JPH1142089A - インターフェロンτ３改変体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ウイルス剤、抗腫瘍剤および自己免疫疾患
治療剤として有用な、活性の高いインターフェロンτ改
変体およびその製造方法を提供する。 【解決手段】 遺伝子操作によって得られ、配列表の配
列番号２のアミノ酸番号１〜１７２で示されるアミノ酸
配列を含むことからなるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、ウイルス感染、
腫瘍および自己免疫疾患の治療に有効な、細胞毒性の少
ないインターフェロン改変体、およびその遺伝子操作に
よる製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】 インターフェロンは、生体内でリンパ
球や線維芽細胞などさまざまな細胞が産生する生理活性
蛋白質で、抗ウイルス作用や抗ガン作用を有する。イン
ターフェロンにはさまざまなサブタイプが存在するが、
そのうちＩ型インターフェロンとして分類されるものと
しては、インターフェロンα、インターフェロンβおよ
びインターフェロンωがよく知られている。特にインタ
ーフェロンαおよびβは抗ウイルス剤として利用されて
おり、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性肝炎に対
して、長期大量投与（１０⁶ ＩＵ／個体、週３回、６ヶ
月間）により、２０〜４０％の患者において有効性が示
されている［Davis, G. L., et. al.,（1989）N. Engl.
J. Med. 321, 1501およびDiBisceglie, A. M., etal.,
（1989）N. Engl. J. Med. 321, 1506参照］。

【０００３】しかしながら、このインターフェロンαま
たはβの大量投与による治療には、発熱等の副作用発現
が問題となっている。この副作用による患者の精神的・
肉体的負担が大きいため、より大量のインターフェロン
αまたはβの投与により有効性を高められ得る可能性が
考えられるにもかかわらず、副作用がこの投与限界を決
める要因となっている。

【０００４】一方、インターフェロンτは、当初、妊娠
後１０日から２１日にかけてヒツジ受胎産物（conceptu
s ）より分泌される蛋白質（ヒツジトロフォブラストプ
ロテイン−１（ＯＴＰ−１）として同定された［Wilso
n, et al. (1979) Biology ofReproduction 20 (Supp.
1): 101A 、およびBazer, F. W., et al. (1986) J. Re
porduction and Fertility 76, 841 参照］。ＯＴＰ−
１は排卵誘発作用を有するプロスタグランジンＦ２αの
子宮内への分泌を抑制する作用を有していたため［Baze
r, F. W., et al. (1986) Biology of Reproduction 7
6, 841 参照］、妊娠の成立に関与する機能を有するも
のと考えられた。後に、ＯＴＰ−１が種々の動物のイン
ターフェロンαとの間に高い（５０〜７０％）アミノ酸
配列相同性を有しており［Imakawa, K., et. al. (198
7) Nature 330, 377 参照］、またＩ型インターフェロ
ンレセプターに結合する性質を有していることが明らか
となり［Stewart, H. J., et al. (1987) J. Endocrino
l. 115, R13 参照］、国際インターフェロン協会によ
り、新たなＩ型インターフェロンファミリーに属する活
性蛋白質として認められた。

【０００５】その後、ヒツジインターフェロンτ（ｏＩ
ＦＮτ）をコードする遺伝子を大腸菌中で発現後、リフ
ォールディングにより活性化された組換え体が、抗ウイ
ルス活性［Stewart, H. J., et al. (1987) J. Endocri
nol. 115, R13 および Pontzer, C. H., et al. (1988)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, 801参照］、抗
腫瘍活性［Pontzer, C. H. et al. (1991) Cancer Res.
51, 5304 参照］、自己免疫抑制活性［Soos, J. M. an
d Johnson, H. M. (1995) J. IFN. Cytokine Res. 15,
39参照］を有することが示された。さらに、インターフ
ェロンαおよびβに比してその細胞毒性が低く［Subram
aniam, P. S., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92, 12270-12274参照］、生体における副作用発現
も低い可能性が示唆されている。

【０００６】ヒト型インターフェロンτをコードするＤ
ＮＡは、今川らによってヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブ
ラリーよりヒトインターフェロンω配列由来のプローブ
を用いてクローニングされている［Imakawa, K., et a
l. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10864参照］。さら
に、国際特許公開 ＷＯ９６／３５７８９公報にはヒト
型インターフェロンτ１乃至τ７と命名された変異遺伝
子が記載されており、その中にヒト型インターフェロン
τ３なる変異遺伝子が開示されている。しかしながら、
ヒト型インターフェロンτ３の改変体に関して、分子中
のどの部位をどのように改変すればその活性を維持もし
くは向上し得るかについては知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】 本発明は、高い抗ウ
イルス活性を有するヒトインターフェロンτ３改変体、
該改変体をコードするＤＮＡ、該改変体の製造方法およ
び該改変体を含むことからなる医薬を提供することを目
的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】 本発明は、（１） 遺
伝子操作によって得られ、配列表の配列番号２のアミノ
酸番号１〜１７２で示されるアミノ酸配列を含むことか
らなるポリペプチド、（２） （１）記載のポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（３） 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４〜５
１９で示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、
（２）記載のＤＮＡ、（４） （２）または（３）記載
のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、
（５） （４）記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換
された宿主細胞、（６） （５）記載の宿主細胞を、イ
ンターフェロン活性を有するポリペプチドの産生が可能
な条件下で培養し、次いで該培養物からインターフェロ
ン活性を有するポリペプチドを回収することを特徴とす
る、インターフェロン活性を有するポリペプチドの製造
方法、（７） （１）記載のポリペプチドを含むことか
らなる医薬、（８） （１）記載のポリペプチドを含む
ことからなる抗ウイルス剤、（９） （１）記載のポリ
ペプチドを含むことからなる抗腫瘍剤、（１０）
（１）記載のポリペプチドを含むことからなる自己免疫
疾患治療剤、に関するものである。

【０００９】本発明者らは、ヒトインターフェロンτ３
（以下「ｈＩＦＮτ３」という）のアミノ酸配列に置換
を施すべく該アミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を
導入し、該変異遺伝子を含むプラスミドで大腸菌を形質
転換して該変異遺伝子を発現させた結果、既知のｈＩＦ
Ｎτ３よりも強力な抗ウイルス活性を有するｈＩＦＮτ
３改変体を作出することに成功し、本発明を完成させ
た。

