DD299659A5 - Faktorregulierte genexpression - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Wirkung eines Interferon Regulatory Factor-1 * dadurch gekennzeichnet, dasz man Wirtszellen kultiviert, die durch einen Vektor transformiert sind, der ein Gen, das fuer ein Protein mit der Wirkung eines Interferon Regulatory Factor-1 codiert enthaelt, und das resultierende Protein isoliert.{DNA-Sequenz codiert Protein mit *}

Description

IFN-ß, ein Cytokin, das ursprünglich wegen seiner potenten nntiviralen Wirksamkeit identifiziert wurde, scheint auch eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellwachstums und der Zelldif ferenziorung zu spielen. In diesem Lusammenhang scheinen neben Viren und poly(rl):poly(rC), die die bekannten Induktoren des IFN-ß-Gens sind, auch viele Cytokine wie der koloniestimulierende Faktor-1 (CSF-1) (Moore u. a., 198<t; Warren und Ralf, 1986; Resnitzky u. a., 1986), der Tumornekrose-Faktor (TNF) (Onozaki u.a., 1988); der plättchenstömmlge Wachstumsfaktor (PDGF) (ZuIIo u.a., 1985) und die IFN (Kohase u.a., 1987) IFN-ß in bestimmten .!eilen zu induzieren, was vermuten läßt, daß sie ähnliche oder identische Signale in die Zielzellen übertragen können.

Es wurde auch gezeigt, daß die IFN-ß-Goninduktion durch Viren und poly(rl):poly(rC) auf der Transkriptionsobrno stattfindet (RajiundPitham 1983; OhnoundTaniguchi, 1983; Dinteru.a., 1983; Zinn u.a., 1983). So wurden cls-wirkende DNA-Sequenzen, die als induzierbare Verstärker fungieren, in der 5'-Flankenregion des Human-IFN-ß-Gens identifiziert (Fujita u.a., 1985,1987; Goodbourn u.a., 1985; Dinter und Hauser, 1987). Die induzierbare Verstärkerregion (d.h. -65 bis -105 in bezug auf die CAP-Stollo) enthält sich wiederholende Hexanucleotideinheiten, von denen einige tatsächlich in der induzierten Aktivierung der Transkription beider Multimerisierung wirken (Fujita u.a., 1987). In Säugetierzellen wie ζ. B. Maus-L929-Zellon und Human-Zellen wurden ein Faktor, IRF-1, der spezifisch an die IFN-ß-Regulationssequenzen bindet, sowie die funktionollen, sich wiederholenden Hexanucleotidsequenzen, (AAGTGA)₄, Identifiziert. Es wurde festgestellt, daß der IRF-1 eine wesentliche Rolle bei der virusinduzierten Aktivierung der IFN-ß-Gentranskription durch Wechselwirkung mit den identifizierten cls-Elementen spielt.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Wirkung eines Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), dadurch gekennzeichnet, dnß man Wirtszellen kultiviert, die durch einen Vektor transformiert sind, der ein Gen, das für ein Protein mit der Wirkung eines Interferon Regulatory Factor-1 codiert enthält, und das resultierende Protein isoliert.

Vorzugsweise das Gen, das für das Protein, das die Wirkung einer IRF-1 hat, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines induziblen Promotors ist, beispielsweise virusinduzierbar, z. B. durch mitogene Stimulierung z. B. mittels Concanavalin A, induzierbar.

Vorzugsweise codiert das Gen für das IRF-1 aktive Protein für oder ist hybridisierbar an das DNA-Molekül, das für Human-IRF-1 oder Maus-IRF-1 codiert.

Das Gen für das IRF-1 wirkende Protein, ist vorzugsweise eine, das für ein Protein codiert, das an die wiederholte Oligomersequenz AAGTGA und die „upstream"-Regulationselemente des Human-IFN-ß-Gens bindet.

Eine bevorzugte DNA-Sequenz (die für Human-IRF-1 codiert) ist durch ein Strukturgen gekennzeichnet, das die folgende Formel I

Formol I

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT

110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGG¹CTGGGACATCAACAAg

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 . 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 ' 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970 CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

oder eine degenerierte Variante davon.

Die DNA-Sequenz kann beispielsweise Jurch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstreanV'-Flankensequenzon wie in der folgenden Formol Il hat:

Formel Il

cgagccccgccgaaccgaggccacccggagccgtgcccagtccacgc cggccgtgcccggcggccttaagaaccaggcaaccactgccttcttccct cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg cqgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaac

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100

TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150

TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 620 630 640 ' 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970

catccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa gctggacttctgtgggcccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctccttgggtcattgacctctcagggcctggcagg ccagtgtctgggtttttcttgtggtgtaaagctggccctgcctcctggga agatgaggttctgagaccagtgtatcaggtcagggacttggacaggagtc agtgtctggctttttcctctgagcccagctgcctggagagggtctcgctg tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa cacc^atcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttggcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag

aggtgtacactaacatttcccccgagctrttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa atatgtacatttgtctttttataaaaagtaaaattgtt

oder eine degenerative Variante davon,

Eine weitere bevorzugte DNA-Sequenz (die für Maus-IRF-1 coaiort) ist durch ein Strukiurgen dor folgenden Formel III

gekennzeichnet:

Formel III

ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT

AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG

ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC

AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA

TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC

TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT

CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG

CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC

CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC

CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC

CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG

GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT

♦ CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT

GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC

GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG

CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA

TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT'GGA GAC

TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT

GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC

. ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGC CTG CCG CCC

TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

oder eine degenerierte Variante davon.

Eine derartige wie im vorhergehenden Absatz genannte DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel IV hat:

Formel IV

1 GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC

6 0 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG

119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC

178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG 227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA

272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA 317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC

3 62 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC. AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC*CGT

4 52 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG 4 97 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC 587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT 632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA 677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG 722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT 767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT 812 ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC 857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG 902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG 947 CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA 992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG

* 1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA 1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG

1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT 1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC 1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC 1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC 1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA 1399 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT 14 58 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 1635 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCATTTATTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082

oder eine degenerierte Variante davon.

Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, dio IRF-1-Aktivität besitzen, schließen DNA-Sequenzen

eukaryotlschen Ursprungs ein, und zwar nicht nur Human- und Maus-, sondorn auch Kücken·, Frosch- und Hefe-DNA-Soquonzen,die mit den DNA-Sequenzen des vorgenannten Human- oder Maus-IRF-1 (Flg.I bis IV) hybridisieren und die für ein Protein mit

IRF-1-Aktivität codieren. Eine derartige cDNA-Sequonz, das an die cDNA von Maus-IRF-1 nach der Definition In Fig.4A hybridisiert, wie Im Folgenden in Formel III a vorgestellt. Formel III n

10 20 30 40 ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60 70 80 90 ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 ' AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA·

140 150 160 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

OQO 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 380 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAÄAAAGAAGAGAGAGTT AAGCAC.

410 420 _ 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTÄGT AATGGA

460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 57D 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 · 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

^{770 780} 790 800 ain

agcatcgaaggcaagcagtacctcagcaacatggggacacggaac

820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 870 880 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCT.GGCCeCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGJCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGT

oder eine degenerierte Variante davon.

Diese DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstreanV'-Flankansequenzen wie in der folgenden Formel IVa hat.

Formel IVo

TCTCAGGCAAGCCGGGGA

ctaacttttagttttgctcctgcgattattcaactgacgggcttt catttccattttacacaccctaacaacactcacaccttgcgggat tgtattggtagcgtggaaaa.aaaaaaagcacattgagagggtacc

10 20 30 40 ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60 70 SO SO ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

140 150 160 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 2O CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

280 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 3SÖ 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC.

4IO 420 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

450 470 480 490 G:AAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 570 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

630 690 700 710 720 CCTGTGTCTTCrTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780" 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

80 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 870 880 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 930 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTT.GTTGGGA

TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGTATTATATTATTTTTT TTCTCTATGATACCTATCTTAGACACATCTAAGGGAGAAAGCCTT GACGATAGATTATTGATTGCTGT'GTCCAACTCCAGAGCTGGAGCT TCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATG CGTATCTCTAGAACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGAGGTGCfGCGTTGCC TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG AGAAAATGTGAACTAGCTGGAATTTTTTTATTCTTGTGAATATGT ACATAGGGCAGTACGAGCAATGTCGCGGGCTGCTTCTGCACCTTA TCTTGAAGCACTTACAATAGGCCTTCTTGTAATCTTGCTCTCCTT

CACAGCACACTCGGCGACCCCTTCTGTGTCCACTACCCCACTACC

CACCCCTCCCTCCTCAACCCCTCCATCCCGGTCCTCTATGCGCCC CTTCCCCCCAACCAATCCCATCACAACCTCTTACCTATCCTTTCC CTCCCAACCCCTTCTATCCCAGCCCACCACCTACCCCACTCCTCC

ccaactcctccattctagcccattacccacgcctctctcctcagc ccagcctaccccatcccaccctgttcctttcctccagtttcctct cctcaaaggcaaggctctacatcttggaggaggaggaggagaaga aaatgagtttcttcaccgctgtcccattttaagactgcttgaata ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg tacaaaggaaaactgtcatggaaatattatgcaaattcccagatc tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagctttttta tttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct

aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttata attttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatc ccttgtggcacattttttttttaattttgtaaaggtgaaaaaaaa acttttatgagctcatgtagcaatcaaattatcctgtggattgat aataaatgaatatggtatatagttaaagattttaaaaaaaaaaaa

oder eine degenerierte Variante davon.

