JPH11266886A - 遺伝子発現調節因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 反復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及びヒトＩ
ＦＮ−β遺伝子の上流制御要素に結合するタンパク質を
コードするＤＮＡ分子の提供。 【解決手段】 配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相
補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ反復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及びヒトＩＦ
Ｎ−β遺伝子の上流制御要素に結合するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ分子。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】一般的に本発明は遺伝子発現
の調節に関する。特にインターフェロン調節因子−１
（ＩＲＦ−１）の活性を有するタンパク質をコードする
組換えＤＮＡ分子、ＩＲＦ−１活性タンパク質をコード
するＤＮＡ配列及び該配列に機能的に結合するプロモー
ター及びレギュレーター配列を特徴とする組換えＤＮＡ
分子、該ＩＲＦ−１活性タンパク質の制御下にあり、か
つ目的タンパク質をコードするＤＮＡ分子により宿主細
胞をトランスホームするための該ＤＮＡ分子の使用、医
薬的に活性なタンパク質をコードする配列及びＩＲＦ−
１活性分子に対する結合部位を含む該タンパク質遺伝子
のプロモーター領域を含む該ＤＮＡ分子、及び該ＤＮＡ
分子によりトランスホームした適当な宿主細胞を培養す
ることによる該ＩＲＦ−１活性タンパク質及び／又は該
医薬的に活性なタンパク質の生産に関する。

【従来の技術】ホ乳類細胞に於ける遺伝子の転写は、制
御ＤＮＡ配列とトランス作用型ＤＮＡ結合タンパク質と
の相互作用が中心的役割を果す複雑なメカニズムで制御
される。転写制御に関し、インターフェロン（ＩＦＮ）
をコードする遺伝子は、多くのサイトカイン遺伝子に共
通する特徴をもつ。すなわち、これらの遺伝子の転写は
種々の細胞外シグナルに従い一時的に誘導される。ＩＦ
Ｎ−α及びＩＦＮ−βの遺伝子の転写は、種々の細胞に
おいてウイルスにより効率的に誘導され、一方ＩＦＮ−
γをコードする遺伝子の転写は、Ｔリンパ球においてマ
イトジエン活性化後に誘導されることが報告されている
（レヴューは、ワイズマン（Weismann) 及びウェーバー
（Weber)、１９８６；タニグチ（Taniguchi)、１９８８
参照）。

【０００１】元々強力な抗ウイルス活性により同定され
たサイトカインであるＩＦＮ−βも、細胞増殖及び細胞
分化をコントロールする上で重要な役割を果しているよ
うである。これに関し、ＩＦＮ−β遺伝子のよく知られ
ているインジューサーであるウイルス及びポリ（ｒ
Ｉ）：ポリ（ｒＣ）の他に、コロニー活性化因子−１
（ＣＳＦ−１）（ムーア（Moore)等、１９８４；ワレン
（Warren) 及びラルフ（Ralf)、１９８６；レスニスキー
（Resnitzky)等、１９８６）、腫瘍ネクロシス因子（Ｔ
ＮＦ）（オノザキ（Onozaki)等、１９８８）、血小板由
来成長因子（ＰＤＧＦ）（ズロ（Zullo)等、１９８５）
及びＩＦＮ類（コハセ（Kohase) 等、１９８７）等の多
数のサイトカインも、特定の細胞中でＩＦＮ−βを誘導
するようであり、このことは、これらが標的細胞におい
て同様の又は同一のシグナルを誘導することを示唆して
いる。ウイルス及びポリ（ｒＩ）：ポリ（ｒＣ）による
ＩＦＮ遺伝子の誘導は、転写レベルで起こることが示さ
れた（ラジ（Raji) 及びピサ（Pitha)、１９８３；オー
ノ（Ohno) 及びタニグチ（Taniguchi)、１９８３；ジン
ター（Dinter) 等、１９８３、ジン（Zinn) 等、１９８
３）。このように誘導促進因子として機能するシス型Ｄ
ＮＡ配列がヒトＩＦＮ−β遺伝子の５′隣接領域内に同
定された（フジタ（Fujita) 等、１９８５、１９８７；
グットバーン（Goodborn) 等、１９８５；ジンター（Di
nter) 及びハウザー（Hauser) 、１９８７）。誘導促進
因子領域（すなわちＣＡＰ部位に関しては−65〜−105
）には、事実多重化したときに転写の誘導活性化に機
能する反復ヘキサヌクレオチドを含む（フジタ（Fujit
a)、１９８７）。

【０００２】

【発明の内容】我々はマウスＬ９２９細胞及びヒト細胞
などのホ乳類細胞において、特異的にＩＦＮ−β制御配
列に結合する因子、ＩＲＦ−１及び機能性反復ヘキサヌ
クレオチド配列：（ＡＡＧＴＧＡ)₄を同定した。我々
は、ＩＲＦ−１が、同定されたシス型成分と相互作用す
ることにより、ＩＦＮ−β遺伝子転写のウイルス誘導活
性化において基本的役割を果していることが分った。広
範な特徴に従い、本発明は、配列番号１記載のＤＮＡ分
子又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ反復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及
びヒトＩＦＮ−β遺伝子の上流制御要素に結合するタン
パク質をコードするＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分
子は、構成的、又は例えばニューキャッスル病ウイルス
などによるウイルス誘導性、又はコンカナバリンＡを用
いるなど、マイトジエン活性化により誘導されるなど、
誘導性のプロモーター領域を含み得る。

【０００３】ＩＲＦ−１活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列は、ヒト及びマウスばかりでなく、例
えばニワトリ、カエル及びイーストなどの真核性生物由
来で、先に述べたヒトまたはマウスのＩＲＦ−１のＤＮ
Ａ配列にハイブリダイズし、かつＩＲＦ−１活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。図
４〜６で定義したようにマウスのＩＲＦ−１のｃＤＮＡ
にハイブリダイズする１つのｃＤＮＡ分子を配列番号１
に示す。例えば、このＤＮＡ分子は、配列番号１で表わ
される構造遺伝子及び配列番号３のＤＮＡ配列内に含ま
れる上流及び下流の隣接配列により特徴づけられる。

【０００４】以下にヒト細胞及びマウス細胞由来のヒト
及びマウスＩＲＦ−１をコードするｃＤＮＡ分子及びマ
ウス細胞及びイースト由来の各々マウスＩＲＦ−１及び
ヒトＩＲＦ−１のｃＤＮＡにハイブリダイズするｃＤＮ
Ａの単離について説明する。この組換えＤＮＡ分子は、
例えばサイトカイン又はプラスミトゲン活性化因子など
の医学的に活性のあるタンパク質を発現するように設計
し得るし、またこの型のものにおいてはＩＲＦ−１活性
分子に対する結合部位を含む該タンパク質の遺伝子のプ
ロモーター領域を機能的に結合した該タンパク質の構造
遺伝子を含むことが望ましい。従って組換えＤＮＡ分子
は、先に定義したＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列によりコ
ードされるＩＲＦ−１活性タンパク質の制御下の、目的
とする医学的に活性なタンパク質の構造遺伝子を含む。
このような組換えＤＮＡ分子において、ＩＲＦ−１活性
分子をコードする遺伝子は、構成的プロモーターの制御
下にあることが好ましく、又は誘導性プロモーターの制
御下にあることが最も好ましい。目的とする医学的に活
性なタンパク質の遺伝子は、反復ＡＡＧＴＧＡ配列を含
むＩＲＦ−１結合部位を含むことが望ましい。

【０００５】また、先に定義した組換えＤＮＡ分子でト
ランスホームした、例えば大腸菌などの細菌、又はイー
スト細胞、又は例えばＣＨＯ細胞又はＬ９２９などのマ
ウス細胞などのホ乳類細胞などの宿主細胞も含む。理想
的には、これらの宿主細胞は、内在するＩＲＦ−１活性
が無いか、又は実質的に含まない細胞系列から選ばれた
ものであることが望ましい。別に、医学的に活性なタン
パク質の生産のため、宿主細胞がＩＲＦ−１活性を有す
るタンパク質をコードする配列を含む第１のＤＮＡ分
子、及び第１のＤＮＡ分子にコードされているＩＲＦ−
１活性タンパク質の制御下の、目的とする医学的に活性
なタンパク質をコードする遺伝子を含む別個の第２のＤ
ＮＡ分子でトランスホームされる。ＩＲＦ−１活性分子
をコードする第１のＤＮＡ分子は、ＩＲＦ−１活性化合
物をコードする遺伝子に機能的に結合する構成的プロモ
ーター配列又は最も望ましくは誘導性プロモーター配列
を含むことが好ましい。また、第２のＤＮＡ分子は反復
ＡＡＧＴＡＧ配列を含む、ＩＲＦ−１活性タンパク質の
結合部位を含むことが望ましい。ＩＲＦ−１活性タンパ
ク質又は医学的に活性なタンパク質は、これらの形質転
換細胞の培養及び従来法による生産タンパク質の単離に
より生産し得る。うまいことに、宿主細胞は、以下に説
明するように、ＩＲＦ−１をコードする遺伝子に機能的
に結合するプロモーターに適当な処理を行うことで発現
が誘導される。また、先に定義したＤＮＡ分子でトラン
スホームした宿主細胞の培養て得られるＩＲＦ−１活性
を有するタンパク質も含む。

【０００６】配列番号１のｃＤＮＡ配列によってコード
される好ましいタンパク質は、配列番号２で表わされる
配列を有している。以下にＩＲＦ−１活性を有するＤＮ
Ａ結合タンパク質をコードするマウス及びヒトのｃＤＮ
Ａの分子クローニング及び特性化を説明する。クローン
化ｃＤＮＡの解析によりマウス及びヒトのＩＲＦ分子の
間に著しい配列保存性があることが明らかになる。さら
にＩＲＦ−１をコードする遺伝子の発現は、マウスＬ９
２９細胞及び脾臓リンパ球において各々ニューキッスル
病ウイルス（ＮＤＶ）及びコンカナバリン（ConA）によ
り誘導されることが示されている。 1. 大腸菌におけるＩＲＦ−１のクローニング及び発現 Ａ．ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを未誘導のマウスＬ９２９細胞
から単離し、ｃＤＮＡの合成に用いた（アルホ（Aruff
o）及びシード（Seed) の方法に従う、１９８７）。生
成したｃＤＮＡをEcoRI 切断したλgtllベクターにクロ
ーン化し、ついで宿主株として大腸菌Ｙ１０９０を用
い、ハイン（Huynh)等（１９８５）の標準操作に従がい
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このλgtllライブラ
リーをプローブとして多重化（４個）ＡＡＧＴＧＡ配列
（以下Ｃ１オリゴマーと呼ぶ、フジタ（Fujita) 等、１
９８７）を用いてスクリーニングした。