【００１０】本発明において「インターフェロン活性を
有する」とは、既知の他のＩ型インターフェロン同様、
抗ウイルス作用、抗腫瘍作用および自己免疫反応抑制作
用を有することをいう。

【００１１】

【発明の実施の形態】 本発明のポリペプチドをコード
するＤＮＡは、ｈＩＦＮτ３遺伝子として知られている
ヌクレオチド配列［国際特許公開 ＷＯ９６／３５７８
９号公報参照］（配列表の配列番号３のヌクレオチド番
号４〜５１９）がコードするアミノ酸配列（配列表の配
列番号４のアミノ酸番号１〜１７２；以下「ｈＩＦＮτ
３配列」という）を基に、そのアミノ酸番号８６のArg
がCys に置換された配列をコードするように、既知のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを遺伝子操作により改変
するか、あるいは所望の改変体をコードするＤＮＡを全
合成することにより得ることができる。

【００１２】ｈＩＦＮτ３配列をコードするＤＮＡは、
文献に記載された方法に従って、ＩＦＮτを産生するヒ
ト組織または細胞株から作製されたｃＤＮＡライブラリ
ーからクローニングすることにより得られる［前出 国
際特許公開 ＷＯ９６／３５７８９号公報参照］。

【００１３】また、例えば大腸菌で組換えタンパク質を
生産する目的で、大腸菌での使用頻度の高いコドンでｈ
ＩＦＮτ３配列をコードするヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡを人工的に調製することもできる。この場合、シ
グナルペプチド部分は不要であるから、成熟型タンパク
質のＮ末端に開始メチオニンコドンが付加されたものを
コードするＤＮＡを調製することができる。なお、本発
明の好適な実施態様においては、通常、組換えＩＦＮτ
３のＮ末端メチオニンは、天然型、改変型を問わず、大
腸菌で発現後、精製に至るまでの過程で自動的に除去さ
れる。

【００１４】ｈＩＦＮτ３配列をコードするＤＮＡに所
望の改変を加える方法としては、該改変部位をコードす
る部分を含む合成オリゴＤＮＡを用いて部位特異的変異
を導入する方法（インビトロ・ミュータジェネシス）
［Mark, D. F., et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 5662-5666 参照］、またポリメラーゼ連鎖反
応（以下「ＰＣＲ」という）［Saiki, R. K., et al (1
988) Science 239, 487-491 参照］を利用して該アミノ
酸をコードするＤＮＡ部分を付け加える方法などを利用
することができる。

【００１５】また、本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡを全合成することもできる［Hunkapiller, M., e
t al (1984) Nature 310, 105-111 参照］。例えば、両
端がオーバーラップするように、センスおよびアンチセ
ンス部分配列を合成し、ＰＣＲ等のＤＮＡポリメラーゼ
反応を利用してそれら部分配列が連結された全配列を構
築することが可能である。

【００１６】なお、所望のアミノ酸に対するコドンはそ
れ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用
する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定で
きる［Grantham, R., et al. (1981) Nucleic Acids Re
s. 9, r43-r74 参照］。さらに、これらヌクレオチド配
列のコドンの一部改変は、前述の部位特異的変異導入法
等に従うことができる。

【００１７】また、あるＤＮＡが上記（３）記載のＤＮ
Ａとハイブリダイズするか否かは、以下のようにして調
べることができる。すなわち、まず被検検体のＤＮＡを
必要に応じてアガロースゲル電気泳動した後、ニトロセ
ルロースまたはナイロン等の膜にブロットし、吸着した
ＤＮＡを熱処理や紫外線照射等により膜に固定する。
（３）記載のＤＮＡを、ランダムプライマー法［Feinbe
rg, A. P., et al. (1983) Anal. Biochem., 132, 6-13
参照］、ニックトランスレーション法［Maniatis, T.,
et al. (1982) "Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual" Cold SpringHarbor Laboratory, New York参照］
等に従って、³²Ｐ等の放射性同位元素、ビオチン、ジゴ
キシゲニンまたは酵素等で標識したプローブを作製す
る。該プローブを含むハイブリダイゼーション溶液中に
膜を浸して、所定の温度でインキュベーションした後、
膜を洗浄し、それぞれの標識に即した方法によりプロー
ブを検出する。ハイブリダイゼーション溶液中に含まれ
るＳＳＣ（salined-sodium citrate：「クエン酸ナトリ
ウム−生理食塩水液」；１×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化
ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）の
濃度は好適には４ないし８×ＳＳＣ、さらに好適には６
×ＳＳＣである。また、インキュベーション温度は好適
には３０ないし７０℃、さらに好適には６０℃である。

【００１８】上記の方法を利用することにより、（３）
記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを、種々のｃ
ＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからクロ
ーニングすることができる。

【００１９】このようにして得られた本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを好適なベクターＤＮＡに組込
むことにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形
質転換させることができる。さらに、これらのベクター
に適当なプロモーターおよび形質転換にかかわる配列を
導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝
子を発現させることが可能である。

【００２０】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis ）
等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で
形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリ
コン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプ
ラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。
またベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選
択性を付与することができる配列を持つものが望まし
い。

【００２１】例えば大腸菌としてはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１
２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ
３２２やｐＵＣ形のプラスミドがよく用いられるが、こ
れに限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいず
れも利用できる。

【００２２】プロモーターとしては、大腸菌においては
トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース
（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース
（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プ
ロモーター、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）Ｐ
Ｌ プロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕ
ｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも
本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。

【００２３】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８［Ohmura,
K., et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93 参照］等が
用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌
用プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝
子の調節配列がよく用いられ、さらに必要によりα−ア
ミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配
列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能と
なる。

【００２４】宿主細胞として大腸菌を用いる場合を例に
挙げると、発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２複製起
点を有し、大腸菌において自律増殖が可能であり、さら
に転写プロモーター、翻訳開始シグナルを備えたものを
用いることができる。該発現ベクターはカルシウム−ク
ロライド法［Mandel, M. and Higa, A. (1970) J. Mol.
Biol. 53, 154参照］、ハナハンの方法［Hanahan, D.
and Meselson, M. (1980) Gene 10, 63 参照］および電
気パルス穿孔法［Neumann, E., et al. (1982)EMBO J.
1, 841-845 参照］等により大腸菌に取り込ませること
ができ、かくして所望のベクターがトランスフェクトさ
れた細胞を得ることができる。

