PT101697B - Processo para a preparacao de um factor de regulacao de expressao genetica - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM FACTOR DE REGULAÇÃO DE EXPRESSÃO GENÉTICA

A transcrição de genes em células de mamíferos é regulada por mecanismos complexos nos quais as interacções das sequências de ADN de regulação com proteínas de ligação de ADN de acção trans desempenham um papel principal. No contexto da regulação de transcrição, os genes que codificam para os interferões (IFNs) apresentam um aspecto comum a muitos genes de citoquinas; a transcrição destes genes é induzida transitoriamente seguindo diversos sinais extracelulares. Encontra-se bem documentado o facto de que a transcrição dos genes para IFN-α e IFN-β é induzida de forma eficiente por vírus em várias células, enquanto que a do gene que codifica para IFN-γ é induzido em linfócitos T (células T) a seguir a estimulação mitogénica (para uma revisão ver Weissmann e Weber, 1986; Taniguchi, 1988).

IFN-β, uma citoquina que foi originalmente identificada pela sua potente actividade antiviral, parece também desempenhar um papel crucial na regulação do crescimento das células e na diferenciação. Neste aspecto, para além de vírus e de poli (rT) :poli (rC) que são indutores bem conhecidos do gene do IFN-β, muitas citoquinas, tais como o factor 1 de estimulação de colónias (CSF-1) (Moore et al., 1984; Warren e Ralf, 1986; Resnitzky et al., 1986), o factor de necrose de tumores (TNF) (Onozaki et al., 1988), o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (Zullo et al., 1985) e IFNs (Kohase et al., 1987) parecem também induzir o IFN-β em certas células, sugerindo que podem transduzir sinais semelhantes ou idênticos nas células visadas.

Demonstrou-se que a indução do gene do IFN-β por vírus e por poli(ri):poli(rC) ocorre ao nível da transcrição (Raji e Pitha, 1983; Ohno e Taniguchi, 1983; Dinter et al., 1983; Zinn et al., 1983). Deste modo as sequências de ADN que actuam em cis funcionando como intensificadores indutíveis foram identificadas dentro da região 5' de flanco do gene de IFN-β humano (Fujita et al., 1985, 1987; Goobourn et al., 1985;

Dinter e Hauser, 1987). A região intensificadora indutível (isto é, -65 a -105 com respeito ao local de remate CAP) contém unidades hexanucleotídicas repetitivas; (AAGTGA)^. Os requerentes descobriram que o IRF-1 desempenha um papel essencial na activação induzida por vírus da transcrição do gene de IFN-β por interacção com os elementos cis identificados.

No pedido de publicado sob o determinadas moléculas

Patente Europeia n° original

N°. 8911518.1, proteína que possuem a de interferão (IRF-I).

0359998, os de ADN recombinante que codificam para actividade de um factor I de regulação requerentes descreveram

A presente invenção proporciona uma molécula de ADN recombinante descrita pela fórmula Illa abaixo indicada:

Fórmula IIIa

20 30 40

ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

60 70 80 90

ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120130

AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

140 150 160 170180

TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210220

GAT AC AGGAAAGCAT CAACCAGGAAT AGA T AAACCAGAT C C AAAA

230 240 250 260270

ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

280 290 300310

ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350360

TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 380 390400

AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAG T TAAGCAC

410 420 430 440450

ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480490

GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530540

AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 570580

TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620630

CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660670

GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710720

CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750760

AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800810

AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840850

ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG γ s'

860 870 880 890900

CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930940

TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980990

CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 10201030

CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGT ou um fragmento, ou uma variante degenerada da molécula ou do fragmento.

A molécula de ADN pode por exemplo ser caracterizada por um gene estrutural que apresenta a Fórmula definida anteriormente e sequências de flanco a montante e a jusante contidas na Fórmula Iva que se apresenta em seguida:

TCTCAGGCAAGCCGGGGA

CTAACTTTTAGTTTTGCTCCTGCGATTATTCAACTGACGGGCTTT

CATTTCCATTTTACACACCCTAACAACACTCACACCTTGCGGGAT TGTATTGGTAGCGTGGAAAAAAAAAAAGCACATTGAGAGGGTACC ' 20 30 '40

ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

60 70 8090

ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120130

AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

140 150 160 170180

TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210220

CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 260270

ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

280 290 300310

ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350360

TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 380 390400

AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC

410 420 430 440450

ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480490

GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530540

AAAAATGAAG TGGAT AGT ACGGTGAAC AT CAT AGT TG T AGGACAG

550 560 570580

TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620630

CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660670

GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710720

CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750760

AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAiAGAGG

770 780 790 800810

AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840850

ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 870 880 890900

CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGACCATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930940

TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990

CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC 1000 1010 1020 1030

CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT 1040

GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTTGTTGGGA TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGTATTATATTATTTTTT TTCTCTATGATACCTATCTTAGACACATCTAAGGGAGAAAGCCTT GACGATAGATTATTGATTGCTGTGTCCAACTCCAGAGCTGGAGCT TCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATG CGTATCTCTAGAACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGACCTGCTGCGTTGCC TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG AGAAAATGTGAACTAGCTGGAATTTTTTTATTCTTGTGAATATGT ACATAGGGCAGTACGAGCAATGTCGCGGGCTGCTTCTGCACCTTA TCTTGAAGCACTTACAATAGGCCTTCTTGTAATCTTGCTCTCCTT CACAGCACACTCGGCGACCCCTTCTGTGTCCACTACCCCACTACC CACCCCTCCCTCCTCAACCCCTCCATCCCGGTCCTCTATGCGCCC CTTCCCCCCAACCAATCCCATCACAACCTCTTACCTATCCTTTCC CTCCCAACCCCTTCTATCCCAGCCCACCACCTACCCCACTCCTCC CCAACTCCTCCATTCTAGCCCATTACCCACGCCTCTCTCCTCAGC CCAGCCTACCCCATCCCACCCTGTTCCTTTCCTCCAGTTTCCTCT CCTCAAAGGCAAGGCT CTACAT CT TGGAGGAGGAGGAGGAGAAGA AAATGAGTTTCTTCACCGCTGTCCCATTTTAAGACTGCTTGAATA ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg TACAAAGGAAAACTGTCATGGAAATATTATGCAAATTCCCAGATC TGAAGACGGAAAATACTCTAATTCTAACCAGAGCAAGCTTTTTTA TTTTTTTATACAAGGGGAATATTTTATTCAAGGTAAAAAAATTCT

ΑΑΑΤΑΑΑΑΤΆΤ AATΤ GT Τ Τ Τ Τ Τ AT CT ΤΤTCΤACAGCAAATΤΤΑΤA

ATTTTAAGATTCCTTTTCCTGTTCATCAGCAGTTGTTATTACATC

CCTTGTGGCACATTTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGAAAAAAAA

ACTTTTATGAGCTCATGTAGCAATCAAATTATCCTGTGGATTGAT

AAT AAAT GAATAT GGTATAT AGTT AAAGAT Τ Τ Τ AAAAAAAAAAAA ou um fragmento, ou uma variante degenerada da molécula ou do fragmento.

A molécula de ADN da presente invenção é de preferência uma molécula que codifica para uma proteína que se liga à sequência oligomérica repetida AAGTGA e aos elementos de regulação a jusante do gene do IFN-β humano.

A molécula de ADN pode incluir uma região promotora a qual é constituída ou indutível, por exemplo indutível por vírus, por exemplo por vírus da doença de Newcastle, ou é indutível por estimulação mitogénica, por exemplo utilizando Concanavalina A.

A molécula de ADN recombinante da presente invenção pode também conter uma sequência promotora e de regulação contida na fórmula V que se apresenta seguidamente:

Fórmula V

PstI

CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299

GC Box 1 GC Box 2

CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAA*GGGGCGGpCCCGCGGTAGCCCC|GGGGCGG|TGGCGCGG -251

GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC -193

CAAT Box

AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTçjGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG

-135

Minor Cap site ' I «

GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC

-77 -21

Major Cap site plRF-L r~

TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT

-19 +1

TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCS + 39

CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97

CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155

PstI

TCGCTCCTGCAG +213 +225 ou uma sua variante degenerada.

A presente invenção compreende também uma célula hospedeira, por exemplo uma célula bacteriana, por exemplo E. coli, ou uma célula de levedura ou uma célula de mamífero, por exemplo uma célula CHO, ou uma célula de rato, por exemplo L929, transformada por uma molécula de ADN recombinante tal como definida acima.

A proteína....... que_ é codificada... pela ... sequência.....de ADN da fórmula Illa apresenta a fórmula VIII.

Fórmula VIII

MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln

IleAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu

LysLysIlePheGlnlleProTrpMetHisAlaAlaArgHisGly

TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPheArgAsnTrpAlalle

HisThrGlyLvsHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys

ThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsp

IleGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAla

PheArgValTyrArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys

LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHis

IleLysGlnGluProValGluSerSerLeuGlyLeuSerAsnGly

ValSerGlyPheSerProGluTyrAlaValLeuThrSerAlalle

LysAsnGluValAspSerThrValAsnllelleValValGlyGln

SerHisLeuAspSerAsnlleGluAspGlnGluIleValThrAsn

ProProAspIleCysGlnValValGluValThrThrGluSerAsp

AspGlnProValSerMetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSer

ProValSerSerTyrAlaGluSerGluThrThrAspSerValAla

SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg

SerlleGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGlyThrArgAsn

ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsnLys

ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro

TyrAsnSerSerTrpProProPheThrAspLeuProLeuProAla

ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr ArgAlaSerValIleLysLysThrSerAspIleThrGlnAlaArg ValLysSerCys

A proteína acima pode ser obtida por cultura de uma célula transformada e isolamento da proteína produzida de um modo convencional.

pedido de Patente Europeia original N°. 8911518.1 descreve a clonagem e a expressão de determinadas proteínas IRF-I da forma seguinte:

1. Clonagem e expressão de ADN de IRF-1 em E. coli

A. Isolou-se ARN poli(A) de células L929 de rato não induzidas e utilizou-se para sintetizar ADNc (segundo o procedimento de Aruffo e Seed, 1987) . 0 ADNc foi em seguida clonado num vector Xgtll cindido com EcoRI e construiu-se um banco de ADNc de acordo com o processo conhecido de Huynh et al., 1985, utilizando E. coli Y1090 como estirpe hospedeira.

Efectuou-se em seguida uma busca no banco de Xgtll com a sequência AA.GTGA multimerizada (4 vezes) (seguidamente referida como oligómero Cl; Fujita et al., 1987) como sonda.

Neste processo de busca, inoculou-se E.

coli Y1090 infectado pelos fagos Xgtll recombinantes em placas rectangulares de

10x13 cm.

As placas foram em seguida incubadas a 12°C durante 4 a horas, após o que eram visíveis cerca de

000 colónias/placa.

