DE4208634A1 - Fuer aphrodisin kodierende dna - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Desoxyribo­ nukleinsäuresequenz, die für Aphrodisin kodiert sowie deren Fragmente, eine Nukleinsäuresequenz als Sonde für die DNA, die für das Peptid Aphrodisin kodiert, das Ex­ pressionsprodukt dieser DNA in Form eines Peptids sowie ein Arzneimittel enthaltend dieses Peptid und schließlich ein Diagnostikmittel zur Aufspürung des Aphrodisins oder seiner aktiven Fragmente oder mit der Synthese des Aphro­ disins verbundener Nukleinsäuren.

Die sogenannten Pheromone sind Sexuallockstoffe, welche bisher aus einer Vielzahl von Organismen, angefangen von niederen Einzellern, wie Bakterien, bis hinauf zu den Säugetieren isoliert und charakterisiert werden konnten. Die Pheromone sind chemisch gesehen entweder niedere Terpene, höhere ungesättigte Fettsäuren oder Proteine/ Peptide und bewirken eine Kommunikation zwischen 2 oder mehreren Individuen im weitesten Sinne. Am bekanntesten sind die flüchtigen Pheromone der Insekten, die eine Partnerfindung über Distanzen von mehreren Kilometern ermöglichen.

Obwohl ein Pheromon-gesteuertes Kopulationsverhalten bei Säugetieren schon früh vermutet und beschrieben wurde, konnte erst in jüngerer Zeit die Struktur eines Säugetier- Pheromons auf Proteinbasis teilweise aufgeklärt werden (Henzel et al., J. Biol. Chem., 263, 16 682-16 687). Dieses als Aphrodisin bezeichnete Pheromon aus dem Hamster-Vaginalsekret hat ein Molekulargewicht von ca. 17 000 Dalton und besteht aus 151 Aminosäuren. Es wirkt bei Kontakt mit der Schnauze des Hamstermännchens und führt zu Kopulationsverhalten selbst gegenüber männlichen Aphrodisin-präparierten Hamstern (homosexuelles Kopu­ lationsverhalten).

Obwohl die Wirkung eines ähnlichen Pheromons der Maus beschrieben wurde (Singer et al., 1988, Biol. Reprod. 38, 193-199) sind bisher keine Strukturdaten und Amino­ säuresequenzen von Proteinpheromonen anderer Säugetiere als derjenigen des Hamsters bekannt geworden. Daten über Nukleotidsequenzen für Aphrodisin oder andere für homo­ loge Protein-Pheromone kodierender Botenribonukleinsäuren (mRNA) "copy-Desoxyribonukleinsäuren" (cDNA) oder Gene entsprechender Proteine sind nicht bekannt. Auch die Existenz eines entsprechenden Vorläuferproteins des Aphrodisins ist nicht bekannt. Um das nutzbare physio­ logische Potential dieser interessanten Wirkstoffgruppe zu untersuchen, erscheint es notwendig, diese Protein­ klasse gezielt zu untersuchen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Werkzeug bereitzustellen, mit dem Aphrodisin und damit korrelierende Proteine bestimmt werden können.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine DNA gemäß Anspruch 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die DNA die folgende Nukleinsäuresequenz auf.

Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:
A = Adenin, R = A oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, G = Guanin, T = Thymin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch DNA-Frag­ mente, die für entsprechende Fragmente des Aphrodisin- Peptids kodieren. Die analytische Erfassung von Nuklein­ säuren, die für Aphrodisin kodieren, auch auf Genab­ schnitten, kann mit hybridisierenden Nukleinsäuresequen­ zen erfolgen. Dabei ist es, um eine eindeutige Aussage zu treffen notwendig, sogenannte stringente Hybridisierungs­ bedingungen einzustellen, die durch Temperatureinflüsse, Einflüsse des gegebenen Mediums etc. gesteuert werden können.