【００２５】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例
えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞［Gluzman, Y. (1981)
Cell23, 175-182 参照］やチャイニーズハムスター卵
巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
［Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 4216-4220参照］、ヒトナマルバ細
胞、ハムスターＢＨＫ細胞等がよく用いられるが、これ
らに限定されない。

【００２６】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位お
よび転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさ
らに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクタ
ーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有する
ｐＳＶ２ｄｈｆｒ［Subramani, S., et al. (1981) Mo
l. Cell. Biol. 1, 854-864参照］等を例示できるが、
これに限定されない。

【００２７】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いれられており、その中でもサッカロミセス属酵母、
例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）が好ましい。該酵母等の真核生物の発現ベク
ターとしては、例えばアルコール脱水素酵素遺伝子のプ
ロモーター［Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (198
2) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025 参照］や酸性ホス
ファターゼ遺伝子のプロモーター［Miyanohara, A., et
al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5参
照］等を好ましく利用できる。

【００２８】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であ
り、さらに転写プロモーター、転写集結シグナルおよび
ＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ
る。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法［Luth
man, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Re
s. 11, 1295-1308 参照］、リン酸カルシウム−ＤＮＡ
共沈澱法［Graham, F. L. and van der Ed, A. J.(197
3) Virology 52, 456-457 参照］および電気パルス穿孔
法［Neumann, E., et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845
参照］等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、
かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。ま
た、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現
ベクターと共にＧ４１８耐性マーカーとして機能するｎ
ｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅ
ｏ［Sambrook, J., et al. (1989) "Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laborat
ory, NY参照］やｐＳＶ２ｎｅｏ［Southern, P. J. and
Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341
参照］等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコ
ロニーを選択することにより本発明のポリペプチドを安
定に産生する形質転換細胞を得ることができる。

【００２９】上記で得られる所望の形質転換体は、常法
に従い培養することができ、該培養により細胞内または
細胞外に本発明のポリペプチドが生産される。該培養に
用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣
用される各種のものを適宜選択でき、例えば、大腸菌で
あればトリプトン−イースト培地（バクトトリプトン
１．６％、イーストエキストラクト１．０％、塩化ナト
リウム ０．５％（ｐＨ７．０））やペプトン培地（デ
ィフコ社製）等を使用できる。また、上記ＣＯＳ細胞で
あればＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグ
ル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に必要に応じウシ
胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用
できる。

【００３０】上記により、形質転換体の細胞内または細
胞外に生産される本発明のポリペプチドは、その物理的
性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法
により、分離・精製することができる。かかる方法とし
ては、具体的には例えば通常の蛋白質沈澱剤による処
理、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ
過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグ
ラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。

【００３１】外来遺伝子を大腸菌等に導入して大量発現
させた場合、産生されたポリペプチドが、封入体と呼ば
れる水に不溶の集塊を形成することがある。そのような
場合、グアニジンイソチオシアネート等の強力な変性剤
を用いて該ポリペプチドを変性させることにより該ポリ
ペプチドを可溶化することができるが、変性したポリペ
プチドは、本来の高次構造を形成していないため活性を
有していないことが多い。また、封入体を形成しない場
合でも、産生されたポリペプチドが、正しい高次構造を
形成しないままの状態であったり、精製中に変性したり
することにより、不活性型として得られることもある。
そのような場合には、ポリペプチドに正しい高次構造を
形成させて活性型の蛋白質を得る目的で、当業者に周知
のリフォールディング技術［例えば、Klemann, S. W.,
et al. (1990) Molecular Endocrinology 4, 1506-1514
および Ymamada, K., et al. (1990) Biotechnology 8,
1036-1040参照］を用いることができる。

【００３２】上記のごとくして得られる本発明のポリペ
プチドがインターフェロン活性を有するか否かは、例え
ば以下に記載するような方法により調べることができ
る。

【００３３】〔１〕抗ウイルス活性［Pestka, S. (198
1) Methods in Enzymology vol.78,386 参照］： ９６
穴細胞培養プレート中で、ウシ腎由来の細胞株ＭＤＢＫ
（ATCC No. CCL22）を、被検試料を含む培地で培養後、
水疱性口内炎ウイルス（Vesicular Stomatitis Virus：
例えば、ATCC No. VR-159 ）を添加し感染させる。一定
時間培養した後、各ウェルの細胞をホルマリン固定し、
クリスタルバイオレットで染色する。各ウェルの５５０
ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞変性作用の抑
制活性として抗ウイルス活性を調べることができる。

【００３４】〔２〕抗腫瘍活性［Pontzer, C. H., et a
l. (1991) Cancer Res. 51, 5304-5307 参照］： ２４
穴細胞培養プレート中で、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ（AT
CC No. CCL25）を、被検試料を含む培地で培養する。８
日間培養後、各ウェルの細胞をホルマリン固定し、クリ
スタルバイオレットで染色して、顕微鏡下で形成コロニ
ー数をカウントする。被検検体が抗腫瘍活性を有する場
合は、形成コロニー数が抑制される。

【００３５】〔３〕自己免疫疾患に対する効果［Soos,
J. M., et al. (1995) J. Immunol.155, 2747-2753 参
照］： ＮＺＷマウスをウシミエリンベーシックプロテ
インで免疫し、さらに百日咳毒素（pertussis toxin ）
を投与することにより、実験的アレルギー性脳脊髄炎を
発症させる。このマウスをしばらく飼育すると症状が消
失するが、ブドウ球菌外毒素Ｂ（Staphylococcul enter
otoxin B；以下「ＳＥＢ」という）を投与することによ
り症状が再発する。このＳＥＢ投与の前に被検試料を投
与して、症状再発の抑制効果を検討する。

【００３６】なお、インターフェロン活性の測定方法は
これらに限定されず、当業者に周知の他の測定方法も用
いられ得る。

【００３７】本発明のポリペプチドは、ウイルスによる
感染症、腫瘍、自己免疫疾患ならびにそれらに付随して
生ずる各種疾患の処置において、単独または他の治療薬
との併用投与で用いられる。

【００３８】上記の症状を処置するために用いる本発明
の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または自己免疫疾患治療剤組
成物は、医学的に許容される担体と治療上有効な量の本
発明のポリペプチドとの混合物からなる。本組成物は、
種々の形態で投与することができ、それらの投与形態と
しては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤
等による経口投与、または、注射剤、点滴剤、坐薬など
による非経口投与をあげることができる。

