HU213162B - Process for producing factor controlling gene expression - Google Patents

Process for producing factor controlling gene expression Download PDF

Info

Publication number
HU213162B
HU213162B HU894329A HU432989A HU213162B HU 213162 B HU213162 B HU 213162B HU 894329 A HU894329 A HU 894329A HU 432989 A HU432989 A HU 432989A HU 213162 B HU213162 B HU 213162B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
priority
aag
protein
gac
atg
Prior art date
Application number
HU894329A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52152A (en
Inventor
Takashi Fujita
Tadatsugu Taniguchi
Original Assignee
Tadatsugu Taniguchi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP88113793A external-priority patent/EP0355190A1/en
Application filed by Tadatsugu Taniguchi filed Critical Tadatsugu Taniguchi
Publication of HUT52152A publication Critical patent/HUT52152A/hu
Publication of HU213162B publication Critical patent/HU213162B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány általánosan a gén-expresszió szabályozására vonatkozik. Részletezve, a találmány a következőkre vonatkozik: egy interferon-szabályzó faktor-1 (Interferon regulatory factor-1, a továbbiakban IRF-1) aktivitású fehérjét kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására; olyan rekombináns DNS molekulákra, amelyek egy IRF-1 aktivitású fehérjét kódoló DNS szekvenciát és egy promotert, valamint egy hozzá kapcsoltan működő szabályozó szekvenciát tartalmaznak; ezeknek a DNS molekuláknak az alkalmazása olyan gazdasejtek transzformálására, amelyek a kívánt fehérjét kódoló DNS molekulákkal is transzformáltak és a fenti IRF-1 fehérje kontrollja alatt vannak; olyan DNS molekulákra, amelyek egy gyógyászatilag aktív fehérjét kódoló szekvenciát, a fenti fehérjét kódoló gén promoter régióját és az IRF-1 molekula kötésére alkalmas helyet tartalmaznak; valamint a fenti IRF-1 aktivitású fehérje és/vagy a fenti gyógyászati aktivitású fehérje előállítására a fenti DNS molekulákkal transzformáit megfelelő gazdasejtek tenyésztésével.
Az emlős sejtekben a gének transzkripcióját komplex mechanizmus szabályozza, amelyben központi szerepet játszanak a szabályzó DNS szekvenciák kölcsönhatásai trans-aktív DNS-kötő fehérjékkel. A transzkripció szabályzását tekintve az interferonokat (továbbiakban IFN-ek) kódoló gének közös vonásokat mutatnak a legtöbb citokin génnel; ezeknek a géneknek a transzkripcióját átmeneti módon egymást követő különböző extracelluláris szignálok indukálják. Megfelelő mértékben bizonyított, hogy az IFN-α és IFN-β géneknek a transzkripcióját különböző sejtekben hatásosan indukálják vírusok, míg az IFN-y-t kódoló gén indukciója a T-limfocitákban (T-sejtekben) mitogén stimulációt követően történik (összefoglalást lásd: Weissmann és Weber, 1986; Taniguchi, 1988).
Úgy tűnik, hogy az IFN-β, amely egy citokin és amelyet eredetileg antivirális aktivitása alapján azonosítottak, szintén döntő szerepet játszik a sejt növekedésében és differenciálódásában. Ebben a tekintetben a vírusok és poli(rl): poli(rC) mellett, amelyek jól ismert indukálói az ΙΕΝ-β-génnek, több citokin, így a telepstimuláló faktor-1 (colony stimulating factor-1, a továbbiakban CSF-1) (Moore és mtsai, 1984; Warren és Ralf, 1986; Resnitzky és mtsai, 1986), a tumor nekrózis faktor (tumor necrosis factor, a továbbiakban TNF) (Onozaki és mtsai, 1988), a vérlemezkékből származó növekedési faktor (platelet-derived growth factor, a továbbiakban PDGF) (Zullo és mtsai, 1985) és az IFNek (Kohase és mtsai, 1987) szintén indukálják bizonyos sejtekben az ΙΕΝ-β-t, amely alapján feltételezhető, hogy ezek hasonló vagy azonos szignálokat transzdukálnak a célsejtekben.
Az IFN-β gén vírusok és poli(rl): poli(rC) általi indukciója látszólag a transzkripciós szinten történik (Raji és Pitha, 1983, Ohne és Taniguchi, 1983; Dinter és mtsai, 1983; Zinn és mtsai, 1983). így indukálható expresszió fokozó hatású círz-aktív DNS szekvenciá10 kát azonosítottak a humán IFN-β gén 5'-végén (Fujita és mtsai, 1985, 1987; Goodbourn és mtsai, 1985; Dinter és Hauser, 1987). Az indukálható expressziót fokozó hatású régió (azaz a CAP-részhez viszonyítva a -65-től a-105-ig teijedő régió) ismétlődő hexanukleo15 tid egységeket tartalmaz, amelyek közül néhány valóban funkcionál a transzkripció indukált aktiválásában, ha az multimerizált (Fujita és mtsai, 1987). Azonosítottunk emlős sejtekben, így egér L929 sejtekben és humán sejtekben egy faktort, az IRF-1-et, amely specifi20 kusan kötődik az IFN-β szabályzó szekvenciákhoz ugyanúgy, mint a funkcionális, ismétlődő hexanukleotid szekvenciákhoz, (AAGTGA)4. Azt találtuk, hogy az IRF-1 lényeges szerepet játszik az IFN-β gén transzkripció vírus által indukált aktiválásában az azo25 nosított cwz-elemekre hatva.
A jelen találmány széleskörű jellegének megfelelően egy olyan DNS molekulát hozunk létre, amely egy interferon szabályzó faktor-1 (interferon regulatory factor-1, a továbbiakban IRF-1) aktivitású fehérjét kó30 dől.
Előnyösen a DNS molekula a humán IRF-1-et vagy egér (murine) IRF-1-et kódolja, vagy hibridizálható az ezeket kódoló DNS-sel.
A DNS molekula előnyösen egy olyan molekula, 35 amely egy olyan fehérjét kódol, amely kötődik az ismétlődő oligomer AAGTGA szekvenciához és a humán IFN-β gén promoter előtti (továbbiakban „upstream”) szabályzó régióihoz.
A DNS molekula tartalmazhat egy promoter régiót, 40 amely lehet konstitutív vagy indukálható, például vírus által indukálható, így Newcastle Disease Vírussal (a továbbiakban NDV), vagy indukálható mitogén stimulációval, így például Concanavalin A-val.
Egy előnyös DNS molekula (amely a humán IRF45 1-et kódolja) az alábbi I képlet szerinti szerkezeti génnel jellemezhető:
1. képlet
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAC-AGGAGATGATCT
110 120 130 140 150
TGC-AGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
HU 213 162 Β
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTG7G
260 270 2S0 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 . 630 640 650
GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930· 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG vagy ennek egy degenerált változata. képletnek és az „upstream” és „downstream” szegélyeA DNS molekulát jellemezni lehet például egy ző szekvenciái a következő II képletnek megfelelő olyan strukturális génnel, amely megfelel a fenti 60 részekettartalmazzák:
HU 213 162 Β
II. képlet
CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC
CGGCCGTGCCCGGCGGCCTTAAGAACCAGGCAACCACTGCCTTCTTCCCT
CTTCCACTCGGAGTCGCGCTTCGCGCGCCCTCACTGCAGCCCCTGCGTCG
CCGGGACCCTCGCGCGCGACCAGCCGAATCGCTCCTGCAGCAGAGCCAAC
20 30 40 50
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150
TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAC-CA
410 420 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC .510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650
GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 7$0 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
HU 213 162 Β
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950
ATGGATC-CCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCGTAGCAGGGCCCCTGGGCCCCTCTTA
TTCCTCTAGGCAAGCAGGACCTGGCATCATGGTGGATATGGTGCAGAGAA
GCTGGACTTCTGTGGGCCCCTCAACAGCCAAGTGTGACCCCACTGCCAAG
TGGGGATGGGCCTCCCTCCTTGGGTCATTGACCTCTCAGGGCCTGGCAGG
CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCTC-GGA AGATGAGGTTCTGAGACCAGTGTATCAGGTCAGGGACTTGGACAGGAGTC AGTGTCTGGCTTTTTCCTCTGAGCCCAGCTC-CCTGGAGAGGGTCTCGCTG
TCACTGGCTGGCTCCTAGGGGAACAGACCAGTGACCCCAGAAAAGCATAA CACCAATCCCAGGGCTGGCTCTGCACTAAGAGAAAATTGCACTAAATGAA
TCTCGTTCCAAAGAACTACCCCTTTTCAGCTGAGCCCTGGGGACTGTTCC AAAGCCAGTGAATGTGAAGGAAAGTGGGGTCCTTCGGGGCAATGCTCCCT .
CAGCCTCAGAGGAGCTCTACCCTGCTCCCTGCTTTGGCTGAGGGGCTTGG
GAAAAAAACTTGGCACTTTTTCGTGTGGATCTTGCCACATTTCTGATCAG
AGGTGTACACTAACATTTCCCCCGAGCTCTTGGCCTTTGCATTTATTTAT '
ACAGTGCCTTGCTCGGGGCCCACCACCCCCTCAAGCCCCAGCAGCCCTCA ACAGC-CCCAGGGAGGGAAGTGTGAGCGCCTTGGTATGACTTAAAATTGGA aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa
ATATGTACATTTGTCTTTTTATAAAAAGTAAAATTGTT vagy ennek egy degenerált változata.
Egy másik, előnyös DNS molekula (amely az egér IRF-l-et kódolja) a következő, a III. képletnek megfelelő strukturális génnel jellemezhető:
III. képlet
ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT t
AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG
ATC TTC CAG ATT CCA TGG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GA.C -ATC .
HU 213 162 Β
AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA·
TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC.
TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT
CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG
CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC
CGA GAC ACT AAG AGC AAA· ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC
CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC
CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG
GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT
CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT
GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC
GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC G.AA GAC CTT ATG AAG
CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA
TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC
TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT
GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC
ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC
TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG
vagy ennek egy degenerált változata.
Egy ilyen, az előbbi fejezetben említett DNS molekula például egy strukturális génnel - amelynek a képlete előbb megadott - és „upstream” és „downstream” szegélyező szekvenciákkal jellemezhető, ahogy a következő i képletben megadjuk:
IV. képlet ggacgtgctt'tcacagtctáagccgaaccgaaccgaaccgáaccgaaccgaaccgc-gcc
GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG
119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCC-CTCTCCGGCACCCTC
178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG
227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA
272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA
317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC
362 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA
407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT
452 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG
497 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG
542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC
HU 213 162 Β
587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT
632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA
677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG
722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT
767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT
812 ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC
857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC .GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GC-G
902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG
947 CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA
992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG
1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA
1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG
1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT
1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG . TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC
1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC · 12 81 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCA.AACAGGGGACCATCCTCC 1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA 1399 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT 1458 GGACAGG AGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAG AGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 1635 GCCCTTCCCAACCG AGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTG AAATGTG AAGGG AAAA A A 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 17 53 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT '
1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGQATTTATTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG
193 0 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC
1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT
04 8 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2 082 , nak az előbbi humán vagy egér IRF-1 DNS szekvenciájával (I—IV. képletek), és amelyek IRF-1 aktivitású fehérjét kódolnak.
vagy ennek egy degenerált változatával.
A találmány szerinti DNS szekvenciák, amelyek az IRF-1 aktivitású fehérjét kódolják, tartalmaznak eukarióta (nem csak humán vagy egér eredetű, hanem például csirke, béka vagy élesztő eredetű) forrásból szárEgy ilyen cDNS molekula, amely hibridizál az egér IRF-1 cDNS-sel, és amelyet a 4A ábra mutat be, az mazó olyan DNS szekvenciákat is, amelyek hibridizál- 60 alábbi Illa képletnek felel meg:
HU 213 162 Β
Illa képlet · 20 30 40.
A7GCCGG7GGAACGGA7GCGAA7GCGCCCG7GG77GGAGGAGCAG *60 ' 70
A7AAA77CCAA7ACGATACCAGGGC7AAAG’
Ξ3 90 ;ggaacaaggag
100 110 120 AAGAAGA7777CCAGA7CCCC7GGA7GCA7
140 150 ISO
7GGGACG7GGAAAAGGA7GC7CCGC7C77C
190 200 219
CA7ACAGGAAAGCA7CAACCAGGAA7AGA7
230 240 ' 250
ACA7GGAAAGCAAA7777CGA7G7GCCA7G:
130
CGGC7CGGCACGGA' ’ 170 ISO
GAAAC7GGGCGA7C
220
AACCAGA7CCAAAA
250 270
Á77CCC7GCCCGAC
2S0
290 = 00
310
A7TGAGGAAG7GAAGGACAGAAGCA7AAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 359 3S0
77CAGAG7C7ACCGGA7GC7GCCC77A7CCGAACGACC77CCAAG
370 3S0 .... 220 400
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAG77AAGCAC.
410 420 _ 430 440 A50
A7CAAGCAAGAACCAG77GAG7CA7C777GGGGC77AG7AA7GGA
460 470 ' 480 490
GTAAGTGGC77T7C7CC7GAG7A7GCGG7CC7GACTTCAGC7A7A
500 510 520 530 -540
AAAAA7GAAG7GGA7AG7ACGG7GAACA7CA7AG77G7AGGACAG
550 560 570 * 580
7CCCA7C7GGACAGCAACA77GAAGA7CAAGAGA7CG7CAC7AAC
590 600 610 * 620 530
CCGCCAGACATC7GCCAGGT7GTAGAAG7GACCAC7GAGAG7GAT
640 650 660 670
GACCAGCCAGTCAGCA7GAG7GAGC7C7ACCC7C7ACAGA777C7
680 690 700 ’ 710 720
CC7G7G7C77CCTACGCAGAAAGCGAAAC7ACCGACAG7G7GGCC
730 ' 740 ' 750 ' 760
AG7GA7GAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACAC7GGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810
AGCATCGAAGGCAAGCAG7ACC7CAGCAACA7GGGGACACGGAAC
820 · 830 840 ' 850'
ACCTA7C7GC7GCCCAGCA7GGCGACC777G7CACC7CCAACAAG
HU 213 162 Β
860 870 880 ' 890 900
CCAGA7CTGCAGG7CACCA7CAAAGAGGA7AGC7G7CCGA7GCCT
910 920 · 930 940
7ACAACAGC7CC7GGCCCCCA777ACAGACC77CCCC77CC7GCC
950 960 S70 980 990
CCAG7GACCCCCACGCCCAGCAGCAG7CGGCCAGACCGGGAGACC
1000 1010 1020 1030
CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT
040
G7CAAGAGC7GT vagy ennek egy degenerált változata. és az „upstream” és „downstream” szekvenciái a IVa
Ezt a DNS molekulát például jellemezheti egy képletnek felelnek meg:
strukturális gén, amelynek a képlete a fentivel azonos
IVa képlet
7C7CAGGCAAGCCGGGGA C7AAC7777AG7777GC7CC7GCGA77A77CAAC7GACGGGC777
CA777CCA7777ACACACCC7AACAACAC7CACACC77GCGGGA7
7G7A77GG7AGCG7GGAAAAAAAAAAAGCACA77GAGAGGG7ACC .
