DE3781865T2 - Klonierung von dns, welche einen menschlichen gip-vorlaeufer kodiert und expressionsverfahren des vorlaeufers. - Google Patents
Klonierung von dns, welche einen menschlichen gip-vorlaeufer kodiert und expressionsverfahren des vorlaeufers.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein gastrisches Inhibitor- Polypeptid (im folgenden als "GIP" bezeichnet") und insbesondere eine geklonte DNA von Human-GIP-Vorläufer, deren Fragment, ein Verfahren zur Herstellung der geklonten DNA oder deren Fragment, sowie ein Plasmid, in das die DNA oder deren Fragment integriert ist.
- Bei GIP handelt es sich um eines der Peptidhormone, die im Magen- im Intestinum, im Pankreas und anderen Organen vorkommen und das zuerst von Brown, J.C. et al aus Schweine-Duodenum isoliert wurde ["J. Physiol. Pharmacol." Vol. 47, Seite 113, (1969)].
- Human-GIP wurde von Valverde, I. et al isoliert und gereinigt, die auch eine Struktur des GIP bestimmten ["FEBS" Volk 172, Seiten 142 bis 148, (1984)]. Nach der in der Literatur angegebenen Beschreibung besteht Human-GIP aus 42 Aminosauren und hat ein Molekulargewicht von etwa 5000. Man nimmt an, daß GIP ein Mitglied der Sekretinfamilie ist, da eine Aminosäuresequenz desselben analog ist zum Sektretin, VIP, Glucagon und dergl.
- Jedes der erwähnten GIP ist aus Tierorganen extrahiert und zeigt physiologische Aktionen, die im allgemeinen in Beschleunigungswirkungen auf die Magensaftsekretion und die Insulinsekretion eingeteilt werden. Es ist bekannt, daß unter den erwähnten Aktionen die letztere bemerkenswert ansteigt, wenn die Blutzuckerkonzentration zunimmt. Im Hinblick auf diese Wirkung wird von GIP erwartet, daß es ein wirksames Mittel zur Heilung bestimmter Diabetes werden könnte. Genauer gesagt ist es unter den Diabetes-Patienten für den Insulinunabhängigen Patienten, dessen B-Zellenfunktion in einem physikalischen Zustand verbleibt, bei dem die Insulin-Sekretion besonders beschleunigt ist, von Vorteil, wenn seine Blutzukkerkonzentration höher ist.
- Das aus dem Stand der Technik bekannte GIP wurde erhalten durch Extraktion aus Tierorganen von Schwein, Rindern oder Menschen. Es war somit ziemlich schwierig, es in größerer Menge zur Verfügung zu stellen. Genauer gesagt ist bisher kein GIP tatsächlich klinisch angewandt worden, und zwar wegen seiner geringen Produktivität, und das trotz der Tatsache, daß eine Wirksamkeit von GIP als Mittel zur Heilung von Diabetes erwartet wird.
- Ein Hauptgesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines industriell akzeptablen Verfahrens für die Herstellung von Human-GIP und damit verwandter Substanzen, und zwar durch Nutzung der sogenannten Biotechnologie.
- Eine Hauptaufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer geklonten DNA, umfassend Human-GIP-Vorläufer oder ein Fragment desselben.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der geklonten DNA oder des Fragments derselben.
- Weitere Aufgaben der Erfindung sind die Schaffung eines Plasmids, bei dem die geklonte DNA oder deren Fragment, beispielsweise Human-GIP per se oder ein anderer, physiologisch aktiver Abschnitt der DNA, integriert ist, so daß ein Mikroorganismus, der mit dem Plasmid transformiert wird, eine Expression des GIP oder der anderen physiologisch aktiven Substanz durchführt, wodurch eine Herstellung derselben in großem Maßstab möglich wird.
- Von den Erfindern wurde als Ergebnis sorgfältiger Studien die klonierte DNA für menschlichen GIP-Vorläufer erhalten und seine Struktur bestimmt, wodurch das Grundproblem gelöst wurde.
- Erfindungsgemäß wird das Hauptziel erreicht durch eine geklonte, einzelsträngige DNA, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, umfassend 459 Nukleotide, welche eine Aminosäuresequenz für menschlichen GIP-Vorläufer kodiert, oder eine klonierte DNA, die aus der besagten einzelsträngigen DNA und komplementärer einzelsträngiger DNA besteht.
