DD299660A5 - Faktorregulierte genexpression - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hestellung eines gewuenschten pharmazeutisch aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die entweder durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer das gewuenschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen fuer ein Protein enthaelt, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer das gewuenschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer ein Protein enthaelt, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) enthaelt, wobei das Gen fuer das gewuenschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1-Proteins ist. Fig. 7 B{Proteinherstellung; DNA-Sequenz codiert Protein mit Interferon-Regulatorsequenz * DNA-Sequenz codiert mit pharmazeutisch aktivem Protein; Cytokine; t-PA}

Description

Hierzu 15 Seiten Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch die Kultivierung von Wirtszellen, die durch DNA-Moleküle transformiert werden, die für ein gewünschtes Protein unter der Kontrolle dieses IRF-1-aktiven Proteins codieren.

Die Transkription von Genen in Säugetierzellen wird durch komplexe Mechanismen reguliert, in denen die Wechselwirkungen der Regulations-DNA-Sequenzen mit den trans-wirkenden DNA-Bindungsproteinen eine zentrale Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription stellen die für Interferone (IFN) codierenden Gene ein Merkmal dar, das vielen Cotykingenen eigen i Jt; die Transkription dieser Gene wird in einem transienten Zustand nach verschiedenen extrazellulären Signalen induziert. Es ist bereits gut dokumentiert worden, daß die Transkription der Gene für IFN-a und IFN-ß in einer Vielzahl von Zellen durch Viren wirksam induziert wird, während die Transkription des für IFN-γ codierenden Gens in T-Lymphozyten (T-Zellen) nach mitogener Stimulierung induziert wird (siehe Weissmann und Weber, 1986; Taniguchi, 1988). IFN-ß, ein Cytokin, das ursprünglich wegen seiner potenten antiviralen Wirksamkeit identifiziert wurde, scheint auch eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung zu spielen. In diesem Zusammenhang scheinen neben Viren und poly(rl):poly(rC), die die bekannten Induktoren des IFN-ß-Gens sind, auch viele Cytokine wie der koloniöstimulierende Faktor-1 (CSF-1) (Moore u. a., 1984; Warren und Ralf, 1986; Resnitzky u. a., 1986), der Tumornekrose-Faktor (TNF) (Onozaki u.a., 1988); der plättchenstämmige Wachstumsfaktor (PDGF) (ZuIIo u.a., 1985) und die IFN (Kohase u. a„ 1987) IFN-ß in bestimmten Zellen zu induzieren, was vermuten läßt, daß sie ähnliche oder identische Signale in die Zielzellen übertragen können.

Es wurde auch gezeigt, daß die IFN-ß-Geninduktion durch Viren und poly(rl):poly(rC) auf der Transkriptionsebene stattfindet (Raji und Pitham 1983; Ohno und Taniguchi, 1983; Dinter u.a., 1983; Zinn u.a., 1983). So wurden cls-wirkende DNA-Sequenzen, die als induzierbare Verstärker fungieren, in der 5'-Flankenregion des Human-IFN-ß-Gens identifiziert (Fujita u.a., 1985,1987; Goodbourn u.a., 1985; Dinter und Hauser, 1987). Die induzierbare Verstärkerregion (d.h. -65 bis -105 in bezug auf die CAP-Stelle) enthält sich wiederholende Hexanucleotideinheiten, von denen einige tatsächlich in der induzierten Aktivierung der Transkription bei der Multimerisierung wirken (Fujita u. a., 1987). In Säugetierzellen wiez. B. Maus-L929-Zellen und Human-Zellen wurden ein Faktor, IRF-1, der spezifisch an die IFN-ß-Regulationssequenzen bindet, sowie die funktionellon, sich wiederholenden Hexanucleotidsequenzen, (AAGTGA)«, identifiziert. Es wurde festgestellt, daß der IRF-1 eine wesentliche Rolle bei der virusinduzierten Aktivierung der IFN-ß-Gentranskription durch Wechselwirkung mit den identifizierten cls-Elementen spielt. Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten pharmazeutischen aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die entweder durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen für ein Protein enthält, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Soquenz enthält, die ein Gen für ein Protein codiert, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) enthält, wobei das Gen für das gewünschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1 -Proteins ist.

Vorzugsweise das Gen, das für das Protein, das die Wirkung einer IRF-1 hat, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines induziblen Promotors ist, beispielsweise virusinduzierbar, z. B. durch mitogene Stimulierung z. B. mittels Concanavalin A, induzierbar.

Vorzugsweise codiert das Gen für das IRF-1 aktive Protein für oder ist hybridisierbar an das DNA-Molekül, das für Human-IRF-1 oder Maus-IRF-1 codiert.

Das Gen für das IRF-1 wirkende Protein, ist vorzugsweise eine, das für ein Protein codiert, das an die wiederholte Oligomersequenz AAGTGA und die „upstream"-Regulationselemente des Human-IFN-ß-Gens bindet, vcizugsweise daher das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine IRF-1 Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen enthält.

Die Wirtszelle kann durch einen ersten Vektor transformiert werden, der ein Gen enthält, die für das IRF-1-aktive Protein codiert, und durch einen zweiten Vektor, der ein Gen enthält, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1 -aktiven Proteins codiert, für das das erste Gen codiert.

Vorzugsweise wird die Wirtszulle durch einen Vektor transformiert, der das Gon enthält, das für das IRF-1 aktive Protein codiert, und ein Gen, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1-aktivon Proteins codiert. Eine bevorzugte DNA-Sequenz (die für Human-IRF-1 codiert) ist durch ein Strukturen gekennzeichnet, das die folgende Formel I hat:

Formell

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT

110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 . 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 C20 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 QCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970 CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

oder eine degenerierte Variante davon.

Die DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturgc η gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"· und „downstreanV'-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel Il hat:

Formelll

cgagccccgccgaaccgaggccacccggagccgtgcccagtccacgc cggccgtgcccggcggccttaagaaccaggcaaccactgccttcttccct cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg ccgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaac

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100

TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150

TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970

catccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa gctggacttctgtgggcccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctccttgggtcattgacctctcagggcctggcagg CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCT₁GGGa agatgaggttctgagaccagtgtatcaggtcagggacttggacaggagtc agtgtctggctttttcctctgagcccagctgcctggagagggtctcgctg tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa caccaatcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttggcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag aggtgtacactaacatttcccccgagctcttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa atatgtacatttgtctttttataaaaagtaaaattgtt

oder eine degenerierte Variante davon.

Eine weitere bevorzugte DNA-Sequenz (die für Maus-IRF-1 codiert) ist durch ein Strukturgen der folgenden Formel III

gekennzeichnet:

Formel III

ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC' CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC AT.G AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC

CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGC GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG * CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

oder eine degenerierte Variante davon.

Eine derartige wie im vorhergehenden Absatz genannte DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel IV hat:

Formel IV

1 GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC

6 0 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG

119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC

178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG

227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA

272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATΓ CCA

317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC

3 62 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT

4 52 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG

4 97 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG ΑΛΑ GAG AGA AAG TCC AAG TCC

587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT

632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA

677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG

722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT

767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT

812 ATA CCA GAT AGC-ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC

857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG

902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG

94 7 CAC CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA

992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG 1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA 1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG 1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT 1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC

1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC

1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC

1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA

13 9 9 GCTGGCCCTCACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT

14 58 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 163 5 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCATTTATTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082

oder eine degenerierte Variante davon.

Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, die IRF-1-Aktivität besitzen, schließen DNA-Sequenzen

oukaryotischen Ursprungs ein, und zwar nicht nur Human- und Maus-, sondern auch Kücken-, Frosch- und Hefe-DNA-Sequunzen,

die mit den DNA-Sequenzen des vorgenannten Human- oder Maus-IRF-1 (Fig.I bis IV) hybridisieren und die für ein Protein mit

IRF-1 -Aktivität codieren.

Eine derartige cDNA-Sequenz, das an die cDNA von Maus-IRF-1 nach der Definition in Fig.4 A hybridisiert, wird im folgenden in

Formel lila vorgestellt.

Formellila

10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

. 50 60 70 80 90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA'

140 150 160 - 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 '250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

. 280 290 300 310

ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 380 390 400

aaaggaaagaaaccaaagacagaäa'a'agaagagagagttaagcac,

410 420 _ 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

4G0 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 57.0 · 5GO TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840 . 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 " 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCeCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGT

oder eine degenerierte Variante davon.

Diese DNA-Sequenz kann beispiolswoise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte

Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Rankensequenzen wie in der folgenden Formel IVa hat.

Formel IVa

tctcacccaagccgggga

ctaacttttagttttgctcctgcgattattcaactgacgggcttt catttccattttacacaccctaacaacactcacaccttgcgggat tgtattggtagcgtggaaaa.aaaaaaagcacattgagagggtacc

IO · 20 30 40

ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60 70 80 SO ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

140 150 160 ' 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 20 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

280 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 3SO 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC.

