DE68915375T2

DE68915375T2 - Gen-Expression regulierender Faktor.

Info

Publication number: DE68915375T2
Application number: DE68915375T
Authority: DE
Inventors: Takashi Dr Fujita; Tadatsugu Dr Taniguchi
Original assignee: Taniguchi Tadatsugu
Current assignee: Taniguchi Tadatsugu
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2009-08-18
Also published as: IE892705L; IL91390A; DK415589A; PT91521B; NO178704C; NO178704B; IE940353L; JPH11266886A; PT101697A; EP0359998B1; JP2905506B2; AU4016989A; NO893386L; EP0359998A2; DK415589D0; DE68929344T2; ATE105861T1; ATE208817T1; EP0359998A3; HUT52152A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression. Insbesondere betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das für ein Protein codiert, das die Aktivität des Interferon-Regulator-Faktors-1 (IRF-1) besitzt; rekombinante DNA-Moleküle, die durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert und eine damit operabel verbundene Promotor- und Regulator- sequenz; die Verwendung solcher DNA-Moleküle zur Transformation von Wirtszellen, die außerdem mit DNA-Molekülen transformiert sind, die für ein gewünschtes Protein codieren und sich unter der Kontrolle des IRF-1-aktiven Proteins befinden; solche DNA- Moleküle, die eine Sequenz, die für ein pharmazeutisch aktives Protein codiert, und eine Promotorregion des Gens des Proteins, die eine Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Molekül enthält, umfassen; und die Herstellung des IRF-1-aktiven Proteins und/oder des pharmazeutisch aktiven Proteins durch Kultivierung von geeigneten Wirtszellen, die mit den DNA-Molekülen transformiert sind.
Die Transkription von Genen in Säugerzellen wird durch komplexe Mechanismen reguliert, wobei Interaktionen der regulatorischen DNA-Sequenzen mit trans-wirkenden DNA-bindenden Proteinen eine zentrale Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription besitzen Gene, die für Interferone (IFNs) codieren, ein gemeinsames Merkmal vieler Cytokin-Gene; die Transkription dieser Gene wird vorübergehend als Folge von verschiedenen extrazellulären Signalen induziert. Es ist gut dokumentiert, daß die Transkription der Gene für IFN-α und IFN-β in einer Vielzahl von Zellen effizient durch Viren induziert wird, während die des für IFN-γ codierenden Gens in T-Lymphocyten (T-Zellen) als Folge einer mitogenen Stimulation induziert wird (zur Übersicht siehe Weissmann and Weber, 1986; Taniguchi, 1988).
IFN-β, ein Cytokin, das ursprünglich aufgrund seiner starken antiviralen Wirksamkeit identifiziert worden war, scheint ferner eine entscheidene Rolle bei der Kontrolle des Zellwachstums und der Differenzierung zu spielen. Neben Viren und poly(rI):poly(rC), die die bekannten Induktoren des IFN-β- Gens darstellen, scheinen in dieser Hinsicht viele der Cytokine, wie der Kolonie-stimulierende Faktor-1 (CSF-1) (Moore et al., 1984; Warren and Ralf, 1986; Resnitzky et al., 1986), der Tumor-Necrose-Faktor (TNF) (Onozaki et al., 1988), der von Thrombozyten gebildete Wachstumsfaktor (PDGF) (Zullo et al., 1985) und IFNs (Kohase et al., 1987), ebenfalls IFN-β in bestimmten Zellen zu induzieren, was darauf schließen läßt, daß sie ähnliche oder identische Signale in den Zielzellen transduzieren können.
Es ist gezeigt worden, daß die IFN-β-Gen-Induktion durch Viren und poly(rI):poly(rC) auf der Transkriptionsebene stattfindet (Raji and Pitha, 1983; Ohno and Taniguchi, 1983; Dinter et al., 1933; Zinn et al., 1983). So sind cis-wirkende DNA-Sequenzen, die als induzierbare Enhancer wirken, innerhalb der 5'- flankierenden Region des humanen IFN-β-Gens identifiziert worden (Fujita et al., 1985, 1987; Goodbourn et al., 1985; Dinter and Hauser, 1987). Die induzierbare Enhancer-Region (d.h. -65 bis -105 bezogen auf die CAP-Stelle) enthält repetitive Hexanukleotideinheiten, von denen einige nach Multimerisierung tatsächlich bei der induzierten Aktivierung der Transkription wirken (Fujita et al., 1987). Es wurden in säugerzellen, wie den L929-Zellen der Maus und Human-Zellen, ein Faktor IRF-1, der spezifisch an die IFN-β-Regulatorsequenzen bindet, sowie die funktionellen, Hexanukleotid- Sequenzwiederholungen (AAGTGA)&sub4; identifiziert. Wir haben herausgefunden, daß IRF-1 eine wichtige Rolle bei der Virusinduzierten Aktivierung der IFN-β-Gentranskription durch Interaktion mit den identifizierten cis-Elementen spielt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA- Molekül, das gekennzeichnet ist durch ein Strukturgen der Formel I: Formel I oder der Formel III:
oder ein Fragment, oder eine degenerierte Variante des Moleküls oder des Fragmentes, das für ein Protein codiert, das die Aktivität des Interferon-Regulator-Faktors-1 (IRF-1) besitzt.
Die Erfindung umfaßt weiterhin eine rekombinante DNA-Sequenz, die mit der Antisense-Version eines wie oben definierten, erfindungsgemäßen Moleküls hybridisiert, und die für ein Protein codiert, das IRF-1-Aktivität besitzt.
Unter IRF-1-Aktivität versteht man die Fähigkeit des Proteins, an die sich wiederholende oligomere Sequenz AAGTGA und an die stromaufwärts gelegenen Regulatorelemente des humanen IFN-β- Gens zu binden.
Das DNA-Molekül kann zum Beispiel durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, daß die oben definierte Formel I und stromaufwärts und stromabwärts gelegene flankierende Sequenzen besitzt, die in der folgenden Formel II enthalten sind: Formel II
oder eine degenerierte Variante davon.
Das DNA-Molekül kann zum Beispiel durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, daß die oben definierte Formel III und stromaufwärts und stromabwärts gelegene flankierende Sequenzen besitzt, die in der folgenden Formel IV enthalten sind: Formel IV
oder eine degenerierte Variante davon.
Das DNA-Molekül kann eine konstitutive oder induzierbare Promotorregion enthalten, die zum Beispiel durch ein Virus, z.B. durch das Newcastle Disease Virus, oder durch eine mitogene Stimulation, z.B. unter Verwendung von Concanavalin A, induzierbar ist.
Zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, die IRF-1-Aktivität besitzen, zählen DNA-Sequenzen mit eukaryotischem Ursprung, nicht nur von Mensch und Maus, sondern auch beispielsweise von Huhn, Frosch und Hefe, die mit den DNA-Sequenzen des vorstehenden Hurnan- oder Nager-IRF-1 hybridisieren (Figuren I bis IV) und die für ein Protein codieren, das IRF-1-Aktivität besitzt.
Später wird die Isolierung von cDNA-Molekülen aus Humanzellen und Mauszellen, die für Human- und Nager-IRF-1 codieren, und aus Hefe, die mit der cDNA des Human-IRF-1 hybridisiert, beschrieben.
Das rekombinante DNA-Molekül kann weiterhin eine Promotor- und Regulatorsequenz enthalten, die in der folgenden Formel V enthalten ist: Formel V Schwache Cap-Stelle Starke Cap-Stelle
oder eine degenerierte Variante davon.
Das rekombinante DNA-Molekül kann weiterhin zur Expression eines pharmazeutisch aktiven Proteins, wie einem Cytokin oder einem Plasminogen-Aktivator, bestimmt sein. In dieser Form enthält es vorzugsweise ein Strukturgen für ein gewünschtes pharmazeutisch aktives Protein, das operabel mit einer Promotor-Region des Gens für das Protein, die eine Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Molekül enthält, verbunden ist.
Somit umfaßt ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül eine wie oben beschriebene DNA-Sequenz und ein Strukturgen für ein gewünschtes, pharmazeutisch aktives Protein unter der Kontrolle des IRF-1-aktiven Proteins, das von der DNA-Sequenz codiert ist. In einem solchen rekombinanten DNA-Molekül befindet sich das für das IRF-1-aktive Molekül codierende Gen vorzugsweise unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder am meisten bevorzugt unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Vorzugsweise umfaßt das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch aktive Protein eine IRF- Bindungsstelle, die AAGTGA-Sequenz-wiederholungen enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin eine Wirtszelle, z.B. eine Bakterienzelle, beispielsweise E. coli, oder eine Hefezelle oder eine Säugerzelle, z.B. eine CHO-Zelle oder eine Maus-Zelle, beispielsweise L929, die mit einem oben beschriebenen, rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Idealerweise wird die Wirtszelle aus einer Zellinie ausgewählt, die keine oder im wesentlichen keine endogene IRF-1-Aktivität besitzt.
Alternativ kann zur Herstellung eines pharmazeutisch aktiven Proteins eine Wirtszelle transformiert werden mit einem ersten DNA-Molekül, das eine Sequenz enthält, die für ein Protein codiert, das die Aktivität von IRF-1 besitzt, und mit einem zweiten separaten DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das für ein gewünschtes, pharmazeutisch aktives Protein codiert, das sich unter der Kontrolle des IRF-1-aktiven Proteins befindet, das von dem ersten DNA-Molekül codiert wird. Vorzugsweise umfaßt das erste DNA-Molekül, das für das IRF-1-aktive Molekül codiert, eine konstitutive Promotor- oder am meisten bevorzugt eine induzierbare Promotorsequenz, die funktionsfähig mit dem Gen, das für die IRF-1-aktive Verbindung codiert, verbunden ist. Weiterhin umfaßt das zweite DNA-Molekül vorzugsweise eine Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Protein, die AAGTGA- Sequenzwiederholungen enthält.
Das IRF-1-aktive Protein oder das pharmazeutisch aktive Protein können auf übliche Weise durch Kultivierung der transformierten Zelle und Isolierung des produzierten Proteins hergestellt werden. Geeigneterweise werden die Wirtszellen durch eine Behandlung induziert, die für den Promotor geeignet ist, der operabel mit dem Gen, das für IRF-1 codiert, verbunden ist, was unten diskutiert wird.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Protein mit IRF-1-Aktivität, das durch Kultivierung eines Wirtes, der mit einem oben beschriebenen DNA-Molekül transfomiert ist, erhalten wird.
Ein bevorzugtes Protein mit IRF-1-Aktivität besitzt die Formel VI: Formel VI
Ein weiteres bevorzugtes Protein mit IRF-1-Aktivität besitzt die Formel VII: Formel VII
Später wird die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Nager- und Human-cDNA, die für DNA-bindende Proteine mit IRF-1- Aktivität codieren, beschrieben.
Wie die Analyse der klonierten cDNAs zeigt, kann man eine bemerkenswerte Sequenz-Konservierung zwischen den Nager- und Human-IRF-1-Molekülen erkennen. Weiterhin wird gezeigt, daß die Expression des für IRF-1 codierenden Gens durch das Newcastle Disease Virus (NDV) und durch Concanavalin A (ConA) in Maus-L929-Zellen bzw. Milzlymphocyten induziert wird.

