotspor"- analyse

"Fotspor"-analyse ble utført for undersøkelse av bindingsegenskapene hos proteinet som kodes for ved XL28-8-cDNA, til en DNA som koder for IFN-/9-gen-oppstrømsområdet.

Protein kodet for ved XL28-8-CDNA, ble ekstrahert fra det induserte lysogen og delvis renset ved kolonnekromatografi som beskrevet ovenfor og undersøkt med hensyn til sine bindingsegenskaper til en DNA som inneholdt IFN-Ø-gen-oppstrømsområdet.

Probe-DNA ble fremstilt som Sall-Hindlll-fragmenter isolert fra p-125cat (som inneholdt villtype-IFN-/3-genet) og p-125DPcat (som inneholdt et mutant IFN-Ø-gen). Plasmidet p-125cat ble konstruert som p-105cat (Fujita et al., 1987), bortsett fra at BamHI (-125)-Tagl (+19)-fragmentet fra pSE-125 (Fujita et al., Cell, Vol. 41, s. 489-496, 1985) ble anvendt. Plasmid p-125DPcat, som hadde punkt-mutasjoner i IFN-jS-regulator-elementene, ble oppnådd ved syntetisk oligonukleotid-rettet mutagenese på p-125cat som beskrevet i Hatakeyama et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 83, s. 9650-9654, 1986). Begge DNA-molekyler var merket ved Hindlll-setet med (7-<32>P)ATP under anvendelse av T4-kinase. 4 f.mol av probe-DNA (spesifikk aktivitet 3 000 cpm/f.mol) ble inkubert i 20 jzl reaksjonsblandingen som inneholdt 25 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6,25 mM MgCl2, 50 mM KC1., 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% glycerol og 2% polyvinylalkohol i nærvær eller fravær av 280 ug av det rensede protein.

Ved analysen ble 5 x 10~<4> enheter DNase I (Worthington) tilsatt og inkubert i 1 minutt ved 25°C.

Fig. 2 viser autoradiogrammer av DNA-fragmentene oppnådd fra prøver oppnådd ved utførelse av følgende fremgangsmåter. På venstre side av Fig. 2 er en del av DNA-sekvensen av villtype-IFN-Ø-proben, og på høyre side av Fig. 2 er en del av DNA-sekvensen av den mutante IFN-/3-probe. 1. Villtype-IFN-/3-proben ble spaltet ved A+G-reaksjoner (se Methods in Enzymology, Vol. 65, s. 499-560) - resultat vist i felt 1. 2. Villtype-IFN-/3-proben ble delvis nedbrutt med DNase I uten beskyttelse - resultat vist i felt 2. 3. Villtype-IFN-Ø-proben ble omsatt med proteinet og deretter nedbrutt med DNase I - resultat vist i felt 3. 4. Villtype-IFN-Ø-proben ble omsatt med proteinet i nærvær av 1 000 gangers molart overskudd av umerket Cl-oligomer og deretter nedbrutt med DNase I - resultat vist i felt 4. 5. Den mutante IFN-Ø-probe ble omsatt med proteinet og deretter nedbrutt med DNase I - resultat vist i felt 5. 6. Den mutante IFN-/3-probe ble spaltet ved A+G-reaksj oner - resultat vist i felt 6.

På Fig. 2 er de beskyttede områder som vist i feltene 3 og 5, angitt henholdsvis på sekvensene angitt på venstre og høyre side av autoradiogrammet. Heksamer-motivene er innrammet.

Av resultatene på Fig. 2 vil det kunne sees at det beskyttede område svarer til nukleotider -100 til -64, og dette er det område som er funnet å være beskyttet av IRF-1 oppnådd fra L929-celler. Beskyttelsen ble motvirket ved anvendelse av overskudd av umerket Cl-oligomer (felt 4). Det ble også funnet, ved anvendelse av lavere proteinkonsentrasjoner, at preferensiell beskyttelse opptrådte i området som inneholdt AAGTGA-motivet (-80 til -70).

Disse resultater angir at proteinet har høyere affinitet til området som inneholder AAGTGA-motivet og lavere affinitet til det omgivende område.

Det mutante IFN-Ø-gensegment bærer T- G-mutasjoner i stillinger -106, -100, -73 og -67. I sammenliknende felt 5 og 2, under de samme analysebetingelser, ser det ut til at beskyttelsen som gis ved de rekombinante proteiner, er begrenset til det ikke-muterte område (felt 2). Denne observasjon er i samsvar med observasjonen at innføring av disse mutasjoner resulterer i en dramatisk reduksjon (20 ganger) av induserbarheten av transkripsjon ved NDV i L929-celler og at in vitro-binding av IRF-1 til det mutante IFN-/3-gen var bemerkelsesverdig bare i det ikke-muterte område.

Videre viser anvendelsen av Cl-oligomeren at proteinet spesifikt beskytter området som inneholder oligomer-sekvensene. Denne beskyttelse svarer identisk til den som bevirkes ved naturlig IRF-1 som stammer fra L929-celler.

4. DNA- konkurranseanalvse

Denne analyse ble utført for undersøkelse av affini-teten av det rekombinante protein til forskjellige DNA-sekvenser innbefattende noen av de kjente transkripsjonene regulator-DNA-sekvenser. Fremgangsmåten var som følger: Hindlll-Sall-fragmentet av IFN-/3-proben ble isolert fra p-125 eat (se Fijita et al., 1987); dette fragment inneholder den humane IFN-/S-gensekvens fra +19 til -125. DNA ble merket ved den 3'-terminale ende ved utfylling av begge ender med [a-<32>P]-dCTP under anvendelse av Klenow-fragment.

Den spesifikke aktivitet av probe-DNA var 8 000

cpm/f.mol.

Gel-retardasjonsanalysene ble utført under betingelsene som er beskrevet ovenfor.

I konkurranseanalyse-kjøringene ble DNA omsatt med proteinet i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av kompetitor-DNA-molekyler i bindingsblandingen som angitt på Fig. 3.

Dannelsesnivået av komplekset ble kvantifisert ved densitometrisk analyse av autoradiogrammet. Kompleks-dannelse i fravær av konkurrent-DNA ble satt til 100%.