410 420 _ 430 440 450 ATCAAXAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 570 58C TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710 ' 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760

AGTCATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 810

AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

8Π 830 840 850

ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 ' 890 900

CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940

TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 930 990

CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1020

CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGTT AAGCCTTTGACTC7CCCTGGTGG7T.GT7GGGA

TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGT ATT AT ATTA7T-TTTT

TTCTCTATGATACCTATCTTAGACACATCTAAGGGAGAAAGCCTT

GACGATAGATTATTGATTGCTGTGTCCAACTCCAGAGCTGGAGCT

TCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATG

CGTATCTCTAGÄACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG

TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGAGGTGCfGCGTTGCC

TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG

AGAAAATGTGAACTAGCTGGAATTTTTTTATTCTTGTGAATATGT

acatagggcagtacgagcaatgtcgcgggctgcttctgcacctta

tcttgaagcacttacaataggccttcttgtaatcttgctctcctt cacagcacactcggcgaccccttctgtgtccactaccccactacc cacccctccctcctcaacccctccatcccggtcctctatgcgccc cttccccccaaccaatcccatcacaacctcttacctatcctttcc ctcccaaccccttctatcccagcccaccacctaccccactcctcc ccaactcctccattctagcccattacccacgcctctctcctcagc ccagcctaccccatcccaccctgttcctttcctccagtttcctct cctcaaaggcaaggctctacatcttggaggaggaggaggagaaga aaatgagtttcttcaccgctgtcccattttaagactgcttgaata ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg tacaaaggaaaactgtcatggaaatattatgcaaattcccagatc tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagctttttta

tttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttata

attttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatc

-14- 299 CCTTGTGGCACATTTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGmAAAAAIA

ACTTTTATGAGCTCATGTAGCAATCAAATTATCCTGTGGATTGAT

AATAAATGAATATGGTATATAGTTAAAGATTTTAAAAAAAAAAAA

oder eine degenerierte Variante davon.

Im folgenden wird die Isolierung von cDNA-Molekülen aus Humanzellen und Mauszellen beschrieben, die für Human- und Maus-IRF-1 codieren, bzw. aus Mauszellen und Hefe, die an die cDNA von Maus-IRF-1 und Human-IRF-1 hybridisieren.

Das recombinante DNA-Molekül kann auch eine Promotor- und Regulationssequenz wie in der folgenden Formol V entholten:

Formel V

Pstl

CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299

GC Box 1 GC Box 2

CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAA'GGGGCGcfccCCGCGGTAGCCCCJGGGGCGCJTGGCGCGG

GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC -193

CAAT Box

AACAGCCTGATTTCCCCGAÄATGATGAGGCCGAGTGGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG -135

kleine CAP-Stelle ' I '

.GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21

große CAP-Stelle plRF-L

ttcgcggcgccgcggactcgccagtgcgcaccactccttcgtcgaggtaIggacgtgct

-19 +1

TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG +39

CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97

CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155

Pstl

TCGCTCCTGCAG +213 +225

oder eine degenerierte Variante davon.'

Ein Vektor kann für die Expression eines pharmazeutisch aktiven Proteins wie beispielsweise eines Cytokins oder eines Plasminogenaktivators vorgesehen sein und wird in dieser Form vorzugsweise ein Strukturgen für ein pharmazeutisch aktives Protein operabel gebunden an eine Promotorregion des Gens für dieses Protein einschließlich einer Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Molekül enthalten.

Somit kann der Vektor eine wie im vorgegangenen erläuterte DNA-Sequenz und ein Strukturgen für ein gewünschtes pharmazeutisch aktives Protein unter der K jntrolle des IRF-1-aktiven Proteins, für das diese DNA-Sequenz codiert, enthalten. In

einem derartigen rekombinanten DNA-Molekül befindet sich das für das IRF-1-aktive Molekül codierende Gen vorzugsweise

unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder noch besser eines induzierbaren Promotors. Vorzugsweise schließt das

Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein eine IRF-Bindungsstelle ein, die repetitive AAGTGA-Sequenzen enthält. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle, z. B. eine Bakterienzelle z. B. E.coli, oder eine Hefezolle oder eine Säugetierzelle ζ. B. eine CHO-ZeIIe oder eine Mauszelle z. B. L929, die durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach der im Vorangegangenen erläuterten Bedeutung transformiert wurden. Idealerweise wird die Wirtszelle aus einer Zellinio ausgewählt,

die keine oder im wesentlichen keine endogene IRF-1-Aktivität zeigt.

Alternativ für die Produktion eines pharmazeutisch aktiven Proteins kann eine Wirtszelle transformiert sein durch ein erstes DNA-Mc lekül oder einen Vektor, die eine für ein Protein mit IRF-1 -Aktivität codierende Sequenz enthalten, und durch ein zweites

separates DNA-Molekül oder einen Vektor, die ein Gen enthalten, das unter der Kontrolle des IRF-1 -aktiven Proteins, für das das

erste DNA-Molekül codiert, für ein gewünschtes, pharmazeutisch aktives Protein codiert. Vorzugsweise umfaßt das erste, für das

IRF-1-aktive Molekül codierende DNA-Molekül einen konstitutiven Promotor oder am besten eine induzierbare Promotorsequenz, die operabel ist. Das zweite DNA-Molekül enthält vorzugsweise auch eine Bindungsstelle für das die

repetitiven AAGTGA-Sequenzen enthaltende IRF-1-aktive Protein.

Das IRF-1 -aktive Protein oder das pharmazeutisch aktive Protein kann durch Kultivierung der transformierten Zelle und Isolierung

des erzeugten Proteins auf herkömmliche Weise hergestellt werden.

Die Wirtszellen werden geeigneterweise durch Behandlung in einer Art und Weise, die dem Promotor entspricht, der operabel an

das für den IRF-1 codierenden Gen gebunden ist, induziert, wie in" folgenden erläutert wird.

Ein bevorzugtes Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Fo, mal Vl:

Formel Vl

Met Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu GIu Met Gin He Asn Ser Asn Gin He Pro GIy Leu He Trp He Asn Lys GIu GIu Met He Phe Gin lie Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His GIy Trp Asp He Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala He His Thr GIy Arg Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn Phe Arg Cys AIa Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ser Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu Pro Pro Leu Thr Arg Asn GIn Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser Pro Asp Thr Phe Ser Asp GIy Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser Leu Ser GIu Trp His Met GIn Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr Asp Leu Tyr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIy AIa AIa Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys Leu Phe GIu GIn Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp GIy Lys GIy Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr GlN Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu He Asp Ser Pro Arg GIy Asp He GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thr GIu Met Lys Asn Met Asp Ser He Met Trp Met Asp Ser Leu Leu GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa Pro

Ein weiteres bevorzugt js Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Formel VII: Formel VII

MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet

GlnlleAsnSerAsnGlnrieProGlyLeuIleTrpHeAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspHeAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspHeGluGluVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro

LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuPrcAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAspGluAspGIuGIuGIyLysLeuPro GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys LysGluGluProGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg LeuProSerIIeGInAIaIleProCysAlaPro

Noch ein weiteres bevorzugtes Protein, das durch die cDNA-Sequenz der Formel lila codiert wird, hat die folgende Formel VIII.

Formel VIII

"MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln

IleAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu

LysLysIlePheGlnlleProTrpMetKisAlaAUArsHlsGly TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPheArsAsnTrpAlal Ie

'HisThrGlyLysHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys

ThrTrpLysAlaAsiiPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsp i'leGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAla

PheArgValTi'rArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHis

IleLysGlnGluProVälGluSerSerLeuGIyLeuSerAsnGly ValSerGlyPheSerProGIuTyrAlaVälLeuThrSerAlalle

-17- 299 LysAsnGluVal AspSerThrValAsn Il ell eVal VaIGIyGi η

SerHisLeuAspSerAsnlleGluAspGlnGluIleValThrAsn ProProAspIleCysGlnValValGluValThrThrGluSerAsp AspGlnProValSerHetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSer

ProValSerSerTyr.AlaGiuSerGluThrThrAspSerV'alAla SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg

Ser 11 eGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGl yThrArsAsn ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsriLys

ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro TyrAsnSerSerTrpProProPheThrÄspLeuProLeuProAla

ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr ArgAlaSerValIleLysLysThrSerAspIleThrGlnAlaArg ValLysSerCys

Im Folgenden wird die molekulare Clonierung und Charakterisierung von Maus- und Human-cDNA, die für DNA-bindende Proteine, die die IRF-I-Aktivität besitzen, codieren, beschrieben.

Eine bemerkenswerte Sequenzerhaltung ist zwischen den Maus- und Human-IRF-1-Molekülen ersichtlich, './ie sich aus der Analyse der clonierten cDNAs ergab. Weiterhin zeigt sich, daß die Expression des für IRF-1 codierenden Gens durch das Newcastle-Virus (NVD) und durch Concanavalin A (Con A) in Maus-L929-Zellen bzw. Milzlymphozyten induziert wird.