' · 20 30 40.
Á7GCCGG7GGAACGGA7GCGAA7GCGCCCG7GGC7GGAGGAGCAG /
60 70 80 . 90
A7AAA77CCAA7ACGA7ACCAGGGC7AAAG7GGC7GAACAAGGAG
100 110 120 130
AAGAAGA7777CCAGA7CCCC7GGA7GCA7GCGGC7CGGCACGGA
140 150 ISO ' ' 170 180
7GGGACG7GGAAAAGGA7GC7CCGC7C77CAGAAAC7GGGCGA7C
190 200 210 220
CA7ACAGGAAAGCA7CAACCAGGAA7AGA7AAACCAGA7CCAAAA
230 240 250 260 270
ACA7GGAAAGCAAA7777CGA7G7GCCA7GAA77CCC7GCCCGAC
280 290 300 310
A77GAGGAAG7GAAGGACAGAAGCA7AAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360
77CAGAG7C7ACCGGA7GC7GCCC77A7CCGAACGACC77CCAAG
HU 213 162 Β
370 3S0 . . 390 400
A A A GG A AA GA A A CCA A A G A CA G AA A A A GAA GA GA GA G 7 T A
AGCAC.
450
JGGA
410 420 _ 430 440
ATCAAGCAAGAACCAG77GAG7CATCT7TGGGGC77AG7AA
460 470 480 490
GTAAGTGGCTTT7CTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA
500 $10 520 530 540
AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG
550 560 570 580
TCCCATCTGGACAGCAACA7TGAAGATCAAGAGA7CG7CACTAAC
590 600 610 620 530
CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCAC7GAGAGTGAT
640 650 660 670
GACCAGCCAGTCAGCA7GAG7GÁGCTC7ACCC7CTACAGATT7CT.
650 690 -700 710 720
CCTG7GTCTTCC7ACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC
730 740 750 750
AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACi GGAGüAAGAGG
770 780 730 800 810
AGCA7CGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACA7GGGGACACGGAAC
820 830 840 850
ACCTA7CTGC7GCCCAGCA7GGCGACCTT7G7CACC7CCAACAAG 860 870 880 - ' 890 900
CCAGATCTGCAGG7CACCA7CAAAGAGGATAGCTG7CCGA7GCCT
Slü 920 '930 940
TACAACAGC7CC7GGCCCCCA7TTACAGACC77CCCCT7CC7GCC
950 960 '970 980 990
CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCA.GTCGGCC.AGACCGGG.AGA.ee
HU 213 162 Β
1000 1010 1020 1030
CGGGCCAGTGTCA7CAAGAAGACA7CTGATATCACCCAGGCCCGT
1040
G7CAAGAGC7G77AAGCC777GAC7C7CCC7GG7GG77G77GGGA
TTTC7TAGCTTTG7G77G77C777G777G7A77A7A77A7T7T7T
77C7C7A7GA7ACC7A7C77AGACACA7C7AAGGGAGAAAGCC77
GACGA7AGA77A77GA77GC7G7G7CCAAC7CCAGAGC7GGAGCT
TCT7C7TAAC7CAGGAC7CCAGCCCCCCCCCCCCC7CGG7AGA7G
CG7A7C7C7AGAACC7GC7GGA7C7GCCAGGGC7AC7CCC7CAAG
77CAAGGACCAACAGCCACACGGGCAG7GGAGG7GC7GCG77GCC
7ACGG7CAAGGCCAGCA7GG7GGAG7GGA7GCC7CAGAACGGAGG
AGAAAA7G7GAAC7AGC7GGAA7777777A77C77G7GAA7A7G7
ACATAGGGCAG7ACGAGCAA7G7CGCGGGC7GC77C7GCACC77A
7C77GAAGCAC77ACAA7AGGCC77C77G7AA7C77GC7C7CC77
CACAGCACAC7CGGCGACCCC77C7G7G7CCAC7ACCCCAC7ACC
CACCCC7CCC7CC7CAACCCC7CCA7CCCGG7CC7C7A7GCGCCC
CTTCCCCCCAACCAATCCCA7CACAACC7C77ACC7A7CC777CC
HU 213 162 Β
C7CCCAACCCC77C7A7CCCAGCCCACCACC7ACCCCAC7CC7CC
CCAACTCCTCCATTCTAGCCCATTACCCACGCCTCTCTCCTCAGC <
CCAGCCTACCCCATCCCACCCTGTTCCTTTCCTCCAGTTTCCTCT
CCTCAAAGGCAAGGCTCTACATCTTGGAGGAGGAGGAGGAGAAGA
AAA7GAG777C77CACCGC7G7CCCA7777AAGAC7GC77GAA7A
A7AAAAAAAAA7C777C7AA7C7GC7A7GC77GAA7GGCACGCGG
7ACAAAGGAAAAC7G7CA7GGAAA7A77A7GCAAA77CCCAGA7C
7GAAGACGGAAAA7AC7C7AA77C7AACCAGAGCAAGC777777A 777TTTTA7ACAAGGGGAA7A77T7A77CAAGG7AAAAAAA77C7
AAA7AAAATA7AA77G77TT7TA7CTTT7C7ACAGCAAA777A7A
A7T77AAGA77CCTTT7CC7GT7CATCAGCAG77G77A77ACA7C
CC77G7GGCACA7777777777AA7777G7AAAGG7GAAAAAAAA
AC7777A7GAGC7CA7G7AGCAA7CAAA77A7CC7G7GGA77GA7
AA7AAA7GAA7A7GG7A7A7AG77AAAGA7777AAAAAAAAAAAA vagy ennek egy degenerált változata.
A következőkben leírjuk a humán és egér IRF-1 et kódoló cDNS molekulának az izolálását humán sejtekből és egér sejtekből és olyan élesztőből, amely 60 hibridizál az egér IRF-1, ill. a humán IRF-1 cDNSével.
A rekombináns DNS molekula tartalmazhat egy promotert és egy szabályzó szekvenciát, amely a következő V. képletnek felel meg:
HU 213 162 Β
PstI
CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG
-299
V. képlet
GC Box 1 GC Box 2
CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAXGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCdGGGGCGGTGGCGCGG
-251
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC
-193
CAAT Box
AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGSSÜüXrSGGGCGCGCAGGAGCG
-135
Minor cap hely
GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC 'Major cap Κθ1Υ _plRF-L
Hr J
TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT · -19 +1
TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG + 39
CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97
CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA +155
PstI
TCGCTCCTGCAG +213 +225 vagy ennek egy degenerált változata.
A rekombináns DNS molekulát úgy is meg lehet tervezni, hogy gyógyászatilag aktív fehérje, pl. egy citokin vagy egy plazminogén aktivátor expressziójára 50 legyen alkalmas és ilyen formában előnyösen tartalmaz egy strukturális gént a kívánt gyógyászatilag aktív fehérje számára, amely működőképesen kapcsolódik a fenti fehérje génjének promoter régiójához, amely utóbbi tartalmazza az IRF-1 aktív molekula kötőhe- 55 lyét.
így a találmány szerinti rekombináns DNS molekula magában foglalhat a fentiekben megadott DNS szekvenciát és egy strukturális gént a kívánt gyógyászatilag hatásos fehérje számára, amely a fent megadott DNS szekvencia által kódolt IRF-1 aktivitású fehéije kontrollja alatt van. Egy ilyen rekombináns DNS molekulában az IRF-1 aktivitású molekulát kódoló gén előnyösen egy konstitutív promoter, vagy még előnyösebben egy indukálható promoter kontrollja alatt van. Előnyös, ha a kívánt gyógyászatilag aktív fehérje génje tartalmaz egy IRF-1 kötőhelyet, amely ismétlődő AAGTGA szekvenciákat foglal magában.
A találmány magában foglal egy gazdasejtet, például egy baktérium sejtet, így pl. E. coli sejtet vagy egy élesztő sejtet, vagy egy emlős sejtet, például egy CHO sejtet (Chinese hamster ovary cell) vagy egy egér sejtet, pl. L929 sejtet, amelyeket a fent megadott rekombi60 náns DNS molekulával transzformálunk. Ideálisan a
HU 213 162 Β gazdasejtet egy olyan sejtvonalból választjuk ki, amely nem, vagy lényegében nem tartalmaz endogén IRF-1 aktivitású anyagot.
Egy más módon a gyógyászatilag hatásos fehérje termelésére a gazdasejtet transzformálni lehet az első, 5 egy IRF-1 aktivitású fehérjét kódoló szekvenciát tartalmazó DNS molekulával és egy második, különálló DNS molekulával, amely kódolja a kívánt, gyógyászatilag aktív fehéqét az első DNS molekula által kódolt IRF-1 fehérjének a kontrollja mellett. Az első, az 10 IRF-1 aktivitású molekulát kódoló DNS molekula előnyösen tartalmaz egy konstitutív promotert vagy még előnyösebben egy indukálható promoter szekvenciát, amely működőképesen kapcsolódik az IRF-1 aktivitású vegyületet kódoló génhez. Szintén előnyös, ha a második DNS molekula magában foglal egy kötőhelyet az IRF-1 aktivitású fehérje számára, amely kötőhely ismétlődő AAGTGA szekvenciákat tartalmaz.
Az IRF-1 aktivitású fehérjét vagy a gyógyászatilag hatásos fehéijét elő lehet állítani transzformált sejtek tenyésztésével és a termelt fehérjéket szokásos módon lehet izolálni.
A gazdasejteket megfelelően lehet indukálni alkalmas módon kezelve a promotert, amely működőképesen kötődik az IRF-1 kódoló génhez, amelyet az alábbiakban tárgyalunk.
A találmány magában foglal egy fehérjét, amelynek IRF-1 aktivitása van és amelyet a fent leírt DNS molekulával transzformált gazdasejt tenyésztésével nyertünk.
Egy előnyös IRF-1 aktivitású fehérje a VI. képletnek felel meg:
VI. képlet
Met Pro Ile Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Met Gin Ile
Asn Ser Asn Gin Ile Pro Gly Leu Ile Trp He Asn Lys Glu Glu Met
Ile Phe Gin Ile Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His Gly Trp Asp He
Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg · Ser Trp Ala Ile His Thr Gly Arg ·
Tyr Lys Ala Gly Glu Lys Glu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn .
Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale Glu Glu Val Lys Asp
Gin Ser Arg Asn Lys Gly Ser Ser Ala Val Arg Val Tyr Arg Met Leu
Pro Pro Leu Thr Arg Asn Gin Arg Lys Glu Arg Lys Ser Lys Ser Ser .
Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys Gly Asp Val Ser
Pro Asp Thr Phe Ser Asp Gly Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp .
His Ser Ser Tyr Thr Thr C-ln Gly Tyr Leu Gly Gin Asp Leu Asp Met
Glu Arg Asp Ile Thr Pro Ala Leu Ser Pro Cys Val Val Ser Ser Ser
Leu Ser Glu Trp His Met Gin Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr .
Asp Leu Tyr Asn Leu GIN Val Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser Glu Ala .
Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gly Lys He Ala Glu Asp Leu Met Lys.
Leu Phe Glu Gin Ser Glu Trp Gin Pro Thr His He Asp Gly Lys Gly .
Tyr Leu Leu Asn Glu Pro Gly Thr GIN Leu Ser Ser Val Tyr Gly Asp .
Phe Ser Cys Lys Glu Glu Pro Glu Ile Asp Ser Pro Arg Gly Asp Ile
Gly Iie Gly Ile Gin His Val Phe Thr Glu Met Lys Asn Met Asp Ser .
Ile Met Trp Met Asp Ser Leu Leu Gly Asn Ser Val Arg Leu Pro Pro
Ser Ile Gin Ala He Pro Cys Ala Pro
Egy másik előnyös IRF-1 aktivitású fehérje a VII. képletnek felel meg:
Vll. képlet
MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet
GlnlleAsnSerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpIleAsnLysGluGluMetHeLeu
GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspIleAsnLysAspAlaCysLeu
HU 213 162 Β
PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro
LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspIleGluGluVal
LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro.
LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys.
AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer,
SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu,
ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuProAsp
TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal
SerProMetProSerIleSerGluAlaThrThrAspGluAspGluGluGlyLysLeuPro
GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys
GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys
LysGluGluProGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal
PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg
LeuProSerlleGlnAlalleProCysAlaPro
Még egy előnyös fehérje, amelyet a Illa képletű cDNS szekvencia kódol, a VIII. képletnek felel meg:
VIII képlet
Me tProVa 1G1 u Ar s?Me t Ar s!.íet Ar sProTr ?L euGluG1uGl n
I leAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu
LysLysI lePheGlη11 e?ro“r?MetHisAl aAlaArsHIsGly , 'TrpAspVa 1G1 uLysAspAl cProLeuPheArsAsnTrpA í a 11 e·
Hí sThrGlyLysHí sGlnProGlylleAspLysProAspProLys
ThrT’rpLysAlaAsnPheArsCysAlaMetAsnSerLeuProAs?
eGluGluValLysAspArgSerl leLysLysGlyAsnAsnAl a.
PheArjValTyrArg'MetLeuProLeuSerGluArgProSerLys
HU 213 162 Β
LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGl uArgVal LysH i s
I leLysGlnGluProValGluSerSerLeuGlyLeuSerAsnGly
Val SerGiyPheSerProGiuTyrAlaValLeuThrSerAl a 11 e
Lys AsnGluVal AspSerThrVaiAsn I leli eVa 1 Val Gl yGl n
SerHisLeuAspSerAsnl leGluAspGlnGluI leValThrAsn
ProPrcAspI leCysGlnValValGluValThrThrGlüserAs?