- Die DNA gemäß der Erfindung hat die folgenden Nukleotidsequenz oder eine beliebige andere Nukleotidsequenz, die mit der ersteren unter biologischen Gesichtspunkten übereinstimmt.
- wobei A, C, G und T jeweils für ein Desoxyribonukleotid stehen, welches eine Adenin-, Cytosin-, Guanin- oder Thyminbase aufweist, und wobei die Sequenz in Codons angegeben ist, derart, daß jedes Codon einer spezifischen Aminosäure entspricht
- Der Ausdruck "Nukleotidsequenzen, die unter biologischen Gesichtspunkten die gleichen sind" bedeutet einen Fall, bei dem selbst dann, wenn die Arten oder Anordnungen der Nukleotide, welche die Codons aufbauen, wie "TTA" und "CTG", verschieden sind, das jeweilige Codon dennoch die gleiche Aminosäure bezeichnet (in diesem Falle bezeichnet jedes, der Codons "Leucin"). In diesem Fall bedeutet der Ausdruck somit Nukleotidsequenzen, welche die folgende Aminosäuresequenz kodieren, welche durch die erwähnte Nukleotidsequenzformel bezeichnet wird.
- Gemäß der menschlichen GIP-Vorläufer cDNA mit der erwähnten Nukleotid-Aminosäuresequenz wird festgestellt, daß Human-GIP in einem Bereich von der 52. bis zur 93. kodiert wird, gezählt von dem Methionin(Met)-Rest, der durch das Startcodon von ATG bezeichnet wird und an beiden Enden begrenzt wird durch den Arginin(Arg)-Rest, der durch das Codon AGG bezeichnet wird. Die etwa 20 Aminosäuren, die beginnend vom Start (Met) angeordnet sind, werden als die angesehen, die einem Signalpeptid entsprechen, das die Sekretion betrifft, und zwar im Hinblick auf die Struktur.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die klonierte, doppelsträngige DNA, welche für menschlichen GIP-Vorläufer kodiert, hergestellt werden, indem man RNA, die aus dem oberen kleinen Intestinum (Duodenum) extrahiert wurde, in Poly(A)RNA umwandelt, eine cDNA-Bibliothek erstellt unter Verwendung der Poly(A)RNA und Vektor-DNA zur Durchführung einer Transformation von Escherichia coli (E. coli) bei vorausgehender Synthese einer Mischung von 16 Tetradecameren, jedes bestehend aus 14 Desoxyribonukleotiden der Formel
- welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
- Ala-Met-Asp-Lys-Ile
- der 13. bis 17. Aminosäure vom N-terminalen Ende einer Aminosäuresequenz, die als jene des Human-GIP bekannt ist, und einer Mischung von 16 Heptadecameren, jedes bestehend aus 17 Desoxyribonukleotiden der Formel
- welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
- Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile
- der 35. bis 40. Aminosäure vom N-terminalen Ende in der bekannten Aminosäuresequenz für Human-GIP; Markierung jedes synthetisierten Oligodesoxyribonukleotids der besagten Formeln (A) und (B) am 5'-terminalen Ende; Screening der erwähnten transformierten E. coli durch eine Hybridisierung unter Verwendung der besagten markierten Oligodesoxyribonukleotide als Sonden, um die doppelsträngige DNA als positiven Klon zu erhalten, welcher beide der Sonden hybridisiert.
- Der Grund dafür, daß die 13. bis 17. Aminosäure vom N-terminalen Ende in den Aminosäuren für GIP als die eine der Sonden für das Oligodesoxyribonukleotid (A) ausgewählt wird und die 35. bis 40. Aminosäure vom N-terminalen Ende in den Aminosäuren für GIP für das Oligodesoxyribonukleotid (8) als die andere Probe ausgewählt wird, liegt darin, daß es dadurch möglich wird, auf 5 oder 6 Arten von Aminosäuren einen Response zu erhalten und auf ein Minimum an Arten von mRNA, die derartigen Aminosäuren entspricht.
- Bei dem Screening von transformierten Zelien (E. coli) findet man im Ergebnis keine Unterschiede, selbst denn die Hybridisierung mit den Oligodesoxyribonukleotiden (A) vor derjenigen mit den anderen Oligodesoxyribonukleotiden (B) durchgeführt wird, oder vice versa.