1. Clonierung und Expression von IRF-I-DNA in E. coli

A. PoIy(A)⁺RNA wurde aus nichtinduziertenMaus-L929-Zellen isoliert und für die Synthese von cDNA (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987) verwendet. Die entstandene cDNA wurde anschließend an einen EcoRI-geschnittenen Agt11 -Vektor cloniert, und eine cDNA-Bibliothek wurde nach dem Standardverfahren von Huynh u. a., 1985, mittels E.coli ^Y1090 als Wirtsstamm konstruiert.

Die entstandene Xg111-Bibliothek wurde anschließend mittels der multimerisierten (4 mal) AAGTGA-Sequenz (im folgenden als das Cl-Oligomer bezeichnet; Fujita u.a., 1987) als Sonde gescreent.

Bei diesem Screening-Verfahren wurde E.coil Y1090, durch die rekombinanten Agtl 1-Phagen infiziert, auf rechteckige Platten

von 10x 13cm ausgestrichen. Die Platten wurden dann bei 12°C 4 bis 5 Stunden, wenn ungefähr 20000 Plaques/Platte zu sehen waren, inkubiert.

Die Membranfilter zum Screenen waren entweder aus Nylon (Nytran; Schloicher & Schnell) odor Nitrocellulose (Schleicher & Schnell). Die Filter wurden in 1OmM IPTG (zur Induktion der LacZ-Genexpression in den entsprechenden Phagenplaques) getaucht und an der Luft getrocknet, dann über die Platten gelegt und 2,5 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Die Plaques werden nur ein Protein erzeugen, für das die cDNA codieit, wenn die cDNA mit dem LacZ-Gen Im Rahmen ist.

Die Filter werden entfernt, 20 Minuten bei 4°C gekühlt und dann ohno Trocknen gescreent.

Die Membranfilter wurden dann wie folgt für den Test vorbereitet:

Aus Maus-L929-Zellen wurde der Kernextrakt hergestellt und auf die Membranen getüpfelt (in einer Menge, die etwa 10pg Protein entsprach).

Vor der DNA-Bindung wurde ein Bindungspuffer, der aus 1OmM Hopes, pH 7,5,5,OmM NaCI, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% Glycerol bestand, zugesetzt. 5% fettfreios Milchpulver (Yukijurishi Inc.) wurde zu dem Puffer gegeben, und die Filter wurden in diesem Gemisch 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert und anschließend 1 Minute im gleichen Puffer, der jedoch kein Milchpulver enthielt, gespült.

Die Filter wurden dann in Bindungspuffer (1 ml) inkubiert, der 350pg/ml Lachssperma-DNA mit oiner durchschnittlichen Länge von etwa 300bp und die "P-markierte Sonde aus CI-Oligomer-DNA (10^ecpm/ml; spezifische Aktivität 2000cpm/f Mol) enthielt (siehe Fujita u.a., 1987). Die Sonden-DNA wurde mit T4-Kinase an den 5'-Termini [γ-³²Ρ)ΑΤΡ endmarkiert.

Nach der Bindung wurden die Filter bei Raumtemperatur mit dem Bindungspuffer 1 bis 2 Stünden lang gewaschen (10 ml Filter), wobei der Bindungspuffer mehrere Male gewechselt wurde. Die Filter wurden dann an dor Luft getrocknet und autoradiographisch untersucht. Bei diesem Test ergaben die Nylonmembranen, jedoch nicht die Nitrocellulosemembranen, ein positives Signal, was durch Zugabe von überschüssigem nichtmarkiertem Cl-Oligomer spezifisch inhibiert wurde.

\uf diese Weise wurden etwa 1,4x 10'Rekombinanten gescreent. Unter den 32 positiven Phagenclonen, die beim ersten Screenen identifiziert wurden, war ein Clon (der als AL28-8 bezeichnet wurde), der wiederholt in aufeinanderfolgenden Screeningdurchgängen an die Sonden-DNA band.

2. Herstellung und Reinigung von Protein in transferiertem E.coil

Lysogene Bakterienclone wurden durch Transfektion von E. coli Y1089 mit AL 28-8 hergestellt. Die über Nacht stehengelassenen Lysogene, die AL 28-8 enthielten, wurden zu 1% in 400 ml L-Brühe eingeimpft. Die Bakterien wurden bei 31 °C gezüchtet, bis OD₆Oo gleich 1 war. Die Temperatur wurde dann für 20 Minuten auf 42⁰C erhöht. IPTG wurde dann zu 1OmM zugegeben, und nach weiterer 20minütiger Inkubation bei 38⁰C wurden die Kulturen schnell pelletiert und in 10ml Lysispuffer suspendiert, der aus 2OmM Hepes pH 7,9,0,2mM EDTA, 0,5mM Spermidin, 0,15mM Spermin, 0,1 mM DTT, 10% Glycerol, 0,5mM Phenylmethyonylsulfonylfluorid (PMSF), 1 pg/ml Pepstatin A, 1 Mg/ml Leupeptin, 500 μ Μ L-l-Tosylamid-2-phenylethylchloromethylbenzamidin, 1OmM N.atriummoiybdat, 2mM Natriumpyrophosphat und 2mM Natriumorthovanadat bestand. Die Zellsuspensionen wurden drei schnellen Gefrier/Auftau-Zyklen ausgesetzt und anschließend bei 30000U min'¹

I Stunde lang bei 4⁰C mittels eines Beckman 50Ti Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entweder direkt für einen Gelverzögerungstest (siehe unten) verwendet oder weiter gereinigt.

Die weiterr Reinigung wurde folgendermaßen ausgeführt:

Etwa 4ml Überstand wurden auf eine poly(di-C):poly(di-C)-Säule mit einem Bettvolumen von 2ml und mit Lysepuffer äquilibrieit, aufgegeben. Das Durchflußmaterial (4 ml) wurde dann auf eine DE 52 (Whatman) Säule mit einem Bettvolumen von 2ml und n<it Puffer Z (25mM Hepes, pH 7,8,12,5mM MgCI₂,1 mM DTT, 20% Glycerol, 0,1 % NP-40,0,5mM PMSF) äquilibriert, aufgegeben. Die DNA-Bindungsaktivität wurde durch den 0,1m KCI enthaltenden Puffer Z eluiert. DasEluat (etwa 4ml) wurde weiter mit Centrion-10 (Amicon) eingeengt. Die Endkonzentration des Proteins betrug 28mg/ml.

3. Charakterisierung des Proteinprodukts des Clons AL28-8 (1) Gelverzögerungstost

Lysogene Bakterienclon·?, die AL28-8 enthielten, wurden durch Transfektion von E.coli Y1089 hergestellt und wurden induziert, um die cloniertecDNA in großen Mengen mittels des Verfahrens von Huynh u.a., 1985, zu exprimieren. Lysogene Clone, die in der gleichen Art und Weise hergestellt und behandelt worden waren, denen das cDNA-lnsert (als A6 bezeichnet) fehlt, wurden als Kontrolle benutzt.

Aus den induzierten Lysogenkulturen wurden Extrakte hergestellt, die je 3μο Protein enthielten (vier Präparate, die als XL28-8a, AL28-8b und A6a und A6'j bezeichnet wurden).

Kernextrakt (3pg Protein) wurde ebenfalls aus Maus-L929-Zellen hergestellt.

Die Extrakte wurden mi' 1 f mol gekennzeichneter C1 -Oligomer-Sonde nach obiger Beschreibung mit einer spezifischen Aktivität von 8000cpm/f mol inkubiert.

Jeder Extrakt wurde auoh einem Vergleichstest unterzogen, in dem eine kompetitive DNA in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubationskultur gegeben wurde.

Die Ergebnisse dos Tests sind in Fig. 1 dargestellt, in der die verschiedenen Bahnen folgendem entsprechen:

Bahn Extrakt

1 nichts

4 A6bmit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarHortem Cl-Oligomer

5 A6b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiei iem C5A-Oligomer*

6 AL 28-8 a

7 AL 28-8 b

8 AL28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 1-Oligomer

9 AL28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer* 10 L929-Zelle

I1 L929-Zelle mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 1-Oligomer

12 L929-Zelle mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer*

• Das in Fujita u.a., 1985 beschriebene C5A-Oligomer ist eine 6mal wiederholte GAAA-Sequenz.

Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß Gebundene Sonden in den Bahnen β, 7,9,10 und 12 nachweisbar sind.

Wie In Fig. 1 gezeigt wird, ergaben Proteinextrakte aus den XL28-8-Lysogenen verschobene Bahnen (Bahnen 6 und 7), deren

Erscheinen durch den Überschuß an nichtmarkierter C 1-Oligomer-DNA inhibiert war, jedoch nicht in dom gleichen Maße wie bei C5A-Oligomer (Bahnen 8 und 9).