AspGlnProVa.lSerL'etSerGluLeuTyrProLeuGlnl leSer
ProValSerSerTyrAIaGluSerGluThrThrAspSerValAl
Ser AspGl uG 1 u As nA 1 aGl uG'l yAr sProH f s Tr ?A'r sLy s Ar g
Seri leGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGlyThrArgAsn
ThrTyrLeuLeuProSerMe.tAlaThrPheValThrSerAsnLys
ProAspLeuGlnValThrl leLysGiuAspSerCysProMetPro
TyrAsnSerSerTrpProPfoPheTh’rAspLeuProLeuProAla
ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr
HU 213 162 Β
ArsAl aSerVal I leLysLysThrSerAsp! lsThrGlnA! aArg
ValLysSerCys
Az alábbiakban leírjuk az egér és humán cDNS molekuláris klónozását és jellemzését, amely cDNS kódolja az IRF-1 aktivitású DNS kötő fehérjét.
Jelentős szekvencia-azonosság látható az egér és a humán IRF-1 molekulák között, amelyet a klónozott cDNS-ek analízise alapján lehet megállapítani. Továbbá, az IRF-l-et kódoló gén expressziója indukálható „Newcastle Disease” vírussal (NDV) és Concanavalin A-val (ConA) L929 egér sejtekben, illetve léplimfocitákban.
Kiviteli példa:
1. Az IRF-1 DNS klónozása és expressziója E. coliban
A poli(A)+ RNS-t nem-indukált L929 egér sejtekből izoláltuk és felhasználtuk a cDNS szintézisére (Aruffo és Seed, 1987, módszere szerint). Az így előállított cDNS-t ezután egy EcoRI-gyel hasított Xgtll vektorba klónoztuk és Huynh és mtsai (1985) standard módszerével létrehoztunk egy cDNS tárat, gazdatörzsként E. coli Y1090-t (Promega Co.) alkalmazva.
A kapott lambda gtll-tárat ezután szűrővizsgálatnak vetettük alá multimerizált (4-szer) AAGTGA szekvenciájával, mint próbaanyaggal (a továbbiakban Cl oligomer; Fujita és mtsai, 1987).
Ebben a szűrővizsgálatban a rekombináns lambda gtll fággal fertőzött E. coli Y 1090-t 10x13 cm méretű szögletes lemezekre vittük fel, a lemezeket 12 ’C-on inkubáltuk 4-5 órán át, ezután 20 000 plakk/lemez volt látható.
A szűrővizsgálatokhoz alkalmazott membránszűrő vagy nylon (Nytran; Schleicher & Schüll) vagy nitrocellulóz (Schleicher & Schüll) membrán volt. A szűrőket 10 mM IPTG-be [izopropil-(P-D-tiogalaktopiranozid)] merítettük (a megfelelő fág plakkokon a lacZ gén expressziójának az indukciója céljából), levegőn megszárítottuk, majd lefedtük a lemezt és 37 ’C-on inkubáltuk 2,5 órán át. A plakkok csak olyan fehérjéket termelnek, amelyet a cDNS kódol, ha a cDNS egy leolvasási kereten belül van a lacZ génnel.
Ezután a szűrőket eltávolítottuk, 4 ’C-on tartottuk 20 percen át, majd megszárítás nélkül szűrővizsgálatnak vetettük alá.
Ezután a membránszűrőket a következő módon készítettük elő a vizsgálatokra:
Egér L929 sejtekből mag kivonatot készítettünk és azt felcseppentettük a membránokra (kb. 10 μg fehérjének megfelelő mennyiséget).
A DNS kötést megelőzően egy kötő puffért alkalmaztunk, amely összetétele a következő: 10 mM HEPES (pH = 7,5), 5,0 mM NaCl, 1 mM DTT (ditiotreitol), 1 mM EDTA, 5% glicerin. A pufferhoz 5% nemzsíros tejport (Yukijurishi Inc.) adtunk és a szűrőket 1 órán át inkubáltuk 4 ’C-on a fenti elegyben, majd 1 percre belemerítettük egy olyan fenti pufferbe, amely nem tartalmazott tejport.
Ezután a szűrőket 1 ml kötő pufferben inkubáltuk, amely puffer 350 μg/ml, közelítőleg 300 bp hosszúságú lazac sperma DNS-t és 32P-vel jelzett próbaanyag Cl oligomer DNS-t (106 cpm/ml; specifikus aktivitás 2000 cpm/fM [femtoM] (lásd: Fujita és mtsai, 1987) tartalmazott. A próba DNS az 5'-végén volt jelezve, a jelzés (γ-32Ρ) ATP-vel történt T4 kináz segítségével.
A kötés megtörténte után a szűrőket a kötő pufferrel 1-2 órán át (10 ml/szűrő) mostuk szobahőmérsékleten, a művelet során többször cserélve a puffért. Ezután a szűrőket levegőn megszárítottuk és autoradiográfiás vizsgálatnak vetettük alá. Ebben a vizsgálatban a nylon membránok pozitív jelet adnak, amelyet specifikusan gátol a feleslegben lévő nem-jelzett Cl oligomer. A nitrocellulóz membránok nem adnak jelet.
Ily módon kb. l,4xl06 rekombinánst lehetett a szűrővizsgálattal találni. Az első szűrővizsgálat során azonosított 32 pozitív fág klón között egy kiónt (lambda L28-8 jelzésű) találtunk, amely a következő szűrővizsgálatok során ismételten kötődött a DNS próbaanyaghoz.
2. A fehérje előállítása transzformált E. coliban és tisztítása
Lizogén baktérium kiónokat készítettünk E. coli Y1089-et lambda L28-8-cal fertőzve. A lambda-L28-8-at befogadó lizogéneket egy éjjel után 1%-os arányban 400 ml L-táptalajba (L-Broth; lásd Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982) oltottuk. A baktériumokat 31 ’C-on tenyésztettük mindaddig, amíg az OD600 az 1-es értéket el nem érte. Ezután a hőmérsékletet 20 percre 42 ’C-ra emeltük, majd IPTG-t adtunk a tenyészethez 10 mM mennyiségben és további 20 percig inkubáltuk 38 ’C-on, majd gyorsan leülepítettük és az üledéket 10 ml lízis pufferben felszuszpendáltuk, amely puffer 20 mM HEPES-t (pH = 7,9), 0,2 mM EDTA-t, 0,5 mM spermidint, 0,15 mM spermlnt, 0,1 mM DTT-t, 10% glicerint, 0,5 mM fenil-metionil-szulfonil-fluoridot (továbbiakban PMSF), 1 μg/ml pepsztatin A-t, 1 μg/ml leupeptint, 500 μΜ L-I-tozilamid-(2-fenil-etil)-(klór-metil)-benzamidint, mM nátrium-molibdátot, 2 mM nátrium-pirofoszfátot és 2 mM nátrium-ortovanadátot tartalmazott. A sejt szuszpenziót háromszor gyors fagyasztás-leolvasztásnak vetettük alá, majd 30 000 rpm fordulattal 1 órán át centrifugáltuk 40 ’C-on Beckman 50 Ti rotorral. A felülúszót vagy közvetlenül használtuk fel a gél-retardációs vizsgálatban (lásd később) vagy tovább tisztítottuk.
A továbbtisztítást a következő módon végeztük:
HU 213 162 Β
Közelítőleg 4 ml felülúszót felvittünk a poli(di-C): poli(di-C) oszlopra, amely ágytérfogata 2 ml volt és lízis pufferrel előzőleg kiegyensúlyoztuk. Az átfolyt anyagot (4 ml) ezután egy 2 ml ágy térfogatú Z pufferrel kiegyensúlyozott [25 mM HEPES (pH = 7,8), 12,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20% glicerin, 0,1% NP-40, 0,5 mM PMSF] DE 52 (Whatman) oszlopra felvittük. A DNS kötő aktivitású anyagot 0,1 M KCl-t tartalmazó Z-pufferrel eluáltuk. Az eluátumot (közelítőleg 4 ml) Centricon-10 (Amicon) segítségével tovább koncentráltuk. A végső fehérje koncentráció 28 mg/ml volt.
3. A XL28-8 klón fehérje termékének a jellemzése
1. Gél retardációs vizsgálat
A XL28-8-at befogadó lizogén baktérium kiónokat E. coli Y1089 fertőzésével (transzfektálás) állítottuk elő és Huynh és mtsai (1985) módszerével indukáltuk a klónozott cDNS magas szintű expresszióját. Az ugyanúgy készített lizogén kiónokat fág-mentes cDNS inszertummal kezeltük (λ 6 jelzés) és kontrollként alkalmaztuk.
Az indukált lizogén tenyészetből kivonatokat készítettünk, amelyek mindegyike 3 pg fehérjét tartalmazott (négy készítményt a következőképpen jelöltünk: ÁL28-8a, >.L28-8b, X6a és X6b).
Egér L929 sejtekből mag kivonatot készítettünk (3 pg fehérje).
A kivonatokat lf. mól jelzett Cl oligomer mintával inkubáltuk a fent leírt módon, az oligomer specifikus aktivitása 8000 cpm/f mól volt.
Minden kivonatot kompetitív vizsgálatnak vetettünk alá, amely vizsgálatban a versengő DNS-t különböző koncentrációkban adtuk az inkubációs elegyhez.
A vizsgálat eredményeit az 1. ábra mutatja be, amelyben a különböző oszlopok a következőknek felelnek meg:
Oszlop Kivonat
1. semmi
2. X6a
3. Z6b
4. X6b a nem jelzett Cl oligomer 1000-szeres moláris feleslegével
5. X6b a nem jelzett C5A oligomer 1000szeres moláris feleslegével
6. AJL28-8a
7. XL28-8b
8. ÁJL28-8b a nem jelzett Cl oligomer 1000-szeres moláris feleslegével
9. AL28-8b a nem jelzett C5A oligomer 1000szeres moláris feleslegével
10. L929 sejt
11. L929 sejt a nem jelzett Cl oligomer 1000-szeres moláris feleslegével
12. L929 sejt a nem jelzett C5A oligomer 1000szeres moláris feleslegével
* A C5A oligomert Fujita és mtsai (1985) írták le; hatszor ismétlődő GAAA szekvenciát tartalmaz.
Az 1. ábrából látható, hogy a kötött próbaanyagok a 6, 7, 9, 10 és 12 oszlopokban mutathatók ki.
Amint az 1. ábrából látható, a XL28-8 lizogénekből nyert fehérje kivonatok más helyen mutatkozó sávokat tartalmaznak (6 és 7 oszlopok), amelyeknek a megjelenését gátolja a feleslegben lévő Cl oligomer DNS, de ugyanilyen mennyiségű C5A oligomer nem gátol (8 és 9 oszlopok).
A XL28-8-ból származó fehérjékkel ellentétben azok a fehérjék, amelyeket az indukált λό-ból származó lizogénekből nyertünk, nem mutatnak ilyen eltolódott sávokat (2-5 oszlopok). Ezek a sávok nagyon nagy hasonlóságot mutatnak az egér L929 sejtekből nyert természetes IRF-1 sávjaival (10 és 12 oszlopok). A két csoport között tapasztalható különbségek a próbaanyag DNS-hez kötött eltérő mennyiségű fehérje következményének tulajdoníthatók.
Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a megjelenő sávok csak a XL28-8-cal transzfektált IPTG-vel indukált Y1089 sejtek esetében mutatható ki.
(ii) A DN-áz „footprinting analízise
A „footprinting” analízis célja az volt, hogy teszteljük a ÁL28-2 cDNS által kódolt fehérének az IFN-β gén „upstream” régióját kódoló DNS-hez való kötődését.
A XL28-8 cDNS által kódolt fehérjét az indukált lizogénből extraháltuk és a fentiekben leírt módon részben tisztítottuk és vizsgáltuk az IFN-β gén „upstream” régióját tartalmazó DNS-hez való kötődését.
A DNS próbaanyagot Sall-HindlII fragmentumként állítottuk elő ρ-125-cat-ból (vad típusú IFN-β gént tartalmaz) és p-125D-cat-ból (egy IFN-β mutáns gént tartalmaz). A ρ-125-cat plazmidot ρ-105-cat fragmentumként szerkesztettük (Fujita és mtsai, 1987), kivéve azt, hogy a pSE-125-ből származó BamHI (-125)-Tagl(+19) fragmentumot alkalmaztuk [Fujita és mtsai, Cell, Vol. 41, 489-496, (1985)]. A p-125DP-cat plazmidot, amely az IFN-β szabályzó részeiben pontmutációkat tartalmaz, szintetikus oligonukleotidra irányuló ρ-125-cat mutagenizissel nyertük, amint azt Hatakeyama és mtsai leíiják [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9650-9654 (1986)]. Mindkét DNS-t a HindHI oldalon (y32P) ATPvel jeleztük T4 kináz segítségével.
A próbaanyag DNS 4-szeres mól mennyiségét (specifikus aktivitás 3000 cpm/mól) 20 pl olyan reakció elegyben inkubáltuk, amely 25 mM Tris-HCl-t (pH = 7,9), 6,25 mM MgCl2-t, 50 mM KCl-t, 1 mM EDTA-t, 0,5 mM DTT-t, 10% glicerint, 2% polivinilalkoholt tartalmazott 280 pg tisztított fehérje jelenlétében vagy anélkül.
A vizsgálatban 5x1 (Γ4 egység DN-áz I-et (Worthington) adtunk az elegyhez és 25 ’C-on 1 percig inkubáltuk.
A 2. ábra a következőkben leírt eljárással nyert mintákból előállított DNS fragmentumoknak az autoradiogramjait tartalmazza. A 2. ábrának baloldali részén a vad típusú IFN-β próba DNS szekvenciájának egy része szerepel, a 2. ábrának a jobb oldalán a mutáns IFN-β DNS szekvenciájának egy része látható.
1. A vad típusú IFN-β próbaanyagot A+G reakciókkal
HU 213 162 Β hasítottuk (lásd: Methods in Enzymology, 65, 499560), az eredmény az 1. oszlopban található.
2. A vad típusú IFN-β próbaanyagot részlegesen emésztettük DN-ázzal védelem nélkül. Az eredmény a 2. oszlopban látható.
3. A vad típusú IFN-β próbaanyagot reagáltattuk a fehérjével, majd DN-áz I-gyel emésztettük. Az eredmény a 3. oszlopban látható.
4. A vad típusú IFN-β próbát reagáltattuk a fehérjével 1000-szeres moláris feleslegben lévő nem jelzett CL oligomerrel és ezután DN-ázzal emésztettük. Az eredményt a 4. oszlop mutatja.
