JP2905506B2

JP2905506B2 - 遺伝子発現調節因子

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Publication number: JP2905506B2
Application number: JP1217170A
Authority: JP
Inventors: 維紹谷口; 尚志藤田
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Current assignee: Individual
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1999-06-14
Anticipated expiration: 2014-06-14
Also published as: EP0359998A2; PT91521A; FI893942A0; HUT52152A; NO893386L; NO893386D0; DE68915375D1; FI893942A; PT101697B; IE64790B1; ES2052846T3; IE940353L; IE892705L; JPH11266886A; EP0359998A3; HU213162B; NZ230399A; ES2162801T3; ATE208817T1; AU618394B2

Description

【発明の詳細な説明】一般的に本発明は遺伝子発現の調節に関する。特に本
発明はインターフェロン調節因子−１（IRF-1）の活性
を有するクンパク質をコードする組換えDNA分子、IRF-1
活性タンパク質をコードするDNA配列及び該配列に機能
的に結合するプロモーター及びレギュレーター配列を特
徴とする組換えDNA分子、該IRF-1活性タンパク質の制御
下にあり、かつ目的タンパク質をコードするDNA分子に
より宿主細胞をトランスホームするための該DNA分子の
使用、医薬的に活性なタンパク質をコードする配列及び
IRF-1活性分子に対する結合部位を含む該タンパク質遺
伝子のプロモーター領域を含む該DNA分子、及び該DNA分
子によりトランスホームした適当な宿主細胞を培養する
ことによる該IRF-1活性タンパク質及び／又は該医薬的
に活性なタンパク質の生産に関する。

ホ乳類細胞における遺伝子の転写は、制御DNA配列と
トランス作用型DNA結合タンパク質との相互作用が中心
的役割を果す複雑なメカニズムで制御される。転写制御
に関し、インターフェロン（IFN）をコードする遺伝子
は、多くのサイトカイン遺伝子に共通する特徴をもつ。
すなわち、これらの遺伝子の転写は種々の細胞外シグナ
ルに従い一時的に誘導される。IFN−α及びIFN−βの遺
伝子の転写は、種々の細胞においてウイルスにより効率
的に誘導され、一方IFN−γをコードする遺伝子の転写
は、Ｔリンパ球においてマイトジエン活性化後に誘導さ
れることが報告されている（レヴューは、ワイズマン
（Weismann）及びウェーバー（Weber）、1986;タニグチ
（Taniguchi）、1988参照）。

元々強力な抗ウイルス活性により同定されたサイトカ
インであるIFN−βも、細胞増殖及び細胞分化をコント
ロールする上で重要な役割を果しているようである。こ
れに関し、IFN−β遺伝子のよく知られているインジュ
ーサーであるウイルス及びポリ（rI）：ポリ（rC）の他
に、コロニー活性化因子−１（CSF-1）（ムーア（Moor
e）等、1984;ワレン（Warren）及びラルフ（Ralf）、19
86;レスニスキー（Resnitzky）等、1986）、腫瘍ネクロ
シス因子（TNF）（オノザキ（Onozaki）等、1988）、血
小板由来成長因子（PDGF）（ズロ（Zullo）等、1985）
及びIFN類（コハセ（Kohase）等、1987）等の多数のサ
イトカインも、特定の細胞中でIFN−βを誘導するよう
であり、このことは、これらが標的細胞において同様の
又は同一のシグナルを誘導することを示唆している。

ウイルス及びポリ（rI）：ポリ（rC）によるIFN遺伝
子の誘導は、転写レベルで起こることが示された（ラジ
（Raji）及びピサ（Pitha）、1983;オーノ（Ohno）及び
タニグチ（Taniguchi）、1983;ジンター（Dinter）等、
1983、ジン（Zinn）等、1983）。このように誘導促進因
子として機能するシス型DNA配列がヒトIFN−β遺伝子の
５′隣接領域内に同定された（フジタ（Fujita）等、19
85、1987;グットバーン（Goodborn）等、1985;ジンター
（Dinter）及びハウザー（Hauser）、1987）。誘導促進
因子領域（すなわちCAP部位に関しては−65〜−105）に
は、事実多重化したときに転写の誘導活性化に機能する
反復ヘキサヌクレオチドを含む（フジタ（Fujita）、19
87）。我々はマウスL929細胞及びヒト細胞などのホ乳類
細胞において、特異的にIFN−β制御配列に結合する因
子、IRF-1及び機能性反復ヘキサヌクレオチド配列：(AA
GTGA)₄を同定した。我々は、IRF-1が、同定されたシス
型成分と相互作用することにより、IFN−β遺伝子転写
のウイルス誘導活性化におてい基本的役割を果している
ことが分った。

本発明の広範な特徴に従い、我々はインターフェロン
調節因子−１（IRF-1）活性を有するタンパク質をコー
ドする組換えDNA分子を提供する。該DNA分子は、ヒトIR
F-1又はマウスIRF-1をコードするか、もしくはこれらを
コードするDNA分子にハイブリダイズし得ることが望ま
しい。

該DNA分子は、反復オリゴマー配列AAGTGA及びヒトIFN
−β遺伝子の上流制御要素に結合するタンパク質をコー
ドするものであることが好ましい。

該DNA分子は、構成的、又は例えばニューキャッスル
病ウイルスなどによるウイルス誘導性、又はコンカナバ
リンＡを用いるなど、マイトジエン活性化により誘導さ
れるなど、誘導性のプロモーター領域を含み得る。

１つの好ましいDNA分子は（ヒトIRF-1をコードす
る）、以下の一般式Ｉで表わされる構造遺伝子により特
徴づけられる。

一般式Ｉ又は、縮重したその変異体（a degenerate variant t
hereof）。

例えば、このDNA分子は、上記一般式で表わされる構
造遺伝子及び以下の一般式II内に含まれる上流及び下流
の隣接配列により特徴づけられる。

一般式II 又は、その変異体。

別の好ましいDNA分子（マウスIRF-1をコードする）
は、以下の一般式IIIで表わされる構造遺伝子により特
徴づけられる。

一般式III 又はその変異体。

例えば先の段落で述べたようにこれらのDNA分子は、
上記一般式で表わされる構造で表わされる構造遺伝子及
び以下の一般式IV内に含まれる上流及び下流の隣接配列
により特徴づけられる。

一般式IV 又は、その変異体。

IRF-1活性を有するタンパク質をコードする本発明のD
NA配列は、ヒト及びマウスばかりでなく、例えばニワト
リ、カエル及びイーストなどの真核性生物由来で、先に
述べたヒトまたはマウスのIRF-1のDNA配列（第Ｉ〜IV
図）にハイブリダイズし、かつIRF-1活性を有するタン
パク質をコードするDNA配列を含んでいる。

第4A図で定義したようにマウスのIRF-1のcDNAにハイ
ブリダイズする１つのcDNA分子を以下の一般式IIIａに
示す。

一般式IIIａ又は、この変異体。

例えば、このDNA分子は、上記一般式で表わされる構
造遺伝子及び以下の一般式IVａ内に含まれる上流及び下
流の隣接配列により特徴づけられる。

一般式IVａ又はこの変異体。

以下にヒト細胞及びマウス細胞由来のヒト及びマウス
IRF-1をコードするcDNA分子及びマウス細胞及びイース
ト由来の各々マウスIRF-1及びヒトIRF-1のcDNAにハイブ
リダイズするcDNAの単離について説明する。