- Eine klonierte, einzelsträngige DNA, welche die Region von Human-GIP kodiert, kann hergestellt werden, indem man die resultierende klonierte, doppelsträngige DNA unter Anwendung eines an sich bekannten Verfahrens zersetzt, beispielsweise durch Behandlung bei 90ºC während etwa 3 Minuten und anschließendes Abkühlen mit einem Eisbad.
- Die klonierte einzel- oder doppelsträngige DNA, welche Human- GIP-Vorläufer kodiert, kann zu Fragmenten unterschiedlicher Länge verarbeitet werden, durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym Bindungsfragmenten, durch Synthese einer Region, die einer Spaltungstechnik nicht zugänglich ist und Bindung der synthetisierten Region an ein Fragment, um das gewünschte Fragment von der Human-GIP-Region allein herzustellen oder einer anderen physiologisch aktiven Region.
- Die klonierte doppelsträngige DNA, die für die Region des Human-GIP-Vorläufers oder ein beliebiges Fragment desselben kodiert, kann in ein Plasmid integriert werden unter Anwendung einer an sich bekannten Technik, beispielsweise durch Herausnahme eines Plasmids aus E. coli, Reinigung des Plasmids, Behandlung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, um das Plasmid an einer spezifischen Basenposition zu zerschneiden und Verschmelzen der klonierten DNA mit der Spaltungsstelle des geschnittenen Plasmids unter Verwendung einer DNA-Ligase um ein Plasmid mit der Recombinanten DNA zu re-konstruieren.
- Die einzelsträngige DNA, welche Human-GIP-Vorläufer oder dessen Fragment kodiert, kann als eine Sonde verwendet werden unter Nutzung derselben für eine Diagnose von insulinunabhängiger Diabetes auf Gen-Niveau. Ein Fragment von DNA, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die anders ist als GIP, kann verwendet werden, um ein neues physiologisch aktives Peptid zu suchen. Der GIP-Vorläufer, GIP per se oder andere physiologisch wirksame Substanzen können in großen Mengen hergestellt werden, indem man einen Mikroorganismus oder eine eukariotische Zelle mit dem Plasmid transformiert, dem die doppelsträngige DNA oder ein Fragment derselben integriert wurden und die Mikroorganismen oder eukariotische Zellen kultiviert.
- Die Erfindung wird jetzt an Hand von Beispielen und einem Testbeispiel zur Bestimmung einer Struktur eines klonierten menschlichen GIP-Vorläufer unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
- Fig. 1 eine Strategie zur Sequenzierung von klonierter cDNA, welche den erfindungsgemäßen Human-GIP-Vorläufer kodiert und eine Restriktionsenzym-Karte, in der nur die relevanten Restriktionsendonuklease-Stellen gezeigt sind;
- Fig. 2 eine bestimmte Nukleotidsequenz von klonierter cDNA, die menschlichen GIP-Vorläufer kodieren, sowie eine Aminosäuresequenz, die der Nukleotidsequenz in der Human-GIP- Vorläufer-Region entspricht; und
- Fig. 3 die Verfahrensstufen zur Herstellung eines Plasmids, wobei der Human-GIP-Vorläufer integriert wird.
- Durch ein Radio-Immunoassay und andere Methoden ist bekannt, daß das Human-GIP in einem oberen Bereich des Dünndarms und in anderen Organen vorliegt ["American J. Anatomy" Volk 1683 Seiten 109 bis 118 (1983)]. Deshalb wurde ein Duodenum, das von einem Patienten während einer Pakreas-Duodenectomie bei Pankreaskrebs erhalten wurde, gemäß dem Verfahren behandelt, das beschrieben ist von Chirgwin, J. M. et al ["Biochemistry" Vol. 18, Seiten 5294 bis 5299 (1979)]. Genauer gesagt wurde die gesamte BNA (1,2 mg) aus dem Gewebe extrahiert mit 4M-Guanidiumthiocyanat, unter Verwendung von 10 mMol-Trishydrochlorid-Puffer, enthaltend 0,5 M KCl, als einen Bindungspuffer, an eine Oligo(dT)cellulosesäule gebunden, und unter Verwendung eines Puffers, der frei von KCl ist, eluiert, um Poly(A)RNA (150 ug) zu erhalten.