5. A mutáns IFN-β próbát reagáltattuk a fehérjével, majd DN-áz I-gyel emésztettük. Az eredményt az 5. oszlop mutatja.
6. A mutáns IFN-β próbát A+G reakciókkal hasítottuk. Az eredmény a 6. oszlopban látható.
A 2. ábrában a védett régiókat, amint az a 3. és 5. oszlopokban látható, az autoradiogram bal és jobb oldali részén jelölt szekvenciákon jeleztük. Az ismétlődő hexamer részeket bekereteztük.
A 2. ábrában megadott eredményekből látható, hogy a védett régió a -100-tól a -64 nukleotidoknak felel meg. Ezt a régiót az L929 sejtekből nyert IRF-1 által védettnek találtuk. Ez a védelem feleslegben alkalmazott, nem jelzett Cl oligomer alkalmazásával megszűnt (4. oszlop). Alacsonyabb fehérje koncentrációkat alkalmazva azt is tapasztaltuk, hogy az előnyös védelem abban a régióban történik, amely az AAGTGA ismétlődő elemet tartalmazza.
Az eredmények azt mutatják, hogy a fehérjének nagyobb az affinitása az AAGTGA ismétlődő régióhoz és alacsonyabb az affinitása a környező régióhoz.
A mutáns IFN-β gén szegmentum a -106, -100, -73 és a -67 helyeken T-G mutációkat tartalmaz. Összehasonlítva az 5. és 2. oszlopokat, ugyanolyan vizsgálati körülmények között a rekombináns fehérje által nyújtott védelem korlátozottabb, mint a nem mutált régióé (2. oszlop). Ez a megfigyelés összhangban van azzal a megállapítással, hogy ezeknek a mutációknak a hatására az L929 sejtekben az NDV által indukálható transzkripció dramatikusan csökken (húszadéra) és hogy az IRF-1 kötődése a mutáns IFN-β génhez in vitro csak a nem mutált régióban jelentős.
Továbbá, a Cl oligomer alkalmazása bizonyítja, hogy a fehérje specifikusan védi az oligomer szekvenciát tartalmazó régiót. Ez a védelem azonos az L929 sejtekből származó natív IRF-1 által kifejtettel.
3. DNS kompetíciós vizsgálat
Ennek a vizsgálatnak az a célja, hogy meghatározza a rekombináns fehérje affinitását a különböző DNS szekvenciákhoz, beleértve néhány ismert transzkripciós szabályzó DNS szekvenciát is. Az eljárás a következő:
Az IFN-β próba HindlII-Sall fragmentumát p125-cat-ból izoláltuk (lásd Fujita és mtsai, 1987); ez a fragmentum tartalmazza a humán IFN-β gén szekvenciáját a +19-től a-125-ig. ADNS-t a 3'-végen jeleztük mindkét véget [γ~32Ρ] dCTP-vel kapcsolva Klenow fragmentum alkalmazásával.
A próbaanyag DNS specifikus aktivitása 8000cpm/fM.
A gél retardációs vizsgálatokat a fentiekben leírt módon végeztük.
A kompetíciós vizsgálat folyamataiban a DNS-t a fehérjével különböző koncentrációjú kompetíciós DNS-ek jelenlétében reagáltattuk a kötőelegyben, amint azt a 3. ábrában megadjuk.
A keletkező komplex képződésének a mértékét mennyiségileg az autoradiogram denzitometriás analízisével határoztuk meg. A kompetíciós DNS távollétében végbemenő komplex képződést vettük 100%-nak.
A kompetíciós DNS-ek szerkezete a következő volt:
a) AP-1: egy szintetikus DNS, amelynek szekvenciája a következő:
5'CTAGA(TGACTCA)6G 3' 3'T(ACTGAGT)6CCTAG 5'
b) TNF (Tumor Necrosis Factor, továbbiakban TNF): szintetikus DNS 37 bp része, amely a +1162-től a +2116-ig terjedő részét tartalmazza a TNF-α első intronjának (lásd Nedwin és mtsai, 1985).
c) Egér H2-Dd: szintetikus DNS 37 bp része, amely tartalmazza az IRS (IFN response sequence, továbbiakban IRS) elemet (-159-től -123-ig), amint azt Korber és mtsai (1988) leírták.
d) Humán IFN-α: szintetikus DNS 46 bp része, amely megfelel a vírus válasz elemnek, lásd: Ryals és mtsai (1985).
e) Cl, C2, C3, C4 és C5A hexamer szekvenciák.
A Cl és a C5A szekvenciákat az előbbiekben már leírtuk. A C2, C3 és C4 szekvenciákat a Cell, 49, 352-367 (1987) közli; ezek a szekvenciák a következők:
AAATGA-C2
AAGGGA-C3 és
AAAGGA-C4
f) Az IFN-β gén szekvencia a +19-től a -66-ig.
A 3. ábrában a baloldali rész azokat az eredményeket mutatja be, amelyeket kompetitorként a hexamer ismétlődő részeket alkalmazva kaptunk. A középső részben a kompetitorként humán IFN gén szegmentumokat alkalmazva kapott eredményeket adtuk meg, és a jobboldali részben pedig a megadott különböző DNS szegmentumokkal kapott eredmények vannak feltüntetve.
A 3. ábrában bemutatott eredményekből látható, hogy az új helyen lévő sáv megjelenését gátolják a hexamer szekvenciák, a hatásosság sorrendje a következő: Cl- C2 - C3 - C4, a C5A nem gátolt szignifikánsan.
Az is megfigyelhető, hogy a szintetikus DNS szegmentumok, amelyek tartalmazzák akár a humán IFNal, vagy az egér H-2Dd gén szabályzó elemeit, a kompetíciós aktivitás emelkedését okozzák. Ez különösen érdekes, minthogy a H-2Dd gén DNS szegmentuma tartalmazza az úgynevezett IFN-válasz szekvenciát (IFN response sequence, továbbiakban IRS), amelynek fokozó hatása van, ha a sejtek az IFN-re
HU 213 162 Β reagálnak (Sugita és mtsai, 1987; Israel és mtsai, 1986; Korber és mtsai 1988).
Tény, hogy az ismétlődő szekvenciák hasonlóak vagy azonosak az IFN-β génben találtakkal, amelyeket az IFN által indukálható gének több promoter szekvenciájában találtak, amikoris a mag-faktorok specifikusan kötődnek (Korber és mtsai, 1988; Lery és mtsai, 1988).
A 3. ábrában megadott eredmények igen hasonlóak azokhoz, amelyeket olyan vizsgálatokban kaptunk, amikor a vizsgálatot azonos körülmények között végeztük L929 sejtek által termelt természetes fehéijét alkalmazva.
Az egér IRF-l-et kódoló cDNS szerkezete
A klónozott DNS-ek szekvenciáját didezoxi-módszerrel (SEQUENASE; United States Biochemical Inc.) vagy standard Maxam-Gilbert módszerrel (Maxam és Gilbert, 1980) határozhatjuk meg.
Az E. coliban lévő ZL28-8 inszertumot a következő módon izoláltuk: a fág DNS-t standard módszerrel készítettük és a DNS-t EcoRI-el emésztettük, a fág DNS-ből kihasított cDNS-t izoláltuk és didezoxi módszerrel meghatároztuk a szekvenciáját (SEQUENASE, United States Biochemical, Inc.). A XL28-8-ban talált cDNS inszertumot 1,8 kb hosszúságúnak találtuk. A nukleotid szekvencia analízise szerint egy nagy nyitott leolvasási keret kapcsolódik a β-galaktozid génhez.
A nagyobb cDNS inszertumokat tartalmazó kiónok szűrővizsgálata céljából kettősszálú cDNS-t szintetizáltunk L929 sejtekből származó poli(A)+ RNS-sel és azt CDM8 vektorba klónoztuk Aruffo és Seed (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8573, 1987) és Seed (Natúré, 329, 840-842, 1987) által közölt eljárással.
A rekombináns plazmidokat bevittük egy MC1061/p3 E. coli törzsbe (Aruffo és Seed fent megadott módszerével) és a cDNS kiónokat a DNS-DNS hibridizáció kimutatása céljából (Kashima és mtsai, Natúré, 313, 402-404, 1985) szűrővizsgálatnak vetettük alá XL28-8-ból származó (32P-jelzett) cDNS próbaanyagokkal, kismértékben szigorú körülmények között és egy pIRF-L kiónt kiválasztottunk a további vizsgálatok céljára.
A pIRF-L kívánt cDNS inszertumát HindlII és Xbal emésztéssel nyertük és a fent leírt módszerrel megállapítottuk a szekvenciáját. A szekvenciát a IV. képlet és a 4. ábra mutatja be.
A XL28-8-ból nyert cDNS szekvencia az átfedő régióban azonos szekvenciát mutat, kivéve, hogy egy A rész hiányzik az 1773 és 1781 nukleotidok között.
A XL28-8-ból származó cDNS 5' és 3' végét nyíllal jelöltük a 4. ábrában. Az ATTTATTTA és az ATTTA szekvenciákat, amelyek valószínűleg az mRNS instabilitását okozzák, bekereteztük.
A 4A ábrából kitűnik, hogy pIRF-L-ből származó egér cDNS-nek a cDNS-e 198 bp hosszúságú és 20 bpvel hosszabb, mint a XL28-8- cDNS-e az 5', ill. a 3' régiókban.
Ezen gén promoter régióját tartalmazó genomiális DNS szekvenciájának az analízise azt bizonyítja, hogy a pIRF-L cDNS-éből hiányzik körülbelül 30 bp a fő CAP helyen (lásd az V. képletet és a 7. ábrát).
Az első ATG kodonnak a közvetlen „upstream” szekvenciája GGACCATGC, hasonló a Kozak-féle megfelelő GCCagCCATGG szekvenciához a transzlációs iniciációs helynél.
Egy kazettában lévő ATG szekvenciát nem találtuk a fenti ATG szekvenciától „upstream” irányban, amely azt bizonyítja, hogy az valóban egy iniciációs kodonja az IRF-1 mRNS-nek.
Amint fent említettük, a ÁL28-8 és a pIRF-L cDNS-ek nukleotid szekvenciái között nem volt kimutatható eltérés az átfedő régiókban, kivéve egy nukleotidot a 3'-nem-kódoló régióban.
Az egér IRF-1 -ről megállapítottuk, hogy 329 aminosavból áll, amely értéket a 37,3 kD molekulasúly alapján kalkuláltunk. Szokásos N-glikozilációs helyet nem találtunk a szekvencián belül.
A fehérje szekvencia adatbázis és az újabban közölt szekvenciák vizsgálata alapján nem találtunk homológiát más ismert fehérjével (Natl. Biomed. Rés. Found., Washington, D. C.).
A hidropátiás „plot” analízis (Kyte és Doolittle, 1982) eredménye azt mutatja, hogy a fehérje nagymértékben hidrofil (4B ábra).
Az egér IRF-1 megállapított primer szekvenciájának a vizsgálata a következőket mutatja:
A fehérje aminoterminális része, amely a 140. aminosavig terjed, gazdag lizinben (Lys) és argininben (Arg). Az összesen 39 lizinből és argininből 31 ebben a régióban található. A 4B ábra alsó részében összefoglaló diagram található a bázikus aminosavak (Arg, Lys) (felfelé mutató oszlopok) és a savas aminosavak (Asp, Glu) (lefelé mutató oszlopok) helyéről.
Amint a 4B ábrából látható, ez a régió erősen hidrofil és feltételezhetően ez a régió felelős elsősorban az IRF-1-nek a specifikus DNS szekvenciához való kötődéséért.
Több DNS-hez kötődő fehéije jellegzetes ismétlődő részei, mint a „zinc fingers” és a „helix-turn-helix” (Pabo és Sauer, 1984, Evans és Hollenberg, 1988) nem voltak kimutathatók az IRF-1 fehérjében.
Ezzel szemben a molekula másik része (azaz a karboxi-terminális része) relatív nagy mennyiségben tartalmaz aszparaginsavat (Asp), glutaminsavat (Glu), szerint (Ser) és treonint (Thr). A 189 aminosavból (a 140-től a 329-ig) 33 (17%) savas aminosav és 36 (19%) Ser és Thr található. Figyelemreméltó, hogy 5 egymást követő savas aminosavból álló csoportot találtunk a 227-től a 231 aminosavig.
A Ser és Thr több esetben csoportokban találhatóak (a 153-156, 190-192, 206-208, 220-222; ezeket a S-T régióknak nevezzük). Az S-T régiókat kis nyitott négyszögekkel jelöltük a 4B ábra alsó részében.
A humán IRF-1-et kódoló cDNS szerkezete
A fentiekben az egér IRF-1-nél leírt eljáráshoz hasonlóan humán IRF-1 cDNS-t klónoztunk és meghatároztuk a szekvenciáját.
Egy humán cDNS tárat készítettünk poli(A)+ RNS segítségével cDNS-t szintetizálva egy humán Jurkat T sejtvonalból. A kettősszálú cDNS szintézis és az azt
HU 213 162 Β követő CDM8 plazmid vektorba való klónozása Aruffo és Seed módszerével történt (Aruffo és Seed, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577, 1987; Seed, Natúré, 329, 840-842, 1987).
A rekombináns plazmidokat Mcl061 E. coli törzsbe vittük Aruffo és Seed fent említett módszere szerint.
Az egér IRF-1 cDNS-el kereszt-hibridizáló cDNS kiónokat szűrővizsgálatnak vetettük alá (32P-vel jelzett) λΙ_28-8 cDNS próbaanyaggal kismértékben szigorú körülmények között a DNS-DNS hibridizáció kimutatása céljából. Az alkalmazott körülmények teljesen azonosak voltak a Kashima és mtsai által leírtakkal (Natúré, 313,402-404, 1985).
A pozitív kiónok közül kiválasztottuk a pHIRF31 kiónt, amely a leghosszabb cDNS inszertumot tartalmazza.
A pHIRF31 klón cDNS szekvenciáját a plazmid DNS Xhol-gyel végzett emésztése és az izolálása után a fent leírt módszerrel határoztuk meg. A humán IRF-1 gén szerkezetét a II. képletben és a 8. ábrában mutatjuk be.
Az összehasonlítás céljából az 5. ábrában egymás mellé helyeztük az egér és a humán IRF-1 szekvenciát.
A humán DNS analízise azt bizonyította, hogy ez az IRF-1 négy aminosavval rövidebb, mint az egér IRF-1.
Az azonos aminosavszekvencia szigorú megtartása látható a két IRF-1 molekulában. Részletezve: az aminoterminális rész 140 aminosavából 133 (95%) azonos.