この組換DNA分子は、以下の一般式Ｖ内に含まれるプ
ロモーター及びレギュレータ配列も含み得る。

一般式Ｖ又はこの変異体。

この組換えDNA分子は、例えばサイトカイン又はプラ
スミトゲン活性化因子などの医学的に活性のあるタンパ
ク質を発現するように設計し得るし、またこの型のもの
においてはIRF-1活性分子に対する結合部位を含む該タ
ンパク質の遺伝子のプロモーター領域を機能的に結合し
た該タンパク質の構造遺伝子を含むことが望ましい。

従って本発明の組換えDNA分子は、先に定義したDNA配
列及び該DNA配列によりコードされるIRF-1活性タンパク
質の制御下の、目的とする医学的に活性なタンパク質の
構造遺伝子を含む。このような組換えDNA分子におい
て、IRF-1活性分子をコードする遺伝子は、構成的プロ
モーターの制御下にあることが好ましく、又は誘導性プ
ロモーターの制御下にあることが最も好ましい。目的と
する医学的に活性なタンパク質の遺伝子は、反復AAGTGA
配列を含むIRF結合部位を含むことが望ましい。

また、本発明は、先に定義した組換えDNA分子でトラ
ンスホームした、例えば大腸菌などの細菌、又はイース
ト細胞、又は例えばCHO細胞又はL929などのマウス細胞
などのホ乳類細胞などの宿主細胞も含む。理想的には、
これらの宿主細胞は、内在するIRF-1活性が無いか、又
は実質的に含まない細胞系列から選ばれたものであるこ
とが望ましい。

別に、医学的に活性なタンパク質の生産のため、宿主
細胞がIRF-1活性を有するタンパク質をコードする配列
を含む第１のDNA分子、及び第１のDNA分子にコ−ドされ
ているIRF-1活性タンパク質の制御下の、目的とする医
学的に活性なタンパク質をコードする遺伝子を含む別個
の第２のDNA分子でトランホームされる。IRF-1活性分子
をコードする第１のDNA分子は、IRF-1活性化合物をコー
ドする遺伝子に機能的に結合する構成的プロモーター配
列又は最も望ましくは誘導性プロモーター配列を含むこ
とが好ましい。また、第２のDNA分子は反復AAGTAG配列
を含む、IRF-1活性タンパク質の結合部位を含むことが
望ましい。

IRF-1活性タンパク質又は医学的に活性なタンパク質
は、これらの形質転換細胞の培養及び従来法による生産
タンパク質の単離により生産し得る。うまいことに、宿
主細胞は、以下に説明するように、IRF-1をコードする
遺伝子に機能的に結合するプロモーターに適当な処理を
行うことで発現が誘導される。

また、本発明は先に定義したDNA分子でトランスホー
ムした宿主細胞の培養で得られるIRF-1活性を有するタ
ンパク質も含む。

IRF-1活性を有する好ましいタンパク質は、一般式VI
で表わされる配列を有する。

一般式VI: IRF-1活性を有する別の好ましいタンパク質は、一般
式VIIで表わされる配列を有している。

一般式VII: また、一般式IIIａのcDNA配列によってコードされる
別の好ましいタンパク質は、一般式VIIIで表わされる配
列を有している。

一般式VIII: 以下にIRF-1活性を有するDNA結合タンパク質をコード
するマウス及びヒトのcDNAの分子クローニング及び特性
化を説明する。

クローン化cDNAの解析によりマウス及びヒトのIRF分
子の間に著しい配列保存性があることが明らかになる。
さらにIRF-1をコードする遺伝子の発現は、マウスL929
細胞及び脾臓リンパ球において各々ニューキッスル病ウ
イルス（NDV）及びコンカナバリン（ConA）により誘導
されることが示されている。

1.大腸菌におけるIRF-1のクローニング及び発現 A.ポリ（Ａ）⁺RNAを未誘導のマウスL929細胞から単離
し、cDNAの合成に用いた（アルホ（Aruffo）及びシード
（Seed）の方法に従う、1987）。生成したcDNAをEcoRI
切断したλgtllベクターにクローン化し、ついで宿主株
として大腸菌Y1090を用い、ハイン（Huynh）等（1985）
の標準操作に従がいcDNAライブラリーを構築した。

このλgtllライブラリーをプローブとして多重化（４
個）AAGTGA配列（以後C1オリゴマーと呼ぶ、フジタ（Fu
jita）等、1987）を用いてスクリーニングした。

このスクリーニング提作では、組換えλgtllファージ
を感染した大腸菌Y1090を10×13cm四角プレート上にプ
レーティングした。それからこのプレートを12℃で４〜
５時間インキュベートすると、プレート当り約20,000個
のプラークが出現した。

スクリーニング用のメンブレンフィルターはナイロン
製（ナイトラン、シュレイチャー・アンド・シュネル社
製）又はニトロセルロース製（シュレイチャー・アンド
・シュネル社）の膜である。このフィルターを10mM IPT
G（適当なファージプラークにおけるlacZ遺伝子発現を
誘導する）に浸し、空気乾燥後プレート上に置いて、37
℃で2.5時間インキュベートした。もし、cDNAがlacZ遺
伝子と読み粋がそろっていれば、そのプラークは、その
cDNAによりコードされているタンパク質を生産するであ
ろう。

その後、このフィルターを取り出し、４℃で20分間冷
やした後、乾燥させないようにしてスクリーニングを行
った。

検定のため、メンブレンフィルターを以下のように調
製した。

マウスL929細胞から核抽出物を調製し、それをメンブ
レン上にスポッティングした（約10μｇのタンパク質相
当量）。

DNA結合を行う前に、10mMへペス（pH7.5）、5.0mM Na
Cl、1mM DTT、1mM EDTA、５％グリセリンを含む結合バ
ッファを用いた。５％脱脂粉乳（ユキジルシ社製）をこ
のバッファに加え、この混合物中でフィルターを４℃、
１時間インキュベーションした後、粉乳を含まない同バ
ッファ中に１分間洗浄した。

その後、このフィルターを、約300bp平均長のサケ精
子DNA350μg/ml及び³²Pラベル化プローブC1オリゴマーD
NA（10⁶cpm/ml、比活性2000cpm/f mole）（フジタ（Fuj
ita）等、1987参照）を含む結合バッファ（1ml）中でイ
ンキュベートした。このプローブDNAは、T4キナーゼと
〔γ−³²P〕ATPを用いて、５′末端ラベルを行った。

結合後、室温で１〜２時間、結合バッファを５回交換
しながら（10ml/フィルター）フィルターを洗浄した。
さらにフィルターを空気乾燥し、オートラジオグラフィ
ーにかけた。この検定において、ナイロンメンブレン
は、過剰の非ラベルC1オリゴマーを含めることにより特
異的に阻害されるポジティブシグナルを与えた。一方、
ニトロセルロースメンブレンはそういう事はなかった。

この方法により、約1.4×10⁶個の組換え体がスクリー
ニングされた。第１回目のスクリーニングで同定された
32個のポジティブファージクローンの中で、１個のクロ
ーン（λL28-8と命名）は、ひきつづくスクリーニング
操作の中で、プローブDNAと再現的に結合することが分
った。