Im Folgenden wird die Isolierung von cDNA-Molekülen aus Humanzellen und Mauszellen beschrieben, die für Human- und Maus-IRF-1 codieren, bzw. aus Mauszellen und Hefe, die an die cDNA von Maus-IRF-1 und Human-IRF-1 hybridisieren. Das recombinante DNA-Molekül kann auch eine Promotor- und Regulationssequenz wie in der folgenden Formel V enthalten:

Formel V

Pstl

GISCAiSAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299

GC Box 1 GC Box 2

CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCCGGGGCGGTGGCGCGG -251

GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC -193

CAAT Box

AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG -135

kleine CAP-Stelle

GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21

große CAP-Stelle plRF-L

I I I

TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1

TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG +39

CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG

. +97

CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155

Pstl

TCGCTCCTGCAG +213 +225

oder eine degenerierte Variante davon.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle, z. B. eine Bakterienzelle z. B. E.coli, oder eine Hefezelle ο Jer eine Säugetierzelle ζ. B. eine CHO-ZeIIe ode/ eine Mauszelle z. B. L929, die durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach der im Vorangegangenen erläuterten Bedeutung transformiert wurden. Idealerweise wird die Wirtszelle aus einer Zellinie ausgewählt, die keine oder im wesentlichen keine endogene IRF-I-Aktivität zeigt.

Das IRF-1-aktive Protein kann durch Kultivierung der transformierten Zelle und Isolierung des erzeugten Proteins auf

herkömmliche Weise hergestellt werden.

Die Wirtszellen werden geeigneterweise durch Behandlung in einer Art und Weise, die dem Promotor entspricht, der operabel an das für den IRF-I codierenden Gen gebunden ist, induziert, wie im Folgenden erläutert wird.

Ein bevorzugtes Protein mit einer IRF-I-Aktivität hat die folgende Formel Vl:

Formel Vl

Met Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu GIu Met Gin He

Asn Ser Asn Gin He Pro GIy Leu He Trp He Asn Lys GIu GIu Met

He Phe Gin He .Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His GIy Trp Asp He

Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala He His Thr GIy Arg

Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn

Phe Arg Cys AIa Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp

Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ssr Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu

Pro Pro Leu Thr Arg Asn Gin Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser

Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser

Pro Asp Thr Phe Ser Asp GIy Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp

His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met

GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser

Leu Ser GIu Trp His Met GIn Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr

Asp Leu Tyr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIu AIa

AIa Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys

Leu Phe GIu GIn Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp GIy Lys GIy

Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr GlN Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp

Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu He Asp Ser Pro Arg GIy Asp He

GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thi GIu Met Lys Asn Met Asp Ser

He Met Trp Met Asp Ser Leu Leu GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa Pro

Ein weiteres bevorzugtes Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Formel VII: Formel VII

MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet

GlnlleAsnSerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpHeAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspIleAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysA.TaClyGluLysGluProAspPro LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspIIeGIuG]uVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuProAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAspGluAspGluGluGlyLysLeuPro GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys • GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys LysGluGlu^roGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg LeuProSerIIeGInAIaIleProCysAlaPro

Noch ein weiteres bevorzugtes Protein, das durch die cDNA-Sequenz der Formel Ilia codiert wird, hat die folgende Formel VIII. Formel VIII

MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln

lleAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu

LysLysllePheGlnlleProTrpMetHisAlaAlaArgHisGly

TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPhoArgAsnTrpAlalle

HisThrGlyLysHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys

ThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsp

lleGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAla

PheArgValTyrArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys

LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHis

HeLysGlnGluProValGluSerSerLeuGlyLeuSerAsnGly

ValSerGlyPheSerProGluTyrAlaValLeuThrSerAlalle

LysAsnGluValAspSerThrValAsnllelleValValGlyGln

SorHisLeuAspSerAsnlleGluAspGlnGlulleValThrAsn

ProProAsplleCysGlnValValGluValThrThrGluSerAsp

AspGlnProValSerMetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSer

ProValSerSerTyrAlaGluSerGluThrThrAspSerValAla

SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg «

SerlleGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGlyThrArgAsn

ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsnLys

ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro

TyrAsnSerSerTrpProProPheThrAspLeuProLeuProAla

ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr

ArgAlaSerVallleLysLysThrSerAsplleThrGlnAlaArg

ValLysSerCys

Im Folgenden wird die molekulare Clonierung und Charakterisierung von Maus- und Human-cDNA, die für DNA-bindende Proteine, die die IRF-1 -Aktivität besitzen, codieren, beschi iiben.

Eine bemerkenswerte Sequenzerhaltung ist zwischen den Maus- und Human-IRF-1-Molekülen ersichtlich, wie sich aus der Analyse derclonierten cDNAs ergab. Weiterhin zeigt sich, daß die Expression des für IRF-1 codierenden Gens durch das Newcastle-Virus (NVD) und durch Concanavalin A (Con A) in Maus-L929-Zellen bzw. Milzlymphozyten induziert wird.

1, Clonierung und Expression von IRF-I-DNA In E.coli

A. PoIy(A)⁺RNA wurde aus nichtinduzierten Maus-L929-Zellen isoliert und für die Synthese von cDNA (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987) verwendet. Die entstandene cDNA wurde anschließend an einen EcoRI-geschnittenen Xgtll-Vektor cloniert, und eine cDNA-Bibliothek wurde nach dem Standardverfahren von Huynh u.a., 1985, mittels E.coli ^Y1090 als Wirtsstamm konstruiert.

Die entstandene Xgtll-Bibliothek wurde anschließend mittels der multimerisierten (4 mal) AAGTGA-Sequenz (im Folgenden als das Cl-Oligomer bezeichnet; Fujita u.a., 1987) als Sonde gescreent.

Bei diesem Screening-Verfahren wurde E. coll Y1090, durch die rekombinanten Xgtll-Phagen infiziert, auf rechteckige Platten von 10 x 13cm ausgestrichen. Die Platten wurden dann bei 12⁰C 4 bis 5 Stunden, wenn ungefähr 20000 Plaques/Platte zu sehen

waren, inkubiert. '

Die Membranfilter zum Screenen waren entweder aus Nylon (Nytran; Schleicher & Schnell) oder Nitrocellulose (Schleicher & Schnell). Die Filter wurden in 1OmM IPTG (zur Induktion der LacZ-Genexpression in den entsprechenden Phagenplaques) getaucht und an der Luft getrocknet, dann über die Platten gelegt und 2,5 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Die Plaques werden nur ein Protein erzeugen, für das die cDNA codiert, wenn die cDNA mit dem LacZ-Gen im Rahmen ist.

Die Filter werden entfernt, 20 Minuten bei 4⁰C gekühlt und dann ohne Trocknen gescreent.

Die Membranfilter wurden dann wie folgt für den Test vorbereitet:

Aus Maus-L929-Zellen wurde der Kernextrakt hergestellt und auf die Membranen getüpfelt (in einer Menge, die etwa 10pg Protein entsprach).

Vor der DNA-Bindung wurde ein Bindungspuffer, der aus 1OmM Hepes, pH 7,5,5,OmM NaCI, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% Glycerol bestand, zugesetzt. 5% fettfreies Milchpulver (Yukijurishi Inc.) wurde zu dem Puffer gegeben, und die Filter wurden in diesem Gemisch 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert und anschließend 1 Minute im gleichen Puffer, der jedoch kein Milchpulver enthielt, gespült.

Die Filter wurden dann in Bindungspuffer (1 ml) inkubiert, der 350pg/ml Lachssperma-DNA mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 300bp und die ³²P-markierte Sonde aus CI-Oligomer-DNA (10^ecpm/ml; spezifische Aktivität 2000cpm/f Mol) enthielt (siehe Fujita u. a., 1987). Die Sonden-DNA wurde mit T4-Kin<-ise an den 5'-Termini (γ-³²Ρ)ΑΤΡ endmarkiert.

Nach der Bindung wurden die Filter bei Raumtemperatur mit dei 11 Bindungspuffer 1 bis 2 Stunden lang gewaschen (10 ml Filter), wobei der Bindungspuffer mehrere Male gewechselt wurde. Die Filter wurden dann an der Luft getrocknet und autoradiographisch untersucht. Bei diesem Test ergaben die Nylonmembranen, ,adoch nicht die Nitrocellulosemembranen, ein positives Signal, was durch Zugabe von überschüssigem nichtmarkiertem Cl-Oligomer spezifisch inhibiert wurde.