Mit der erfindungsgemäßen DNA lassen sich auch Nuklein­ säuresequenzen aufspüren und isolieren, indem unter stringenten Bedingungen die Hybridisierung durchgeführt wird und beispielsweise der entstandene Nukleinsäurekom­ plex isoliert wird. Solche Nukleinsäuresequenzen, die beispielsweise auch aus RNA bestehen können, können dann durch an sich bekannte weitere Prozessierung zu den ent­ sprechenden Expressionsprodukten umgesetzt werden.

Mithin ist der Gegenstand der Erfindung auch ein Poly­ peptid, das erhältlich ist durch Expression der erfin­ dungsgemäßen Nukleinsäuren. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein Polypeptid der Struktur.

Das erfindungsgemäße Polypetid entspricht dem Aphrodisin mit Ausnahme der sechs N-terminalen Aminosäuren.

Das erfindungsgemäße Polypeptid ist als Arzneimittel ge­ eignet. Dieses Arzneimittel enthält eine wirksame Menge des Polypeptids oder ein pharmazeutisch wirksames Poly­ peptidfragment des Aphrodisins. Das Arzneimittel enthält vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und Trä­ gerstoffe, die seine Anwendung ermöglichen. Als Appli­ kationsformen kommen insbesondere auch topikale An­ wendungsformen in Betracht. Die Polypeptid-enthaltenden Arzneimittel sind beispielsweise zur Therapie von Potenz- und Fertilitätsstörungen sowie von daraus resultierenden psychischen Störungen einsetzbar. Eine Nutzung anderer auftretender Effekte, wie zum Beispiel Steigerung des allgemeinen Wohlbefindens, ist möglich.

In der Tiermedizin können derartige Arzneimittel eben­ falls mit Erfolg eingesetzt werden, insbesondere auch zur Induktions des Kopulationsverhaltens bei der Zucht von Nutztieren aller Art sowie bei der Zucht von sich in Ge­ fangenschaft schwer zu vermehrenden Tieren, wie seltene exotische Tiere.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch zur Therapie hormonell bedingert Störungen des natürlichen Sexuallebens bedingter psychischer Erkrankungen des Menschen dienen.

Als Diagnostikmittel zur Bestimmung des Titers von Aphrodisin oder deren pharmazeutisch wirksamen Derivaten können die Peptide oder Peptidfragmente gemäß der Er­ findung eingesetzt werden, beispielsweise in Kompetetions- Assays. Es ist ebenfalls möglich, mit Hilfe des erfin­ dungsgemäßen Polypeptids oder Polypeptidfragments Anti­ körper oder Antikörperfragmente gegen entsprechende Epitope des Polypeptids oder Polypeptidfragments herzu­ stellen und diese Antikörper in einem Diagnostik-Assay zu verwenden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die als Hybridisierungssonde eingesetzt werden kann, ist es auf molekularbiologischer Ebene möglich, beispielsweise den Titer von Aphrodisin kodierenden Nukleinsäuren zu bestimmen und damit den Aphrodisin-Status zu bestimmen.

Die erfindungsgemäße DNA wurde wie folgt isoliert: Aus einem Hamster-Uterovaginaltrakt wurde die RNA isoliert. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit der RNA unter Ver­ wendung eines Primers UNIP 2 und kommerziell erhältlicher reverser Transkriptase (MMLV, Firma BRL) durchgeführt. Der Primer UNIP 2 besaß die folgende Struktur:

CCT GAA TTC TAG AGC TCA (T) 17.

Dieser Primer besteht aus 17 Thymidin-Nukleotiden, die komplementär zum Poly(A)-Schwanz eukaryontischer Boten­ ribonukleinsäuren sind und einer Region am 5′-Ende, welche drei Erkennungssequenzen für hexanukleotidspezif­ ische Restriktionsendonukleasen besitzt.

Die Primer, die für die Polymerase Chain Reaction (PCR) eingesetzt werden, müssen komplementär zu den flankieren­ den Teilregionen der zu amplifizierenden DNA sein. Zu­ nächst wurden PCR-Primer konstruiert der folgenden Art:

Die fettgedruckten Sequenzen an den 5′-Enden der Primer entsprechen nicht der Aphrodisin revers translatierten DNA-Sequenz, sondern beinhalten Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen. Hierdurch wird ohne mit der PCR-Reaktions zu interferieren eine Klonierung der PCR- Fragmente erleichtert.