- Durch eine Elektrophorese wird festgestellt, daß diese RNA nicht degradiert ist, im Hinblick auf die RNA-Banden bei 18s und 28s.
- Die cDNA-Bibliothek von Humanduodenum wird konstruiert unter Verwendung von 30 /g der erwähnten Poly(A)RNA und 4,3 ug Vektor/Primer-DNA, und zwar gemäß dem Verfahren, das beschrieben wurde von Okayama, H. und Berg, P. ["Mol. Gell. Biol." Vol. 2, Seiten 161 bis 170 (1982)]. E. coli (HB101) wird gemäß dem Verfahren transformiert, das beschrieben wurde von Morrison, D. A. ["Methods in Enzymol." vol. 68, Seiten 326 bis 331 (1979)]. Durch ein Screening unter Verwendung von LB-Agar- Platte, enthaltend 40 ug/ml Amplcillin, werden Ampicillinresistente Transformanten erhalten, und zwar mit 10 000 Zellen pro 1 ug der Poly(A)RNA, genauer gesagt etwa 300 000 Zellen insgesamt.
- Ein Gemisch von 16 Tetradecameren, jedes bestehend aus 14 Desoxyribonukleotiden der Formel
- welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
- Als-Met-Asp-Lys-Ile
- der 13. bis 17. Aminosäure vom N-terminalen Ende einer Aminosäuresequenz, die als jene des Human-GIP bekannt ist, und ein Gemisch von 16 Heptadecameren, jedes bestehend aus 17 Desoxyribonukleotiden der Formel
- welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
- Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile
- der 35. bis 40. Aminosäuresequenz vom N-terminalen Ende bei der bekannten Aminosäuresequenz von Human-GIP, werden synthetisiert, und zwar gemäß einer modifizierten Methode [Ito, N. et al "Nucleic Acids Res." Vol. 10, Seiten 1755 bis 1769 (1982)] der Triestermethode ["Tetrahedron Letters" Vol. 28, Seiten 2449 bis 2452 (1978)].
- Diese Desoxyribonukleotide schließen sämtliche der möglichen mRNA-Sequenzen ein, welche den genannten Aminosäurensequenzen entsprechen, ausgenommen den terminalen Nukleotidrest, welcher der 17. und 40. Aminosäure von "Ile" entspricht.
- Die Klonierung wird durchgeführt gemäß der Methode, die beschrieben ist von Hanahan, D. et al ["Gene" Vol. 10, Seiten 63 bis 67 (1980)]. Genauer gesagt werden etwa 30 000 Zellen unter den etwa 300 000 Ampicillin-resistenten Transformanten, die unter (b) beschrieben wurden, auf Nitrocellulosefilter repliziert, 3 bis 4 Stunden auf einer Agar-Platte, enthaltend 50 ug Ampicillin, kultiviert und auf eine LB-Agar-Platte transferiert, welche 500 ug Chloramphenicol enthält, um das Ganze bei 37ºC über Nacht weiter zu kultivieren. Eine auf dem Filter gebildete Kolonie wird einer Bakteriolyse unterworfen. Genauer gesagt wird eine doppelsträngige DNA in eine einzelsträngige DNA überführt, auf einer Platte fixiert, neutralisiert unter Einstellung eines pH von 7,5, und das Filter wird 5 Minuten in Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1,5M-NaCl, eingetaucht, um bakterielle Fragmente oder dergl., mit Ausnahme von DNA, zu entfernen. Anschließend wird das Filter an der Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC gebacken und auf diese Weise wird ein Testfilter für das Screening erhalten. Dabei handelt es sich um ein Nitrocellulosefilter, das die DNA von etwa 30 000 Transformanten trägt.
- Das Screening der Transformanten wird wie folgt durchgeführt, und zwar gemäß der Methode, die von Grunstein, M. et al ["proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." Vol. 72, Seiten 3961 bis 3965 (1975)] beschrieben wurde.