1. Klonierung und Expression der IRF-1-DNA in E. coli

A. Poly(A)&spplus; RNA wurde aus nicht-induzierten Maus L929-Zellen isoliert und zur Synthese von cDNA verwendet (wobei man dem Verfahren nach Aruffo and Seed, 1987 folgte). Die resultierende cDNA wurde sodann in einen mit EcoRI- geschnittenen λgt11-Vektor kloniert, und eine cDNA-Bank wurde gemäß dem Standardverfahren nach Huynh et al., 1985 unter Verwendung von E. coli Y1090 als Wirtsstamm erzeugt.
Die resultierende λgt11-Bank wurde sodann unter Verwendung der multimerisierten (4-fach) AAGTGA-Sequenz (im folgenden als C1-Oligomer bezeichnet; Fujita et al., 1987) als Sonde gescreent.
Bei diesem Screening-Verfahren wurden E. coli Y1090, die mit den rekombinanten λgt11-Phagen infiziert waren, auf 10x13 cm großen viereckigen Schalen ausplattiert. Die Schalen wurden sodann 4 bis 5 Stunden bei 12ºC inkubiert, bis etwa 20 000 Plaques/Schale sichtbar waren.
Als Membranfilter zum Screening wurden entweder Nylon- (Nytran; Schleicher & Schnell) oder Nitrocellulose- Membranen (Schleicher & Schnell) verwendet. Die Filter wurden in IPTG eingetaucht (zur Induktion der lacZ- Genexpression bei den entsprechenden Phagenplaques) und an der Luft getrocknet, sodann auf die Schalen gelegt und 2,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Plaques produzieren nur dann ein Protein, das von der cDNA codiert wird, wenn sich die cDNA in demselben Leserahmen wie das lacZ-Gen befindet.
Sodann wurden die Filter entfernt, 20 Minuten bei 4ºC gekühlt und, ohne sie zu trocknen, dem Screening unterzogen.
Die Membranfilter wurden sodann für den Assay wie folgt präpariert:
Kernextrakt wurde aus Maus-L929-Zellen hergestellt und auf die Membranen getüpfelt (in einer etwa 10 ug Protein entsprechenden Menge).
Bevor man die DNA-Bindung durchführte, wurde ein Bindungspuffer, der aus 10 mM Hepes, pH 7,5, 5,0 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA und 5 % Glycerin bestand, verwendet.
5 % entfettetes Milchpulver (Yukijurishi Inc.) wurde zu dem Puffer gegeben, und die Filter wurden in dem Gemisch 1 Stunde bei 4ºC inkubiert und sodann 1 Minute in dem gleichen Puffer, der aber kein Milchpulver enthielt, gespült.
Die Filter wurden sodann in Bindungspuffer (1 ml) inkubiert, der 350 ug/ml einer Lachssperma-DNA mit einer durchschnittlichen Länge von ungefähr 300 bp und eine ³²p- markierte C1-Oligomer DNA-Sonde (10&sup6; cpm/ml; spezifische Aktivität 2 000 cpm/fmol) enthielt (siehe Fujita et al., 1987). Die DNA-Sonde wurde an den 5'-Termini mit [γ-³²P)ATP unter Verwendung von T4-Kinase endmarkiert.
Nach der Bindung wurden die Filter bei Raumtemperatur 1 bis 2 Stunden mit dem Bindungspuffer (10 ml/Filter) gewaschen, wobei der Bindungspuffer mehrfach während dieses Vorgangs gewechselt wurde. Die Filter wurden sodann an der Luft getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen. Bei diesem Assay ergaben die Nylon-Membranen, aber nicht die Nitrocellulose-Membranen, ein positives Signal, das spezifisch durch die Aufnahme von überschüssigem, unmarkiertem C1-Oligomer inhibiert wurde.
Etwa 1,4x10&sup6; Rekombinanten wurden auf diese Weise gescreent. Unter den 32 positiven Phagen-Klonen, die bei dem ersten Screening identifiziert wurden, fand man einen Klon (bezeichnet als λL28-8), an den wiederholt die DNA- Sonde in nachfolgenden Screening-Runden band.