Os filtros de membrana para a busca eram membranas de nylon (Nytran; Schleicher & Schnell) ou de nitrocelulose (Schleicher & Schnell). Os filtros foram mergulhados em IPTG 10 mM (para a indução do gene de expressão lacZ nas colónias de fagos apropriados) e secos ao ar, em seguida foram cobertos sobrepostos nas placas e incubados a 37°C durante 2,5 horas. As colónias apenas produzirão uma proteína codificada por ADNc se o ADNc estiver em concordância de quadro com o gene lacZ.

Os filtros foram em seguida removidos e arrefecidos a 4°C durante 20 minutos e, sem secar, foram submetidos a selecção.

Os filtros de membrana foram em seguida preparados para análise tal como se segue:

Preparou-se um extracto nuclear de células L929 de rato e depositou-se (numa quantidade correspondente a cerca de 10 pg de proteína) sobre as membranas.

Antes de se efectuar a ligação de ADN utilizou-se um tampão de ligação constituído por Hepes 10 mM a pH 7,5, NaCl 5,0 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM e 5% de glicerol. Adicionou-se 5% de leite em pó magro (Yukijurishi Inc.) ao tampão e incubaram-se os filtros na mistura durante 1 hora a 4°C e em seguida enxaguaram-se durante 1 minuto no mesmo tampão mas neste caso sem leite em pó.

Incubaram-se em seguida os filtros em tampão de ligação (1 ml) contendo 350 pg/ml de ADN de esperma de salmão com um comprimento médio de aproximadamente 300 pb e ADN oligomérico Cl sonda marcado com ³²p (10⁶ cpm/ml; actividade específica 2 000 cpm/fmol) (ver Fujita et al., 1987). A sonda de ADN foi marcada nas extremidades 5' com [γ-³²Ρ]ΑΤΡ utilizando quinase T4.

Após a ligação, os filtros foram lavados à temperatura ambiente com o tampão de ligação durante 1 a 2 horas (filtro de 10 ml), mudando o tampão de ligação várias vezes durante esta operação. Os filtros foram em seguida secos ao ar e submetidos a auto-radiografia. Nesta análise, as membranas de nylon, ao contrário das membranas de nitrocelulose, deram um sinal positivo que era inibido de forma especifica com a inclusão do oligómero Cl não marcado em excesso.

Seleccionaram-se desta forma cerca de 1,4x10” recombinantes. Entre os 32 clones fágicos positivos identificados na primeira selecção, verificou-se que um clone (designado por ÀL28-8) se ligava repetidamente com a sonda de ADN em selecções subsequentes.

2. Produção e purificação de proteína em E. coli transfectado

Prepararam-se clones bacterianos lisogénicos por transfecção de E. coli Y1089 com ÀL28-8. Em seguida inocularamse os clones lisogénicos contendo ÀL28-8 obtidos de um dia para o outro em 400 ml de meio L a 1%. Cultivaram-se as bactérias a 31°C até que a D0₆oo alcancou o valor de 1. A temperatura foi então ajustada a 42°C durante 20 min. Em seguida adicionou-se IPTG 10 mM e, após incubação a 38°C durante mais 20 min, as culturas foram rapidamente centrifugadas e o agregado foi suspenso em 10 ml de tampão de lise constituído por Hepes 20 mM a pH 7,9, EDTA 0,2 mM, espermidina 0,5 mM, espermina 0,15 mM, DTT 0,1 mM, 10% de glicerol, fluoreto de fenilmetionilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM, 1 pg/ml de pepstatina A, 1 μg/ml de leupeptina, L-l-tosilamida-2-feniletilclorometilbenzamida 500 μΜ, molibdato de sódio 10 mM, pirofosfato de sódio 2 mM e ortovanadato de .sódio-.2.....mM... Submeteram-se as suspensões - das células a três ciclos rápidos de congelamento - descongelamento e em seguida centrifugaram-se a 30 000 rpm durante uma hora a 4°C utilizando um rotor Beckman 5o Ti. O sobrenadante foi utilizado directamente para uma análise de retardamento em gel (ver em seguida) ou em alternativa foi ainda purificado.

A purificação adicional foi levada a efeito como se segue:

Aplicaram-se aproximadamente 4 ml do sobrenadante numa coluna de poli(di-C): poli(di-C) com um volume de leito de 2 ml e equilibrada com um tampão de lise. Aplicou-se em seguida o material eluído (4 ml) a uma coluna DE 52 (Whatman) contendo um volume de leito de 2 ml equilibrada com tampão Z (Hepes 25 mM a pH 7,8, MgCl₂ 12,5 mM, DTT 1 mM, 20% de glicerol, 0,1% de Np-40 e PMSF 0,5 mM) . Eluiu-se a actividade de ligação de ADN com tampão Z contendo Kcl 0,1 mM. O eluido foi novamente concentrado utilizando centricon-10 (Amicon). A concentração final da proteína era de 28 mg/ml.

3. Caracterização do produto proteico do clone 1L28-8:

(i) Análise de retardamento em gel

Prepararam-se clones bacterianos lisogénicos contendo ÀL288 por transfecção de E. coli Y1089 e induziram-se para expressar o ADNc clonado a altos níveis utilizando o procedimento de Huynh et al., 1985. Utilizaram-se para comparação clones lisogénicos preparados e tratados do mesmo modo com o fago não contendo inserido o ADNc (designado por λ6).

Prepararam-se extractos contendo cada um 3 μg de proteína das culturas induzidas do lisogénio (quatro preparados designados por ÀL28-8a, ÀL28-8b, X6a e À6b).

Foi também preparado extracto nuclear (3 μg de proteína) a partir de células L929 de rato.

Os extractos foram incubados com um fmol de sonda oligomérica Cl marcada tal como descrito acima com uma actividade específica de 8 000 cpm/fmol.

Cada extracto foi também submetido a análises por

competição,

nas quais se adicionou um ADN competidor em

várias concentrações à incubação.

Os resultados da análise são apresentados na Fig. 1, em que

as diversas	pistas possuem a seguinte correspondência:
Pista	Extracto
1	nenhum
2	À6a
3	X6b
4	X6b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado
5	X6b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado*
6	ÀL28-8a
7	XL28-8b
8	ÀL28-8b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado
9	XL28-8b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado*
10 11	células L929 células L929 com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado
12	células L929 com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado*

* O oligómero C5A encontra-se descrito em Fujita et al., 1985 e é uma sequência 6 vezes repetida de GAAA.

A partir da Fig. 1 é possível verificar que as sondas de ligação são detectáveis nas pistas 6, 7, 9, 10 e 12.

Tal como se mostra na Fig. 1, os extractos proteicos dos lisogénios de λΙ.28-8 deram origem a bandas desviadas (pistas 6 e 7), cujo aparecimento foi inibido por excesso de ADN do oligómero Cl não marcado mas não pela mesma quantidade do oligómero C5A (pistas 8 e 9).

Em contraste com as proteínas derivadas de ÀL28-8, as que foram preparadas a partir do lisogénio derivado de λ6 induzido não deram origem a essas bandas desviadas (pistas 2 a 5) . Pode-se verificar que as bandas modificadas são muito semelhantes às do IRF-1 natural de células de rato (pistas 10 e 12) . Estas diferenças que existem nos dois conjuntos de bandas desviadas é considerado como uma consequência das diferentes quantidades de proteína ligada à sonda de ADN.

Além disso, verificou-se que as bandas desviadas foram detectadas apenas com as proteínas induzidas por IPTG das células Y1089 transfectadas com ÀL28-8.

(ii)Análise do rasto de ADNase

Efectuou-se uma análise de rasto a fim de verificar as propriedades de ligação da proteína codificada por ADN de ÀL28-8 a um ADN que codifica para a região a montante do gene do IFN-β.

A proteína codificada pelo ADN de ÀL28-8 foi extraída do lisogénio induzido e parcialmente purificada por cromatografia em coluna tal como descrito acima e ensaiada para verificação das suas propriedades em relação a um ADN contendo a região a montante do gene do IFN-β.

Prepararam-se sondas de ADN sob a forma de fragmentos SalI-HindIII isolados a partir de p-125cat (contendo o tipo selvagem do gene de IFN-β) e de p-125DPcat (contendo um gene de IFN-β mutante) . 0 plasmídeo p-125cat foi construído como o p105cat (Fujita et al., 1987), excepto em que se utilizou o fragmento BamHI (-125)-TagI (+19) de pSE-125 (Fujita et al.,

Cell, Vol. 41, págs. 489-496, 1985). 0 plasmídeo p-125DPcat, contendo mutações pontuais no interior dos elementos reguladores do IFN-β, foi obtido por mutagénese dirigida de oligonucleótidos sintéticos em P-125cat, tal como descrito em Hatakeyama et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 83, págs. 9640-9654, 1986). Ambos os ADNs foram marcados no local HindIII por meio de (γ-³²Ρ[ΑΤΡ utilizando quinase T4.

Incubaram-se 4 fmol da sonda de ADN (actividade específica 3 000 cpm/fmol) na mistura reaccional de 20 μΐ contendo TrisHC1 25 mM a pH 7,9, MgCl₂ 6,25 mM, Kcl 50 mM, EDTA 1 mM, DTT o, 5 mM, 10% de glicerol e 2% de álcool polivinílico na presença ou na ausência de 280 μg de proteína purificada.

Na análise adicionaram-se 5xl0^_<1 unidades de ADNase I (Worthington) e incubou-se durante 1 min a 25°C.

A Fig.2 mostra auto-radiogramas dos fragmentos de ADN obtidos a partir de amostras obtidas realizando os procedimentos seguintes. No lado esquerdo da Fig. 2 encontra-se parte da sequência de ADN da sonda de IFN-β de tipo selvagem e do lado direito da Fig. 2 encontra-se parte da sequência de ADN da sonda de IFN-β mutante.

1. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi cindida por reacções de A+G (ver Methods in Enzymology, Vol. 65, págs. 499-560) - o resultado é apresentado na pista 1.

2. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi digerida parcialmente por ADNase I sem protecção - o resultado é apresentado na pista 2.

3.	A sonda	de	IFN-β de	tipo selvagem	foi feita	reagir com	a
	proteína	e	em seguida	digerida com	ADNase I -	o resultado	é
	apresentado	na pista	3 .
4 .	A sonda	de	IFN-β de	tipo selvagem	foi feita	reagir com	a
	proteína	na	presença	de um excesso	molar de	1000 vezes	de

oligómero Cl não marcado e em seguida digerida com ADNase I - o resultado é apresentado na pista 4.

5. A sonda de IFN-β mutante foi feita reagir com a proteína e em seguida digerida com ADNase I - o resultado é apresentado na pista 5.