Die Amplifikation Aphrodisin-spezifischer DNA-Fragmente durch die PCR-Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: Ein bestimmtes Aliquot des cDNA-Erststrangsynthese-Ansatzes wurde in vier Ansätze mit den unterschiedlichen PCR- Primerkombinationen pipettiert. Dann wurde die PCR- Reaktion in Standardansätzen durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden im Vergleich mit einem DNA-Größen­ standard elektrophoretisch in einem Agarosegel getrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt und im UV-Licht beob­ achtet. In allen entsprechenden Ansätzen waren homogene DNA-Banden zu erkennen. Die entsprechenden Größen wurden mit Hilfe eines Regressionsprogrammes bestimmt und mit den zu erwartenden vorausberechneten Größen verglichen. Es ergaben sich gute Übereinstimmung der gemessenen mit den berechneten Werten. Das aus der Primer-Kombination AP-1 und AP-4 gewonnene amplifizierte Fragment wurde elektro­ phoretisch in einem Agarosegel getrennt, die entsprechen­ de Bande isoliert und mit Hilfe eines Qiaex®-DNA-Ex­ traktionskits der Firma Diagen aus dem Gel isoliert.

Zur Erzeugung der für die Klonierung notwendigen homo­ genen DNA-Einzelstrangenden wurde das Fragment unter Standardbedingungen mit der Restriktionsendonuklease Xba I von BRL behandelt. Alle vier verwendeten PCR-Primer besitzen eine Erkennungssequenz für dieses Enzym. DNA des Kloniervektors z. B. pUC-18 wurde mit dem gleichen Enzym zur Erzeugung Ligations-kompatibler Enden linearisiert. Das erhaltene cDNA-Fragment wurde in einem Standardansatz und unter Verwendung eines DNA-Ligase-Enzyms mit der Vektor-DNA ligiert. Dieses Fragment wurde in einen Klo­ niervektor, z. B. pUC-18, eingebaut. E. coli-Bakterien wurden mit dem Ligationsansatz transformiert und auf einem Nähragar plattiert, der eine antibiotische Substanz aufwies, gegen die die transformierten Zellen resistent waren. Nach hinreichend langer Inkubationszeit wurden die gewachsenen Kolonien identifiziert und vereinzelt. Aus den jeweils isolierten Klonen wurde anschließend mit Hilfe eines Nukleinsäureisolationskits (Qiagen®-Miniprep- Kits der Firma Diagen) präpariert. Von den isolierten Klonen wurden die Insertionen der Vektor-DNA jeweils von beiden Enden ausgehend sequenziert.

Die in Fig. 1 abgebildete Gesamtsequenz wurde auf diese Weise erhalten. Über der cDNA-Sequenz der Fig. 1 ist zusätzlich die daraus abgeleitete Proteinsequenz des Aphrodisins im Drei-Buchstaben-Code angegeben. Die Fig. 1 zeigt darüber hinaus noch die Lage der Primer ap 1 bis ap 6.

Der Vergleich der erhaltenen cDNA-Sequenz mit der aus der reversen Translation des Proteins erhaltenen variablen Sequenz zeigt völlige Übereinstimmung (siehe Fig. 2) innerhalb des klonierten Bereiches.

Die Fig. 3 zeigt Fragmente aus verschiedenen Aphrodisin PCR-Ansätzen nach gelelektrophoretischer Größenauftren­ nung. Am oberen Rand des Bildes sind die verwendeten Primer-Kombinationen angegeben.

Fig. 4 zeigt die Größe der PCR-Fragmente gemäß Fig. 3 in Kbp (Kilobasenpaare).

Die Fig. 5 zeigt das Ergebnis der "Northern-Hybridi­ sierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschiedenen Abschnitten des Hamster-Uterovaginal­ traktes. Es hybridisiert nur die RNA aus Vagina und Bartholinischen Drüsen.

