-
DNA-Sequenz eines neuen Interferon-α1, rekombinantes Plasmid
und Transformand, welche beide die DNA-Sequenz enthalten Die Erfindung betrifft
die DNA-Sequenz eines neuen Human-Interferon-α1 (im folgenden als IFN-α1
bezeichnet).
-
IFN-α-Spezies werden im allgemeinen von Zellen, üblicherweise
Leukocyten, gebildet, die mit induzierenden Viren, wie Sendai-Virus, New Castle-Disease-Virus
und Grippevirus, behandelt worden sind. Es wird angenommen, dass IFN-α-Spezies
ein wirksames Mittel in der Behandlung verschiedener durch Viren verursachter Erkrankungen
darstellen, wie z.B. bei Häpatitis Bund Kerato-Konjunktivitis Epidemica.
-
In letzter Zeit wurden ausgedehnte Analysen von IFN-α-Genen
im molekularen Bereich sowie zur Beziehung zwischen Struktur derselben und deren
physiologischen Aktivitäten durchgeführt. Die bisher veröffentlichten Erkenntnisse
weisen darauf hin, dass IFN-α-Gene heterogen sind und dass auf dem menschlichen
Chromosom mindestens 20 IFN-o&-Gene existieren. Das erfolgreiche Clonieren von
13 dieser Gene, zusammen mit deren DNA-Sequenzen, wurde bereits publiziert. Die
Ergebnisse weisen darauf hin, dass die spezifische physiologische Aktivität von
IFN-ot und dessen Aktivitätsgrad von verschiedenen Faktoren abhängen, wie z.B. der
Aminosäuresequenz des Interferons.
-
IFN-α1 stellt einen Subtyp von IFN-α dar. Die DNA-Sequenz
einer Spezies von IFN-α ist bekannt (nicht geprüfte, veröffentlichte japanische
Patentanmeldung Nr. 150100/1981, welche mit US-PS 4 530 901 und EP-B-32123 korrespondiert).
-
Die vorliegende Erfindung betrifft die DNA-Sequenz eines neuen Human-IFN-α1,
welches eine neue Aminosäuresequenz kodiert, die sich von der der bekannten IFN-α1,
unterscheidet. Es wird angenommen, dass aufgrund des Unterschiedes in den Aminosäuresequenzen
das IFN-oL gemäss der vorliegenden Erfindung physiologische Aktivitäten besitzt,
die sich von denen der bekannten Spezies von IFN-α1 unterscheiden.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die DNA-Sequenz eines IFN-
°21 wobei die genannte DNA-Sequenz ein
Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz kodiert: 10 CY-S
ASP LEU PRO GLU THR HIS SER LEU ASP ASN 20 ARG ARG THR LEU MET LEU LEU ALA GLN MET
SER 30 ARG ILE SER PRO SER SER CYS LEU MET ASP ARG 25 40 HIS ASN PHE GLY PHE PRO
GLN GLU GLU PHE ASP so GLY ASN GLN PHE GLN LYS ALA PRO ALA ILE SER 60 VAL LEU HIS
GLU LEU ILE GLN GLN ILE PHE ASN o LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP 80
ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU 90 LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU
ALA CYS 100 110 VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO 120 LEU MET ASN VAL
ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS 130 LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR 140
GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL 100 VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER
LEU SER LEU 160 SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS 166 GLU Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz eines IFN-α mit der folgenden
Sequenz von Nukleotidbasen:
TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGA
CCTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTC CTCCTGTCTGATGGACAGACATAACTTTGGATTTCCCCAG
GAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCA TCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCT
CTTTACCACAAAAGATTCATC TGCTGCTTGGGATGAGGAC CTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGA
ATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGG AGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTG
AAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGA AGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGA
AATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAA AGATTAAGGAGGAAGGAA Das bekannte IFN-ot
1 weist Asparaginsäure als Aminosäure 35 auf und die DNA, die für diese Aminosäure
kodiert, ist GAC. Das IFNU 1 gemäss der vorliegenden Erfindung weist Asparagin als
Aminosäure 35 auf und die DNA, die für diese Aminosäure kodiert, ist AAC.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein rekombinantes Plasmid,
welches die vorstehend genannten DNA-Sequenz enthält. Im weiteren umfasst die vorliegende
Erfindung einen Transformanden, der erhalten wird, durch Transformieren eines Wirtes
mit dem genannten rekombinanten Plasmid.
-
Fig. 1 zeigt die Spaltstellen von Restriktionsenzymen im cDNA-Insert
in pHL696, wobei die ausgezogene Linie das cDNA-Insert und die gestrichelte Linie
die von pBR322 abgeleiteten Sequenzen darstellt; Fig. 2 gibt einen überblick über
die Ve-rfahren zum Konstruieren eines reifen IFN -itGens; Fig. 3 zeigt ein Verfahren
zur Herstellung der translationalen Initiationsstelle; Fig. 4 gibt die DNA-Sequenz
der translationalen Initiationsstelle von IFN-0t1 in dem Plasmid, das von Clon Nr.
11 stammt, wieder; Fig. 5 zeigt die Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmids
pIα1 tacl; und Fig. 6 zeigt die Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmids
pIct1 tac2.
-
Die DNA-Sequenz von IFN-α1 gemäss der vorliegenden Erfindung
kann nach den folgenden Verfahren hergestellt werden.