2. Herstellung und Reinigung des Proteins aus transfizierten E. coli

Lysogene bakterielle Klone wurden durch Transfektion von E.coli Y1089 mit λL28-8 hergestellt. Lysogene Klone, die über Nacht inkubiert worden waren und λL28-8 enthielten, wurden sodann in einer Konzentration von 1 % in 400 ml L-Brühe überimpft. Man ließ die Bakterien bei 31ºC bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 1 wachsen. Die Temperatur wurde sodann für 20 Min. auf 42ºC erhöht. IPTG wurde dann bis 10 mM zugegeben, und nach einer weiteren 20-minütigen Inkubation bei 38ºC wurden die Kulturen schnell pelletiert und in 10 ml Lysis-Puffer suspendiert, der aus 20 mM Hepes pH 7,9, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 0,1 mM DTT, 10 % Glycerin, 015 mM Phenylmethyonylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug/ml Pepstatin A, 1 ug/ml Leupeptin, 500 uM L-I-Tosylamid-2-phenylethylchlormethylbenzamidin, 10 mM Natriummolybdat, 2 mM Natriumpyrophosphat und 2 mM Natriumorthovanadat bestand. Die Zellsuspensionen wurden drei schnellen Gefrier-Auftau- Zyklen unterzogen, und nachfolgend unter Verwendung eines Beckman 50 Ti-Rotors bei 30 000 UpM 1 Stunde bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde entweder direkt für einen Gel-Retardations-Assay (siehe unten) verwendet oder weiter gereinigt.
Eine weitere Reinigung wurde wie folgt durchgeführt:
Etwa 4 ml des Überstandes wurden auf eine poly(di-C): poly(di-C)-Säule mit einem Bettvolumen von 2 ml appliziert und mit Lysis-Puffer äquilibriert. Der Durchfluß (4 ml) wurde sodann auf eine DE 52 (Whatman)-Säule mit einem Bettvolumen von 2 ml, die mit Puffer Z (25 mM Hepes, pH 7,8, 12,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 20 % Glycerin, 0,1% NP-40, 0,5 mM PMSF) äquilibriert worden war, appliziert. Die DNA-bindende Aktivität wurde mit Puffer Z, der 0,1 M KCl enthielt, eluiert. Das Eluat (ungefähr 4 ml) wurde unter Verwendung einer Centricon-10 (Amicon) weiter konzentriert. Die Proteinendkonzentration betrug 28 mg/ml.

3. Charakterisierung des Proteinproduktes des Klons λL23-8:

(1) Gel-Retardations-Assay

Lysogene bakterielle Klone, die λL28-8 enthielten, wurden durch Transfektion von E. coli Y1089 hergestellt und unter Verwendung des Verfahrens von Huynh et al., 1985 induziert, um klonierte cDNA mit einem hohen Level zu exprimieren. Lysogene Klone, die auf die gleiche Weise mit einem Phagen, dem das cDNA-Insert fehlte (bezeichnet als λ6) hergestellt und behandelt worden waren, wurden als Kontrolle verwendet.
Extrakte, die jeweils 3 ug Protein enthielten, wurden aus den induzierten Kulturen der Lysogene hergestellt (vier Präparationen, die als λL28-8a, λ28-8b und λ6a und λ6b bezeichnet wurden).
Kernextrakt (3 ug Protein) wurde ferner aus Maus-L929- Zellen hergestellt.
Die Extrakte wurden, wie oben beschrieben, mit 1 fmol markierter C1-Oligomer-Sonde inkubiert, die eine spezifische Aktivität Von 8 000 cpm/fmol besaß.
Jeder Extrakt wurde weiterhin einem Kompetitionsassay unterzogen, wobei eine Kompetitor-DNA in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubation gegeben wurde.
Die Resultate des Assays sind in Fig. 1 dargestellt, in der die verschiedenen Laufspuren den folgenden Bedeutungen entsprechen: Laufspur Extrakt ohne Laufspur Extrakt λ6b mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem Cl-Oligomer λ6b mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem C5A-Oligomer* λL28-8b mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem C1-Oligomer λL28-8b mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem C5A-Oligomer* L929 Zellen L929 Zellen mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem C1-Oligomer L929 Zellen mit 1000-fachem molarem Überschuß an nicht markiertem C5A-Oligomer* * Das C5A-Oligomer ist in Fujita et al., 1985, beschrieben und stellt eine 6-fache GAAA- Sequenzwiederholung dar.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß gebundene Sonden in den Laufspuren 6, 7, 9, 10 und 12 detektierbar sind.
Wie in Fig. 1 dargestellt, verursachten Proteinextrakte der λL28-3-Lysogene eine Verlagerung von Banden (Laufspuren 6 und 7), deren Auftreten durch einen Überschuß an nichtmarkierter C1-Oligomer DNA, aber nicht durch die gleiche Menge an C5A-Oligomer inhibiert wurde (Laufspuren 8 und 9).
Im Gegensatz zu von λL28-8-stammenden Proteinen bildeten diejenigen, die aus den induzierten von λ6-stammenden Lysogenen präpariert worden sind, nicht diese verlagerten Banden (Lauf spuren 2-5). Man kann erkennen, daß die verlagerten Banden sehr ähnlich zu denen des natürlichen IRF-1 aus Maus-L929-Zeilen sind (Laufspuren 10 und 12). Die Unterschiede, die zwischen den zwei Sets der verlagerten Banden bestehen, werden als Folge von unterschiedlichen Proteinmengen, die an die DNA-Sonde gebunden sind, angesehen.
Zusätzlich findet man, daß die verlagerten Banden nur bei den Proteinen der IPTG-induzierten Y1089-Zellen, die mit λL28-8 transfiziert worden waren, detektierbar waren.

(ii) DNAse Footprinting-Analyse

Eine Footprinting-Analyse wurde durchgeführt, um die Bindungseigenschaften des von der λL28-8-cDNA codierten Proteins mit einer DNA, die für die stromaufwärts gelegene Region des IFN-β-Gens codierte, zu untersuchen.
Das von der λL28-8-cDNA codierte Protein wurde, wie oben beschrieben, aus dem induzierten Lysogen extrahiert, mittels Säulenchromatographie partiell gereinigt und auf seine Bindungseigenschaften mit einer DNA, die die stromaufwärts gelegene Region des IFN-β-Gens enthielt, hin untersucht.
DNA-Sonden wurden als SalI-HindIII-Fragmente hergestellt, die aus p-125cat (enthaltend das Wildtyp IFN-β-Gen) und aus p-125DPcat (enthaltend ein mutiertes IFN-β-Gen) isoliert wurden. Das Plasmid p-125cat wurde als p-105cat konstruiert (Fujita et al., 1987), mit dem Unterschied, daß das BamHI (-125)-TagI (+19)-Fragment aus pSE-125 (Fujita et al., Cell, Vol. 41, S. 429-496, 1985) verwendet wurde. Das Plasmid p-125DPcat, das Punktmutationen innerhalb der IFN-β Regulatorelemente enthielt, erhielt man durch gezielte Mutagenese mit synthetischen Oligonukleotiden bei p-125cat, was in Hatakeyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 83, Seiten 9650-9654, 1986) beschrieben ist. Beide DNAs wurden an der HindIII-Stelle mit (γ&supmin;³²P)ATP unter Verwendung von T4-Kinase markiert.
4 fmol der DNA-Sonde (sPezifische Aktivität 3 000 cpm/fmol) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 280 ug des gereinigten Proteins in einem 20 ul Reaktionsgemisch inkubiert, das 25 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6,25 mM MgCl&sub2;,50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10 % Glycerin und 2 % Polyvinylalkohol enthielt. Bei dem Assay wurden 5 x 10&supmin;&sup4; Einheiten DNAse I (Worthington) zugegeben und 1 Minute bei 25ºC inkubiert.
Fig. 2 zeigt mit Proben, die unter Durchführung der folgenden Verfahren erhalten wurden, erhaltene Autoradiogramme der DNA- Fragmente. Auf der linken Seite der Fig. 2 ist ein Teil der DNA-Sequenz der Wildtyp-IFN-β-Sonde dargestellt, und auf der rechten Seite der Fig. 2 ist ein Teil der DNA-Sequenz der mutierten IFN-β-Sonde dargestellt.
1. Die Wildtyp-IFN-β-Sonde wurde durch A+G-Reaktionen gespalten (siehe Methods in Enzymology, Band 65, Seiten 499-560) - das Ergebnis ist in Laufspur 1 gezeigt.
2. Die Wildtyp-IFN-β-Sonde wurde ungeschützt partiell mit DNAse I verdaut - das Ergebnis ist in Laufspur 2 dargestellt.
3. Man ließ die Wildtyp-IFN-β-Sonde mit dem Protein reagieren und verdaute sie dann mit DNAse I - das Ergebnis ist in Laufspur 3 dargestellt.
4. Man ließ die Wildtyp IFN-β-Sonde mit dem Protein in Gegenwart eines 1 000-fachen molaren Überschusses an nicht-markiertem C1-Oligomer reagieren und verdaute sie dann mit DNAse I - das Ergebnis ist in Laufspur IV dargestellt.
5. Man ließ die mutierte TFN-β-Sonde mit dem Protein reagieren und verdaute sie dann mit DNAse I - das Ergebnis ist in Laufspur 5 dargestellt.
6. Die mutierte IFN-β-Sonde wurde durch A+G-Reaktionen gespalten - das Ergebnis ist in Laufspur 6 dargestellt.
In Fig. 2 sind die geschützten Regionen, wie sich in den Laufspuren 3 und 5 erkennen läßt, jeweils bei den Sequenzen gekennzeichnet, die auf der linken und rechten Seite des Autoradiogramms dargestellt sind. Die Hexamer-Motive sind eingerahmt.
Den Ergebnissen in Figur 2 kann man entnehmen, daß die geschützte Region den Nukleotiden -100 bis -64 entspricht, das ist die Region, bei der man feststellte, daß sie von IRF-1, das aus L929-Zellen erhalten wurde, geschützt wird. Der Schutz wurde durch Verwendung eines Überschusses an nicht-markiertem C1-Oligomer aufgehoben (Laufspur 4). Man fand weiterhin unter Verwendung von niedrigeren Proteinkonzentrationen heraus, daß ein bevorzugter Schutz in der Region auftrat, die das AAGTGA- Motiv enthielt (-80 bis -70).
Diese Resultate zeigen, daß das Protein eine höhere Affinität zu der Region, die das AAGTGA-Motiv enthält, und eine niedrigere Affinität zu der umgebenden Region besitzt.
Das mutierte IFN-β-Gensegment enthält T- G-Mutationen an den Positionen -106, -100, -73 und -67. Bei einem Vergleich der Laufspuren 5 und 2 erscheint unter den gleichen Assay- Bedingungen der Schutz, der von den rekombinanten Proteinen geboten wird, auf die nichtmutierte Region beschränkt zu sein (Laufspur 2). Diese Beobachtung stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Einführung dieser Mutationen in einer drastischen Reduktion (20-fach) der Induzierbarkeit der Transkription durch NDV in L929-Zellen resultiert, und daß eine in vitro-Bindung von IRF-1 an das mutierte IFN-β-Gen nur in der nichtmutierten Region zu bemerken war.
Weiterhin zeigt die Verwendung des Cl-Oligomers, daß das Protein spezifisch die Region schützt, die die Oligomer-Sequenz enthält. Dieser Schutz ist identisch mit dem, den das native IRF-1, das aus L929-Zellen stammt, bietet.