Die Fig. 6 zeigt das Ergebnis der "Dot-Blot-Hybridisie­ rung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschiedenen Abschnitten des Hamster-Uterovaginaltraktes. RNA aus der Vagina hybridisiert mindestens um Faktor 5 stärker als RNA aus den Bartholinischen Drüsen.

Die Fig. 7 zeigt das Ergebnis der "Southern-Hybridi­ sierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen genomische DNA aus verschiedenen Tierarten.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Hybridisierungssonde konnte der Syntheseort des Aphrodisins innerhalb des Hamster-Uterovaginaltraktes genauer lokalisiert werden. Dazu wurde RNA aus verschiedenen Abschnitten des Utero­ vaginaltraktes (Ovarien, Uterusschenkel, Uterus, Vagina, Bartholinische Drüsen) extrahiert. Hybridisierungsexperi­ mente zeigten, daß das Aphrodisin hauptsächlich in vagi­ nalem Gewebe, eventuell auch in den Bartholinischen Drüsen synthetisiert wird. Die Autoradiogramme der ent­ sprechenden Hybridisierungsexperimente zeigen die Fig. 5 und 6.

Die Existenz aphrodisinspezifischer Gene in anderen Spezies konnte mittels der erfindungsgemäßen Hybridi­ sierungssonde untersucht werden. Es wurde dazu genomische DNA aus Meerschweinchen, Ratte, Tupaja (Streifenhörnchen- Primat), Kaninchen sowie als Referenz Hamster extrahiert. Die Hybridisierungsbedingungen wurden etwas weniger stringent gewählt, um Basenfehlpaarungen entsprechender Nukleinsäuren der anderen Spezies auszugleichen. Fig. 7 zeigt das Ergebnis der Hybridisierungsexperimente, aus denen sich ergibt, daß in allen genannten Spezies Aphro­ disin kodierende Gene vorhanden sein müssen.

Beispiel

Aus einem Hamster-Uterovaginaltrakt mit einem Naßgewicht von 600 mg wurden 165 µg Gesamt-RNA extrahiert.

Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit 5 µg der präparier­ ten RNA unter Verwendung des selbst synthetisierten Primers UNIP 2 und MMLV-Reverser Transkriptase der Firma BRL durchgeführt. Der Primer besteht aus 17 Thymidin- Nukleotiden, die komplementär zum Poly(A)-Schwanz eu­ karyontischer Botenribonukleinsäuren sind und einer Region am 5′-Ende, welche drei Erkennungssequenzen für hexanukleotidspezifische Restriktionsendonukleasen be­ sitzt.

CCT GAA TTC TAG AGC TCA (T) 17.

Es wurden die folgenden Aphrodisin-PCR-Primer syntheti­ siert.

Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:
A = Adenin, R = A oder G, S = C oder G, H = A oder C oder T, V = A oder C oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, W= A oder T, G = Guanin, M= A oder C, T = Thymin, K = G oder T, B = C oder G oder T, D = A oder G oder T.

Mit den genannten Primern bzw. Primerkombinationen wurde die Polymerase Chain Reaction durchgeführt. Je ein 1/15 des cDNA-Erststrangsyntheseansatzes wurden in vier An­ sätzen mit unterschiedlicher PCR-Primer-Kombination pi­ pettiert:
Ansatz 1 PCR-Primer AP-1 und AP-3
Ansatz 2 PCR-Primer AP-1 und AP-4
Ansatz 3 PCR-Primer AP-2 und AP-3
Ansatz 4 PCR-Primer AP-2 und AP-4.

Die PCR-Reaktionen wurden in Standardansätzen mit folgen­ den Zyklen gefahren:
94°C 30 sec "Aufschmelzen" der DNA-Doppelstränge
45°C 1 min Hybridisierung der Primer mit Ziel-DNA
72 °C 1 min "Elongation"=Polymerisations-Reaktion.