- Jedes der nach dem unter Punkt (c) angegebenen Verfahren synthetisierten Oligodesoxyribonukleotide, das durch die genannten Formeln A und B dargestellt wird, wird einer Endmarkierung am 5-terminalen Ende unterzogen mit [τ-³²P]ATP (Amersham, 5000 Ci/mMol) und T4 Polynukleotidkinase (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan). Auf diese Weise werden aus den Oligodesoxyribonukleotiden Sonden für das Screening erhalten. Eine relative Aktivität der jeweiligen Probe beträt 1 bis 2·10&sup6; cpm/pMol.
- Das Screening der Transformanten auf dem Testfilter erfolgt durch eine Hybridisierung bei 40ºC während 18 Stunden und unter Verwendung der markierten Oligodesoxyribonukleotide der durch die Formel B gezeigten Gruppe, die als Sonden dienen. Die Beurteilung erfolgt mit der Autoradiogramm-Methode. Man stellt fest, daß lediglich 6 Transformanten unter 30 000 Transformanten hybridisierte positive Klone sind. Diese positiven Klone werden anschließend durch eine weitere Hybridisierung bei 36ºC während 18 Stunden und unter Verwendung der markierten Oligodesoxyribonukleotide der durch die Formel A gezeigten Gruppe, die als Sonden verwendet werden einen screening unterzogen und auf die gleiche Weise wie oben bewertet. Man stellt fest, daß lediglich ein positiver Klon vorhanden ist.
- Dieser positive Klon, nämlich Human-(menschlichen)-GIP-Vorläufer enthaltender Klon, wird durch eine Elektrophorese analysiert. Dabei wird festgestellt, daß er eine cDNA-insert-Region von etwa 800 bp aufweist, umfassend Poly(dA)(dT) Schwänze und Poly(dG)(dC) Trakte. Diese klonierte DNA ist eine doppelsträngige und ihre Nukleotidsequenz wird im unten angegebenen Testbeispiel aufgeklärt. Die DNA kann deshalb in ein oder mehrere Fragmente unterschiedlicher Länge gebracht werden, indem man sie mit einem geeigneten Restriktionsenzym behandelt und falls erforderlich, eine synthetische DNA an das Fragment bindet, um ein gewünschtes DNA-Fragment zu erhalten, bestehend aus dem GIP-Vorläufer-Bereich, GIP-Bereich oder einem anderen Bereich, der bestimmte physiologische Aktivität zeigt.
- Die doppelsträngige DNA und doppelsträngiges DNA-Fragment oder Stück können in die entsprechenden einzelsträngigen Komponenten überführt werden durch Behandlung bei 90ºC während etwa 3 Minuten und anschließender Eiskühlung, wodurch eine Zersetzung verursacht wird.
- Eine Nukleotidsequenz des cDNA-Insertionsbereichs für den geklonten Human-GIP-Vorläufer wird direkt bestimmt oder durch Subklonierung an ein pUC19 Plasmid, und zwar gemäß der Methode, die beschrieben wurde von Maxam, A.M. et al ["Methods in Enzymol." Volk 65, Seiten 499 bis 560 (1980)] und der Methode, die beschrieben wurde von Hattori, M. et al ["Anal. Biochem" Vol. 152, Seiten 232 bis 238 (1980)], der ein modifiziertes Plasmid einsetzt.
- In Fig. 1 sind angegeben eine cDNA-Region des Human-GIP-Vorläufer enthaltenden Klons, Restriktionsenzyme, ausgewählt zur Bestimmung der Nukleotidsequenz in der Region und eine Strategie zur Sequenzierung der klonierten cDNA. Bei den Zahlenwerten am obersten Abschnitt der Figur handelt es sich um die Nukleotidzahlen, angegeben bezogen auf Human-GIP-Vorläufer- Region, die im mittleren Bereich der Figur als Kasten dargestellt ist. Bei "Ball" und ähnlichen Bezeichnungen handelt es sich um Namen von Restriktionsenzymen und ein dabei in Klammern angegebener Zahlenwert zeigt einen Spaltungsbereich oder die Startposition (Nukleotidzahl) zur Bestimmung der Nukleotidsequenz. In dem umrahmten Bereich für Human-GIP-Vorläufer zeigt eine Region (S) die vermutlichen Signalpeptide, ein weitere Bereich (GIP) zeigt den bereits bekannten, Human-GIP entsprechenden Bereich. Im unteren Abschnitt von Fig. 1 bezeichnet jede der horizontalen Pfeillinien eine Richtung und Grenze der zu bestimmenden Nukleotidsequenz auf Grund des jeweiligen Restriktionsenzyms. Jedes der Bestimmungsergebnisse, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren von Maxam A.M. et al durchgeführt wurde, ist durch einen Pfeil gezeigt mit einer kurzen vertikalen Linie, die eine isotopenmarkierte Position am 5'-Ende zeigte jedes Bestimmungsergebnis, das unter Anwendung "der von Hattori, M. et al. beschriebenen Dideoxymethode erhalten wurde, wird durch einen kleinen Kreis an einem Ende des Pfeils bezeichnet. Dieser Kreis gibt eine, Startposition für die Nukleotidsequenzierung an.