Strukturen av konkurrent-DNA-molekylene er som følger: a) AP-1: en syntetisk DNA med følgende sekvens b) TNF: 37 bp av syntetisk DNA som omfatter fra +1162 til +2116 (se Nedwin et al., 1985) av det første TNF-a-intron; c) muse-H2-Dd: 37 bp av syntetisk DNA som omfatter IRS-elementet (-159 til -123) som beskrevet av Korber et al., 1988; d) human IFN-ot: 46 bp syntetisk DNA som svarer til virus-Responselement, se Ryals et al., 1985. e) Heksamer-sekvenser Cl, C2, C3, C4 og C5A. Sekvensene Cl og C5A er som beskrevet ovenfor. Sekvensene C2, C3 og C4 er som publisert i Cell, 49, 352-367 (1987); de representerer henholdsvis sekvensene

f) IFN-/3-gensekvensen fra +19 til -66.

På Fig. 3 viser det venstre panel resultatene oppnådd når heksamer-repetisjonene ble anvendt som konkurrenter. Det midterste panel gir resultatene når humane IFN-gensegmenter ble anvendt som konkurrenter, og det høyre panel gir de tilsvarende resultater, under anvendelse av forskjellige DNA-segmenter som angitt i panelet.

Av resultatene som er vist på Fig. 3, vil det kunne sees at utseendet av det forskjøvne bånd ble utkonkurrert av heksamer-sekvensene i effektivitetsordenen Cl - C2 - C3 - C4, men ble ikke i noen betydelig grad utkonkurrert av C5A.

Det kan også observeres at de syntetiske DNA-segmenter som omfatter de regulerende elementer av enten humane IFN-al-eller muse-H-dD<d->gener, ga opphav til en konkurrerende aktivitet. Dette er spesielt interessant siden DNA-segmentet av H-2D<2->genet inneholder den såkalte IFN-respons-sekvens (IRS) som virker som forsterker når cellene responderer på IFN (Sugita et al., 1987; Israel et al., 1986; Korber et al., 1988).

Faktisk finnes sekvens-motiver som er lik eller identisk med disse som finnes på IFN-/J-genet, i mange av promotor-sekvensene i de IFN-induserbare gener hvor kjerne-faktorer viser seg å bindes spesifikt (Korber et al., 1988; Lery et al., 1988).

Resultatene som er vist på Fig. 3, er meget lik dem som fås når analysen gjentas under liknende betingelser under anvendelse av naturlig protein dannet fra L929-celler.

Struktur av cDNA som koder for muse- IRF- 1

DNA-sekvensen i de klonede DNA-molekyler ble bestemt enten ved en dideoksy-metode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) eller ved standard-Maxam-Gilbert-metoden (Maxam og Gilbert, 1980).

XL28-8-innskuddet i E. coli Y1089 ble isolert som følger: fag-DNA ble fremstilt ved standard-fremgangsmåter og DNA ble nedbrutt med EcoRI, og deretter ble cDNA som var spaltet fra fag-DNA, isolert og sekvensbestemt ved dideoksy-metoden (Sequenase: United States Biochemical Inc.). cDNA-innskuddet i XL28-8 ble funnet å være 1,8 kb langt. Nukleotidsekvens-analysen åpenbarte en stor åpen leseramme bundet i fase med galaktosid-genet.

For undersøkelse av kloner som inneholdt større cDNA-innskudd, ble dobbeltkjedet cDNA syntetisert med L929-celle-avledet poly(A)<+>RNA og klonet i vektor CDM8 i henhold til den publiserte fremgangsmåte ifølge Aruffo og Seed (Prod. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 84, s. 8573, 1987) og Seed (Nature, vol. 329, s. 840-842, 1987).

De rekombinante plasmider ble innført i E.coli-stamme MC1061/p3 (i henhold til fremgangsmåten til Aruffo og Seed; som ovenfor), og klonene av cDNA ble undersøkt under anvendelse av den XL28-8-avledede (<32>P-merkede) cDNA-probe under måtelig strenge betingelser for DNA-DNA-hybridisering (Kashima et al., Nature, vol. 313, ss ' 402-404, 1985), og en klon pIRF-L ble utvalgt for ytterligere undersøkelse.

Det ønskede cDNA-innskudd av pIRF-L ble oppnådd ved nedbrytning med Hindlll og Xbal og sekvensbestemt ved frem-gangsmåtene som er beskrevet ovenfor. Sekvensen er vist i Formel IV og på Fig. 4.

cDNA-sekvensen fra XL28-8 ble funnet å inneholde en identisk sekvens i det overlappende område, bortsett fra at én A-rest manglet mellom nukleotidene 1773 og 1781.

De 5'- og 3'-terminale ender av den XL28-8-avledede cDNA er markert med piler på Fig. 4. ATTTATTTA- og ATTTA-sekvensene som eventuelt gir mRNA-ustabiliteten, er innrammet.

Som det vil sees av Fig. 4A, var cDNA fra muse-cDNA som stammet fra pIRF-L, 198 bp og 20 bp lengre enn for XL28-8-cDNA i henholdsvis 5'- og 3'-områdene.

Analyse av genom-DNA-sekvensen som inneholder promotor-området i dette gen, viser at cDNA fra pIRF-L mangler ca. 30 bp fra hoved-CAP-setet, se nedenfor og Formel V og Fig. 7.

Sekvensen like oppstrøms for det første ATG-kodon, GGACCATGC, passer godt med Kozak's konsensus-sekvens

A

GCC CCATGG, for translasjonsbegynnelsessetet.

G

En ATG-sekvens i leseramme ble ikke funnet i oppstrøms sekvensen fra den ovenfor nevnte ATG-sekvens, hvilket bekreftet at det faktisk er begynnelseskodonet for IRF-1-mRNA.

Som nevnt ovenfor, ble det ikke påvist noen forskjell i nukleotidsekvens mellom XL28-8- og pIRF-L-cDNA-molekylene innenfor de overlappende områder, bortsett fra ett nukleotid i 3'-non-kodingsområdet.

Muse-IRF-1 ble således funnet å bestå av 329 aminosyrer med en beregnet molekylvekt på 37,3 KD. Kanoniske N-glykosyleringsseter kommer ikke fram innenfor denne sekvens.

Ingen betydelig homologi med andre kjente proteiner ble påvist ved undersøkelse i Protein Sequence Database (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) og senere publiserte sekvenser.

Hydropati-"plot"-analyse ifølge Kyte og Doolittle, 1982, angir at proteinet som helhet er meget hydrofilt (Fig. 4B).