Es wurden insgesamt 40 Zyklen gefahren und anschließend noch ein Zyklus unter gleichen Bedingungen, jedoch mit zehnminütiger Elongationszeit, um sicherzustellen, daß alle Polymerisationsprodukte in voller Länge vorliegen.

Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurden je 1/10 der PCR- Ansätze zusammen mit einem DNA-Größenstandard elekropho­ retisch in einem "Mini"-Agarosegel aufgetrennt mit Ethidiumbromid angefärbt und bei Durchlicht (UV-Licht) photographiert. In allen vier Ansätzen waren homogene DNA-Banden erkennbar. Die Größen der entsprechenden PCR- Produkte wurden mit Hilfe eines Regressionsprogrammes be­ stimmt und mit den zu erwartenden vorausberechneten Größen verglichen.

Die Amplifikation der korrekten Fragmente wurde verifi­ ziert, indem ein Teil von Ansatz 2 mit den Primer AP-2 und AP-3 erneut amplifiziert wurden entsprechend Ansatz 3. Da das Primerpaar AP-2/AP-3 innerhalb der Region liegt, gegen welche die Primer AP-1 und AP-4 aus Ansatz 2 hybridisieren, wäre im Falle eines Aphrodisin-spezifischen DNA-Fragments im Ansatz 2 aus der erneuten Amplifikation ein Ansatz 3 entsprechendes DNA-Fragment zu erwarten. Dies konnte elektrophoretisch verifiziert werden. Das DNA-Fragment gemäß Ansatz 2 ist das größte der cDNA-Frag­ mente aller vier PCR-Ansätze und wurde für die Klonierung weiterverwendet. Die PCR-Produkte gemäß Ansatz 2 wurden elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt, prä­ parativ isoliert und mit Hilfe eines Qiaex®-DNA-Extrak­ tionskits der Firma Diagen aus dem Gel isoliert.

Homogene DNA-Einzelstrangenden wurden erzeugt durch Be­ handlung des PCR-Fragments unter Standardbedingungen mit der Restriktionsendonuklease Xba I von BRL (Bethesda Re­ search Laboratories). Jeder der verwendeten PCR-Primer besaß eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym. DNA des Klonierungsvektors pUC-18 wurde mit dem gleichen Enzym zur Erzeugung Ligations-kompatibler Enden lineari­ siert.

Das erhaltene cDNA-Fragment wurde in einem Standardver­ fahren unter Verwendung des Enzyms T4-DNA-Ligase (Firma Bethesda Research Laboratories) mit der Vektor-DNA des Vektors pUC-18 ligiert. E. coli DH5α-Zellen wurden mit dem Ligationsansatz transformiert und auf Ampicillin- haltigem LB-Nähragar ausplattiert. Hierauf können nur solche Zellen wachsen, welche ein Molekül des rekom­ binierten Vektors pUC-18 beinhalten. Nach Inkubierung über Nacht bei 37°C wurden drei Klone (Bakterienkolonien) mit rekombiniertem Vektor identifiziert und vereinzelt. Die Klone erhielten die Bezeichnung pPET-1, pPET-2 und pPET-3. Aus diesen Klonen wurde anschließend mit Hilfe des Qiagen®-Miniprep-Kits der Firma Diagen jeweils ca. 5 µg Vektor-DNA präpariert. Von je 1 µg Vektor-DNA aller drei Klone wurden die Insertionen jeweils von beiden Enden ausgehend in üblicher Weise sequenziert. Aus der Sequenzierung wurde die Gesamtsequenz des DNA-Fragments gemäß Ansatz 2 ermittelt.

Aus den erhaltenen Sequenzdaten wurden zwei hochspezi­ fische PCR-Primer synthetisiert, die im Gegensatz zu den Primern AP 1-4 nicht mehr bzw. gering variiert waren (nur aufgrund von Sequenz-Unsicherheit AP-6 zweifach variiert), sondern genau der Aphrodisin-cDNA entsprachen. Ihre Sequenzen sind im folgenden aufgelistet:

Bereiche, welche Erkennungssequenzen für Restriktions­ endonukleasen enthalten, sind fett dargestellt.