- Fig. 2 zeigt die auf diese Weise bestimmte Nukleotidsequenz der klonierten cDNA, die den Human-GIP-Vorläufer codiert, sowie die Aminosäuresequenz, die der Nukleotidsequenz in der Human-GIP-Vorläufer-Region entspricht. In Fig. 2 ist der an der Oberseite angegebene Zahlenwert der Zahlenwert der Nukleotide wie in Fig. 1 und ein weiterer Zahlenwert an der unteren Seite ist ein Zahlenwert der Aminosäurereste in der Human-GIP-Vorläufer-Region. Die mit einer durchgezogenen Linie eingefaßte Region zeigt die bekannte Human-GIP-Region und jede der mit gestrichelten Linien eingefaßten Regionen zeigt die Regionen, die als Sonde für das Screening der Transformanten in Beispiel 1 angewandt wurden. Man erkennt aus Fig. 2, daß von dem Startcodon von ATG für N-terminales Methionin ein offener Leserahmen für 153 Aminosäurereste existiert, bevor das erste Terminationscodon von TGA auftritt und die Nukleotidsequenz, die das bekannte Human-GIP codiert, darin vorliegt. Diese liegt in der Region von Tyrosin (Tyr) in der 52. Position der Aminosäurezahl bis Glutamin (Glu) in der 93. Position. Der N-terminale Bereich, nämlich das erste Met bis 20. Leu scheint eine Signalsequenz (S-Region in Fig. 1) zu sein, welche im Hinblick auf ihre Struktur, die aus relativ hydrophoben Aminosäuren besteht, allgemein bei sekretorischen Proteinen gefunden werden kann. Im Hinblick darauf, daß der der erwähnten GIP-Region entsprechende Bereich durch basische Aminosäuren von Arginin (Arg) begrenzt wird, scheint es so zu sein, daß GIP in der Form des Vorläufers sekretiert wird und anschließend durch eine Protease im Blut oder dergl. gespalten wird, unter Bildung von maturem GIP. Es gibt ein canonisches Polyadenylierungssignal, AATAAA (Nukleotide Hr 553 bis 558), das 55 bp vor dem Poly(A)Trakt angeordnet ist. Eine derartige Sequenz ist gewöhnlich viel näher am Ort der Polyadenylierung angeordnet und man könnte sagen, daß die Sequenz ATTAAA (Nukleotide Nr. 592 bis 597) die Polyadenylierungssequenz ist, die bei Human-GIP-mRNA verwendet wird.
- Diese Ausführungsform wird unter Bezugnahme auf die Zeichnung, und zwar insbesondere Fig. 3 erläutert. Zunächst wird der cDNA-Klon für Human-GIP-Vorläufer, wie er in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist, mit Restriktionsenzymen Eco471 und PstI behandelt, um ein Fragment von etwa 530 bp zu erhalten. Andererseits werden NheI und XHoI Linker hergestellt unter Verwendung eines von Pharmasia im Handel erhältlichen DNA-Synthesizer. Die Linker werden mit Eco471- und XhoI-Stellen des Fragments vereinigt.
- Ein im Handel erhältliches Plasmid ("pMSG", verkauft von Pharmasia) wird mit den Restriktionsenzymen Nhel und Xhol behandelt. An die resultierenden Enden werden die erwähnten Fragmente mit Linkern unter Rekonstruktion eines Plasmids gebunden, in das der Human-GIP-Vorläufer integriert ist.
- Wie im letzten Teil der Fig. 3 zu sehen ist, hat das resultierende Plasmid den DNA-Klon von Human-GIP-Vorläufer stromabwärts eines kraftvollen Promoters für eine lange terminale Wiederholungseinheit bei Mausmammatumor-Virus.