2.形質転換大陽菌におけるタンパク質の生産及び精製大腸菌Y1089をλL28-8でトランスフェクトすることに
より、溶原性バクテリアクローンを調製した。λL28-8
を宿す溶原体一晩培養物を400mlL培地中１％濃度となる
よう接種した。この細菌を、OD600値が1.0となるまで31
℃で増殖した。その後、温度を20分間42℃にシフトし
た。それからIPTGを10mMとなるように加え、38℃でさら
に20分間インキュベートした後この培養物を迅速にペレ
ット化してから、20mMへペス（pH7.9）、0.2mM EDTA、
0.5mMスペルミジン、0.15mMスペルミン、0.1mM DTT、10
％グリセロール、0.5mMフェニルメチオニルスルホニル
フルオライド（PMSF）、１μg/mlペプスタチンＡ、１μ
g/mlロイペプチン、500μML-I−トシルアミド−２−フ
ェニレンクロロメチルベンズアミジン、10mMモリプデン
酸ナトリウム、2mMピロリン酸ナトリウム及び2mMオルト
バナデン酸ナトリウムを含む溶菌バッファ10ml中に懸濁
した。この細胞サスペンジョンに、３回凍結−融解操作
を行ない、つづいて、ベックマン50Tiローターを用い、
４℃、30,000rpmで１時間の遠心を行った。上清は、直
接ゲル遅延検定法（以下参照）に用いるか、又はさらに
精製した。

精製は以下のように行った。

約4mlの上清をベッド体積2mlの、溶菌バッファで平衡
化したポリ（di-C）；ポリ（di-C）カラムにかけた。溶
出物質（4ml）を、バッファＺ（25mMヘペス、pH7.8、1
2.5mM MgCl₂、1mM DTT、20％グリセロール、0.1％NP-4
0、0.5mM PMSF）で平衡化したベッド体積2mlのDE52（ワ
ットマン製）カラムにかけた。DNA結合活性成分は、0.1
mM KClを含むバッファＺで溶出した。さらにこの溶出物
（約4ml）をコンセントリコン−10（アミコン製）を用
いて濃縮した。最終的タンパク質濃度は28mg/mlであっ
た。

3.クローンλL28-8のタンパク質産物の特性（ｉ）ゲル遅延検定法 λL28-8を宿す溶原性細菌クローンを、大腸菌Y1089の
トランスフェクションにより調製し、ハイン（Huynh）
等の操作を用い、高レベルのクローン化cDNA発現を誘導
した。コントロールとして、cDNA挿入物を欠くファージ
（λ６と命名）を用い、同様の方法で溶原性クローンの
調製及び処理を行った。

各々３μｇのタンパク質を含む抽出物を溶原体の誘導
培養物（λL28-8a、λL28-8b及びλ6a及びλ6bと命名し
た４個の調製物）から調製した。

また核抽出物（３μｇタンパク質）をマウスL929細胞
から調製した。

この抽出物を、先に示した、比活性8000cpm/f moleを
有するラベル化C1オリゴマープローブ1f moleとインキ
ュベートした。

このインキュベーション物に種々の濃度の競合DNAを
加える競合検定法を、各抽出物について行った。

この検定結果を第１図に示す。各レーンは以下に示す
ものに対応する。

レーン抽出物１なし２ λ6a ３ λ6b ４ λ6bと1000倍モル過剰の未ラベルC1オリゴマー５ λ6bと1000倍モル過剰の未ラベルC5Aオリゴマー^＊６ λL28-8a ７ λL28-8b ８ λL28-8bと1000倍モル過剰の未ラベルC1オリゴマー９ λL28-8bと1000倍モル過剰の未ラベルC5Aオリゴマー^＊ 10 L929細胞 11 L929細胞と1000倍モル過剰の未ラベルClオリゴマー 12 L929細胞と1000倍モル過剰の未ラベルCA5オゴマー^＊＊C5Aオリゴマーはフジタ（Fujita）等、1985で説明
されており、GAAAの６回反復配列である。

第１図から、結合プローブは、レーン6,7,9,10及び12
に検出されていることは明白である。

第１図に示されているように、λL28-8溶原体からの
タンパク質抽出物は、シフトしたバンドを与えている
（レーン６及び７）。この出現は過剰の未ラベルC1オリ
ゴマーDNAで阻害されたが、同量のC5Aオリゴマーでは阻
害されない（レーン８及び９）。

λL28-8由来のタンパク質とは対照的に、誘導された
λ６由来の溶原体から調製したものはこのようなシフト
バンドを与えない（レーン２−５）。シフトバンドはマ
ウスL929細胞由来の天然のIRF-1のバンドと非常に類似
していると見ることができる（レーン10及び12）。２組
のシフトバンドに存在する差異は、プローブDNAに結合
するタンパク質の量が異なる結果であると考えられる。

さらに、このシフトバンドはλL28-8でトランスフェ
クトしたIPTG誘導Yl089細胞由来のタンパク質について
のみ検出可能であることが分った。

（ii）DNaseフットプリンティング分析フットプリンティング分析は、IFN−β遺伝子上流領
域をコードするDNAに対する、λL28-8cDNAによりコード
されるタンパク質の結合性をテストすることで行った。

λL28-8cDNAにコードされるタンパク質を誘導溶原体
から抽出し、先に述べたカラムクロマトグラフィーによ
り部分的に精製し、IFN−β遺伝子上流領域を含むDNAに
対する結合性をテストした。

プローブDNAはp-125cat（野生型のIFN一β遺伝子を含
む）及びp-125DPcat（IFN−β遺伝子変異体を含む）か
ら単離したSal I-Hind IIIフラグメントとして調製し
た。プラスミドp-125catは、pSE-125（フジタ（Fujit
a）等、セル（Cell）、41、489-496、1985）由来のBamH
I（−125）−TagI（十19）フラグメントを用いること以
外p-105cat（フジタ（Fujita）等、1987）と同様に構築
した。IFN一β制御要素内に点突然変異を含むプラスミ
ドp-125DPcatは、ハタケヤマ（Hatakeyama）等、（プロ
シーディング・イン・ナショナル、アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,83,9650-965
4、1986）により報告されているように、p-125catの合
成オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により得た。両
DNAはT4キナーゼを用い（γ一³²P〕ATPにより、そのHin
d III部位をラベル化した。

プローブDNA4f mole（比活性3,000cpm/f mole）を25m
Mトリス−HCl、pH7.9、6.25mM MgCl₂,50mM KCl,1mM EDT
A,0.5mM DTT、10％グリセリン、２％ポリビニルアルコ
ールを含む20μｌの反応混合物中、精製タンパク質280
μｇの有無の条件下でインキュベートした。

この検定においては、５×10^-4ユニットのDNase I
（ワーシントン製）を添加し、25℃で１分間インキュベ
ートした。

第２図は以下に示す操作を行って得られたサンプル由
来のDNAフラグメントのオートラジオグラムを示す。第
２図の左側は、野生型IFN−βプローブのDNA配列の一部
であり、また第２図の右側は変異体IFN−βプローブのD
NA配列の一部である。

1.野生型IFN−βプローブをＡ＋Ｇ反応で切断した（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol
ogy）65,499-560参照）。結果をレーン１に示す。

2.野生型IFN−βプローブを保護なしにDNase Iで部分消
化した。結果をレーン２に示す。

3.野生型IFN−βプローブをタンパク質と反応させた後D
Nase Iで消化した。結果をレーン３に示す。

4.野生型IFN−βプローブを、1000倍モル過剰の未ラベ
ルC1オリゴマーの存在下でタンパク質と反応させた後、
DNase Iで消化した。結果をレーン４に示す。

5.変異体IFN−βプローブをタンパク質と反応させた
後、DNase Iで消化した。結果をレーン５に示す。

6.変異体IFN−βプローブをＡ＋Ｇ反応で切断した。結
果をレーン６に示す。

第２図において、レーン３及びレーン５から明らかで
あるように保護領域は、各々オートラジオグラムの左及
び右に示されている配列上に表われている。へキサマー
モチープを枠で囲んだ。