Auf diese Weise wurden etwa 1,4 x 10° Rekombinanten gescreent. Unter den 32 positiven Phagenclonen, die beim ersten Screenen identifiziert wurden, war ein Clon (der als λ L28-8 bezeichnet wurde), der wiederholt in aufeinanderfolgenden Screeningdurchgängen an die Sonden-DNA band.

2. Herstellung und Reinigung von Protein In transferiertem E.coil

LysogeneBakterienclone wurden durch Transfektion von E. COÜY1089 mit λ L28-8 hergestellt. Dio über Nacht stehengelassenen Lysogene, dir \ L 28-8 enthielten, wurden zu 1 % in 400 ml L-Brühe eingeimpft. Die Bakterien wurden bei 31⁰C gezüchtet, bis OD₆Oo gleich 1 war. Die Temperatur wurde dann für 20 Minuten auf 42°C erhöht. IPTG wurde dann zu 10mM zugogobon, und nach wciteror 20minütiger Inkubation bei 38⁰C wurden die Kulturen schnell pelletiert und in 10ml Lysispuffer suspendiert, dor aus 2OmM Hepes pH 7,9,0,2mM EDTA, 0,5mM Spermldin, 0,15mM Spermin, 0,1 mM DTT, 10% Glycerol, 0,5mM . Phonylmethyonylsulfonylfluorid (PMSF), 1 pg/ml Pepstatin A, 1 pg/ml Leupeptin, 500 μΜ L-l-Tosylamid-2-phenylethylchloromethylbenzamidin, 1OmM Natriummolybdat, 2mM Natriumpyrophosphat und JmM Natriumorthovanadat bestand. Die Zellsuspensionen wurden drei schnellen Gefrier/Auftau-Zyklen ausgesetzt und anschließend bei 30000Umin~'

I Stunde lang bei 4°C mittels eines Beckman 50Ti Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entweder direkt für einen Gelverzögerungstest (siehe unten) verwendet oder weiter gereinigt.

Die weitere Reinigung wurde folgendermaßen ausgeführt:

Etwa 4ml Überstand wurden auf eine poly(di-C):poly(di-C)-Säule mit einem Bettvolumen von 2 ml und mit Lysepuffer äquilibriert, aufgegeben. Das Durchflußmaterial (4 ml) wurde dann auf eine DE 52 (Whatman) Säule mit einem Bettvolumen von 2ml und mit Puffer Z (25mM Hepes, pH 7,8,12,5mM MgCI₂,1 mM DTT, 20% Glycerol, 0,1 % NP-40,0,5mM PMSF) äquilibriert, aufgegeben. Die DNA-Bindungsaktivität wurde durch den 0,1 m KCI enthaltenden Puffer Z eluiert. Das Eluat (etwa 4 ml) wurde weiter mit Certricon-10 (Amicon) eingeengt. Die Endkonzentration des Proteins betrug 28mg/ml.

3. Charakterisierung des Proteinprodukts des Clons λ L28-8 (1) Gelverzögerungstest

Lysouene Bakterienclone, die λ L28-8 enthielten, wurden durch Transfektion von E.coli Y1089 hergestellt und wurden induziert, um dio clonierte cDNA in großen Mengen mittels des Verfahrens von Huynh u. a. 1985, zu exprimieren. Lysogene Clone, die in der gloichen Art und Weise hergestellt und behandelt worden waren, denen das cDNA-lnsert (als λ6 bezeichnet) fehlt, wurden als Kontrolle benutzt.

Aus den induzierten Lysogenkulturen wurden Extrakte hergestellt, die je 3pg Protein enthielten (vier Präparate, die als λ L 28-8a, λ L28-8b und λ 6a und λ 6b bezeichnet wurden).

Kernextrakt (3μς Protein) wurde ebenfalls aus Maus-L929-Zellon hergestellt.

Die Exktrakte wurden mit 1 f mol gekennzeichneter Cl-Oligomer Sonde nach obiger Boschreibung mit einer spezifischen Aktivität von 8000cpm/f mol inkubiert.

Jeder Extrakt wurde auch einem Vergleichstest unterzogen, in dem eine kompetitive DNA in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubationskultur gegeben wurde.

Die Ergebnisse des Tests sind in Fig. 1 dargestellt, in der die verschiedenen Bahnen Folgendem entsprechen:

Br in Extrakt

1 nichts

4 X6b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem Cl-Oligomer

5 .A6b mit 1 OOOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 5A-Oligomer*

6 λ L 28-8 a

7 \L28-8b

8 λ L 28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem Cl-Oligomer

9 XL28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 5 A-Oligomer * 10 L929-Zelle

I1 L929-Zelle mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem Cl-Oligomer

12 L929-Zelle mit 10OOfachum molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer*

'Das ii lujita u.a., 1985 beschriebene C 5 A-Oligomer ist eine 6mal wiederholte GAAA-Sequenz.

Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß gebundene Sonden in den Bahnen 6,7,9,10 und 12 nachweisbar sind.

Wie ίη Fig. 1 gezeigt wird, ergaben Proteinextrakte aus den λ L28-8-Lysogenen verschobene Bahnen (Bahnen 6 und 7), deren Erscheinen durch den Überschuß an nichtmarkierter CI-Oligomer-DNA inhibiert war, jedoch nicht in dem gleichen Maße wie bei C5A-Oligomer (Bahnen 8 und 9).

Im Gegensatz zu den λ L28-8stämmigen Proteinen ergaben diejenigen, die aus den induzierten λ 6stämmigen Lysogenen hergestellt worden waren, keine derartigen verschobenen Banden (Bahnen 2-5). Die verschobenen Banden sind dicht bei denen von natürlichem IRF-I aus Maus-L929-Zellen (Bahnen 10 und 12) zu sehen. Die in den beiden Reihen der verschobenen Banden existierenden Unterschiede sind als eine Folge der unterschiedlichen Mengen an Protein, das an die Sonden-DNA gebunden ist, zusehen.

Weiter wird festgestellt, daß die verschobenen Banden nur bei den Proteinen aus IPTG-induzierten Y1089-Zellen, die mit λ L 28-8 transferiert waren, nachweisbar waren.

(Ii) DNAse-Fußspurenanalyse

Die Fußspurenanalyse wurde durchgeführt, um die Bindungseigenschaften des durch λ L28-8-cDNA codierten Proteins an eine DNA, die für die IFN-ß-Gon-„upstream"-Region codiert, zu testen.

Das durch λ L28-8-cDNA codierte Protein wurde aus dem induzierten Lysogen extrahiert und teilweise durch Säulenchromatographie wie oben beschrieben gereinigt und auf seine Bindungseigenschaften an eine DNA, die die IFN-ß-Gen-„upstream"-Region enthält, geprüft.

Die Sonden-DNAs wurden als Sall-Hindlll-Fragmente hergestellt, die aus p-125cat (das das Wildtyp IFN-ß-Gen enthält) und p-125 DPcat (das ein mutiertes IFN-ß-Gen enthält) isoliert wurden. Das Plasmid p-125cat wurde als p-105cat konstruiert (Fujita u.a., 1987), mit der Ausnahme, daß das Fragment BamHI (-125)-Tagl (+19) aus pSE-125 (Fujita u.a., Cell, Bd.41, S.489-496,1985) verwendet wurde. Das Plasmid p-125 DPcat, das Punktmutationen innerhalb der IFN-ß-Regulationselemente trägt, wurde durch

synthetische ortsspezifische Oligonucleotidmutagenese an p-125cat wie bei Hatakeyama u. a., Proc. Natt. Acod. Sei. USA, Bd. 83, S.9650-9654,1986) beschrieben, gewonnen. Beide DNAs wurden durch [γ-³²Ρ)ΑΤΡ mittels T4-Kinase an der Hindlll-Stelle markiert.

4 f.Mol Sonden-DNA (spezifische Aktivität 3000cpm/f.Mol) wurden in 20μΙ Roaktionsgemisch, das 25mM Tris-HCI, pH 7,9, 6,25mM MgCI₂, 5OmM KCI, 1 mM EDTA, 0,5mM DTT, 10% Glycerol, 2% Polyvinylalkohol enthielt, mit oder ohne 280Mg gereinigtes Protein inkubiert.

In dem Test wurden 5 x 10~⁴ Einheiten DNAase I (Worthington) zugefügt und 1 Minute bei 25°C inkubiert.

Fig. 2 zeigt Autoradiogramme der aus den Proben gewonnenen DNA-Fragmente, die während der folgenden Verfahren gewonnen wurden. Auf der linken Seite von Fig. 2 ist der Teil der DNA-Sequenz der Wildtyp-IFN-ß-Sonde dargestellt, und auf der rechten Seite der Teil der DNA-Sequonz der mutierten IFN-ß-Sonde.

1. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten (siehe Methods in Enzymology, Bd.65, S.499-560) das Ergebnis wird in Bahn 1 gezeigt.

2. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde teilweise durch DNAase I ohne Schutz digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 2 gezeigt.

3. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und dann mit DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 3 gezeigt.

4. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein in Gegenwart eines 10OOfachen molaren Überschusses an nichtmarkiertem Cl-Oligomer umgesetzt und anschließend mit DNAase I digeriert- das Ergebnis wird in Bahn 4 gezeigt.

5. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und anschließend durch DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 5 gezeigt.

6. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten - das Ergebnis wird in Bahn β gezeigt.

In Fig. 2 werden die in den Bahnen 3 und 5 gefundenen geschützten Regionen entsprechend den auf der linken bzw. rechten Seite des Autoradiogramms dargestellten Sequenzen gezeigt. Die Hexamormotive sind eingerahmt.

Aus den Ergebnissen in Fig. 2 ist ersichtlich, daß die geschützte Region den Nucleotiden -100 bis -64 entspricht und dier die Region ist, die durch aus L929-Zellon gewonnene IRF-1 geschützt wird. Der Schutz wurde durch die Verwendung von überschüssigem nichtmarkiertem Cl-Oligomer (Bahn 4) aufgehoben. Bei Verwendung geringerer Proteinkonzentration wurde auch festgestellt, daß die das AAGTGA-Motiv (-80 bis -70) enthaltende Region bevorzugt geschützt war.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Protein eine höhere Affinität zu der das AAGTGA-Motiv enthaltenden Region und eine geringere Affinität zu der Nachbarregion hat.

Das mutierte IFN-ß-Gensegment trägt T-G-Mutationen an den Positionen -106, -100, -73 und -67. In den Vergleichsbahnen 5 und 2 unter den gleichen Testbedingungen erscheint der durch die rokombinanten Proteine gewährte Schutz an der nichtmutierten Region eingeschränkt (Bahn 2). Diese Beobachtung stimmt mit der BeoD&chtung überein, daß die Einführung dieser Mutationen zu einer drastischen Reduzierung (20fach) der Induzierbarkeit der Transkription durch NDV in L929-Zellen führt und daß die in vitro Bindung von IRF-1 an das mutierte IFN-ß-Gen nur in der nichtmutierten Region feststellbar war.

Weiter zeigt die Ve: Wendung des C1-Oligomers, daß das Protein spezifisch die Region schützt, die die Oligomersoquenzen enthält. Dieser Schutz entspticht vollkommen dem, der durch nativen IRF-1, der aus L-929-Zollon stammt, gewährt wird.

3. DNA-Konkurrenztest

Dieser Test wird ausgeführt, um die Affinität des rekombinanten Proteins zu verschiedenen DNA-Sequenzen einschließlich einigen'bekannten Transkriptionsregulations-DNA-Sequenzen zu untersuchen. Das Verfahren wird folgenderweise durchgeführt:

Das Hindlll-Sall-Fragment der IFN-ß-Sonde wurde aus p-125cat isoliert (siehe Fujita u.a., 1987); dieses Fragment enthält die Hunian-IFN-ß-GP!isequenz von +19 bis -125. Die DNA wurde an den 3'-Termini durch Füllen beider Enden mit Ct-³²P] dCTP mittels Klenow-Fragment markiert.

Die spezifische Aktivität der Sonden-DNA betrug 8000cpm/f. Mol.

Die Gelverzögerungstests wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

In den Durchläufen des Konkurrenztests wurde, wie in Fig. 3 gezeigt, die DNA mit dem Protein in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Konkurrenz-DNAs in dem Bindungsgemisch umgesetzt.

Der Bildungswert des Komplexes wurde durch densitometrische Analyse des Autoradiogramms quantitativ bestimmt. Die Komplexbildung in Abwesenheit von Konkurrenz-DNA wurde als 100% angenommen.

Die Struktur der Konkurrenz-DNAs sah folgendermaßen aus:

a) AP-1: eine synthetische DNA mit folgender Sequenz

5'CTAGA(TGACTCA)eG 3" 3'T(ACTGAGT)₆CCTAg 5'

b) TNF: 37 bp lange synthetische DNA, die von +1¹ "2 bis +2116 (siehe Nedwin u.a., 1985) des ersten TNF-a-lntrons reicht;

c) Maus-H2-D^d: 37 bp lange synthetische DNA, die das von Korber u. a„ 1988 beschriebene IRS-Element (-159 bis -123) umfaßt;

d) Human-IFN-a: 46bp lange synthetische DNA, die dem Virus-Antwortelement (Virus Response Element) entspricht (siehe Ryals u.a., 1985).

e) HexamersequenzenC1,C2,C3, C4undC5A.

Die Sequenzen C1 und C5A sind die oben beschriebenen. Die Sequenzen C2, C3 und C4 sind die in Cell, 49,352-367 (1987) beschriebenen. Sie stellen die Sequenzen

AAATGA - C 2 AAGGGA - C3und AAAGGA - C4

f) dielFN-ß-Gensequenzvon +19 bis-66.

Die linke Tafel in Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Hexamerwiederholungen als Konkurrenten verwendet wurden. Die mittlere Tafel zeigt die Ergebnisse, wenn Human-IFN-Gensegmente als Konkurrenten eingesetzt wurden, und die

rechte Tafel zeigt die entsprechenden Ergebnisse, wenn die in der Tafel angegebenen unterschiedlichen DNA-Segmenteverwendet wurden.

Aus den Ergebnissen in Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Erscheinen der verschobenen Bande durch die Hexamersequenzen In dieser Reihenfolge der Wirksamkeit C1-C2-C3-C4 verdrängt wurde, jedoch signifikant nicht verdrängt wurde durch C5A. Es kann auch beobachtet werden, daß die synthetischen DNA-Segmente, die die Regulationselemente von entweder Human- IFN-o. 1 oder Maus-H-2 D^d-Gonen umfassen, zu einer konv<etitiven Aktivität Anlaß geben. Dies ist insbesondere interessant, da

das DNA-Segment dos H-2 D^d-Gens die sogenannte IFN-Antwortsequenz (IRS) enthält, die al j ein Verstärker fungiert, wenn die

Zellen auf IFN reagieren (Sugita u.a., 1987; Israel u.a., 1986; Korber u.a., 1988). Tatsächlich werden ähnliche oder gleiche Sequenzmotivo wie auf dem IFN-ß-Gen in vielen Promotorsequenzen der IFN-

induzierbaren Gene gefunden, wo Kernfaktoren spezifisch zu binden scheinen (Korber u.a., 1988; Lery u.a., 1988).

Die in Fig. 3 gegebenen Ergebnisse ähneln sehr denen, die gewonnen werden, wenn der Test unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von natürlichem, aus L929-Zellen produziertem Protein wiederholt wird. Struktur der für Maue-IRF-I codierenden cDNA Die DNA-Sequenz der clonierten DNAs wurde entweder durch die Didesoxymethode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) oder durch das Standardverfahren von Maxam und Gilbort, 1980) bestimmt. Das \L28-8-lnsert in E. coli Y1089 wurde folgendermaßen isoliert: Die Phagen-DNA wurde durch das Standardverfahren

hergestellt und die DNA wurde durch EcoRI digeriert, dann wurde die aus der Phagen-DNA ausgeschnittene cDNA mit Hilfe der

Didesoxymethode (Sequenase: United States Biochemical Inc.) isoliert unu sequenziert. Die Länge des cDNA-lnserts in XL28-8

betrug 1,8kb. Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte einen großen offenen Leserahmen in Phase mit dem ß-Galactosidgen.

Zum Screenen von Clonen, die größere cDNA-lnserts enthalten, wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert mit L929-Zellen-

stämmiger poly(A)*RNA und in den Vektor CDM8cloniert nach dem Verfahren von Aruffo und Seed (Pi oc. Natl. Acad. Sei., USA,

Bd.84, S.8573,1987) und Seed (Nature, Bd. 329, S.840-842,1987). Die rokombinanten Plasmide wurden in den E. coli-Stamm MC 1061/p3 eingeführt (nach dem Verfahren von Aruffo und Seod,

siehe oben), und die Clone der cDNA wurden mittels AL28-8-stämmiger (³²P-markierter)-cDNA-Sonde unter strengen

Bedingungen für DNA-DNA-Hybridisierung gescreent (Kashima u.a., Nature, Vol.313, S.402-404,198B), und ein Clon plRF-L

wurde zur weiteren Untersuchung selektioniert.

Das gewünschte cDNA-lnsert von plRF-L wurde durch Digestion mit Hindill und Xbal gewonnen und durch die oben

beschriebenen Methoden sequenziert. Die Sequenz wird in Formel IV und in Fig. 4 gezeigt.

Es stellte sich heraus, daß die cDNA-Sequenz aus AL28-8 eine identische Sequenz in der überlappenden Region enthielt, mit der Ausnahme, daß ein Α-Rest zwischen den Nucleotiden 1773 und 1781 fehlte. Die 5'- und 3'-Termini der XL 28-8-stämmigen cDNA sind durch Pfeile in Fig.4 gekennzeichnet. Die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die möglicherweise die mRNA-lnstabilität übertragen, sind eingerahmt. Wie aus Fig. 4 A ersichtlich wird, war die cDNA der Maus-cDNA, die von plRF-L abgeleitet war, 198 bp lang und damit 20 bp langer

als die von AL28-8-cDNA in den 5'- bzw. 3'-Regionen.