Im Gegensatz zu den XL28-8-stämmigen Proteinen ergaben diejenigen, die aus den induzierten X6-stämmigen Lysogenen hergestellt worden waren, keine derartigen verschobenen Banden (Bahnen 2-5). Die verschobenen Banden sind dicht bei denen von natürlichem IRF-1 aus Maus-L929-Zellen (Bahnen 10 und 12) zu sehon. Die in den beiden Reihen der verschobenen fanden existierenden Unterschiede sind als eine Folge der unterschiedlichen Mengen an Protein, das an di j Sonden-DNA gebunden ist, zusehen.

Weiter wird festgestellt, daß die verschobenen Banden nur bei den Proteinen aus IPTG-induzierten Y 1089-Zollen, die mit XL 28-8 transfektiert waren, nachweisbar waren.

(II) DNAase-Fußspuranalyse

Die Fußspurenanalyse wurde durchgeführt, um die Bindungseigenschaften des durch XL28-8-cDNA codierton Proteins an eine DNA, die für die IFN-ß-Gen-„upstream"-Region codiert, zu testen.

Das durch XL28-8-cDNA codierte Protein wurde aus dem induzierten Lysogen extrahiert und teilweise durch Säulenchromatographie wie oben beschrieben gereinigt und auf seine Bindungseigonschaften an eine DNA, die die IFN-ß-Gen-

„upstream"-Region enthält, geprüft. ·

Die Sonden-DNAs wurden als Sall-Hindlll-Fragmente hergestellt, die aus p-125cat (das das Wildtyp IFN-ß-Gon enthält) und p-125 DPcat (das ein mutiertes IFN-ß-Gon enthält) isoliert wurden. Das Plasmid p-125cat wurde als p-105cat konstruiert (Fujita

u. a., 1987), mit der Ausnahme, daß das Fragment BamHI(-125)-Tagl (+19) aus pSE-125 (Fujita u.a., Cell, Bd. 41, S.489-496,1985) verwendet wurde. Das Plasmid p-125DPcat, das Punktmutationen innernalb der IFN-ß-Regulationselemente trägt, wurde durch synthetische ortsspezifische Oligonucieotidmutagenese an p-125cat wie bei Hatakeyama u. a., Proc. Natl. Aced. Sei. USA, Bd.83, S.9650-9654,1986) beschrieben, gewonnen. Beide DNAs wurden durch (y-³²P]ATP mittels T4-Kinase an der Hindlll-Stelle markiert.

4f. Mol Sonden-DNA (spezifische Aktivität 3OOOcpm/f. Mol) wurden in 20μΙ Reaktionsgemisch, das 25 mM Tris-HCI, pH 7,9, 6,25mM MgCI₂,5OmM KCI, 1 mM EDTA, 0,5mM DTT, 10% Glycerol, 2% Polyvinylalkohol enthielt, mit oder ohne 280Mg gereinigtes Protein inkubiert.

In dem Test wurden 5x 10~⁴ Einheiten DNAaso I (Worthington) zugefügt und 1 Minute bei 25°C inkrbiert.

Fig. 2 zeigt Autoradiogramme dor aus den Proben gewonnenen DNA-Fragmente, die während der folgenden Verfahren gewonnen wurden. Auf der linken Seite von Fig. 2 ist der Teil der DNA-Sequenz der Wildtyp-IFN-ß-Sonde dargestellt, und auf der rechten Seite der Teil der DNA-Sequenz der mutierten IFN-ß-Sonde.

1. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten (siehe Methods in Enzymology, Bd. 65, S.499-560) - das Ergebnis wird in Bahn 1 gezeigt.

2. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde teilweise durch DNAase I ohne Schutz digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 2 gezeigt.

3. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und dann mit DNAase i digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 3 gezeigt.

4. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein in Gegenwart eines 10OOfachen molaren Überschusses an nichtmarkiertem C 1-Oligomer umgesetzt und anschließend mit DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 4 gezeigt.

5. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und anschließend durch DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 5 gezeigt.

6. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten - das Ergebnis wird in Bahn 6 gezeigt.

In Fig. 2 werden die in den Bahnen 3 und 5 gefundenen geschützten Regionen entsprechend den auf der linken bzw. rechten Seite des Autoradiogramms dargestellten Sequenzen gezeigt. Die Hexamermotive sind eingerahmt.

Aus den Ergebnissen in Fig. 2 ist ersichtlich, daß die geschützte Region den Nucleotiden -100 bis -64 entspricht und dies die Region ist, die durch aus L929-Zellen gewonnene IRF-1 geschützt wird. Der Schutz wurde durch die Verwendung von überschüssigem nichtmarkiertem C1 -Oligomer (Bahn 4) aufgehoben. Bei Verwendung geringerer Proteinkonzentration wurde auch . estgestellt, daß die das AAGTGA-Motiv (-80 bis -70) enthaltende Region bevorzugt geschützt war.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Protein eine höhere Affinität zu der das AAGTGA-Motiv enthaltenden Region und eine geringere Affinität zu der Nachbarregion hat.

Das rr\utierte IFN-ß-Gensegment trägt T- G-Mutationen an den Positionen -106, -100, -73 und -67. In den Vergleichsbahnen 5 und 2 unter den gleichen Testbedingungen erscheint der durch die rekombinanten Proteine gewährte Schutz an der nichtmutierten Region eingeschränkt (Bahn 2). Diese Beobachtung stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Einführung dieser Mutationen zu einer drastischen Reduzierung (20fach) der Induzierbarkeit der Transkription durch NDV in L929-Zellen führt und daß die In-vitro-Bindung von IRF-1 an das mutierte IFN-ß-Gen nur in der nichtmutierten Region feststellbar war.

Weiter zeigt die Verwendung des C1-Oligomers, daß das Protein spezifisch die Region schützt, die die Oligomersequenzen enthält. Dieser Schutz entspricht vollkommen dem, der durch nativen IRF-1, der aus L-929-Zellen stammt, gewährt wird.

3. DNA-Konkurrenztest

Dieser Test wird ausgeführt, um die Affinität des rekombinanten Proteins zu verschiedenen DNA-Sequenzen einschließlich einigen bekannten Transkriptionsregulations-DNA-Sequonzen zu untersuchen. Das Verfahren wird folgenderweise durchgeführt:

Das Hindlll-Sall-Fragment der IFN-ß-Sonde wurde aus p-125cat isoliert (siehe Fujita u. a., 1987); dieses Fragment enthält die Human-IFN-ß-Gensequenz von +19 bis -125. Die DNA wurde an den 3'-Termini durch Füllen beider Enden mit Ia-³²P) dCTP mittels Klenow-Fragment markiert.

Die spezifische Aktivität der Sonden-DNA betrug 8000cpm/f. Mol,

Die Gelverzögerungstests wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

In den Durchläufen des Konkurrenztests wurde, wie in Fig. 3 gezeigt, die DNA mit dem Protein in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Konkurrenz-DNAs in dem Bindungsgemisch umgesetzt.

Der Bildungswert des Komplexes wurde durch densitometrische Analyse des Autoradiogramms quantitativ bestimmt. Die Komplexbildung in Abwesenheit von Konkurrenz-DNA wurde öls 100%angenommen.

Die Struktur der Konkurrenz-DNAs sah folgendermaßen aus:

a) AP-1: eine synthetische DNA mit folgender Sequenz

5¹CTAGA(TGACTCAIeG 3' 3¹T(ACTGAGT)₆CCTAg 5'

b) TNF: 37bp lange synthetische DNA, die von +1162 bis +2116 (siehe Nedwin u.a., 1985) des ersten TNF-a-Introns reicht;

c) Maus-Η 2-D^d: 37 bp lange synthetische DNA, die das von Korber u. a., 1988 beschriebene IRS-Elemont (-159 bis -123) umfaßt;

d) Human-IFN-α: 46bp lange synthetische DNA, die dem Virus-Antwortelement (Virus Response Element) entspricht (siehe Ryals u.a., 1985).

θ) Hexamersequenzen C1, C2, C3, Cd und C5A.

Die Sequenzen C1 und C5A sind die oben beschriebenen. Die Sequenzen C2, C3 und C4 sina die in Cell, 49,352-367 (1987) beschriebenen. Sie stellen die Sequenzen

AAATGA - C 2 AAGGGA - C3und AAAGGA - C4

f) dielFN-ß-Gensequenzvon +19 bis -66.

Die linke Tafel in Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Hexamerwiederholungen als Konkurrenten verwendet wurden. Die mittlere Tafel zeigt die Ergebnisse, wenn Human-IFN-Gensegmente als Konkurrenton eingesetzt wurden, und die rechte Tafel zeigt die entsprechenden Ergebnisse, wenn die in der Tafel angegebenen unterschiedlichen DNA-Segmente verwendet wurden.