6. A sonda de IFN-β mutante foi cindida por reacções A+G - o resultado é apresentado na pista 6.

Na Fig. 2 as regiões protegidas tal como são reveladas nas pistas 3 e 5 são indicadas respectivamente nas sequências apresentadas nos lados esquerdo e direito do auto-radiograma. Os motivos hexaméricos estão inscritos num rectângulo.

A partir dos resultados na Fig. regiões protegidas sendo esta a região obtido a partir das uso do oligómero

Verificou-se também, correspondem aos poder-se-á ver que as nucleótidos -100 a -64, que se células descobriu

Cl não proteína, que ocorre contém o motivo AAGTGA ser protegida pelo IRF-1

L929. A protecção foi anulada pelo marcado em excesso utilizando concentrações protecção preferencial na (-80 a -70).

(pista baixas região de que

Estes resultados indicam que a proteína possui uma alta afinidade para a região que contém o motivo AAGTGA e uma baixa afinidade para a região circundante.

segmento de gene de IFN-β mutante transporta mutações TG nas posições -106, -100, -73 e -67. Na comparação das pistas 5 e 2 sob as mesmas condições de análise, a protecção ganha pelas proteínas recombinantes parece restrita à região não mutada (pista 2) . Esta observação está em conformidade com a observação de que a introdução destas mutações tem como resultado uma drástica redução (20 vezes) da indutibilidade da transcrição por NDV em células L929 e que a ligação in vitro do IRF-1 ao gene IFN-β mutante era notável apenas na região não mutada.

Para além disso, a utilização do oligómero Cl revela que a proteína protege especificamente a região que contém as sequências oligoméricas. Esta protecção corresponde de forma idêntica à obtida por IRF-1 nativo derivado de células L929.

3. Análise de competição de ADN

Esta análise foi levada a efeito para se examinar a afinidade da proteína recombinante em relação a várias sequências de ADN incluindo algumas das sequências de ADN de regulação de transcrição conhecidas. Procedeu-se do seguinte modo:

Isolou-se o fragmento HindIII-SalI da sonda de IFN-β a partir de p-125 cat (ver Fujita et al·., 1987); este fragmento contém a sequência do gene de IFN-β humano de +19 a -125. O ADN foi marcado nas extremidades 3' terminais por preenchimento em ambas as extremidades com [a-³²P]dCTP utilizando o fragmento de Klenow.

A actividade específica da sonda de ADN era de 8 000 cpm/fmol.

As análises de retardação em gel foram levadas a efeito sob as condições acima descritas.

Na realização das análises de competição, o ADN foi feito reagir com a proteína na presença de diversas concentrações de ADNs em competição nas misturas de ligação tal como indicado na Fig. 3.

O nível de formação do complexo foi quantificado por análise densitométrica do auto-radiograma. A formação do complexo na ausência de ADN competidor foi tomada como 100%.

A estrutura dos ADNs competidores era a seguinte:

a) AP-1: um ADN sintético com a seguinte sequência:

5'CTAGA (TGACTCA) _SG 3'

3' T (ACTGAGT) ₆CCTAG 5'

b) TNF: 37 pb de ADN sintético que abrange desde +1162 a +2116 (ver Nadwin et al.,1985) do primeiro intrão de TNF-a;

c) H2-D^d de murino: 37 pb de ADN sintético que abrange o elemento IRS (-159 a -123) tal como descrito por Korber et al., 1988;

d) IFN-α humano: 4 6 pb de ADN sintético que correspondem ao Elemento de Resposta de virus, ver Ryals et al., 1985.

e) Sequências hexaméricas Cl, C2, C3, C4 e C5a.

As sequências Cl e C5a encontram-se descritas acima. As sequências C2, C3 e C4 são tal como publicado em Cell, 49, 352-367 (1987); representam as sequências

AAATGA	C2
AAGGGA	C3 e
AAAGGA	C4 respectivamente

f) A sequência do gene de IFN-β de +19 a -66.

Na Fig. 3 o painel do lado esquerdo mostra os resultados obtidos quando as repetições do hexâmero foram utilizadas como competidores. 0 painel do meio mostra os resultados quando os segmentos do gene de IFN humano foram utilizados como competidores e o painel do lado direito mostra os resultados correspondentes utilizando diversos segmentos de ADN tal como indicado dentro do painel.

A partir dos resultados apresentados na Fig. 3 ver-se-á que o aparecimento da banda desviada foi eliminado por competição pelas sequências hexaméricas pela ordem de eficiência Cl- C2C3- C4, mas não foi eliminado de forma significativa por competição por C5a.

Também se pode observar que os segmentos de ADN sintético que abrangem os elementos regulatórios de ambos os genes de IFN-αΙ humano e de H-2D^d de murino deram origem a uma actividade competitiva. Este facto é particularmente interessante uma vez que o segmento de ADN do gene de H-2D^d contém a chamada sequência de resposta IFN (IRS) que funciona como um intensificador quando as células respondem ao IFN (Sujita et al., 1987; Israel et al., 1986; Korber et al., 1988).

De facto, encontram-se em muitas das sequências promotoras dos genes indutiveis por IFN motivos sequenciais idênticos ou semelhantes a estes encontrados no gene de IFN-β em que os factores nucleares parecem ligar-se de modo específico (Korber et al., 1988; Lery et al., 1988).

Os resultados apresentados na Fig. 3 são aproximadamente semelhantes aos obtidos quando a análise é repetida sob condições idênticas utilizando proteína natural produzida a partir de células L929.

Estrutura do ADNc que codifica para IRF-I de murino

A sequência de ADN dos ADNs clonados foi determinada por um método didesoxi (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) ou pelo método normal Maxam-Gilbert (Maxam e Gilbert, 1980).

Isolou-se a inserção de ÀL28-8 em E. coli YI089 como se segue: preparou-se o ADN fágico por procedimentos normais e digeriu-se o ADN por EcoRI, em seguida isolou-se o ADNc cindido do ADN fágico e sequenciou-se pelo método didesoxi (Sequenase; United States Biochemical, Inc.). Verificou-se que o ADNc inserido em ÀL28-8 tinha 1,8 kb de comprimento. A análise de sequência nucleótidica revelou um grande quadro de leitura livre ligado em fase com o gene do β-galactósido.

Para seleccionar os clones que continham as inserções de ADNc maiores, sintetizou-se ADNc de cadeia dupla com ARN poli (A)⁺ derivado de células L929 e clonado no vector CDMB de acordo com o processo publicado de Aruffo e Seed (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84, pág. 8573, 1987) e Seed (Nature, Vol. 329, págs. 840-842, 1987).

Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos na estirpe de E. coli MC1061/p3 (de acordo com o processo de Aruffo e Seed; tal como descrito acima), submeteram-se os clones de ADNc a selecção utilizando a sonda de ADNc derivada de XL28-8 (marcado com ^j2P) sob condições pouco rígidas para hibridação de ADN-ADN (Kashima et al., Nature, Vol. 313, págs. 402-404, 1985) e seleccionou-se um clone pIRF-L para estudo posterior.

A inserção de ADNc de pIRF-L pretendida foi obtida por digestão com HindIII e Xbal e foi sequenciada pelos métodos descritos acima. A sequência é apresentada na fórmula IV e na Fig. 4.

Verificou-se que a sequência de ADNc de ÀL28-8 contém uma sequência idêntica na região de sobreposição com a excepção de que faltava um resíduo de A entre os nucleótidos 1773 e 1781.

As extremidades terminais 5' e 3' do ADNc derivado de λΙ>288 estão marcadas por flechas na Fig. 4. As sequências ATTTATTTA e ATTTA que possivelmente conferem instabilidade ao ARNm estão inscritas em rectângulos.

Tal como se verifica a partir da Fig. 4A, o ADNc de murino derivado do pIRF-L era mais longo em 198 pb e 2 0 pb do que o ADNc de ÀL28-8 nas regiões 5' e 3' respectivamente.

Por análise da sequência de ADN genómico que contém a região promotora deste gene verifica-se que no ADNc de pIRF-L faltam cerca de 30 pb do local de remate principal, ver abaixo, fórmula V e Fig. 7.

A sequência imediatamente a montante do primeiro codão ATG, GGACCATGC, concorda bem como a sequência de consenso de Kozak GCC^a _g GCATGG para o local de inicio de tradução.

Não se encontrou qualquer sequência ATG em concordância de quadro na sequência a montante da sequência ATG acima mencionada confirmando que esta é de facto o codão de início para o ARNm de IRF-I.

Tal como foi referido acima, não se detectou qualquer diferença na sequência de nucleótidos entre os ADNc' s de λΣ28-8 e pIRF-L dentro das regiões sobrepostas, excepto um nucleótido na região não codificadora 3' .

Verificou-se deste modo que o IRF-I de murino era constituído por 329 ácidos aminados com um P.M. calculado de 37,3 kD. Não se encontraram locais de N-glicosilação canónicos no interior da sequência.

Não se detectou qualquer homologia significativa com outras proteínas conhecidas por meio de busca na base de dados Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) e em sequências mais recentemente publicadas.

Uma análise da hidropatia registada em gráfico de acordo com Kyte e Doolittle, 1982, indica que a proteína no seu conjunto é altamente hidrofílica (Fig. 4B).

Por inspecção da sequência primária deduzida do IRF-I de murino detectaram-se as seguintes características:

A metade terminal amina que se prolonga até ao ácido aminado (a.a.) 140 é rica em lisina (Lys) e arginina (Arg). De facto, 31 do total de 39 resíduos Lys e Arg estão localizados

nesta região. No painel inferior da Fig. 4B representa-se um sumário diagramático da localização dos ácidos aminados básicos (Arg e Lys) (colunas ascendentes) e ácidos aminados acidicos (Asp e Glu) (colunas descendentes).

Como se apresenta na Fig. 4B, esta região mostra uma forte hidrofilicidade e é considerada como a região responsável em primeiro lugar pela ligação de IRF-I às sequências de ADN especificas.

Nestas circunstâncias, os motivos característicos para muitas proteínas que se ligam a ADN, tais como dedos de zinco e motivos de hélice-volta-hélice (Pabo e Sauer, 1984, Evans e Hollenberg, 1988) não foram detectáveis na proteína IRF-I.

Pelo contrário, o resto da molécula (isto é, a metade terminal carboxilo) apresenta uma abundância relativa de ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), serina (Ser) e treonina (Thr) . De 89 ácidos aminados (do a.a. 140 ao 329), 33 (17%) representam ácidos aminados acidicos e 36 (19%) representam Ser e Thr. É notável que se encontre um grupo de 5 ácidos aminados acidicos consecutivos nos a.a. 227 a 231. Com respeito a Ser e Thr, muitos aparentam formar aglomerados (região nos a.a. 153 a 156, 190 a 192, 206 a 208 e 220 a 222; aqui referidas como as regiões S-T) . As regiões S-T são representadas por pequenos rectângulos abertos no painel inferior da Fig. 4B.