Die Analyse der Genom-DNA-Sequenz, die die Promotorregion dieses Gens enthält, zeigt, daß die cDNA von plRF-L etwa 30bp

von der größeren CAP-Stelle fehlt, siehe unten und Formel V und Fig.7.

Die unmittelbare „upstream"-Sequenz des ersten ATG-Codons, GGACCATGC, paßt gut In die Kozaksche Consonsus-Sequenz GCCqCCATGG für die Translationsinitationsstelle. Eine ATG-Sequenz im Rahmen wurde in der „upstream"-Sequenz von der oben erwähnten ATG-Sequenz aus nicht gefunden,

was bestätigt, daß dies tatsächlich das Initiationscodon für die IRF-l-mRNA ist.

Wie bereits erwähnt, wurde in der Nucleotidsequenz keine Differenz zwischen den cDNAs von XL28-8 und plRF-L innerhalb der

überlappenden Regionen gefunden, mit Ausnahme «ines Nucleotide in der 3'-nichtcodierenden Region.

Die Maus-IRF-I bestand damit aus 329 Aminosäuren mit einer berechneten relativen Molekülmasse von 37,3KD. Kanonische N-Glycosyliergngsstellen erscheinen nicht in der Sequenz. Zu anderen bekannten Proteinen wurde boi Recherchen in Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.) und bei erst kürzlich veröffentlichten Sequenzen keine signifikante Homologie nachgewiesen. Die Hydropathieanalyse nach Kyte und Doolittlo, 1982, zeigt, daß das Protein als Ganzes hoch hydrophil ist (Fig.4 B). Die Untersuchung der abgeleiteten Primärsequenz des Maus-IRF-I zeigt die folgenden Merkmale: Die endständige Aminohälfte, zur Aminosäure 140 verlängert, ist reich an Lysin (Lys) und Arginin (Arg). Tatsächlich sind 31 der

39 Lys- und Arg-Reste in dieser Region lokalisiert. Im unteren Teil von Fig.4 B ist im Diagramm eine Zusammenfassung der

Lokalisierung der basischen Aminosäuren (Arg, Lys) (nach oben gerichtete Säulen) und der sauren Aminosäuren (Asp, GIu)

(nach unten gerichtete Säulen) dargestellt.

Wie in Fig. 4 B gezeigt, weist diese Region eine starke Hydrophilie auf und wird als die Region angesehen, die hauptsächlich für

die IRF-I-Bindung an die spezifischen DNA-Sequenzen verantwortlich ist.

In diesem Zusammenhang waren die für viele DNA-bindenden Proteine charakteristischen Motive wie Zinkfinger und Helix/ Helix-Motive (Pabo und Sauer, 1984, Evans und Hollenberg, 1988) in dem IRF-I-Protein nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu zeigt der Rest des Moleküls (d. h. die endständige Carboxylhälfte) einen relativen Überfluß an Asparaginsäure

(Asp), Glutaminsäure (GIu), Serin (Ser) und Threonin (Thr). Von 189 Aminosäuren (von Aminosäure 140 bis 329) sind 33 (17%)saure Aminosäuren und 36 (19%) sind Ser und Thr. Beachtenswert ist, daß ein Cluster von 5 aufeinanderfolgenden sauren

Aminosäuren in den Aminosäuren 227 bis 231 gefunden wurde. Ser und Thr scheinen viele Cluster zu bilden (Aminosäureregion

bei 153-156,190-192,206-208, 220-222; die hier als die S-T-Regionen bezeichnet werden). Die S-T-Regionon werden durchkleine offene Rechtecke in der unteren Tafel von Fig.4 B dargestellt.

Struktur der Human-IRF-I codierenden'cDNA Nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise für Maus-IFR-I wurde Human-IRF-l-cDNA cloniert und

sequenziert.

Eine Human-cDNA-Bibliothek wurde durch Synthetisierung von cDNA mittels PoIy(A)⁺RNA aus einer Human-T-Zellinie Jurkat

hergestellt. Die doppelsträngige cDNA-Synthese und anschließende Clonierung in den Plasmidvektor CDM 8 wurdeentsprechend dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd.84, S.8573-8577,1987) und Seed (Nature,

Bd.329, S.840-842,1987) durchgeführt. Die rekombinanten Plasmide wurden in don E. coli-Stamm MC 1061/p3 mittels dos Verfahrens von Aruffo und Seod (siehe oben)

eingeführt.

Die Clone, die mit Maus-IRF-l-cDNA kreuzhybridisieren, wurden zum Screenen mit XL28-8-cDNA ("P-markiert) als Sonde unter

wenig strengen Bedingungen fü^r die DNA-DNA-Hybridisierung vorwendet. Die angewandten Bedingungen waren genau diegleichen wie bei Kashima u.a. (Nature, Bd.313, S.402-404,1985) beschrieben.

Aus den positiven Clonen wurde Clon pHIRF31, der das längste cDNA-lnsert enthielt, soloktionion. Dio gewünschte cDNA-Sequenz von Clon pHIRF31 wurde durch Digestion der Plasmid-DNA durch Xhol isoliert un^r> 'mach

durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Struktur des Human-IRF-I-Gens wird in Formel Il und Fig.8 gezeigt.

Die Sequenzen für das abgoleitete Maus- und Human-IRF-I sind zum Vergleich in Fig. 5 untereinander dargestellt. Die Analyse der Human-DNA zeigte, daß diese IRF-I um vier Aminosäuren kürzer ist als die Maus-IRF-I. Die starke Erhaltung der Aminosäuresequenzen läßt sich zwischen den beiden IRF-I-Molekülen erkennen. Insbesondere 133 der

140 Aminosäuren (95%) der Aminoendhälften können als gleich angesehen werden.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die obigen Beobachtungen zeigen, daß IRF-I eine neue Klasse von DNA-bindendem Protein ist. Es sei auch darauf hingewiesen, daß die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die in vielen Cytokin- und Protoonkogen-mRNAs

gefunden werden, in der3'-nichttranslatierten Region der Maus-IRF-l-cDNA vorhanden sind und daß auch die Sequenz ATTTA inder entsprechenden Region der Human-IRF-l-cDNA gefunden wird. Von diesen Sequenzen nimmt man an, daß sie in derposttranskriptionalen Regulation der Genexpression eine Rollo spielen, indem sie der mRNA Instabilität übertragen (Shaw und

Kamen, 1986; Caput u.a., 1986). Das Plasmid pIRF-L wurde in E. coil MC 1061/p3 transferiert, das als E. coli MC 106/p3 (pIRF-L) am Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-kon 305, Japan,

entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Form BP-2005 hinterlegt wurde.

Das Plasmid plRF31 wurde in gleicher Weise in E. coli MC 106/p3 transferiert, das als E. coli MC 106/p3 (plRF-31) am FRI

entsprechend den Bedingungen des Budaposter Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Form BP-2006 hinterlegt wurde.

Regulation des IRF-Gens

1. Expression der IRF-l-mRNA

In Anbetracht der Tatsache, daß IRF-I Affinitäten zu Regulationssequenzon von anderen Genen als dem IFN-ß-Gen beweist und

somit ander Regulation einer Reihe von Genen in verschiedenen Zelltypen beteiligt ist, wurde die Expression der IRF-l-mRNA in

Mauszellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen stammten, mit Maus-cDNA als Sonde untersucht. Zur Herstellung

dieser Sonde wurde M13 mp 10 Phagen-DNA (siehe unten), die den codierenden Strang an IRF-I-Gen-Pstl-Fragment enthielt, als

Matrize zur Synthetisierung der ³²P-markiorten „anti-sonse" DNA verwendet. Das Produkt wurde durch EcoRI digeriert, und die Sonden-DNA wurde wie bei Fujita u.a. (19f 5) beschrieben isoliert. Die gesamte RNA wurde nach dom bewährten Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, isoliert. Die Blot-Analyse wurde dann im wesentlichen wie bei Thomas (1980) beschrieben durchgeführt, der Röntgenfilm wurde 3 Tage

belichtet, und die Ergebnisse sind in Fig.6A gezeigt. Die verschiedenen Bahnen stellen die Ergebnisse der Durchgänge dar, beidenen Ganzzell-RNA aus den folgenden Geweben verwendet wurde:

Bahn	1	Hirn
Bahn	2	Herz
Bahn	3	Leber
Bahn	4	Lunge
Bahn	5	Milz (nicht stimuliert)
Bahn	6	Thymus
Bahn	7	Niere
Bahn	8	Muskel
Bahn	9	Darm
Bahn	10	Milz (nicht stimuliert)
Bahn	11	ConA- stimulierte Milz

In den.Durchgängen für jede Bahn wurden S\ig der Ganzzell-RNA verwendet, mit Ausnahme von Bahn 8, bei der nur 1,2 pg RNA

verwendet wurden.