Összefoglalva, a fenti megfigyelés azt jelzi, hogy az IRF-1 a DNS-t kötő fehérjéknek egy új osztálya.
Azt is meg kell jegyezni, hogy több citokinben és proto-onkogén mRNS-ben talált ATTTATTTA és ATTTA szekvenciák jelen vannak az egér IRF-1 cDNS 3'-nem transzlatált régiójában és hasonlóan megtalálható az ATTTA szekvencia a humán IRF-1 cDNS megfelelő régiójában is. Ezekről a szekvenciákról feltételezzük, hogy szerepet játszanak a gén expresszió poszt-transzkripciós szabályzásában instabillá téve az mRNS-t (Shaw és Kamen, 1986; Caput és mtsai, 1986).
A pIRF-L plazmiddal transzfektáltuk az MC1061/p3 E. coli törzset, amelyet MC106/p3 (pIRFL) néven letétbe helyeztünk a Fermentation Research Institue Agency of Industrial Science and Technology (FRI)-nál (Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibraki-ken 305, Japan) 1988. augusztus 19-én a budapesti egyezmény szerint FERM BP-2005 számon.
A pIRF31 plazmiddal hasonló módon transzfektáltuk az MC1061/p3 E. coli törzset, amelyet MC106/p3 (pIRF-31) néven letétbe helyeztünk az FRI-nél 1988. augusztus 19-én a budapesti egyezmény szerint FERM BP2006 számon.
Az 1RF gén szabályzása
1. Az IRF-1 mRNS expressziója
Tekintettel azon tényekre, hogy az IRF-1 affinitással rendelkezik más gének szabályzó szekvenciáihoz is mint az IFN-β gén és így résztvesz különböző sejttípusok géncsoportjainak a szabályzásában, a különböző szövetekből és szervekből származó egér sejtekben lévő IRF-1 mRNS expressziójának a meghatározását egér cDNS próbaanyag felhasználásával végeztük. Ennek a próbaanyagnak az elkészítése céljából az IRF-1 gén PstI fragmentum „sense” szálát tartalmazó Ml3 mplO fág DNS (lásd az alábbiakban) használtuk templátként a 32P-jelzett „antisense” DNS szintéziséhez, a terméket EcoRI-el emésztettük és a próbaanyag DNS-t Fujita és mtsai által leírt módszerrel izoláltuk (1985).
A teljes RNS-t Aruffo és Seed (1987) módszerével izoláltuk.
A telephibridizációs (blotting) analízist lényegében Thomas (1980) módszerével végeztük, a röntgen filmet 3 napon át exponáltuk és az eredményeket a 6A ábrában mutatjuk be. A különböző oszlopok a következő szövetekből nyert teljes sejt RNS készlettel kapott eredményeket mutatják be:
1. oszlop agy
2. oszlop szív
3. oszlop máj
4. oszlop tüdő
5. oszlop lép (nem stimulált)
6. oszlop timusz
7. oszlop vese
8. oszlop izom
9. oszlop bél
10. oszlop lép (nem stimulált)
11. oszlop ConA-val stimulált lép
Minden futtatás esetében 5 μg teljes sejt RNS-t alkalmaztunk, kivéve a 8. oszlopot, amelynél csak 1,2 μg RNS-t használtunk.
A 6A ábrából látható, hogy a legtöbb RNS próbaanyagban ezzel a telephibridizációs módszerrel a közelítőleg 2,0 kb méretűnek megfelelő sávokat detektáltunk, bár az mRNS expresszió szintje alacsony volt.
Meg kell jegyezni, hogy az mRNS expressziós szint a lépből származó limfociták esetében drasztikusan megnövekszik ConA-val való stimuláció után (11. oszlop).
Egy további vizsgálatban az L929 egér sejteket NDV-vel indukáltuk az előbbiekben leírt módon (Fujita és mtsai, 1985) és a citoplazmában lévő RNS-t az infekció után minden harmadik órában extraháltuk Aruffo és Seed (1987) módszere szerint.
A próbaanyag DNS-eket a következő különböző szekvenciákból készítettük és „multiprime” jelzési reakcióval (Amersham) jeleztük azokat:
(i) egy XL28-8-ból származó 1,8 kb méretű EcoRI fragmentummal (specifikus aktivitás 2xl08 cprn^g);
(ii) egy egér IFN-β genomiális kiónból származó
0,5 kb méretű BamHl-BglII fragmentummal (specifikus aktivitás 5xlO8 cpnujig) és (iii) egy humán β-aktin pszeudogént tartalmazó klón
2,0 kb méretű BamHI-PvuII fragmentumával (specifikus aktivitás 5xl08 cpm/pg).
Az eredményeket a 6B ábra mutatja be. Telephibridizációs analízist végeztünk a fent leírt módon Thomas (1980) módszerét alkalmazva.
Minden oszlopra 10 μg citoplazmatikus RNS-t vittünk fel. Árontgenfilmet 3 órán át exponáltuk. Adenzitometriás analízis azt bizonyította, hogy az IRF-1
HU 213 162 Β mRNS közelítőleg 25-szörösére növekedett 9-12 órával az NDV infekció után.
Bár az mRNS növekedés drasztikus, az csak átmeneti, a csúcsot a 9-12. óra között éri el és az indukció után 15 órával kiegyenlítődik. Az mRNS akkumuláció megelőzi az IFN-β mRNS akkumulációt; amint az a 6B ábrából látható, az IRF-1 mRNS indukciót már az DNV fertőzés utáni 3. órában meg lehet figyelni, míg az IFN-β mRNS csak a 6. órában detektálható azonos telephibridizációs körülmények között mindkét RNS esetében.
Az IRF-1 promoter
Amint fent bemutattuk, az IRF-1 gén különböző ágensek, így vírusok és mitogének által, a transzkripciós úton szabályozott.
A kromoszomális DNS „Southern biot” analízise azt bizonyította, hogy az IRF-1 gén egérben összekapcsolódik és nem „multimembered”.
Egy újszülött egér DNS-ét tartalmazó Xfág tárat szűrővizsgálatnak vetettünk alá ugyanazon XL28-8-ból származó, fent alkalmazott cDNS próbaanyagot használva az IRF-1 promoter szekvenciát magában foglaló kiónok kiválasztására. Négy pozitív kiónt azonosítottunk, melyek mindegyike ugyanazt a genomiális DNS-t és a Ági 4-2 egyikét tartalmazta, ezt használtuk a további analízis során. Egy Pstl fragmentumot szubklónoztunk a pUC19 Pstl helyére apl9IRFP szerkesztése céljából.
Ezután ugyanezt a DNS-t az M13mpl 1 Pstl helyére klónoztuk, amelyet a DNS szekvencia analízisére használtunk fel.
A fenti klónokból származó Pstl fragmentum nukleotidszekvencia-analízisét az előbbiekben leírt módon végeztük. A „major” és „minor” CAP helyeket „Sj mapping” analízissel azonosítottuk.
A meghatározott szekvenciát a 7A ábrában mutatjuk be. Amint látható, a DNS „downstream” szekvenciája teljesen megegyezik a pIRF-L-ből származó cDNS-ével.
Az Sl nukleáz analízis bizonyítja az IRF-1 mRNS két CAP helyének a jelenlétét, amelyekben a „major” hely a „minor” helytől „downstream” irányban közelítőleg 20 nukleotid távolságra helyezkedik el. Tipikus TATA box szekvenciák nincsenek a gén „upstream” régióján belül. A CpG szekvencia szokatlan gyakorisága szempontjából ez a régió egy „HTP szakaszt” alkot (Bírd, 1986).
A promoter régió két GC boxot és egy CAAT boxot tartalmaz (lásd 7A ábra), az előbbi boxok Spl-et kötnek (Kadogan és mtsai, 1986) és az utóbbi CP-l-et vagy CP-2-t (Chodosh és mtsai, 1988).
Ezután megvizsgáltuk a promoter szekvenciákat tartalmazó Pstl fragmentum extracelluláris jelekre reagáló képességét, így pl. a vírus általi indukálhatóságot. A vizsgálatot a következő módon végeztük:
Egy kiméra gént szerkesztettünk, amelyben a „reporter” gén, nevezetesen egy bakteriális klóramfenikol-acetiltranszferáz (továbbiakban CAT) gén szomszédos a Pstl szegmentum „downstream” részével. Ezt úgy oldottuk meg, hogy a P19IRFP-ből (lásd fent) egy Pstl fragmentumot kihasítottunk BamHI és HindlII segítségével és a kapott fragmentumot a pA10-cat2 BglII-HindlII váz fragmentumába klónoztuk a pIRFcat szerkesztése céljából (Rosenthal és mtsai, 1983).
Különböző további szerkezeteket állítottunk elő: pIRFAcat-ot állítottunk elő a pl9IRFP-ből származó BamHI-HindlII fragmentum HaelII emésztésével, amelynek az egyetlen felismerési helye a „major” CAP helytől számítva a -30-tól a -35 helyig terjed (5A ábra). A kapott HaelII-HindlII fragmentumot ligáltuk a pA10cat2 GblII-HindlII váz fragmentumával és a következő szintetikus DNS-sel:
5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3'
3'GATCTAAAGAAGCGC 5' így mind a pIRFcat és a pIRFAcat tartalmazza a
-320, illetve a-48 helyig a szekvenciákat.
A p-125cat tartalmazza a humán IFN-β gén promoter szekvenciáját, amint azt Fujita és mtsai (1987) leírták.
ApSV2cat-ot Gorman és mtsai (Science, 221, 551— 553) írták le.
Referencia génként pRSVgpí-t alkalmaztunk (lásd fent Germán és mtsai).
A különböző géneket kalciumfoszfátos módszert alkalmazva (Fujita és mtsai, 1985) egér L929 sejtekbe transzformáltuk. 5xl06 sejtet transzformáltunk 7,5 pg teszt plazmiddal, amely tartalmazza a CAT „reporter” gént és 2,5 pg pRSVgpZ-t. A sejteket NDV-vei indukáltuk vagy ál-indukáltuk és Fujita és mtsai (1985) által leírt módszerrel enzimes vizsgálatnak vetettük alá.
A relatív CAT aktivitás kalkulációjában a pSV2cat-tal transzfektált ál-indukált sejtek CAT aktivitását vettük 100%-nak. Minden CAT aktivitást az illető minta Ecogpí-jével normalizáltunk (Mulligan és Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072-2076). Azokat a mintákat, amelyekben a CAT aktivitás a háttérszínt alatt volt, b.b-vel jelöltük.
Az eredményeket a 7B ábra mutatja be.
Látható, hogy a pIRFcat transzfekciója egér L929 sejtekbe növeli az alacsony szintű CAT aktivitás expresszióját. A CAT expressziós szint abban az esetben növekszik, ha a transzfektált sejteket NDV-vel stimuláljuk. Az IRF-1 gén 300 bp méretű „upstream” szekvenciájának a deléciója gyakorlatilag megszünteti a konstitutív és az indukált CAT gén expressziót. Ez bizonyítja, hogy a promoter szekvencia az „upstream” régió 300 bp-n belüli régiójában van és vírussal indukálható.
Az expressziós plazmidok szerkesztése
1. XL28-8 klón fág DNS-ét EcoRI-el emésztettük és megkaptuk a cDNS inszertumot. A cDNS EcoRI végét T4 polimerázzal tompa végűvé tettük, majd Aruffo és Seed (1987) módszerével a következő szekvenciájú szintetikus adapter DNS-ekkel ligáltuk Aruffo és Seed (1987) módszerével:
pGATCCATTGTGCTGG és pCCAGCACAATG
HU 213 162 Β
A szintetikus DNS-eket 5-20% káliumacetátos gradiens centrifugálással (Aruffoés Seed, 1987) eltávolítottuk, az IRF-1 cDNS-t kapcsoltuk az adapter DNS-ekkel, mindkét végéhez BstXI-et hasított CDM8 vektor DNS-t ligáivá (Seed, B, Natúré, 329, 840-842, 1987). Izoláltuk a pIRF-S és pIRF-A plazmidokat, amelyek a CMV promoterhez viszonyítva „sense” és „antisense” orientációban az IRF-1 cDNS-t tartalmazzák.
Mindegyik DNS plazmidot p-55cat vagy p55CiBvel (Fujita és mtsai, 1987) L929 sejtekbe kontranszfektáltuk és meghatároztuk a CAT expressziós szintet.
Az eredményeket az alábbi 1. táblázat mutatja.
1. táblázat
Transzfektált plazmidok Indukció NDV-vel CAT aktivitás (%-os átszámítás)
1. kísérlet pIRF-S p-55cat - <1%
plRF-S P-55C1B - 50%
pIRF-A p-55cat - <1%
p-IRF-A - <1%
2. kísérlet pIRF-S P-55C1B - 1,7%
p-IRF-S P-55C1B + 3,6%
plRF-A P-55C1B - <0,1%
pIRF-A P-55C1B + <0,1%
A DNS transzfekció hatékonysága a befogadó sejt állapotától függően változik (ebben az esetben egér L929 sejtekétől). A hatékonyság az 1. kísérlettel összehasonlítva a 2. kísérletben sokkal alacsonyabb volt. Ezért a CAT expresszió szintje a 2. kísérletben viszonylag alacsonyabb.
A fenti táblázatból látható, hogy szignifikáns CAT aktivitás csak a p-55CIB és pIRF-S-sel transzfektált sejtekben volt kimutatható. Ez azt mutatja, hogy az IRF-1 a p-55CIB'ben lévő CAT gén „upstream” régiójában lévő ismétlődő (8-szor) AAGTGA szekvenciához kötődik és ezért elősegíti a disztális CAT gén transzkripcióját.
Az eredmények továbbá azt is mutatják, hogy a CAT expresszió szintje megnövekszik (több mint kétszeresére) a transzfektált sejtek NDV-vel való fertőzésének a hatására (1. táblázat), bizonyítva, hogy a gén expresszió kontrollja különböző stimulusokkal, így vírusokkal lehetséges.
2. Egy IRF-1 DNS-t kötő doment és GAL4 élesztő transzkripciós doment tartalmazó expressziós plazmidot a következő módon szerkesztenünk:
pIRF-S plazmidot HindlII-al emésztettünk és izoláltuk a Pstl-et és a cDNS inszertumot. A cDNS-t DralII-al emésztettük és a közelítőleg 550 bp méretű HindlII-DralII fragmentumot kinyertük és azt A fragmentumnak neveztük el.