Inspeksjon av den utledede primærsekvens av muse-IRF-1 viser følgende trekk: Den aminoterminale halvdel, som strekker seg til aminosyre (a.a.) 140, er rik på lysin (Lys) og Arginin (Arg). Faktisk befinner 31 av 39 av den totale mengde Lys- og Arg-rester seg i dette område. I det nedre panel på Fig. 4B er det representert en skjematisk oppsummering av beliggenheten av de basiske aminosyrer (Arg, Lys) (oppoverrettede kolonner) og sure aminosyrer (Asp, Glu) (nedoverrettede kolonner).

Som vist på Fig. 4B, viser dette område sterk hydrofilisitet og ansees for å være det område som hovedsakelig er ansvarlig for binding av IRF-1 til de spesifikke DNA-sekvenser.

I denne forbindelse var karakteristiske motiver for mange DNA-bindingsproteiner såsom Sink-fingre og motiver med heliks dreiet rundt heliks (Pabo og Sauer, 1984, Evans og Hollenberg, 1988), ikke påvisbare i IRF-l-proteinet.

I motsetning til dette, viser resten av molekylet (d.v.s. den karboksylterminale halvdel) forholdsvis mye asparaginsyre (Asp), glutaminsyre (Glu), serin (Ser) og treonin (Thr). Av 189 aminosyrer (fra a.a. 140 til 329) representerer 33 (17%) sure aminosyrer og 3 6 (19%) representerer Ser og Thr. Spesielt finnes en klase av 5 etter hverandre følgende sure aminosyrer i a.a. 227-231. Når det gjelder Ser og Thr, ser mange ut til å danne klaser (område ved a.a. 153-156, 190-192, 206-208, 220-222; omtalt som S-T-områdene i det foreliggende). S-T-områdene er angitt ved små åpne rektangler i det nedre panel på Fig. 4B.

Struktur av cDNA som koder for human IRF- 1

Idet man fulgte en fremgangsmåte lik den som er beskrevet ovenfor når det gjelder muse-IRF-1, ble human IRF-l-cDNA klonet og sekvensbestemt.

Et human-cDNA-bibliotek ble fremstilt ved syntetisering av cDNA under anvendelse av poly(A)<+>RNA fra en human T-cellelinje Jurkat. Syntesen av den dobbeltkjedede cDNA og etterfølgende kloning i plasmidvektor CDM8 ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Aruffo og Seed (Proe. Nati., Acad. Sei., USA, vol. 84, s. 8573-8577, 1987) og Seed (Nature, vol. 329, s. 840-842, 1987).

De rekombinante plasmider ble innført i E.coli-stamme MC1061/p3 under anvendelse av fremgangsmåten ifølge Aruffo og Seed som nevnt ovenfor.

Kloner av cDNA som kryss-hybridiserer med muse-IRF-1-cDNA, ble undersøkt under anvendelse av XL28-8—cDNA (<32>P-merket) som probe under måtelig strenge betingelser for DNA-DNA-hybridisering. De anvendte betingelser var nøyaktig som beskrevet av Kashima et al. (Nature, vol. 313, s. 402-404, 1985).

Blant de positive kloner ble klon pHIRF31 som inneholdt det lengste cDNA-innskudd, utvalgt.

Den ønskede cDNA-sekvens av klon pHIRF31 ble isolert ved fordøying av plasmid-DNA med Xhol og etter isolering underkastet sekvensbestemmelse ved fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor. Strukturen av det humane IRF-l-gen er vist i Formel II og på Fig. 8.

Sekvensene for den avledede muse- og humane IRF-1 er vist sidestilt for sammenlikning på Fig. 5.

Analyse av den humane DNA åpenbarte at denne første IRF-1 er kortere enn muse-IRF-1 med fire aminosyrer.

Solid konservering av aminosyresekvensene kan sees mellom de to IRF-l-molekyler. Spesielt kan 133 av 140 aminosyrer (95%) av de aminoterminale halvdeler sees å være identiske.

Samlet angir ovennevnte observasjon at IRF-1 er en ny klasse DNA-bindingsproteiner.

Det bør også være klart at sekvensen ATTTATTTA og ATTTA, funnet i mange cytokin- og proto-onkogen-mRNA-molekyler, er tilstede innenfor det 3'-ikke-translaterte område i muse-IRF-1-DNA, og likeså finnes sekvensen ATTTA innenfor det tilsvarende område av det humane IRF-l-cDNA. Disse sekvenser antas å spille en rolle ved post-transkripsjonell regulering av gen-ekspresjon ved at de gjør mRNA ustabile (Shaw og Kamen, 1986; Caput et al., 1986).

Plasmid pIRF-L ble transfektert i E. coli MC1061/p3 som var deponert som E. coli MC106/p3 (pIRF-L) ved Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibara-ki-ken 305, Japan, under betingelsene i Budapest-Traktaten 19. august 1988 under nr. FERM BP-2005.

Plasmid pIRF31 ble likeledes transfektert i E. coli MC1061/p3 som var deponert som E.coli MC106/p3 (pIRF-31) ved FRI under Budapest-Traktaten 19. august 1988 under nr. FERM BP-2006.

Regulering av IRF- qenet

1. Ekspresjon av IRF- 1- mRNA

I betraktning av det faktum at IRF-1 viser affiniteter til regulator-sekvenser av andre gener enn IFN-/3-gen og således er med på reguleringen av et sett gener i forskjellige celletyper, ble undersøkelse av ekspresjonen av IRF-1-mRNA i museceller som stammet fra forskjellige vev og organer, utført under anvendelse av muse-cDNA som probe. For fremstilling av denne probe, ble M13 mplO-fag-DNA (se nedenfor) som inneholdt sense-kjeden av IRF-l-gen-Pstl-fragmentet, anvendt som templat for syntetisering av den <32>P-merkede anti-sense-DNA, produktet ble nedbrutt med EcoRI og probe-DNA isolert som beskrevet av Fujita et al. (1985).

Total-RNA ble isolert ved den etablerte fremgangsmåte ifølge Aruffo og Seed 1987.