3. DNA-Kompetitions-Assay

Dieser Assay wurde durchgeführt, um die Affinität des rekombinanten Proteins zu verschiedenen DNA-Sequenzen, einschließlich einiger der bekannten Transkriptions- Regulator-DNA-Sequenzen, zu untersuchen. Das Verfahren war wie folgt:
Das HindIII-SalI-Fragment der IFN-β-Sonde wurde aus p-125 cat isoliert (siehe Fijita et al., 1987); dieses Fragment enthält die humane TFN-β-Gensequenz von +19 bis -125. Die DNA wurde an den 3'-Termini markiert, indem man beide Enden mit [α-³²P] dCTP unter Verwendung des Klenow- Fragmentes auffüllte.
Die spezifische Aktivität der DNA-Sonde betrug 8 000 cpm/fmol.
Die Gel-Retardations-Assays wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Bei den Läufen des Kompetitions-Assays ließ man die DNA mit dem Protein in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an Kompetitor-DNAs in dem Bindungsgemisch reagieren, wie in Figur 3 dargestellt ist.
Der Bildungsgrad des Komplexes wurde durch densitometrische Analyse des Autoradiogramms quantifiziert. Die Komplexbildung in Abwesenheit der Kompetitor-DNA wurde als 100 % genommen.
Die Kompetitor-DNAs besaßen folgende Strukturen:
a) AP-1: eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz
b) TNF: 37 bp der synthetischen DNA, die den Bereich von +1162 bis +2116 (siehe Nedwin et al., 1985) des ersten Introns von TNF-α umfaßt;
c) Nager H2-Dd: 37 bp der synthetischen DNA, die das IRS-Element (-159 bis -123) umfaßt, das von Korber et al., 1988 beschrieben wurde;
d) humanes IFN-α: synthetische DNA mit 46 bp, die dem Virus-Response-Element entspricht, siehe Ryals et al., 1985;
e) die Hexamer-Sequenzen C1, C2, C3, C4 und C5A. Die Sequenzen C1 und C5A sind oben beschrieben worden. Die Sequenzen C2, C3 und C4 sind in Cell, 49, 352-367 (1987) veröffentlicht; sie entsprechen den Sequenzen
AAATGA - C2
AAGGGA - C3 bzw.
AAAGGA - C4;
f) die IFN-β-Gensequenz von +19 bis -66.
In Fig. 3 zeigt das linke Feld die Ergebnisse, die erhalten wurden, als die Hexamer-Wiederholungen als Kompetitoren verwendet wurden. Das mittlere Feld zeigt die Ergebnisse für Segmente des humanen IFN-Gens, die als Kompetitoren verwendet wurden, und das rechte Feld zeigt die entsprechenden Ergebnisse unter Verwendung von verschiedenen DNA-Segmenten, die innerhalb des Feldes gezeigt sind.
Aus den in Fig. 3 gezeigten Ergebnissen kann man erkennen, daß das Auftreten der verlagerten Bande durch die Hexamer-Sequenzen in der Reihenfolge ihrer Wirksamkeit C1- C2- C3- C4 kompetitiv gehemmt wurde, aber daß sie nicht signifikant durch C5A kompetitiv gehemmt wurde.
Man kann weiterhin erkennen, daß die synthetischen DNA- Segmente, die die Regulator-Elemente entweder des humanen IFN- α1- oder des Nager-H-2Dd-Gens umfaßten, eine kompetitive Aktivität hervorriefen. Dies ist besonders interessant, da das DNA-Segment des H-2Dd-Gens die sogenannte IFN-Response-Sequenz (IRS) enthält, die als Enhancer wirkt, wenn die Zellen auf IFN reagieren (Sugita et al., 1987; Israel et al., 1986; Korber et al., 1988).
In der Tat werden Sequenz-Motive, die ähnlich oder identisch zu denjenigen sind, die man in dem IFN-P-Gen gefunden hat, in vielen Promotor-Sequenzen von IFN-induzierbaren Genen, an die Kernfaktoren spezifisch zu binden scheinen, gefunden (Korber et al., 1988; Lery et al., 1988).
Die in Fig. 3 gezeigten Resultate sind sehr ähnlich zu denjenigen, die man erhält, wenn der Assay unter entsprechenden Bedingungen unter Verwendung von natürlichem Protein, das von L929-Zellen produziert wird, wiederholt wird.