【０００７】このスクリーニング操作では、組換えλgt
llファージを感染した大腸菌Ｙ１０９０を１０×１３cm
四角プレート上にプレーティングした。それからこのプ
レートを１２℃で４〜５時間インキュベートすると、プ
レート当り約２0,０００個のプラークが出現した。スク
リーニング用のメンブレンフィルターはナイロン製（ナ
イトラン、シュレイチャー・アンド・シュネル社製）又
はニトロセルロース製（シュレイチャー・アンド・シュ
ネル社）の膜である。このフィルターを１０mMＩＰＴＧ
（適当なファージプラークにおけるｌacＺ遺伝子発現を
誘導する）に浸し、空気乾燥後プレート上に置いて、３
７℃で2.５時間インキュベートした。もし、ｃＤＮＡが
ｌacＺ遺伝子と読み枠がそろっていれば、そのプラーク
は、そのｃＤＮＡによりコードされているタンパク質を
生産するであろう。その後、このフィルターを取り出
し、４℃で２０分間冷やした後、乾燥させないようにし
てスクリーニングを行った。検定のため、メンブレンフ
ィルターを以下のように調製した。マウスＬ９２９細胞
から核抽出物を調製し、それをメンブレン上にスポッテ
ィングした（約１０μg のタンパク質相当量）。

【０００８】ＤＮＡ結合を行う前に、１０mMへペス（pH
7.5）、5.0 mM NaCl 、１mMＤＴＴ、１mMＥＤＴＡ、５
％グリセリンを含む結合バッファを用いた。５％脱脂粉
乳（ユキジルシ社製）をこのバッファに加え、この混合
物中でフィルターを４℃、１時間インキュベーションし
た後、粉乳を含まない同バッファ中に１分間洗浄した。
その後、このフィルターを、約３００bp平均長のサケ精
子ＤＮＡ３５０μg ／ml及び³²Ｐラベル化プローブＣｌ
オリゴマーＤＮＡ（１０⁶cpm/ml 、比活性２０００cpm/
f mole) 、（フジタ（Fujita) 等、１９８７参照）を含
む結合バッファ（１ml）中でインキュベートした。この
プローブＤＮＡは、Ｔ４キナーゼと〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ
を用いて、５′末端ラベルを行った。結合後、室温で１
〜２時間、結合バッファを５回交換しながら（１０ml／
フィルター）フィルターを洗浄した。さらにフィルター
を空気乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。この
検定において、ナイロンメンブレンは、過剰の非ラベル
Ｃｌオリゴマーを含めることにより特異的に阻害される
ポジティブシグナルを与えた。一方、ニトロセルロース
メンブレンはそういう事はなかった。この方法により、
約1.4 ×１０⁶ 個の組換え体がスクリーニングされた。
第１回目のスクリーニングで同定された３２個のポジテ
ィブファージクローンの中で、１個のクローン（λＬ２
８−８と命名）は、ひきつづくスクリーニング操作の中
で、プローブＤＮＡと再現的に結合することが分った。

【０００９】2. 形質転換大腸菌におけるタンパク質の
生産及び精製 大腸菌Ｙ１０８９をλＬ２８−８でトランスフェクトす
ることにより、溶原性バクテリアクローンを調製した。
λＬ２８−８を宿す溶原体一晩培養物を４００mlＬ培地
中１％濃度となるよう接種した。この細菌を、ＯＤ６０
０値が1.０となるまで３１℃で増殖した。その後、温度
を２０分間４２℃にシフトした。それからＩＰＴＧを１
０mMとなるように加え、３８℃でさらに２０分間インキ
ュベートした後この培養物を迅速にペレット化してか
ら、２０mMへペス（pH7.9 ）、0.2mMＥＤＴＡ、0.5 mM
スペルミジン、0.１５mMスペルミン、0.１mMＤＴＴ、１
０％グリセロール、0.５mMフェニルメチオニルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１μg ／mlペプスタチン
Ａ、１μg ／mlロイペプチン、５００μM Ｌ−１−トシ
ルアミド−２−フェニレンクロロメチルベンズアミジ
ン、１０mMモリブデン酸ナトリウム、２mMピロリン酸ナ
トリウム及び２mMオルトバナデン酸ナトリウムを含む溶
菌バッファ１０ml中に懸濁した。この細胞サスペンジョ
ンに、３回凍結−融解操作を行ない、つづいて、ベック
マン５０Tiローターを用い、４℃、30,000rpm で１時間
の遠心を行った。上清は、直接ゲル遅延検定法（以下参
照）に用いるか、又はさらに精製した。

【００１０】精製は以下のように行った。約４mlの上清
をベッド体積２mlの、溶菌バッファで平衡化したポリ
（di−Ｃ）；ポリ（di−Ｃ）カラムにかけた。溶出物質
（４ml）を、バッファＺ（２５mMへペス、pH7.８、１2.
５mMMgCl₂ 、１mM DTT、２０％グリセロール、0.１％Ｎ
Ｐ−４０、0.５mM ＰＭＳＦ）で平衡化したベッド体積
２mlのＤＥ５２（ワットマン製）カラムにかけた。ＤＮ
Ａ結合活性成分は、0.１mM KClを含むバッファＺで溶出
した。さらにこの溶出物（約４ml）をコンセントリコン
−１０（アミコン製）を用いて濃縮した。最終的タンパ
ク質濃度は２８mg／mlであった。 3. クローンλＬ２８−８のタンパク質産物の特性 （ｉ）ゲル遅延検定法 λＬ２８−８を宿す溶原性細菌クローンを、大腸菌Ｙ１
０８９のトランスフェクションにより調製し、ハイン
（Huynh)等の操作を用い、高レベルのクローン化ｃＤＮ
Ａ発現を誘導した。コントロールとして、ｃＤＮＡ挿入
物を欠くファージ（λ６と命名）を用い、同様の方法で
溶原性クローンの調製及び処理を行った。各々３μg の
タンパク質を含む抽出物を溶原体の誘導培養物（λＬ２
８−８ａ、λＬ２８−８ｂ及びλ６ａ及びλ６ｂと命名
した４個の調製物）から調製した。

【００１１】また核抽出物（３μg タンパク質）をマウ
スＬ９２９細胞から調製した。この抽出物を、先に示し
た、比活性８０００cpm/f moleを有するラベル化Ｃｌオ
リゴマープローブ１ｆ mole とインキュベートした。こ
のインキュベーション物に種々の濃度の競合ＤＮＡを加
える競合検定法を、各抽出物について行った。この検定
結果を図１に示す。各レーンは以下に示すものに対応す
る。 レーン 抽 出 物 １ なし ２ λ６ａ ３ λ６ｂ ４ λ６ｂと1000倍モル過剰の未ラベルＣｌオリゴマー ５ λ６ｂと1000倍モル過剰の未ラベルＣ５Ａオリゴマー^* ６ λＬ２８−８ａ ７ λＬ２８−８ｂ ８ λＬ２８−８ｂと1000倍モル過剰の未ラベルＣｌオリゴマー ９ λＬ２８−８ｂと1000倍モル過剰の未ラベルＣ５Ａオリゴマー^* １０ Ｌ９２９細胞 １１ Ｌ９２９細胞と1000倍モル過剰の未ラベルＣｌオリゴマー １２ Ｌ９２９細胞と1000倍モル過剰の未ラベルＣＡ５オリゴマー^* ＊Ｃ５Ａオリゴマーはフジタ（Fujita) 等、１９８５で説明されて おり、ＧＡＡＡの６回反復配列である。

【００１２】図１から、結合プローブは、レーン６，
７，９，１０及び１２に検出されていることは明白であ
る。図１に示されているように、λＬ２８−８溶原体か
らのタンパク質抽出物は、シフトしたバンドを与えてい
る（レーン６及び７）。この出現は過剰の未ラベルＣｌ
オリゴマーＤＮＡで阻害されたが、同量のＣ５Ａオリゴ
マーでは阻害されない（レーン８及び９）。λＬ２８−
８由来のタンパク質とは対照的に、誘導されたλ６由来
の溶原体から調製したものはこのようなシフトバンドを
与えない（レーン２−５）。シフトバンドはマウスＬ９
２９細胞由来の天然のＩＲＦ−１のバンドと非常に類似
していると見ることができる（レーン１０及び１２）。
２組のシフトバンドに存在する差異は、プローブＤＮＡ
に結合するタンパク質の量が異なる結果であると考えら
れる。さらに、このシフトバンドはλＬ２８−８でトラ
ンスフェクトしたＩＰＴＧ誘導Ｙ１０８９細胞由来のタ
ンパク質についてのみ検出可能であることが分った。

【００１３】（ii) ＤＮase フットプリンティング分析 フットプリンティング分析は、ＩＦＮ−β遺伝子上流領
域をコードするＤＮＡに対する、λＬ２８−８ｃＤＮＡ
によりコードされるタンパク質の結合性をテストするこ
とで行った。λＬ２８−８ｃＤＮＡにコードされるタン
パク質を誘導溶原体から抽出し、先に述べたカラムクロ
マトグラフィーにより部分的に精製し、ＩＦＮ−β遺伝
子上流領域を含むＤＮＡに対する結合性をテストした。
プローブＤＮＡはｐ−１２５cat （野生型のＩＦＮ−β
遺伝子を含む）及びｐ−１２５ＤＰcat （ＩＦＮ−β遺
伝子変異体を含む）から単離したSal Ｉ−HindIIIフラ
グメントとして調製した。プラスミドｐ−１２５cat
は、ｐＳＥ−１２５（フジタ（Fujita）等、セル（Cel
l) 、４１、４８９−４９６、１９８５）由来のＢamＨ
Ｉ（−１２５）−ＴagＩ（＋１９）フラグメントを用い
ること以外ｐ−１０５cat(フジタ（Fujita) 等、１９８
７）と同様に構築した。ＩＦＮ−β制御要素内に点突然
変異を含むプラスミドｐ−１２５ＤＰcat は、ハタケヤ
マ（Hatakeyama) 等、（プロシーディング・イン・ナシ
ョナル、アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl.
Acad. Sci.) ＵＳＡ，８３，９６５０−９６５４、１９
８６）により報告されているように、ｐ−１２５cat の
合成オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により得た。
両ＤＮＡはＴ４キナーゼを用い（γ−³²Ｐ）ＡＴＰによ
り、そのHind III部位をラベル化した。