【００３９】注射剤または点滴剤として投与される場
合、本発明の治療組成物は発熱物質を含まず、非経口的
に許容可能な水溶液の態様である。ｐＨ、等張性、およ
び安定性を考慮して調製される上記の非経口的に許容さ
れうるタンパク質溶液の調剤は、当業者に周知の技術に
より実施できる。

【００４０】上記症状の処置における投与量および投与
法は、本薬剤の作用に影響を及ぼし得る要因、例えば、
患者の症状、体重、性、年令、食餌、何らかの感染の重
度、投与の時間およびその他の臨床上影響を与える要因
を考慮して診察する医師によって決定されうる。通常、
経口投与では成人に対して１日約１ｎｇないし１００ｍ
ｇであり、これらを１回または数回に分けて投与するこ
とができる。また、非経口投与では、１回約１ｎｇない
し１００ｍｇを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射に
よって投与することができる。

【００４１】本発明の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または自
己免疫疾患治療剤組成物は、他の適当な抗ウイルス剤、
抗腫瘍剤または自己免疫疾患治療剤と併用して用いられ
得る。この場合、他の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または自
己免疫疾患治療剤は本発明の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤ま
たは自己免疫疾患治療剤組成物中の一成分として加えて
用いることができるが、別々の組成物として同じ患者に
投与することもできる。上記の併用は、他の抗ウイルス
剤、抗腫瘍剤または自己免疫疾患治療剤単独での処置の
活性または効果を増進しうる。

【００４２】本発明の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または自
己免疫疾患治療剤は、前述のＩＦＮτ３改変体を主成分
として含有する。他の成分としては、一般的な医薬添加
物が選ばれる。添加物がなくとも本発明の目的は達成さ
れるが、一般的には主として安定化のために添加物が加
えられる。そのような医薬添加物としては、局方に記載
された、医薬添加物として使用できる蛋白質または糖類
の中から選ばれる。特に好適にはヒト血清アルブミン、
ゼラチン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースな
どの中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、これ
らに限定するものではない。

【００４３】

【実施例】 以下に参考例および実施例を挙げて本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
ない。

【００４４】参考例． ｈＩＦＮτ３をコードするＤＮ
Ａの調製および大腸菌での発現 １）ＤＮＡの調製 ｈＩＦＮτ３の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡを大
腸菌で発現させるため、国際特許公開 ＷＯ９６／３５
７８９号公報の記載を参考にして、配列表の配列番号３
に示すＤＮＡを調製した。まず、以下に記載するオリゴ
ヌクレオチドをＤＮＡ合成機（モデル３９２；（株）パ
ーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ
事業部製）にて合成した： 5'- ATGTGTGACC TGTCTCAGAA CCACGTGCTG GTTGGCAGCC AGAACCTCAG GCTCCTGGGC C AAATG -3' （τ３−１：配列表の配列番号５）； ５’− ＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ ＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧ ＡＡＧＧＧＡＧＡＧ
Ｔ ＣＴＣＣＴＣＡＴＴＴ ＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧ ＣＣＴＧＡＧ −３’ （τ３−２：配列表の配列番号６）； ５’− ＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡ ＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡ ＧＡＣＴＴＣＧＣＴ
Ｔ ＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡ ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧ ＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣ Ｔ ＣＣＡＧ −３’ （τ３−３：配列表の配列番号７）； 5'- GAAGCTCTGC TGGAGCATCT CGTGGAGCAC AGAGATGGCC TGGGCCTCCT GGAGCTGGCC A CCCTCCAC -3' （τ３−４：配列表の配列番号８）； 5'- AGATGCTCCA GCAGAGCTTC AACCTCTTCC ACACAGAGCA CTCCTCTGCT GCCTGGGACA C C -3' （τ３−５：配列表の配列番号９）； 5'- CAGCTGCTGA TGGAGTCCAG TGCGGAGCTG CTCCAGGAGG GTGGTGTCCC AGGCAGCAGA G GA -3' （τ３−６：配列表の配列番号１０）； 5'- ACTGGACTCC ATCAGCAGCT GGATGACCTG GATGCCTGCC TGGGGCAGGT GACGGGAGAG G AA -3' （τ３−７：配列表の配列番号１１）； 5'- CAGGGTGGGG CCCGTTCTTC CCAGGGCAGA GTCTTCCTCT CCCGTCACCT GCCC -3' （τ３−８：配列表の配列番号１２）； 5'- AGAACGGGCC CCACCCTGGC CATGAAGAGG TATTTCCAGG GCATCCATGT CTACCTGAAA G -3' （τ３−９：配列表の配列番号１３）； 5'- TTCCAGTCTG ACAATTTCCC AGGCGCAGTC ACTATATCCC TTCTCTTTCA GGTAGACATG G ATGCC -3' （τ３−１０：配列表の配列番号１４）； 5'- TGGGAAATTG TCAGACTGGA AATCATGAGA TCCTTGTCTT CATCAACCAG CTTGCAC -3' （τ３−１１：配列表の配列番号１５）； 5'- TCAAGGTGAG CTCAGGTCTC CATCCATCAT TCTTAACCTT TTGTGCAAGC TGGTTGATGA A GA -3' （τ３−１２：配列表の配列番号１６）。

【００４５】次いで、τ３−１とτ３−２、およびτ３
−３とτ３−４、τ３−５とτ３−６、τ３−７とτ３
−８、τ３−９とτ３−１０、τ３−１１とτ３−１２
の各組み合わせで、各約０．１ｎｍｏｌのオリゴヌクレ
オチドを２種類づつ混合し、それぞれ１サイクルあたり
９６℃で３０秒、５４℃で１分、７２℃で１分の条件に
てＰＣＲを４サイクル実施した。なお、以下に記載する
参考例および実施例中のすべてのＰＣＲにおいて、ＬＡ
ＰＣＲキット・バージョン２（宝酒造（株）社製）を
使用した。鋳型ＤＮＡ以外の反応液組成は以下に記載す
る通りであった： １０倍濃度 ＬＡ ＰＣＲ緩衝液（Ｍｇ²⁺）（キットに添付） ５μｌ ｄＮＴＰ混合液（キットに添付） ８μｌ プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） 各０．５μｌ ＬＡ Ｔａｑポリメラ−ゼ（５単位／μｌ、キットに添付） ０．５μｌ 滅菌蒸留水で全量５０μｌとする（ただし、上記の例の
ように、複数の鋳型を混合して相補鎖をアニーリングさ
せることにより、互いに一方の鋳型が他方の鋳型のプラ
イマーとなるような条件の反応においては、プライマー
は添加されない場合がある）。