第２図の結果から、保護領域は−100〜−64のヌクレ
オチドに相当し、この領域がL929細胞由来のIRF-1によ
り保護されることが分る。この保護は、過剰の未ラベル
C1オリゴマーの使用により阻止される（レーン４）。ま
たより低いタンパク質濃度では、選択的保護が、AAGTGA
モチーフを含む領域（−80〜−70）に起こることが示さ
れている。

これらの結果は、このタンパク質がAAGTGAモチーフを
含む領域により高い親和性を有し、かつ、その周囲の領
域にはより低い親和性を持つことを示している。

変異体IFN−β遺伝子セグメントは、部位−106、−10
0、−73及び−67にＴ−Ｇ突然変異をもっている。同様
の検定条件のレーン５及び２の比較により、この組換え
タンパク質により提供される保護は、非変異領域に限定
されるようである（レーン２）。この観察は、これら変
異体の導入がL929細胞におけるNDVによる転写誘導の著
しい減少（20倍）を招き、かつ、変異体IFN遺伝子に対
するIRF-1のインビトロにおける結合が非変異領域のみ
に顕著であるという観察と一致している。

さらに、C1オリゴマーの使用は、このタンパク質がこ
のオリゴマー配列を含む領域を特異的に保護することを
明らかにした。この保濃は、L929細胞由来の本来のIRF-
1によって提供されるものと一致した。

3.DNA競合検定この検定は、既知の転写制御DNA配列を含む種々のDNA
配列に対する、この組換えタンパク質の親和性をテスト
するために行った。その提作を以下に示す。

p-125cat（フジタ（Fujita）等、1987）から、IFN−
βプローブのHind III-Sal Iフラグメントを単離した。
このフラグメントは、＋19〜−125のヒトIFN−β遺伝子
配列を含んでいる。このDNAを、クレノーフラグメント
を用いた〔α−³²p〕dCTPによる両端の充填により３′
端ラベルした。

プローブDNAの比活性は8000cpm/f moleであった。

先に述べた条件下で、ゲル遅延検定を行った。

競合検定において、そのDNAを、第３図に示した結合
混合物中、種々の濃度の競合DNAの存在下でそのタンパ
ク質は反応させた。

複合体形成度は、オートラジオグラムの濃度解析によ
り定量した。競合DNA非存在下での複合体形成を100％と
した。

競合DNAの構造を以下に示す。

ａ）AP-1:以下の配列を有する合成DNA ｂ）TNF:TNF−α第１イントロンの＋1162〜＋2116に渡
る37bpのフラグメント（ネドウィン（Nedwin）等、198
5）。

ｃ）マウスH2-D^d：コーバー（Korber）等（1988）によ
り報告されているIRS要素（−159〜−123）に当る37bp
の合成DNA。

ｄ）ヒトIFN−α：ウイルス応答要素に対応する4bbpの
合成DNA。ライアルス（Ryals）等（1985）参照。

ｅ）へキサマー配列C1、C2、C3、C4及びC5A。

C1及びC5Aの配列は先に述べた。C2、C3及びC4の配列
は、セル（cell）、49、352-367（1987）に公表されて
いる。それらは各々で表わされる。

ｆ）＋19〜−66のIFN−β遺伝子配列。

第３図において、左側のパネルは、反復へキサマーを
競合者として用いたときに得られた結果を示している。
中央のパネルはヒトのIFN遺伝子セグメントを競合者と
して使用したときの結果を示しており、右側のパネル
は、パネル中に示した種々のDNAセグメントを用いたと
きの結果を示している。

第３図の結果から、シフトバンドの出現は、C1、C2、
C3、C4の効率順でへキサマー配列と競合しているが、C5
Aとは有意に競合しなかったことが分る。

また、ヒトIFN−α１又はマウスH-2D^d遺伝子の制御要
素に渡る合成DNAセグメントは、競合活性を示すことが
観察された。このことは、H-2D^d遺伝子のDNAセグメント
が、細胞がIFNに応答するとき、促進因子として械能す
るいわゆるIFN−応答配列を含むことから特に興味深い
（スジタ（Sugita）等、1987;イスラエル（Israel）
等、1986;コーバー（Korber）等、1988）。

事実、IFN−β遺伝子にみられるものと同様又は同一
の配列モチーフが、核因子が特異的に結合すると考えら
れるIFN誘導性遺伝子の多数のプロモーター中に見い出
される（コーバー（Korber）等、1988、レリー（Lery）
等、1988）。

第３図に示される結果は、L929細胞に由来する天然の
タンパク質を用いたときと同様の条件下でこの検定を再
現したとき得られる結果と非常によく似ている。

（マウスIRF-IをコードするcDNAの構造）クローン化したDNAのDNA配列は、ダイデオキシ法（シ
ークエナーゼ、コナイテッドステートバイオケミカルス
製）又は、標準マキサム・ギルバート法（マキサム（Ma
xam）及びギルバート（Gilbert）、1980）により決定し
た。

大腸菌Yl089におけるλL28-8挿入物を以下のように単
離した。そのファージDNAを標準操作で調製し、EcoRIで
消化後、このファージDNAから切り出したcDNAを単離し
てから、ダイデオキシ法（シークエナーゼ；ユナイテッ
ドステートバイオケミカル社製）で配列決定した。λL2
8-8中のcDNA挿入物は1.8kb長であることが分った。その
ヌクレオチド配列分析によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子と相を同じくした大きい読み枠配列が明らかになっ
た。

より大きいcDNA挿入物を含むクローンをスクリーニン
グするため、二本鎖cDNAをL929細胞由来のポリ（Ａ）⁺R
NAで合成し、アルフォ（Aruffo）及びシード（seed）
（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（proc,Natl,Acad,Sci）USA、84、857
3、1987）及びシード（seed）（ネイチャー（Natur
e）、329、840-842、1987）の公表されている操作に従
ってベクターCDM8中にクローニングした。

この組換えプラスミドを大腸菌MClO61/p3株に導入し
（アルフォ（Aruffo）及びシード（seed）の提作に従が
う、上述）、cDNAのクローンを、DNA-DNAハイブリダイ
ゼーションのための低イオン強度条件下でλL28-8由来
の（³²Pラベル化）cDNAプローブでスクリーニングして
（カシマ（Kashima）等、ネイチャー（Nature）、313、
402-404、1985）、次の実験のためのクローンpIRF-Lを
選択した。

pIRF-Lの目的とするcDNA挿入物は、Hind III及びxba
Iによる消化で入手し、先に示した方法で配列決定し
た。この配列を一般式IV及び第４図に示す。

λL28-8由来のcDNA配列は、１個のＡ残基がヌクレオ
チド1773及び1781の間で欠失していること以外、重複領
域に同一配列を含んでいることが分った。

λL28-8由来のcDNAの５′及び３′末端を、第４図中
に矢印で示した。おそらくmRNAの不安定性に関するATTT
ATTTA及びATTTA配列を枠で囲んだ。

第4A図から明白なように、pIRF-L由来のマウスcDNA
は、λL28-8cDNAのcDNAより、５′及び３′末端で各々1
98bp及び20bp長かった。

この遺伝子のプロモーター領域を含むゲノムDNA配列
の分析は、pIRF-LのcDNAは、主要CAP部位から約30bpを
欠失していることが明らかになった。以下及び一般式Ｖ
及び第７図参照。

第１のATGコドンの直ぐ上流の配列、GGACCATGCは、翻
訳開始部位のコザック（Kozac）のコンセンサス配列とよく一致している。

同相のATC配列は、上述のATG配列の上流配列中には見
い出されず、このことは、事実それがIRF-I mRNAに対す
る開始コドンであることを確認した。

先に述べたように、３′側非コード領域以外、重複領
域内のλL28-8及びpIRF-LのcDNAのヌクレオチド配列間
に差がないことが検出された。

従って、マウスIRF-Iは、37.3kDの計算上の分子量を
有する329個のアミノ酸からなることが分った。規範的
なＮ−グリコシレーション部位はこの配列内には見い出
されない。