"Blotting"-analysen ble så utført hovedsakelig som beskrevet av Thomas (1980), og røntgen-filmen ble eksponert i 3 dager, og resultatene er vist på Fig. 6A. De forskjellige baner representerer resultatene av kjøringer utført under anvendelse av hel-celle-RNA fra følgende vev:

Felt 1 Hjerne

Felt 2 Hjerte

Felt 3 Lever

Felt 4 Lunge

Felt 5 Milt (ustimulert)

Felt 6 Thymus

Felt 7 Nyre

Felt 8 Muskel

Felt 9 Tarm

Felt 10 Milt (ustimulert)

Felt 11 ConA-stimulert milt

I kjøringen for hvert felt ble det anvendt 5 pg hel-celle-RNA, bortsett fra i felt 8, hvor det bare ble anvendt 1,2ug RNA.

Det vil kunne sees av Fig. 6A at et bånd som svarte til ca. 2,0 kb, ble påvist i de fleste av RNA-prøvene ved denne "blotting"-analyse, skjønt mRNA-ekspresjonsnivået synes lavt. Det er bemerkelsesverdig at mRNA-ekspresj onsnivået i de milt-avledede lymfocytter ble dramatisk forsterket etter stimulering med ConA (Felt 11) .

I en ytterligere analyse ble muse-L929-celler indusert ved NDV som beskrevet tidligere (Fujita et al., 1985) qg cytoplasma-RNA ekstrahert, ved fremgangsmåten ifølge Aruffo og Seed 1987, hver tredje time etter infisering.

Probe-DNA ble fremstilt ved de følgende forskjellige sekvenser og merket ved multiprimings-merkingsreaksjonen (Amersham), nemlig

(i) et 1,8 kb EcoRI-fragment fra XL28-8 (spesifikk aktivitet 2 x IO<8> cpm/^g); (ii) et 0,5 kb BamHI-Bglll-fragment fra en muse-IFN-/3-genom-klon (spesifikk aktivitet 5 x IO8 cpm//xg) og (iii) et 2,0 kb BamHI-PvuII-fragment av en klon som inneholdt humant /?-aktin-pseudogen (spesifikk aktivitet 5 x IO<8> cpm/^g) .

Resultatene er vist på Fig. 6B. l,Blotting"-analyse ble utført, som beskrevet ovenfor, under anvendelse av fremgangsmåten ifølge Thomas (1980).

Hvert felt fikk 10 jug cytoplasma-RNA. Røntgenfilmen ble eksponert i 3 timer. Densitometrisk analyse åpenbarte at IRF-1-mRNA øket ca. 25 ganger, 9-12 timer etter NDV-infeksjon.

Skjønt økningen i mRNA er dramatisk, er den kortvarig, og har en topp etter 9-12 timer og flater ut 15 timer etter induksjon. mRNA-opphop ing går forut for opphopingen av IFN-/3-mRNA; som det vil kunne sees av Fig. 6B, kan induksjonen av IRF-1-mRNA observeres allerede 3 timer etter NDV-infeksjon, mens IFN-/3-mRNA kan påvises først -etter 6 timer under liknende "blotting<n->betingelser for begge RNA-typer.

IRF- l- promotoren

Som vist ovenfor, reguleres IRF-l-genet transkripsjonelt ved forskjellige midler såsom virus og mitogener.

"Southern blot"-analyse av kromosomal-DNA anga at IRF-l-genet kan være spleiset og ikke flerleddet i musen.

Et X-fag-bibliotek som inneholdt DNA fra nyfødte mus, ble undersøkt med hensyn til de kloner som omfattet IRF-l-promotorsekvensen, under anvendelse av den samme >L28-8-avledede cDNA-probe som anvendt ovenfor. Fire positive kloner ble identifisert, som alle ble funnet å inneholde den samme genom-DNA, og én av dem, Xgl4-2, ble anvendt for ytterligere analyse. Et Pstl-fragment ble sub-klonet i Pstl-setet i pUC19 for konstruksjon av pl9IRFP.

Den samme DNA ble deretter klonet i Pstl-setet i M13mpl0 og M13mpll, som ble anvendt for dannelse av DNA for sekvensanalyse.

Nukleotid-sekvensanalyse av Pstl-fragmentet fra ovennevnte kloner ble utført som tidligere beskrevet. Hoved- og bi-CAP-seter ble identifisert ved SI-kartleggingsanalyse.

Den bestemte sekvens er vist på Fig. 7A. Som det vil kunne sees, passer den nedstrøms sekvens av DNA fullstendig til den samme hos den pIRF-L-avledede cDNA.

Sl-nuklease-analysen angir tilstedeværelse av to CAP-seter for IRF-1-mRNA hvor hoved-setet er ca. 20 nukleotider nedstrøms for bi-setet. Typiske TATA-boks-sekvenser er ikke tilstede i det oppstrøms område av genet. I betraktning av den uvanlige rikelighet av CpG-sekvens, utgjør dette område sannsynligvis en "HTF-øy" (Bird, 1986) .

Promotor-området inneholder to GC-bokser og én CAAT-boks (se Fig. 7A); førstnevnte bokser skulle binde Spl (Kadogan et al., 1986) og sistnevnte CP-1 eller CP-2 (Chodosh et al., 1988).

Pstl-fragmentet som inneholdt promotor-sekvensene, ble så undersøkt med hensyn til sin reaktivitet som svar på ekstracellulære signaler, f.eks. virus-induserbarhet, på følgende måte: Et kimært gen ble konstruert hvor et referent-gen, nemlig et bakterielt kloramfenikol-acetyltransferase-(CAT)-gen nedstrøms støtte an mot Pstl-segmentet. Dette ble gjort ved bortskjæring av et Pstl-fragment fra P19IRFP (se ovenfor) ved BamHI og Hindlll og kloning av det resulterende fragment i Bglll-Hindlll-skjelettfragmentet av pA10cat2 (Rosenthal et al., 1983) under konstruksjon av pIRFcat.

Flere ytterligere konstruksjoner ble fremstilt som følger:

pIRFAcat ble fremstilt ved nedbryting av det pl9IRFP-avledede BamHI-Hindlll-fragment med Haelll hvis enkelt-gjen-kj ennelsessete befinner seg ved -30 - -35 fra hoved-CAP-setet (Fig. 5A) . Det resulterende HaeIII-HindIII-fragment ble ligert med Bglll-Hindlll-skjelettfragmentet av pA10cat2 og den følgende syntetiske DNA

Således inneholdt både pIRFcat og pIRFAcat sekvenser opp til henholdsvis -320 og -48 fra hoved-CAP-setet.

p-125cat inneholder promotorsekvensen av det humane IFN-/3-gen som beskrevet av Fujita et al., 1987.

pSV2cat er beskrevet i Gorman et al., Science, vol. 221, S. 551-553.