Struktur der cDNA, die für das Nager-IRF-1 codiert

Die DNA-Sequenz der klonierten DNAs wurde entweder mittels einer Didesoxy-Methode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) oder mittels der Standard Maxam-Gilbert-Methode (Maxam and Gilbert, 1980) bestimmt.
Das λL28-8-Insert aus E. coli Y1089 wurde wie folgt isoliert: die Phagen-DNA wurde mittels Standard-Verfahren hergestellt, und die DNA wurde mit EcoRI verdaut; sodann wurde die cDNA, die aus der Phagen-DNA geschnitten worden war, isoliert und mittels der Didesoxy-Methode (Sequenase: United States Biochemical Inc.) sequenziert. Das cDNA-Insert aus λL28-8 wies eine Länge von 1,8 kb auf. Die Nucleotid-Sequenzanalyse zeigte einen großen offenen Leserahmen, der in Phase mit dem β-Galactosidase-Gen verbunden war.
Um nach Klonen zu screenen, die größere cDNA-Inserts enthielten, wurde eine doppelsträngige cDNA mit einer poly(a)&spplus;RNA, die aus L929-Zellen stammte, synthetisiert und in den Vektor CDM8 kloniert - gemäß dem veröffentlichten Verfahren nach Aruffo and Seed (Prod. Natl. Acad. Sci., USA, Band 84, geiten 8573, 1987) und Seed (Nature, Band 329, Seiten 840-842, 1987).
Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli-Stamm MC1061/p3 eingeführt (gemäß dem Verfahren nach Aruffo and Seed; siehe oben), und die cDNA-Klone wurden unter Verwendung der von λL28-8-abstamrnenden (³²p-markierten) cDNA-Sonde unter schwachstringenten Bedingungen bei der DNA-DNA-Hybridisierung gescreent (Kashima et al, Nature, Band 313, Seiten 402-404, 1985), und der Klon pIRF-L wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Das gewünschte cDNA-Insert von pIRF-L wurde durch Verdau mit HindIII und XbaI erhalten und mittels der oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Sequenz ist in Formel IV und in Figur 4 dargestellt.
Man fand, daß die cDNA-Sequenz von λL28-8 eine identische Sequenz in dem überlappenden Bereich enthielt, mit der Ausnahme, daß ein A-Rest zwischen den Nucleotiden 1773 und 1781 fehlte.
Die 5'- und 3'-Termini der von λL28-8 abstammenden cDNA sind in Fig. 4 mit Pfeilen markiert. Die ATTTATTTA- und ATTTA- Sequenzen, die möglicherweise der mRNA eine Instabilität verleihen, sind eingerahmt.
Wie aus Fig. 4A ersichtlich ist, war die cDNA der von pIRF-L abstammenden Nager-cDNA 198 bp bzw. 20 bp länger als die der λL28-8-cDNA in den 5'- bzw. 3'-Bereichen.
Eine Analyse der genomischen DNA-Sequenz, die die Promotor- Region dieses Gens enthielt, zeigte, daß die cDNA von pIRF-L ab etwa 30 bp von der starken CAP-Stelle entfernt fehlte, siehe unten, Formel V und Figur 7.
Die direkt stromaufwärts des ersten ATG-Codons gelegene Sequenz, GGACC C, stimmt gut mit Kozak's-Konsensus-Sequenz GCC CC G der Translations-Initiations-Stelle überein.
Eine im Leseraster gelegene ATG-Sequenz wurde nicht in der stromaufwärts der oben erwähnten ATG-Sequenz gelegenen Sequenz gefunden, was bestätigte, daß es sich bei dieser in der Tat um das Initiations-Codon der IRF-1-mRNA handelte.
Wie oben erwähnt, wurde kein Unterschied in der Nukleotid- Sequenz zwischen den cDNAs von λL28-8 und pIRF-L innerhalb der überlappenden Regionen entdeckt, mit der Ausnahme eines Nukleotides in der 3'-nicht-codierenden Region.
Man fand, daß der Nager-IRF-1 aus 329 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 37,3 KD bestand. Echte N-Glycosylierungsstellen erscheinen nicht innerhalb der Sequenz.
Bei einer Suche in der Proteinsequenz-Datenbank (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) und jüngeren veröffentlichten Sequenzen wurde keine wesentliche Homologie mit anderen bekannten Proteinen entdeckt.
Eine Hydropathie-Plot-Analyse gemäß Kyte and Doolittle, 1982 zeigte, daß das Protein im ganzen stark hydrophil ist (Figur 4B).
Eine Untersuchung der abgeleiteten Primärsequenz des Nager-IRF-1 ließ die folgenden Merkmale erkennen:
Die aminoterminale Hälfte, die sich bis Aminosäure (a.a.) 140 erstreckt, ist reich an Lysin (Lys) und an Arginin (Arg). Tatsächlich liegen 31 von insgesamt 39 Lys- und Arg-Resten in dieser Region. Im unteren Feld von Fig. 4B ist eine diagrammartige Zusammenfassung der Lokalisation der basischen Aminosäuren (Arg, Lys) (obere Reihe) und der sauren Aminosäuren (Asp, Glu) (untere Reihe) dargestellt.
Wie in Fig. 4B dargestellt ist, zeigt diese Region eine starke Hydrophilizität und wird als die Region betrachtet, die primär für die Bindung von IRF-1 an die spezifischen DNA-Sequenzen verantwortlich ist.
In diesem Zusammenhang waren Motive, die für viele DNA-bindende Proteine charakteristisch sind, wie Zink-Finger und Helix-Turn- Helix-Motive (Pabo and Sauer, 1984, Evans and Hollenberg, 1988) in dem IRF-1-Protein nicht feststellbar.
Im Gegensatz dazu zeigt der Rest des Moleküls (d.h. die Carboxyl-terminale Hälfte) einen relativ hohen Anteil an Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu), Serin (Ser) und Threonin (Thr). Von 189 Aminosäuren (von Aminosäuren 140 bis 329) stellen 33 (17 %) saure Aminosäuren dar, und 36 (19 %) sind Ser und Thr. Bemerkenswerterweise wird ein Cluster von 5 aufeinanderfolgenden sauren Aminosäuren bei den Aminosäuren 227 bis 231 gefunden. Weiterhin scheinen viele der Ser- und Thr-Reste Cluster zu bilden (Aminosäureregionen 153-156, 190- 192, 206-208 und 220-222; hier als die S-T-Regionen bezeichnet). Die S-T-Regionen sind durch kleine offene Rechtecke im unteren Feld von Fig. 4B dargestellt.

Struktur der cDNA, die für humanes IRF-1 codiert

Eine humane IRF-1-cDNA wurde kloniert und sequenziert, indem man einem ähnlichen Verfahren folgte, wie es oben für Nager- IRF-1 beschrieben wurde.
Eine humane cDNA-Bank wurde hergestellt, indem man eine cDNA unter Verwendung von poly(A)&spplus;RNA einer humanen Jurkat-T- Zellinie synthetisierte. Die Synthese der doppelsträngigen cDNA und die nachfolgende Klonierung in den Plasmid-Vektor CDM8 wurde gemäß dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl., Acad. Sci., USA, Band 84, Seiten 8573-8577, 1987) und Seed (Nature, Band 329, Seiten 840-842, 1987) durchgeführt.
Die rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli-Stamm MC1061/p3 eingeführt, wobei man das oben erwähnte Verfahren nach Aruffo und Seed verwendete.
Nach cDNA-Klonen, die mit der Maus IRF-1-cDNA kreuzhybridisierten, wurde unter Verwendung der λL28-8-cDNA (³²p-markiert) als Sonde unter schwach-stringenten Bedingungen der DNA-DNA-Hybridisierung gescreent. Die angewandten Bedingungen stimmten exakt mit denen überein, die von Kashima et al. (Nature, Band 313, Seiten 402-404, 1985) beschrieben wurden.
Unter den positiven Klonen wurde der Klon pHIRF31 ausgewählt, der das längste cDNA-Insert besaß.
Die gewünschte cDNA-Sequenz des Klons pHIRF31 wurde durch Verdau der Plasmid-DNA mit XhoI isoliert und nach der Isolierung einer Sequenzierung mit den oben beschriebenen Methoden unterzogen. Die Struktur des humanen IRF-1-Gens ist in Formel II und in Fig. 8 dargestellt.
Die abgeleiteten Sequenzen des Nager- und des Human-IRF-1 sind zum Vergleich in Fig. 5 einander gegenübergestellt.
Eine Analyse der humanen DNA zeigte, daß dieser IRF-1 um vier Aminosäuren kürzer als der Nager-IRF-1 ist.
Man kan eine starke Konservierung der Aminosäuresequenzen zwischen den beiden IRF-1-Molekülen erkennen. Insbesondere kann man erkennen, daß 133 von 140 Aminosäuren (95 %) der aminoterminalen Hälften identisch sind.
Zusammengenommen zeigen die obigen Beobachtungen, daß IRF-1 eine neue Klasse von DNA-bindenden Proteinen darstellt.
Es soll weiterhin erwähnt werden, daß die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die man in vielen Cytokin- und Proto-Oncogen-mRNAs findet, innerhalb der 3'-nicht-translatierten Region der Nager- IRF-1-cDNA vorkommen, und ebenso kann man die Sequenz ATTTA innerhalb der entsprechenden Region der humanen IRF-1-cDNA finden. Man nimmt an, daß diese Sequenzen eine Rolle bei der post-transkriptionalen Regulation der Genexpression spielen indem sie der mRNA eine Instabilität verleihen (Shaw and Kamen, 1986; Caput et al., 1986).
E. coli MC1061/p3 wurde mit dem Plasmid pIRF-L transfiziert und als E.coli MC106/p3 (pIRF-L) gemäß dem Budapester Vertrag bei Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan am 19. August 1988 mit der Nummer FERM BP-2005 hinterlegt.
Entsprechend wurde E. coli MC1061/p3 mit dem Plasmid pIRF31 transfiziert und als E.coli MC106/p3 (pIRF-31) gemäß dem Budapester Vertrag beim FRI am 19. August 1988 mit der Nummer FERM BP-2006 hinterlegt.