タンパク質配列データベース（ナショナル・バイオメ
ディカル・リサーチ・ファンデーション（Natl,Biomed,
Res,Found,）ワシントン,D,C,）及びより最近に企表さ
れた配列の検索によってはその他のタンパク質に対して
有意な相同性は検出されなかった。

カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）（198
2）に従うハイドロパシープロット解析は、このタンパ
ク質は全体として非常に親水性が高いことを示した（第
4B図）。

マウスIRFの推定される一次配列の洞察により、次の
性質が明らかになった。

アミノ酸（a,a,）140までのアミノ末端側半分は、リ
ジン（Lys）及びアルギニン（Arg）が豊富である。事
実、全Lys及びArg残基39個のうちの31個は、この領域に
存在する。第4B図の下側パネルには、塩基性アミノ酸
（Arg、Lys）（上欄）及び酸性アミノ酸（Asp、Glu）
（下欄）の位置を図的にまとめて示してある。

第4B図に示してあるように、この領域は強い親和性を
示し、特異的DNA配列へのIRF-Iの結合を主として担って
いる領域であると考えられている。

これと関連して、ジンクフィンガーやヘリックス−タ
ーン−ヘリックスモチーフなどの（パボ（Pabo）及びサ
ウア（Sauer）、1984、エバンス（Evans）及びホレンバ
ーグ（Hollenberg）、1988）多くのDNA結合タンパク質
に特徴的なモチーフは、IRF-Iタンパク質には検出され
なかった。

対照的に、この分子の残りの部分（すなわちカルボキ
シル末端半分）は、比較的アスパラギン酸（Asp）、グ
ルタミン酸（Glu）、セリン（Ser）及びスレオニン（Th
r）を多く含んでいる。189個のアミノ酸のうち、33個
（17％）は酸性アミノ酸であり、また36個（19％）はSe
r及びThrである。特に、５個の連続した酸性アミノ酸ク
ラスターが227〜231のアミノ酸内に見られる。Ser及びT
hrに関しては、多くのものがこのクラスターを形成して
いるようである（153-156、190-192、206-208、220-222
のアミノ酸領域、以後Ｓ−Ｔ領域と呼ぶ）。このＳ−Ｔ
領域は、第4B図の下側パネル中、小さな逆三角形で示し
た。

（ヒトIRF-IをコードするcDNAの構造）マウスIRF-Iに対する操作と同様の操作に従がい、ヒ
トのIRF-I cDNAをクローン化し、かつ配列決定した。

ヒトのcDNAライブラリーを、ヒトＴ細胞系列ジャーカ
ト（Jarkat）由来のポリ（Ａ）⁺RNAを用い、cDNAを合成
することにより調製した。二本鎖cDNA合成及びひきつづ
くプラスミドベクターCDM8へのクローニングはアルフォ
（Aruffo）及びシード（Seed）（プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）USA、84、8573-8577、1987）及びシ
ード（Seed）（ネイチャー（Nature）、329、840-842、
1987）の操作に従って行った。

この組換えプラスミドを、先に述べたアルフォ（Aruf
fo）及びシード（seed）の操作を用い、大腸菌MCl061/p
3株に導入した。

マウスIRF-I cDNAとクロスハイブリダイズするcDNAの
クローンをDNA-DNAハイブリダイゼーションのための低
イオン強度条件下、プローブとしてλL28-8cDNA（³²Pラ
ベル化）を用いてスクリーニングした。使用した条件
は、カシマ（Kashima）等（ネイチャー（Nature）、31
3、402-404、1985）により報告されているものと全く同
じである。

クローンpHIRF31の目的cDNA配列は、このプラスミドD
NAをxho Iで消化し、単離後、上述の方法によって配列
決定した。ヒトIRF-I遺伝子の構造を一般式II及び第８
図に示した。

推定されるマウス及びヒトのIRF-Iの配列を比較のた
め並列して第５図に示した。

ヒトDNAの分析は、このIRF-IがマウスIRF-Iに比べア
ミノ酸４個短かくなっていることを示した。

アミノ酸配列の強い保存性が２つのIRF-I分子間に見
ることができる。特に、アミノ末端側半分の140個のア
ミノ酸のうちの133個（95％）は、同一であると言い得
る。

合せて言うと、上述の観察は、IRF-Iが新しいクラス
のDNA結合タンパク質であることを示している。

また、多くのサイトカイン及びプロトオンコジーンmR
NA中に見られる配列ATTTATTTA及びATTTAは、マウスのIR
F-I cDNAの３′非翻訳領域内に存在し、また、配列ATTT
Aは、同様に、ヒトIRF-I cDNAの相当する領域内に存在
することは特筆すべきである。これらの配列は、遺伝子
の翻訳後の制御において、mRNAに不安定性を与えること
による役割を果していると考えられている（ショウ（sh
aw）及びカメン（Kamen）、1986;カプト（caput）等、1
986）。

プラスミドpIRF-Lを大腸菌MCl061/p3にトランスフェ
クトし、これを、ブタペスト協定に基づき、1988年８月
19日、ファーメンテーション・リサーチ・インスチチュ
ート・エイジェンシー・オブ・インダストリアル・サイ
エンス・アンド・テクノロジー（Fermentation Researc
h Institute Agency of Industrial Science and Techn
ology）（FRI）（日本茨城県筑波市，東一丁目１−３）
に、登録番号FERMBP-2005、大陽菌MCl061/p3（pIRF-L）
として登録した。

同様にプラスミドpIRF31を大腸菌MCl061/p3にトラン
スフェクトし、これを、ブダペスト妨定に基づき、1988
年８月19日、登録番号FERM BP-2006、大陽菌MCl061/p3
（PHIRF-31）として登録した。

IRF遺伝子の制御 1.IRF-I mRNAの発現 IRF-IがIFN−β遇伝子以外の遺伝子の制御配列に対す
る親和性を表わし、かつ種々の細胞における一群の遺伝
子の制御に関係しているという事実から、種々の組織及
び器官由来のマウス細胞におけるIRF-I mRNAの発現試験
を、プローブとしてマウスcDNAを用いて行った。このプ
ローブを調製するため、IRF-I遺伝子のPstIフラグメン
トのセンス鎖を含むM13 mpl0ファージDNA（以下参照）
をテンプレートとして用い、³²Pラベル化アンチセンスD
NAを合成し、この産物をEcoRIで消化後、このプローブD
NAをフジタ（Fujita）等の方法に従がい単離した。

全RNAをアルフォ（Aruffo）及びシード（Seed）（198
7）により確立された操作法により単離した。

ついでブロッティング分析を基本的にトーマス（Thom
as）（1980）の方法を用いて行ない、Ｘ線フィルムは３
日間露光した結果を第6A図に示す。種々のレーンは、以
下の組織に由来する総細胞RNAを用いて行った実験結果
を示している。

レーン1 脳レーン2 心臓レーン3 肝臓レーン4 肺レーン5 脾臓（非活性化）レーン6 胸腺レーン7 腎臓レーン8 筋肉レーン9 腸レーン10 脾臓（非活性化）レーン11 ConA−括性化脾臓レーン８では1.2μｇのRNAを用いた以外は各レーンと
も５μｇの総細胞RNAを用いた。

第6A図から、約2.0kbに相当するバンドは本ブロッテ
ィング分析により、ほとんどのRNAサンプルから検出さ
れたことが分る。もっともmRNA発現レベルは低いようで
ある。脾臓由来のリンパ球におけるmRNA発現レベルは、
ConAによる活性化後著しく増加したことは重要である
（レーン11）。