Aus den Ergebnissen in Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Erscheinen der verschobenen Bande durch die Hexamersequenzen in dieser Reihenfolge der Wirksamkeit C1-C2-C3-C4 verdrängt wurde, jedoch signifikant nicht verdrängt wurdo durch C 5 A. Es kann auch beobachtet werden, daß die synthetischen DNA-Segmente, die die Regulationselemente von entweder Human-IFN-a1 oder Maus-H-2D^d-Genen umfassen, zu einer kompetitiven Aktivität Anlaß geben. Dies ist insbesondere interessant, da das DNA-Segment des H-2 D^d-Gens die sogenannte IFN-Antwortsequenz (IRS) enthält, die als ein Verstärker fungiert, wenn die Zellen auf IFN reagieren (Sugita u.a., 1987; Israel u.a., 1986; Korber u.a., 1988).

Tatsächlich werden ähnliche oder gleiche Sequenzmotive wie auf dem IFN-ß-Gen in vielen Promotorsequenzen der IFN-induzierbaren Gene gefunden, wo Kernfaktoren spezifisch zu binden scheinen (Korber u. a., 1988; Lery u.a., 1988). Die in Fig. 3 gegebenen Ergebnisse ähneln sehr denen, die gewonnen werden, wenn der Test unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von natürlichem, aus L929-Zellen produziertem Protein wiederholt wird.

Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA

Die DNA-Sequenz der clonierten DNAs wurde entweder durch die Didesoxymethode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) oder durch das Standardverfahren von Maxam und Gilbert, 1980) bestimmt.

Das AL2ß-8-lnsert in E.coli Y1089 wurde folgendermaßen isoliert: Die Phagen-DNA wurde durch das Standardverfahren hergestellt und die DNA wurde durch EcoRI digeriert, dann wurde die aus der Phagen-DNA ausgeschnittene cDNA mit Hilfe der Didesoxymethode (Sequenase: United States Biochemical Inc.) isoliert und sequenziert. Die Länge des cDNA-lnserts in AL28-8 betrug 1,8kb. Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte einen großen offenen Leserahmen in Phase mit dem ß-Galactosidgen.

Zum Screenen von Clonen, die größere cDNA-lnserts enthalten, wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert mit L929-Zellenstämmiger poly(A)*RNA und in den Vektor CDM 3 cloniert nach dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd.84, S.8573,1987) und Seed (Nature, Bd.329, S. 840-842,1987).

Die rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm MC1061/p3 eingeführt (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, liehe oben), und die Clone der cDNA wurden mittels AL28-8-stämmiger ("P-markierter)-cDNA-Sonde unter strongen Bedingungen für DNA-DNA-Hybridisierung gescreent (Kashima u.a., Nature, Vol.313, S.402-404,1985), und ein Clon pIRF-L wurde zur weiteren Untersuchung selektioniert.

Das gewünschte cDNA-lnsert von pIRF-L wurde durch Digestion mit Hindlll und Xbal gewonnen und durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Sequenz wird in Formel IV und in Fig.4 gezeigt.

Es stellte sich heraus, daß die cDNA-Sequenz aus XL 28-8 eine identische Sequenz in der überlappenden Region enthielt, mit der Ausnahme, daß ein Α-Rest zwischen den Nucleotiden 1773 und ISI fehlte.

Die 5'- und 3'-Termini der AL28-8-stämmigen cDNA sind durch Pfeile in Fig.4 gekennzeichnet. Die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die möglicherweise die mRNA-lnstabilität übertragen, sind eingerahmt.

Wie aus Fig.4 A ersichtlich wird, war die cDNA der Maus-cDNA, die von pIRF-L abgeleitet war, 198 bp lang und damit 20 bp länger als die von \L28-8-cDNA in den 5'- bzw. 3'-Regioneii.

Die Analyse der Genom-DNA-Sequenz, die die Promotorregion dieses Gens enthält, zeigt, daß die cDNA von pIRF-L etwa 30bp von der größeren CAP-Stelle fehlt, siehe unten und Formel V und Fig. 7.

Die unmittelbare „upstreanV'-Sequenz des ersten ATG-Codons, GGACCATGC, paßt gut in die Kozaksche Consensus-Sequenz GCC§CCATGG für die Translationsinitationsstelle.

Eine ATG-Sequenz im Rahmen wurde in der „upstreanV'-Sequenz von der oben erwähnten ATG-Sequenz aus nicht gefunden, was bestätigt, daß dies tatsächlich das Initationscodon für die IRF-l-mRNA ist.

Wie bereits erwähnt, wurde in der Nucleotidsequenz keine Differenz zwischen den cDNAs von XL28-8 und pIRF-L innerhalb der überlappenden Regionen gefunden, mit Ausnahme eines Nucleotide in der S'-nichtcodierenden Region.

Die Maus-IRF-I bestand damit aus 329 Aminosäuren mit einer berechneten relativen Molekülmasse von 37,3KD. Kanonische N-Glycosylierungsstellen erscheinen nicht in der Sequenz.

Zu anderen bekannten Proteinen wurde bei Recherchen in Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,

D. C.) und bei erst kürzlich veröffentlichten Sequenzen keine signifikante Homologie nachgewiesen.

Die Hydropathieanalyse nach Kyte und Doolittle, 1982, zeigt, daß das Protein als Ganzes hoch hydrophil ist (Fig.4B).

Die Untersuchung der abgeleiteten Primärsequenz des Maus-IRF-I zeigt die folgenden Merkmale:

Die endständige Aminohälfte, zur Aminosäure 140 verlängert, ist reich an Lysin (Lys) und Arginin (Arg). Tatsächlich sind 31 dor 39 Lys- und Arg-Reste in dieser Region lokalisiert. Im untoren Teil von Fig.4B ist im Diagramm eine Zusammenfassung der Lokalisierung der basischen Aminosäuren (Arg, Lys) (nach obon gerichtete Säulen) und der sauren Aminosäuren (Asp, GIu) (nach unten gerchtete Säulen) dargestellt.

Wie in Fig.4B gezeigt, weist diese Region eine starke Hydrophilie auf und wird als die Region angesehen, die hauptsächlich für die IRF-I-Bindung an die spezifischen DNA-Sequenzen verantwortlich ist.

In diesem Zusammenhang waren die für viele DNA-bindenden Proteine charakteristischen Motive wie Zinkfinger und Helix/ Helix-Motive (Pabo und Sauer, 1984, Evans und Hollenberg, 1988) in dem IRF-I-Protein nicht nachweisbar.

Im Gegensatz dazu zeigt der Rest des Moleküls (d.h. die endständige Carboxylhälfte einen relativen Überfluß an Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (GIu), Serin (Ser) und Threonin (Thr). Von 189 Aminosäuren (von Aminosäure 140 bis

329) sind 33 (17%) saure Aminosäuren und 36 (19%) sind Ser und Thr. Beachtenswert ist, daß ein Cluster von 5 aufeinanderfolgenden sauren Aminosäuren in den Aminosäuren 227 bis 231 gefunden wurde. Ser und Thr scheinon viele Cluster zu bilden (Aminosäureregion bei 153-156,190-192, 206-208, 220-222; die hier als die S-T-Regionen bezeichnet werden). Die S-T-Regionen werden durch kleine offene Rechtecke in der unteren Tafel von Fig.4 B dargestellt.

Struktur der Human-IRF-I codierenden cDNA

Nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise für Maus-IRF-I wurde Human-IRF-l-cDNA cloniert und

sequenziert. '

Eine Human-cDNA-Bibliothek wurde durch Synthetisierung von cDNA mittels poly(A)*RNA aus einer Human-T-Zellinie Jurkat hergestellt. Die doppelsträngige cDNA-Syntheεο und anschließende Clonierung in den Plasmidvektor CDM8 wurde entsprechend dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc.Natl. Acad.Sci., USA, Bd.84, S.8573-8577,1987) und Seed (Nature, Bd. 329, S. 840-842,1987) durchgeführt.

Die rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm MC 1061/p 3 mittels dos Verfahrens von Aruffo und Seed (siehe oben) eingeführt.

Die Clone, die mit Maus-IRF-l-cDNA kreuzhybridisieren, wurden zum Screenen mit \L 2G-8-cDNA ("P-markiert) als Sonde unter wenig strengen Bedingungen für die DNA-DNA-Hybridisierung verwendet. Die angewandten Bedingungen waren genau die gleichen wie bei Kashima u.a. (Nature, Bd.313, S.402-404,1985) beschrieben.

Aus den positiven Clonen wurde Clon pHIRF31, der das längste cDNA-lnsert enthielt, selektioniert.

Die gewünschte cDNA-Soquenz von Clon pHIRF31 wurde durch Digestion der Plasmid-DNA durch Xhol isoliert und danach durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Struktur des Human-IRF-I-Gens wird in Formel Il und Fig.8 gezeigt.

Die Sequenzen für das abgeleitete Maus- und Human-IRF-I sind zum Vergleich in Fig. 5 untereinander dargestellt.

Die Analyse der Human-DNA zeigte, daß diese IRF-I um vier Aminosäuren kürzer ist als die iviaus-IRF-l.