Die Primer entsprechen den Regionen 158-182 bzw. 193-220 der cDNA. Mit ihrer Hilfe und dem Primer "UNIP-2" (komplementär zum Poly(A)-Ende der mRNA) war eine Am­ plifikation des 3′-terminalen Restes der cDNA bis zum sogenannten "Poly(A)-Schwanz" möglich. Dies wurde in zwei Stufen analog zu dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit folgenden Modifikationen durchgeführt:

Ansatz 5 PCR-Primer AP-5 und UNIP-2
94°C 30 sec "Aufschmelzen"
50°C 1 min Hybridisierung
72°C 1 min Elongation.

Es wurden 10 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei im letzten Zyklus die Elongationszeit auf 10 min verlängert wurde. Aus Ansatz 5 wurde 1 µl entnommen und in Ansatz 6 mit den Primern AP-6, der weiter in Richtung 3′-Terminus hybri­ disiert, und UNIP 2 in 30 Zyklen unter gleichen Bedingun­ gen "nachverstärkt" (erhöhte Spezifität durch 2 Amplifi­ kationen mit unterschiedlichen Primern). Im letzten Zyklus wurde auch hier die Elongationszeit auf 10 min verlängert.

Das Amplifikationsprodukt wurde elektrophoretisch über­ prüft. Die aus der Elektrophorese erhaltene Fragmentgröße (560 bp) stimmte erneut relativ gut mit der errechneten Größe (530 bp) überein (siehe Abb. 3 und Abb. 4).

Das amplifizierte DNA-Fragment wurde weiterverarbeitet, wie oben beschrieben, mit dem Unterschied, daß 5 Klone isoliert und sequenziert wurden. Diese Klone erhielten die Bezeichnung pPET 11-15.

Aus den Sequenzdaten konnte die Aphrodisin-cDNA-Sequenz bis zum Poly(A)-Schwanz ergänzt werden. Die aus der Se­ quenz abgeleitete Protein-Sequenz stimmte mit der be­ kannten Aminosäuresequenz (Fig. 1) überein.

Um den Syntheseort des Aphrodisins innerhalb des Hamster- Uterovaginaltraktes genauer lokalisieren zu können wurde aus 5 Goldhamstern die RNA verschiedener Abschnitte des Uterovaginaltraktes (Ovarien, Uterusschenkel, Uterus, Vagina, Bartholinische Drüsen) extrahiert. Von dieser RNA wurden einerseits je 5 g gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran (Amersham Hybond N+) übertragen ("Northern-Blotting"), andererseits verschiedene Massen (0,02-2 g) direkt punktförmig auf Nylonmembran fixiert ("Dot-Blotting"). Die Membran-gebundene RNA wurde unter hochstringenten Bedingungen (42°C) gegen radioaktiv markierte Aphrodisin-cDNA des Klons pPET 1 hybridisiert und danach unter stringenten Bedingungen gewaschen (Casey, J. und Davidson, N. 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1539-1552):

Hybridisierungslösung (10 ml):

50% (v/v) Formamid
5 x Denhardt′s Lösung
5 x SSPE
0,1% (w/v) SDS
100 µg/ml Hefe-RNA
ca. 50 ng radioaktiv (³²P) markierte Aphrodisin-cDNA

Die Hybridisierung erfolgte über Nacht (ca. 16 Stunden). Die Autoradiogramme sind in Fig. 5 und 6 gezeigt. Aus den Autoradiogrammen ist ersichtlich, daß die Aphrodisin- cDNA unter den genannten Bedingungen nur gegen eine mRNA-Species hybridisiert (nur eine homogene Bande in der Northern-Hybridisierung). Weiterhin kann aus den "Northern"- und "Dot-Blot"-Hybridisierungen geschlossen werden, daß Aphrodisin hauptsächlich in vaginalem Gewebe, evtl. auch in den Bartholinischen Drüsen (mindest. um Faktor 5 geringer) synthetisiert wird.