Regulation des IRF-Gens

1. Expression der IRF-1 mRNA

Aufgrund der Tatsache, daß IRF-1 Affinitäten zu Regulatorsequenzen von anderen Genen als dem IFN-β-Gen zeigt und es somit an der Regulation eines Sets von Genen in verschiedenen Zelltypen beteiligt ist, wurde eine Untersuchung der Expression der IRF-1 mRNA in Mauszellen, die von verschiedenen Geweben und Organen stammten, unter Verwendung der Nager-cDNA als Sonde durchgeführt. Um diese Sonde herzustellen, wurde M13 mp10-Phagen-DNA (siehe unten), die den codierenden Strang des PstI-Fragmentes des IRF-1-Gens enthielt, als Matritze verwendet, um eine ³²p-markierte Antisense-DNA zu synthetisieren, das Produkt wurde mit EcoRI verdaut, und die DNA-Sonde wurde isoliert, wie von Fujita et al. (1985) beschrieben wurde.
Gesamt-RNA wurde gemäß dem etablierten Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, isoliert.
Die Blot-Analyse wurde sodann im wesentlichen so durchgeführt, wie von Thomas (1980) beschrieben wurde, der Röntgenfilm wurde 3 Tage exponiert, und die Resultate sind in Fig. 6A dargestellt. Die verschiedenen Laufspuren zeigen die Ergebnisse von Läufen, die unter Verwendung von gesamter zellulärer RNA der folgenden Gewebe durchgeführt wurde:
Laufspur 1 Gehirn
Laufspur 2 Herz
Laufspur 3 Leber
Laufspur 4 Lunge
Laufspur 5 Milz, nicht stimuliert
Laufspur 6 Thymus
Laufspur 7 Niere
Laufspur 8 Muskel
Laufspur 9 Darm
Laufspur 10 Milz, nicht stimuliert
Laufspur 11 ConA-stimulierte Milz
In jeder Laufspur wurden bei einem Lauf 5 ug gesamte zelluläre RNA verwendet, mit Ausnahme von Laufspur 8, in der nur 1,2 ug RNA verwendet wurden.
Man kann in Fig. 6A erkennen, daß eine Bande, die etwa 2,0 kb entspricht, bei den meisten RNA-Proben dieser Blot-Analyse erkannt wurde, obwohl der Level der mRNA-Expression niedrig zu sein scheint. Es ist bemerkenswert, daß der Level der mRNA- Expression in den von der Milz stammenden Lymphozyten nach Stimulation mit ConA drastisch zunahm (Laufspur 11).
In einem weiteren Assay wurden Maus L929-Zellen wie vorher beschrieben (Fujita et al., 1985) mit NDV induziert, und die zytoplasmatische RNA wurde jeweils drei Stunden nach der Infektion gemäß dem Verfahren von Aruffo and Seed 1987, extrahiert.
DNA-Sonden wurden von folgenden verschiedenen Sequenzen präpariert und mittels der Multiprime-Markierungsreaktion (Amersham) markiert:
(i) ein 1,8 kb EcoRI-Fragment von λL28-8 (spezifische Ativität 2x 10&sup8; cpm/ug);
(ii) ein 0,5 kb BamHI-BglII-Fragment von einem genomischen Klon des Maus-IFN-β (spezifische Aktivität 5x10&sup8; cpm/ug) und
(iii) ein 2,0 kb BamHI-PvuII-Fragment eines Klons, der ein humanes β-Actin-Pseudogen enthielt (spezifische Aktivität 5x10&sup8; cpm/ug).
Die Ergebnisse sind in Fig. 6B dargestellt. Eine Blot-Analyse wurde wie oben beschrieben unter Verwendung des Verfahrens von Thomas (1980) durchgeführt.
Jede Laufspur enthielt 10 ug cytoplasmatische RNA. Der Röntgenfilm wurde 3 Stunden exponiert. Eine densitometrische Analyse zeigte, daß die IRF-1 mRNA 9-12 Stunden nach der NDV- Infektion etwa 25-fach zunahm.
Die Zunahme an mRNA ist zwar drastisch, aber nur vorübergehend, wobei sie ihren Höchstwert nach 9 bis 12 Stunden erreicht und 15 Stunden nach der Induktion abfällt. Eine mRNA-Akkumulation geht der Akkumulation der IFN-β-mRNA voraus; so kann man in Fig. 6B erkennen, daß die Induktion der IRF-1 mRNA schon 3 Stunden nach der NDV-Infektion beobachtet werden kann, während die IFN-β mRNA unter ähnlichen Blot-Bedingungen für beide RNAs erst nach 6 Stunden feststellbar ist.