-
Menschliche periphere Leukozyten, die sich zur Herstellung von IFN-oC
eignen, werden mit aus Leukozyten stammendem IFN einem Priming unterworfen, wie
z.B. einem von menschlichen Leukozyten stammenden IFN, das durch Fraktionierung
mit Ethanol erhalten wird, wie dies in Tissue Culture Association: In Proceeding
of a Tissue Culture Association Work Shop in Vitro Article Nr. 3 (1973) und Adsorption
an Silicagel, wie in US-PS 4 526 782 offenbart, beschrieben wird, und welche dann
mit einem geeigneten Induzierer, wie Sendai-Virus, behandelt und kultiviert werden.
Die gezüchteten Zellen werden homogenisiert und es wird eine IFN-OU-kodierende mRNA
extrahiert. Unter Verwendung der extrahierten mRNA wird, z.B. unter Verwendung von
reverser Transcriptase eine einzelstrangige cDNA synthetisiert. Eine doppelstrangige
DNA, die von der cDNA abgeleitet ist, wird in einen geeigneten Clonierungsvektor,
wie pBR322 pUC9, pAT153, pJDB207 und pUC8 insertiert. Das erhaltene rekombinante
Plasmid wird dazu verwendet, einen geeigneten Wirtsmikroorganismus, wie z.B. E.
coli, Hefen und Bacillus subtilis, zu transformieren.
-
Nach dem Screenen auf einen geeigneten Marker, wie Arzneimittelresistenz,
werden die Transformanden einer Kolonie-Hybridisierung oder einer Behandlung der
Plasmid-DNA mit Restriktionsenzymen unterworfen, um ein Plasmid zu isolieren, das
IFN-QL -cDNA enthält. Als Ergebnis dieser Verfahren erhält man eine doppelstrangige
DNA, die für IFN-oC, kodiert. Die Basensequenz dieser doppelstrangigen DNA kann
z.B. mit Hilfe der Maxam-Gilbert-Methode (Maxam, A. und Gilbert, W., 1979, Methods
in Enzymology 65, 499-560) bestimmt werden, um die Existenz des IFN-oL -Gens zu
bestätigen.
-
Ein rekombinantes Plasmid, welches die auf diese Weise erhaltene IFN-CL
1-DNA-Sequenz enthält, kann nach den folgenden Verfahren hergestellt werden.
-
Das gesamte oder ein Teil des IFN-OC -Gens wird vom Clon abgespalten
und - sofern gewünscht - wird der translationale Initiationscodon an die translationale
Initiationsstelle angebracht. Ausserdem kann ein geeigneter Promotor in Stromaufwärtsrichtung
der Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz gebunden werden. Geeignete Promotoren umfassen einen
trp-Promotor, lac-Promotor, Amylasepromotor, SV 40-Promotor, ;<-Phagen-Promotor
und einen tufB-Promotor, sowie deren Hybrid-Promotoren, wie z.B. einen tac-Promotor.
Das IFN- oU1-Gen, an welches der translationale Initiationscodon oder Promotor angebracht
werden kann, wird in einen geeigneten Clonierungsvektor, wie pUC9 und pBR322, insertiert,
wodurch das gewünschte rekombinante Plasmid hergestellt wird.
-
Ein Transformand kann erhalten werden, indem man einen geeigneten
Wirt mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid mittels konventioneller Verfahren
transformiert (Mandel, M. und Higa, A.: J. Mol. Biol., 53, 154 (1970) und Hanahan,
D.: J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)). Illustrative Wirte umfassen E. coli, Hefen,
Bacillus subtilis und tierische Zellen, wie COS, CH0, L und Vero; wobei E. coli
bevorzugt ist.
-
Der auf diese Weise erhaltene Transformand wird in einem Medium, das
üblicherweise für den Wirt verwendet wird, kultiviert. Nach dem Kultivieren werden
die Zellen
gesammelt und z.B. in einer Pufferlösung suspendiert
(z.B. 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 30 mM NaCl und 6 mM EDTA).
-
Die Zellen werden aufgebrochen und unter Erhalt eines überstandes
zentrifugiert. Das IFN-061 in dem überstand kann mit Hilfe von Anti-IFN-O6-polyclonalen
Antikörpern und/oder Anti-IFN-ol--monoclonalen Antikörpern gereinigt werden.
-
Die auf diese Weise hergestellte DNA-Sequenz kodiert nachweislich
für ein IFN-uL 1 -Polypeptid, das sich von der bekannten IFN-Aminosäuresequenz im
Hinblick auf die Aminosäure in Position 35 unterscheidet. Die genannte DNA-Sequenz
erlaubt die Zurverfügungstellung eines neuen IFN-α1-Derivats und befriedigt
damit einen Bedarf nach einer Vielfalt an Methoden zur IFN-Entwicklung.
-
Das folgende Beispiel soll die vorliegende Erfindung näher erläutern,
ohne dabei diese zu beschränken. Es wurden mehrere bekannte Restriktionsenzyme in
dem Beispiel verwendet, z.B PvuII, HincII, Sau3AI, HinfI, BamHI, HaeII, HaeIIIund
BglII, erhalten von Takara Shuzo Co., Ltd.; EcoRI und PstI, erhalten von Nippon
Gene Co., Ltd.; und DdeI, erhalten von BRL. Die in dem Beispiel verwendete T4-DNA-Ligase
wurde von Takara Shuzo Co., Ltd., erhalten.