【００１４】プローブＤＮＡ４f mole（比活性3,000 cp
m/f mole) を２５mMドリス−HCl 、pH7.9 、6.２５mM M
gCl₂，５０mM KCl, １mM EDTA, 0.5mMＤＴＴ、１０％グ
リセリン、２％ポリビニルアルコールを含む２０μl の
反応混合物中、精製タンパク質２８０μg の有無の条件
下でインキュベートした。この検定においては、５×１
０^-4ユニットのDNase Ｉ（ワーシントン製）を添加し、
２５℃で１分間インキュベートした。図２は以下に示す
操作を行って得られたサンプル由来のＤＮＡフラグメン
トのオートラジオグラムを示す。図２の左側は、野生型
ＩＦＮ−βプローブのＤＮＡ配列の一部であり、また図
２の右側は変異体ＩＦＮ−βプローブのＤＮＡの配列の
一部である。

【００１５】1. 野生型ＩＦＮ−βプローブをＡ＋Ｇ反
応で切断した（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology)６５，４９９−５６０参照）。結
果をレーン１に示す。 2. 野生型ＩＦＮ−βプローブを保護なしにDNase Ｉで
部分消化した。結果をレーン２に示す。 3. 野生型ＩＦＮ−βプローブをタンパク質と反応させ
た後DNase Ｉで消化した。結果をレーン３に示す。 4. 野生型ＩＦＮ−βプローブを、１０００倍モル過剰
の未ラベルＣ１オリゴマーの存在下でタンパク質と反応
させた後、DNase Ｉで消化した。結果をレーン４に示
す。 5. 変異体ＩＦＮ−βプローブをタンパク質と反応させ
た後、DNase Ｉで消化した。結果をレーン５に示す。 6. 変異体ＩＦＮ−βプローブをＡ＋Ｇ反応で切断し
た。結果をレーン６に示す。

【００１６】図２において、レーン３及びレーン５から
明らかであるように保護領域は、各々オートラジオグラ
ムの左及び右に示されている配列上に表われている。ヘ
キサマーモチープを枠で囲んだ。図２の結果から、保護
領域は−１００〜−６４のヌクレオチドに相当し、この
領域がＬ９２９細胞由来のＩＲＦ−１により保護される
ことが分る。この保護は、過剰の未ラベルＣ１オリゴマ
ーの使用により阻止される（レーン４）。またより低い
タンパク質濃度では、選択的保護が、AAGTGAモチーフを
含む領域（−８０〜−７０）に起こることが示されてい
る。これらの結果は、このタンパク質がAAGTGAモチーフ
を含む領域により高い親和性を有し、かつ、その周囲の
領域にはより低い親和性を持つことを示している。変異
体ＩＦＮ−β遺伝子セグメントは、部位−１０６、−１
００、−７３及び−６７にＴ−Ｇ突然変異をもってい
る。同様の検定条件のレーン５及び２の比較により、こ
の組換えタンパク質により提供される保護は、非変異領
域に限定されるようである（レーン２）。この観察は、
これら変異体の導入がＬ９２９細胞におけるＮＤＶによ
る転写誘導の著しい減少（２０倍）を招き、かつ、変異
体ＩＦＮ遺伝子に対するＩＲＦ−１のインビトロにおけ
る結合が非変異領域のみに顕著であるという観察と一致
している。さらに、Ｃ１オリゴマーの使用は、このタン
パク質がこのオリゴマー配列を含む領域を特異的に保護
することを明らかにした。この保護は、Ｌ９２９細胞由
来の本来のＩＲＦ−１によって提供されるものと一致し
た。

【００１７】3. ＤＮＡ競合検定 この検定は、既知の転写制御ＤＮＡ配列を含む種々のＤ
ＮＡ配列に対する、この組換えタンパク質の親和性をテ
ストするために行った。その操作を以下に示す。ｐ−１
２５cat （フジタ（Fujita) 等、１９８７）から、ＩＦ
Ｎ−βプローブのHind III −Sal Ｉフラグメントを単
離した。このフラグメントは、＋１９〜−１２５のヒト
ＩＦＮ−β遺伝子配列を含んでいる。このＤＮＡを、ク
レノーフラグメントを用いた〔α−³²Ｐ〕dCTPによる両
端の充填により３′端ラベルした。プローブＤＮＡの比
活性は８０００cpm/f moleであった。先に述べた条件下
で、ゲル遅延検定を行った。競合検定において、そのＤ
ＮＡを、図３に示した結合混合物中、種々の競合ＤＮＡ
の存在下でそのタンパク質は反応させた。複合体形成度
は、オートラジオグラムの濃度解析により定量した。競
合ＤＮＡ非存在下での複合体形成を１００％とした。競
合ＤＮＡの構造を以下に示す。

【００１８】 ｂ） ＴＮＦ：ＴＮＦ−α第１イントロンの＋１１６２
〜＋２１１６に渡る３７bpのフラグメント（ネドウィン
（Nedwin) 等、１９８５）。 ｃ） マウスＨ２−Ｄ^d ：コーバー（Korber）等（１９
８８）により報告されているＩＲＳ要素（−１５９〜−
１２３）に当る３７bpの合成ＤＮＡ。 ｄ） ヒトＩＦＮ−α：ウイルス応答要素に対応する４
ｂbpの合成ＤＮＡ。ライアルス（Ryals)等（１９８５）
参照。 ｅ） ヘキサマー配列Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ4 及びＣ５
Ａ。 Ｃ１及びＣ５Ａの配列は先に述べた。Ｃ２、Ｃ３及びＣ
４の配列は、セル(Cell)、４９、３５２−３６７（１９
８７）に公表されている。それらは各々 AAATGA − Ｃ2 AAGGGA − Ｃ3 、及び AAAGGA − Ｃ4 で表わされる。 ｆ） ＋１９〜−６６のＩＦＮ−β遺伝子配列。

【００１９】図３において、左側のパネルは、反復ヘキ
サマーを競合者として用いたときに得られた結果を示し
ている。中央のパネルはヒトのＩＦＮ遺伝子セグメント
を競合者として使用したときの結果を示しており、右側
のパネルは、パネル中に示した種々のＤＮＡセグメント
を用いたときの結果を示している。図３の結果から、シ
フトバンドの出現は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４の効率順
でヘキサマー配列と競合しているが、Ｃ５Ａとは有意に
競合しなかったことが分る。また、ヒトＩＦＮ−α１又
はマウスＨ−２Ｄ^d 遺伝子の制御要素に渡る合成ＤＮＡ
セグメントは、競合活性を示すことが観察された。この
ことは、Ｈ−２Ｄ^d 遺伝子のＤＮＡセグメントが、細胞
がＩＦＮに応答するとき、促進因子として機能するいわ
ゆるＩＦＮ−応答配列を含むことから特に興味深い（ス
ジタ(Sugita)等、１９８７；イスラエル（Israel) 等、
１９８６；コーバーKorber) 等、１９８８）。事実、Ｉ
ＦＮ−β遺伝子にみられるものと同様又は同一の配列モ
チーフが、核因子が特異的に結合すると考えられるＩＦ
Ｎ誘導性遺伝子の多数のプロモーター中に見い出される
（コーバー（Korber) 等、１９８８、レリー（Lery)
等、１９８８）。

【００２０】図３に示される結果は、Ｌ９２９細胞に由
来する天然のタンパク質を用いたときと同様の条件下で
この検定を再現したとき得られる結果と非常によく似て
いる。 （マウスＩＲＦ−１をコードするｃＤＮＡの構造）クロ
ーン化したＤＮＡのＤＮＡ配列は、ダイデオキシ法（シ
ークエナーゼ、コナイテッドステートバイオケミカルス
製）又は、標準マキサム・ギルバート法（マキサム（Ma
xam)及びギルバート（Gilbert)、１９８０）により決定
した。大腸菌Ｙ１０８９におけるλＬ２８−８挿入物を
以下のように単離した。そのファージＤＮＡを標準操作
で調製し、EcoR Iで消化後、このファージＤＮＡから切
り出したｃＤＮＡを単離してから、ダイデオキシ法（シ
ークエナーゼ；ユナイテッドステートバイオケミカル社
製）で配列決定した。λＬ２８−８中のｃＤＮＡ挿入物
は1.８kb長であることが分った。そのヌクレオチド配列
分析によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と相を同じくし
た大きい読み枠配列が明らかになった。より大きいｃＤ
ＮＡ挿入物を含むクローンをスクリーニングするため、
二本鎖ｃＤＮＡをＬ９２９細胞由来のポリ（Ａ） ⁺ＲＮ
Ａで合成し、アルフォ(Aruffo)及びシード（Seed)(プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc, Natl, Acad, Sci)ＵＳＡ、８４、８
５７３、１９８７）及びシード（Seed) （ネイチャー
（Nature) 、３２９、８４０−８４２、１９８７）の公
表されている操作に従ってベクタ−ＣＤＭ８中にクロー
ニングした。

【００２１】この組換えプラスミドを大腸菌ＭＣ１０６
１／ｐ３株に導入し（アルフォ(Aruffo)及びシード（Se
ed) の操作に従がう、上述）、ｃＤＮＡのクローンを、
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのための低イオ
ン強度条件下でλＬ２８−８由来の（³²Ｐラベル化）ｃ
ＤＮＡプローブでスクリーニングして （カシマ（Kash
ima)等、ネイチャー（Nature) 、３１３、４０２−４０
４、１９８５）、次の実験のためのクローンｐＩＲＦ−
Ｌを選択した。ｐＩＲＦ−Ｌの目的とするｃＤＮＡ挿入
物は、Hind III及び Xba I による消化で入手し、先に
示した方法で配列決定した。この配列を一般式IV及び図
４〜６に示す。λＬ２８−８由来のｃＤＮＡ配列は、１
個のＡ残基がヌクレオチド１７７３及び１７８１の間で
欠失していること以外、重複領域に同一配列を含んでい
ることが分った。

【００２２】λＬ２８−８由来のｃＤＮＡの５′及び
３′末端を、図４〜６中に矢印で示した。おそらくｍＲ
ＮＡの不安定性に関する ATTTATTTA及び ATTTA配列を枠
で囲んだ。図４〜６から明白なように、ｐＩＲＦ−Ｌ由
来のマウスｃＤＮＡは、λＬ２８−８ｃＤＮＡのｃＤＮ
Ａより、５′及び３′末端で各々１９８bp及び２０bp長
かった。この遺伝子のプロモーター領域を含むゲノムＤ
ＮＡ配列の分析は、ｐＩＲＦ−ＬのｃＤＮＡは、主要Ｃ
ＡＰ部位から約３０bpを欠失していることが明らかにな
った。以下及び一般式Ｖ及び図１１参照。 第１のＡＴＧコドンの直ぐ上流の配列、ＧＧＡＣＣＡＴＧＣは、翻訳開始部位 Ａ のコザック（Kozac)のコンセンサス配列ＧＣＣ ＣＣＡＴＧＣとよく一致してい Ｇ る。

【００２３】同相のＡＴＣ配列は、上述のＡＴＧ配列の
上流配列中には見い出されず、このことは、事実それが
ＩＲＦ−１ ｍＲＮＡに対する開始コドンであることを
確認した。先に述べたように、３′側非コード領域以
外、重複領域内のλＬ２８−８及びｐＩＩＲＦ−Ｌのｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列間に差がないことが検出され
た。従って、マウスＩＲＦ−１は、３7.３ｋＤの計算上
の分子量を有する３２９個のアミノ酸からなることが分
った。規範的なＮ−グリコシレーション部位はこの配列
内には見い出されない。タンパク質配列データベース
（ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデ
ーション（Natl, Biomed, Res, Found,)ワシントン，
Ｄ，Ｃ，）及びより最近に公表された配列の検索によっ
てはその他のタンパク質に対して有意な相同性は検出さ
れなかった。

【００２４】カイト（Kyte) 及びドゥーリトル（Doolit
tle)（１９８２）に従うハイドロパシープロット解析
は、このタンパク質は全体として非常に親水性が高いこ
とを示した（図７）。マウスＩＲＦの推定される一次配
列の洞察により、次の性質が明らかになった。アミノ酸
（ａ，ａ）１４０までのアミノ末端側半分は、リジン
（Lys)及びアルギニン（Arg)が豊富である。事実、全 L
ys及び Arg残基３９個のうちの３１個は、この領域に存
在する。図７の下側パネルには、塩基アミノ酸（Arg,
Lys)（上欄）及び酸性アミノ酸（Asp, Glu)(下欄）の位
置を図的にまとめて示してある。図７に示してあるよう
に、この領域は強い親和性を示し、特異的ＤＮＡ配列へ
のＩＲＦ−１の結合を主として担っている領域であると
考えられている。これと関連して、ジンクフィンガーや
ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフなどの（パボ
（Pabo) 及びサウア（Sauer)、１９８４、エバンス（Ev
ans)及びホレンバーグ（Hollenberg) 、１９８８）多く
のＤＮＡ結合タンパク質に特徴的なモチーフは、ＩＲＦ
−１タンパク質には検出されなかった。

【００２５】対照的に、この分子の残りの部分（すなわ
ちカルボキシル末端半分）は、比較的アスパラギン酸
（Asp)、グルタミン酸（Glu)、セリン（Ser)及びスレオ
ニン（Thr)を多く含んでいる。１８９個のアミノ酸のう
ち、３３個（１７％）は酸性アミノ酸であり、また３６
個（１９％）はSer 及びThr である。特に、５個の連続
した酸性アミノ酸クラスターが２２７〜２３１のアミノ
酸内に見られる。Ser 及びThr に関しては、多くのもの
がこのクラスターを形成しているようである（１５３−
１５６、１９０−１９２、２０６−２０８、２２０−２
２２のアミノ酸領域、以後Ｓ−Ｔ領域と呼ぶ）。このＳ
−Ｔ領域は、図７の下側パネル中、小さな逆三角形で示
した。 （ヒトＩＲＦ−１をコードするｃＤＮＡの構造）マウス
ＩＲＦ−１に対する操作と同様の操作に従がい、ヒトの
ＩＲＦ−１ ｃＤＮＡをクローン化し、かつ配列決定し
た。ヒトのｃＤＮＡライブラリーを、ヒトＴ細胞系列ジ
ャーカト（Jarkat) 由来のポリ（Ａ） ⁺ＲＮＡを用い、
ｃＤＮＡを合成することにより調製した。二本鎖ｃＤＮ
Ａ合成及びひきつづくプラスミドベクターＣＤＭ８への
クローニングはアルフォ（Aruffo) 及びシード（Seed）
（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、
84、８５７３−８５７７、１９８７）及びシード（See
d)(ネイチャー(Nature)、３２９、８４０−８４２、１
９８７）の操作に従って行った。

【００２６】この組換えプラスミドを、先に述べたアル
フォ（Aruffo) 及びシード(Seed)の操作を用い、大腸菌
ＭＣ１０６１／ｐ３株に導入した。マウスＩＲＦ−１
ｃＤＮＡとクロスハイブリダイズするｃＤＮＡのクロー
ンをＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのための低
イオン強度条件下、プローブとしてλＬ２８−８ｃＤＮ
Ａ（³²Ｐラベル化）を用いてスクリーニングした。使用
した条件は、カシマ（Kashima)等（ネイチャー（Natur
e) 、３１３、４０２−４０４、１９８５）により報告
されているものと全く同じである。クローンｐＨＩＲＦ
３１の目的ｃＤＮＡ配列は、このプラスミドＤＮＡを X
hoＩで消化し、単離後、上述の方法によって配列決定し
た。ヒトＩＲＦ−１遺伝子の構造を一般式II及び図１３
〜１５に示した。推定されるマウス及びヒトのＩＲＦ−
１の配列を比較のため並列して図８に示した。ヒトＤＮ
Ａの分析は、このＩＲＦ−１がマウスＩＲＦ−Ｉに比べ
アミノ酸４個短かくなっていることを示した。アミノ酸
配列の強い保存性が２つのＩＲＦ−Ｉ分子間に見ること
ができる。特に、アミノ末端側半分の１４０個のアミノ
酸のうちの１３３個（９５％）は、同一であると言い得
る。合せて言うと、上述の観察は、ＩＲＦ−Ｉが新しい
クラスのＤＮＡ結合タンパク質であることを示してい
る。

【００２７】また、多くのサイトカイン及びプロトオン
コジーンｍＲＮＡ中に見られる配列ATTTATTTA 及び ATT
TAは、マウスのＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡの３′非翻訳領域
内に存在し、また、配列 ATTTA は、同様に、ヒトＩＲ
Ｆ−Ｉ ｃＤＮＡの相当する領域内に存在することは特
筆すべきである。これらの配列は、遺伝子の翻訳後の制
御において、ｍＲＮＡに不安定性を与えることによる役
割を果していると考えられている（ショウ（Shaw) 及び
カメン（Kamen)、１９８６；カプト（Caput)等、１９８
６）。プラスミドｐＩＲＦ−Ｌを大腸菌ＭＣ１０６１／
ｐ３にトランスフェクトし、これを、ブタペスト協定に
基づき、１９８８年８月１９日、ファーメンテーション
・リサーチ・インスチチュート・エイジェンシー・オブ
・インダストリアル・サイエンス・アンド・テクノロジ
ー（Fermentation Research Institute Agencyof Indus
trial Science and Technology)（ＦＲＩ）（日本茨城
県筑波市，東一丁目１−３）に、登録番号ＦＥＲＭＢＰ
−２００５、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３（ｐＩＲＦ−
Ｌ）として登録した。

【００２８】同様にプラスミドｐＩＲＦ３１を大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１／ｐ３にトランスフェクトし、これを、ブダ
ペスト協定に基づき、１９８８年８月１９日、登録番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−２００６、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３
（ｐＨＩＲＦ−３１）として登録した。 ＩＲＦ遺伝子の制御 1. ＩＲＦ−Ｉ ｍＲＮＡの発現 ＩＲＦ−ＩがＩＦＮ−β遺伝子以外の遺伝子の制御配列
に対する親和性を表わし、かつ種々の細胞における一群
の遺伝子の制御に関係しているという事実から、種々の
組織及び器官由来のマウス細胞におけるＩＲＦ−Ｉ ｍ
ＲＮＡの発現試験を、プローブとしてマウスｃＤＮＡを
用いて行った。このプローブを調製するため、ＩＲＦ−
Ｉ遺伝子の PstＩフラグメントのセンス鎖を含むＭ１３
ｍｐ１０ファージＤＮＡ（以下参照）をテンプレートと
して用い、³²Ｐラベル化アンチセンスＤＮＡを合成し、
この産物を EcoR Ｉで消化後、このプローブＤＮＡをフ
ジタ（Fujita) 等の方法に従がい単離した。全ＲＮＡを
アルフォ（Aruffo）及びシード（Seed) （１９８７）に
より確立された操作法により単離した。ついでブロッテ
ィング分析を基本的にトーマス（Thomas)(１９８０）の
方法を用いて行ない、Ｘ線フィルムは３日間露光した結
果を図１０Ａに示す。種々のレーンは、以下の組織に由
来する総細胞ＲＮＡを用いて行った実験結果を示してい
る。

【００２９】 レーン１ 脳 レーン２ 心臓 レーン３ 肝臓 レーン４ 肺 レーン５ 脾臓（非活性化） レーン６ 胸腺 レーン７ 腎臓 レーン８ 筋肉 レーン９ 腸 レーン１０ 脾臓（非活性化） レーン１１ ConA−活性化脾臓 レーン８では1.２μg のＲＮＡを用いた以外は各レーン
とも５μg の総細胞ＲＮＡを用いた。

【００３０】図１０Ａから、約2.０kbに相当するバンド
は本ブロッティング分析により、ほとんどのＲＮＡサン
プルから検出されたことが分る。もっともｍＲＮＡ発現
レベルは低いようである。脾臓由来のリンパ球における
ｍＲＮＡ発現レベルは、ConAによる活性化後著しく増加
したことは重要である（レーン１１）。さらに検定する
ため、先に示されているように（フジタ（Fujita) 等、
１９８５）ＮＤＶを用いてマウスＬ９２９細胞を誘導
し、ついでアルフォ（Aruffo) 及びシード（Seed) 、１
９８７の操作により、感染後３時間目に、細胞質性ＲＮ
Ａを抽出した。プロブＤＮＡを以下に示す種々の配列か
ら調製し、マルチプライムラベル化反応により（アマー
シャム社）ラベル化した。 （ｉ） λＬ２８−８由来の1.８kb EcoR Ｉフラグメ
ント（比活性２×10⁸cpm/μg ）。 （ii) マウスＩＦＮ−βゲノムクローン由来の0.５kb
BamH Ｉ−Bal IIフラグメント（比活性５×１０⁸ cpm/
μg ）及び （iii) ヒトβ−アクチンシュードジーンを含むクロー
ンの2.０kb BamH I−Pvu IIフラグメント（比活性５×
１０⁸ cpm/μg ）。

【００３１】この結果を図１０Ｂに示す。ブロッティン
グ分析は、トーマス（Thomas)(１９８０）の操作を用
い、先に述べたように行った。各レーンは１０μg の細
胞質性ＲＮＡを含んでいる。Ｘ線フィルムは３時間露光
した。濃度分析で、ＩＲＦ−Ｉ ｍＲＮＡはＮＤＶ感染
から９〜１２時間後に、約２５倍増加したことが分っ
た。ｍＲＮＡの増加は劇的であるが、誘導から９〜１２
時間後にピークに達し、１５時間後に元に戻るという一
時的なものであった。ｍＲＮＡの蓄積はＩＦＮ−βｍＲ
ＮＡの蓄積を促進した。すなわち図１０Ｂから分るよう
に、ＩＲＦ−Ｉ ｍＲＮＡの誘導は、ＮＤＶ感染から３
時間後すでに観測し得るが、一方、ＩＦＮ−βｍＲＮＡ
は、両ＲＮＡに対し同様のブロッティング条件下、感染
から６時間後に検出された。 （ＩＲＦ−Ｉプロモーター）先に説明したように、ＩＲ
Ｆ−Ｉ遺伝子は、ウイルス及びマイトジェンなどの種々
の試剤により転写時に制御される。染色体ＤＮＡのサウ
ザーンブロット分析は、ＩＲＦ−Ｉ遺伝子がマウス中で
スプライスされ、かつ多重化されないことを示してい
る。新生マウスＤＮＡを含むλファージライブラリー
を、先に使用した同λＬ２８−８由来のｃＤＮＡプロー
ブを用い、ＩＲＦ−Ｉプロモーター配列を宿すクローン
に関するスクリーニングした。４個のポジティブクロー
ンが同定され、その全てが同ゲノムＤＮＡを含むことが
分った。そのうちの１つ、λｇ１４−２をさらに分析す
るために使用した。Pst I フラグメントを pUC１９のPs
t I 部位にサブクローンし、ｐ１９ＩＲＦＰを構築し
た。

【００３２】その後、同ＤＮＡをＭ１３mp１０及びＭ１
３mp１１のPst I 部位にクローン化し、それらを配列分
析用のＤＮＡを作るのに用いた。上記クローン由来のPs
t I フラグメントのヌクレオチド配列分析を先に示した
方法で行った。メジャー及びマイナＣＡＰ部位をＳＩマ
ッピング分析で同定した。決定された配列を図１１に示
す。ここから分るように、このＤＮＡの下流配列は、 p
ＩＲＦ−Ｌ由来のｃＤＮＡの下流配列と完全に一致して
いる。Ｓ１ヌクレアーゼ分析は、ＩＲＦ−Ｉ ｍＲＮＡ
に対する２つのＣＡＰ部位の存在を示している。メジャ
ー部位は、マイナー部位の約２０ヌクレオチド下流に存
在する。典型的なＴＡＴＡボックス配列は、この遺伝子
の上流領域には存在しない。CpG 配列が異常に多いこと
から、おそらくこの領域は“ＨＴＦアイランド”（バー
ド(Bird)、１９８６）を構成しているのであろう。この
プロモーター領域は２つのＧＣボックス及び１つのＣＡ
ＡＴボックスを含んでいる（図１１参照）。前者のボッ
クスは SpIと結合し（カドガン(Ksdogan)等、１９８
６）、また後者とＣＰ−１又はＣＰ−２と結合する（チ
ョドシュ(Chodosh) 等、１９８８）。

【００３３】その後、このプロモーター配列を含むPst
I フラグメントについて例えば以下の方法におけるウイ
ルス誘導性等、細胞外シグナルに応答する反応性をテス
トした。Pst I セグメントの下流にレポーター遺伝子、
すなわち細菌性クロラムフェニコール、アセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を組込んだキメラ遺伝子
を構築した。これは、ｐ１９ＩＲＦ由来のPst I フラグ
メント（上述）をBamH I及び Hind III で切断し、生成
したフラグメントを pA₁₀ cat₂の Bgl IＩ─ Hind III
メジャーフラグメント（ローゼンタル（Rosenthal)等、
１９８３）にクローニングすることによって行ない、ｐ
ＩＲＦ catを構築した。さらにいくつかの構築物を以下
のように調製した。メジャーＣＡＰ部位から−３０〜−
３５に位置する唯一の Hae III部位を含むｐ１９ＩＲＦ
Ｐ由来のBamH I− Hind III フラグメントを Hae IIIで
消化することによりｐＩＲＦ△ catを調製した（図８参
照）。生成した Hae III− Hind III フラグメントを p
A₁₀ cat₂のBgl II− Hind III メジャーフラグメント及
び以下の合成ＤＮＡ 5′GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3′ 3′GATCTAAAGAAGCGC 5′ にライゲーションした。従って、ｐＩＲＦ cat及びｐＩ
ＲＦ△ catは、メジャーＣＡＰ部位から各々−３２０及
び−４８までの位置に配列を含んでいる。ｐ−１２５ c
atは、フジタ（Fujita) 等（１９８７）により述べられ
ているように、ヒトのＩＦＮ−β遺伝子のプロモーター
配列を含んでいる。ｐＳＶ２ catはゴーマン（Gorman)
等（サイエンス（Science)、２２１、５５１−５５３）
により報告されている。

【００３４】レファレンス遺伝子として、ｐＲＳＶgpt
を使いた（ゴーマン（Gorman) 等、上述参照）。リン酸
カルシウム法を用い、マウスＬ９２９細胞中に種々の遺
伝子をトランスフェクトした（フジタ（Fujita) 等、１
９８５）。５×１０⁶ 細胞を、7.５μgのＣＡＴレポー
ター遺伝子を含むテストプラスミド及び2.５μg のｐＲ
ＳＶgptでトランスフェクトした。この細胞をＮＤＶで
誘導するか、又は、偽誘導した後、フジタ（Fujita) 等
（１９８５）により報告されている酵素検定法で試験し
た。相対的ＣＡＴ活性を計算するために、ｐＳＶ２ cat
でトランスフェクトした偽誘導細胞由来のＣＡＴ活性を
１００％とした。各ＣＡＴ活性は、各サンプルの Eco
gpt により（ムリガン（mulligan) 及びバーグ（Barg)
、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)ＵＳＡ、
７８、２０７２−２０７６）標準化した。ＣＡＴがバッ
クグランドレベル以下のサンプルについては、ｂ．ｂ．
と印した。その結果を図１２に示す。

【００３５】マウスＬ９２９へのｐＩＲＦ catのトラン
スフェクションは、低レベルのＣＡＴ活性を与えること
が分る。このＣＡＴ発現レベルはトランスフェクトした
細胞をＮＤＶで活性化した時増加した。実際に、ＩＲＦ
−Ｉ遺伝子の３００bp上流配列の欠失（ｐＩＲＦ△ ca
t）はＣＡＴ遺伝子の構成的及び誘導性の発現を阻害し
た。このことは、このプロモーター配列が３００bp上流
領域内に存在し、かつウイルス誘導性であることを示し
ている。 （発現プラスミドの構築） 1. クローンλＬ２８−８のファージＤＮＡを EcoR Ｉ
で消化し、ｃＤＮＡ挿入物を回収した。そのｃＤＮＡの
EcoR Ｉ部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した
後、アルフォ（Aruffo) 及びシード（Seed) （１９８
７）の方法に従がい、配列 pGATCCATTGTGCTGG 及
び pCCAGCACAATGで表わされる合成アダプターＤＮＡと
ライゲーションした。５−２０％酢酸カリウム密度勾配
遠心によりその合成ＤＮＡを除去後（アルフォ（Aruff
o) 及びシード（Seed)(１９８７））、両端に結合した
アダプターＤＮＡを含むＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡをBstX I
切断ＣＤＭ８ベクターＤＮＡとライゲーションした（シ
ード（Seed) 、Ｂ、ネイチャー（Nature) 、３２９、８
４０−８４２、１９８７）。ＣＭＶプロモーターに関
し、各々センス及びアンチセンス配向性のＩＲＦ−Ｉ
ｃＤＮＡを含むｐＩＲＦ−Ｓ及びｐＩＲＦ−Ａを単離し
た。各プラスミドＤＮＡを、ｐ−５５ cat又はｐ５５Ｃ
１ＢとともにＬ９２９細胞へコトランスフェクトし、つ
いでそのＣＡＴ発現レベルを測定した。その結果を以下
の表１に示す。

【００３６】

【表１】 表 １ トランスフェクトした ＮＤＶによる ＣＡＴ活性 プラスミド 誘導 （転換体％） ───────────────────────────────── 実験１ ｐＩＲＦ−Ｓ ｐ−５５ cat − ＜ １％ ｐＩＲＦ−Ｓ ｐ−５５ ClB − ５０％ ｐＩＲＦ−Ａ ｐ−５５ cat − ＜ １％ ｐＩＲＦ−Ａ − ＜ １％ ───────────────────────────────── 実験２ ｐＩＲＦ−Ｓ ｐ−５５ ClB − 1.７％ ｐＩＲＦ−Ｓ ｐ−５５ ClB ＋ 3.６％ ｐＩＲＦ−Ａ ｐ−５５ ClB − ＜ 0.１％ ｐＩＲＦ−Ａ ｐ−５５ ClB ＋ ＜ 0.１％ ─────────────────────────────────

【００３７】ＤＮＡのトランスフェクション効率は、受
容細胞の状態に依存して変化する（この場合、マウスＬ
９２９細胞）。この効率は実験１に比べ実験２では非常
に低かった。それゆえ、ＣＡＴ発現レベルは実験２にお
いて相対的に低かった。上記表から分るように、有意な
ＣＡＴ活性は、ｐ−５５ＣＩＢ及びｐＩＲＦ−Ｓでトラ
ンスフェクトした細胞においてのみ検出された。それら
は、ＩＲＦ−Ｉがｐ−５５ＣＩＢ中のＣＡＴ遺伝子の上
流に存在する反復（８回）AAGTGA配列に結合し、それに
より末端のＣＡＴ遺伝子の転写を促進することを示して
いる。さらにこの結果は、ＣＡＴ発現レベルがＮＤＶで
その細胞をトランスフェクトすることにより増加する
（２倍以上）ことを示し、このことは、ウイルスのよう
な種々の刺激剤で遺伝子発現をコントロールし得ること
を示している。 2. ＩＲＦ−Ｉ ＤＮＡ結合ドメイン及びイーストＧＡ
Ｌ４の転換活性化ドメインからなるタンパク質生産のた
めの発現プラスミドを以下のように構築した。プラスミ
ドｐＩＲＦ−Ｓを Hind III 及びPst I で消化し、その
ｃＤＮＡ挿入物を単離した。このｃＤＮＡを Dra IIIで
消化し、その Hind III − Dra IIIフラグメント（約５
５０bp）を回収してフラグメントＡと命名した。発現ベ
クターＣＤＭ８を Hind III 及び Xba Iで消化しそのメ
ジャーＤＮＡを単離しフラグメントＢと命名した。

【００３８】イーストのＧＡＬ４転写活性化ドメインを
コードするＤＮＡを以下のようにプラスミドｐＲＢ９６
８（マ（Ma）及びパシン（Ptashne)から単離した。まず
ｐＲＢ９６８ＤＮＡを Hind III で消化し、その末端を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した。このＤＮＡ
に合成 Xba IリンカーＤＮＡを付加し、つづいてそのＤ
ＮＡを Pvu II 及び Xba Iで消化した。生成したおよそ
６００bpの Pvu II − Xba Iフラグメントを回収しフラ
グメントＣと命名した。さらに、以下に示す配列の合成
ＤＮＡを合成し、 (5′)GTGTCGTCCAG(3′) (3′)GCACACAGCAGGTC(5 ′) フラグメントＤを命名した。フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及
びＤをライゲーションすることにより発現ベクターｐＩ
ＲＦＧＡＬ４を構築した。コントロールプラスミドとし
て、フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及び以下の配列： (5′)GTGTCTGACAG(3′) (3′)GCACACAGACTGTC (5′) の合成ＤＮＡをライゲーションしてプラスミドｐＩＲＦ
△ＧＡＬ４を構築した。ターミネータートリプレット、
ＴＧＡが、ｐＩＲＦ△ＧＡＬ４中のＩＲＦ−Ｉ及びＧＡ
Ｌ４配列の間に相を同じくして存在するので、その発現
タンパク質はＧＡＬ４活性化ドメインを欠除しているは
ずである。プラスミドにコードされているキメラ転写因
子の機能性をテストするため、ｐＩＲＦＧＡＬ４及びｐ
ＩＲＦ△ＧＡＬ４を各々、ｐ−５５ＣＩＢとともにＬ９
２９細胞にコトランスフェクトと、そのＣＡＴ発現をモ
ニターした。この結果を以下の表２に示す。

【００３９】

【表２】 表 ２ ────────────────────────────────── トランスフェクトした ＣＡＴ活性（転換率％） プラスミド ────────────────────────────────── ｐＩＲＦ−Ｓ ｐ−５５ＣｌＢ ２．０ ％ ｐＩＲＦ−Ａ ｐ−５５ＣｌＢ ＜ ０．２ ％ ｐＩＲＦＧＡＬ ｐ−５５ＣｌＢ １．４ ％ ｐＩＲＦ ＧＡＬ４ ｐ−５５ＣｌＢ ＜ ０．２ ％ ────────────────────────────────── 宿主細胞：マウスＬ９２９細胞、細胞はＮＤＶによる誘
導を行なわなかった。

【００４０】これらの結果は、インターロイキン、イン
ターフェロン、（α，β及びγ）、プラスミノーゲン活
性化因子、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー活性化
因子、インシュリン、ヒト成長ホルモン又はスーパーオ
キシドジスミューターゼ（又はヒト遺伝子の変異体）を
コードする遺伝子のような目的遺伝子の発現は、ＩＲＦ
−Ｉで増加し得ることを示している。ＩＦＮ−α、ＩＦ
Ｎ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−オメガ等のインターフェ
ロン遺伝子及びｔ−ＰＡ、プロウロキナーゼ又はウロキ
ナーゼ等のプラスミノーゲン活性化因子などの上記の目
的遺伝子は、例えば AAGTGAなどのＩＲＦ−Ｉに対する
種々の長さの認識配列と融合したプロモーターを含める
ことによってもより効率的に発現し得る。例えばその目
的遺伝子は本来のＩＲＦ−Ｉ又はキトラＩＲＦ−Ｉ遺伝
子と共に、種々の宿主細胞に誘導し得る。例えば AAGT
GA 反復数の増加する等、ＩＲＦ−Ｉ認識部位ＤＮＡの
長さを増加すること、及び転写因子の発現レベルの増加
により、目的遺伝子の高レベルの発現が達成し得る。

【００４１】例えば、AAGTGA反復配列を、ＩＦＮ−βプ
ロモーター又はＳＶ４０ウイルス初期プロモーターなど
の適当なプロモーターに付加し得る。ｔ−ＰＡ又はＩＦ
Ｎ−β遺伝子などの目的遺伝子をこれらのプロモーター
の下流に結合し得る。すなわちこのように構築した遺伝
子の構造は、(AAGTGA)_x （プロモーター）（ｔ−ＰＡ遺
伝子などの目的遺伝子）さらにこのような遺伝子を、例
えば CHODXB II (dhfr 株）細胞のような（アーローブ
(Urlaub)及びチャシン（Chasin) プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７７、４２１６−４２
２０、１９８０）ＣＨＯ細胞に導入し、これを増殖し
た。先に述べたように、理想的には、宿主細胞が内在性
のＩＲＦ−Ｉ活性を持たないか、又は実質的に持たない
細胞から選ばれることが望ましい。好ましくはＣＭＶプ
ロモーターなどの強力なプロモーター又はメタロチオネ
ン遺伝子プロモーターなどの誘導性プロモーターを有す
るＩＲＦ−Ｉ遺伝子を従来法により種々の宿主細胞に導
入し得る。

【００４２】このＩＲＦ遺伝子は目的遺伝子と共に導入
し、増殖し得るが、一方、ＩＲＦ−Ｉ遺伝子及び目的遺
伝子を別々に宿主細胞に導入し得る。このようにトラン
スフェクトした細胞においては、ＩＲＦ−Ｉは構成的に
も（例えば、ＣＭＶプロモーターの場合）又は誘導的に
も（例えばメタロチオネンプロモーターの場合、亜鉛の
ような二価金属により誘導される）生産され得る。発現
したＩＲＦ−Ｉは AAGTGA 反復に結合し、そして例え
ばｔ−ＰＡ又はＩＦＮ遺伝子などの末端目的遺伝子を増
加させる。さらに、このような発現は、表１から分るよ
うに、ＮＤＶ誘導のようにウイルスにより増大し得た。
このような誘導がＩＲＦ−Ｉの活性を増大させる実験２
からも同様の事が言える。 （一般式III のマウスＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡとクロスハ
イブリダイズするマウスｃＤＮＡ配列）マウスｃＤＮＡ
ライブラリーを先に述べたように調製した。ｃＤＮＡは
マウスＬ９２９細胞由来のｍＲＮＡを用い、標準操作に
より合成し、これを標準操作によりλgtllベクターに挿
入した。生じたλgtllライブラリーを、スクリーニング
し、以下のように、上述したマウスＩＲＦ−ＩｃＤＮＡ
とクロスハイブリダイズする挿入物を有するｃＤＮＡを
単離した。ファージプラークＤＮＡを含むニトロセルロ
ースフィルターを以下に示す段階のインキュベーション
を行った。

【００４３】(1) ３×ＳＳＣ中、６５℃、３０分間、
つづいて(2) デンハート溶液（0.２％ウシ血清アルブ
ミン、0.２％フィコール、0.２％ポリビニルピロリドン
２５）を含む３×ＳＳＣ中６０分間のインキュベーショ
ン、つづいて(3) １M NaCl、５０mMトリスー HCl、
（pH8.０）、１０mMＥＤＴＡ、0.１％ＳＤＳ、５０μg
／ml一本鎖キャリヤーＤＮＡ（例えばサケ精子ＤＮＡ）
及びデンハート溶液を含む溶液中、６５℃、１２時間の
インキュベーションを含むプレハイブリダイゼーション
ステップ、つづいて、(4) プローブとして³²Ｐラベル化
マウスＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡを含めること以外は第３段
階のインキュベーションを繰り返す。このｃＤＮＡプロ
ーブは、λＬ２８−８由来の EcoR Ｉ切断挿入物として
調製し、マルチプライムラベリングシステムにより（上
述）ラベル化した。このインキュベーションは６５℃で
１２時間行った。

【００４４】その後このフィルターを洗浄し、２×ＳＳ
Ｃ溶液で簡単にすすいだ後、0.１％ＳＤＳを含む３×Ｓ
ＳＣ溶液を用い、６５℃で３０分間洗浄した。この操作
を２回繰返した。ｐＨＨ−４５と命名したポジティブク
ローンの１つを選択し、これがＩＲＦのコード配列の一
部のみをカバーするｃＤＮＡを含むことを明らかにし
た。ｐＨＨ−４５中のｃＤＮＡ挿入物を単離し、“マウ
スＩＲＦ−ＩをコードするｃＤＮＡの構造”という表題
の基、ｐＩＲＦ−Ｌの調製のため、上述のより大きい挿
入物を含むクローンのスクリーニングに用いた。ポジテ
ィブクローンと同定されたものの中からｐＩＲＦ２−５
と命名される１つのクローンを選択し、マウスＩＲＦ−
Ｉについて述べた操作を用いて特徴づけた。完全にハイ
ブリダイズするｃＤＮＡ配列を一般式IVａに示し、対応
するＩＲＦタンパク質のアミノ酸配列を一般式III に示
す。プラスミドｐＩＲＦ２−５を大腸菌ＭＣ１０６１／
ｐ３にトランスフェクトし、この大腸菌ＭＣ１０６１／
ｐ３（ｐＩＲＦ２−５）は１９８８年、１１月２２日に
ベダペスト協定に基づき登録番号 FERMBP − 2157 でＦ
ＲＩに登録した。

【００４５】（ヒトＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡ配列とハイブ
リダイズするイーストゲノム由来のｃＤＮＡ）イースト
のＤＮＡを標準操作で調製し、 EcoR Ｉで消化した。こ
の消化ＤＮＡ５μg を0.８％アガロースゲルで電気泳動
し、標準操作によりＤＮＡブロッティングを行った。ブ
ロットしたフィルターを以下に示したもの以外はマウス
ＩＲＦ−ＩとハイブリダイズするマウスＤＮＡを単離し
た先の操作と同様に処理した。ステップ（３）における
温度は５５℃で行ない、またステップ（４）におけるイ
ンキュベーションも、５５℃で行なった。また放射性プ
ローブは、ｐＨＩＲＦ３１の Xho I 消化で単離したヒ
トＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡを、マウスＩＲＦ−Ｉに対して
先に述べた例で示したようにラベル化して用いた。フィ
ルターは２×ＳＳＣ中５５℃で洗浄した。ポジティブク
ローンは、オートラジオグラフィーで同定した（図１６
参照）。

【００４６】参考文献 アブリュー（Abreu) S. L., バンクロフト（Bancroft)
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【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Prof. Tadatsugu Taniguchi <120> Factor Regulating Gene Expression <130> X1G-0146 <150> EP 88113793.9 <151> 1988-08-24 <150> EP 88119602.6 <151> 1988-11-24 <160> 3 <210> 1 <211> 1047 <212> nucleic acid <213> CELL LINE : Mouse L929 <220> <221> CDS <222> 1..1047 <300> <310> EP 89115158.1 A2 <311> 1989-08-17 <312> 1990-03-28 <400> 1 atg ccg gtg gaa cgg atg cga atg cgc ccg tgg ctg gag gag cag ata 48 Met Pro Val Glu Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Glu Gln Ile 1 5 10 15 aat tcc aat acg ata cca ggg cta aag tgg ctg aac aag gag aag aag 96 Asn Ser Asn Thr Ile Pro Gly Leu Lys Trp Leu Asn Lys Glu Lys Lys 20 25 30 att ttc cag atc ccc tgg atg cat gcg gct cgg cac gga tgg gac gtg 144 Ile Phe Gln Ile Pro Trp Met His Ala Ala Arg His Gly Trp Asp Val 35 40 45 gaa aag gat gct ccg ctc ttc aga aac tgg gcg atc cat aca gga aag 192 Glu Lys Asp Ala Pro Leu Phe Arg Asn Trp Ala Ile His Thr Gly Lys 50 55 60 cat caa cca gga ata gat aaa cca gat cca aaa aca tgg aaa gca aat 240 His Gln Pro Gly Ile Asp Lys Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn 65 70 75 80 ttt cga tgt gcc atg aat tcc ctg ccc gac att gag gaa gtg aag gac 288 Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ile Glu Glu Val Lys Asp 85 90 95 aga agc ata aag aaa gga aac aac gcc ttc aga gtc tac cgg atg ctg 336 Arg Ser Ile Lys Lys Gly Asn Asn Ala Phe Arg Val Tyr Arg Met Leu 100 105 110 ccc tta tcc gaa cga cct tcc aag aaa gga aag aaa cca aag aca gaa 384 Pro Leu Ser Glu Arg Pro Ser Lys Lys Gly Lys Lys Pro Lys Thr Glu 115 120 125 aaa gaa gag aga gtt aag cac atc aag caa gaa cca gtt gag tca tct 432 Lys Glu Glu Arg Val Lys His Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu Ser Ser 130 135 140 ttg ggg ctt agt aat gga gta agt ggc ttt tct cct gag tat gcg gtc 480 Leu Gly Leu Ser Asn Gly Val Ser Gly Phe Ser Pro Glu Tyr Ala Val 145 150 155 160 ctg act tca gct ata aaa aat gaa gtg gat agt acg gtg aac atc ata 528 Leu Thr Ser Ala Ile Lys Asn Glu Val Asp Ser Thr Val Asn Ile Ile 165 170 175 gtt gta gga cag tcc cat ctg gac agc aac att gaa gat caa gag atc 576 Val Val Gly Gln Ser His Leu Asp Ser Asn Ile Glu Asp Gln Glu Ile 180 185 190 gtc act aac ccg cca gac atc tgc cag gtt gta gaa gtg acc act gag 624 Val Thr Asn Pro Pro Asp Ile Cys Gln Val Val Glu Val Thr Thr Glu 195 200 205 agt gat gac cag cca gtc agc atg agt gag ctc tac cct cta cag att 672 Ser Asp Asp Gln Pro Val Ser Met Ser Glu Leu Tyr Pro Leu Gln Ile 210 215 220 tct cct gtg tct tcc tac gca gaa agc gaa act acc gac agt gtg gcc 720 Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ala Glu Ser Glu Thr Thr Asp Ser Val Ala 225 230 235 240 agt gat gaa gag aac gca gag ggg aga cca cac tgg agg aag agg agc 768 Ser Asp Glu Glu Asn Ala Glu Gly Arg Pro His Trp Arg Lys Arg Ser 245 250 255 atc gaa ggc aag cag tac ctc agc aac atg ggg aca cgg aac acc tat 816 Ile Glu Gly Lys Gln Tyr Leu Ser Asn Met Gly Thr Arg Asn Thr Tyr 260 265 270 ctg ctg ccc agc atg gcg acc ttt gtc acc tcc aac aag cca gat ctg 864 Leu Leu Pro Ser Met Ala Thr Phe Val Thr Ser Asn Lys Pro Asp Leu 275 280 285 cag gtc acc atc aaa gag gat agc tgt ccg atg cct tac aac agc tcc 912 Gln Val Thr Ile Lys Glu Asp Ser Cys Pro Met Pro Tyr Asn Ser Ser 290 295 300 tgg ccc cca ttt aca gac ctt ccc ctt cct gcc cca gtg acc ccc acg 960 Trp Pro Pro Phe Thr Asp Leu Pro Leu Pro Ala Pro Val Thr Pro Thr 305 310 315 320 ccc agc agc agt cgg cca gac cgg gag acc cgg gcc agt gtc atc aag 1008 Pro Ser Ser Ser Arg Pro Asp Arg Glu Thr Arg Ala Ser Val Ile Lys 325 330 335 aag aca tct gat atc acc cag gcc cgt gtc aag agc tgt 1047 Lys Thr Ser Asp Ile Thr Gln Ala Arg Val Lys Ser Cys 340 345 <210> 2 <211> 349 <212> amino acid <400> 2 Met Pro Val Glu Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Glu Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ser Asn Thr Ile Pro Gly Leu Lys Trp Leu Asn Lys Glu Lys Lys 20 25 30 Ile Phe Gln Ile Pro Trp Met His Ala Ala Arg His Gly Trp Asp Val 35 40 45 Glu Lys Asp Ala Pro Leu Phe Arg Asn Trp Ala Ile His Thr Gly Lys 50 55 60 His Gln Pro Gly Ile Asp Lys Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn 65 70 75 80 Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ile Glu Glu Val Lys Asp 85 90 95 Arg Ser Ile Lys Lys Gly Asn Asn Ala Phe Arg Val Tyr Arg Met Leu 100 105 110 Pro Leu Ser Glu Arg Pro Ser Lys Lys Gly Lys Lys Pro Lys Thr Glu 115 120 125 Lys Glu Glu Arg Val Lys His Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu Ser Ser 130 135 140 Leu Gly Leu Ser Asn Gly Val Ser Gly Phe Ser Pro Glu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Thr Ser Ala Ile Lys Asn Glu Val Asp Ser Thr Val Asn Ile Ile 165 170 175 Val Val Gly Gln Ser His Leu Asp Ser Asn Ile Glu Asp Gln Glu Ile 180 185 190 Val Thr Asn Pro Pro Asp Ile Cys Gln Val Val Glu Val Thr Thr Glu 195 200 205 Ser Asp Asp Gln Pro Val Ser Met Ser Glu Leu Tyr Pro Leu Gln Ile 210 215 220 Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ala Glu Ser Glu Thr Thr Asp Ser Val Ala 225 230 235 240 Ser Asp Glu Glu Asn Ala Glu Gly Arg Pro His Trp Arg Lys Arg Ser 245 250 255 Ile Glu Gly Lys Gln Tyr Leu Ser Asn Met Gly Thr Arg Asn Thr Tyr 260 265 270 Leu Leu Pro Ser Met Ala Thr Phe Val Thr Ser Asn Lys Pro Asp Leu 275 280 285 Gln Val Thr Ile Lys Glu Asp Ser Cys Pro Met Pro Tyr Asn Ser Ser 290 295 300 Trp Pro Pro Phe Thr Asp Leu Pro Leu Pro Ala Pro Val Thr Pro Thr 305 310 315 320 Pro Ser Ser Ser Arg Pro Asp Arg Glu Thr Arg Ala Ser Val Ile Lys 325 330 335 Lys Thr Ser Asp Ile Thr Gln Ala Arg Val Lys Ser Cys 340 345 <210> 3 <211> 2448 <212> nucleic acid <213> CELL LINE : Mouse L929 <220> <221> CDS <222> 154..1200 <300> <310> EP 89115158.1 A2 <311> 1989-08-17 <312> 1990-03-28 <400> 3 tctcaggcaa gccggggact aacttttagt tttgctcctg cgattattca actgacgggc 60 tttcatttcc attttacaca ccctaacaac actcacacct tgcgggattg tattggtagc 120 gtggaaaaaa aaaaagcaca ttgagagggt acc atg ccg gtg gaa cgg atg cga 174 Met Pro Val Glu Arg Met Arg 1 5 atg cgc ccg tgg ctg gag gag cag ata aat tcc aat acg ata cca ggg 222 Met Arg Pro Trp Leu Glu Glu Gln Ile Asn Ser Asn Thr Ile Pro Gly 10 15 20 cta aag tgg ctg aac aag gag aag aag att ttc cag atc ccc tgg atg 270 Leu Lys Trp Leu Asn Lys Glu Lys Lys Ile Phe Gln Ile Pro Trp Met 25 30 35 cat gcg gct cgg cac gga tgg gac gtg gaa aag gat gct ccg ctc ttc 318 His Ala Ala Arg His Gly Trp Asp Val Glu Lys Asp Ala Pro Leu Phe 40 45 50 55 aga aac tgg gcg atc cat aca gga aag cat caa cca gga ata gat aaa 366 Arg Asn Trp Ala Ile His Thr Gly Lys His Gln Pro Gly Ile Asp Lys cca gat cca aaa aca tgg aaa gca aat ttt cga tgt gcc atg aat tcc 414 Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser 75 80 85 ctg ccc gac att gag gaa gtg aag gac aga agc ata aag aaa gga aac 462 Leu Pro Asp Ile Glu Glu Val Lys Asp Arg Ser Ile Lys Lys Gly Asn 90 95 100 aac gcc ttc aga gtc tac cgg atg ctg ccc tta tcc gaa cga cct tcc 510 Asn Ala Phe Arg Val Tyr Arg Met Leu Pro Leu Ser Glu Arg Pro Ser 105 110 115 aag aaa gga aag aaa cca aag aca gaa aaa gaa gag aga gtt aag cac 558 Lys Lys Gly Lys Lys Pro Lys Thr Glu Lys Glu Glu Arg Val Lys His 120 125 130 135 atc aag caa gaa cca gtt gag tca tct ttg ggg ctt agt aat gga gta 606 Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu Ser Ser Leu Gly Leu Ser Asn Gly Val 140 145 150 agt ggc ttt tct cct gag tat gcg gtc ctg act tca gct ata aaa aat 654 Ser Gly Phe Ser Pro Glu Tyr Ala Val Leu Thr Ser Ala Ile Lys Asn 155 160 165 gaa gtg gat agt acg gtg aac atc ata gtt gta gga cag tcc cat ctg 702 Glu Val Asp Ser Thr Val Asn Ile Ile Val Val Gly Gln Ser His Leu 170 175 180 gac agc aac att gaa gat caa gag atc gtc act aac ccg cca gac atc 750 Asp Ser Asn Ile Glu Asp Gln Glu Ile Val Thr Asn Pro Pro Asp Ile 185 190 195 tgc cag gtt gta gaa gtg acc act gag agt gat gac cag cca gtc agc 798 Cys Gln Val Val Glu Val Thr Thr Glu Ser Asp Asp Gln Pro Val Ser 200 205 210 215 atg agt gag ctc tac cct cta cag att tct cct gtg tct tcc tac gca 846 Met Ser Glu Leu Tyr Pro Leu Gln Ile Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ala 220 225 230 gaa agc gaa act acc gac agt gtg gcc agt gat gaa gag aac gca gag 894 Glu Ser Glu Thr Thr Asp Ser Val Ala Ser Asp Glu Glu Asn Ala Glu 235 240 245 ggg aga cca cac tgg agg aag agg agc atc gaa ggc aag cag tac ctc 942 Gly Arg Pro His Trp Arg Lys Arg Ser Ile Glu Gly Lys Gln Tyr Leu 250 255 260 agc aac atg ggg aca cgg aac acc tat ctg ctg ccc agc atg gcg acc 990 Ser Asn Met Gly Thr Arg Asn Thr Tyr Leu Leu Pro Ser Met Ala Thr 265 270 275 ttt gtc acc tcc aac aag cca gat ctg cag gtc acc atc aaa gag gat 1038 Phe Val Thr Ser Asn Lys Pro Asp Leu Gln Val Thr Ile Lys Glu Asp 280 285 290 295 agc tgt ccg atg cct tac aac agc tcc tgg ccc cca ttt aca gac ctt 1086 Ser Cys Pro Met Pro Tyr Asn Ser Ser Trp Pro Pro Phe Thr Asp Leu 300 305 310 ccc ctt cct gcc cca gtg acc ccc acg ccc agc agc agc cgg cca gac 1134 Pro Leu Pro Ala Pro Val Thr Pro Thr Pro Ser Ser Ser Arg Pro Asp 315 320 325 cgg gag acc cgg gcc agt gtc atc aag aag aca tct gat atc acc cag 1182 Arg Glu Thr Arg Ala Ser Val Ile Lys Lys Thr Ser Asp Ile Thr Gln 330 335 340 gcc cgt gtc aag agc tgt taagcctttg actctccctg gtggttgttg 1230 Ala Arg Val Lys Ser Cys 345 ggatttctta gctttgtgtt gttctttgtt tgtattatat tatttttttt ctctatgata 1290 cctatcttag acacatctaa gggagaaagc cttgacgata gattattgat tgctgtgtcc 1350 aactccagag ctggagcttc ttcttaactc aggactccag cccccccccc ccctcggtag 1410 cagccacacg ggcagtggag gtgctgcgtt gcctacggtc aaggccagca tggtggagtg 1530 gatgcctcag aacggaggag aaaatgtgaa ctagctggaa tttttttatt cttgtgaata 1590 tgtacatagg gcagtacgag caatgtcgcg ggctgcttct gcaccttatc ttgaagcact 1650 tacaataggc cttcttgtaa tcttgctctc cttcacagca cactcggcga ccccttctgt 1710 gtccactacc ccactaccca cccctccctc ctcaacccct ccatcccggt cctctatgcg 1770 ccccttcccc ccaaccaatc ccatcacaac ctcttaccta tcctttccct cccaacccct 1830 tctatcccag cccaccacct accccactcc tccccaactc ctccattcta gcccattacc 1890 cacgcctctc tcctcagccc agcctacccc atcccaccct gttcctttcc tccagtttcc 1950 tctcctcaaa ggcaaggctc tacatcttgg aggaggagga ggagaagaaa atgagtttct 2010 tcaccgctgt cccattttaa gactgcttga ataataaaaa aaaatctttc taatctgcta 2070 tgcttgaatg gcacgcggta caaaggaaaa ctgtcatgga aatattatgc aaattcccag 2130 atctgaagac ggaaaatact ctaattctaa ccagagcaag cttttttatt tttttataca 2190 aggggaatat tttattcaag gtaaaaaaat tctaaataaa atataattgt tttttatctt 2250 ttctacagca aatttataat tttaagattc cttttcctgt tcatcagcag ttgttattac 2310 atcccttgtg gcacattttt tttttaattt tgtaaaggtg aaaaaaaaac ttttatgagc 2370 tcatgtagca atcaaattat cctgtggatt gataataaat gaatatggta tatagttaaa 2430 gattttaaaa aaaaaaaa 2448

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の溶原性クローンに由来する核抽出物に関
する競合検定法の結果を示す。

【図２】ＩＦＮ−βプローブの保護領域決定実験のオー
トラジオグラムを示している。

【図３】この組換えタンパク質の、種々のＤＮＡに対す
る親和性を試験するため各濃度の競合ＤＮＡの存在下で
競合実験を行った結果を示す。

【図４】ｐＩＲＦ−Ｉの望ましいｃＤＮＡ挿入物の配列
を示している。

【図５】ｐＩＲＦ−Ｉの望ましいｃＤＮＡ挿入物の配列
を示している。

【図６】ｐＩＲＦ−Ｉの望ましいｃＤＮＡ挿入物の配列
を示している。

【図７】マウスＩＲＦ−１の推定されるアミノ酸配列中
の塩基性及び酸性アミノ酸の位置を図的に示したもので
ある。

【図８】推定されるマウス及びヒトのＩＲＦ−Ｉの配列
を比較のため並列して示してある。

【図９】推定されるマウス及びヒトのＩＲＦ−Ｉの配列
を比較のため並列して示してある。

【図１０】図１０Ａは、種々の器官及び組織由来の総Ｒ
ＮＡを、プローブとしてマウスｃＤＮＡを用いたブロッ
ティング分析した結果を示す。図１０Ｂは、ＮＤＶ誘導
したマウスＬ９２９由来の細胞質ＲＮＡの、種々のプロ
ーブを用いたブロッティング分析の結果を示す。

【図１１】ＩＲＦ−Ｉプロモーターを有するクローンの
Pst I フラグメントの配列分析で決定された配列を示
す。

【図１２】ＣＡＴ遺伝子を含む各プラスミドを有する細
胞をＮＤＶで誘導したときのＣＡＴ活性を示す。

【図１３】ヒトのＩＲＦ−Ｉ遺伝子の構造を示す。

【図１４】ヒトのＩＲＦ−Ｉ遺伝子の構造を示す。

【図１５】ヒトのＩＲＦ−Ｉ遺伝子の構造を示す。

【図１６】ヒトのＩＲＦ−Ｉ ｃＤＮＡとコハイブリダ
イズする、イースト及びヒトＤＮＡを示すオートラジオ
グラフを示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相
   補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつ反復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及びヒトＩＦ
   Ｎ−β遺伝子の上流制御要素に結合するタンパク質をコ
   ードするＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 反復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及びヒ
   トＩＲＦ−β遺伝子の上流制御要素に結合するタンパク
   質をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号２で表さ
   れるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする前記Ｄ
   ＮＡ分子。
3. 【請求項３】 ＤＮＡ分子であって、配列番号３記載の
   ＤＮＡ分子又は該ＤＮＡ分子と縮重の関係を有する、反
   復オリゴマー配列ＡＡＧＴＧＡ及びヒトＩＲＦ−β遺伝
   子の上流制御要素に結合するタンパク質をコードする変
   異体。
4. 【請求項４】 配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相
   補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
   るＤＮＡ分子によりコードされ、かつ反復オリゴマー配
   列ＡＡＧＴＧＡ及びヒトＩＦＮ−β遺伝子の上流制御要
   素に結合するタンパク質。
5. 【請求項５】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
   するタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか１項記載のＤＮ
   Ａ配列を含有するプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか１項記載のＤＮ
   Ａ分子でトランスホームした宿主細胞。