Estrutura do ADNc que codifica para o IRF-I humano

Seguindo um procedimento semelhante ao descrito acima para o IRF-I de murino, clonou-se e sequenciou-se o ADNc de IRF-I humano.

Preparou-se um banco de ADNc humano por síntese de ADNc utilizando poli (A) ARN de uma linha de células T humana Jurkat. A síntese de ADN de cadeia dupla e a subsequente clonagem para o vector plasmídico CDM8 foram levadas a cabo de acordo com o processo de Aruffo e Seed (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84, págs. 8573-8577, 1987) e Seed (Nature, Vol. 329, págs. 840-842, 1987).

Introduziram-se os plasmídeos recombinantes numa estirpe de E. coli MC1061/p3 utilizando o procedimento de Aruffo e Seed tal como mencionado acima.

Procedeu-se a	uma	busca	dos	clones de	ADNc	que hibridam por
reacção	cruzada	com	ADNc	de	IRF-I de	rato	utilizando ADNc
(marcado	com 32P)	de	XL28-	-8 como sonda	sob	condições pouco

críticas para hibridação de ADN-ADN. As condições empregues foram exactamente como descritas por Kashima et al. (Nature, Vol. 313, págs. 402-404, 1985).

Dos clones positivos, seleccionou-se o clone pHIRF31 contendo a inserção de ADNc mais longa.

A sequência de ADNc pretendida do clone pHIRF31 foi isolada por digestão do ADN plasmídico por Xhol a após isolamento foi submetida a sequenciação pelos métodos descritos acima. A estrutura do gene de IRF-I humano é apresentada na fórmula II e na Fig. 8.

As sequências deduzidas para o IRF-I de murino e humano são apresentadas justapostas para comparação na Fig. 5.

Por análise do ADN humano verificou-se que este IRF-I é maia curto que o IRF-I de murino em quatro ácidos aminados.

Pode verificar-se a ocorrência de forte conservação das sequências de ácidos aminados entre as duas moléculas de IRF-I. Em particular pode ver-se que 133 de entre 145 ácidos aminados (95%) das metades terminais de amina são idênticos.

Tomada no seu conjunto, a observação anterior indica que o IRF-I é uma nova classe de proteína de ligação de ADN.

Também se deve notar que as sequências ATTTATTTA e ATTTA, encontradas em muitas citoquinas e ARNm's de proto-oncogenes, estão presentes no interior da região não traduzida 3' do ADNc de IRF-I de murino e, de forma idêntica, a sequência ATTTA encontra-se no interior da região correspondente ao ADNc de IRF-I humano. Crê-se que estas sequências desempenham um papel na regulação de pós-transcrição da expressão genética conferindo instabilidade ao ARNm (Shaw e Kamen, 1986; Caput et al., 1986).

plasmídeo pIRF-L foi transfectado para E. coli MC1061/p3, que foi depositado como E. coli MC1061/p3 (pIRF-L) na Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (ERI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken 305, Japão, sob os termos do Tratado de Budapeste em 19 de Agosto de 1988 sob o n°. FERM BP-2005.

O plasmídeo pIRE31 foi transfectado de forma semelhante para E. coli MCI061/p3 que foi depositado como E. coli MC1061/p3 (pIRF-31) na FRI sob os termos do Tratado de Budapeste em 19 de Agosto de 1988 sob o n°. FERM BP-2006.

Regulação do gene do IRF

1. Expressão do ARNm de IRF-I

Tendo em vista o facto de que o IRF-I manifesta afinidades com sequências de regulação de genes diferentes do gene do IFNβ e que se encontra deste modo envolvido na regulação de um conjunto de genes em diversos tipos de células, efectuou-se um exame da expressão do ARNm de IRF-I em células de rato derivadas de diversos tecidos e órgãos utilizando ADNc de murino como sonda. Para preparar esta sonda, utilizou-se ADN do fago M13 mplO (ver abaixo) contendo a cadeia de sentido directo do fragmento PstI do gene do IRF-I como matriz para sintetizar o ADN de sentido inverso marcado com ³²P, digeriu-se o produto por EcoRI e isolou-se a sonda de ADN tal como descrito por Fujita et al., (1985).

ARN total foi isolado pelo processo estabelecido de Aruffo e Seed, 1987.

Em seguida efectuou-se uma análise de mancha essencialmente como descrito por Thomas (1980), sendo a película de raios X exposta durante 3 dias, e os resultados são apresentados na Fig. 6A. As várias pistas representam os resultados de ensaios efectuados utilizando ARN integral de células dos seguintes tecidos:

Pista	1	cérebro
Pista	2	coração
Pista	3	fígado
Pista	4	pulmão
Pista	5	baço (não estimulado)
Pista	6	timo
Pista	7	rim
Pista	8	músculo
Pista	9	intestino
Pista	10	baço (estimulado)
Pista	11	Con A - baço estimulado

Para o ensaio em cada pista utilizaram-se 5 pg de ARN integral das células, excepto na pista 8, para a qual se utilizaram apenas 1,2 μς de ARN.

Pode verificar-se a partir da Fig. 6A que se detectou uma banda correspondente a cerca de 2.0 kb na maioria das amostras de ARN através desta análise de mancha apesar do nível de expressão do ARNm parecer baixo. É de notar que o nível de expressão de ARNm nos linfócitos derivados de baço foi aumentado drasticamente a seguir a estimulação por Con A (Pista

11).

Numa análise adicional induziram-se células L929 de rato por NDV tal como descrito anteriormente (Fujita et al., 1985) e extraiu-se o ARN citoplasmático, pelo processo de Aruffo e Seed, 1987, de três em três horas após a infecção.

Prepararam-se ADNs sonda a partir de várias sequências que se seguem e marcaram-se pela reacção de marcação de iniciador múltiplo (Amersham), nomeadamente (i) um fragmento EcoRI de 1,8 kb de ÀL28-8 (actividade específica 2x10^a cpm/μς);

(ii) um fragmento BamHI-BglII de 0,5 kb de um clone genómico de IFN-β (actividade específica 5x10^a οριη/μς) e (iii) um fragmento BamHI-PvuII de 2,0 kb de um clone contendo pseudogene de β-actina humana (actividade específica 5x10^a cpm/pg).

Os resultados são apresentados na Fig. 6B. Realizaram-se análises de mancha tal como descrito acima, utilizando o procedimento de Thomas (1980).

Em cada pista depositaram-se 10 pg do ARN citoplasmático. A película de raios X foi exposta durante 3 horas. Verificou-se por meio de análises densitométricas que o ARNm de IRF-I aumentou cerca de 25 vezes 9 a 12 horas após a infecção por NDV.

Se bem que o aumento de ARNm seja muito elevado, é também transitório, com um pico entre as 9 e as 12 horas e baixando cerca de 15 horas após a indução. A acumulação de ARNm precede a acumulação de ARNm de IFN-B; como se pode ver na Fig. 6B, a indução de ARNm de IRF-I pode ser observada 3 horas após a infecção de NDV enquanto que o ARNm de IFN-β só é detectável após 6 horas sob condições de análise de mancha idênticas para ambos os ARNs.

O promotor de IRF-I

Tal como demonstrado acima, a transcrição do gene de IRF-I é regulada por vários agentes tais como vírus e mitogenes.

Por análise de mancha de Southern do ADN cromossomal verificou-se que o gene de IRF-I pode ser emendado e não transformado em membros múltiplos no rato.

Submeteu-se um banco do fago λ contendo ADN de rato recémnascido a uma busca para seleccionar os clones que contêm a sequência promotora de IRF-I utilizando a mesma sonda de ADNc derivada de ÀL28-8 utilizada anteriormente. Identificaram-se quatro clones positivos, tendo-se verificado que todos eles contêm o mesmo ADN genómico e utilizou-se um deles, Xgl4-2, para análises adicionais. Sub-clonou-se um fragmento PstI no interior do local PstI de pUC19 para construir o vector P19IRFP.

Clonou-se em seguida o mesmo ADN no interior do local PstI de M13mpl0 e M13mpll, que foram utilizados para gerar ADN para análises de sequência.

A análise de sequência de nucleótidos do fragmento PstI dos clones referidos foi efectuada tal como descrito anteriormente. Identificaram-se locais de remate principal e secundário por análises de mapeação SI.

Na Fig. 7A apresenta-se a sequência determinada. Como se pode verificar, a sequência a jusante do ADN emparelha perfeitamente com a do ADNc derivado de pIRF-L.

A análise de nuclease SI indica a presença de dois locais de remate para o ARNm de IRF-I, estando o local principal cerca de 20 nucleótidos a montante do local secundário. Não se encontram sequências caixa TATA típicas presentes no interior da região a montante do gene. Em vista da abundância inusitada de sequência CpG, esta região constitui provavelmente uma ilha HTF (Bird, 1986) .

A região promotora contém duas caixas GC e uma caixa CAAT (ver Fig. 7A) ; as caixas referidas em primeiro lugar devem ligar Spl (Kadogan et al., 1986) e a última CP-1 ou CP-2 (Chodosh et al., 1988).

O fragmento PstI que contém as sequências promotoras foi em seguida ensaiado para determinação da sua reactividade em resposta a sinais extracelulares, por exemplo indutibilidade por vírus, do seguinte modo:

Construiu-se um gene quimérico no qual se justapôs um gene relator, nomeadamente um gene de acetiltransferase de cloranfenicol bacteriano (CAT), a jusante do segmento PstI. Esta construção foi feita através da amputação de um fragmento PstI de P19IRPF (ver acima) por BamHI e HindIII e da clonagem do fragmento resultante no interior do fragmento da estrutura BglII-HindIII de pA_:0cat₂ (Rosenthal et al., 1983) a fim de construir o vector pIRFcat.

Prepararam-se várias outras construções do seguinte modo:

Preparou-se o vector pIRFÁcat por digestão do fragmento BamHIHindlII derivado de pl9IRFP com HaelII cujo único local de reconhecimento se localiza a desde -30 até -35 do local de remate principal (Fig. 5A). Ligou-se o fragmento HaellI-HindIII com o fragmento de estrutura BglIII-HindIII de pAi₀cat₂ e o ADN sintético seguinte

5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3'

3'GATCTAAAGAAGCGC 5'

Deste modo tanto o vector pIRFcat como o pIRFhcat continham sequências até -320 e -48 respectivamente do local de remate principal.

O vector p-125cat contém a sequência promotora do gene IFNβ humano tal como descrito por Fujita et al., 1987.

O vector pSV2cat encontra-se descrito em Gorman et al·., Science, Vol. 221, págs. 551-553.