-
BEISPIEL (1) Extraktion von mRNA 10 Leukozyten (10 Zellen) die abgetrennt
wurden aus menschlichem peripheren Blut, wurden einem Priming mit 100 I.E./ml menschlichem
Leukocyten-IFN, das erhalten wurde durch Fraktionierung mit Ethanol (In Proceeding
of a Tissue Culture Association Work Shop In Vitro, Article Nr. 3 (1973)) in einem
5 % (G/V) Plasmanat enthaltenden MEM-Medium unterworfen, und mit 200 HA/ml Sendai-Virus
zur Induktion 4,5 bis 5 Stunden lang behandelt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation
bei 3.000 Upm (20 Minuten) gesammelt und 1 x 1010 bis 10 3 x 10 Zellen wurden in
einer Lösung aus 4 M Guanidinthiocyanat (Gu'HSCN), 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, und 0,1
M 2-Mercaptoethanol homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 bis 20 ml einer Lösung,
die 5,7 M Cäsiumchlorid und 0,1 M EDTA enthält, in einem Polyaroma-Gefäss für einen
Beckmann 60 Ti-Rotor überlagert und bei 30.000 Upm und 15 0C 17 Stunden lang zentrifugiert,
wobei ein RNA-Niederschlag erhalten wurde. Der RNA-Niederschlag wurde in 15 bis
20 ml einer Lösung aus 6 M Guanidin-Hydrochlorid (Gu HCl), 10 mM EDTA, pH 7,0, und
10 mM Dithiothreitol suspendiert, 3 Minuten auf 680C erwärmt und mit Eiswasser abgekühlt.
Nach Zugabe von 0,04 Volumen 1 N Essigsäure und 0,5 Volumen Ethanol wurde das Gemisch
2 Stunden bei -800C stehen gelassen und unter Erhalt eines RNA-Niederschlages zentrifugiert.
-
Diese RNA wurde mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in 0,01
M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) aufgelöst,
3 Minuten auf 65 0C
erwärmt, rasch abgekühlt und mit 1/9 Volumen 5 M NaCL vermischt. Das Gemisch wurde
einer Säulenchromatografie auf oligo(dT)-Cellulose unterworfen, um auf diese Weise
poly(A)RNA in konzentrierter Form zu erhalten. Die aktiven poly(A)RNA-Fraktionen
wurden mit Ethanol präzipitiert und mittels 8 bis 30 %-iger (G/G) Sucrosedichtegradientenzentrifugation
angereichert (SW 41Ti Rotor bei 22.000 Upm und 50C, 17 Stunden).
-
Durch physikalische Fraktionierung wurden sechs Fraktionen erhalten;
ein Teil der RNA aus jeder Fraktion wurde in einen Xenopus laevis Oocyt zur Messung
der Aktivität des synthetisierten IFN-oU unter Verwendung eines RPHA-Reagens von
Green Cross Corporation injiziert. Es wurde festgestellt, dass die Fraktion 3 (12
bis 15S) eine Aktivität im Bereich von 2.600 bis 4.000 RNA aufwies.
-
(2) Synthese von cDNA Reaktionslösung I (133/um) der nachstehend angegebenen
Zusammensetzung wurde unter Verwendung von 201zug der in (1) hergestellten RNA bereitet.
Die Lösung wurde mit Eis 5 Minuten lang gekühlt und dann 10 Minuten auf 460C erwärmt.
Nach Deproteinisierung mit Phenol wurde die Lösung 20 Minuten bei 700C mit 0,1 N
NaOH behandelt, um die RNA zu denaturieren (degrade).
-
REAKTIONSLöSUNG I Tris-HCl, pH 8,3 50 mM KC 1 70 mM Mg 12 10 mM dATP,
dCTP, dGTP und TTP (Boehringer) je 0,5 mM 06-32P-dCTP (Amersham) 50 uCi Dithiothreitol
0,2 mM 0ligo(dT)1218(CRI) 25 /ug/ml mRNA 150 /ug/ml AMV-reverse Transcriptase 800
E/ml H20 bis auf 133 ul (3) Synthese von doppelstrangiger DNA Die in (2) erhaltene
cDNA wurde in 100 µl einer Lösung aus 200 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 20 mM MgCl2,
2 mM Dithiothreitol und 0,5 mM jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP aufgelöst. Nach
Wärmebehandlung während 2,5 Minuten bei 580 C wurde die Lösung 2 Minuten bei 10.000
Upm zentrifugiert; zu dem erhaltenen überstand wurden 22 Einheiten DNA-Polymerase
I Klenow-Fragmente bis auf ein Gesamtvolumen von 200 µl zugegeben. nachdem die Reaktion
über Nacht bei 15°C fortgesetzt wurde, wurde das Gemisch mit Phenol deproteinisiert,
und Glycerin wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 x (V/V) zugegeben. Das Gemisch
wurde auf eine Sephadex G-100-Säule aufgegeben und mit einer G-100-Pufferlösung
eluiert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA und 100 mM NaCl).
-
Fraktionen von jeweils 5 Tropfen wurden zur Bestimmung ihrer Radioaktivität
vermessen. Die Maxima der Radioaktivität wurden miteinander vereinigt und die DNA
mit Ethanol ausgefällt.
-
Die erhaltene doppelstrangige DNA wurde in 72 1ul Wasser aufgelöst
und zu 0,2 Volumen einer 5 x S1 Nuklease-Pufferlösung (0,167 M Natriumacetat, pH
4,5, 5 mM ZnCl2) gegeben. Nach Zugabe von 0,02 Einheit/7 µL S1-Nuclease wurde das
Gemisch 5 Minuten auf 37°C erwärmt.
-
Nach Beendigung der Reaktion wurde die DNA mit dem gleichen Volumen
(1101um) Wasser-gesättigtem Phenol/ Chloroform (1:1) extrahiert; die erhaltene Lösung
wurde mit Ethanol unter Bildung eines Niederschlages behandelt.
-
Der erhaltene Niederschlag wurde in einem TE-Puffer (10 mM Tris, 1
mM EDTA, pH 8,0) aufgelöst, 3 Minuten auf 65°C erwärmt und mit Eiswasse rasch abgekühlt.
-
Diese abgekühlte Lösung wurde auf einen 5 bis 25 %-igen (G/V) Sucrosedichtegradienten
überschichtet und mit einem Spinco SW41 Ti-Rotor 17,5 Stunden bei 38.000 Upm und
4°C zentrifugiert. Die Radioaktivitäten der 20 Fraktionen, die nach der Zentrifugation
erhalten wurden, wurden gemessen und die hochaktiven Fraktionen miteinander vereinigt.
Das Gemisch wurde mit Ethanol unter Bildung eines Niederschlages vermischt; der
Niederschlag wurde mit 70 %-igem (V/V) Ethanol gewaschen und getrocknet.
-
Diese Verfahren führten zu einer doppelstrangigen DNA.
-
(4) dC-Tailing Die in (3) hergestellte doppelstrangige DNA (162 ng),
dCTP im 5.000-fachen molaren Uberschuss des 3'-OH-Endes und 5/ul eines 10 x TdT-Puffers
(1,4 M Kaliumcacodylat, 0,3 M Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM COCl2, 1 mM Dithiothreitol)
wurden vermischt und ein Gesamtvolumen von 50 ,ul wurde 2 Minuten auf 37 0C erwärmt.
Daraufhin wurden 45 Einheiten einer .terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase zugegeben
und das Gemisch 1 Minute auf 37 0C erwärmt; daraufhin waren 21,5 dC-Reste an das
3'-OH-terminale Ende der doppelstrangigen DNA gebunden. Extraktion mit Phenol und
DNA-Präzipitation mit Ethanol wurden ausgeführt, wobei die doppelstrangige DNA mit
dC-Schwanz erhalten wurde.
-
(5) Spaltung des E. coli-Plasmids und Zugabe von dG-Schwanzstücken
E. coli-Plasmid pBR322 (6/ug) wurde einer 2-stündigen Reaktion bei 370C in einer
PstI-Reaktionslösung (12 Einheiten PstI, 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 M MgCl2,
0,05 M (NH4)2S04) unterworfen.
-
Das erhaltene PstI-abgebaute pBR322 (4 pMol) wurde mit dGTP (12 nMol)
und 10/kl 10 x TdT-Puffer vermischt.
-
Insgesamt 100/ul des Gemisches wurden 2 Minuten bei 370C stehen gelassen.
Daraufhin wurden 84 Einheiten teminaler Desoxidyltransferase zugegeben und das Gemisch
105 Sekunden auf 37°C erwärmt; daraufhin waren ca.
-
18 dG-Reste an das Plasmid gebunden. Extraktion mit Phenol und Präzipitation
mit Ethanol wurden durchgeführt, um pBR322 mit einem dG-Schwanzstück zu isolieren.
-
(6) Verschweissen und Transformieren von E. coli Die in (3) hergestellte
doppelstrangige DNA (0,25 pMol) mit dC-Schwanzstuck, das in (4) hergestellte pBR322
(0,025 pMol) mit dG-Schwanzstück und 15/ul 10 x Verschweiss-Puffer (100 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 1 M NaCl, 25 mM Na 2EDTA) wurden auf insgesamt 600 /ul eingestellt und das
Gemisch 10 minuten auf 70°C erwärmt. Dauraufhin wurde das Gemisch Langsam über 24
Stunden von 70°C auf 370C abgekühlt, wodurch die Verschweissreaktion abgeschlossen
wurde. Die erhaltene DNA wurde dazu verwendet, E. coli RR1 nach dem in J. Mol. Biol.
53, 154 (1970) beschriebenen Verfahren zu transformieren; 74.000 Tetracyclin-resistente
und Ampicillin-empfindliche Clone wurden selektiert.
-
(7) Selektieren von cDNA-haltigen Plasmiden Sonden aus mRNA (wie in
(1) erhalten) wurden nach dem Verfahren von Maizels (N. Maizels, Cell, 2, 431-438
(1976)) hergestellt. Die Mengen der verwendeten mRNA, die Dauer der Hydrolyse und
die Mengen an /;P-32P7ATP sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefasst.
TABELLE
1 1 2 3 mRNA 4 µg 4 µg 2 µg Hydrolyse 90°C, 3 Min 90°C, 3,5 Min 90°C, 3,5 Min [γ-32p]ATP
165 µCi 250 µCi 125 µCi Polynucleotid Kinase NEB**, 10 Einh. Boe**, 21 Einh. NEB**,
16 Einh.
-
Ausbeute an (+)mRNA 2,42x107 cpm* 2,65x107 cpm* 1,72x107 cpm* mRNA
(-)mRNA 1,80x107 cpm* 2,46x107 cpm* 1,13x107 cpm* cpm* : Cerenkov-Counts NEB** :
erhältlich von new England Bolabs Boe*** : erhältlich von Boehringer
Als
Ergebnis der Kolonien-Hybridisation unter Verwendung der erhaltenen / P/mRNAs als
Sonden wurden 894 Clone selektiert. Diese wurden einer weiteren Selektion mit Hilfe
von Restriktionsenzymen unterworfen. Goeddel et al berichtete in Nature, 290, 20-26
(1981) über die Basensequenz von IFN-OC1 und die Grössen der mit Hilfe verschiedener
Restriktionsenzyme erhaltenen Fragmente, wie sie aus dieser Basensequenz (siehe
nachfolgende Tabelle 2) hervorgehen. DNAs wurden aus den Clonen, die mittels Kolonien-Hybridisation
selektiert wurden, extrahiert und die extrahierten DNAs wurden mit verschiedenen
Restriktionsenzymen (Tabelle 3) abgebaut. Eine Selektionierung auf DNAs, die die
in Tabelle 2 aufgeführten Fragemente ergeben,zeigte, dass das Plasmid, bezeichnet
als pHL696, Fragemente von im wesentlichen den gleichen Grössen ergab.
-
Deshalb wurde pHL696 in grossen Mengen geclont und die Restriktionsenzym-Karte
aufgestellt (Fig. 1); diese Karte war mit der vorhergesagten Karte identisch.
-
TABELLE 2 oL1 PvuII 301 Bg LII BglII + PvuII 215, 86 PvuII + HincII
301 BglII + EcoRI 372 PvuII + EcoRI 301, 294 - : kein Fragment erhalten N.B. die
Zahlen betreffen Basenpaare TABELLE 3 pHL 156 pHL470 pHL 684 pHl 696 PvuII --- ---
--- --- 295 BgLII BglII+PvuII 89 90 92 85 210,85 PvuII+HincII NT NT NT NT NT BgLII+EcoRI
380 380 NT 380 390 PvuII+ECORI NT NT 290 NT NT - : kein Fragment erhalten NT : nicht
getestet N.B. : die Zahlen betreffen die Basenpaare
Die komplette
Basensequenz des IFN- 1 -Strukturgens wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt
und ist nachfolgend wiedergegeben: TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGA CCTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTC
CTCCTGTCTGATGGACAGACATAACTTTGGATTTCCCCAG GAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCA
TCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCT CTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGAC
CTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGA ATGACTTGGÄAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGG
AGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTG AAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGA
AGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGA ÁATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAA
AGATTAAGGAGGAAGGAA (8) Konstruktion des reifen IFN-α1-Gens Aus dem in pHL696
geclonten IFN-α1-Gen wurde die für die Signalsequenz kodierende Region weggelassen
und der Protein-Initiierungscodon ATG gebunden. Eine übersicht dieser Verfahren
ist in Fig. 2 und 3 gezeigt.
-
Genauer gesagt bedeutet dies: pHL 696 (4981zug) wurden mit Sau3AI
abgebaut und ein 176 bp Fragment wurde mittels 6 %-igem (G/V) PAGE abgetrennt. Das
abgetrennte Fragment wurde unter Verwendung von DEAE-Cellulosepapier wiedergewonnen.
Dieses Fragment (8,2/um) wurde mit HinfI abgebaut und mittels 10 %-igem (G/V) PAGE
unter Erhalt eines 64 bP Fragmentes abgetrennt (1,5/ug). 500 pMol von 11 mer GATCACACATG,
markiert mit P am 5'-Terminus (Produkt von Celltech) wurden mit 500 pMol 11 mer
GATCCATGTGT (Produkt von Nippon Zeon Co., Ltd.) und 1,5/ug des 64 bp Fragmentes
vermischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten auf 650C erwärmt und rasch abgekühlt. Zu
diesem abgekühlten Gemisch wurde ein Legierungspuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6
mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP) zugegeben und die Reaktion über Nacht
bei 16°C durchgeführt. Daraufhin erfolgte Extraktion mit Phenol/Chloroform und Präzipitation
der DNA mit Ethanol.
-
Der DNA-Niederschlag wurde 1 Stunde mit 30 Einheiten HinfI bei 37
0C abgebaut. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte mittels 10 %-igem (G/V) PAGE;
die Existenz eines Fragmentes der gewünschten Grösse (75 bp) wurde bestätigt. Dieses
Fragment wurde unter Verwendung von DEAE-Cellulosepapier wiedergewonnen. Das genannte
Fragment wies eine Radioaktivität von 2,34 x 106 cpm auf.
-
Das Fragment wurde mit 60 Einheiten DdeI abgebaut und 10 %-igem (G/V)
PAGE unterworfen. Es wurde ein Schnitt aus einem Gel hergestellt, der dem gewünschten
28 bp entsprach,und auf DEAE-Cellulosepapier adsorbiert. Das durch Elution gewonnene
Fragment wies eine Radioaktivität
von 2,04 x 105 cpm auf.
-
Ein anderer Teil (10/zug) von pHL696 wurde mit PstI und DdeI abgebaut
und ein Fragment der Grössenordnung 829 bp isoliert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI
unter Erhalt von 250 ng eines 549 bp Fragmentes abgebaut.
-
Der gesamte Bereich des 18 bp Fragmentes wurde mit 125 ng des 549
bp Fragmentes ligiert; DNA-Trennung erfolgte mit 5 %-igem (G/V) PAGE. Eine Bande,
entsprechend der Grösse in der Nähe der gewünschten 567 bp wurde nachgewiesen. Die
aus dieser Bande extrahierte DNA wies eine Radioaktivität von 1,49 x 104 cpm auf.
-
Plasmid pBR322 wurde mit EcoRI und BamHI behandelt und ein 3985 bp
Fragment, welches ein Ampicillin-Resistenzgen (Apr) umfasste, wurde isoliert. Ein
Teil (340 ng) dieses Fragmentes wurde mit dem gesamten Anteil der 567 bp Fraktion
ligiert, wobei 5,6 Einheiten T4 DNA-Ligase verwendet wurden. Beim Transformieren
von RR1, ein Stamm von E. coli, mit dem gesamten Anteil der Reaktionslösung, wurden
ca. 4.000 Apr-Transformanden erhalten Plasmid-DNAs wurdenaus den Transformanden
mit Hilfe des "Miniprep"- Verfahrens (Birnboim, H. und Doly, J.
-
: Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979)) extrahiert und solche mit einem
567 bp EcoRI-BamHI-Fragment wurden selektiert. Von den getesteten 120 Clonen besassen
118 eine Plasmid-DNA, die annähernd ein 567 bp EcoRI-BamHI-Fragment aufwies.
-
Vier von diesen 118 Clonen wurden mit Restriktionsenzymen
analysiert
und es ergab sich eine grosse Wahrscheinlichkeit, dass sämtliche vier Clone die
gewünschte Plasmid-DNA aufwiesen.
-
Aus diesem Grunde wurde die Plasmid-DNA in einem selektierten Clon,
der als Clon Nr. 11 bezeichnet wurde, mit Hilfe der "geklärten Lysat"-Methode (Clewell,
D.B.
-
und Helinski, D.R.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 62, 1159 (1969))
hergestellt, und der folgende Identifikationstest durchgeführt.
-
Die von Clon Nr. 11 abgeleitete Plasmid-DNA wurde mit mehreren Restriktionsenzymen
behandelt und die Grössen der erhaltenen Fragmente mit 6 %-igem (G/V) PAGE gemessen.
-
Das Plasmid in Clon Nr. 11 ergab Fragmente der gleichen Grösse wie
die für das gewünschte Plasmid (siehe Tabelle 4).
-
TABELLE 4
| Fragmentgröse (Basenpaare) - gefunden Werte |
| Fragment Miniprep geklärtes Lysat vorhergesagter Wert |
| BamHi + EcoRI 548 542 567 |
| BamHi + EcoRI + BgLII 193,368 194,368 195,372 |
| EciRI + BgLII + PvuII 84, 284, 372* 86,286 |
| BamHi + PvuII + BgLII 86,196 86,195 |
| BamHi + PvuII 87 86 |
| BamHi + PvuII 277 281 |
| BamHi + PvuII 285 286 |
N.B.: das mit * bezeichnet Fragment ergab sich aus einem teilweisen Abbau mit PvuII
Wenn
dieses Fragment mit DdeI abgebaut wurde, so wurden zwei DdeI-Fragmente (1223 bp,
621 bp) identifiziert, die für das gewünschte Plasmid charakteristisch sind. Die
Plasmid-DNA von Clon Nr. 11 wurde als pIα1 bezeichnet.
-
Nach Markierung der BglII-Stelle mit P wurde dieses Plasmid mit HincII
gespalten und die Basensequenz des erhaltenen 470 bp Fragmentes nach der Maxam-Gilbert-Methode
bestimmt. Ein Teil der Basensequenz dieses Fragmentes ist in Fig. 4 gezeigt. Die
bestimmte Sequenz stimmte mit der vorhergesagten überein.
-
(9) Herstellung eines Plasmids zur Expression in E. coli (Eine Übersicht
der Präparationsverfahren ist in Fig. 5 wiedergegeben) (a) Isolierung von Fragmenten
Plasmid pIα1 wurde mit EcoRI und BamHI abgebaut und 73,8 µg des gewünschten
567 bp Fragmentes durch Elektrophorese mit 1 %-igem (G/V) Agarosegel abgetrennt.
-
Plasmid pDR540 (107 µg, erhalten von PL.
-
Biochemical), wurde mit BamI und HindIII abgebaut; 8,46 µg des gewünschten
91 bP Fragmentes, welches einen tac-Promotor enthielt, wurden erhalten.
-
Ein anderer Teil (37,5 µg) von pDR540 wurde mit BamHI und EcoRI abgebaut,
wobei 1,98 µg
des gewünschten 371 bp Fragmentes erhalten wurden.
-
Der 3'-terminale Bereich von pHL696, einschliesslich der AATAAA-Sequenz
wurde mit EcoRI und BglI abgebaut, wobei 14,6 µg eines 380 bP Fragmentes erhalten
wurden.
-
Plasmid pBR322 (5,65/ug) wurde mit EcoRI und PstI behandelt, wobei
2,81 µg eines 3610 bp Fragmentes, welches ein Tetracyclin-Resistenzgen (Tcr) erhielt,
erhalten wurden. Ein anderer Anteil vonpBR322 wurde mit EcoRI und HindIII abgebaut
und ein Teil des abgebauten Plasmids wurde zu 10 %-igem (G/V) PAGE zugegeben, um
zu bestätigen, dass ein vollständiger Abbau erfolgt war. Anstelle einer Abtrennung
des Fragmentes wurde der Rest der Reaktionslösung unmittelbar mit BAP (bakterielle
alkalische Phosphatase, Produkt von BRL) zur Verwendung bei der nachfolgenden Ligierung
behandelt.
-
(b) Herstellung von Plasmid pIα1 tacI zur Expression in E. coll
Zunächst wurden 7,5 µg des Fragmentes (567 bp), welches das IFN-OL -Gen umfasste,
mit 4,5 µg des Fragmentes (380 bp) einschliesslich der AATAAA-Sequenz ligiert. Das
Ligierungsprodukt wurde mit jeweils 80 Einheiten PstI und BamHI behandelt und das
gewünschte 847 bP Fragment
mit 4,5 %-igem (G/V) PAGE abgetrennt.
Dieses Fragment wurde mit BAP behandelt und mit 1/ug 371 bp Fragment (welches den
tac-Promotor/ Operator und die SD-Sequenz enthält) ligiert.
-
Das Legierungsprodukt wurde mit 5 Einheiten PstI abgebaut; die Analyse
mit 4,5 %-igem (G/V) PAGE zeigte die Existenz eines Fragmentes mit einer Grösse,
die ähnlich der gewünschten Grösse war (1218 bp). Dieses Fragment wurde gewonnen
und mit 200 ng eines pBR322 EcoRI-PstI-Fragmentes (3610 bp) ligiert. Das Ligierungsprodukt
wurde zur Transformierung von E. coli JM103 verwendet. Es wurden 600 Tetracyclin-resistente
Transformanden erhalten.
-
Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanden mit Hilfe des "Miniprep"-Verfahrens
hergestellt und mit verschiedenen Restriktionsenzymen analysiert; es bestand ein
Hinweis darauf, dass einer der Transformanden das gewünschte Plasmid enthielt. Reine
"geklärte Lysate" des Plasmids in diesem speziellen Transformanden wurden im weiteren
untersucht und die durch Behandlung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhaltenen
Fragmente wiesen Grössen auf, die in guter übereinstimmung mit den vorhergesagten
Werten waren (siehe Tabelle 5). Aus diesem Grunde wurde dieses Plasmid als pIK1
tac1 bezeichnet.
TABELLE 5
| Fragmentgrösse (bp) |
| Fragment gefundener Wert vorhergesagter Wert |
| EcoRI 955 938 |
| BamHI 740 749 |
| HindIII 334 312 |
| EcoRI + BamHI 380, 386, 563 371, 378, 567 |
| EcoRI + HindIII 36, 229, 645 32, 280, 658 |
| BamHI + HindIII 93, 330, 345 91, 312, 346 |
| PstI + EcoRI 278, 910 280, 938 |
| PstII + BglI 680 652 |
| BgLI + PvuII 84 86 |
| HindIII + BgLII 286, 339 286, 312 |
| HindIII + PvuII 334, 380 312, 372 |
(c) Herstellung des Plasmids pIα1#tac2 zur Expression in
E. coli (Eine übersicht der Präparationsverfahren ist in Fig. 6 aufgezeigt) Zunächst
wurden 5 µg des Fragmentes welches das IFN-Gen umfasste, mit 1,46/ug eines 91 bp
Fragmentes, welches den tac-Promotor/ Operator und die SD-Sequenz enthielt, ligiert.
-
Nach Abbau des Polymeren mit 60 Einheiten HindIII wurde das Ligierungsprodukt
zu 4,5 %-igem (G/V) PAGE zugegeben. Dabei wurde das gewünschte 658 bp Fragment nachgewiesen.
Die Hälfte des gewonnenen Fragmentes wurde mit 118 µg eines BAP-behandel EcoRI-HindIII-FragmeXn-ts
ligiert. Das Ligierungsprodukt wurde zum Transformieren von E. coli JM103 verwendet
und 750 Ampizillin-resistente Transformanden erhalten.
-
Plasmide aus diesen Transformanden wurden mit Hilfe des "Miniprep"
- Verfahrens hergestellt und mit verschiedenen Restriktionsenzymen analysiert; es
bestand ein Hinweis darauf, dass ein Clon das gewünschte Plasmid enthielt.
-
Deshalb wurde das Plasmid dieses Clons mit Hilfe der "geklärten Lysat"-Methode
hergestellt; die durch Behandlung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhaltenen
Fragmente waren in guter übereinstimmung mit den vorhergesagten Werten (siehe Tabelle
6). Dieses Plasmid wurde als pIoU1 tac2 bezeichnet.
-
TABELLE 6
| Fragmentgrösse (bp) |
| Fragment gefundener Wert vorhergesagter Wert |
| BamHI 453 437 |
| BamHI + HindIII 94, 346 91, 346 |
| EciRI + HindIII 665 658 |
| PvuII + HindIII 374 372 |
| BgLII + HindIII 287 286 |
| EciRI + BamHI 434, 562, 1010* 437, 567 |
| BamHI + BgLII 187, 430, 630* 195, 437 |
| EciRI + BgLII 372 372 |
| PvuII + BgLII 85 86 |
| EciRI * PvuII + BgLII 86, 283 86, 286 |
N.B.: Sämtlich Fragmente, die mit einem * gekennzeichnet sind, ergaben sich durch
teilweisen Abbau mit BamHI.
-
(10) Expression des IFN-α1-Gens Die Transformanden JM103/pIα1
tac1 und JM103/pIα1 tac2 wurden über Nacht bei 37°C in Schüttelkultur gehalten
und zwar in einem Medium, welches durch Zugabe von Ampicillin oder Tetracyclin zu
einem LB-Medium (10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl wurden
in 1.000 ml destilliertem Wasser aufgelöst und der pH der Lösung wurde mit 0,1 N
Natriumhydroxid auf 7,5 eingestellt) hergestellt worden war. Ein Teil (0,5 ml) der
Kultur wurde in ein Medium der gleichen Zusammensetzung, wie dies vorstehend beschrieben
ist, inokuliert und bei 370C unter Schütteln kultiviert. Bei OD650 = 1, wurde IPTG
(Isopropyl-n-D-thiogalactosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben.
Die Schüttelkultur wurde fortgesetzt und bei OD650 = 3 wurden die gezüchteten Zellen
aus 40 ml der Kultur gesammelt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und
in 5 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8), 30 mM NaCl, 6 mM EDTA und 10/ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid
suspendiert. Zu dieser Suspension wurde Lysozym bis zu einer Endkonzentration von
1 mg/ml zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei OOC behandelt.
-
Nach 5 Cyclen der Schnellgefrierung und des schnellen Auftauens wurde
die Kultur zweimal zentrifugiert und zwar zunächst 20 Minuten bei 10.000 Upm und
4 0C, dann 1 Stunde bei 40.000 Upm und 4 0C (Spinco SW50.1 Rotor). Die IFN-oC-Aktivität
des erhaltenen überstandes (S-100 sup.) wurde für jeden Transformanden gemessen.
Die gesammelten Kulturzellen wogen 0,18 bis 0,20 9/40 ml Kulturlösung (Nassbasis)
für jeden verwendeten Transformanden.
-
Messungen der IFN-OQ-Aktivität wurden nach der CPE-Methode durchgeführt
(unter Verwendung der FL3-1-Zellinie und Sindbis-Virus, wie vom nationalen Gesundheitsinstitut,
Japan empfohlen). Der Transformand JM103/pIα1 tac1 wies eine Aktivität von
3,8 x 104 I.E./1.000 ml Kulturlösung auf; der Wert für JM103/pIoRi1 tac2 betrug
7,6 x 104 I.E./1.000 ml Kulturlösung.
-
(11) Reinigung von IFN-ot1 Herstellung einer Säule mit monoclonalem
Antikörper: BALB/C-Mäuse wurden mit IFN-α 10 Wochen lang immunisiert. Nach
Bestätigung der Zunahme des Blut-Antikörper-Titers wurden Milzzellen (B-Zellen)
aus jedem Tier extrahiert. Die extrahierten B-Zellen wurden mit einer Maus-Myeloma-Zellinie,
X63-Ag8653 (erhalten von Flow Inc., USA) in Gegenwart von Polyethylenglykol 1000
fusioniert. Kolonien der fusionierten Zellen, die Anti-IFN-°t1-Antikörper bildeten,
wurden selektiert, indem verschiedene Tests durchgeführt wurden, wie z.B. Blutkörperchen-Aggregationsreaktion,
Enzymimmunoreaktion und neutralisierende Antikörperreaktion.
-
Die selektierten Kolonien wurden in der Abdominalhöhle einer Maus
kultiviert und 7 bis 10 Tage danach Ascites abgetrennt. Dieser abgetrennte Maus-Ascites
stellte einen starken Inhibitor der IFN-OL1 -Aktivität dar.
-
Die monoclonalen Antikörper in dem Maus-Ascites wurden an eine CNBr-aktivierte
Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)
gebunden, um auf diese Weise
wasserunlösliche, immobilisierte monoclonale Antikörper herzustellen.
-
10 ml dieser immobilisierten monoclonalen Antikörper wurden in eine
Säule gepackt und der überstand des Lysats mit einer Fliessgeschwindigkeit von 50
ml/h bei Raumtemperatur über diese Säule gegeben. Nachdem 4 insgesamt 4 x 10 I.E.
IFN-oC 1 an die Säule absorbiert waren, wurde letztere mit 0,1 bis 1,0 M NaCl-Lösung
zur Entfernung der Verunreinigungen gewaschen.
-
Daraufhin wurde 3,5 M KSCN-Lösung auf die Säule injiziert, um IFN-α1
in dem Effluent zu gewinnen. Die Ausbeute an IFN-α1 betrug 80 %; die spezifische
Aktivität war 1,5 x 107 I.E./mg.