さらに検定するため、先に示されているように（フジ
タ（Fujita）等、1985）NDVを用いてマウスL929細胞を
誘導し、ついでアルフォ（Aruffo）及びシード（See
d）、1987の操作により、感染後３時間目に、細胞質性R
NAを抽出した。

プロブDNAを以下に示す種々の配列から調製し、マル
チプライムラベル化反応により（アマーシャム社）ラベ
ル化した。

（ｉ）λL28-8由来の1.8kb EcoR Iフラグメント（比活
性２×10⁸cpm/μｇ）。

（ii）マウスIFN−βゲノムクローン由来の0.5kb BamHI
-Bgl IIフラグメント（比活性５×10⁸cpm/μｇ）及び（iii）ヒトβ−アクチンシュードジーンを含むクロー
ンの2.0kb BamH I-Pvu IIフラグメント（比活性５×10⁸
cpm/μｇ）。

この結果を第6B図に示す。ブロッティング分析は、ト
ーマス（Thomas）（1980）の操作を用い、先に述べたよ
うに行った。

各レーンは10μｇの細胞質性RNAを含んでいる。Ｘ腺
フィルムは３時間露光した。濃度分析で、IRF-I mRNAは
NDV感染から９〜12時間後に、約25倍増加したことが分
った。

mRNAの増加は劇的であるが、誘導から９〜12時間後に
ピークに達し、15時間後に元に戻るという一時的なもの
であった。mRNAの蓄積はIFN−β mRNAの蓄積を促進し
た。すなわち第6B図から分るように、IRF-I mRNAの誘導
は、NDV感染から３時間後すでに観測し得るが、一方、I
FN−βmRNAは、両RNAに対し同様のブロッティング条件
下、感染から６時間後に検出された。

（IRF-Iプロモー夕ー）先に説明したように、IRF-I遺伝子は、ウイルス及び
マイトジェンなどの種々の試剤により転写時に制御され
る。染色体DNAのサウザーンブロット分析は、IRF-I遺伝
子がマウス中でスプライスされ、かつ多重化されないこ
とを示している。

新生マウスDNAを含むλファージライブラリーを、先
に使用した同λL28-8由来のcDNAプローブを用い、IRF-I
プロモーター配列を宿すクローンに関するスクリーニン
グした。４個のポジティブクローンが同定され、その全
てが同ゲノムDNAを含むことが分った。そのうちの１
つ、λg14-2をさらに分析するために使用した。PstIフ
ラグメントをpUC19のPstI部位にサブクローンし、P19IR
FPを構築した。

その後、同DNAをM13mp 10及びM13 mp 11のPstI部位に
クローン化し、それらを配列分析用のDNAを作るのに用
いた。

上記クローン由来のPstIフラグメントのヌクレオチド
配列分析を先に示した方法で行った。メジャー及びマイ
ナCAP部位をSIマッピング分析で同定した。

決定された配列を第7A図に示す。ここから分るよう
に、このDNAの下流配列は、pIRF-L由来のcDNAの下流配
列と完全に一致している。

S1ヌクレアーゼ分析は、IRF-I mRNAに対する２つのCA
P部位の存在を示している。メジャー部位は、マイナー
部位の約20ヌクレオチド下流に存在する。典型的なTATA
ボックス配列は、この遺伝子の上流領域には存在しな
い。CpG配列が異常に多いことから、おそらくこの領域
は“HTFアイランド”（バード（Bird）、1986）を構成
しているのであろう。

このプロモーター領域は２つのGCボックス及び１つの
CAATボックスを含んでいる（第7A図参照）。前者のボッ
クスはSpIと結合し（カドガン（Kadogan）等、1986）、
また後者はCP-1又はCP-2と結合する（チョドシュ（chod
osh）等、1988）。

その後、このプロモーター配列を含むPstIフラグメン
トについて例えば以下の方法におけるウイルス誘導性
等、細胞外シグナルに応答する反応性をテストした。

PstIセグメントの下流にレポーター遺伝子、すなわち
細菌性クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）遺伝子を組込んだキメラ遺伝子を構築し
た。これは、p19IRF由来のPstIフラグメント（上述）を
BamH I及びHind IIIで切断し、生成したフラグメントを
pA₁₀cat₂のBgl II-Hind IIIメジャーフラグメント（ロ
ーゼンタル（Rosenthal）等、1983）にクローニングす
ることによって行ない、pIRF catを構築した。

さらにいくつかの構築物を以下のように調製した。

メジャーCAP部位から−30〜−35に位置する唯一のHae
III部位を含むp19IRFP由来のBamHI-Hind IIIフラグメ
ントをHae IIIで消化することによりpIRFΔcatを調製し
た（第5A図参照）。生成したHae III-Hind IIIフラグメ
ントをpA₁₀ cat₂のBgl II-Hind IIIメジャーフラグメン
トの合成DNA にライゲーションをした。

従って、pIRF cat及びpIRFΔcatは、メジャーCAP部位
から各々−320及び−48までの位置に配列を含んでい
る。

ｐ−125catは、フジタ（Fujita）等（1987）により述
べられているように、ヒトのIFN−β遺伝子のプロモー
ター配列を含んでいる。

pSV2catはゴーマン（Gorman）等（サイエンス（Scien
ce）、221、551-553）により報告されている。

レファレンス遺伝子として、pRSV gptを使いた（ゴー
マン（Gorman）等、上述参照）。

リン酸カルシウム法を用い、マウスL929細胞中に種々
の遺伝子をトランスフェクトした（フジタ（Fujlta）
等、1985）。５×10⁶細胞を、7.5μｇのCATレポーター
遺伝子を含むテストプラスミド及び2.5μｇのpRSV gpt
でトランスフェクトした。この細胞をNDVで誘導する
か、又は、偽誘導した後、フジタ（Fujita）等（1985）
により報告されている酵素検定法で試験した。

相対的CAT活性を計算するために、pSV2catでトランス
フェクトした偽誘導細胞由来のCAT活性を100％とした。
各CAT活性は、各サンプルのEco gptにより（ムリガン
（mulligan）及びバーグ（Barg）、プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）USA、78、2072-2076）標準化し
た。CATがバックグランドレベル以下のサンプルについ
ては、b.b.と印した。

その結果を第7B図に示す。

マウスL929へのpIRF catのトランスフェクションは、
低レベルのCAT活性を与えることが分る。このCAT発現レ
ベルはトランスフェクトした細胞をNDVで活性化した時
増加した。実際に、IRF-I遺伝子の300bp上流配列の欠失
（pIRFΔcat）はCAT遺伝子の構成的及び誘導性の発現を
阻害した。このことは、このプロモーター配列が300bp
上流領域内に存在し、かつウイルス誘導性であることを
示している。

（発現プラスミドの構築） 1.クローンλL28-8のファージDNAをEcoRIで消化し、CDN
A挿入物を回収した。そのcDNAのEcoRI部位をT4DNAポリ
メラーゼで平滑化した後、アルフォ（Aruffo）及びシー
ド（Seed）（1987）の方法に従がい、配列 pGATCCATTGTGCTGG及びpCCAGCACAATG で表わされる合成アダプタ−DNAとライゲーションし
た。

5-20％酢酸カリウム密度勾配遠心によりその合成DNA
を除去後（アルフォ（Aruffo）及びシード（seed）（19
87））、両端に結合したアダプターDNAを含むIRF-I cDN
AをBstX I切断CDM8ベクターDNAとライゲーションした
（シード（seed）、Ｂ、ネイチャー（Nature）、329、8
40-842、1987）。CMVプロモーターに関し、各々センス
及びアンチセンス配向性のIRF-I cDNAを含むpIRF-S及び
pIRF-Aを単離した。