- Falls L- oder CHO-Zellen unter Verwendung eines derartigen Plasmids transformiert und kultiviert werden, kann daher der Human-GIP-Vorläufer leicht in großen Mengen hergestellt werden.
Claims (4)
1. Geklonte, einzelsträngige DNA, die für eine Inhibitor-
Polypeptid-Vorstufe des menschlichen Magens kodiert und ein
einzelnes, offenes Leseraster mit 459 Desoxyribonukleotiden
enthält, im wesentlichen bestehend aus folgender Sequenz;
wobei A, C, G und T für die jeweiligen
Desoxyribonukleotide stehen, die eine Adenin-Base, Cytosin-Base,
Guanin-Base oder eine Thymin-Base besitzen, und wobei die
Sequenz in Codons angegeben ist, welche je eine spezifische
Aminosäure kodieren,
oder irgendeine andere Nukleotidsequenz, die zur besagten
Sequenz degeneriert ist; oder eine doppelsträngige DNA, die
aus der besagten einzelsträngigen DNA und ihrer
komplementären einzelsträngigen DNA besteht.
2. Eine geklonte, einzelstrangige DNA oder
doppelsträngige DNA, gemäß Anspruch 1, wobei die besagte einzelstrangige
DNA 153 Aminosäure-Reste kodiert, im wesentlichen bestehend
wie folgt.
3. Plasmid, das eine doppelsträngige DNA enthält,
umfassend eine geklonte, einzelsträngige DNA, die für eine
Inhibitor-Polypeptid-Vorstufe des menschlichen Magens kodiert
und ein einzelnes, offenes Leseraster mit 459
Desoxyribonukleotiden enthält, im wesentlichen bestehend aus folgender
Sequenz:
wobei A, C, U
und T für die jeweiligen
Desoxyribonukleotide stehen, die eine Adenin-Base, Cytosin-Base,
Guanin-Base oder eine Thymin-Base besitzen, und wobei die
Sequenz in Codons angegeben ist, welche je eine spezifische
Aminosäure kodieren;
oder irgendeine andere Nukleotidsequenz, die zur besagten
Sequenz degeneriert ist, und ihre komplementäre
einzelsträngige DNA, oder ein Fragment der besagten
doppelsträngigen DNA.
4. Verfahren zur Herstellung einer geklonten,
einzelsträngige DNA, die 459 Desoxyribonukleotide enthält und eine
Inhibitor-Polypeptid-Vorstufe des menschlichen Magens kodiert
und einer doppelsträngige DNA, die aus der besagten
geklonten, einzelsträngigen DNA und ihrer komplementären
einzelsträngigen DNA besteht, wobei das Verfahren folgende
Stufen umfaßt:
- Umwandlung von RNA, extrahiert aus dem oberen Dünndarm,
in poly(A)-RNA;
- Erstellung einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung der
besagten poly(A)-RNA und Vektor-DNA zur Durchführung
einer Transformation von Escherichia coli, bei
vorausgehender Synthese einer Mischung von 16 Tetradecameren,
jedes bestehend aus 14 Desoxyribonukleotiden der Formel
welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
Ala-Met-Asp-Lys-Ile
der 13. bis 17. Aminosäure vom N-terminalen Ende einer
Aminosäuresequenz, die als jene des Inhibitor-Peptids
des Magens bekannt ist, und einer Mischung von 16
Heptadecameren, jedes bestehend aus 17
Desoxyribonukleotiden der Formel
welche komplementär zur mRNA ist, entsprechend
Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile
der 35. bis 40. Aminosäure vom N-terminalen Ende der
Aminosäuresequenz des Inhibitor-Peptids des Magens;
- Markierung jedes synthetisierten
Oligodesoxyribonukleotids der besagten Formeln (A) und (B) am
5'-terminalen Ende;
- Screening der besagten transformierten Escherichia coli
durch eine Hybridisierung unter Verwendung der besagten
markierten Oligodesoxyribonukleotiden als Sonden, um
die doppelsträngige DNA als positiven Klon zu erhalten,
welcher mit beiden Sonden-Gruppen hybridisiert; und
- falls erforderlich, Trennung der doppelsträngigen DNA
in ihre einzelsträngigen DNA-Strukturen.
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