Aus Fig.6 A ist ersichtlich, daß eine Bande, die etwa 2,0kb entsprach, in den meisten RNA-Proben durch diese Blot-Analyse

nachgewiesen wurde, obwohl der mRNA-Expressionswert niedrig zu sein schien. Es ist bemerkenswert, daß der

Expressionswert von mRNA in den Lymphozyten aus der Milz nach der Stimulierung durch ConA (Bahn 11) drastisch zunahm. In einem weiteren Test wurden Maus-L929-Zellen durch NDV induziert wie im vorangegangenen beschrieben (Fujita u. a., 1985),

und die Zytoplasma-RNA wurde nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, alle drei Stunden nach der Infektion extrahiert.

Sonden-DNAs wurden aus den folgenden verschiedenen Sequenzen hergestellt und durch die „mtiltiprime"- Markierungsreaktion (Amersham) markiert, und zwar

(i) ein 1,8kbEcoRI-Fragment ausλί28·8 (spezifischeAktivität 2 x 10^ecpm/pg);(ii) ein 0,5kb BamHI-Bglll-Fragment aus einem Maus-IFN-ß-Genomclon (spezifische Aktivität 5 χ lo'cpm/pg) und(iii) ein 2,0kb BamHI-Pvull-Fragment eines Clons, das ein Human-ß-Actinpseudogen enthält (spezifische Aktivität 5 χ 10^scpm/

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 B dargestellt. Die Blot-Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei das Verfahren von Thomas (1980) angewandt wurde. JedeBahn erhielt 1Opg Zytoplasma-RNA. Der Röntgenfilm wurde 3 Stunden belichtet. Die densitometrische Analyse zeigte, daß

die IRF-l-mRNA 9-12 Stunden nach der NDV-Infektion um das 25fache zunahm.

Obwohl die Zunahme an mRNA drastisch ist, ist es ein transientes Ereignis, es erreicht seinen Höhepunkt bei 9 bis 12 Stunden

und gleicht sich 12 Stunden nach der Induktion aus. Die mRNA-Anreicherung geht der Anreicherung an IFN-ß-mRNA voraus; wieaus Fig. 6B ersichtlich ist, läßt sich die Induktion von IRF-l-mRNA bereits 3 Stunden nach der NDV-Infektion beobachten, währenddie IFN-ß-mRNA bei gleichen Blot-Bedingungen für beide RNAs erst 6 Stunden danach nachweisbar ist.

DerlRF-l-Promotor Wie im vorangogangonon demonstriert wurde, wird das IRF-I-Gon transkriptionoll durch verschiedene Agonzien wie Viren und Mitogene reguliert. Die Souther-Blot-Analyso der Chromosomen-DNA zeigte, daß das IRF-I-Gen gesploißt werden kann und nicht in der Maus

„multimemberod" ist.

Eine λ-Phagenbibllothek, dio Baby-Maus-DNA enthielt, wurde nach den Clonen gescreent, die die IRF-I-Promotorsequenz

enthalten, wobei die gleiche \L28-8-stämmigo cDNA-Sonde wie oben verwendet wurde. Es wurden vier positive Cloneidentifiziert, von denen bei allen die gleiche Genom-DNA festgestellt wurde und eine davon für die weitere Analyse verwendetwurde (Kg 14-2). Ein Pstl-Fragment wurde in die Pet-I-Stelle von pUC 19 subclonlert, um ρ 19IRFP zu konstruieren.

Die gleiche DNA wurde danach in die Pstl-Stelle von M13 nip 10 und M 13mp 11 clonlert, die zur Erzeugung von DNA für die Sequenzanalyse verwendet wurden. Die Nucleotldsequenzanalyse des Pstl-Fragments aus den obengenannten Clonon wurde wie bereits beschrieben durchgeführt. Große und kleine CAP-Stellen wurden durch Sl-Kartierungsanalyse identifiziert. Die bestimmte Sequenz wird in Fig. 7 A gezeigt. Wie daraus ersichtlich ist, paß die „downstroam "-Sequenz der DNA

ausgezeichnet zu der von plRF-L abgeleiteten cDNA.

Die S1 -Nucleaseanalyse zeigt das Vorhandensein von zwei CAP-Stellen für die IRF-ImRNA, in der sich dio größere Stelle etwa

20 Nucleotide „downstream" von der kleineren Stelle befindet.

Typische TATA-Boxsequenzen sind in der „upstream"-Roglon dos Gens nicht vorhanden. In Anbetracht der ungewöhnlichen Fülle an CpG-Sequonzon, stellt diese Region wahrscheinlich eine „HIF-Insel" dar (Bird, 1986). Dio Promotorregion enthält zwei GC-Boxen und eineCAAT-Box (siehe Fig. 7 a); dioersteren Boxen müßten SpI binden (Kadogan

u.a., 1986) und die letzteren CP-1 odor CP-2(Chodosh u.a., 1988).

Das die Promotorsequenzen enthaltende Pstl-Fragment wurde dann auf folgende Art und Weise auf seine Reaktivität als Antwort

auf extrazelluläre Signale, z. B. Virusinduzierbarkeit, getestet.

Ein chimäres Gen wurde konstruiert, in dem ein Roportergon, und zwar ein bakterielles Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)· Gen „downstream" vom Pstl-Segment anstieß. Dies geschah durch Ausschneiden eines Pstl-Fragmontes aus P19IRFP (siehe

oben) durch BamHI und Hindill und Clonierung des erhaltenen Fragmentes in das Bglll-Hindlll-Rückgratfragment von pAioCatj(Rosenthal u.a., 1983), um plRFcat herzustellen.

Verschiedene weitere Konstrukto wurden folgendermaßen hergestellt:

plRFAcat wurde durch Digerieren des ρ 19IRFP-stä'mmigen BamHI-Hindlll-Fragmentes mit Haelll hergestellt, dessen einzelne

Erkennungsstelle bei -30 bis -35 von der größeren CAP-Stsllo (Fig.5A) liegt. Das entstandene Haelll-Hindlll-Fragment wurde

mit BGIII-Hindlll-Rückgratfragment von pAi_Ocat₂ und dor folgenden synthetischen DNA lipiert:

5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3¹ 3'GATCTAAAGAAGCGc 5'

Damit enthielten sowohl plRFcat als auch plRFAcat Sequenzen bis zu -320 bzw. -48 von dor größeren CAP-Stelle aus.

p-125cat enthält die Promotorsequenz dos Human-IFN-ß-Gons wie bei Fujita u. a., 1987, beschrieben.

pSV2cat ist in Gorman u.a., Science, Bd.221, S.551-553 beschrieben.

Als Rejerenzgen wurde pRSVgpt verwendet (siehe Gorman u.a., s.o.). Die unterschiedlichen Gene wurden mittels der Calcium-Phosphat-Methode (Fujita u.a., 1985) in Maus-L929-Zellen transferiert.

5 x 10^s Zellen wurden mit 7,5pg des das CAT-Reportergen und 2,5pg pRSVgpt enthaltenden Testplasmids transferiert. Die

Zellen wurden durch NDV induziert oder „mock"-induziert und anschließend dem Enzym-Test wie bei Fujita u.a., 1985,

beschrieben unterzogen.

Zur Berechnung der relativen CAT-Aktivität wurde die CAT-Aktivität aus den „mock"-induzierten Zellen, die mit pSV2cat

transferiert waren, als 100% angenommen. Jede CAT-Aktivität wurde durch Ecogpt der entsprechenden Proben normalisiert(Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd.78, S. 2072-2076). Die Proben, in denen CAT unter dem Hintergrundwert lag,wurden mit b.b. (below background level) gekennzeichnet.

Die Ergebnisse sind in Fig.7B c. ,ustellt. Es ist erkennbar, daß die Transfektion von plRFcat in Maus-L929 die Expression der CAT-Aktivität mit niedrigem Wert

verursachte. Der CAT-Expressionswort wurde erhöht, wenn die transferierten Zellen durch NDV stimuliert wurden. Die Deletionder 300-bp-„upstream "-Sequenz des IRF-I-Gens (plRFAcat) hob faktisch sowohl die konstitutive als auch die induzierte

Expression des CAT-Gens auf. Dies zeigt, daß die Promotorsequenz innerhalb der 300-bp-„upstroam"-Region liegt und

virusinduzierbar ist.

Konstruktion von Expressionsplasrruden

1. Phagon-DNA von Clon λ L 28-8 wurde durch EcoRI digeriert, und das Insert wurde gewonnen. Die EcoRI-Stellon der cDNAwurden durch T4-DNA-Polymerase geglättet und anschließend mit synthetischen Adaptor-DNAs, die die SequenzpGATCCATTGTGCTGG und pCCAGCACAATG besaßen, ligiert, s. Aruffo und Seed 1987.