各プラスミドDNAを、p-55cat又はp55CIBとともにL929
細胞へコトランスフェクトし、ついでそのCAT発現レベ
ルを測定した。

その結果を以下の第１表に示す。

DNAのトランスフェクション効率は、受容細胞の状態
に依存して変化する（この場合、マウスL929細胞）。こ
の効率は実験１に比べ実験２では非常に低かった。それ
ゆえ、CAT発現レベルは実験２において相対的に低かっ
た。

上記表から分るように、有意なCAT活性は、P-55CIB及
びpIRF-Sでトランスフェクトした細胞においてのみ検出
された。それらは、IRF-Iがp-55CIB中のCAT遺伝子の上
流に存在する反復（８回）AAGTGA配列に結合し、それに
より末端のCAT遺伝子の転写を促進することを示してい
る。

さらにこの結果は、CAT発現レベルがNDVでその細胞を
トランスフェクトすることにより増加する（２倍以上）
ことを示し、このことは、ウイルスのような種々の刺激
剤で遺伝子発現をコントロールし得ることを示してい
る。

2.IRF-I DNA結合ドメイン及びイーストGAL4の転換活性
化ドメインからなるタンパク質生産のための発現プラス
ミドを以下のように構築した。

プラスミドpIRF-SをHind III及びpstIで消化し、その
cDNA挿入物を単離した。このcDNAをDra IIIで消化し、
そのHind III-Dra IIIフラグメント（約550bp）を回収
してフラグメントＡと命名した。

発現ベクターCDM8をHind III及びXba Iで消化しその
メジャーDNAを単離しフラグメントＢと命名した。

イーストのGAL4転写活性化ドメインをコードするDNA
を以下のようにプラスミドpRB968（マ（Ma）及びパシン
（Ptashne））から単離した。

まずpRB968DNAをHind IIIで消化し、その末端をT4DNA
ポリメラーゼにより平滑化した。このDNAに合成xba Iリ
ンカーDNAを付加し、つづいてそのDNAをPvu II及びxba
Iで消化した。

生成したおよそ600bpのPvu II-Xba Iフラグメントを
回収しフラグメントＣと命名した。

さらに、以下に示す配列の合成DNAを合成し、フラグメントＤを命名した。

フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＤをライゲーションする
ことにより発現ベクターpIRFGAL4を構築した。コントロ
ールプラスミドとして、フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及び以
下の配列；の合成DNAをライゲーションしてプラスミドpIRFΔGAL4
を構築した。

ターミネータートリプレット、TGAが、pIRFΔGAL4中
のIRF-I及びGAL4配列の間に相を同じくして存在するの
で、その発現タンパク質はGAL4活性化ドメインを欠除し
ているはずである。

プラスミドにコードされているキメラ転写因子の機能
性をテストするため、pIRFGAL4及びpIRFΔGAL4を各々、
p-55CIBとともにL929細胞にコトランスフェクトと、そ
のCAT発現をモニターした。この結果を以下の第２表に
示す。

宿主細胞：マウスL929細胞、細胞はNDVによる誘導を行
なわなかった。

これらの結果は、インターロイキン、インターフェロ
ン（α，β及びγ）、プラスミノーゲン活性化因子、エ
リスロポイエチン、顆粒球コロニー活性化因子、インシ
ュリン、ヒト成長ホルモン又はスーパーオキシドジスミ
ューターゼ（又はヒト遺伝子の変異体）をコードする遺
伝子のような目的遺伝子の発現は、IRF-Iで増加し得る
ことを示している。

IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IFN−オメガ等のインタ
ーフェロン遺伝子及びｔ−PA、プロウロキナーゼ又はウ
ロキナーゼ等のプラスミノーゲン活性化因子などの上記
の目的遺伝子は、例えばAAGTGAなどのIRF-Iに対する種
々の長さの認識配列と融合したプロモーターを含めるこ
とによってもより効率的に発現し得る。

例えばその目的遺伝子は本来のIRF-I又はキトラIRF-I
遺伝子と共に、種々の宿主細胞に誘導し得る。例えばAA
GTGA反復数の増加する等、IRF-I認識部位DNAの長さを増
加すること、及び転写因子の発現レベルの増加により、
目的遺伝子の高レベルの発現が達成し得る。

例えばAAGTGA反復配列を、IFN−βプロモーター又はS
V40ウイルス初期プロモーターなどの適当なプロモータ
ーに付加し得る。t-PA又はIFN−β遺伝子などの目的遺
伝子をこれらのプロモーターの下流に結合し得る。すな
わちこのように構築した遺伝子の構造は、 (AAGTGA)_x（プロモーター）（t-PA遺伝子などの目的
遺伝子）さらにこのような遺伝子を、例えばCHODXB II
（dhfr株）細胞のような（アーローブ（Urlaub）及びチ
ャシン（chasin）プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、77、4216-4220、1980）CHO細胞に導入し、こ
れを増殖した。

先に述べたように、理想的には、宿主細胞が内在性の
IRF-I活性を持たないか、又は実質的に持たない細胞か
ら選ばれることが望ましい。好ましくはCMVプロモータ
ーなどの強力なプロモーター又はメタロチオネン遺伝子
プロモーターなどの誘導性プロモーターを有するIRF-I
遺伝子を従来法により種々の宿主細胞に導入し得る。

このIRF遺伝子は目的遺伝子と共に導入し、増殖し得
るが、一方、IRF-I遺伝子及び目的遺伝子を別別に宿主
細胞に導入し得る。

このようにトランスフェクトした細胞においては、IR
F-Iは構成的にも（例えばCMVプロモーターの場合）又は
誘導的にも（例えばメタロチオネンプロモーターの場
合、亜鉛のような二価金属により誘導される）生産され
得る。発現したIRF-IはAAGTGA反復に結合し、そして別
えばt-PA又はIFN遺伝子などの末端目的遺伝子を増加さ
せる。

さらに、このような発現は、第１表から分るように、
NDV誘導のようにウイルスにより増大し得た。このよう
な誘導がIRF-Iの活性を増大させる実験２からも同様の
事が言える。

（一般式IIIのマウスIRF-I cDNAとクロスハイブリダイ
ズするマウスcDNA配列）マウスcDNAライブラリーを先に述べたように調製し
た。cDNAはマウスL929細胞由来のmRNAを用い、標準操作
により合成し、これを標準操作によりλgt IIベクター
に挿入した。生じたλgt IIライブラリーを、スクリー
ニングし、以下のように、上述したマウスIRF-I cDNAと
クロスハイブリダイズする挿入物を有するcDNAを単離し
た。

ファージプラークDNAを含むニトロセルロースフィル
ターを以下に示す段階のインキュベーションを行った。

（１）３×SSC中、65℃、30分間、つづいて（２）デンハート溶液（0.2％ウシ血清アルブミン、0.2
％フィコール、0.2％ポリビニルピロリドン25）を含む
３×SSC中60分間のインキュベーション、つづいて（３）1M NaCl、50mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM EDT
A、0.1％SDS、50μg/ml一本鎖キャリヤーDNA（例えばサ
ケ精子DNA）及びデンハート溶液を含む溶液中、65℃、1
2時間のインキュベーションを含むプレハイブリダイゼ
ーションステップ、つづいて、（４）プローブとして₃₂Pラベル化マウスIRF-I cDNAを
含めること以外は第３段階のインキュベーションを繰り
返す。このcDNAプローブは、λL28-8由来のEcoRI切断挿
入物として調製し、マルチプライムラベリングシステム
により（上述）ラベル化した。このインキュベーション
は65℃で12時間行った。