【００４６】上記の各組み合わせのオリゴヌクレオチド
は、何れも３’末端側に互いに相補的な配列を有してい
る。ＰＣＲにおいて、まずこれら相補鎖がアニーリング
し、次いで残りの一本鎖部分にポリメラーゼ反応による
相補鎖が生成されるので、結果として元のヌクレオチド
の鎖長の合計から重複部分を除いた鎖長の二本鎖ＤＮＡ
が得られる。各反応生成物をポリアクリルアミドゲル電
気泳動し、目的の鎖長に相当するバンド部分のゲルを切
り出して、それぞれの反応で増幅されたＤＮＡ断片
（「τ３（１〜２）」、「τ３（３〜４）」、「τ３
（５〜６）」、「τ３（７〜８）」、「τ３（９〜１
０）」および「τ３（１１〜１２）」という）を抽出精
製した。

【００４７】次に、以下に記載するオリゴヌクレオチド
プライマー： 5'- ATACGGATCC CATATGTGTG ACCTGTCTCA GAACCACGTG CTG -3' （τ３−１Ｐｒ：配列表の配列番号１７）； 5'- GAAGCTCTGC TGGAGCATCT CGTG -3' （τ３−２Ｐｒ：配列表の配列番号１８）； 5'- AGATGCTCCA GCAGAGCTTC AACCTC -3' （τ３−３Ｐｒ：配列表の配列番号１９）； 5'- CAGGGTGGGG CCCGTTCTTC CCAG -3' （τ３−４Ｐｒ：配列表の配列番号２０）； 5'- AGAACGGGCC CCACCCTGGC CATG -3' （τ３−５Ｐｒ：配列表の配列番号２１）； 5'- TTAAGGATCC TCAAGGTGAG CTCAGGTCTC CATCC -3' （τ３−６Ｐｒ：配列表の配列番号２２） を合成し、表１に記載する組み合わせでＰＣＲを実施し
た。

【００４８】

【表１】 ────────────────────────────────── 鋳型（２種類を混合） プライマー ────────────────────────────────── τ３（１〜２）、τ３（３〜４） τ３−１Ｐｒ、τ３−２Ｐｒ τ３（５〜６）、τ３（７〜８） τ３−３Ｐｒ、τ３−４Ｐｒ τ３（９〜１０）、τ３（１１〜１２） τ３−５Ｐｒ、τ３−６Ｐｒ ────────────────────────────────── ＰＣＲはいずれの場合も１サイクルあたり９８℃で３０
秒、５４℃で１分、７２℃で１分の条件で２０サイクル
実施した。各反応液中の２種類の鋳型は、３’末端側に
互いに相補的な配列を有するので、ＰＣＲによりこれら
の相補鎖で連結したＤＮＡが生成される。各反応生成物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、目的の鎖長に相
当するバンドを切り出して、それぞれの反応で増幅され
たＤＮＡ断片（それぞれ「τ３（１〜４）」、「τ３
（５〜８）」および「τ３（９〜１２）」という）を抽
出精製した。

【００４９】同様にして、τ３（１〜４）とτ３（５〜
８）を混合して鋳型とし、τ３−１Ｐｒとτ３−４Ｐｒ
をプライマーとするＰＣＲ（１サイクルにつき９８℃で
１分、５４℃で２分、７２℃で２分; ２０サイクル）を
実施して、τ３（１〜４）とτ３（５〜８）が接続され
たＤＮＡ（「τ３（１〜８）」という）を調製した。さ
らに、τ３（１〜８）とτ３（９〜１２）を混合して鋳
型とし、τ３−１Ｐｒとτ３−６Ｐｒをプライマーとす
るＰＣＲを実施することにより、ｈＩＦＮτ３（配列表
の配列番号４）をコードするヌクレオチド配列（配列表
の配列番号３）を含むＤＮＡを得た。該ヌクレオチド配
列は、ｈＩＦＮτ３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
の５’末端に、翻訳開始のためのメチオニンコドンが付
加されているものである。

【００５０】２）発現ベクターの構築 上記１）で得られたＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＮｄｅＩで消化し、ＴＥ緩衝液（０．０１ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミン四
酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という））に溶解した。一方、
プラスミドベクターｐＡＲ３０４０［Rosenberg, A.
H., et al. (1987） Gene 56, 125-135 参照］も同様に
ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化し、ＴＥ緩衝液に溶解
した。これらのＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化された
ＤＮＡを ０．１乃至０．３ｐｍｏｌ相当分づつ混合
し、ＤＮＡライゲーションキット・ バージョン１（宝酒
造（株）社製）を使用して連結することにより、ｐＡＲ
３０４０のＴ７プロモーターの直後にｈＩＦＮτ３をコ
ードするＤＮＡが挿入された大腸菌用組換え発現ベクタ
ー ｐＴ７ｈＩＦＮτ３を構築した（図１）。また上記
１）で得られたｈＩＦＮτ３をコードするＤＮＡのヌク
レオチド配列はジデオキシ法［Sanger, F. (1981) Scie
nce 214, 1205 参照］によるＤＮＡシークエンシングに
より確認した。

【００５１】３）大腸菌における発現 上記２）で構築したｐＴ７ｈＩＦＮτ３ ＤＮＡをアル
カリ法［Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nuc. Ac
ids Res. 7, 1518 参照］により大量調製した。１乃至
１０ｎｇ相当のｐＴ７ｈＩＦＮτ３ ＤＮＡを、ハナハ
ン法［Hanahan,D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580
参照］により調製された大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）
株（ストラタジーン社製）のコンピテント細胞 ５０μ
ｌに加え、２０分間氷冷した後、３７℃で２分間保温し
てから直ちに氷冷した。このものに５００μｌのＳＯＣ
培地（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、３７℃で
４０分間振とう培養した。この培養液を １００μｇ／
ｍｌ アンピシリンを含むＬ−ブロス寒天培地プレート
上に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。出現したアンピ
シリン耐性コロニーを単離してＭ９ＣＡ培地に接種し、
培養液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）
が０．４から０．８に達するまで２４〜２６℃で振とう
培養した後、等量のＬ培地およびイソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトピラノシド（最終濃度１ｍＭ）を加え、３
７℃でさらに４時間振とう培養した。ここで使用された
培地の組成は以下に記載する通りであった： Ｍ９ＣＡ培地： リン酸二ナトリウム１２水和物 １５ｇ リン酸一カリウム ３ｇ 塩化ナトリウム ０．５ｇ 塩化アンモニウム １ｇ カザミノ酸 ２ｇ １Ｍ 硫酸マグネシウム ２００μｌ ２０％ グルコース １ｍｌ １Ｍ 塩化カルシウム １０μｌ 水 １リットル Ｌ培地： バクト・トリプトン（ディフコ社製） １０ｇ バクト・イーストエキストラクト（ディフコ社製） ５ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 水 １リットル Ｌ−ブロス寒天培地 バクト・ トリプトン １２．５ｇ バクト・イーストエキストラクト ３．７５ｇ バクト・アガー（ディフコ社製） ７．５ｇ 水 ５００ｍｌ。