Die starke Erhaltung der Aminosäuresequenzen läßt sich zwischen den beiden IRF-I-Molekülen erkennen. Insbesondere 133 der 140 Aminosäuren (95%) der Aminoendhälften können als gleich angesehen werden.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die obigen Beobachtungen zeigen, daß IRF-I eine neue Klasse von DNA-bindendem Protein ist.

Es sei auch darauf hingewiesen, daß die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die in vielen Cytokin- und Protoonkogen-mRNAs gefunden werden, in der3'-nichttranslatierten Region der Maus-IRF-l-cDNA vorhanden sind und daß auch die Sequenz ATTTA in der entsprechenden Region der Human-IRF-l-cDNA gefunden wird. Von diesen Sequenzen nimmt man an, daß sie in der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression eine Rolle spielen, indem sie der mRNA Instabilität übertragen (Shaw und Kamen, 1986; Caput u.a., 1986).

Das Plasmid plRF-L wurde in E.coli MC 1061/p3 transferiert, das als E.coli MC106/p3 (plRF-L) am Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2005 hinterlegt wurde.

Das Plasmid plRF31 wurde in gleicherweise in E.coli MC1061/p3 transfektiert, das als E.coli MC106/p3 (plRF,-31) am FRI entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2006 hinterlegt wurde.

Regulation des IRF-Gens

1. Expression der IRF-l-mRNA

In Anbetracht der Tatsache, daß IRF-I Affinitäten zu Regulationssequen?en von anderen Genen als dem IFN-ß-Gen beweist und somiran der Regulation einer Reihe von Genen in verschiedenen Zelltypen beteiligt ist, wurde die Expression der IRF-l-mRNA in Mauszellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen stammten, mit Maus-cDNA als Sonde untersucht. Zur Herstellung dieser Sonde wurde M13 mp 10 Phagen-DNA (siehe unten), die den codierenden Strang von IRF-I-Gen-Pstl-Fragment enthielt, als Matrize zur Synthetisierung der ³²P-markierten „anti-sense" DNA verwendet. Das Produkt wurde durch EcoRI digeriert, und die Sonden-DNA wurde, wie bei Fujitau.a, (1985) beschrieben, isoliert.

Die gesamte RNA wurde nach dem bewährten Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, isoliert.

Die Blot-Analyse wurde dann im wesentlichen wie bei Thomas (1980) beschrieben durchgeführt, der Röntgenfilm wurde 3 Tage belichtet, und die Ergebnisse sind in Fig. 6A gezeigt. Die verschiedenen Bahnen stellen die Ergebnisse der Durchgänge dar, bei denen Ganzzell-RNA aus den folgenden Geweben verwendet wurde:

Bahn 1 Hirn

Bahn 2 Herz

Bahn 3 Leber

Bahn 4 Lunge

Bahn 5 Milz (nicht stimuliert)

Bahn 6 Thymus

Bahn 7 Niere

Bahn 8 Muskel

Bahn 9 Darm

Bahn 10 Milz (nicht stimuliert)

Bahn 11 ConA-stimulierte Milz

In den Durchgängen für jode Bahn wurdon 5pg der Ganzzell-RNA verwendet, mit Ausnahme von Bahn 8, boi der nur 1,2Mg RNA verwendet wurden.

Aus Fig.6A ist ersichtlich, daß eine Bande, die etwa 2,0kb entsprach, in don moisten RNA-Probon durch diose Blot-Analyso nachgewiesen wurde, obwohl der mRNA-üxprossionswort niedrig zu sein schien. Es ist bemerkenswert, daß dur Expressionswert von mRNA In den Lymphozyton aus der Milz nach der Stimulierung durch ConA (Bahn 11) drastisch zunahm.

In einem weiteren Test wurden Maus-L929-Zellen durch NDV induziert wie im vorangegangenen boschriobon (Fujita u. a., 1985), und die Zytoplasma-RNA wurde nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, alle drei Stunden nach der Infoktir -xtrahiert.

Sonden-DNAs wurden aus den folgenden verschiedenen Sequenzen hergestellt und durch die „multiprime"-Markierungsreaktion (Amersham) markiert, und zwar

(i) ein 1,8kb EcoRI-Fragment aus AL28-8 (spezifische Aktivität 2x IO'cpm/μο); (ii) ein 0,5kb BamHI-Bg 11l-Fragment aus einem Maus-IFN-ß-Genomclon (spezifische Aktivität 5x 10^ecpm/pg) und (iii) ein 2,0kb BamHI-Pvull-Fragment eines Clons, das ein Human-ß-Actinpsoudogon enthalt (spozifische Aktivität 5x 10⁸cpm/pg).

Die Ergebnisse sind in Fig.6B dargestellt. Die Blot-Analyso wurde wie oben beschrieben durcligoiuhrt, wobei das Vorfahron von Thomas (1930) angewandt wurde.

Jede Bahr erhielt 10pg Zytoplasma-RNA. Dor Röntgenfilm wurde 3 Stunden belichtet. Die densitomotrische Analyse zeigte, daß die IRF-l-n'DRNA9-12 Stunden nach der NDV-Infektion um das 25fache zunahm.

Obwohl die Zunahme an mRNA drastisch ist, ist es ein transientes Ereignis, es erreicht seinen Höhepunkt bei 9 bis 12 Stunden und gleicht sich 12 Stunden nach der Induktion aus. Die mRNA-Anraicherung geht der Anreicherung an IFN-ß-mRNA voraus; wie aus Fig. 6B ersichtlich ist, läßt sich die Induktion von IRF-l-mRNA beroits 3 Stunden nach der NDV-Infektion beobachten, während die IFN-ß-mRNA bei gleichen Blot-Bedingungen für beide RNAs erst 6 Stunden danach nachwoisbar ist.

DerlRF-l-Promotor

Wie im vorangogangenen demonstriert wurde, wird das IRF-I-Gon transkriptionell durch verschiedene Agenzien wie Viren und Mitogene reguliert.

Die Souther-Blot-Analyse der Chromosomen-DNA zeigte, daß das IRF-I-Gen gespleißt werden kann und nicht in der Maus „multimembered" ist.

Eine λ-Phagenbibliothek, die Baby-Maus-DNA enthielt, wurde nach den Clonen gescreent, die die IRF-I-Promotorsequenz enthalten, wobei die gleiche λ L28-8stämmige cDNA-Sonde wie oben verwendet wurde. Es wurdon vier positive Clone identifiziert, von denen bei allen die gleiche Genom-DNA festgestellt wurde und eine davon für die weitere Analyse verwendet wurde (Xg 14-2). Ein Pstl-Fragment wurde in die Pst-I-Stelle von pUC 19 subcloniert, um p19IRFP zu konstruieren.

Die gleiche DNA wurde danach in die Pstl-Stolle von M13 mp 10 und M 13mp11 cloniert, die zur Erzeugung von DNA für die Sequenzanalyse verwendet wurden.

Die Nucleotidsequenzanalyse des Pstl-Fragmonts aus den obengenannten Clonen wurde wie bereits beschrieben durchgeführt.

Große und kleine CAP-Stellen wurden durch Sl-Kartierungsanalyse identifiziert.

Die bestimmte Sequenz wird in Fig.7A gezeigt. Wie daraus ersichtlich ist, paßt die „downstream"-Sequenz der DNA ausgezeichnet zu der von plRF-L abgeleiteten cDN A.

Die S1 -Nucleaseanalyse zeigt das Vorhandensein von zwei CAP-Stellen für die IRF-l-mRNA, in der sich die größere Stelle etwa 20 Nucleotide „downstream" von der kleineren Stelle befindet. Typische TATA-Boxsequenzen sind in der „upstreanV'-Region des Gens nicht vorhanden. In Anbetracht der ungewöhnlichen Fülle an CpG-Sequenzen stellt diese Region wahrscheinlich eine „HTF-Insel" dar (Bird, 1986).

Die Promotorregion enthält zwei GC-Boxen und eine CAAT-Box (siehe Fig. 7 a); die ersteren Boxen müßten SpI binden (Kadogan u.a., 1986) und die letzteren CP-1 oder CP-2(Chodosh u.a., 1988).

Das die Promotorsequenzen enthaltende Pstl-Fragment wurde dann auf folgende Art und Weise auf seine Reaktivität als Antwort auf extrazelluläre Signale, z. B. Virusinduzierbarkeit, getestet.

Ein chimäres Gen wurde konstruiert, in dem ein Reportergen, unc¹ zwar ein bakterielles Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)-Gen „downstream" vom Pstl-Segment anstieß. Dies geschah durch Ausschneiden eines Pstl-Fragmentes aus P19IRFP (siehe oben) durch BamHI und Hindlll und Clonierung des erhaltenen Fragmentes in das Bglll-Hindlll-Rückgratfragment von pA,_ocat₂ (Rosenthal u.a., 1983), um plRFcat herzustellen.