Um die Existenz Aphrodisin-spezifischer Gene in anderen Spezies als Hamster zu überprüfen, wurde genomische DNA aus Meerschweinchen, Ratte, Tupaja (Streifenhörnchen- Primat), Kaninchen und auch Hamster extrahiert. Je 5 g der DNA wurde mit dem Hexanukleotid-spezifischen Re­ striktionsenzym Hind III hydrolysiert, gelelektro­ phoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran (Amersham Hybond N+) übertragen. Da mit Basenfehlpaarungen in anderen Species als Hamster zu rechnen war, wurde die Membran-gebundene DNA unter Bedingungen nur mittlerer Stringenz (37°C, siehe Formamid-Konzentration * in Hybri­ disierlösung) über Nacht (ca. 16 Stunden) gegen radio­ aktiv markierte Aphrodisin-cDNA hybridisiert und danach unter stringenten Bedingungen gewaschen (Casey, J. und Davidson, N. 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1539-1552):

Hybridisierungslösung (10 ml):

20% (v/v) Formamid
5 x Denhardt′s Lösung
5 x SSPE
0,1% (w/w) SDS
10g/ml Hefe-RNA
ca. 50 ng radioaktiv (³²P) markierte Aphrodisin-cDNA

*Die Formamid-Konzentration ist mitbestimmend für die Stringenz einer Hybridisierung: Je höher die Konzentration, desto höher die Stringenz.

Das Autoradiogramm (Fig. 7) zeigt, daß die Stringenz ausreichend hoch war, um mit Ausnahme der Kaninchen-DNA nur jeweils 1 Signal in allen Spezies zu ergeben. Es zeigt vor allem, daß in allen untersuchten Spezies Aphro­ disin-Gen ähnliche Gene vorhanden sein müssen. Das Signal im niedermolekularen Bereich der Kaninchen-DNA stellt keinen Widerspruch zu ausreichender Stringenz dar, da sich eine Hind III-Erkennungssequenz im Aphrodisin-Gen entsprechenden Bereich der Kaninchen-DNA befinden könnte. Dies würde nach Hind III-Hydrolyse zur Bildung von zwei hybridisierenden Fragmenten führen. Die Größen der hy­ bridisierenden Hind III-DNA-Fragmente konnten durch Ver­ gleich mit einem Größenstandard wie folgt abgeschätzt werden:

Hamster, Kaninchen, Tupaja ca. 8000 Basenpaare
Ratte <8000 Basenpaare
Meerschweinchen ca. 3500 Basenpaare

Die Größenübereinstimmung bei Hamster, Kaninchen und Tupaja zeigt ebenfalls die Spezifität der Hybridisierung.

Claims (9)

1. DNA kodierend für Aphrodisin.

2. DNA nach Anspruch 1 mit der folgenden Nukleinsäurese­ quenz: Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:
A = Adenin, R = A oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, G = Guanin, T = Thymin.

3. DNA-Fragmente aus der DNA gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2, das für Fragmente des Aphrodisins kodiert.

4. Nukleinsäuresequenz, die mit der DNA gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 3 unter stringenten Bedingungen hybridi­ siert.

5. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 4, erhältlich durch Hybridisierung mit der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 unter stringenten Bedingungen und Isolierung des ent­ sprechenden Komplexes.

6. Polypeptid erhältlich durch Expression der Nukleinsäuren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 in geeigne­ ten Expressionssystemen.

7. Polypeptid der Struktur

8. Arzneimittel enthaltend eine wirksame Menge des Poly­ peptids oder ein pharmazeutisches Polypeptid-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 6 oder 7.

9. Diagnostikmittel enthaltend ein Polypeptid oder Polypeptid- Fragment oder einen Antikörper oder Fragmente eines Anti­ körpers gegen Epitope des Polypeptids oder Polypeptid- Fragments nach einem der Ansprüche 6 und/oder 7 und/oder mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die als Hybridisie­ rungssonde zum Aufspüren von Nukleinsäuren, die für Aphro­ disin kodieren, geeignet ist.