【００５２】４）粗精製 上記３）の培養後の培養液を遠心分離して上清を除いた
後、沈澱した大腸菌体をフレンチプレスにて破砕した。
このものを２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、未破
砕細胞および細胞破片を沈澱させてから、上清を１２０
００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、沈澱を回収した。こ
の沈澱を １％ トリトンＸ−１００を含む緩衝液（１
００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５））にて２回洗浄し、さらに、１ｍＭ フ
ッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含むＴＥ
緩衝液にて１回洗浄後、６Ｍ グアニジンイソチオシア
ネートおよび ０．２５％ ２−メルカプトエタノール
を含む ０．０１ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）にタンパク質濃度が １ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解
し、その後 ０．２５％ ２−メルカプトエタノールを
含む ０．０１ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を徐々に滴下して１０倍に希釈した。希釈後の溶液を
０．０２ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対
して４℃下で透析した（透析チューブの分画分子量１０
００。３時間毎に膜外液を交換し、計１２時間実施し
た。）後、透析チューブ内液を遠心分離（４６５０×
ｇ、１５分）することにより析出物を沈澱させた。得ら
れた上清を、限外ろ過膜（ビバポア、排出限界分子量７
５００；ビバサイエンス社製）を用いて１０倍濃縮した
ものを、ｈＩＦＮτ３粗精製試料とした。

【００５３】実施例１. 改変体 ｈＩＦＮτ３Ｃの調
製 １）ＤＮＡの調製および発現 以下に記載する配列を有するヌクレオチド： 5'- GGCCCGGGAG GATCCCATAT GTGTGACCTG TCTCAGAACC ACGTGCTG -3' （τ３−７Ｐｒ：配列表の配列番号２３）； 5'- GAGCTGCTCC AGGAGGGTGG TGTC -3' （τ３−８Ｐｒ：配列表の配列番号２４）； 5'- GACACCACCC TCCTGGAGCA GCTCTGCACT GGACTCCATC AGCAGCTG -3' （τ３−９Ｐｒ：配列表の配列番号２５）； 5'- TCAAGGATCC TTACTTAGTT ATCAAGGTGA GCTCAGGTCT CCATC -3' （τ３−１０Ｐｒ：配列表の配列番号２６） を合成した。

【００５４】次に、前記参考例の１）で調製されたｈＩ
ＦＮτ３をコードするＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで
消化した。これを鋳型とし、τ３−７Ｐｒとτ３−８Ｐ
ｒ、ならびにτ３−９Ｐｒとτ３−１０Ｐｒを各々プラ
イマーとして、ＰＣＲを２５サイクル（１サイクルにつ
き９６℃で１分、５４℃で１分、７２℃で３分）実施
し、それぞれ増幅されたＤＮＡ断片を回収した。得られ
た２つのＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、τ３−７Ｐｒ
とτ３−１０Ｐｒをプライマーとして、ＰＣＲを２５サ
イクル（１サイクルにつき９６℃で１分、５４℃で１
分、７２℃で３分）実施することにより、改変体 ｈＩ
ＦＮτ３Ｃ（配列表の配列番号２）をコードするヌクレ
オチド配列（配列表の配列番号１）を含むＤＮＡを得
た。このＤＮＡを前記参考例２）記載の方法によりプラ
スミドベクター ｐＡＲ３０４０に組込み、改変体 ｈ
ＩＦＮτ３Ｃを大腸菌で発現させる組換えベクター ｐ
Ｔ７ｈＩＦＮτ３Ｃを調製した（図２）。

【００５５】以下、前記参考例の３）〜４）に記載した
方法で、ｐＴ７ｈＩＦＮτ３Ｃで形質転換された大腸菌
を培養することにより、ｈＩＦＮτ３Ｃポリペプチド粗
精製試料を調製した（ただし、６Ｍ グアニジンイソチ
オシアネートおよび ０．２５％ ２−メルカプトエタ
ノールを含む０．０１ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に沈澱を溶解する工程におけるタンパク質濃度
を ０．５ｍｇ／ｍｌとし、その後 ０．２５％ ２−
メルカプトエタノールを含む ０．０１ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を徐々に滴下して希釈する際の
倍率を６倍とした）。

【００５６】２）アミノ酸配列確認 上記１）で得られた粗精製試料について、そのＮ末端の
アミノ酸配列を軒原らの方法［Nokihara, K., et al.
(1992) Analytical Letters 25, 513-533参照］に従っ
てプロテインシークエンサー（モデルＰＳＱ−１；島津
製作所（株）社製）で解析した結果、 Xaa-Asp-Leu-Ser-Gln-Asn-His-Val-Leu-Val （配列表の配列番号２７） なる配列が確認された。この配列は、Ｎ末端のXaa （Cy
s と推測される）以外は配列表の配列番号２のアミノ酸
番号２〜１０に示されるアミノ酸配列と同一であった。
したがって、上記１）記載の方法により、配列表の配列
番号２に示されるアミノ酸配列からＮ末端メチオニンが
除去されたポリペプチドが得られることが判明した。

【００５７】実施例２． 改変体 ｈＩＦＮτ３Ｃの精
製 １）イオン交換クロマトグラフィー 実施例１で調製された ｈＩＦＮτ３Ｃ粗精製試料につ
いて、以下に記載する条件でイオン交換クロマトグラフ
ィーを実施した： カラム： ＤＥＡＥ−セファロース ２０ｍｌ（ハイプ
レップ・ファストフロー、ファルマシア社製）； 溶媒： ０．０２Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）； 流速： ２ｍｌ／分； 検出波長： ２８０ｎｍ； 溶出条件： 試料をカラムに注入し、溶媒にてカラムを
洗浄後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配で
溶出。