Verschiedene weitere Konstrukte wurden folgendermaßen hergestellt:

plRFAcat wurde durch Digerieren des ρ 19IRFP-stämmigen BamHI-Hindlll-Fragmentes mit Haelll hergestellt, dessen einzelne Erkennungsstelle bei -30 bis -35 von der größeren CAP-Stelle (Fig.5 A) liegt. Das entstandene Haelll-Hindlll-Fragment wurde mit BGIII-Hindlll-Rückgratfragment von pA,_ocat₂ und der folgenden synthetischen DNA ligiert:

5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3' 3¹GATCTAAaGAAGCGC 5'

Damit enthielten sowohl plRFcat als auch plRFAcat Sequenzen bis zu -320 bzw, -48 von der größeren CAP-Stolle aus.

p-125cat enthält die Promotorsequenz des Human-IFN-ß-Gens wie bei Fujita u.a., 1987, beschrieben.

pSV2cat ist in Gorman u.a., Science, Bd.221, S. 551-553 beschrieben.

Als Referenzgen wurde pSRVgpt verwendet (siehe Gorman u.a., s.o.).

Die unterschiedlichen Gene wurden mittels der Calcium-Phosphat-Methode (Fujita u.a., 1985) in Maus-L929-Zellen transferiert.

5 χ 10^e Zellen wurden mit 7,5pg des das CAT-Reportergen und 2,5pg pRSVgpt enthaltenden Testplamids transferiert. Die Zellen wurden durch NDV induziert oder „mock"-induziert und anschließend dem Enzym-Test wie bei Fujita u.a., 1985, beschrieben unterzogen.

Zur Berechnung der relativen CAT-Aktivität wurde die CAT-Aktivität aus den „mock"-induzierten Zellen, die mit pSV2cat transferiert waren, als 100% angenommen. Jede CAT-Aktivität wurde durch Ecogpt der entsprechenden Proben normalisiert (Mulligan und Berg, Proc.Natl. Acad.Sci.USA, Bd.78, S.2072-2076). Die Proben, in denen CAT unter dem Hintergrundwert lag, wurden mit b. b. (below background level) gekennzeichnet.

Die Ergebnisse sind in Fig.7 B dargestellt.

Es ist erkennbar, daß die Transfektion von plRFcat in Maus-L929 die Expression der CAT-Aktivität mit niedrigem Wert

verursachte. Der CAT-Expressionswort wurde erhöht, wenn die transfoktiorton Zollon durch NDV stimuliert wurden. Die Dolotion der 300-bp-„upstnam"-Soquonz dos IRF-I-Gons (plRFAcat) hob faktisch sowohl die konstitutive als auch die induzierto Expression dos CAT-Gens auf. Dios zoigt, daß dio Promotorsoquonz innorhalb dor 300-bp-„upstroam"-Rogion Mögt und virusinduzierbar ist.

Konstruktion von Expresslonsplasmldon

1. Phagon-DNA von Clon M.28-8 wurdo durch EcoRI digeriert, und das Insort wurdo gowonnon. Dio EcoRI-Stollon clor cD^Awurden durrh T4-DNA-Polymoraso goglnttot und anschlioßond mit synthetischen Adaptor-DNAs, dio dio

Sequenz pGATCCATTGTGCTGG und pCCAGCACAATG besaßen, ligiort, s. Aruffo und Soed 1987. Nach Entfernung der synthetischen DNAs durch gradiento Zontrifugierung mit 5-20% Kaliumacotat (Aruffo und Sood, 1987)

wurde die IRF-l-cDNA mit den an boidon Enden geknüpften Adaptor-DNAs mit BstXI-goschnittonor CDMe-Voktor-DNA liyiort(Seed, B, Nature, Bd.329,S.840-842,1987). üio Plasmido plRF-S und plRF-A, dio die IRF-l-cDNA in der „sonso"- und „antisonso"·

Ausrichtung in bezug auf den CMV-Promotor enthielten, wurden isoliert. Jode Plasmid-DNA wurdo ontwodor mit p-55cat odor p55CIB (Fujita u.a., 1987) in L929-Zollon co-transfoktiort und dor CAT· Expressionswert wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabollo 1 unton dargostollt: Tabelle 1 «

	Transfektierte Plasmide	Induktion durch NDV	CAT-Aktivität (% Umwandlung)
	plRF-S p-55cat	-	<1%
	plRF-S P-55CIB	—	50%
Experiment 1	plRF-A p-55cat	-	< 1 %
	piRF-A	-	<1%
	plRF-S P-55CIB	—	1,7%
	plRF-S P-55CIB	+	3,6%
Experiment 2	plRF-A P-55CIB	-	<0,1%
>	plRF-A p-boCIB	+	<0,1%

Die DNA-Transfektionsoffizienz hängt vom Zustand der Rezipientenzellen (in diesem Fall Maus-L929-Zellon) ab. Die Effizienz war

in Experiment 2 viel niedriger als in Experiment 1, der CAT-Expressionswert ist daher vergleichsweise niedriger als in

Experiment 2. Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die signifikante CAT-Aktivität nur in durch p-55CIB und p-IRF-S transferierten Zellen nachweisbar. Sie zeigen, daß dor IRF-I an die wiederholten (8mal) AAGTGA-Sequenzen, die „upstream" des CAT-Gens in P-55CIB vorhanden sind, bindet ι I daher dio Transkription des distalen CAT-Gens fördert. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, iß der CAT-Expressionswert durch Infektion der transferierten Zellen mit NDV (Tabelle 1)

erhöht wird (um mehr als das doppelte), was zeigt, daß die Kontrolle der Genexpression durch unterschiedliche Stimuli wiebeispielsweise Viren möglich ist.

2. Ein Expessionsplasmid für die Produktion eines Proteins, das aus IRF-I-DNA bindender Domäne und

Transkriptionsaktivierungsdomäne von Hofe-GAL4 bestand, wurde folgendermaßen konstruiert: Das Plasmid plRF-S wurde durch Hindill und Pstl digeriert, und das cDNA-lnsert wurde isoliert. Dio cDNA wurde durch Dralll

digeriert, und das Hindlll-Dralll-Fragm nt (etwa 550bp) wurdo gewonnen und als Fragment A bezeichnet.

Der Expressionsvektor CDM 8 wurde durch Hindill und Xbal digeriert, und dio Rückgrat-DNA wurde isoliert und als Fragment B

bezeichnet.

Die für die Hefe-GAL4-Transkriptionsaktiviorungsdomäne codierende DNA wurde aus Plasmid pRB968 folgendermaßen isoliert

(Ma und Ptashne, 1987):

Die pRB968-DNA wurde zuerst mit Hindill digeriert, und die Enden wurden durch T<1-DNA-Polymerase geglättet. Synthetische Xba-I-Linker-DNA wurde zu dor DNA gegeben, und dio DNA wurdo dann durch Pvull und Xbal digeriert. Das entstandene ca. 600bρ lange Pvull-Xbal-DNA-Fragment wurde gewonnen und als Fragment C bezeichnet. Zusätzlich wurdo eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz hergestellt:

(5'IGTGTCGTCCAGO') (3')GCACACAGCAGGTC(5')

und als Fragment D bezeichnet.

Ein ^xpressionsvektor plRFGAL4 wurde durch Ligation der Fragmente A, B, C und D konstruiert. Als Kontrollplasmid wurde Plasmid plRFAGAL4 durch Ligation der Fragmente A, B₁C und oiner synthetischen DNA mit der folgenden Sequenz konstruiert:

(B'IGTGTCTGACAGO¹) (3')GCACACAGATGTC(5·)

Da ein Terminatortriplett, TGA, im Rahmen zwischen den IRF-I- und GAL4-Sequenzen in plRFAGAL4 vorhanden ist, müßle dem exprimierten Protein die GAL4-Aktivioiungsdomäno fehlen.

Um die funktionellen Eigenschaften des Plasmids zu testen, das für den chimören Transkriptionsfaktor codiert, wurden plRFGAL4 und plRFAGAL4 beide mit p-55CIB in L929-Zellen cotransfektiert, und die CAT-Expression wurde überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt:

Tabelle 2

Transferiertes Plasmid CAT-Aktivität (% Umwandlung)

plRF-S 2,0%

P-55CIB

plRF-A <0,2%

P-55CIB

plRFGAL 1,4%

P-55CIB

plRFGAL4 <0,2%

P-55CIB

Wirtszellen waren Maus-L929-Zellen. Die Zellen waren nicht durch NDV induziert.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Expression eines Zielgens (wie beispielsweise Gene, die für ein Interleukin, ein Interferon (α, β und γ), einen plasminogenen Aktivator, Erythropoietin, Granulozytkolonie-stimulierenden Faktor, Insulin, Human-Wachstumshormon oder Superoxiddismutase (oder Mutanten der Humangene) durch IRF-I erhöht werden kann.