A CDM8 expressziós vektort HindlII-al és Xbal-el emésztettük, a váz DNS-t izoláltuk és B fragmentumnak neveztük el.
pRB968 plazmidból izoláltuk az élesztő GAL4 transzkripcionális aktivációs domént kódoló DNS-t a következő módon (Ma és Ptashne, 1987):
A pRB968 DNS-t először HindlII-al emésztettük és a végeket T4 polimerázzal tompává tettük. A DNS-hez szintetikus Xbal linker DNS-t adtunk, majd egymást követően a DNS-t PvuII-vel és Xbal-el emésztettük.
A kapott, közelítőleg 600 bp méretű PvuII-Xbal DNS fragmentumot izoláltuk és C fragmentumnak neveztük el.
Ezenkívül az alábbi szekvenciájú szintetikus DNS-t állítottuk elő:
(5')GTGTCGTCCAG(3') (3')GCACACAGCAGGTC(5') amelyet D fragmentumnank neveztünk el.
Egy pIRFGAL4 expressziós vektort szerkesztettünk az A, B, C és D fragmentumok ligálásával. Kontroll plazmidként pIRFAGAL4 plazmidot szerkesztettünk az A, B, C fragmentumok és a következő szekvenciájú DNS ligálásával:
(5')GTGTCTGACAG(3') (3')GCACACAGACTGTC(5Z)
Minthogy a pIRFAGAF4-ben terminátor tripletként az IRF-1 és GAL4 szekvenciák között TGA van, a kifejezett fehérje nem tartalmaz GAL4 aktivációs doment.
A kiméra transzkripciós faktort kódoló plazmid funkcionális tulajdonságainak a vizsgálata céljából pIRFGAL4-et és pIRFAGAF4-et p-55ClB-vel F929 sejtekbe kotranszfektáltunk, és ellenőriztük a CAT expressziót.
Az eredményeket az alábbi 2. táblázat mutatja be:
2. táblázat
Transzfektált plazmid CAT aktivitás (%-os átszámítás)
pIRF-S P-55C1B 2,0%
pIRF-A P-55C1B <0,2%
pIRFGAL4 P-55C1B 1,4%
pIRFÁGAL4 <0,2%
P-55C1B
A gazdasejtek egér L929 sejtek voltak. A sejteket nem indukáltuk NDV-vel.
Az eredmények azt mutatják, hogy a cél-gén expressziója fokozódik IRF-1 hatására. A cél-gének a kö23
HU 213 162 Β vetkezőket kódolhatják: interleukin, interferon (α, β és γ), plazminogén aktivátor, eritropoietin, granulocita stimuláló faktor, inzulin, humán növekedési faktor vagy szuperoxid-diszmutáz (vagy humán gének mutánsai).
A fent említett cél-gének, így az interferon gének, azaz az IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-omega, valamint a plazminogén aktivátorok, így a t-PA, pro-urokináz vagy urokináz stb. expressziója sokkal hatásosabb, ha azok a promotert az IRF-1 felismerő szekvenciáinak, pl. AAGTGA-nak a különböző hosszúságú részeivel összekapcsoltan tartalmazza.
A cél-gént be lehet vinni például különböző gazdasejtekbe az intakt IRF-1 vagy a kiméra IRF-1 génekkel együtt. Az IRF-1 felismerő DNS rész hosszának a növekedésével, azaz növelve az AAGTGA ismétlődő részek számát és a transzkripciós faktor expressziós szintjének a növelésével a cél-génnek egy igen magas expressziós szintje érhető el.
Például az AAGTGA ismétlődő részt hozzá lehet kapcsolni egy megfelelő promoterhez, mint például az IFN-β promoter vagy az SV40 vírus korai promotere. A cél-gént, például a t-PA gént vagy az IFN-β gént egy ilyen promoterhez „downstream” irányban lehet kapcsolni, az így kapott gén a következő szerkezetű: (AAGTGA)X (promoter) (cél-gén t-PA gén)
Egy ilyen gént azután be lehet vinni és amplifikálni lehet CHO sejtekben, pl. CHO DXBII (dhfr-törzs) sejtekben (Urlaub és Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4216-4220, 1980).
A fentiek alapján előnyös a gazdasejtet olyan sejtek közül kiválasztani, amelyeknek nincs, vagy lényegében nincs endogén IRF-1 aktivitásuk. Az IRF-1 gént előnyösen egy erős promoterrel, mint a CMV promoterrel vagy egy indukálható promoterrel, mint a metallotionein gén promoter, szokásos módszerrel különböző gazdasejtekbe lehet bevinni.
Az IRF-1 gént cél-génnel együtt lehet bevinni és amplifikálni. Alternatív módon az IRF-1 gént és a cél-gént külön is be lehet vinni a gazdasejtbe.
Az ilyen transzfektált sejtekben az IRF-1 termelődhet konstitutív módon (pl. a CMV promoter esetében) vagy indukált módon (pl. a metallotionein promoter esetében kétértékű fémmel, pl. cinkkel történik az indukálás). A kifejezett IRF-1 az AAGTGA ismétlődő részhez kötődik és növeli a disztális cél-gént, pl. a t-PA gént vagy az IFN gént.
Egy ilyen expresszió tovább növelhető vírussal, így NDV-vel indukálva, mint az az 1. táblázat 2. kísérletének az eredményéből látható, amelyben az IRF-1 aktivitást növeli egy ilyen indukció.
A III képletnek megfelelő egér IRF-1 cDNS-sel kereszt-hibridizáló egér cDNS szekvenciája
Egy egér cDNS tárat állítottunk elő a fentiekben leírt módon. A cDNS-t standard módszerrel szintetizáltuk, egér L929 sejtekből származó mRNS-sel és a cDNS-t standard eljárással inszertáltuk Xgtll vektorba. A kapott XgtII tárat ezután szűrővizsgálatnak vetettük alá, hogy izoláljuk azokat a cDNS kiónokat, amelyek inszertumai kereszthibridizálnak a fent leírt egér IRF-1 cDNS-sel. A szűrővizsgálatot a következő módon végeztük:
A fág plakk DNS-eket tartalmazó nitrocellulóz szűrőket a következő lépések szerint inkubáltuk:
1. 3xSSC, 65 °C, 30 perc, majd
2. 60 perc inkubálás 3xSSC-ben, amely Denhart-féle oldatot tartalmaz (0,2% marhaszérumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polivinil-pirrolidon 25), majd
3. egy pre-hibridizáló lépés, amelyben 12 órán át inkubáltuk 65 °C-on 1 M NaCl-t, 50 mM Tris-HCl (pH = 8,0) puffért, 10 mM EDTA-t, 0,1% SDS-t (sodium dodecil sulphat, továbbiakban SDS), 50 pg/ml egyszálas vivő DNS-t (pl. lazac sperma DNS-t) és Denhart-féle oldatot tartalmaz és
4. a harmadik lépésként leírt inkubációt megismételtük, de 32P-vel jelzett egér ERF-1 cDNS, mint próbaanyag jelenlétében. Ezt a cDNS próbát XL28-8ból származó inszertum EcoRI hasításával állítottuk elő és Multiprime jelző rendszerrel (lásd fent) transzlatáltuk. Az inkubációt 12 órán át 65 °C-on végeztük.
Ezután a szűrőket mostuk, 2xSSC oldatba merítettük, majd 0,1% SDS-t tartalmazó 3xSSC oldatban mostuk 30 percen át 65 °C-on. Ezt a műveletet kétszer megismételtük.
A pozitív klónok egyikét kiválasztottuk, pHH-45nek jelöltük és megállapítottuk róla, hogy egy IRF-et kódoló szekvencia egy részének megfelelő cDNS-t tartalmaz.
A ρΗΗ-45-ben lévő cDNS inszertumot izoláltuk és felhasználtuk olyan szűrővizsgálatok elvégzésére, amelyekben a fent leírt nagyobb inszertumokat tartalmazó kiónokat kerestünk a pIRF-L előállítása céljából, amelyet az „egér IRF-1-et kódoló cDNS szerkezete” című fejezetben írtunk le.
A pozitív kiónok közül egyet, a pIRF2-5-nek jelöltet azonosítottuk, kiválasztottuk és a fent, az egér IRF-1-nél már leírt módon jellemeztük. A teljes hibridizáló cDNS szekvencia a IVa képletben, a megfelelő IRF fehéije aminosav szekvenciája a VHI. képletben látható.
A pIRF2-5 plazmidot MC1061/p3 E. coliba infektáltuk és az E. colit az FRI-nél 1988. november 22-én FERM BP-2157 szám alatt a budapesti egyezmény szerint letétbe helyeztük.
Humán IRF-1 cDNS szekvenciával hibridizáló élesztőgenomból származó cDNS
Standard eljárással élesztő DNS-t készítettünk és
EcoRI-el emésztettük. Az emésztett DNS 5 pg-ját 0,8% agaróz gélre vittük és elektroforetizáltuk, majd standard módon a DNS-t telephibridizációnak vetettük alá.
A telephibridizációs szűrőt pontosan úgy kezeltük, mint ahogy azt az előző példában az egér IRF-1-gyei hibridizáló egér DNS izolálásánál leírtuk, kivéve a következőket:
A 3. lépésben az inkubációs hőmérséklet 55 °C és a 4. lépésben az inkubációt szintén 55 °C-on végeztük és a radioaktív minta pHIRF31 -bői a plazmid Xhol-es emésztésével izolált humán IRF-1 cDNS volt, ezt a próbát az egér IRF-1 példájában az előbbiekben leírt módon jelez24
HU 213 162 Β tűk. A szűrőt 55 °C-on 2xSSC-vel mostuk. A pozitív kiónokat autoradiográfiával azonosítottuk (lásd 9. ábra).
Az 5. ábrán megtartott aminosavakat csillaggal jelöltük. A szekvenciákat az aminosav kód egy betűjelével adjuk meg a következők szerint: A, alanin; C, cisztein; D, aszparaginsav; E, glutaminsav; F, fenilalanin; G, glicin; H, hisztidin; I, izoleucin; K, lizin; L, leucih; M, metionin; N, aszparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, szerin; T, treanin; V, valin; W, triptofán és Y, tirozin.
ÍROD ALOM JÉG YZÉK
1. Abreu S. L., Bancroft F. C. és Stewart II E. W. (1979). Interferon priming. J. Bioi. Chem., 254, 414418.
2. Aruffo A. és Seed B. (1987). Molecular cloning of a cDNA by a high-efficiency COS cell expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577.
3. Bírd A. P. (1986). CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Natúré, 321, 209-213.
4. Caput D., Beutler B., Hartog K., Thayer R., Brown-Schimer S. és Cerami A. (1986). Identification of a common nucleotide sequence in the 3' untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1670-1674.
5. Cavalieri R. L., Havell E. Z., Vilcek J. és Pestka
S. (1977). Induction and decay of humán fibroblast interferon mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4415-4419.
6. Chodosh L. A., Baldwin A. S., Carthew R. W. és Sharp P. A. (1988). Humán CCAAT-binding proteins have heterologous subunits. Cell., 53, 11-24.
7. Dinter H., Hauser H., Mayr U., Lammers R., Bruns W„ Gross G. és Collins J. (1983). Humán interferon-beta and co-induced genes: molecular studies. In the biology of the Interferon System 1983, E. De Maeyer és H. Schellekens, eds. (Amsterdam: Elsevier Science Publishers), 33-34.
8. Dinter H. és Hauser H. (1987). Cooperative interaction of multiple DNA elements in the humán interferon-β promoter. Eur. J. Biochem., 766, 103— 109.
9. Evans R. M. és Hollenberg S. M. (1988). Zinc Fingers: Gilt by association. Cell., 52, 1-3.
10. Fujita T„ Saito S. és Kohno S. (1979). Priming increases the amount of interferon mRNA in poly(rl): poly(rC)-treated L cells. J. Gén. Viol., 45, 301-308.
11. Fujita T., Ohno S., Yasumitsu H. és Taniguchi T. (1985). Delimination and properties of DNA sequences required fór the regulated expression of humán interferon-β gene. Cell., 41, 489-496.
12. Fujita T„ Shibuya H„ Hotta H., Yamanishi K. és Taniguchi T. (1987). Interferon-β gene reguládon: Tandemly repeated sequences of a synthetic 6 bp oligomer function as a virus-inducible enhancer. Cell., 49, 357-367.
13. Galabru J. és Hovanessian A. G. (1985). Two interferon-β indeced proteins are involved in the protein kinese complex dependent on double-stranded RNA. Cell., 43, 685-694.
14. Goodbourn S., Zinn K. és Maniatis T. (1985).
Humán β-interferon gene expression is regulated by an inducible enhancer element. Cell., 41, 509-520.
15. Huynh T. V., Young R. A. és Davis R. W. (1985). Constructing and screening cDNA libraries in gtlO and 11. In DNA cloning-A Practical Approach, Volume 1, D. M. Glover, ed. (Oxford: IRL Press), pp. 49-78.
16. Israel A., Kimura A., Fournier A., Fellous M. és Kourilsky P. (1986). Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Natúré, 322, 743-746.
17. Kadonaga J. T., Jones K. A. és Tjian R. (1986). Promoter-specific activation of RNA polymerase II transcription by Sp 1. Trends Biochem. Sci., 77, 20-23.
18. Kakidani K. és Ptashne M. (1986). GAL4 activates gene expression in mammalian cells. Cell., 52, 161-167.
19. Keller A. D. és Maniatis T. (1988). Identification of an inducible factor that binds to a positive regulatory element of the humán β-interferon gene. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 3309-3313.
20. Kohase M., May L. T„ Tamm I., Vilcek J. és Sehgal P. B. (1987). A cytokine network in humán diploid fibroblasts: interactions of béta interferons, tumor necrosis factor, platelet-derived growth factor and interleukin-1. Mól. Cell. Bioi., 7, 272-280.
21. Korber B., Mermod N., Hood L. és Stroynowski I. (1988). Reguládon of gene expression by interferons: Control of H-2 Promoter responses. Science, 239, 1302-1306.
22. Kozák M. (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucl. Acids. Rés., 75, 8125-8143.
23. Krebs E., Eisenman R., Kuenzel E., Litchfield D„ Lozeman E, Liischer B. és Sommercorn J. (1988). Casein Kinase II as a potentially important enzyme concerned with signal transduction. In the Molecular Biology of Signal Transduction (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) Abstract p. 35.
24. Kuhl D„ de la Fuente J., Chaturvedi M., Parimoo S., Ryals J., Mayer F. és Weissmann C. (1987). Reversible silencing of enhancers by sequences derived írom the humán IFN-α promoter. Cell., 50, 10571069.