Como gene de referência utilizou-se pRSVgtp (ver Gorman et al., acima).

Os vários genes foram transfectados para células L929 de rato utilizando o método de fosfato de cálcio (Fujita et al., 1985). Transfectaram-se 5x10° células com 7,5 pg do plasmídeo de ensaio contendo o gene relator CAT e 2,5 pg de pRSVgtp. As células foram induzidas por NDV ou por indução falsa e em seguida foram submetidas à análise enzimática conforme descrito por Fujita et al., 1985.

Ao calcular a actividade relativa de CAT, a actividade de CAT das células induzidas falsamente transfectadas com pSV2cat foi tomada como 100%. Cada actividade de CAT foi normalizada pelo Ecogtp (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., Vol. 78, págs. 2072-2076) das amostras respectivas. As amostras em que o CAT se encontrava abaixo do nível de fundo foram marcadas

b.b. (below background).

Os resultados são apresentados na Fig. 7B.

Verifica-se que a transfecção do vector pIRFcat em L929 de rato deu origem à expressão de baixo nível de actividade de CAT. O nível de expressão de CAT foi intensificado quando as células transfectadas foram estimuladas por NDV. A supressão da sequência de 300 pb a jusante do gene IRF-I (pIRFÁcat) virtualmente aboliu as expressões tanto constitutiva como induzida do gene CAT. Este facto demonstra que a sequência promotora se encontra no interior da região de 300 pb a jusante e é indutível por vírus.

Construção de plasmideos de expressão

1. Digeriu-se ADN fágico do clone λΙ.28-8 por EcoRI e recolheu-se o ADNc da inserção. Os locais EcoRI do ADNc

foram alinhados por meio de polimerase de ADN T4 e em seguida foram ligados com ADNs adaptadores sintéticos possuindo as sequências pGATCCATTGTGCTGG e pCCAGCACAATG de acordo com Aruffo e Seed, 1987.

Após remoção dos ADNs sintéticos por centrifugação com um gradiente de 5 a 20% de acetato de potássio (Aruffo e Seed, 1987), ligou-se o ADNc de IRF-I com os ADNs adaptadores fixados a ambas as extremidades com ADN do vector CDMB cindido por BstXI (Seed, B, Nature, Vol. 329, págs. 840-842, 1987). Isolaram-se os plasmideos pIRF-S e pIRF-A contendo o ADNc de IRF-I na orientação de sentido directo e de sentido inverso com respeito ao promotor CMV respectivamente.

Cada ADN plasmidico foi transfectado quer com p-55cat quer com p55ClB (Fujita et al., 1987) em célula L929 e determinou-se o nível de expressão de CAT.

Os resultados são apresentados no Quadro 1 abaixo:

QUADRO 1

	Plasmideos transfectados	Indução por NDV	Actividade de CAT (% de conversão)
Exp. 1	pIRF-S p-55cat		< 1 %
pIRF-S P-55CIB	—	50 %
pIRF-A p-55cat		< 1 %
pIRF-A	—	< 1 %
Exp. 2	pIRF-S p-55CIB		1,7 %
p-IRF-S P-55CIB	+	3, 6 %
pIRF-A P-55CIB		< 0,1 %
p-IRF-A p-55CIB	+	< 0,1 %

A eficiência da transfecção do ADN varia em função do estado das células receptoras (neste caso células L929 de rat) . A eficiência foi muito mais baixa na Exp. 2 em comparação com a Exp. 1. Deste modo, o nível de expressão de CAT é relativamente mais baixo na Exp. 2.

Como se pode varificar no quadro anterior, apenas foi detectada actividade de CAT significativa em células transfectadas por p-55CIB e pIRF-S. Estes dados demonstram que o IRF-I se liga com as sequências AAGTGA repetidas (8 vezes) presentes a montante do gene CAT em p-55CIB e por isso promove a transcrição do gene CAT distai.

Os resultados mostram ainda que o nível de expressão de CAT é aumentado (mais de duas vezes) por infecção das células transfectadas com NDV (Quadro 1), demonstrando que é possível controlar a expressão dos genes por diversos estímulos tais como vírus.

2. Construiu-se do modo exposto seguidamente um plasmídeo de expressão para a produção de uma proteína constituído pelo domínio de ligação de ADN de IRF-I e pelo domínio de activação de transcrição da levedura GAL4:

Digeriu-se o plasmídeo pIRF-S por HindIII e PstI e isolouse a inserção do ADNc. Digeriu-se o ADNc por DralII e recuperou-se o fragmento HindIII-DralII (cerca de 500 pb) , tendo sido designado como fragmento A.

Digeriu-se o vector de expressão CDM8 por HindIII e Xbal e isolou-se o ADN estrutural, tendo sido designado como fragmento B.

Isolou-se o ADN que codifica para o domínio de activação de transcrição da levedura GAL4 a partir do plasmídeo pRB968 (Ma e Ptashne, 1987) como se segue:

Em primeiro lugar digeriu-se o ADN de pRB968 por HindIII e alinharam-se as extremidades por polimerase de ADN T4. Adicionou-se ADN ligante de Xbal sintético ao ADN e subsequentemente digeriu-se o ADN por PvuII e Xbal.

Recuperou-se o fragmento resultante de ADN PvuII-Xbal de cerca de 600 pb e designou-se como fragmento C.

Além disso, preparou-se um ADN sintético com a seguinte sequência:

(5')GTGTCGTCCAG(3') (3')GCACACAGCAGGTC(5') designado como fragmento D.

Construiu-se um vector de expressão pIRFGAL4 por ligação dos fragmentos A, B, C e D. Como plasmídeo de regulação construiu-se o plasmídeo pIRFÁGAL4 por ligação dos fragmentos A, B e C e de um ADN sintético com a seguinte sequência:

(5' ) GTGTCTGACAG(3') (3' )GCACACAGACTGTC(5' )

Uma vez que está presente um tripleto terminador, TGA, em concordância de quadro entre as sequências de IRF-I e GAL4 no plasmídeo pIRFÁ GAL4, na proteína expressa deve faltar o

domínio de activação GAL4.
A fim	de verificar as	propriedades funcionais	dos
factores	de transcrição	quiméricos codificados	pelo

plasmideo, co-transfectou-se cada um dos plasmideos pIRFGAL4 e pIRFÁGAL4 com p-55CIB em células e verificou-se se ocorria a expressão de CAT. Os resultados são apresentados no Quadro 2 que se segue:

QUADRO 2

Plasmideo transfectado	Actividade de CAT (% de conversão)
pIRF-S P-55CIB	2,0%
pIRF-A P-55CIB	< 0,2 %
pIRFGAL4 p-55CIB	1,4%
pIRFAGAL4 P-55CIB	< 0,2 %

Célula hospedeira, células L929 de rato. As células não foram induzidas por NDV.

Os resultados mostram que a expressão de um gene visado (tais como os genes que codificam para uma interleuquina, um interferão (α, β e γ) , um activador de plasminogénio, a eritropoietina, o factor de estimulação de colónias de granulócitos, a insulina, a hormona de crescimento humana ou a dismutase de superóxido (ou mutantes dos genes humanos)) pode ser aumentada por IRF-I.

Os genes visados como mencionado acima, tais como genes de interferão, por exemplo IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ómega, e de activadores de plasminigénio, por exemplo t-PA, prouroquinase ou uroquinase, etc., podem ser expressos mais eficientemente também por inclusão para esse fim de promotores fundidos com diversos comprimentos de sequências de reconhecimento para IRF-I, por exemplo AAGTGA.

s''

Por exemplo os genes visados podem ser introduzidos em várias células hospedeiras, juntamente com IRF-I intacto ou com genes de IRF-I quiméricos. Aumentando o comprimento do ADN de local de reconhecimento do IRF-I, por exemplo por aumento do número de repetições AAGTGA e o nível de expressão do factor de transcrição, pode-se alcançar um alto nível de expressão dos genes visados.

Por exemplo as sequências de repetição AAGTGA podem ser postas em contacto com um promotor apropriado tal como o promotor de IFN-β ou o promotor precoce de vírus SV4 0. Um gene visado, por exemplo um gene de t-PA ou um gene de IFNβ, pode ser ligado a jusante de um promotor como os referidos; a estrutura de um gene construído deste modo seria (AAGTGA) _x (Promotor) (gene visado, p. ex. gene do tPA) .

Este gene poderia então ser introduzido e amplificado em células CHO, por exemplo célula CHO DXBII (estirpe dhfr) (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 77, págs. 4216-4220, 1980).

Idealmente, tal como discutido acima, uma célula hospedeira será escolhida a partir de uma célula que não possui qualquer actividade de IRF-I endógena ou que não possui esta actividade a um nível substancial. O gene de IRF-I, de preferência com um promotor forte tal como um promotor CMV ou um promotor indutível tal como um promotor de um gene de metalotioneno, pode ser introduzido no interior das diversas células hospedeiras de um modo convencional.

O gene de IRF-I pode ser co-introduzido e amplificado juntamente com o gene visado. Em alternativa, o gene de

IRF-I e o gene visado podem ser introduzidos separadamente no interior da célula hospedeira.

Em células transfectadas conforme descrito, o IRF-I pode ser produzido quer constitutivamente (no caso por exemplo do promotor de CMV) quer de modo induzido (no caso por exemplo do promotor de metalotioneno é induzido por metais divalentes tais como zinco). 0 IRF-I expresso ligase às repetições AAGTGA e aumenta o gene visado distai, por exemplo o gene de t-PA ou o gene de IFN.

Esta expressão pode ser ainda aumentada por indução virai, por exemplo por NDV, tal como se pode ver no Quadro 1, Experiência 2. Esta indução aumenta a actividade do IRF-

I.

Sequência de ADNc de rato que apresenta hibridação cruzada com ADNc de IRF-I de murino da fórmula III

Preparou-se um banco de ADNc de rato pelo processo descrito acima. 0 ADNc foi sintetizado pelo processo normal utilizando o ARNm derivado de células de rato L929 e inseriu-se o ADNc no vector Xgtll pelo processo normal. 0 banco de Àgtll resultante foi em seguida submetido a uma busca para isolar os clones de ADNc cujas inserções apresentam hibridação cruzada com o ADNc de IRF-I de murino descrito acima, tal como se segue:

Incubaram-se filtros de nitrocelulose contendo ADNs de placas fágicas de acordo com as seguintes fases (1) em 3xSCC a 65°C durante 30 minutos, seguidos por (2) 60 minutos de incubação em 3xSSC contendo solução de Denhart (0,2% de albumina de soro de bovino, 0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona 25), seguidos de (3) uma fase de pré-hibridação constituída por uma incubação durante 12 horas a 65°C numa solução contendo NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, EDTA 10 mM, 0,1% de SDS, 50 μς/ιηΐ de ADN suporte de cadeia simples (por exemplo ADN de esperma de salmão) e solução de Denhart e (4) repetiu-se a incubação da fase 3 mas incluindo ADNc de IRF-I de murino marcado com ³²P como sonda. Esta sonda de ADNc foi preparada sob a forma da inserção cindidapor EcoRI de kL28-8 e foi traduzida pelo sistema de marcação Multiprime (ver acima). A incubação foi efectuada a 65°C durante 1\2 horas.