Nach Entfernung der synthetischen DNAs durch gradiento Zentrifugiorung mit 5-20% Kaliumacetat (Aruffo und Seod, 1987)

wurde die IRF-l-cDNA mit den an beide Enden geknüpften Adaptor-DNAs mit BstXI-geschnittener CDM8-Vektor-DNA ligiert(Seed, B, Nature, Bd. 329, S. 840-842,1987). Die Plasmide plRF-S undplRF-A,die die IRF-IcDNA in der „sense"- und „antisense"-

Ausrichtung in bezug auf den CMV-Promotor enthielten, wurden isoliert. Jede Plasmid-DNA wurde entweder mit p-55cat oder p55CIB (Fujita u.a., 1987) in L929-Zellen co-transfektiert und der CAT- Expressionswert wurde bestimmt. . Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt:

	Transferierte Plasmide	Induktion durch NDV	CAT-Aktivltät (% Umwandlung)
	plRF-S p-55cat	-	<1%
	plRF-S P-55CIB	-	50%
Experiment 1	plRF-A p-55cat	-	<1%
	plRF-A	-	<1%
	plRF-S P-55CIB	—	1,7%
	plRF-S P-55CIB	+	3,6%
Experiment 2	plRF-A P-55CIB	-	<0,1%
	plRF-A P-55CIB	+	<0,1%

Die DNA-Transfektionseffizienz hängt vom Zustand der Rezipientenzellen (in diesem Fall Maus-L929-Zellen) ab. Die Effizienz war in Experiment 2 viel niedriger als in Experiment 1, der CAT-Expresslonswert ist daher vergleichsweise niedriger als in Experiment 2.

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die signifikante CAT-Aktivität nur in durch p-55CIB und p-IRF-S transferierten Zellen nachweisbar. Siezeigen, daß der TRF-I an die wiederholten (8mal) AAGTGA-Sequenzen, die ,upstream" des CAT-Gens in P-55CIB vorhanden sind, bindet und daher die Transkription des distalen CAT-Gens fördert.

Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß der CAT-Expressionswert durch Infektion der transferierten Zellen mit NDV (Tabelle 1) erhöht wird (um mehr als das doppelte), was zeigt, daß die Kontrolle der Genexpression durch unterschiedliche Stimuli, wie beispielsweise Viren, möglich ist.

2. Ein Expressionsplasmid für die Produktion eines Proteins, das aus TRF-I-DNA bindender Domäne und Transkriptionsaktivierungsdomäne von Hefe-GAL4 bestand, wurde folgendermaßen konstruiert:

Das Plasmid plRF-S wurde durch Hindlll und Pstl digeriert, und das cDNA-lnsert wurde isoliert. Die cDNA wurde durch Drall!

digeriert, und das Hindlll-Dralll-Fragment (etwa 550bp) wurde gewonnen und als Fragment A bezeichnet.

Der Expressionsvektor CDMB wurde durch Hindlll und Xbal digeriert, und die Rückgrat-DNA wurde isoliert und als Fragment B bezeichnet.

Die für die Hefe-GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne codierende DNA wurde aus Plasmid pRB968 folgendermaßen isoliert (Ma und Ptashne, 1987):

Die pRB 968-DNA wurde zuerst mit Hindlll digeriert, und die Enden wurden durch T4-DNA-Polymerase geglättet. Synthetische Xba-I-Linker-DNA wurde zu der DNA gegeben, und die DNA wurde dann durch Pvull und Xbal digeriert.

Das entstandene ca. 600bρ lange Pvull-Xbal-DNA-Fragment wurde gewonnen und als Fragment C bezeichnet.

Zusätzlich wurde eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz hergestellt:

(3')GCACACAGCAGGTC(5·)

und als Fragment D bezeichnet.

Ein Expressionsvektor plRFGAL4 wurde durch Ligation der Fragmente A, B, C und D konstruiert. Als Kontrollplasmid wurde Plasmid plRFAGAL4 durch Ligation der Fragmente A, B, C und einersynthetischen DNA mit der folgenden Sequenz konstruiert:

(Ö'JGTGTCTGACAGO¹) O')GCACACAGACTGTC(5')

Da ein Terminatortriplett, TGA, im Rahmen zwischen den IRF-I- und GAL4-Sequenzen in plRFAGAL4 vorhanden ist, müßte dem exprimierten Protein die GAL4-Aktivierungsdomäne fehlen.

Um die funktioneilen Eigenschaften des Plasmids zu testen, das für den chimären Transkriptionsfaktor codiert, wurden plRFGAL4 und plRFAGAL4 beide mit p-55CIB in L92&-Zellen cotransfektiert, und die CAT-Expression wurde überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt:

Tabelle 2

TransfektiertesPlasmid CAT-Aktivität(%Umwandlung)

plRF-S 2fi%

P-55CIB

plRF-A <0,2%

P-55CIB

plRFGAL 1,4%

P-55CIB

plRFGAL4 <0,2%

P-55CIB

Wirtszellen waren Maus-L929-Zellen. Die Zellen waren nicht durch NDV induziert.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Expression eines Zielgens (wie beispielsweise Gene, die für ein Interloukin, ein Interferon (α, β und γ), einen plasminogenen Aktivator, Erythropoiotin, Granulozytkolonie-stimulierondon Faktor, Insulin, Human-Wachstumshormon oder Superoxiddismutase (oder Mutanten der Humangene) durch IRF-I erhöht werden kann.

Solche Zielgene wie die oben erwähnten, wie Interferongene, z. B. IFN-a, IFN-ß, IFN-γ, IFN-Omega und plasminogene Aktivatoren,

z. B. t-PA, pro-Urokinase oder Urokinase usw. können auch wirkungsvoller exprimiert werden, indem Promotoren eingeführt werden, die mit unterschiedlich langen Erkennungssequenzen für IRF-I, z. B. AAGTGA, verschmolzen sind.

Die Zielgene können beispielsweise in unterschiedliche Wirtszellen zusammen mit entweder intakten IRF-I- oder chimären IRF-I-Genen eingeführt werden. Durch Verlängerung der IRF-I-Erkennungsstellen-DNA, z. B. durch Erhöhung der Anzahl der AAGTGA-Wiederholungen und des Expressionswertes des Transkriptionsfaktors, läßt sich ein hoher Expressionswert der Zielgene erreichen.

Beispielsweise können die AAGTGA-Wiederholungssequenzen an einen geeigneten Promotor wie "inen IFN-ß-Promotor oder einen frühen SV40-Virus-Promotor angrenzen. Ein Zielgen, z. B. ein t-PA-Gen oder IFN-ß Gen kann „downstream" eines solchen Promotors verbunden werden; die Struktur eines derartig konstruierten Gens würde sein

(AAGTGA)_x (Promotor) (Zielgen z.B. t-PA-Gen)

Ein derartiges Gen könnte dann in CHO-Zellen, z. B. CHO DXBII-Zellen (dhfr-Stamm) eingeführt und in diesen verstärkt werden (Urlaub und Chasin, Proc.Natl., Acad.Sci., USA, Bd.77, S. 4216-4220,1980).

Idealerweise wird, wie im vorangegangenen diskutiert wurde, eine Wirtszelle aus einer Zelle, die im wesentlichen keinen Wert einer endogenen IRF-I-Aktivität aufweist, gewählt. Das IRF-I-Gen, vorzugsweise entwedor mit einem .'starken Promotor, wie einem CMV-Promotor oder einem induzierbaren Promotor, wie einem Metallothionein-Genpromotor, kann auf herkömmliche Art und Weise in die verschiedenen Wirtszellen eingeführt werden.

Das IRF-I-Gen kann co-eingeführt und zusammen mit dem Zielgen verstärkt werden. Auf alternative Weise können das IRF-I-Gen und das Zielgen getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.

In derartigen transferierten Zellen kann IRF-I entweder konstitutiv (im Falle z. B. eines CMV-Promotors) oder induzierbar (im Fall

z. B. des Metallothionein-Promotors wird durch zweiwertige Metalle wie Zink induziert) hergestellt werden. Der exprimierte IRF-I bindet an die AAGTGA-Wiederholungen und verstärkt das di tale Zielgen, z. B. das t-PA-Gen oder das IFN-Gen.

Eine derartige Expression kann weiter durch ei.i Virus, z. B. NDV-Induktion, verstärkt worden, und wie aus Tabelle 1, Experiment 2, ersichtlich ist, erhöht diese Induktion die Aktivität des IRF-I.