Der IRF-1-Promotor

Wie oben gezeigt wurde, wird das IRF-1-Gen transkriptional durch verschiedene Agenzien, wie Viren und Mitogene, reguliert.
Eine Southern-Blot-Analyse der chromosomalen DNA zeigte, daß das IRF-1-Gen in der Maus gespleißt werden kann und nicht mehrteilig vorliegt.
Eine λ-Phagenbank, die DNA von neugeborenen Mäusen enthielten, wurde nach Klonen gescreent, die die IRF-1-Promotorsequenz enthielten, wobei die gleiche, oben verwendete, von λL28-8 stammende cDNA-Sonde verwendet wurde. Vier positive Klone wurden identifiziert, von denen alle die gleiche genomische DNA enthielten, und einer von diesen, λg14-2, wurde für die weitere Analyse verwendet. Ein PstI-Fragment wurde in die PstI-Stelle von pUC19 subkloniert, um p19IRFP zu konstruieren.
Die gleiche DNA wurde danach in die PstI-Stelle von M13mp10 und M13mp11 kloniert, die verwendet wurden, um DNA zur Sequenzanalyse zu erzeugen.
Eine Nukleotid-Sequenzanalyse der PstI-Fragmente der obigen Klone wurde wie vorher beschrieben durchgeführt. Starke und schwache CAP-Stellen wurden mittels S1-Mapping-Analyse identifiziert.
Die ermittelten Sequenzen sind in Figur 7A dargestellt. Wie man erkennen kann, stimmt die stromabwärts gelegene Sequenz der DNA vollständig mit der von pIRF-L stammenden cDNA überein.
Die S1-Nuklease-Analyse zeigt das Vorkommen von zwei CAP- Stellen bei der IRF-1 mRNA, wobei die starke Stelle etwa 20 Nukleotide stromabwärts der schwachen Stelle liegt. Typische TATA-Box-Sequenzen sind innerhalb der stromaufwärts gelegenen Region des Gens nicht vorhanden. Angesichts der unüblichen Menge an CpG-Sequenzen bildet dieser Bereich wahrscheinlich eine "HTF-Insel" (Bird, 1986).
Die Promotor-Region enthält zwei GC-Boxen und eine CAAT-Box (siehe Figur 7A); die erstgenannte Box sollte SpI (Kadogan et al., 1986) und die letztgenannte CP-1 oder CP-2 (Chodosh et al., 1988) binden.
Das PstI-Fragment, das die Promotor-Sequenzen enthielt, wurde sodann auf seine Reaktivität bei der Reaktion auf extrazelluläre Signale, z.B. die Virus-Induzierbarkeit, folgendermaßen untersucht:
Ein chimäres Gen wurde konstruiert, in dem ein Reporter-Gen, nämlich das Gen einer bakteriellen Chloramphenikol- Acetyltransferase (CAT), stromabwärts an das PstI-Segment angrenzte. Dies wurde erreicht, indem ein PstI-Fragment von p19IRFP (siehe oben) mittels BamHI und HindIII geschnitten wurde, und das resultierende Fragment in das BglII-HindIII- Gerüstfragment von pA&sub1;&sub0;cat&sub2; (Rosenthal et al., 1983) kloniert wurde, um pIRFcat zu konstruierten.
Mehrere weitere Konstrukte wurden wie folgt hergestellt:
pIRFΔcat wurde hergestellt, indem man das von p19IRFP-stammende BamHI-HindIII-Fragment mit HaeIII verdaute, dessen einzige Erkennungsstelle -30 bis -35 Nukleotide entfernt von der starken CAP-Stelle liegt (Fig. 5A). Das resultierende HaeIII- HindIII-Fragment wurde mit dem BgIII-HindIII-Gerüstfragment von pA&sub1;&sub0;cat&sub2; und der folgenden synthetischen DNA
ligiert.
Sowohl pIRFcat als auch PIRFΔcat enthielten somit Sequenzen bis -320 bzw. -48, ausgehend von der starken CAP-Stelle.
p-125cat enthält die Promotor-Sequenz des humanen IFN-β-Gens, wie von Fujita et al., 1987, beschrieben wurde.
pSV2cat ist in Gorman et al., Science, Band 221, Seiten 551-553 beschrieben.
Als Referenz-Gen wurde pRSVgpt verwendet (Gorman et al., siehe oben).
Maus L929-Zellen wurden mittels der Calciumphosphat-Methode (Fujita et al., 1985) mit den verschiedenen Genen transfiziert. 5x10&sup6;-Zellen wurden mit 7,5 ug des Test-Plasmides transfiziert, das das CAT-Reportergen und 2,5 4g pRSVgpt enthielt. Die Zellen wurden mit NDV induziert oder mock-induziert und sodann dem enzymatischen Assay unterzogen, wie von Fujita et al., 1985 beschrieben wurde.
Bei der Berechnung der relativen CAT-Aktivität wurde die CATAktivität der mock-induzierten Zellen, die mit PSV2cat tranfiziert worden waren, als 100 % genommen. Die CAT-Aktivität der jeweiligen Probe wurde mit Ecogpt normalisiert (Mulligan and Berg, Proc.Natl. Acad. Sci, USA, Band 78, Seiten 2072- 2076). Die Proben, bei denen der CAT-Wert unterhalb des Hintergrund-Levels lag, wurden als b.b. bezeichnet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7B dargestellt.
Man kann erkennen, daß die Transfektion von Maus L929 mit pIRFcat eine Expression mit einem niedrigen Grad an CAT- Aktivität ergab. Der CAT-Expressionsgrad erhöhte sich, als die transfizierten Zellen mit NDV stimuliert wurden. Die Deletion der stromaufwärts gelegenen Sequenz von 300 bp des IRF-1-Gens (pIRFΔcat) brachte sowohl die konstitutive als auch die induzierte Expression des CAT-Gens praktisch zum Verschwinden. Dies zeigt, daß die Promotor-Sequenz innerhalb der stromaufwärts gelegenen 300 bp großen Region liegt und Virusinduzierbar ist.

Konstruktion der Expressionsplasmide

1. Die Phagen-DNA des Klons λL28-8 wurde mit EcoRI verdaut, und das cDNA-Insert wurde gewonnen. Gemäß Aruffo und Seed, 1987, wurden die EcoRI-Stellen der cDNA mittels T4-DNA- Polymerase in glatte Enden überführt und sodann mit synthetischen Adaptoren-DNAs ligiert, die die Sequenzen pGATCCATTGTGCTGG und pCCAGCACAATG besaßen.
Nach Entfernung der synthetischen DNAs durch Zentrifugation mit einem 5-20%-igen Kaliumacetat-Gradienten (Aruffo und Seed, 1987) wurde die IRF-1-cDNA, an deren beiden Enden die Adaptoren-DNAs gebunden waren, mit der BstXI-gespaltenen CDM8- Vektor-DNA ligiert (Seed, B. Nature, Band 329, Seiten 840-842, 1987). Die Plasmide pIRF-S und pIRF-A, die die IRF-1-cDNA in der Sense- bzw. Antisense-Orientierung in Hinsicht auf den CMV- Protomor enthielten, wurden isoliert.
L929-Zellen wurden mit der jeweiligen Plasmid-DNA zusammen mit entweder p-55cat oder p55ClB (Fujita et al., 1987) cotransfiziert, und der CAT-Expressionsgrad wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1 Transfizierte Plasmide Induktion mit NDV CAT-Aktivität (% Konversion) Vers.
Die Effizienz der DNA-Transfektion verändert sich in Abhängigkeit vom Zustand der aufnehmenden Zellen (in diesem Fall der Maus L929-Zellen). Die Effizienz war in Versuch 2 viel niedriger als im Vergleich zu Versuch 1. Daher ist der CAT- Expressionsgrad in Versuch 2 relativ geringer.
Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war eine signifikante CAT-Aktivität nur bei den Zellen feststellbar, die mit p-55ClB und pIRF-S transfiziert worden waren. Dies zeigt, daß IRF-1 an die 8-fach wiederholte AAGTGA-Sequenzen bindet, die stromaufwärts des CAT-Gens in p-55ClB vorhanden sind und dadurch die Transkription des distalen CAT-Gens fördert.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß sich der CAT- Expressionsgrad durch Infektion der transfizierten Zellen mit NDV erhöht (mehr als 2-fach, siehe Tabelle 1), was zeigt, daß es möglich ist, die Genexpression durch verschiedene Stimuli, wie Viren, zu kontrollieren.
2. Ein Expressionsplasmid zur Herstellung eines Proteins, das aus der IRF-1 DNA-bindenden Domäne und der Transkriptionsaktivierenden Domäne des Hefe GAL4 bestand, wurde wie folgt konstruiert:
Das Plasmid pIRF-S wurde mit HindIII und PstI verdaut, und das cDNA-Insert wurde isoliert. Die cDNA wurde mit DraIII verdaut und das HindIII-DraIII-Fragment (etwa 550 bp) wurde gewonnen und als Fragment A bezeichnet.
Der Expressionsvektor CDM8 wurde mit HindIII und XbaI verdaut, und das DNA-Gerüst wurde isoliert und als Fragment B bezeichnet.
Die DNA, die für die Transkriptions-aktivierende Domäne des Hefe GAL4 codiert, wurde aus dem Plasmid pRB968 (Ha und Ptashne, 1987) wie folgt isoliert:
Die pRB968-DNA wurde zuerst mit HindIII verdaut, und die
Termini wurden mittels T4-DNA-Polymerase in glatte Enden überführt. Eine synthetische XbaI-Linker-DNA wurde zu der DNA zugegeben, und die DNA wurde danach mit PvuII und XbaI verdaut.
Das resultierende, ca. 600 bp große PvuII-XbaI-DNA-Fragment wurde gewonnen und als Fragment C bezeichnet.
Zusätzlich wurde eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz präpariert:
und als Fragment D bezeichnet.
Der Expressionsvektor pIRFGAL4 wurde konstruiert, indem man die Fragmente A, B, C und D ligierte. Als Kontroll-Plasmid wurde das Plasmid pIRFΔGAL4 konstruiert, indem man die Fragmente A, B, C und eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz ligierte:
Da sich ein Terminator-Triplett, TGA, im Leseraster zwischen den IRF-1- und GAL4-Sequenzen im pIRFΔGAL4 befindet, sollte dem exprimierten Protein die GAL4-Aktivierungsdomäne fehlen.
Um die funktionalen Eigenschaften des Plasmid-codierten chimären Transkriptionsfaktors zu untersuchen, wurden L929- Zellen mit pIRFGAL4 und pIRFΔGAL4 jeweils mit p-55ClB cotransfiziert und die CAT-Expression wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle 2 dargestellt: Tabelle 2 Transfiziertes Plasmid CAT-Aktivität (% Konversion)
Wirtszelle: Maus L929-Zellen. Die Zellen wurden nicht mit NDV induziert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Expression eines Ziel-Gens (wie ein Gen, das für ein Interleukin, ein Interferon (α, β und γ) einen Plasminogen-Aktivator, Erythropoietin, den Granulocyten- Kolonie-stimulierenden Faktor, Insulin, humanes Wachstumshormon oder Superoxid-Dismutase (oder Mutanten der humanen Gene) codiert, durch IRF-1 erhöht werden kann.
Die oben erwähnten Zielgene, wie Interferongene, z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-omega, und Plasminogen-Aktivatoren, z.B. t- PA, pro-Urokinase oder Urokinase, können effizienter exprimiert werden, indem man weiterhin Promotoren, die mit verschiedenen Längen der Erkennungssequenzen für IRF-1, z.B. AAGTGA, fusioniert sind, einbaut.
Zum Beispiel können die Zielgene in verschiedene Wirtszellen zusammen mit entweder intakten IRF-1- oder chimären IRF-1-Genen eingeführt werden. Durch Vergrößerung der Länge der DNA mit der IRF-1-Erkennungsstelle, zum Beispiel durch Erhöhung der Anzahl der AAGTGA-Wiederholungen, und des Expressionsgrades des Transkriptionsfaktors kann eine hochgradige Expression der Zielgene erreicht werden.
Zum Beispiel können die AAGTGA-Sequenzwiederholungen an einen geeigneten Promotor, wie den IFN-β-Promotor oder den frühen Promotor des SV40-Virus, angrenzen. Ein Zielgen, z.B. das t-PA- Gen oder das IFN-β-Gen, kann stromabwärts mit einem solchen Promotor verbunden werden; die Struktur eines solchermaßen konstruierten Gens würde wie folgt aussehen:
(AAGTGA)x (Promotor) (Zielgen, z.B. das t-PA-Gen).
Dieses Gen könnte sodann in CHO-Zellen, z.B. CHO DXBII-(dhfr- Stamm) Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 77, Seiten 4216-4220, 1980) eingeführt und darin amplifiziert werden.
Wie oben diskutiert wurde, wird eine Wirtszelle idealerweise aus solchen Zellen ausgewählt, die keine oder keine wesentliche endogene IRF-1-Aktivität besitzen. Das IRF-1-Gen, das entweder einen starken Promotor wie den CMV-Promotor oder einen induzierbaren Promotor, wie den Promotor des Metallothionen- Gens, besitzt, kann in die verschiedenen Wirtszellen auf übliche Weise eingeführt werden.
Das IRF-1-Gen kann zusammen mit dem Zielgen eingeführt und amplifiziert werden. Alternativ können das IRF-1-Gen und das Zielgen getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.
In diesen transfizierten Zellen kann IRF-1 entweder konstitutiv (zum Beispiel im Fall des CMV-Promotors) oder induziert (z.B. wird es im Fall des Metallothionen-Promotors durch zweiwertige Metalle, wie Zink, induziert) produziert werden. Der exprimierte IRF-1 bindet an die AAGTGA-Wiederholungen und verstärkt die Expression des distalen Zielgens, z.B. des t-PA- Gens oder IFN-Gens.
Diese Expression konnte weiterhin durch eine Virus-Induktion, z.B. durch NDV, verstärkt werden, wie man in Tabelle 1, Versuch 2, erkennen kann, wo diese Induktion die Aktivität des IRF-1 erhöht.