Solche Zielgene wie die oben erwähnten, wie Interferongene, z. B. IFN-a, IFN-ß, IFN-γ, IFN-omega und plasminogene Aktivatoren,

z. B. t-PA, pro Urokinase oder Urokinase usw. können auch wirkungsvoller exprimiert werden, indem Promotoren eingeführt werden, die mit unterschiedlich langen Erkennungssequenzen für IRF-I, z. B. AAGTGA, verschmolzen sind.

Die Zielgene können beispielsweise in unterschiedliche Wirtszellen zusammen mit entweder intakten IRF-I- oder Chimären IRF-I-Genen eingeführt werden. Durch Verlängerung der IRF-I-Erkennungsstellen-DNA, z. B. durch Erhöhung der Anzahl der AAGTGA-Wiederholungen und des Expressionswertes des Transkriptionsfaktors, läßt sich ein hoher Expressionswert der Zielgene erreichen.

Beispielsweise können die AAGTGA-Wiederholungssequenzen an einen geeigneten Promotor wie einen IFN-ß-Promotor oder einen frühen SV40-Virus-Promotor angrenzen. Ein Zielgen, z. B. ein t-PA-Ger. oder IFN-ß-Gen, kann „downstream" eines solchen Promotors verbunden werden; die Struktur eines derartig konstruierten Gens würde sein

(AAGTGA)_x (Promotor) (Zielgen z.B. t-PA-Gen).

Ein derartiges.Gen könnte dann in CHO-Zellen, z.B. CHO DXBII-Zellen (dhfr-Stamm) eingeführt und in diesen verstärkt werden (Urlaub und Chasin, Proc.Natl., Acad.Sci., USA, Bd.77, S.421&-4220,1980).

Idealerweise wird, wie im vorangegangenen diskutiert wurde, eine Wirtszelle aus einer Zelle, die im wesentlichen keinen Wert einer endogenen IRF-I-Aktivität aufweist, gewählt. Das IRF-I-Gen, vorzugsweise entweder mit einem starken Promotor wie einem CMV-Promotor oder einem induzierbaren Promotor wie einem Metallothionein-Genpromotor, kann auf herkömmliche Art und Weise in die verschiedenen Wirtszellen eingeführt werden.

Das IRF-I-Gen kann co-eingeführt und zusammen mit dem Zielgen verstärkt werden. Auf alternative Waise können das IRF-I-Gen und das Zielgen getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.

In derartigen transferierten Zellen kann IRF-I entweder konnstitutiv (im Falle z. B. eines CMV-Promotors) oder induzierbar (im Fall z. B. des Metallothionein-Promotors wird durch zweiwertige Metalle wie Zink induziert) hergestellt werden. Der exprimierte IRF-I bindet an die AAGTGA-Wiederholungen und verstärkt das distale Zielgen, z. B. das t-PA-Gen oder das IFN-Gen.

Eine derartige Expression kann weiter durch ein Virus, z. B. NDV-Induktion, verstärkt werden, und wie aus Tabelle 1, Experiment 2, ersichtlich ist, erhöht diese Induktion die Aktivität des IRF-I.

Maus-cDNA-Sequenz, die mit Maus-IRF-l-cDNA der Formel III kreuzhybridisiert Eine Maus-cDNA-Bibliothek wurde nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Die cDNA wurde durch das Standardverfahren synthetisiert. Dabei wurde Maus-L929-Zellen-stämmige mRNA verwendet, und die cDNA wurde durch das Standardverfahren in den Xgtll-Vektor inseriert. Die entstandene Xgtll-Bibliothek wurde dann zur Isolierung der cDNA-Clone gescreent, deren Insertc mit der oben beschriebenen Maus-IRF-l-cDNA folgendermaßen kreuzhybridisieren: Nitrocellulosefilter, die die Phagen-Plaque-DNAs enthalten, wurden in den folgenden Stufen inkubiert:

(1) in 3 χ SCC bei 65°C 30 Minuten lang und anschließend

(2) 60minütige Inkubation in 3 x SSC, das Denhartsche Lösung enthält (0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyiinylpyrrolidon 25), und anschließend

(3) eine Vor-Hybridisierungsstufe, die aus der 12stündigen Inkuuaaon bei 65"C in einer Lösung, die 1M NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH 8,0,1OmM EDTA, 0,1 % SDS, 50\ig/m\ einzelsträngigeTräger-DNA (z.B. Lachssperma-DNA) und Denhartsche Lösung enthält, besteht und

(4) die Inkubation der Stufe 3 wurde wiederholt, wobei ³²P-markierte Maus-IRF-l-cDNA als Sonde eingeführt wurde. Diese

cDNA-Sonde wurde als das von EcoRI geschnittene Insert aus λί-28-8 hergestellt und durch das Multiprime-Markierungssystem (siehe oben) translatiert. Die Inkubation wurde 12 Stunden lang bei 65⁰C durchgeführt.

Dann wurden die Filter gewaschen, kurz in 2 χ SCC-Lösung gespült und anschließend in 3 χ SCC-Lösung, die 0,1% SDS enthielt, 30 Minuten lang bei 65⁰C gewaschen. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt.

Einer der positiven Clone, der als PHH-45 bezeichnet wurde, wurde selektioniert und es zeigte sich, daß er cDNA enthielt, die nur einen Teil der Codiersequenz für einen IRF abdeckte.

Das cDNA-lnsert in PHH-45 wurde deshalb isoliert und zum Screenen von Clonen verwendet, die größere Inserte enthielten, wie

im vorangegangenen unter der Überschrift „Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA" für die Herstellung von plRF-L beschrieben wurde.

Von den identifizierten positiven Clonen wurde der als plRF2-5 bezeichnete selektioniert und charakterisiert, wobei das im vorangegangenen für Maus-IRF-I beschriebene Verfahren angewandt wurde. Die komplette hybridisierende cDNA-Sequenz wird in Formel IVa gezeigt, und die Aminosäuresequenz des entsprechenden IRF-Proteins wird in Formel VIII dargestellt.

Das Plasmid plRF2-5 wurde in E.coli MC 1061/p3 transferiert, das als E.coli am FRI entsprechend dem Budaposter Vertrag am

22. November 1988 unter der Nr. FERM BP-2157 hinterlegt wurde.

cDNA aus dem Hefegenom, die mit Human-IRF-l-cDNA-Sequenz hybridisiert Hefe-DNA wurde nach dem Standardverfahren hergestellt und mit EcoRI digeriert. 5μg der digerierten DNA wurden auf 0,8% Agarosegel gegeben und mittels Standardverfahren einer Elektrophorese und einem DNA-Biot-Test unterzogen.

Das geblottete Filter wurde bis auf folgende Ausnahme genau nach der Beschreibung im vorangegangenen Beispiel zur Isolierung von Maus-DNA, die mit Maus-IRF-I hybridisier*, behandelt:

In Stufe (3) betrug die Inkubationstemperatur 55⁰C, und in Stufe (4) wurde die Inkubation ebenfalls bei 55°C ausgeführt, und die radioaktive Sonde war die aus pHIRF31 durch Digestion des Plasmids mit Xhol isolierte Human-IRF-l-cDNA, wobei diese Sonde wie im vorangegangenen Beispiel für Maus-IRF-I boschrieben markiert wurde. Das Filter wurde bei 55⁰C in 2 χ SSC gewaschen.

Die positiven Clone wurden durch Autoradiographie identifiziert (siehe Fig. 10).

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Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten μι m ^eutisch aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die er'wndi durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Soquenz enthält, die ein Gon für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen für ein Protein enthält, dos die Wirkung einer Interferon-Regulartorsequenz (IRF-I) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für ein Protein enthält, das die Wirkung einer Interferon-Rogulatorsequenz (IRF-1) enthält, wobei das Gen für das gewünschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1-Proteins ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle durch einen ersten Vektor transformiert wird, der das Gen enthält, das für das IRF-1-aktive Protein codiert, und durch einen zweiten Vektor, der ein Gen enthält, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1-Proteins codiert, für das das erste Gen codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle durch einen Vektor transformiert wird, der eine DNA-Sequenz enthält, die beide genannte Gene enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Vektor oder einem der Vektoren das Gen, das das IRF-1-aktive Protein codiert, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines induziblen Promotors ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine IRF-1-Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen enthält.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT

110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 55^ AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 .900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.

ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.

10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60. 70 SO " 90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCG'iCTCGGCACGGA"

MQ 150 160 ' 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 2EO '-> 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

oso 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAA^GAAACAACGCC

320 330 3'!0 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

37Ü 380 390 400 AAAGSAAAGAAACCAAAGACAGAÄAAÄGAAGAC^GAGTTAAGCAC.

410 420 _ 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTtTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480 · 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 57.0 · 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 ·. 610 · ' 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 " 710 7*20 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGArACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 ' 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGC_-AJGTCGGCCAGACCGGGAGACc

1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

10 40
GTCAAGAGCTGT

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-Protein codiert, eine Sequenz ist, die sich zu einer DNA-Sequenz hybridisiert, wie sie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert ist.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzelle ist.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Protein ein Cytokin- oder Plasminogenaktivator ist.