【００５８】２８０ｎｍの吸光度ピークフラクションを
採取し、その一部を試料として、後記の試験例記載の方
法で抗ウイルス活性を調べた結果、約０．２Ｍ 塩化ナ
トリウムにて溶出されたメインピークのフラクションに
強い活性が認められた。

【００５９】２）ゲルろ過（１） 上記１）記載のメインピークのフラクション全部を限外
ろ過膜（前出ビバポア：排出限界分子量７５００）を用
いて１〜２ｍｌまで濃縮したものについて、以下に記載
する条件でゲルろ過を実施した： カラム： スーパーデックス２００カラム（プレップグ
レード、１×１００ｃｍ：ファルマシア社製）； 溶媒： ０．０２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、
０．１５Ｍ 塩化ナトリウム； 流速： １ｍｌ／分； 検出波長： ２８０ｎｍ； 分画： ２ｍｌ／フラクション。

【００６０】２８０ｎｍの吸光度のメインピークのフラ
クション（２７〜３５番目のフラクション）を回収し、
まとめて限外ろ過膜（前出ビバポア：排出限界分子量７
５００）を用いて１〜２ｍｌまで濃縮した。

【００６１】３）ゲルろ過（２） 上記２）で得られたメインピークのフラクションの濃縮
液について、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）装置（日立製作所（株）社製）を用い、以下に記
載する条件でゲルろ過を実施した： カラム： 順相ゲルろ過カラム ＴＳＫ ｇ−２０００
Ｓｗ（０．７５×６０ｃｍ：東ソー（株）社製）； 溶媒： ０．０１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、
０．１Ｍ 塩化ナトリウム； 流速： ０．５ｍｌ／分 検出波長： ２８０ｎｍ； ３つのピークフラクションを採取し、それぞれのフラク
ションの一部を試料として後記の試験例記載の方法で抗
ウイルス活性を調べた結果、３番目のピークフラクショ
ンに強い活性が認められた。

【００６２】４）逆相ＨＰＬＣ 上記３）で得られた活性画分について、以下に記載する
条件で逆相ＨＰＬＣを実施した： カラム： Ｃ４カラム（０．４６×１５ｃｍ：バイダッ
ク社製）； 溶媒： ３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．０１Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ ８．０）、０．０５％ トリフロロ酢酸； 流速： １ｍｌ／分 検出波長： ２８０ｎｍ； 溶出条件： 試料を数回に分けてカラムに注入した後、
３０％〜９０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶
出。

【００６３】ピークフラクションを採取し、それぞれの
フラクションの一部を試料として後記の試験例記載の方
法で抗ウイルス活性を調べた結果、強い活性が認められ
たフラクションを回収し、ｈＩＦＮτ３Ｃ精製品とし
た。

【００６４】試験例． 抗ウイルス活性 ＭＤＢＫ細胞（ATCC No. CCL22）を用い、水疱性口内炎
ウイルス（VesicularStomatitis Virus）ニュージャー
ジー（New Jersey）株（以下「ＶＳＶ」という）による
細胞変性作用の抑制活性として抗ウイルス活性を測定す
る、インターフェロン力価測定の常法［Pestka, S. (19
81) Methods in Enzymology vol.78, 386 参照］に従
い、以下に記載する方法で抗ウイルス活性を測定した。

【００６５】まず、ＭＤＢＫ細胞を、１０％ウシ胎児血
清を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「培地」と
いう）に３×１０⁵ 細胞／ｍｌとなるように懸濁してか
ら、この細胞懸濁液を９６穴の細胞培養用プレートの各
ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス
下で静置した。細胞がウェル底に付着した後に、前記参
考例および実施例で得られた被検試料が段階希釈された
培地を１００μｌ／ウェル加え、３７℃、５％炭酸ガス
下で１時間静置培養した。次いで、１．２５×１０⁵ プ
ラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの感染価のＶＳＶを含
む培地を５０μｌ／ウェル加え、３７℃、５％炭酸ガス
下で２０時間静置培養した。

【００６６】培養終了後、各ウェルの細胞をホルマリン
固定してから、０．１％のクリスタルバイオレット溶液
にて染色し、洗浄後、５０％エタノール（１００μｌ／
ウェル）を加えて細胞に残存した色素を溶解させた。こ
のプレートの各ウェルについて、５５０ｎｍの吸光度を
測定した。ＶＳＶを添加しなかったウェルの吸光度を１
００％、ＶＳＶを添加し被検試料を添加しなかったウェ
ルの吸光度を０％として、吸光度が５０％となるような
試料濃度をＩＣ₅₀とした。なお、力価定量のための対照
として、リコンビナントヒトインターフェロンα（３×
１０⁶ ＩＵ／ｍｌ；コラボレイティブ・バイオメディカ
ル・プロダクツ社製）を段階希釈したものについて同様
に抗ウイルス活性を測定し、該測定値との比較から各試
料の相対的な抗ウイルス活性を求めた。

【００６７】前記参考例および実施例１で調製された各
ポリペプチド粗精製品の抗ウイルス活性は、表２に記載
する通りであった。

【００６８】

【表２】 ────────────────────────── 試料 抗ウイルス活性（ＩＵ／ｍｇ） ────────────────────────── ｈＩＦＮτ３ ＜５×１０⁵ ｈＩＦＮτ３Ｃ ＞１×１０⁷ ────────────────────────── 製剤例 ．本発明のインターフェロンτ３改変体は、水ま
たはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無
菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供され
る。また、無菌粉末製剤（インターフェロンτ３改変体
を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填してお
き、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよ
い。

【００６９】

【発明の効果】以上のごとく、本発明のインターフェロ
ンτ３改変体は、高い抗ウイルス活性を有し、また細胞
毒性が低いことから、優れた抗ウイルス剤、抗腫瘍剤ま
たは自己免疫疾患治療剤として使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌用組換え発現ベクター ｐＴ７ｈＩＦ
Ｎτ３。