Os filtros foram em seguida lavados, enxaguados brevemente em solução de 2xSCC e em seguida lavados em solução de 3xSCC contendo 0,1% de SDS durante 30 minutos a 65°C. Este procedimento foi repetido por duas vezes.

Seleccionou-se um dos clones positivos designado por PHH-45 e verificou-se que continha ADNc que cobria apenas uma parte da sequência de codificação para um IRF.

A inserção de ADNc em PHH-45 foi por conseguinte isolada e utilizada para seleccionar clones contendo inserções maiores tal como descrito acima para a preparação de pIRF-L sob o título Estrutura do ADNc que codifica para o IRF-I de murino.

Dos clones positivos identificados, seleccionou-se o que é designado por pIRF2-5 e caracterizou-se utilizando o processo anteriormente descrito para IRF-I de murino. A sequência

completa de ADNc que híbrida é apresentada na fórmula Iva e a sequência de ácidos aminados da proteína de IRF correspondente é apresentada na fórmula VIII.

Transfectou-se o plasmideo pIRF 2-5 em E. coli MC 1061/p3, o qual foi depositado como E. coli no FRI nos termos do Tratado de Budapeste em 22 de Novembro de 1988 sob o n°. FERM BP-2157.

ADNc do genoma de levedura que hibrida com uma sequência de

ADNc de IRF-I humano

Preparou-se ADN de levedura pelo processo normal e digeriuse com EcoRI. Depositaram-se 5 μς do ADN digerido em gel de agarose a 0,8% e submeteram-se a electroforese e a análise de mancha de ADN por processos normais.

Tratou-se o filtro com as manchas exactamente como descrito

no exemplo	precedente para isolamento	do	ADN	de	rato que
hibrida	com	IRF-I de murino excepto no que	se	segue
Na fase	(3)	, a temperatura de incubação foi	de 55	°c	e na fase
(4) a	incubação foi também efectuada	a	55°C	e	a sonda
radioactiva	foi o ADNc de IRF-I humano	isolado	a	partir de

pHIRF31 por digestão do plasmideo com Xhol, sendo esta sonda marcada conforme descrito no exemplo anterior para o IRF-I de murino. O filtro foi lavado a 55°C em 2xSSC. Os clones positivos'foram identificados por auto-radiografia (ver Fig.9).

Referências

Abreu S.L., Bancroft F.C., and Stewart II E.W. (1979).

Interferon priming.

J. Biol. Chem. 254, 4.14-418.

Aruffo A., and Seed B. (1987). Molecular cloning of a cDNA by a high-efficiency COS cell expression system.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 8573-8577.

Bird A.P. (1986) . CpG-rich islands and the function of DNA methylation.

Nature 321, 209-213.

Caput D., Beutler B., Hartog K., Thayer R., Brown-Schimer

S., and Cerami A. (1986). Identification of a common nucleotide sequence in the 3' untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators.

Proc. Natl. Acad. Sei USA 83, 1670-1674.

Cavalieri R.L., Havell E.Z., Vilcek J., and Pestka S. (1977). Induction and decay of human fibroblast interferon mRNA.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 4415-4419.

Chodosh L.A., Baldwin A.S., Carthew R.W., and Sharp P.A. (1988). Human CCAAT-binding proteins have heterologous subunits.

Cell 53, 11-24.

Dinter H., Hauser H., Mayr U., Lammers R., Bruns. W., Gross

G., and Collins J. (1983). Human interferon-beta and co-induced genes: molecular studies. In the biology of the Interferon -System 1983, E. .......... ....... ..............

De Maeyer and H. Schellekens, eds. (Amsterdam: Elsevier Science Publishers), 33-34.

Dinter H., and Hauser H. (1987). Cooperative interaction of multiple DNA elements in the human interferon-β promoter.

Eur. J. Biochem. 166, 103-109.

Evans R.M., and Hollenberg S.M. (1988). Zinc Fingers: Gilt by association.

Cell 52, 1-3.

Fujita T., Saito S., and Kohno S. (1979). Priming increases the amount of interferon mRNA in poly(rl):poly(rC)-treated L cells.

J.Gen. Viol. 45, 301-308.

Fujita T., Ohno S., Yasumitsu H., and Taniguchi T. (1985). Delimination and properties of DNA sequences required for the regulated expression of human interferon-β gene

Cell 41, 489-496.

Fujita T., Shibuya H., Hotta H., Yamanishi K., and Taniguchi T. (1987). Interfero-β gene regulation: Tandemly repeated sequences of a synthetic 6 bp oligomer function as a virus-inducible enhancer.

Cell 49, 357-367.

Galabru J., and Hovanessian A.G. (1985) . Two interferon-β indeced proteins are involved in the protein kinase complex dependent on double-stranded RNA.

Cell 43, 685-694.

Goodbourn S., Zinn K., and Maniatis T. (1985). Human βinterferon gene expression is regulated by an inducible enhancer element.

Cell 41, 509-520

Huynh T.V., Young R.A., and Davis R.W. (1985). Constructing and screening cDNA libraries in XgtlO and λΐΐ. In DNA cloning-A Practical-.Approach, Volume 1, D.M. Glover, ed.

(Oxford: IRL Press), pp. 49-78.

Israel A., Kimura A., Fournier A., Fellous M., and Kourilsky P. (1986). Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.

Nature 322, 743-746.

Kadonaga J.T., Jones K.A., and Tjian R. (1986). Promoterspecific activation of RNA polymerase II transcription by Sp 1. Trends Biochem. Sei. 11, 20-23.

Kakidani H., and Ptasnne M. (1986) . GAL4 activates gene expression in mammalian cells.

Cell 52, 161-167.

Keller A.D., and Maniatis T. (1988). Identification of an inducible factor that binds to a positive regulatory element of the human β-interferon gene.

Proc. Natl. Acad. Sei USA 85, 3309-3313.

Kohase M., May L.T., Taram I., Vilcek J., and Sehgal P.B. (1987). A cytokine network in human diploid fibroblasts: interactions of beta interferons, tumor necrosis factor, platelet-derived growth factor and interleukin-1. Mol.

Cell. Biol. 7, 272-280.

Korber B., Mermod N., Hood L., and Stroynowski I. (1988). Regulation of gene expression by interferons: Control of H-2 Promoter responses.

Science 239, 1302-1306.

Kozak M. (1987). An Analysis of. 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.

Nucl. Acids Res. 15, 8125-8143.

Krebs E., Eisenman R., Kuenzel E., Litchfield D., Lozeman

F., Liischer B., and Sommercorn J. (1988). Casein Kinase II as a potentially important enzyme concerned with signal transduction. In the Molecular Biology of Signal Transduction (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) Abstract p.35.............

Kuhl D., de la Fuente J., Chaturvedi M., Parimoo S., Ryals J., Mayer F., and Weissmann C. (1987).

Reversible silencing of enhancers by sequences derived from the human IFN-α promoter.

Cell 50, 1057-1069.

Kyte J., and Doolittle R.F. (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.

J. Mol. Biol. 157, 105-132.

Levy D.E., Kessler D.S., Pine R., Reich N., and Darnell J.E. (1988). Interferon-induced nuclear factors that bind a snared promoter element correlate with positive and negative transcriptional control.

Genes and Development 2, 383-393.

Ma J., and Ptashne M. (1987). The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognised by GAL80.

Cell 50, 137-142.

Maxam A., and Gilbert W. (1980). Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavages.

Meth. Enzym. 65, 499-560.

Moore R.N., Larsen H.S., Horohov D.W., and Rouse B.T. (1984) . Endogenous regulation of macrophase proliferative expansion by colony-stimulation-factor-induced interferon. Science 223, 178-180.

Nedwin G., Naylor S., Sakaguchi A., Smith D., JarrettNedsin J., Pennica D., Goeddel D., and Gray P. (1985). Human Iymphotoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homology and chromosomal localisation.

Nucl. Acids. Res. 13, 6361-6373.

Nir U., Cohen B., Chen L., and Revel M. (1984) . A human IFN-βΙ gene deleted of promoter sequences upstream from the TATA box is controlled post-transcriptionally by dsRNA.

Nucl. Acids Res. 12, 6979-6993.

Ohno S., and Taniguchi T. (1983) . The ' 5'-flanking sequence of human interferon-β gene is responsible for virai induction of transcription.

Nucl. Acids Res. 11, 5403-5412.

Onozaki K., Urawa H., Tamatani T., Iwamura Y-, Hashimoto

T., Baba T., Suzuki H., Yamada M., Yamamoto S., Oppenheim J.J., and Matsushima K. (1988). Synergistic interactions of

interleukin 1, interferon-β and tumor necrosis factor in terminally differentiating a mouse myeloid leukemic cell line (MI).

J. Immunol. 140, 112-119.

Pabo C.O., and Sauer R.T. (1984). Protein-DNA recognition. Ann. Rev. Biochem. 53, 293-321.

Raji N.B.K., and Pitha P.M. (1981). An analysis of interferon mRNA in human fibroblast cells induced to produce interferon.

Proc. Natl. Acad. Sei USA 78, 7426-7430.

Raji N.B.K., and Pitha P.M. (1983). Two leveis of regulation of β-interferon gene expression in human cells.

Proc. Natl. Acad. Sei USA 80, 3923-3927.

Resnitzky D., Yarden A., Zipori D., and Kimchi A. (1986). Autocrine β-related interferon controls c-myc suppression and growth arrest during hematopoietic cell differentiation.

Cel 46, 31-40.

Rosenthal N., Kress M., Gruss P., and Khoury G. (1983). BK virai enhancer element and a human cellular homolog.

Science 222, 749-755.

Ryals J., Dieks P., Ragg H., and Weissmann C. (1985). A 46nucleotide promoter segment from an INF-α gene renders an unrelated promoter inducible by virus.

Cell 41, 497-507.

Shaw G., and Kamen R. (1986) . A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation.

Cell 4_6, 659-667.

Singh H., LeBowitz J.H., Baldwin Jr. A.S., and Sharp P.A. (1988). Molecular cloning of an enhancer binding protein: Isolation by screening of an expression library with a recognition site DNA.

Cell 52, 415-423.

Sugita K., Miyazaki J.I.,

Appella E.,

Interferons increase

transcription and Ozato K.

(1987) .

a major histocompatibility class I gene via a 5' interferon consensus sequence.

Mol. Cell Biol 7, 2625-2630.

Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., and Hamuro J. (1983). Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2.

Nature 302, 305-310.

Taniguchi T. (1988) . regulation of cytokine gene expression.

Ann. Rev. Immunol. 6, 439-464.

Thomas P.S. (1980). Hybridisation of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5201-5205.

Tiwari R.J., Kusari J., and Sen G.C. (1987). Functional equivalents of interferon-mediated signals needed for induction of a mRNA can be generated by double-stranded RNA and growth factors.

EMBO J. 6, 3373-3378.

Warren M.K., and Ralf P. (1986). Macrophage growth factor CSF-I stimulates human monocyte production of interferon, tumor necrosis factor and colony stimulating activity.

J. Immunol. 137, 2281-2285.

Webster N., Jin J.R., Green S., Hollis L., and Chambon P. (1988) . The yeast UAGs is a transcriptional enhancer in human HeLa cells in the presence of the GAL4 trans-activator.

Cell 52, - 169-178. · ........

Weissmann C., and Weber H. 81986). The interferon genes. Proc. Natl. Acid Res. Mol. Biol., 33, 251-300.

Young R.A., and Davis R.W. (1983) . Yeast RNA polymerase II genes: Isolation with antibody probes.

Science 222, 778-782.

Zinn K., Dimaio D., and Maniatis T. (1983). Identification of two distinct regulatory regions adjacent to the human βinterferon gene.

Cell 34, 865-879.

Zullo J.N., Cochan B.H., Huang A.S., and Stiles C.D. (1985). Platelet-derived growth factor and doublestranded ribonucleic acids and stimulate expression of the same genes in 3T3 cells.

Cell 43, 793-800.

Lisboa, 4 de Maio de 1995.

FIG .1

FIG. 2

LICACAO RELATIVA IV.)

FIG. 3

COMPETIDOR (excesso molar em número de vezes)

FIG .iA

Página a

GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGâACCGAACCGAACCGAACCGGGCC

GAGTTC-CGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG

CTTCG7GCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC

TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA

?^L28-8 „ 1 AGCCACC

1 Me t ATG

Pro CCA

Ile ATC

Thr ACT

Arg CGA

Me t ATG

Arg CGG

Me t ATG

A r g Pro A GA CCC

Trp TGG

Leu CTA

Glu GAG

Met ATG

Gin CAG

Ile ATT

Asn AAT

Ser TCC

Asn AAC

20 Gin CAA

Ile ATC

Pro CCA

Glv GGG

Leu I1e C73 ATG

Trp TGG

í 1 e A TC

Asn A AT

Lys A A. A

Glu GAA

Glu GAG

Me t ATG

Ile ATC

Phe TTC

Gin CAG

Ile ATT

Pro CCA

Τ C O TGG

4C Lys :-:ís A A. C .*ά C

Ala GCT

Λ '.a GCT

Lys AAG

His CAC

Gly GGC

Tr p TGG

Asp GAC

Ile ATC

Asn AAC

Lys AAG

Asp GAT

Al a GCC

Cys TGT

Leu Phe C7G TTC

Arg CGG

Sc r AGC

Trp TGG

Ala GCC

60 Ile ATT

HÍS CAC

Thr ACA

Gly GGC

Arg CGA

Tyr TAC

Lys AAA

Ala GCA

Gly GGA

Gíj Lys GA A AAA

Glu GAG

l'to CCA

Asp GAT

Pro CCC

Lys AAG

Thr ACA

Trp TGG

Lvs AAG

Ala GCA

80 Asn AAC

Phe TTC

Arg CGT

cys TGT

Ala ?le: GGG ATG

Asn AAC

S i c TU.C

Leu CTG

Pro CCA

Asp GAC

Ile ATC

Glu GAG

Glu GAA

val GTG

Lys AAG

Aso GAT

C-ln CAG

Ser AGT

ICO A : ; Asn AGG AAC

Lys A AG

G 1. y GGC

Ser AGC

Ser TCT

Ala C-CT

Val GTG

Arg CCG

Val GTG

Ty r TAC

Arg CGG

Met ATG

Leu CTG

Pro CCA

Pr: Leu cc: CTG

Th c ACC

Arg AGG

Asn AAC

Gin CAG

120 Arg AGG

Lys AAA

Glu GAG

Arg AGA

Lys AAG

Ser TCC

Lys AAG

Ser TCC

Ser AGC

A r ç A S p CGA GAx_

Thr ACT

Ly Λ AG

Ser AGC

Lys AAA

Thr ACC

Lys AAG

Arg AGG

Lys AAG

Leu CTG

140 cys TGT

ciy GGA

Asp G<h í

Val GTT

Ser ? r c ag: ccc

Asp GAC

Tln ACT

Phe TTC

Se r TCT

Asp GAT

Gly GGA

Leu CTC

Ser AGC

Se r AGC

Ser TCT

Thr ACC

Leu CTA

FIG. 4 A

Página b

160

Pro

Asp

Asp

His

Ser

Ser

Tyr

Thr

Thr

Gin

Gly

Tyr

Leu

Gly

Gin

677

CCT

GAT

GAC

CAC

AGC

AGT

TAC

ACC

ACT

CAG

GGC

TAC

CTG

GGT

CAG

180

Asp

Leu

Asp

Met

Glu

Arg

Asp

Ile

Thr

Pro

Ala

Leu

Ser

Pro

Cys

722

GAC

TTG

GAT

ATG

GAA

AGG

GAC

ATA

ACT

CCA

GCA

CTG

TCA

CCG

TGT

200

Vai

Vai

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

Glu

Trp

His

Me t

Gin

Met

Asp

Ile

767

GTC

GTC

AGC

AGC

AGT

CTC

TCT

GAG

TGG

CAT

ATG

CAG

ATG

GAC

ATT

I le

Pro

Asp

Ser

Th r

^h c

Asp

Leu

Tyr

Asn

Leu

Gin

Vai

Ser

Pro

812

ATA

CCA

GAT

AGC

ACC

ACT

GAT

CTG

TAT

AAC

CTA

CAG

GTG

TCA

CCC

220

Met

? r o

Se r

Th r

Ser

G1 u

Ala

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Glu

Gly

S57

ATG

CCT

TCC

ACC

TCC

GA A

GCC

GCA

ACA

GAC

GAG

GAT

GAG

GAA

GGG

2 40

Lys

lie

Ala

Glu

Asp

Leu

Met

Lys

Leu

Phe

Glu

Gin

Ser

Glu

Trp

902

AAG

ATA

GCC

GAA

GAC

CTT

ATG

AAG

CTC

TTT

GAA

CAG

TCT

GAG

TGG

260

Gin

Pro

Thr

His

Ile

Asp

Gly

Lys

Gly

Tyr

Leu

Leu

Asn

Glu

Pro

947

CAG

CCG

ACA

CAC

A TC

GAT

GCC

AAG

GGA

TAC

TTG

CTC

AAT

GAG

CCA

Gly

Thr

Gin

Le u

C o r

C o r

Vai

Tyr

Gly

Asp

Phe

Ser

Cys

Lys

Glu

992

GGG

ACC

CAG

CTC

TCT

TCT

GTC

TAT

GGA

GAC

TTC

AGC

TGC

AAA

GAG

280

Glu

Pro

G1 u

Ile

Asp

Ser

Pro

Arg

Gly

Aso

Ile

Gly

Ile

Gly

Ile

1037

GAA

CCA

GAG

ATT

GAC

AGC

CCT

CGA

GGG

GAC

ATT

GGG

ATA

GGC

ATA

300

Gin

His

Vai

Phe

Th r

Glu

Me t

Lys

Asn

Met

Asp

Ser

I le

Met

Trp

1082

CA A

CAT

GTC

TTC

ACG

GAG

ATG

AAG

AAT

ATG

GAC

TCC

A TC

ATG

TGG

320

Me t

ASO

Ser

Leu

Leu

Gly

Asn

Ser

Vai

Ar g

Leu

Pro

Pro

Ser

Ile

112 7

ATG

GAC

AGC

CTG

CTG

GG<.

AAC

TCT

GTG

AGG

CTG

CCG

CCC

TCT

ATT

329

Gin

Ala

Ile

Pro

Cys

Ala

Pro.

.1172 CAG GCC ATT-CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC

2 2 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC

81 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC

FIG.4A

Pcgina c

4 0 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA

139 9 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT

53 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG

157 6 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT

3 5 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA

9 4 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG

5 3 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT

1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCjATTTATTTÃfrA

71 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCC AG

3 0 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTC7TGACTATCTATTAGAAACGCCAC

8 9 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT

04 8 TTTTATAAA4ÃTTTÃÍAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2 082

FÍG.tB

20.00

60.00

100.00

3.50---140.00 180.00 2 2 0.00 260.00 300 00 | 160.00 | 200.00 | 240,00 j 230.00 | 320.00

-2.50240.00 ),h ujiniiim

280.00

320.00

300.00

120.00

200.00

DIMENSÃO DA CÉLULA:19

Índice de hidropatia

-0.50---140.00 180.00

FIG. 5

RATO	1 2 5 50 MPITRMRMRPWLEMQINSNQIPGLIWINKEEMIFQIPWKHAAKHGWDINK
HOMEM	MPITWMRMRPWLEMQINSNQIPGLIWINKEEMILEIPWKHAAKHGWDINK

75100

DACLFRSWAIHTGRYKAGEKEPDPKTWKANFRCAMNSLPDIEEVKDQSRN

DACLFRSWAIHTGRYKAGEKEPDPKTWKANFRCAMNSLPDIEEVKDQSRN

125150

KGSSAVRVYRMLPPLTRNQRKERKSKSSRDTKSKTKRKLCGDVSPDTFSD

KGSSAVRVYRHLPPLTKNQRKERKSKSSRDAKSKAKRLSCGDSSPDTFSD

175200

GLSSSTLPDDHSSYTTQGYLGQDLDMERDITPALSPCWSSSLSEWHMQM

GLSSSTLPDDHSSYTVPGYM-QDLEVEQALTPALSPCAVSSTLPDWHIPV

225250

DIIPDSTTDLYNLQVSPMPSTSEAATDEDEEGKIAEDLMKLFEQSEWPQT

EVVPDSTSDLYNFQVSPMPSISEATTDEDEEGKLPEDIMKLLEQSEWQPT

275300

HIDGKGYLLNEPGTQLSSVYGDFSCKEEPEIDSPRGDIGIGIQHVFTEMK

NVDGKGYLLNEPGVQPTSVYGDFSCKEEPEIDSPGGDIGLSLQRVFTDLK

.................... 329'

NMDS IMWMDSLLGNSVRLP.PS IQAIPCAP

NMDAT-WLDSLLTP-VRLP-SIQAIPCAP

FIG. 6

- A c t i η

FIG. 7A

PstI CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299

Co/xo GC7 Caixa GC2 caggggagtggagtggagcaa£gggcgg)gcccgcggtagcccqggggcgg;tggcgcgg

-251 gcccgagggggtggggagcacagctgccttgtacttccccttcgccgcttagctctac

-193

Caixa CAA T AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTQGGCCAAT,GGGCGCGCAGGAGCG -135

Local de remate secundário

I 11 GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77-21

Local de remate princ ipol ' ___plRF-L

IIII

TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19+1

TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG

CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97

CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155

PstI

TCGCTCCTGCAG...

+ 213

+225 ......- .............. -

L/ O 7 4. w c ;

pIRrcat pIR.-Acat

F/G.7B

Ca í + 22 5

Indução porndv

Actividade rela t~i va de CAT (°/o)

I ;oo

I í

67.6

2.2

6.4

b. b.

b. b.

b. b.

0.3 i

FIG. 8

PÓgina b

510 520 530 540 550

AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

GlyTyrMetGlnAspLeuGluValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSer

560 570 560 590600

CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA ProCysAlaValSerSerThrLeuProAspTrpHisIleProValGlu

610 620 630 640650

GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

ValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnValSer ProMet

660 670 630 690700

GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC P roSerIleSe rGluAlaTh rTb rAspGluAspGluGluGlyLysLeu Pro

710 720 730 740750

CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

GluAspIleMe tGysLeuLcLGluGlnSerGluTrpGlnProThr Asn

760 770 780 790800

GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

ValAspGlyLysGlyTyrLeuLeuAsnGluProGlyVàlGlnProThrSer

810 820 830 840850

TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

ValTyrGlyAspPheSerCysLysGluGluProGluIleAspSerProGly

860 870 880 890900

GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

GlyAspIleGlvLeuSerLeuG LnAr gValPheTh rAspLeuLysAsn

910 920 930 940950

ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

Me tAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArgLeuProSer

960970

CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCGTAGCAGGGCCCCTGGGCCCCTCTTA

IleGlnAlalleProCysAlaPro'* *

TTCCTCTAGGCAAGCAGGACCTC-GCATCATGGTGGATATGGTGCAGAGAA

GCTGGACTTCTGTGGGCCCCTCAACAGCCAAGTGTGACCCCACTGCCAAG TGGGGATGGGCCTCCCTCCTTGGGTCATTGACCTCTCAGGGCCTGGCAGG CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCTGGGA

AGATGAGGTTCTGAGACCAGTGTATCAGGTCAGGGACTTGGACAGGAGTC

FIG.8

Pagina a

CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC

CGGCCGTGCCCGGCGGCCTTAAGAACCAGGCAACCACTGCCTTCTTCCCT

CTTCCACTCGGAGTCGCGCTTCGCGCGCCCTCACTGCAGCCCCTGCGTCG

CCGGGACCCTCGCGCGCGACCAGCCGAATCGCTCCTGCAGCAGAGCCAAC .20 30 4050

ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMetGlnlleAsn

70 80 90100

TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAÁGAGGAGATGATCT

SerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpIleAsnLysGluGluMetlleLeu

110 120 130 140150

TGGAGATCCCATPGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

GluUeProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspIleAsnLys

160 170 180 190200

GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

AspAlaCysLeuPheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAla

210 220 230 240250

AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

GlyGluLysGluProAspProLysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAla

260 270 280 290300

CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

Me tAsnSerLeuProAspIleGluGluValLysAspGlnSerArgAsn

310 320 340 340350

AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA LysGlySerSerAlaValArgValTyrArgMetLeuProProLeuThrLys

360 370 380 390400

GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

AsnGlnArgLysGluArgLysSer LysSerSer ArgAspAlaLysSerLys '410 420 430 440450

AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

AlaLysArgLysSerCysGlvAspSe rSe rPr oAspThrPheSerAsp

460 470 480 490500

GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC GlyLeuSerSerSerThrLeuProAspAapHisSerSerTyrThrValPro

Claims (7)

1. Processo para a preparação de uma molécula de ADN recombinante que contém a seguinte sequência nucleótídica

   Fórmula IIIa

   10 20 3040

   ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

   50 60 70 8090

   ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

   100 110 120130

   AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

   140 150 160 170180

   TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

   190 200 210220

   C AT AC AGGAAAG CAT CAAC CAGGAAT AGAT AAAC C AGAT C CAAAA

   230 240 250 260270

   ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

   280 290 300310

   AT T GAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

   320 330 340 350360

   TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

   370 380 390400

   AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC

   410 420 430 440450

   ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA ..... 460 470 ' 480 490'

   GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

   500 510 520 530540

   AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAAÇATCATAGTTGTAGGACAG

   550 560 570580

   TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

   590 600 610 620630

   CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

   640 650 660670

   GAC CAGCCAG T CAGCAT GAG T GAGC TCTACCCTCTACAGAT T TCT

   680 690 700 710720

   CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

   730 740 750760

   AGT GAT GAAGAGAAC C-C AGAGGGGAGAC C AC AC T GGAGGAAGAGG

   770 780 790 800810

   AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

   820 830 840850

   ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

   860 870 880 890900

   CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

   910 920 930940

   TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTC-CC

   950 960 970 980990

   CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

   1000 1010 10201030

   C GGGCCAG T G T CAT CAAGAAGACATCTGATAT CACCCAGGCCCGT

   1040 C-TCAAGAGCTGT ou um fragmento, ou uma variante degenerada da molécula ou do fragmento, que codifica para uma proteína que se liga à sequência oligomérica repetida AAGTGA e aos elementos de regulação a montante do gene de IRF-β humano, caracterizado por se isolarem sequências de ADN que codificam para uma proteína com as propriedades referidas a partir de uma origem eucariótica, como por exemplo de origem humana ou com origem em ratos, galinhas, rãs ou em leveduras, e se seleccionar por hibridação cruzada um clone positivo.
2. 2. Processo para a preparação de uma molécula de ADN recombinante que hibrida com a versão de sentido inverso da molécula definida de acordo com a reivindicação 1 e que codifica para uma proteína que se liga à sequência oligomérica repetida AAGTGA e aos elementos de regulação a montante do gene de IRF-β humano, caracterizado por se utilizar como matriz uma cadeia de sentido directo obtida pelo processo da reivindicação 1.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de ADN recombinante preparada conter sequências de flanco a montante e a jusante conforme a seguinte fórmula:

   Fórmula IVa

   TCTCAGGCAAGCCGGGGA

   CTAACTTTTAGTTTTGCTCCTGCGATTATTCAACTGACGGGCTTT

   C AT T T C CAT T T T AC AC AC C C TAACAACAC T C AC AC C T T G C G GGAT

   TGTATTGGTAGCGTGGAAAAAAAAAAAGCACATTGAGAGGGTACC

   10 20 3040

   ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

   50 60 70 8090

   ATAAAT T C CAATACGATACCAGGGC TAAAG T GGC TGAACAAGGAG

   100 110 120130

   AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

   140 150 160 170180

   TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

   190 200 210220

   CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

   230 240 250 260270

   ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

   280 290 300310

   ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

   320 330 340 350360

   TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

   370 380 390400

   AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC

   410 420 430 440450

   ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

   460 470 480490

   GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

   500 510 520 530540

   AAAAAT GAAG T G GAT AG T ACGGT G AAC AT C AT AG T T G T AGGAC AG

   550 560 570580

   TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

   590 600 610 620630

   CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

   640 650 660670

   GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

   680 690 700 710720

   CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

   730 740 750760

   AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

   770 780 790 800810

   AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

   820 830 840850

   ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

   860 870 880 890900

   CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGACCATAGCTGTCCGATGCCT

   910 920 930940

   TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

   950 960 970 980990

   CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

   1000 1010 10201030

   CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

   1040

   GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTTGTTGGGA

   TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGTATTATATTATTTTTT T T C T C Τ ATGATAC C T AT C T TAGACACAT C T AAGGGAGAAAC-C C T T GACGATAGATTATTGATTGCTGTGTCCAACTCCAGAGCTGGAGCT TCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATG CGTATCTCTAGAACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGACCTGCTGCGTTGCC TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG AG AAAAT GT GAAC TAGC T GGAAT T T T T T TAT T C T T GT GAATAT G T ACATAGGGCAGTACGAGCAATGTCGCGGGCTGCTTCTGCACCTTA TCTTGAAGCACTTACAATAGGCCTTCTTGTAATCTTGCTCTCCTT CACAGCACACTCGGCGACCCCTTCTGTGTCCACTACCCCACTACC CACCCCTCCCTCCTCAACCCCTCCATCCCGGTCCTCTATGCGCCC CTTCCCCCCAACCAATCCCATCACAACCTCTTACCTATCCTTTCC CTCCCAACCCCTTCTATCCCAGCCCACCACCTACCCCACTCCTCC CCAACTCCTCCATTCTAGCCCATTACCCACGCCTCTCTCCTCAGC CCAGCCTACCCCATCCCACCCTGTTCCTTTCCTCCAGTTTCCTCT CCTCAAAGGCAAGGCTCTACATCTTGGAGGAGGAGGAGGAGAAGA AAATGAGTTTCTTCACCGCTGTCCCATTTTAAGACTGCTTGAATA ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg TACAAAGGAAAACTGTCATGGAAATATTATGCAAATTCCCAGATC TGAAGACGGAAAATACTCTAATTCTAACCAGAGCAAGCTTTTTTA T T T T T T T AT ACAAGGG GAAT AT T T TAT T C AAG G TAAAAAAAT T C T AAATAAAATATAATTGT TTTTTATCTTTTCTACAGCAAATTTATA ATTTTAAGATTCCTTTTCCTGTTCATCAGCAGTTGTTATTACATC CCTTGTGGCACATTTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGAAAAAAAA ACTTTTATGAGCTCATGTAGCAATCAAATTATCCTGTGGATTGAT

   ΑΑΤΆΑΑΤ GAATAT G G T AT AT AG T T AAAGAT T T T ΑΑΑΑΑΑΆΑΑΑΑΑ
4. 4. Processo para a preparação de uma célula hospedeira transformada, caracterizado por se utilizar para a transformação uma molécula de ADN recombinante preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o gene ou o fragmento ou a sua variante degenerada definido na reivindicação 1 estar sob a regulação de um promotor constitutivo ou de um promotor indutivel.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula bacteriana ou uma célula de uma levedura ou uma célula de mamífero.
7. 7. Processo para a preparação de uma proteína com a estrutura definida pela sequência de ADN definida na reivindicação 1 ou na reivindicação 3, caracterizado por compreender uma fase de efectuar uma cultura de uma célula hospedeira preparada de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6 e se isolar a proteína expressa pela cultura.