Som referanse-gen ble anvendt pRSVgpt, (se Gorman et al., ovenfor).

De forskjellige gener ble transfektert i muse-L929-celler under anvendelse av kalsiumfosfat-metoden (Fujita et al., 1985). 5 x IO<6> celler ble transfektert med 7,5 ug av forsøks-plasmidet som inneholdt CAT-referent-genet og 2,5 ug pRSV<g>pt. Cellene ble indusert med NDV eller "narre"-indusert og deretter underkastet enzymanalysen som beskrevet av Fujita et al., 1985.

Ved beregning av den relative CAT-aktivitet, ble CAT-aktivitet fra de "narre"-induserte celler, transfektert med pSV2cat, satt til 100%. Hver CAT-aktivitet ble normalisert ved Eco opt (Mulligan og Berg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 78, s. 2072-2076) for de respektive prøver. I prøver hvor CAT var under bakgrunnsnivået, ble de merket som b.b..

Resultatene er vist på Fig. 7B.

Det vil kunne sees at transfeksjon av pIRFcat i muse-L929 ga opphav til ekspresjon av lavnivå-CAT-aktivitet. CAT-ekspresjonsnivået ble øket når de transfekterte celler ble stimulert med NDV. Utelukkelse av den oppstrøms 300 bp-sekvens av IRF-l-genet (pIRFAcat) opphevet faktisk både konstitutiv og indusert ekspresjon av CAT-genet. Dette viser at promotorsekvensen ligger innenfor oppstrøms-300 bp-området og er virus-induserbar.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmider

1. Fag-DNA fra klon XL28-8 ble nedbrutt med EcoRl, og cDNA-innskuddet ble gjenvunnet. EcoRI-setene i cDNA ble gjort plane ved T4-DNA-polymerase og så ligert med syntetiske adapter-DNA-molekyler med sekvensen pGATCCATTGTGCTGG og pCCAGCACAATG i henhold til Aruffo og Seed, 1987.

Etter fjerning av de syntetiske DNA-molekyler med 5-20% kaliumacetat-gradientsentrifugering (Aruffo og Seed, 1987) , ble IRF-l-cDNA med adapter-DNA-molekylene festet til begge sine ender, ligert med BstXI-spaltet CDM8-vektor-DNA (B. Seed, Nature, vol. 329, s. 840-842, 1987). Plasmidene pIRF-S og pIRF-A som inneholdt IRF-1-cDNA i henholdsvis "sense"- og "antisense"-orientering med hensyn til CMV-promotoren, ble isolert.

Hvert plasmid-DNA ble ko-transfektert med enten p-55cat eller p55ClB (Fujita et al., 1987) i L929-celler, og CAT-ekspresjonsnivået ble bestemt.

Resultatene er vist i Tabell 1 nedenfor:

DNA-transfeksjonseffektiviteten varierer avhengig av tilstanden til mottakscellen (i dette tilfelle muse-L929-celler). Effektiviteten var mye lavere i Forsøk 2 sammenliknet med Forsøk 1. CAT-ekspresjonsnivået er derfor forholdsvis lavere i Forsøk 2.

Som det vil kunne sees av ovennevnte tabell, var betydelig CAT-aktivitet påvisbar bare i cellene som var transfektert med p-55ClB og pIRF-S. De viser at IRF-1 bindes til de repeterte (8 ganger) AAGTGA-sekvenser som er tilstede oppstrøms i CAT-genet i p-55ClB og derved aktiverer transkripsjonen av det distale CAT-gen.

Resultatene viser videre at CAT-ekspresjonsnivået er øket (mer enn to ganger) ved infeksjon av de transfekterte celler med NDV (Tabell 1), hvilket viser* at det er mulig å kontrollere gen-ekspresjonen ved forskjellige stimuli såsom virus. 2. Et ekspresjons-plasmid for dannelse av et protein som består av IRF-l-DNA-bindingsområde og transkripsjonelt aktiverings-område hos gjær-GAL4, ble konstruert som følger: Plasmid pIRF-S ble nedbrutt med Hindlll og Pstl og cDNA-innskuddet isolert. cDNA ble nedbrutt med Dralll, og Hindlll-Dralll-fragmentet (ca. 550 bp) ble gjenvunnet og betegnet Fragment A.

Ekspresjonsvektoren CDM8 ble nedbrutt med Hindlll og

Xbal og skjelett-DNA isolert og betegnet Fragment B.

DNA som kodet for det transkripsjonene gjær-GAL4-aktiveringsområde, ble isolert fra plasmid pRB968 (Ma og Ptashne, .1987) som følger: pRB968-DNA ble først nedbrutt med Hindlll, og endene ble gjort plane ved T4-DNA-polymerase. Syntetisk Xbal-linker-DNA ble tilsatt til DNA, og DNA ble deretter nedbrutt med PvuII og Xbal.

Det resulterende ca. 600 bp PvuII-Xbal-DNA-fragment

ble gjenvunnet og betegnet Fragment C.

Dessuten ble en syntetisk DNA med følgende sekvens dannet:

betegnet Fragment D.

En ekspresjonsvektor pIRFGAL4 ble konstruert ved ligering av Fragmentene A, B, C og D. Som kontrollplasmid

ble plasmid pIRFAGAL4 konstruert ved ligering av Fragmenter A, B, C og en syntetisk DNA med følgende sekvens:

Siden en terminator-triplett, TGA, er tilstede i leseramme mellom IRF-1- og GAL4-sekvensene i p*IRFAGAL4, skulle det uttrykte protein mangle GAL4-aktiverings-området.

For undersøkelse av de funksjonelle egenskaper hos den plasmid-kodede kimæriske transkripsjonene faktor, ble pIRFGAL4 og pIRFAGAL4 begge ko-transfektert med p-55C1B i L929-celler og CAT-ekspresjonen kontrollert. Resultatene er vist i Tabell 2 nedenfor:

Verts-celle, Muse-L929-celler. Cellene var ikke indusert med NDV

Resultatene viser at ekspresjonen av et mål-gen (såsom et gen som koder for et interleukin, et interferon (a, p og y), en plasminogen-aktivator, erytropoietin, granulocytt-kolonistimulerende faktor, insulin, humant veksthormon eller superoksyd-dismutase (eller mutanter av de humane gener), kan forsterkes ved IRF-1.

Mål-gener som nevnt ovenfor, såsom interferon-gener, f.eks. IFN-a, IFN-Ø, IFN-ir, IFN-omega og plasminogen-aktivatorer, f.eks. t-PA, pro-urokinase eller urokinase o.s.v., kan uttrykkes mer effektivt også ved at det for disse inkorporeres promotorer sammensmeltet med forskjellige lengder av gjenkjennelses-sekvenser for IRF-1, f.eks. AAGTGA.

For eksempel kan mål-genene innføres i forskjellige vertsceller, sammen med enten intakte IRF-1^- eller kimæriske IRF-l-gener. Ved økning av lengden av IRF-l-gjenkjennelses-sete-DNA, f.eks. ved økning av antallet AAGTGA-repeteringer og ekspresjonsnivået for transkripsjonsfaktoren, kan en høynivå-ekspresjon av mål-genene oppnås.

For eksempel kan AAGTGA-repeterings-sekvensen støte an mot en egnet promotor såsom IFN-/3-promotor eller SV40-virus-tidligpromotor. Et mål-gen, f.eks. et t-PA-gen eller IFN-/3-gen, kan bindes nedstrøms for en slik promotor; strukturen av et slikt konstruert gen er

(AAGTGA)x (Promotor) (mål-gen f.eks. t-PA-gen).

Et slikt gen kunne så innføres i, og forsterkes i, CHO-celler, f.eks. CHO DXBII-(dhfr-stamme)-celler (Urlaub og Chasin, Proe. Nati., Acad. Sei., USA, vol. 77, s. 4216-4220, 1980).

Som omtalt ovenfor, vil en vertscelle ideelt velges blant celler som ikke har noe, eller hovedsakelig ikke har noe, nivå av endogen IRF-l-aktivitet. IRF-l-genet, fortrinnsvis enten med en sterk promotor såsom en CMV-promotor eller en induserbar promotor såsom en metalltionen-genpromotor, kan innføres i de forskjellige vertsceller på vanlig måte.

IRF-l-genet kan innføres samtidig med, og forsterkes sammen med, mål-genet. Alternativt kan IRF-l-genet og mål-

genet innføres atskilt i vertscellen.

I slike transfekterte celler kan IRF-1 dannes enten konstitutivt (når det gjelder f.eks. CMV-promotor) eller på en indusert måte (når det gjelder f.eks. metalltionen-promotoren, induseres den ved toverdige metaller såsom sink). Den uttrykte IRF-1 bindes til de AAGTGA-repeterende enheter og forsterker det distale mål-gen, f.eks. t-PA-genet eller IFN-genet.

Slik ekspresjon kunne ytterligere forsterkes ved virus-, f.eks. NDV-induksjon; som det vil kunne ses av Tabell 1, Forsøk 2, øker slik induksjon aktiviteten av IRF-1.

Muse-cDNA-sekvens som kryss-hybridiserer med muse-IRF-l-cDNA ifølge Formel III ;

Et muse-cDNA-bibliotek ble fremstilt ved fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor. cDNA ble syntetisert ved standard-fremgangsmåten under anvendelse av det muse-L929-celle-avledede mRNA, og cDNA ble innført i XgtlI-vektoren ved standard-fremgangsmåten. Det resulterende Xgtll-bibliotek ble så undersøkt under isolering av cDNA-kloner hvis innskudd kryss-hybridiserer med muse-IRF-l-cDNA beskrevet ovenfor, som følger: Nitrocellulosefiltre som inneholdt fag-plakk-DNA, ble inkubert i følgende trinn:

(1) i 3 x SCC ved 65°C i 30 minutter, fulgt av

(2) 60 minutters inkubering i 3 x SSC som inneholdt Denharfs oppløsning (0,2% bovint serumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon 25), fulgt av (3) et for-hybridiseringstrinn som besto av inkubering i 12 timer ved 65°C i en oppløsning som inneholdt 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% SDS, 50 iiq/ ml enkeltkjedet bærer-DNA (f.eks. laksespermie-DNA) og Denharfs oppløsning,

og

(4) inkuberingen i trinn 3 ble gjentatt, men under inkorporering av <32>P-merket muse-IRF-l-cDNA som probe. Denne cDNA-probe ble fremstilt som det EcoRI-spaltede innskudd fra XL-28-8 og translatert ved Multiprime-merkingssystemet (se ovenfor). Inkuberingen ble utført ved 65°C i 12 timer.

Filtrene ble så vasket, skyllet kort i 2xSCC-oppløsning og deretter vasket i 3xSCC-oppløsning som inneholdt 0,1% SDS i 30 minutter ved 65°C. Denne fremgangsmåte ble gjentatt to ganger.

Én av de positive kloner, betegnet pHH-45, ble utvalgt og ble påvist å inneholde cDNA som dekket bare en del av en kodingssekvens for en IRF.

cDNA-innskuddet i PHH-45 ble derfor isolert og anvendt for undersøkelse av kloner som inneholdt større innskudd som beskrevet ovenfor når det gjelder fremstilling av pIRF-L under overskriften "Struktur av cDNA som koder for muse-IRF-1".

Blant de identifiserte positive kloner, ble klonen med betegnelsen pIRF2-5 utvalgt og karakterisert under anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet tidligere for muse-IRF-1. Den fullstendige hybridiserende cDNA-sekvens er vist i formel IVa, og aminosyresekvensen for det tilsvarende IRF-protein er vist i formel VIII.

Plasmid pIRF 2-5 ble transfektert i E. coli MC 1061/p3, som var deponert som E. coli i FRI under Budapest-Traktaten 22. november 1988 under nr. FERM BP-2157.

cDNA fra gjær-genomet som hybridiserer med human IRF-1-cDNA- sekvens

Gjær-DNA ble fremstilt ved standard-fremgangsmåten og nedbrutt med EcoRI. 5 ug av den nedbrutte DNA ble påsatt på 0,8% agarose-gel og underkastet elektroforese og DNA-"blotting" ved standard-fremgangsmåter.

Det "blottede" filter ble behandlet nøyaktig som beskrevet i det foregående eksempel for isolering av muse-DNA som hybridiserer med muse-IRF-1, bortsett fra som følger: I trinn (3) var inkubasjonstemperaturen 55°C, og i trinn (4) ble inkuberingen også utført ved 55°C, og den radioaktive probe var den humane IRF-l-cDNA isolert fra pHIRF31 ved Xhol-nedbryting.av plasmidet, og denne probe var merket som beskrevet i det foregående eksempel med hensyn til muse-IRF-1. Filteret ble vasket ved 55°C i 2 x SSC. De positive kloner ble identifisert ved autoradiografi (se Fig. 10).

Referanser

Abreu S.L., Bancroft F.C., and Stewart II E.W. (1979). Interferon priming.

J. Biol. Chem. 254, 414-418.

Aruffo A. , and Seed B. (1987). Molecular cloning of a cDNA by a high-efficiency COS cell expression system.

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 8573-8577.

Bird A.P. (1986). CpG-rich islands and the function of DNA methylation.

Nature 321, 209-213.

Caput D., Beutler B., Hartog K., Thayer R., Brown-Schimer S.f and Cerarai A. (1986). Identification of a common nucleotide sequence in the 3' untranslated region of mRNA molecu-les specifying inflamraatory raediators. Proe. Nati. Acad. Sei USA 83, 1670-1674.

Cavalieri R.L., Havell E.Z., Vilcek J., and Pestka S.

(1977). Induction and decay of human fibroblast interferon mRNA.

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 4415-4419.

Chodosh L.A., Baldwin A.S., Carthew R.W., and Sharp P.A.

(1988). Human CCAAT-binding proteins have heterologous su-bunits.

Cell 53, 11-24.

Dinter H., Hauser H., Mayr U., Lammers R., Bruns W., Gross G., and Collins J. (1983). Human interferon-beta and co-induced genes: molecular studies. In the biology of the Interferon System 1983, E. De Maeyer and H. Schellekens, eds.

(Amsterdam: Elsevier Science Publishers), 33-34.

Dinter H., and Hauser H. (1987). Cooperative interaction of multiple DNA elements in the human interferon-fl promoter. Eur. J. Biochem. 166, 103-109.

Evans R.M., and Hollenberg S.M. (1988). Zinc Fingers: Gilt by association.

Cell 52, 1-3.

Fujita T., Saito S., and Kohno S. (1979). Priming increases the amount of interferon mRNA in poly(rI):poly(rC)-treated L cells.

J. Gen. Viol. 45,301-308.

Fujita T., Ohno S., Yasumitsu H., and Taniguchi T. (1985). Delimination and properties of DNA sequences required for the regulated expression of human interferon-S gene Cell 41, 489-496.

Fujita T., Shibuya H., Hotta H.r Yamanishi K., and Taniguchi T. (1987). Interfero-fl gene regulation: Tanderaly repeated sequences of a synthetic 6 bp oligomer function as a virus-inducible enhancer.

Cell 49, 357-367.

Galabru J., and Hovanessian A.G. (1985). Two interferon-B indeced proteins are involved in the protein kinase complex dependent on double-stranded RNA.

Cell 43, 685-694.

Goodbourn S., Zinn K., and Maniatis T. (1985). Human fl-interferon gene expression is regulated by an inducible enhancer element.

Cell 41, 509-520.

Huynh T.V., Young R.A., and Davis R.W. (1985). Constructing and screening cDNA libraries in gtlO and 11. In DNA cloning-A Practical Approach, volume 1, D.M. Glover, ed.

(Oxford: IRL Press), pp. 49-78.

Israel A., Kimura A., Fournier A., Fellous M., and Kourilsky P. (1986). Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature 322, 743-746.

Kadonaga J.T., Jones K.A., and Tjian R. (1986). Promoter-specific activatidn of RNA polymerase II transcription by Sp 1. Trends Biochem. Sei. 11, 20-23.

Kakidani H., and Ptashne M. (1986). GAL4 activates gene expression in mammalian cells.

Cell 52., 161-167.

Keller A.O., and Maniatis T. (1988). Identification of an inducible factor that binds to a positive regulatory element of the human fl-interferon gene.

Proe. Nati. Acad. Sei USA 85, 3309-3313.

Kohase M., May L.T. > Tanun I. / Vilcek J., and Sehgal P.B.

(1987). A cytokine network in human diploid fibroblasts: interactions of beta interferons, tumor necrosis factor, platelet-derived growth factor and interleukin-1.. Mol. Cell. Biol. 1, 272-280.

Korber B., Merraod N., Hood L., and Stroynowski i. (1988). Regulation of gene expression by interferons: Control of H-2 Promoter responses.

Science 239, 1302-1306.

Kozak M. (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.

Nucl. Acids Res. 15, 8125-8143.

Krebs E./ Eisenman R., Kuenzel E., Litchfield D. , Lozeman F., Liischer B., and Sommercorn J. (1988). Casein Kinase II as a potentially important enzyme concerned withVsignal transduction. In the Molecular Biology of Signal Transduc-tion (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor La-boratory) Abstract p.35.

Kuhl D., de la Fuente J., Chaturvedi M., Parimoo S., Ryals J., Mayer F., and Weissmann C. (1987). Reversible silencing of enhancers by sequences derived from the human IFN-a promoter.

Cell 50, 1057-1069.

Kyte J., and Doolittle R.F. (1982). A simple method for dis-playing the hydropathic character of a protein.

J. Mol. Biol. 157, 105-132.

Levy D.E., Kessler D.&., Pine R., Reien N.f and Darnell J.E.

(1988). Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive and negative transeriptional control. Genes and Development 2_, 383-393.

Ma J.r and Ptashne M. (1987). The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognised by GAL80.

Cell 50, 137-142.

Maxam A., and Gilbert W. (1980). Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavages.

Meth. Enzym. 6_5, 499-560.

Moore R.N., Larsen H.S., Horohov D.W., and Rouse B.T.

(1984). Endogenous regulation of macrophase proliferative

expansion by colony-stimulation-factor-induced interferon. Science 223, 178-180.

Nedwin G. , Naylor S., Sakaguchi A., Smith D., Jarrett-Nedsin J., Pennica D., Goeddel D., and Gray P. (1985). Human lym-photoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homo-logy and chromosomal localisation.

Nucl. Acids Res. 13, 6361-6373.

Nir U., Cohen B., Chen L., and Revel M. (1984). A human IFN-fll gene deleted of promoter sequences upstream from/the TATA box is controlled post-transcriptionally by dsRNA. Nucl. Acids Res. 12, 6979-6993.

Ohno S., and Taniguchi T. (1983). The 5'-flanking sequence of human interferon-fl gene is responsible for viral induction of transcription.

Nucl. Acids Res. 11, 5403-5412.

Onozaki K., Urawa H., Tåraatani T., Iwamura Y., Hashimoto T., Baba T., Suzuki H., Yamada M., Yaraaraoto S., Oppenheira J.J., and~Matsushima K. (1988).Synergistic interactions of interleukin 1, interferon-0 and tumor necrosis factor in ter?-minally differentiating a mouse myeloid leukemic cell line J. Iramunol. 140, 112-119.

Pabo C.O., and Sauer R.T. (1984). Protein-DNA recognition. Ann. Rev. Biochem. 5_3, 293-321.

Raji N.B.K., and Pitha P.M. (1981). An analysis of interferon mRNA in human fibroblast cells induced -to produce in-ter feron.

Proe. Nati. Acad. Sei USA J8_, 7426-7430.

Raji N.B.K., and Pitha P.M. (1983). Two levels of regulation of fi-interferon gene expression in human cells.

Proe. Nati. Acad. Sei USA 80, 3923-3927.

Resnitzky D. , Yarden A., Zipori D., and Kirachi A. (1986). Autocrine fl-related interferon controls c- myc suppression and growth arrest during hematopoietic cell differentiation. Cell 4_6, 31-40.

Rosenthal N., Kress M., Gruss P., and Khoury G. (1983). BK viral enhancer element and a human cellular homolog. Science 222, 749-755.

Ryals J., Dieks P., Ragg H., and Weissmann C. (1985). A 46-nucleotide promoter segment from an INF-a gene renders an unrelated promoter inducible by virus.

Cell 41, 497-507.

Shaw G., and Kamen R. (1986). A conserved AU seguence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation.

Cell 46, 659-667.

Singh H., LeBowitz J.H., Baldwin Jr.A.S., and Sharp P.A.

(1988). Molecular cloning of an enhancer binding protein: Isolation by screening of an expression library with are-cognition site DNA.

Cell 52 415-423.

Sugita K., Miyazaki J.I., Appella E., and Ozato K. (1987). Interferons increase transcription of a major histocompati-bility class I gene via a 5' interferon consensus sequence. Mol. Cell. Biol. 7, 2625-2630.

Taniguchi T. , Matsui H., Fujita T., Takaoka C, Kashima N., Yoshimoto R., and Hamuro J. (1983). Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2.

Nature 302, 305-310.

Taniguchi T. (1988). regulation of cytokine gene expression. Ann. Rev. Immunol. 6_, 439-464.

Thomas P.S. (1980). Hybridisation of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose.

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5201-5205.

Tiwari R.J., Kusari J., and Sen G.C. (1987). Functional equivalents of interferon-mediated signals needed for induction of a mRNA can be generated by double-stranded RNA and growth factors.

EMBO J. 6_, 3373-3378.

Warren M.K., and Ralf P. (1986). Macrophage growth factor CSF-1 stimulates human monocyte production of interferon, tumor necrosis factor and colony stimulating activity.

J. Immunol. 137, 2281-2285.

Webster N., Jin J.R., Green S., Hollis M., and Chambon P.

(1988). The yeast UAGs is a transcriptional enhancer in

human HeLa cells in the presence of the GAL4 trahs-actiyator. Cell 52, 169-178.

Weissmann C, and Weber H. 81986). The interferon genes. Proe. Nati. Acid Res. Mol. Biol., 33, 251-300.

Young R.A., and Davis R.W. (1983). Yeast RNA polymerase II genes: Isolation with antibody probes.

Science 222,' 7778-782.

Zinn K., Dimaio D., and Maniatis T. (1983). Identification of two distinct regulatory regions adjaceht to the human fl-interferon gene.

Cell 34_, 865-879.

Zullo J.N., Cochan B.H., Huang A.S., and Stiles CD. (1985). Platelet-derived growth factor and double-stranded ribonuc-leic acids and stimulate expression of the same genes in/3T3 cells.

Cell 4_3, 793-800.

Claims (15)

1. DNA-sekvens, karakterisert ved at den inneholder en sekvens som koder for et protein med aktivitet som interferon-regulerende faktor-1 (IRF-1) som angitt i fig. 4A og fig. 8, og eventuelt en promoterregion som angitt i fig. 7A.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for en human IRF-1 eller en muse-IRF-1.

3. DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den koder for et protein som bindes til den gjentatte oligomer-sekvens AAGTGA (Cl-sekvens) og de regulerende oppstrøms-elementer i det humane IFN-/?-gen.

4. DNA-sekvens ifølge krav 1-3, karakterisert ved at det inneholder et strukturelt gen med formelen:

5. DNA-sekvens ifølge krav 1-4, karakterisert ved at det inneholder et strukturelt gen med formelen

6. DNA-sekvens ifølge krav 1-4, karakterisert ved at det inneholder et strukturelt gen med formelen:

7. DNA-sekvens ifølge krav 1-5, karakterisert ved at den hybridiserer til et DNA-molekyl som definert i hvilket som helst av kravene 5-6, og at den koder for et protein med IRF-l-aktivitet.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den innbefatter et promotor-område som er operabelt bundet til DNA-sekvensen ifølge krav 1-7 som koder for det IRF-l-aktive protein og er istand til å uttrykke dette i en egnet vertcelle.

9. Ekspresjonsvektor ifølge krav 8, karakterisert ved at promotoren er en konstitutiv promotor eller en induserbar promotor.

10. Ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 8 og 9, karakterisert ved at det omfatter en promotor- og regulatorsekvens som innbefattes i følgende

11. Ekspresjonsvektor ifølge krav 8, karakterisert ved at den er et av plasmidene pHIRF31 FERM BP-2006; pIRF-2 , FERM BP-2005; og plasmid PIRF2-5, FERM BP-2157.

12. Anvendelse av IRF-1 for å øke ekspresjonen åv et ønsket målgen for å oppnå et høyere utbytte av det tilhørende målproteinet.

13. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert ved en ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 8-11.

14. Vertscelle ifølge krav 13, karakterisert ved at den er en bakteriecelle eller en gjærcelle eller en pattedyrscelle.

15. Protein med IRF-l-aktivitet, karakterisert ved at det har en aminosyre-sekvens som kodes for av et strukturelt gen ifølge krav 1-6.