Maus-cDNA-Sequenz, die mit Maus-IRF-l-cDNA der Formel III kreuzhybridisiert Eine Maus-cDNA-Bibliothek wurde nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise hergestallt. Die cDNA wurde durch das Standardverfahren synthetisiert. Dabei wurde Maus-L929-Zellen-stämmige mRNA verwendet, und die cDNA wurde durch das Standardverfahren in den Agtll-Vektor inseriert. Die entstandene Xgtll-Bibliothek wurde dann zur Isolierung der cDNA-Clone gescreent, deren Inserte mit der oben beschriebenen Maus-IRF-l-cDNA folgendermaßen kreuzhybridicieren: Nitrocellulosefilter, die die Phagen-Pläque-DNAs enthalten, wurden in den folgenden Stufen inkubiert

(1) in3x SCC bei 65⁰C 30 Minutenlang und anschließend

(2) 60minütige Inkubation in 3x SSC, das Denhartsche Lösung enthält (0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyfinylpyrrolidon 25), und anschließend

(3) eine vor-Hybridisierungsstufe, die aus der 12stündigen Inkubation bei 65°C in einer Lösung, die 1M NaCI, 50mM Tris-HCI, pH8,0,1OmM EDTA, 0,1 % SDS, 50 Mg/ml einzelsträngige Träger-DNA (z. B. Lachssperma-DNA) und Denhartsche Lösung enthält, besteht und

(4) die Inkubation der Stufe 3 wurde wiederholt, wobei "P-markierte Maus-IRF-l-cDNA als Sonde eingeführt wurde. Diese cDNA-Sonde wurde als das von EcoRI geschnittene Insert aus \L-28-8 hergestellt und durch das Multiprime-Markierungssystem (siehe oben) translation. Die Inkubation wurde 12 Stunden lang bei 65⁰C durchgeführt.

Dann wurden die Filter gewaschen, kurz in 2x SCC-Lösung gespült und anschließend in 3x SCC-Lösung, die 0,1 % SDS enthielt, 30 Minuten lang bei 65⁰C gewaschen. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt.

Einer der positiven Clone, der als pHH-45 bezeichnet wurde, wurde selektioniert und es zeigte sich, daß er cDNA enthielt, die nur einen Teil der Codiersequenz für einen IRF abdeckte.

Das cDNA-lnsert in PHH-45 wurde deshalb isoliert und zum Screenen von Clonen verwendet, die größere Inserte enthielten, wie im vorangegangenen unter der Überschrift „Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA" für die Herstellung von PIRF-L beschrieben wurde.

Von den identifizierten positiven Clonen wurde der als plRF2-5 bezeichnete selektioniert und charakterisiert, wobei das im vorangegangenen für Maus-IRF-I beschriebene Verfahren angewandt wurde. Die komplette hybridisierende cDNA-Sequenz wird in Formel IVa gezeigt, und die Aminosäuresequenz des entsprechenden IRF-Proteins wird in Formel VIII dargestellt.

Das Plasmid plRF 2-5 wurde in E.coli MC 1061/p3 transferiert, das als E.coli am FRI entsprechend dem Budapester Vertrag am

22. November 1988 unter der Nr. FERM BP-2157 hinterlegt wurde.

cDNA aus dem Hefegenom, die mit Human-IRF-l-cDNA-Sequenz hybridisiert Hefe-DNA wurde nach dem Standardverfahren hergestellt i'nd mit EcoRI digeriert. 5μρ der digerierten DNA wurde auf 0,8% Agarosegel gegeben und mittels Standardverfahren einer Elektrophorese und einem DNA-Blot-Test unterzogen. Das geblottete Filter wurde bis auf folgende Ausnahme genau nach der Deschreibung in vorangegangenen Beispiel zur Isolierung von Maus-DNA, die mit Maus-IRF-I hybridisiert, behandelt: In Stufe (3) betrug die Inkubationstemperatur 55⁰C, und in Stufe (4) wurde die Inkubation ebenfalls bei 55⁰C ausgeführt, und die radioaktive Sonde war die aus pHIRF31 durch Digestion des Plasmids mit Xhol isolierte Human-IRF-l-cDNA, wobei diese Sonde, wie im vorangegangenen Beispiel für Maus-IRF-I beschrieben, markiert wurde. Das Filter wurc*e bei 55⁰C in 2x SSC gewaschen. Die positiven Clone wurden durch Autoradiographie identifiziert (siehe Fig. 10).

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Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der V. Ί> ng eines Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), dadurch gekennzeichnet, daß man Wir^zMIi ι kultiviert, die durch einen Vektor transformiert sind, der ein Gen, das für ein Protoin mit der Wirkung eines Interferon Regulatory Factor-1 codiert enthält, und das resultierende Protein isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für ein menschliches- oder Mäuse-IRF-1 codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen ein Protein codiert, das zur Bindung an die sich wiederholende Oligomersequenz AAGTGA (C 1-Sequenz) und das „Stromaufwärts-Regulator-Element" des menschlichen IFN-ß-Gens fähig ist.

4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen an einen konstitutiven Promotor oder einen induzible Promotor operable gebunden ist.

5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante enthält

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT

110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGAC CAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGA^GTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekonnzeiohnet, daß das Gen eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante enthält

10 20 30 40 ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60 70 30 90 ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGdCTCGGCACGGA

IiO 150 ISO 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 2S0 '-> 270 ♦ ACATGGAAAGCAAATTV FCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

OSO 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCAT AAAGAAA'jGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 3SO . 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAÄAAÄGAAGACAGAGTTAAGCAC.

410 420 _. .430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 Ü70 580

tcccatctggacagcaacattgaagatcaagagatcgtcactaac

590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710 720

CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760

AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 810

AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840 850

ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 870 880 890 900

CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940

TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990

CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1030

CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040
GTCAAGAGCTGT

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 his 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eine Sequenz der folgenden Formel odor nine Degenorat-Variante davon enthält ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC , AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAO TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eine DNA-Sequenz enthält, die eine Sequenz ist, die sich zu einer DNA-Sequenz hybridisiert, wie sie in einem der Ansprüche 5 bis 7 definiert ist und die ein IRF-Ί aktives Molekül codiert.

9. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzelle ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eines der folgenden Plasmide ist

pH IRF 31, pIRF-L und pIRF 2-5.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekonnzeichnet, daß ein Protein der folgenden Formel hergestellt wird

Met Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu GIu Met Gin He Asn Ser Asn Gin He Pro GIy Leu He Trp He Asn Lys GIu GIu Met He Phe Gin He Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His GIy Trp Asp He Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala lie His Thr GIy Arg Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn Phe Arg Cys AIa Met Asn Jer Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ser Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu Pro Pro Leu Thr Arg Asn GIn Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser Pro Asp Thr Phe Ser Asp GIy Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser Leu Ser GIu Trp His Met Gin Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr Asp Leu Tyr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIu AIa AIa Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys • Leu Phe GIu GIn Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp GIy Lys GIy Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr GlN Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu He Asp Ser Pro Arg GIy Asp He GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thr GIu Met Lys Asn Met Asp Ser He Met Trp Met Asp Ser Leu Leu GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa Pro

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein der folgenden Formel hergestellt wird

MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet

GlnlleAsnSerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpIleAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspIleAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspIleGluGluVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLuuSerProCysAlaValSerSerThrLeuProAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal

. SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAsp^. uAspGluGluGlyLysLeuPro GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys LysGluGluPioGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal. PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg LeuProSerlleGlnAlalleProCysAlaPro

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein der folgenden Formel hergestellt wird

MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln HeAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu LysLysllePheGlnlleProTrpMetHisAlaAlaArgHisGly TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPheArgAsnTrpAlalle HisThrGlyLysHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys ThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAiaMetAsnSerLeuProAsp HeGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAla PheArgValTyrArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHis HeLysGlnGluProValGluSerSerLeuGlyLeuSerAsnGly ValSerGlyPheSerProGluTyrAlaValLeuThrSerAlalle LysAsnGluValAspSerThrValAsnllelleValValGlyGln SerHisLeuAspSerAsnlleGluAspGlnGlulieValThrAsn ProProAsplleCysClnValValGluValThrThrGluSerAsp AspGlnProValSerMetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSer ProValSerSerTyrAlaGluSerGluThrThrAspSerValAla SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg SerlleGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGlyThrArgAsn ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsnLys ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro TyrAsnSerSerTrpProProPheThrAspLeuProLeuProAla ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr ArgAlaSerVallleLysLysThrSerAsplleThrGlnAlaArg ValLysSerCys

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Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung eines IRF-1 aktiven Proteins durch die Kultivierung von Wirtszellen, die durch ein DNA-Molekül transformiert werden, die für dieses IRF-1 -aktiven Proteins codiert.

Die Transkription von Genen in Säugetierzellen wird durch komplexe Mechanismen reguliert, in denen die Wechselwirkungen der Regulations-DNA-Sequenzen mit den trans-wirkenden DNA-Bindungsproteinen eine zentrale Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription stellen die für Interferone (IFN) codierenden Gene ein Merkmal dar, das vielen Cotykingenen eigen ist; die Transkription dieser Gene wird in einem transienten Zustand nach verschiedenen extrazellulären Signalen induziert. Es ist bereits gut dokumentiert worden, daß die Transkription der Gene für IFN-a und IFN-ß in einer Vielzahl von Zellen durch Viren wirksam induziert wird, während die Transkription des für IFN-γ codierenden Gens in T-Lymphozyten (T-Zellen) nach mitogener Stimulierung induziert wird (siehe Weissmann und Weber, 1986; Taniguchi, 1988).