【図２】 大腸菌用組換え発現ベクター ｐＴ７ｈＩＦ
Ｎτ３Ｃ。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..519 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：4..519 特徴を決定した方法：E 配列 ATG TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGC CAG AAC CTC 48 Met Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu -1 1 5 10 15 AGG CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CTT CGC TTC TGT CTG CAG 96 Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln 20 25 30 GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG 144 Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln 35 40 45 CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG 192 Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln 50 55 60 AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC 240 Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr 65 70 75 ACC CTC CTG GAG CAG CTC TGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC 288 Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp 80 85 90 95 CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG 336 Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu 100 105 110 GGA AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG AGG TAT TTC CAG GGC ATC 384 Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile 115 120 125 CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG GAA ATT 432 His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile 130 135 140 GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT TCA TCA ACC AGC TTG CAC 480 Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His 145 150 155 AAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA 522 Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 160 165 170 配列番号：２ 配列の長さ：１７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu -1 1 5 10 15 Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln 20 25 30 Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln 35 40 45 Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln 50 55 60 Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr 65 70 75 Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp 80 85 90 95 Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu 100 105 110 Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile 115 120 125 His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile 130 135 140 Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His 145 150 155 Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 160 165 170 配列番号：３ 配列の長さ：５２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..519 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：4..519 特徴を決定した方法：E 配列 ATG TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGC CAG AAC CTC 48 Met Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu -1 1 5 10 15 AGG CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CTT CGC TTC TGT CTG CAG 96 Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln 20 25 30 GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG 144 Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln 35 40 45 CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG 192 Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln 50 55 60 AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC 240 Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr 65 70 75 ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC 288 Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp 80 85 90 95 CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG 336 Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu 100 105 110 GGA AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG AGG TAT TTC CAG GGC ATC 384 Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile 115 120 125 CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG GAA ATT 432 His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile 130 135 140 GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT TCA TCA ACC AGC TTG CAC 480 Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His 145 150 155 AAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA 522 Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 160 165 170 配列番号：４ 配列の長さ：１７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu -1 1 5 10 15 Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln 20 25 30 Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln 35 40 45 Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln 50 55 60 Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr 65 70 75 Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp 80 85 90 95 Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu 100 105 110 Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile 115 120 125 His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile 130 135 140 Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His 145 150 155 Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 160 165 170 配列番号：５ 配列の長さ：66 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATGTGTGACC TGTCTCAGAA CCACGTGCTG GTTGGCAGCC AGAACCTCAG GCTCCTGGGC 60 CAAATG 66 配列番号：６ 配列の長さ：56 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CTGTCCTGCA GACAGAAGCG AAGGGAGAGT CTCCTCATTT GGCCCAGGAG CCTGAG 56 配列番号：７ 配列の長さ：65 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTTCGCTT TCCCCCAGGA GATGGTGGAG GGTGGCCAGC 60 TCCAG 65 配列番号：８ 配列の長さ：69 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :Yes 配列 GAAGCTCTGC TGGAGCATCT CGTGGAGCAC AGAGATGGCC TGGGCCTCCT GGAGCTGGCC 60 ACCCTCCAC 69 配列番号：９ 配列の長さ：62 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGATGCTCCA GCAGAGCTTC AACCTCTTCC ACACAGAGCA CTCCTCTGCT GCCTGGGACA 60 CC 62 配列番号：１０ 配列の長さ：63 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 ＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡ ＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧ ＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧ ＣＴＣ
ＣＡＧＧＡＧＧ ＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣ ＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡ ６０ ＧＧＡ
６３ 配列番号：１１ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACTGGACTCC ATCAGCAGCT GGATGACCTG GATGCCTGCC TGGGGCAGGT GACGGGAGAG 60 GAA 63 配列番号：１２ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CAGGGTGGGG CCCGTTCTTC CCAGGGCAGA GTCTTCCTCT CCCGTCACCT GCCC 54 配列番号：１３ 配列の長さ：61 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカ
ル：No アンチセンス：No 配列 AGAACGGGCC CCACCCTGGC CATGAAGAGG TATTTCCAGG GCATCCATGT CTACCTGAAA 60 G 61 配列番号：１４ 配列の長さ：66 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 TTCCAGTCTG ACAATTTCCC AGGCGCAGTC ACTATATCCC TTCTCTTTCA GGTAGACATG 60 GATGCC 66 配列番号：１５ 配列の長さ：57 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧ ＴＣＡＧＡＣＴＧＧＡ ＡＡＴＣＡＴＧＡＧＡ ＴＣＣ
ＴＴＧＴＣＴＴ ＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧ ＣＴＴＧＣＡＣ ５７ 配列番号：１６ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 TCAAGGTGAG CTCAGGTCTC CATCCATCAT TCTTAACCTT TTGTGCAAGC TGGTTGATGA 60 AGA 63 配列番号：１７ 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATACGGATCC CATATGTGTG ACCTGTCTCA GAACCACGTG CTG 43 配列番号：１８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 GAAGCTCTGC TGGAGCATCT CGTG 24 配列番号：１９ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGATGCTCCA GCAGAGCTTC AACCTC 26 配列番号：２０ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CAGGGTGGGG CCCGTTCTTC CCAG 24 配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：No 配列 AGAACGGGCC CCACCCTGGC CATG 24 配列番号：２２ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 TTAAGGATCC TCAAGGTGAG CTCAGGTCTC CATCC 35 配列番号：２３ 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGCCCGGGAG GATCCCATAT GTGTGACCTG TCTCAGAACC ACGTGCTG 48 配列番号：２４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 GAGCTGCTCC AGGAGGGTGG TGTC 24 配列番号：２５ 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GACACCACCC TCCTGGAGCA GCTCTGCACT GGACTCCATC AGCAGCTG 48 配列番号：２６ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 TCAAGGATCC TTACTTAGTT ATCAAGGTGA GCTCAGGTCT CCATC 45 配列番号：２７ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質） ハイポセティカル：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＢＡＦ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子操作によって得られ、配列表の配
   列番号２のアミノ酸番号１〜１７２で示されるアミノ酸
   配列を含むことからなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
   ４〜５１９で示されるヌクレオチド配列を含むことから
   なる、請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または３に記載のＤＮＡを含む
   ことからなる組換えＤＮＡベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えＤＮＡベクターで
   形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を、インターフ
   ェロン活性を有するポリペプチドの産生が可能な条件下
   で培養し、次いで該培養物からインターフェロン活性を
   有するポリペプチドを回収することを特徴とする、イン
   ターフェロン活性を有するポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドを含むこと
   からなる医薬。
8. 【請求項８】 請求項１記載のポリペプチドを含むこと
   からなる抗ウイルス剤。
9. 【請求項９】 請求項１記載のポリペプチドを含むこと
   からなる抗腫瘍剤。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のポリペプチドを含むこ
    とからなる自己免疫疾患治療剤。