cDNA aus dem Hefe-Genom, die mit humanen IRF-1-cDNA-Sequenzen hybridisiert

Hefe-DNA wurde nach dem Standard-Verfahren hergestellt und mit EcoRI verdaut. 5 ug der verdauten DNA wurden auf ein 0,8%-iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese und einem DNA- Blotting nach Standardverfahren unterzogen.
Der geblottete Filter wurde genauso behandelt, wie es in dem vorhergehenden Beispiel der Isolierung einer Maus-DNA, die mit dem Nager-IRF-1 hybridisiert, beschrieben wurde, mit folgenden Ausnahmen:
In Schritt (3) betrug die Inkubationstemperatur 55ºC, in Schritt (4) wurde die Inkubation auch bei 55ºC durchgeführt, und als radioaktive Sonde verwendete man die humane IRF-1-cDNA, die mittels XhoI-Verdau des Plasmides pHIRF31 isoliert worden war, wobei diese Probe so markiert wurde, wie es in dem vorhergehenden Beispiel für Nager-IRF-1 beschrieben wurde. Der Filter wurde bei 55ºC mit 2xSSC gewaschen. Die positiven Klone wurden mittels Autoradiographie identifiziert (siehe Figur 9).

Literatur

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Claims

1. Rekombinates DNA-Molekül, gekennzeichnet durch ein Strukturen mit der Formel

oder ein Fragment, oder eine degenerierte Variante des Moleküls oder des Fragmentes, das für ein Protein codiert, das die Aktivität des Interferon-Regulator-Faktors-1 (IRF-1) besitzt.

2. Rekombinante DNA-Sequenz, die mit der anti-Sense-Version eines Moleküls gemäß Anspruch 1 hybridisiert, und die für ein Protein codiert, das IRF-1-Aktivität besitzt.

3. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Promotor- und Regulatorsequenz, die in der folgenden Formel vorkommt: Schwache Cap-Site Starke Cap-Site

4. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein Strukturgen für ein gewünschtes, Pharmazeutisch aktives Protein unter der Kontrolle des IRF-1-Proteins, das von der DNA-Sequenz codiert ist.

5. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 4, worin sich das für das IRF-1-aktive Molekül codierende Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors befindet.

6. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 oder 5, worin das Gen für das gewünschte, Pharmazeutisch aktive Protein eine IRF-1-Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von AAGTGA- Sequenzwiederholungen enthält.

7. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, worin das gewünschte, Pharmazeutisch aktive Protein ein Cytokin oder ein Plasminogen-Aktivator ist.

8. Wirtszelle, transformiert mit einem rekombinanten DNA- Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Wirtszelle gemäß Anspruch 8, die transformiert worden ist mit einem ersten DNA-Molekül, das eine Sequenz enthält, die für ein Protein codiert, das die Aktivität von IRF-1 besitzt, und mit einem zweiten separaten DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das für ein gewünschtes, Pharmazeutisch aktives Protein codiert, das sich unter der Kontrolle des IRF-1-Proteins befindet, das von dem ersten DNA-Molekül codiert wird.

10. Wirtszelle gemäß Anspruch 9, worin sich das für das TRF-1- aktive Molekül codierende Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder einesinduzierbaren Promotors befindet.

11. Wirtszelle gemäß Anspruch 8 oder 9 bis 10, worin das Gen für das gewünschte, Pharmazeutisch aktive Protein eine Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Protein umfaßt, die eine Vielzahl von AAGTGA-Sequenzwiederholungen umfaßt.

12. Transformierte Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, ausgewählt unter einer Bakterienzelle, einer Hefezelle oder einer Säugerzelle.

13. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten, pharmazeutisch aktiven Proteins, wobei man eine Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 kultiviert.

14. Protein, das die durch ein Strukturgen gemäß Anspruch 1 oder 2 definierte Struktur besitzt.

15. Plasmid, ausgewählt unter

Plasmid pHIRF31, FERM BP-2006;

Plasmid pIRF-L, FERM BP-2005; oder

Plasmid pIRF2-5, FERM BP-2157.