25. Kyte J. és Doolittle R. F. (1982). A simple method fór displaying the hydropathic character of a protein. J. Mól. Bioi., 157, 105-132.
26. Levy D. E., Kessler D. S., Pine R., Reich N. és Damell J. E. (1988). Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive, and negative transcriptional control. Genes and Development, 2, 383-393.
27. Ma J. és Ptashne M. (1987). The carbory-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognised by GAL80. Cell., 50, 137-142.
28. Maxam A. és Gilbert W. (1980). Sequencing end-labeled DNA with base specific Chemical cleavages. Meth. Enzym. 65, 499-560.
29. Moore R. N., Larsen H. S., Horohov D. W. és
HU 213 162 Β
Rouse Β. T. (1984). Endogenous reguládon of macrophase proliferative expansion by colony-stimulationfactor-induced interferon. Science, 223, 178-180.
30. Nedwin G., Naylor S., Sakaguchi A., Smith D., Jarrett-Nedsin J., Pennica D., Goeddel D. és Gray P. (1985). Humán lymphotoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homology and chromosomal localisation. Nucl. Acids. Rés., 13, 6361-6373.
31. Nir U„ Cohen B„ Chen L. és Revei M. (1984). A humán IFN-βΙ gene deleted of promoter sequences upstream front the TATA box is controlled post-transcriptionally by dsRNA. Nucl. Acids. Rés., 12, 69796993.
32. Ohno S. és Taniguchi T. (1983). The 5'-flanking sequence of humán interferon-β gene is responsile fór viral induction of transcription. Nucl. Acids. Rés., 11, 5403-5412.
33. Onozaki K., Urawa H., Tamatani T, Iwamura Y, Hashimoto T, Baba T, Suzuki H., Yamada M., Yamamoto S., Oppenheim J. J. és Matsushima K. (1988). Synergistic interactions of interleukin 1, interferon-β and tumor necrosis factor in terminally differentiating a mouse myeloid leukemic cell line (Ml). J. Immunoi., 140, 112-119.
34. Pabo C. O. és Sauer R. T. (1984). Protein-DNA recognition. Ann. Rév. Biochem., 53, 293-321.
35. Raji N. Β. K. és Pitha P. M. (1981). An analysis of interferon mRNA in humán fibroblast cells induced to produce interferon. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 7426-7430.
36. Raji N. Β. K. és Pitha P. M. (1983). Two levels of regulation of β-interferon gene expression in humán cells. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 3923-3927.
37. Resnitzky D., Yardén A., Zipori D. és Kimchi A. (1986). Autocrine β-related interferon Controls cmyc suppression and growth árrést during hematopoietic cell differentiation. Cell., 46, 31—40.
38. Rosenthal N., Kress M., Gruss P. és Khoury G. (1983). BK viral enhancer element and a humán cellular homolog. Science, 222, 749-755.
39. Ryals J., Dieks P, Ragg H. és Weissmann C. (1985). A 46-nucleotide promoter segment from an INF-α gene renders an unrelated promoter inducible by vírus. Cell., 41, 497-507.
40. Shaw G. és Kamen R. (1986). A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Cell., 46, 659-667.
41. Singh H., LeBowitz J. H., Baldwin Jr. A. S. és Sharp P. A. (1988). Molecular cloning of an enhancer binding protein: Isolation by screening, of an expression library with a recognition site DNA. Cell., 52, 415^423.
42. Sugita K., Miyazaki J. I., Appella E. és Ozato K. (1987). Interferons increase transcription of a major histocompatibility class I gene via a 5' interferon consensus sequence. Mól. Cell. Bioi., 7, 2625-2630.
43. Taniguchi T, Matsui H., Fujita T, Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R. és Hamuro J. (1983). Structure and expression of a cloned cDNA fór humán interleukin-2. Natúré, 302, 305-310.
44. Taniguchi T. (1988) regulation of cytokine gene expression. Ann. Rév. Immunoi. 6, 439^164.
45. Thomas P. S. (1980) Hybridisation of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205.
46. Tiwari R. J„ Kusari J. és Sen G. C. (1987). Functional equivalents of interferon-mediated signals needed fór induction of a mRNA can be, generated by double-stranded RNA and growth factors. EMBO J., 6, 3373-3378.
47. Warren Μ. K. és Ralf P. (1986). Macrophage growth factor CSF-1 stimulates humán monocyte production of interferon, tumor necrosis factor and colony stimulating activity. J. Immunoi. 137, 2281-2285.
48. Webster N., Jin J. R., Green S., Hollis M. és Chambon P. (1988). The yeast UAGs is a transcriptional enhancer in humán HeLa cells in the presence of the GAL4 tram-activator. Cell., 52, 169-178.
49. Weissmann C. és Weber H. (1986). The interferon genes. Proc. Natl. Acid. Rés. Mól. Bioi., 33, 251— 300.
50. Young R. A. és Davis R. W. (1983). Yeast RNA polymerase II genes: Isolation with antibody probes. Science, 222, 778-782.
51. Zinn K., Dimaio D. és Maniatis T. (1983). Identification of two distinct regulatory regions adjacent to, the humán β-interferon gene. Cell., 34, 865879.
52. Zullo J. N., Cochan Β. H., Huang A. S. és Stiles C. D. (1985). Platelet-derived growth factor and double-stranded ribonucleic acids and stimulate expression of the same genes in 3T3 cells. Cell., 43, 793-800.

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1 GGACGTGCTTTCACÁGTCTÁAGCCGAACCGÁACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC 60 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG 119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCC-CTCTCCGGCACCCTC
178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AC-CCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG 227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA 272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA 317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC 362 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT 452 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG 497 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC 587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT 632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA
HU 213 162 Β
677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG 722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT 767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT 812 ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC 857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC .GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG 902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG 947 CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA 992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG 1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA 1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG 1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT 1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG . TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC
1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC 12 81 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC 1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA 1399 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATC-GATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT 1458 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAG AGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGC ACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 1635 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTG AAATGTG AAGGG AAAA.AA 169 4 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGGATTTATTTÁTA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAC-TCCTCAGCAGGCCCAG
193 0 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC
1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT
204 8 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082 , képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS mole- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez kulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (El- ve, hogy a sőbbsége: 1988.08 24.)
10 -20 30 40ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCG~£?7~GGAGGAGCAG
50 60 '70 :j ' 90 ataaattccaatacga_taccagggctaaag~gg:tg.-.acaaggag
HU 213 162 Β
140 150 ISO ' 170 ISO
7GGGACG7GGAAAAGGA7GC7CCGCTC77CAGAAAC7GGGCGA7C
190 200 210 220
CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAA7A.GA7AAACCAGA.TCCAAAA
230 240 ' 250 250 270
ACA7GGAAAGCAAA7777CGA7G7GCCA7GAA77CCC7GCCCGAC
280 290 . 300 310
A77GAGGAAG7GAAGGACAGAAGCA7AAA.GA.AAGGAAACAACGCC
320 330 340
77CAGAG7C7ACCGGA7GC7GCCC77A7CC(
350 350
ACGACC77CCAAG
370 380 220
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGA
400
77AAGCAC,
410 420 _ 430 440 459
A7CAAGCAAGAACCAG77GAG7CA7C777GGGGC77AG7AA7GGA
460 470 ' 480 · 490
G7AAG7GGC7777C7CC7GAG7A7GCGG7CC7GAC77CAGC7A7A
500 510 520 530 ‘540
AAAAA7GAAG7GGATAGTACGG7GAACATCATAGTTGTAGGACAG 550 560 570 * 580
7CCCA7C7GGACAGCAACA77GAAGA7CAAGAGATCG7CAC7AAC
590 600 610 620 630
CCGCCAGACA7C7GCCAGG77G7AGAAG7GACCAC7GAGAG7GA7
640 650 660 670
GACCAGCCAG7CAGCA7GAG7GAGC7C7ACCCTCTACAGATT7CT
680 690 700 ’ 710 720
CC7G7G7C77CC7ACGCAGAAAGCGAAAC7ACCGACAG7GTGGCC
730 ' 740 · 750 ' 760
AG7GA7GAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACAC7GGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810
AGCATCGAAGGCAAGCAG7ACC7CAGCAACA7GGGGACACGGAAC qoq * 830 8-0 830
ACCTATC7GC7GCCCAGCA7GGCGACC7T7G7CACC7CCAACAAG
860 870 880 ' 890 900
CCAGA7C7GCAGG7CACCA7CAAAGAGGA7AGC7GTCCGA7GCCT
S10 920 930 940
7ACAACAGC7CC7GGCCCCCA777ACA.GACC77CCCC77CC7GCC
950 960 970 980 990
CCAG7GACCCCCACGCCCAGCAGCAG7CGGCCAGACCGGGAGACC
1000 1010 1020 1030
CGGGCCAG7G7CA7CAAGAAGACA7C7GATA7CACCCAGGCCCGT
HU 213 162 Β képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS molekulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy a
7C7CAGGCAAGCCGGGGA CTAAC77T7AGT777GC7CC7GCGA77A77CAAC7GACGGGC77T • f *
CATTTCCATTTTACACACCC7AACAACACTCACACCTTGCGGGAT
7GTAT7GG7AGCG7GGAAAAAAAAAAAGCACA77GAGAGGG7ACC .
10 -20 30 40.
Á7GCCGG7GGAACGGA7GCGAA7GCGCCCG7GGC7GGAGGAGCAG /
50 60 ‘ 70 80 90
A7AAA77CCAA7ACGA7ACCAGGGC7AAAG7GGC7GAACAAGGAG
100 110 120 130
AAGAAGA7777CCAGA7CCCC7GGA7GCA7GCGGC7CGGCACGGA
140 150 ISO ' ’ 170 180
7GGGACG7GGAAAAGGA7GC7CCGC7C77CAGAAAC7GGGCGA7C .
190 200 210 220
CA7.4CAGGAAAGCA7CAACCAGGAA7AGA7AAACCAGA7CCAAAA
230 240 250 260 270
ACA7GGAAAGCAAA7777CGA7G7GCCA7GAA77CCC7GCCCGAC
280 290 300 310
A77GAGGAAG7GAAGGACAGAAGCA7AAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360
77CAGAG7C7ACCGGA7GC7C-CCC77A7CCGAACGACC77CCAAG
370 3S0 390 4C0
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGÁAGAGAGAG77AAGCAC.
410 420 _ 430 440 450
A7CAAGCAAGAACCAG77GAG7CA7C777GGGGC77AG7AA7GGA
460 470 480 490
GTAAGTGGCTTT FCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA
HU 213 162 Β
500 510 520 530 540
AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGT7GTAGGACAG 550 560 570 580
TCCCA7CTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGA7CG7CACTAAC
590 δ00 610 620 630
CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT
640 650 660 670
GACCAGCCAGTCAGCA7GAG7GÁGCTC7ACCC7C7ACAGATT7CT
6S0 690 -700 710 720
CCTGTGTCTTCC7ACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC
730 740 750 760
AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACAC7GGAGGAAGAGG
770 730 7S0 300 810
AGCA7CGAAGGCAAGCAG7ACC7CAGCAACA7GGGGACACGGAAC
820 830 840 S50
ACCTA7CTGC7GCCCAGCA7GGCGACCTT7G7CACC7CCAACAAG
860 870 830 ' 890 900
CCAGA7CTGCAGGTCACCA7CAAAGAGGATAGCTG7CCGA7GCC7
Slü 920 930 940
TACAACAGCTCC7GGCCCCCA77TACAGACC77CCCCT7CC7GCC
950 960 '970 930 990
CCA G 7GA CCCCCACGCCCAGCA GCA G7CGGCCA G A CCGGG.A G A CC
1000 1010 1020 10.30
CGGGCCAGTGTCA7CAAGAAGACA7CTGATATCACCCAGGCCCG7
GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTC7CCCTGG7GGTT.G7 i GGGA
TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGTATTATATTATTTTTT
HU 213 162 Β
777C77AGCTTTG7G77G77C7T7G7T7G7A77A7A77A777777 '
7TCTC7A7GA7ACCTATC7TAGACACA7C7AAGGGAGAAAGCC7T ..
GACGA7AGA77A77GA77GC7G7G7CCAAC7CCAGAGC7GGAGC7
7C77C77AAC7CAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCC7CGG7AGA7G '
CG7A7CTC7AGAACC7GC7GGA7C7GCCAGGGC7AC7CCC7CAAG
77CAAGGACCAACAGCCACACGGGCAG7GGAGG7GC7GCG77GCC
7ACGG7CAAGGCCAGCA7GG7GGAG7GGA7GCC7CÁGAACGGAGG
AGAAAA7G7GAAC7AGC7GGAA77777T7A77C77G7GAA7A7G7
ACA7AGGGCAG7ACGAGCAA7G7CGCGGGC7GC77C7GCACC77A
7C77GAAGCACT7ACAA7AGGCCT7CT7G7AA7C77GC7C7CC77
CACAGCACAC7CGGCGACCCC77C7G7G7CCAC7ACCCCAC7ACC .
CACCCC7CCC7CC7CAACCCC7CCA7CCCGG7CC7C7A7GCGCCC .
C77CCCCCCAACCAA7CCCA7CACAACC7C77ACC7A7CC777CC
C7CCCAACCCC77C7A7CCCAGCCCACCACC7ACCCCAC7CC7CC
CCAAC7CC7CCA77C7AGCCCA77ACCCACGCC7C7C7CC7CAGC ·
HU 213 162 Β
AAATAAAATATAATTG7TTTTTATCTTTTCTACAGCAAATTTATA
ATTTTAAGATTCCTTTTCCTGTTCATCAGCAGTTGTTATTACATC
CCTTGTGGCACATTTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGAAAAAAAA
ACTTTTATGAGCTCATGTAGC.AATCAAATTATCCTGTGGATTGAT
AATAAATGAATATGGTATATAGTTAAAGATTTTAAAAAAAAAAAA képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS molekulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11.24.)