その後このフィルターを洗浄し、２×SSC溶液で簡単
にすすいだ後、0.1％SDSを含む３×SSC溶液を用い、65
℃で30分間洗浄した。この操作を２回繰返した。

pHH-45と命名したポジティブクローンの１つを選択
し、これがIRFのコード配列の一部のみをカバーするcDN
Aを含むことを明らかにした。

pHH-45中のcDNA挿入物を単離し、“マウスIRF-Iをコ
ードするcDNAの構造”という表題の基、pIRF-Lの調製の
ため、上述のより大きい挿入物を含むクローンのスクリ
ーニングに用いた。

ポジティブクローンと同定されたものの中からpIRF2-
5と命名される１つのクローンを選択し、マウスIRF-Iに
ついて述べた操作を用いて特徴づけた。完全にハイブリ
ダイズするcDNA配列を一般式IVａに示し、対応するIRF
タンパク質のアミノ酸配列を一般式IIIに示す。

プラスミドpIRF2-5を大陽菌MCl061/p3にトランスフェ
クトし、この大腸菌MC1061/p3（pIRF2-5）は1988年、11
月22日にベダペスト協定に基づき登録番号FERMBP-2157
でFRIに登録した。

（ヒトIRF-I cDNA配列とハイブリダイズするイーストゲ
ノム由来のcDNA）イーストのDNAを標準操作で調製し、EcoR Iで消化し
た。この消化DNA5μｇを0.8％アガロースゲルで電気泳
動し、標準操作によりDNAブロッティングを行った。

ブロットしたフィルターを以下に示したもの以外はマ
ウスIRF-IとハイブリダイズするマウスDNAを単離した先
の操作と同様に処理した。

ステップ（３）における温度は55℃で行ない、またス
テップ（４）におけるインキュベーションも、55℃で行
なった。また放射性プローブは、pHIRF31のXho I消化で
単離したヒトIRF-I cDNAを、マウスIRF-Iに対して先に
述べた例で示したようにラベル化して用いた。フィルタ
ーは２×SSC中55℃で洗浄した。ポジティブクローン
は、オートラジオグラフィーで同定した（第10図参
照）。

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【図面の簡単な説明】

第１図は種々の溶原性クローンに由来する核抽出物に関
する競合検定法の結果を示す。第２図は、IFN−βプローブの保護領域決定実験のオー
トラジオグラムを示している。第３図は、この組換えクンパク質の、種々のDNAに対す
る親和性を試験するため各濃度の競合DNAの存在下で競
合実験を行った結果を示す。第4A図はpIRF-Lの望ましいcDNA挿入物の配列を示してい
る。第4B図は、マウスIRF-Iの推定されるアミノ酸配列中の
塩基性及び酸性アミノ酸の位置を図的に示したものであ
る。第５図は推定されるマウス及びヒトのIRF-Iの配列を比
較のため並列して示してある。第6A図は種々の器官及び組織由来の総RNAを、プローブ
としてマウスcDNAを用いたブロッティング分析した結果
を示す。第6B図は、NDV誘導したマウスL929由来の細胞質RNAの、
種々のプローブを用いたブロッティング分析の結果を示
す。第7A図は、IRF-Iプロモーターを有するクローンのPstI
フラグメントの配列分析で決定された配列を示す。第7B図はCAT遺伝子を含む各プラスミドを有する細胞をN
DVで誘導したときのCAT活性を示す。第８図はヒトのIRF-I遺伝子の構造を示す。第９図はヒトIRF-I cDNAとコハイブリダイズする、イー
スト及びヒトDNAを示すオートラジオグラフを示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式IIIのDNA分子又はその相補配列にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインター
フェロン調節因子−１（IRF-1）の活性を有するタンパ
ク質をコードするDNA分子。
【請求項２】IRF-1活性を有するタンパク質をコードす
るDNA分子であって、一般式：又はで表されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする
前記DNA分子。
【請求項３】DNA分子であって、一般式：で表される構造遺伝子を特徴とするDNA分子又は該DNA分
子と縮重の関係を有する、IRF-1活性を有するタンパク
質をコードする変異体。
【請求項４】DNA分子であって、一般式：で表される構造遺伝子を特徴とするDNA分子又は該DNA分
子と縮重の関係を有する、IRF-1活性を有するタンパク
質をコードする変異体。
【請求項５】DNA分子であって、一般式：又はで表されるDNA分子又は該DNA分子と縮重の関係を有す
る、IRF-1活性を有するタンパク質をコードする変異
体。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNA
分子並びに以下の一般式：で表される配列中に含まれているプロモーターおよび調
節配列を含有する組換えDNA分子。
【請求項７】（ａ）請求項１〜６のいずれか１項記載の
DNA分子；及び（ｂ）目的とする医学的活性を有する、該DNA分子配列
でコードされるIRF−１タンパク質により発現が制御さ
れる構造遺伝子を含有し、該構造遺伝子のプロモーターがIRF-1活性分
子への結合部位を有する組換えDNA分子。
【請求項８】IRF-1活性分子をコードする遺伝子が構成
的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にある
請求項７記載の組換えDNA分子。
【請求項９】目的とする医薬的活性を有するタンパク質
の発現制御配列が多数のAAGTGA反復配列を含むIRF-1結
合部位を含む請求項７又は８記載の組換えDNA分子。
【請求項１０】目的とする医薬的活性を有するタンパク
質がサイトカイン又はプラスミノーゲン活性化因子であ
る請求項７〜９のいずれか１項記載の組換えDNA分子。
【請求項１１】請求項７記載の組換えDNA分子でトラン
スホームした宿主細胞。
【請求項１２】請求項８〜11のいずれか１項記載の組換
えDNA分子でトランスホームした宿主細胞。
【請求項１３】IRF-1活性を有するタンパク質をコード
する配列を含む第一のDNA分子と、該第一のDNA分子によ
りコードされるIRF-1タンパク質の制御下の、目的とす
る医薬的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
含む別個の第二のDNA分子によりトランスホームした請
求項12記載の宿主細胞。
【請求項１４】IRF-1活性分子をコードする遺伝子が構
成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にあ
る請求項13記載の宿主細胞。
【請求項１５】目的とする医薬的活性を有するタンパク
質の発現制御配列が多数のAAGTGA反復配列を含むIRF-1
活性タンパク質に対する結合部位を含む請求項13又は14
記載の宿主細胞。
【請求項１６】細菌細胞又はイースト細胞又は哺乳類細
胞であるトランスホームした請求項12〜15のいずれか１
項記載の宿主細胞。
【請求項１７】請求項12〜16のいずれか１項に記載の宿
主細胞を培養することを含む、目的とする医薬的活性を
有するタンパク質の製造法。
【請求項１８】宿主細胞にウイルスを感染させる請求項
17記載の方法。
【請求項１９】式IIIのDNA分子又はその相補配列にスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子に
よりコードされ、かつIRF-1の活性を有するタンパク
質。
【請求項２０】一般式；又はで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２１】請求項６記載の組換えDNA分子でトラン
スホームした宿主細胞を培養することを含む、IRF-1活
性を有するタンパク質の製造法。
【請求項２２】請求項１〜５のいずれか１項記載のDNA
配列を含有するプラスミド。
【請求項２３】式IIの配列を含有するプラスミドpHIRF3
1 FERM BP-2006。
【請求項２４】式IVの配列を含有するプラスミドpIRF-L
FERM PB-2005。