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6-9. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS molekulával hibridizáló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10-11. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS molekulával hibridizáló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
14. Az 1-9. vagy 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a
PstI
CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG
-299
GC Box 1 GC Box 2
CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCCGGGGCGGTGGCGCGG
-251
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC
-193
CAAT Box
AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGjgSCüSffSGGGCGCGCAGGAGCG
-135
Minor cap“ hely ’ ' ’
GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21 '-Major csp Κθ1Υ _plRP-L
Hf j
TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1
TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG + 39
HU 213 162 Β
CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97
CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGC-CACCCTCTGCGAA +155
Pstl
TCGCTCCTGCAG +213 +225 képletben megadott promoter és regulátor szekvenciá-
15. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal kát is magába foglaló rekombináns DNS molekulát jellemezve, hogy a állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
Pstl
CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -2 99
GC Box 1
GC Box 2
CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCCGGGGCGG.TGGCGCGG
251
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC
-193
CAAT Box aacagcctgatttccccgaaatgatgaggccgagtgggCcaáTgggcgcgcaggagcg
-135
Minor cap hely gcgcggcgggggcgtggccgagtccgggccggggaatcccgctaagtgtttagatttc
-77 -21 'Major csp hely
Hr | ttcgcggcgccgcggactcgccagtgcgcaccactccttcgtcgaggtaggacgtgct
-19 +1 ttcacagtctaagccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgggccgagttgcg +39 ccgaggtcagccgaggtggccagaggaccccagcatctcgggcatctttcgcttcgtg + 97 cgcgcatcgcgtacctacaccgcaactccgtgcctcgctctccggcaccctctgcgaa +155
Pstl
TCGCTCCTGCAG +213 +225 képletben megadott promoter és regulátor szekvenciákat is magába foglaló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
HU 213 162 Β
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-9., 12. vagy 14. igénypontok szerint előállított DNS szekvenciák bármelyikét és egy gyógyászatilag aktív fehérjét a kódolt IRF-1 fehéije kontrollja alatt működőén kódoló szerkezeti gént tartalmazó rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988.08. 24.)
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10-11., 13. vagy 15. igénypontok szerint előállított DNS szekvenciák bármelyikét és egy gyógyászatilag aktív fehéijét a kódolt IRF-1 fehéije kontrollja alatt működőén kódoló szerkezeti gént tartalmazó rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy konstitutív promoter vagy egy indukálható promoter kontrollja alatt álló IRF-1 aktivitású molekulát kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988.08. 24.)
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy konstitutív promoter vagy egy indukálható promoter kontrollja alatt álló IRF-1 aktivitású molekulát kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
20. A 16. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több AAGTGA ismétlődő szekvenciából álló IRF-1-et kötő helyet tartalmazó gyógyászatilag aktív fehérjét kódoló gént magába foglaló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988.08.24.)
21. A 17. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több AAGTGA ismétlődő szekvenciából álló IRF-1-et kötő helyet tartalmazó gyógyászatilag aktív fehérjét kódoló gént magába foglaló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
22. A 16., 18. vagy 20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag aktív fehérjeként citokint vagy plazminogén aktivátort kódoló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
23. A 17., 19. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag aktív fehérjeként citokint vagy plazminogén aktivátort kódoló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11.24.)
24. Eljárás IRF-1 aktivitású fehérjét termelő transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdasejtet az 1-9., 12., 14., 16., 18., 20. vagy 22. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNS kifejezésére alkalmas vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
25. Eljárás IRF-1 aktivitású fehéijét termelő transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdasejtet a 10., 11., 13., 15., 17., 19., 21. vagy 23. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNS kifejezésére alkalmas vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy IRF-1 aktivitású fehérjét kódoló szekvenciát és az ezen szekvencia által kifejezett IRF-1 hatású fehéije kontrollja alatt álló, a kívánt gyógyászatilag hatásos fehéijét kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
27. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy IRF-1 aktivitású fehérjét kódoló szekvenciát és az ezen szekvencia által kifejezett IRF-1 hatású fehérje kontrollja alatt álló, a kívánt gyógyászatilag hatásos fehéijét kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy, az IRF-1 aktivitású fehéijét egy konstitutív vagy egy indukálható promoter kontrollja alatt kódoló gént tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy, az IRF-1 aktivitású fehérjét egy konstitutív vagy egy indukálható promoter kontrollja alatt kódoló gént tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
30. A 26. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet több AAGTGA ismétlődő szekvenciából álló, az IRF-1 aktivitású fehérjét kötő helyet magába foglaló gyógyászatilag aktív fehéijét kódoló gént tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
31. A 27. vagy 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet több AAGTGA ismétlődő szekvenciából álló, az IRF-1 aktivitású fehérjét kötő helyet magába foglaló gyógyászatilag aktív fehéijét kódoló gént tartalmazó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
32. A 24., 26. vagy 28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként bakteriális, élesztő vagy emlős sejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
33. A 25., 27. vagy 29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként bakteriális, élesztő vagy emlős sejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
34. Eljárás gyógyászatilag hatásos fehéije termelésére, azzal jellemezve, hogy egy, a 24., 26. vagy 28. igénypontok bármelyike szerint előállított gazdasejtet tenyésztünk, és a tenyészetből a fehérjét izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
35. Eljárás gyógyászatilag hatásos fehérje termelésére, azzal jellemezve, hogy egy, a 25., 27. vagy 29. igénypontok bármelyike szerint előállított gazdasejtet tenyésztünk, és a tenyészetből a fehéijét izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 11.24.)
36. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vírussal fertőzött gazdasejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
37. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vírussal fertőzött gazdasejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1988. 11.24.)
38. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. vagy 8. igénypont szerint előállított DNS-t tartalmazó transzformlt gazdasejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
HU 213 162 Β
39. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerint előállított DNS-t tartalmazó transzformált gazdasejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
40. Eljárás a pHIRF31 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-t kg ti 1 vektorba inszertálunk. (Elsőbbsége: 1988.08.24.)
41. Eljárás a pIRF-L plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-t CDM8 vektorba inszertálunk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
1. Eljárás interferon-szabályzó faktor-1 (IRF-1) aktivitású fehéijét és adott esetben egy gyógyászatilag aktív fehérjét is kódoló rekombináns DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy IRF-1 aktivitású fehérjét termelő sejtből poli(A)+ RNS-t izolálunk, erről cDNS-t szintetizálunk, a cDNS-t egy alkalmas vektorba betoldva megfelelő gazdasejtben klónozzuk, és a cDNS-tárat alkalmas próbaanyaggal szűrjük. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poli(A)+ RNS-t humán vagy egér sejtből izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poli(A)+ RNS-t AAGTGA (Cl szekvencia) ismétlődő oligomer szekvenciához és a humán IFN-β gén szabályzó „upstream” elemeihez kötődő fehérjét termelő sejtből izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IRF-1 aktivitású fehérjét kódoló DNS szekvenciához működőképesen kapcsolódó promoter régiót tartalmazó DNS-t állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
HU 213 162 Β
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként egy konstitutív promotert vagy egy indukálható promotert tartalmazó DNS-t állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08. 24.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy a
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAC-ACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 120 130 140 150
TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGC-ACATCAACAAG
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 2S0 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340' 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATC-CTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTC-ATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 . 630 640 650
GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTC-ACAC-CCCAG
860 870 880 890 900
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
HU 213 162 Β
910 920 930- 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS molekulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08 24.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy a
CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC CGGCCGTGCCCC-GCGGCCTTAAGAACCAGGCAACCACTGCCTTCTTCCCT · CTTCCACTCGGAGTCGCGCTTCGCGCGCCCTCACTGCAGCCCCTGCGTCG ' CCGGGACCCTCGCGCGCGACCAGCCGAATCGCTCCTGCAGCAGAGCCAAC
10 20 30 40 50
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150
TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAC-CA
410 420 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650 gttgtgccggacagcaccagtgatctgtacaacttccaggtgtcacccat
660 670 680 690 700 gccctccatctctgaagctacaacagatgaggatgaggaagggaaattac
HU 213 162 Β
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 7Ö0 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 ' 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 9C0
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCGTAGCAGGGCCCCTGGGCCCCTCTTA
TTCCTCTAGGCAAGCAGGACCTGGCATCATGGTGGATATGGTGCAGAGAA
GCTGGACTTCTGTGGGCCCCTCAACAGCCAAGTGTGACCCCACTGCCAAG
TGGGGATGGGCCTCCCTCCTTGGGTCATTGACCTCTCAGGGCCTGGCAGG
CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCTGGGA_
AGATGAGGTTCTGAGACCAGTGTATCAGGTCAGGGACTTGGACAGGAGTC ·
AGTGTCTGGCTTTTTCCTCTGAGCCCAGCTGCCTGGAGAGGGTCTCGCTG
TCACTC-GCTGGCTCCTAGGGGAACAGACCAGTGACCCCAGAAAAGCATAA CACCA.ATCCCAGGGCTGGCTCTGCACTAAGAGAAAATTGCACTAAATGAA
TCTCGTTCCAAAGAACTACCCCTTTTCAGCTGAGCCCTGGGGACTGTTCC ·
AAAGCCAGTGAATGTGAAGGAAAGTGGGGTCCTTCGGGGCAATGCTCCCT CAGCCTCAGAGGAGCTCTACCCTGCTCCCTGCTTTGGCTGAGGGGCTTGG
GAAAAAAACTTGGCACTTTTTCGTGTGGATCTTGCCACATTTCTGATCAG
AGGTGTACACTAACATTTCCCCCGAGCTCTTGGCCTTTGCATTTATTTAT ' acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca ACAGGCCCAGGGAGGGAAGTGTGAGCGCCTTGGTATGACTTAAAATTGGA
AATGTCATCTAACCATTAAGTCATGTGTGAACACATAAGGACGTGTGTA.A
ATATGTACATTTGTCTTTTTATAAAAAGTAAAATTGTT képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS molekulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1988. 08 24.)
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy a
HU 213 162 Β
AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA· TAC AAA GCA GGA GAÁ AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC. TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC ’CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA· ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG C-GT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG
képlettel ábrázolt szerkezetű rekombináns DNS mole-
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve kulát vagy egy degenerált változatát állítjuk elő. (El- hogy a sőbbsége: 1988. 08 24.)
5 42. Eljárás a pIRF2-5 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-t kgtll vektorba inszertálunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 24.)
HU894329A 1988-08-24 1989-08-23 Process for producing factor controlling gene expression HU213162B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88113793A EP0355190A1 (en) 1988-08-24 1988-08-24 Factor regulating gene expression
EP88119602A EP0355202A1 (en) 1988-08-24 1988-11-24 Factor regulating gene expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52152A HUT52152A (en) 1990-06-28
HU213162B true HU213162B (en) 1997-02-28

Family

ID=26114389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU894329A HU213162B (en) 1988-08-24 1989-08-23 Process for producing factor controlling gene expression

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0359998B1 (hu)
JP (2) JP2905506B2 (hu)
AT (2) ATE208817T1 (hu)
AU (1) AU618394B2 (hu)
DE (2) DE68929344T2 (hu)
DK (1) DK415589A (hu)
ES (2) ES2162801T3 (hu)
FI (1) FI893942A (hu)
HU (1) HU213162B (hu)
IE (2) IE64790B1 (hu)
IL (1) IL91390A (hu)
NO (1) NO178704C (hu)
NZ (1) NZ230399A (hu)
PH (1) PH31199A (hu)
PT (2) PT91521B (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9305855A (es) * 1992-09-24 1995-01-31 Tadatsugu Taniguchi Factores 1 y 2 reguladores del interferon en el diagnostico de latumorigenicidad.
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1

Also Published As

Publication number Publication date
EP0359998A2 (en) 1990-03-28
PT91521A (pt) 1990-03-08
FI893942A0 (fi) 1989-08-23
HUT52152A (en) 1990-06-28
NO893386L (no) 1990-02-26
NO893386D0 (no) 1989-08-23
DE68915375D1 (de) 1994-06-23
FI893942A (fi) 1990-02-25
PT101697B (pt) 1999-07-30
IE64790B1 (en) 1995-09-06
ES2052846T3 (es) 1994-07-16
IE940353L (en) 1990-02-24
IE892705L (en) 1990-02-24
JPH11266886A (ja) 1999-10-05
EP0359998A3 (en) 1990-07-04
NZ230399A (en) 1992-04-28
ES2162801T3 (es) 2002-01-16
ATE208817T1 (de) 2001-11-15
AU618394B2 (en) 1991-12-19
EP0359998B1 (en) 1994-05-18
PH31199A (en) 1998-05-05
DK415589D0 (da) 1989-08-23
AU4016989A (en) 1990-03-01
PT91521B (pt) 1996-01-31
DE68929344T2 (de) 2002-07-11
JPH02174682A (ja) 1990-07-06
JP2905506B2 (ja) 1999-06-14
DE68929344D1 (de) 2001-12-20
PT101697A (pt) 1995-12-29
DK415589A (da) 1990-02-25
NO178704B (no) 1996-02-05
DE68915375T2 (de) 1994-09-29
ATE105861T1 (de) 1994-06-15
IL91390A (en) 1995-08-31
IL91390A0 (en) 1990-04-29
NO178704C (no) 1996-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miyamoto et al. Regulated expression of a gene encoding a nuclear factor, IRF-1, that specifically binds to IFN-β gene regulatory elements
Yelverton et al. Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon
JP3769189B2 (ja) Ｔ細胞誘導性因子（ｔｉｆ）をコードする単離された核酸分子、コードされたタンパク質およびその使用
US7972833B2 (en) Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFs), the proteins encoded, and uses thereof
Reeves et al. Molecular cloning of a functional bovine interleukin 2 cDNA.
JP2561255B2 (ja) 組換コロニ−刺激因子▲下−▼１
EP0256843A1 (en) Expression of g-csf and muteins thereof and their use
HU215241B (hu) Eljárás telepstimuláló faktor-1 új formáinak előállítására, valamint az eljárásban alkalmazható expressziós kazetta, vektor és rekombináns gazdasejtek előállítására
US5759853A (en) Coding, promoter and regulator sequences of IRF-1
KR100270348B1 (ko) 전사인자 에이피알에프
HUT62328A (en) Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants
Agarwal et al. Comparison of Gene Expression in Normal and Growth Hormone Receptor-Deficient Dwarf Chickens Reveals a Novel Growth Hormone-Regulated Gene
Yasuhisa et al. Isolation of the cDNA clone for mouse glycophorin, erythroid-specific membrane protein
US20010024652A1 (en) Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFs), the proteins encoded, and used thereof
HU213162B (en) Process for producing factor controlling gene expression
KR970009158B1 (ko) 돼지 성장호르몬 동족체
Lattion et al. Characterization of a new tissue-specific transcription factor binding to the simian virus 40 enhancer TC-II (NF-κB) element
DD299660A5 (de) Faktorregulierte genexpression
DD299659A5 (de) Faktorregulierte genexpression
JPH10295382A (ja) インターフェロンτ改変体
JPH10113191A (ja) ヒトインターフェロンτ変異体
JPH1142089A (ja) インターフェロンτ３改変体

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee