WO1993019173A1 - Für aphrodisin kodierende dna - Google Patents

Abstract

Es wird eine DNA kodierend für Aphrodisin mit N-terminalem Signalpeptid, einem das Kopulationsverhalten von Kleinsäugern stimulierenden Polypeptid, beschrieben. Daraus sind DNA-Fragmente erhältlich, die als Nukleinsäuresonden zur analytischen Erfassung entsprechender Gene oder komplementärer Nukleinsäuren eingesetzt werden können. Ebenfalls wird ein Polypeptid beschrieben, das durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure erhältlich ist, sowie dessen Eignung als Arzneimittel. Ebenfalls werden Diagnostikmittel beschrieben, die auf Polypeptid- oder Polypeptidfragmentbasis oder entsprechenden Antikörpern gegen diese Polypeptide oder Polypeptidfragmente beruhen. Als Diagnostikmittel kommt ebenfalls die erfindungsgemäße Nuckleinsäure oder deren Fragmente, die für Aphrodisin kodieren, in Betracht.

Description

Für Aphrodisin kodierende DNA

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Desoxyribonu¬ kleinsäure, die für Aphrodisin mit und ohne Signalpeptid kodiert sowie deren Fragmente, Signalpeptid des Aphrodisins, Nukleinsäuren als Sonde für die DNA, die für das Peptid Aphrodisin oder Signalpeptid oder Kombinationen kodiert, das Expressionsprodukt dieser DNA in Form eines Peptids sowie ein Arzneimittel enthaltend dieses Peptid und schließlich ein Diagnostikmittel zur Aufspürung des Aphrodisins oder seiner aktiven Fragmente oder mit der Syn¬ these des Aphrodisins verbundener Nukleinsäuren.

Die sogenannten Pheromone sind Sexuallockstoffe', welche bisher aus einer Vielzahl von Organismen, angefangen von niederen Ein¬ zellern, wie Baktieren, bis hinauf zu den Säugetieren isoliert und charakterisiert werden konnten. Die Pheromone sind chemisch gesehen entweder niedere Terpene, höhere ungesättigte Fettsäuren oder Proteine/ Peptide und bewirken eine Kommunikation zwischen 2 oder mehreren Individuen im weitesten Sinne. Am bekanntesten sind die flüchtigen Pheromone der Insekten, die eine Partner- findung über Distanzen von mehreren Kilometern ermöglichen.

Obwohl ein Phero on-gesteuertes Kopulationsverhalten bei Säu¬ getieren schon früh vermutet und beschrieben wurde, konnte erst in jüngerer Zeit die Struktur eines Säugetier Pheromons auf Proteinbasis teilweise aufgeklärt werden (Henzel et al. , 1988, J. Biol. Chem., 263, 16682 - 16687). Dieses als Aphrodisin be¬ zeichnete Pheromon aus dem Hamster-Vaginalsekret hat ein Mole¬ kulargewicht von ca. 17.000 Dalton und besteht aus 151 Amino¬ säuren. Es wirkt bei Kontakt mit der Schnauze des Hamstermännchen und führt zu Kopulationsverhalten selbst gegenüber männlichen Aphrodisin-präparierten Hamstern (homosexuelles Kopu¬ lationsverhalten) .

Obwohl ein Pheromonsystem mit ähnlicher Wirkung bei der Maus beschrieben wurde (Singer et ai., 1988, Biol. Reprod. 38, 193 - 199) sind bisher keine Strukturdaten und Aminosäuresequenzen von Proteinpheromonen anderer Säugetiere als derjenigen des Hamsters bekannt geworden. Daten über Nukleotidsequenzen für Aphrodisin oder andere für homologe Protein-Pheromone kodierender Botenribo- nukleinsäuren ( RNA) "copy-Desoxyribonukleinsäuren" (cDNA) oder Gene entsprechender Proteine sind nicht bekannt. Auch die Existenz eines entsprechenden Vorläuferproteins des Aphrodisins ist nicht bekannt. Um das nutzbare physiologische Potential dieser interes¬ santen Wirkstoffgruppe zu untersuchen, erscheint es notwendig, diese Proteinklasse gezielt zu untersuchen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Werkzeug bereitzustellen, mit dem Aphrodisin und damit korrelierende Proteine bestimmt werden können.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine DNA gemäß Anspruch 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die DNA die folgende Nukleinsäuresequenz auf:

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT 9 18 27 36

CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GTC

51 60 69 78 87

ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA 99

108 117 126 135

TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA TG GAA 147

156 165 174 183

ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC 195

204 213 222 231

ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GGT 243

252 261 270 279 AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TTT 291

300 309 318 327

ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GTT 339

348 357 366 375

GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT

387 396 405 414 423

GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT

435 444 453 462 471

ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA

483 492 501

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die DNA die folgende Nukleinsäuresequenz auf:

ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT 9 18 27 36

CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GT

51 60 69 78 87

ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AG

99 108 117 126 135

TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GA

147 156 165 174 183

ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GT

195 204 213 222 231

ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GG

243 252 261 270 279

AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TT

291 300 309 318 327

ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GT

339 348 357 366 375

GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CT

387 396 405 414 423

GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AA

435 444 453 462 471

ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA

483 492 501 Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist auch die vollständige cDNA-Sequenz des Feldhamster-Aphrodisins mit vollständiger ko¬ dierender Region sowie 3'- nicht translatierter Region gemäß nachstehender Sequenz:

GCA AAG TCA GGC ACC ACC ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC

TTT AGT CTG GCT CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG

TAT ACC ATT GTC ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA

GGA CCA CTG AGA TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC

AGT GAA ATG GAA ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC

AAG ACC ACA GTC ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC

CAG TTT GAA GGT AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC

AAG ATT TTC TTT ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG

AAC ATG ATT GTT GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA

AAT GAA ATA CTT GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA

AAC ATT CTC AAT ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA TAA AGG CCT

TCC GTA GGT GAG AAC AGG ATG GCA ATT AGG CAT CAT ATC CTC TTG ATC

ATG GAA TCA GCA TCA CAA ATA AAT CAC CAT TTC ATT CTA CAT GAA TTG

TCC CAT CTC CTG TAG AGC CAG GAT ACC ACA TAT CAA ATT CCT GGC TTA

GCT TTC CTT TCC CAT CAC ATG ATG TAT TAC CTG TTC TTA TTT TTT TGA

CTG ATT AAA TAA ATT GTT TCA AGA AGC. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Sequenze die für Signalpeptide des Aphrodisins kodieren. Zwei Sequenz sind als Beispiele nachstehend aufgeführt:

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT

9 18 27 36

CAT GCT sowie

ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT

9 18 27 36

CAT GCT

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch DNA-Fragmente, die für entsprechende Fragmente des Aphrodisinpeptids mit o ohne Signalpeptid kodieren. Die analytische Erfassung von kleinsäuren, die für Aphrodisin mit oder ohne Signalpeptid dieren, auch auf Genabschnitten, kann mit hybridisierenden kleinsäuren, die z.B. komplementäre Sequenz besitzen, erfolg Dabei ist es, um eine eindeutige Aussage zu treffen, notwend sogenannte stringente Hybridisierungsbedingungen einzustell die durch Temperatureinflüsse, Einflüsse des gegebenen Medi etc. gesteuert werden können. Vorzugsweise sollten dabei Oli nukleotide mit mindestens etwa 40 Nukleotiden eingesetzt werd Ausgehend von der erfindungsgemäßen DNA lassen sich auch Hyb disierungssonden ableiten, die zur Aufspürung und Isolierung für Aphrodisin kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden k nen. Diese Sonden können unter stringenten Hybridisierungsbed gungen mit zu untersuchenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäu enthaltenden Proben umgesetzt werden. Solchermaßen aufgespü Nukleinsäuren, die beispielsweise auch aus RNA bestehen könn können dann durch an sich bekannte weitere Prozesse zu den e sprechenden Expressionsprodukten umgesetzt werden.

Auch das Signalpeptid bzw. dessen kodierende Nukleinsäuresequ kann Ziel einer diagnostischen Erfassung sein. Signalpept dienen üblicherweise zur Ausschleusung des synthetisierten P teins aus den Zellen des das Protein oder Peptid produzieren Organs. Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Signalpep¬ tid oder mit der Nukleinsäure des Signalpeptids in Wechselwir¬ kung tretenden Nukleinsäuren wie beispielsweise hybridisierende Oligonukleotide oder Antikörper/-fragmente können mithin zur Lokalisation des Entstehungsortes von Aphrodisin oder -Derivaten verwendet werden. Dabei kann es schon hinreichend sein, daß die mit dem Signalpeptid oder seiner kodierenden Sequenz (DNA oder RNA) in Wechselwirkung tretenden Antikörper/-fragmente oder Nu¬ kleinsäuren nur teilweise mit dem Signalpeptid in Wechselwirkung treten. Vorzugsweise kann die Sonde sowohl mit dem Signalpeptid- anteil wie auch dem Aphrodisinanteil der erfindungsgemäßen Nu- kleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder dem exprimierten Peptid selbst in Wechselwirkung treten.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Nukleinsäure der nachste¬ henden Sequenz

TCT AGA ATT CAR GGN AAR TGG TAY ACN ATT GTC ATT GCT GCT GAC AAT 9 18 27 36 - 45

CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT 57 66 75 84 93 102

TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GAA ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC

111 120 129 138 147 156

CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA

165 174 183 192 201 210

ACC CAG TTT GAA GGT AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG

219 228 237 246 255 264

ATT TTC TTT ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT

273 282 291 300 309 318

GTT GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT GTG

327 336 345 354 363 372

CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT ATT CTT GCT

381 390 399 408 417 426

ACA GAT ACT TGT CCT GAA TAA AGG CCT TCC GTA GGT GAG AAC AGG ATG GCA ATT

435 444 453 462 471 480

AGG CAT CAT ATC CTC TTG ATC ATG GAA TCA GCA TCA CAA ATA AAT CAC CAT TTC

489 498 507 516 525 534

ATT CTA CAT GAA TTG TCC CAT CTC CTG TAG AGC CAG GAT ACC ACA TAT CAA ATT

543 552 561 570 579 588 CCT GGC TTA GCT TTC CTT TCC CAT CAC ATG ATG TAT TAC CTG TTC TTA TTT TTT 597 606 615 624 633 642

TGA CTG ATT AAA TAA ATT GTT TCA AGA AGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 651 660 669 678 687 696

AAA AAA AAA AAA AAA AA 705

Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:

A = Adenin, R = A oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, G = Guanin, T = Thy in, .

Gegenstand der Erfindung sind auch Polypeptide, die erhältlich sind durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein Polypeptid der Struktur:

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Al

10 His Ala Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Va

20 3

Ile Ala Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Ar

40 Phe Tyr Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Gl

50 60

Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Va

70 Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gl

80 90

Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Ph

100 11

Thr Asn Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Va

120 Val Ala Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Le 130 140 Val Gin Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn

150

Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 160 167

Dieses Peptid kann aus dem Feldhamster (Cricetus cricetus) gewonnen werden. Ein weiteres Beispiel für ein Aphrodisin, das durch Expression der Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 erhätlich ist, ist nachstehend wiedergegeben:

Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

10 His Ala Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Val

20 30

Ile Ala Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg

40 Phe Tyr Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Glu

50 60

Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val

70 Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gly

80 90

Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe

100 110

Thr Asn Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val

120 Val Ala Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu

130 140

Val Gin Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn

150 Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 160 167 Dieses Protein kann aus dem Goldhamster isoliert werden, da die entsprechende DNA-Sequenz in dieser Spezies gefunden wur¬ de .

Ein weiteres Peptid, das erfindungsgemäß beansprucht wird, ist ein Fragment des Aphrodisins mit der nachstehend wiedergegebe¬ nen Struktur :

Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Val Ile Ala Ala Asp Asn 3 6 9 12

Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg Phe Tyr Phe Arg His Ile Asp Cys

16 19 22 25 28 31

Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys

35 38 41 44 47 50

Ser Lys Thr Thr Val Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe

54 57 60 63 66 69

Glu Gly Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe Thr

73 76 79 82 85 88

Asn Lys Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Gly Lys

92 95 98 101 104 107

Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin Phe Ala His Glu Lys

111 114 - 117 120 123 126

Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu

130 133 136 139 142 145

Dieses Polypeptid entspricht dem Aphrodisin mit Ausnahme der sechs N-terminalen Aminosäuren.

Die Signalpeptide, die aus den erfindungsgemäß beanspruchten Nukleinsäuren gemäß Ansprüchen 4 und 5 exprimiert werden, sind

ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung und weisen die

folgende Struktur auf:

^•

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

10 His Ala sowie Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

10 His Ala.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind als Arzneimittel ge¬ eignet. Dieses Arzneimittel enthält eine wirksame Menge min¬ destens eines Polypeptids oder mindestens ein pharmazeutisch wirksames Polypeptidfragment der Aphrodisine. Das Arzneimit¬ tel enthält vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und Trägerstoffe, die seine Anwendung ermöglichen. Als Appli¬ kationsformen kommen insbesondere auch topikale Anwendungs- formen in Betracht. Das Organ, über welches Aphrodisin beim Hamster wirkt, ist das sogenannte "Vomeronasale Organ" oder "Jacobsonsche Organ" . Es befindet sich in der Nase und ist beim Menschen größtenteils noch vorhanden (Ortmann, R. (1989) HNO 57, 191 - 197; Moran, D.T. _r Jafek, B.W. und Rowley, J.C. III (1991) J. Steroid Bioche . Molec. Biol. 39, 545 - 552; Steensaas, L.J., Lavker, R.M. , Monti-Bloch, L., Grosser, B.I. und Berliner, D.L. (1991) J. Steroid Biochem'. Molec. Biol. 39, 553 - 560) und wahrscheinlich sogar funktionstüchtig (Monti-Bloch, L. und Grosser, B.I. (1991) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 39, 573 - 582) .

Die das Polypeptid-enthaltenden Arzneimittel sind beispiels¬ weise zur Therapie von Potenz- und Fertilitätsstörungen sowie von daraus resultierenden psychischen Störungen einsetzbar. Eine Nutzung anderer auftretender Effekte, wie zum Beispiel Steigerung des allgemeinen Wohlbefindens, ist möglicht.

In der Tiermedizin können derartige Arzneimittel ebenfalls mit Erfolg eingesetzt werden, insbesondere auch zur Induk- tions des Kopulationsverhaltens bei der Zucht von Nutztieren aller Art sowie bei der Zucht von sich in Gefangenschaft schwer zu vermehren lassender Tieren, wie seltener exotischer Tiere. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch zur Therapie hormoneil bedingter Störungen des natürlichen Sexuallebens und dadurch bedingter psychischer Erkrankungen des Menschen dienen.

Als Diagnostikmittel zur Bestimmung des Titers von Aphrodisin oder deren pharmazeutisch wirksamen Derivate können die Pep¬ tide oder Peptidfragmente gemäß der Erfindung eingesetzt wer¬ den, beispielsweise in Kompetetions-Assays. Es ist ebenfalls möglich, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polypeptidfragments Antikörper oder Antikörperfragmente gegen entsprechende Epitope des Polypeptids oder Polypeptidfrag¬ ments herzustellen und diese Antikörper in einem Diagnostik- Assay zu verwenden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nuklein¬ säure, die als Hybridisierungssonde eingesetzt werden kann, ist es auf molekularbiologischer Ebene möglich, beispielswei¬ se den Titer von Aphrodisin kodierenden Nukleinsäuren zu be¬ stimmen und damit den Aphrodisin-Status zu bestimmen. Die Diagnostikermittel, die zur Detektion von Sigiialpeptiden des Aphrodisin Verwendung finden können, sind zur Bestimmung des Entstehungortes von Aphrodisin einsetzbar. Dafür kommen ins¬ besondere gegen die Nukleinsäure oder das exprimierte Signal¬ peptid gerichtete Antikörper oder deren Fragmente in Frage.

Es können auch von der Signalnukleinsäuresequenz abgeleitete komplementäre Nukleinsäuren als Hybridisierungssonden im Sin¬ ne des erfindungsgemäßen Diagnostikmittels eingesetzt werden. Es kommen als Diagnostikmittel auch solche in Frage, die mono- oder polyklonale Antikörper/-fragmente enthalten, wel¬ che gegen Epitope sowohl des Aphrodisins wie des entsprechen¬ den Signalpeptids gerichtet sind.

Die DNA gemäß Anspruch 9 wurde wie folgt isoliert: Aus einem Hamster-Uterovaginaltrakt wurde die RNA isoliert. Die cDNA- Erststrangsynthese wurde mit der RNA unter Verwendung eines Primers UNIP 2 und kommerziell erhälticher reverser Trans- kriptase (MMLV, Firma BRL) durchgeführt. Der Primer UNIP 2 besaß die folgende Struktur:

CCT GAA TTC TAG AGC TCA (T) 17.

Dieser Primer besteht aus 17 Thymidin-Nukleotiden, die kom¬ plementär zum Poly(A) -Schwanz eukaryontischer Botenribonu¬ kleinsäuren sind und einer Region am 5'-Ende, welche drei ErkennungsSequenzen für hexanukleotidspezifische Restrik- tionsendonukleasen besitzt.

Die Primer, die für die Polymerase Chain Reaction (PCR) ein¬ gesetzt werden, müssen komplementär zu den flankierenden Teilregionen der zu amplifizierenden DNA sein. Zunächst wur¬ den PCR-Primer konstruiert der folgenden Art:

Bezeich- Sequenz (5'->3') Variationen nung

AP-1 CCC TCT AGA ATT CAR GGN AAR TGG TAY ACN AT. 128

AP-2 CCT CTA GAA TTC TAY GTN ATH ACN AAY AAY CAR TG 768

AP-3 AAT CTA GAA TTC TTN CCY TCR AAY AAY TGN GTY TG 256

A -4 ACT CTA GAA TTC TTY TTY TCR TGM GCR AAY TGM AC 512

Die fettgedruckten Sequenzen an den 5'-Enden der Primer ent¬ sprechen nicht der Aphrodisin revers translatierten DNA- Sequenz, sondern beinhalten Erkennungssequenzen für Restrik- tionsendonukleasen. Hierdurch wird ohne mit der PCR-Reaktions zu interferieren eine Klonierung der PCR-Fragmente erleich¬ tert. Die Amplifikation Aphrodisin-spezifischer DNA-Fragmente durch die PCR-Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: Ein be¬ stimmtes Aliquot des cDNA-Erststrangsynthese-Ansatzes wurde in vier Ansätze mit den unterschiedlichen PCR-Primerkombinationen pipettiert. Dann wurde die PCR-Reaktion in Standardansätzen durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden im Vergleich mit einem DNA-Größenstandard elektrophoretisch in einem Agaro- segel getrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt und im UV- Licht beobachtet. In allen entsprechenden Ansätzen waren homo¬ gene DNA-Banden zu erkennen. Die entsprechenden Größen wurden mit Hilfe eine Regressionsprogrammes bestimmt und mit den zu erwartenden vorausberechneten Größen verglichen. Es ergaben sich gute Übereinstimmung der gemessenen mit den berechneten Werten. Das aus der Primer-Kombination AP-1 und AP-4 gewonnene amplifizierte Fragment wurde elektrophoretisch in einem Agaro- segel getrennt, die entsprechende Bande isoliert und mit Hilfe eeiinneess QQii;aex -DNA-Extraktionskits der Firma Diagen aus dem Gel isoliert

Zur Erzeugung der für die Klonierung notwendigen homogenen DNA-Einzelstrangenden wurde das Fragment unter Standardbedin¬ gungen mit der Restriktionsendonuklease Xba I von BRL behan¬ delt. Alle vier verwendeten PCR-Primer besitzen eine Erken¬ nungssequenz für dieses Enzym. DNA des Kloniervektors z. B. pUC-18 wurde mit dem gleichen Enzym zur Erzeugung Ligations- kompatibler Enden linearisier . Das erhaltene cDNA-Fragment wurde in einem Standardansatz und unter Verwendung eines DNA- Ligase-Enzyms mit der Vektor-DNA ligiert. Dieses Fragment wurde in einen Kloniervektor, z. B. pUC-18, 'eingebaut. E. coli-Bakterien wurden mit dem Ligationsansatz transformiert und auf einem Nähragar plattiert, der eine antibiotische Subs¬ tanz aufwies, gegen die die transformierten Zellen resistent waren. Nach hinreichend langer Inkubationszeit wurden die ge¬ wachsenen Kolonien identifiziert und vereinzelt. Aus den je¬ weils isolierten Klonen wurde anschließend mit Hilfe eines Nukleinsäureisolationskits (Qiagen -Miniprep-Kits der Firma Diagen) die rekombinante Plasmid-DNA präpariert. Von den iso¬ lierten Klonen wurden die Insertionen der Vektor-DNA jeweils von beiden Enden ausgehend sequenziert.

Die in Figur l abgebildete Gesamtsequenz wurde auf diese Weise erhalten. Über der cDNA-Sequenz der Figur 1 ist zusätzlich die daraus abgeleitete Proteinsequenz des Aphrodisins im Drei- Buchstaben-Code angegeben. Die Figur 1 zeigt darüber hinaus noch die Lage der Primer ap 1 bis ap 6. Der Vergleich der erhaltenen cDNA-Sequenz mit der aus der re- versen Translation des Proteins erhaltenen variablen Sequenz zeigt völlige Übereinstimmung (siehe Figur 2) innerhalb des klonierten Bereiches.

Die Figur 3 zeigt Fragmente aus verschiedenen Aphrodisin PCR- Ansätzen nach gelelektrophoretischer Größenauftrennung. Am oberen Rand des Bildes sind die verwendeten Primer-Kombinatio¬ nen angegeben.

Figur 4 zeigt die Größe der PCR-Fragmente gemäß Figur 3 in Kbp (Kilobasenpaare) .

Die Figur 5 zeigt das Ergebnis der "Northern-Hybridisierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschie¬ denen Abschnitten des Harnster-Uterovaginaltraktes. Es hybridi¬ siert nur die RNA aus Vagina und Bartholinischen Drüsen.

Die Figur 6 zeigt das Ergebnis der "Dot-Blot-Hybridisierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschie¬ denen Abschnitten des Hamster-Uterovaginaltrakt.es. Hybridi- sierungsexperimente zeigten, daß Aphrodisin hauptsächlich in vaginalem Gewebe und den Bartholinischen Drüsen synthetisiert wird.

Die Figur 7 zeigt das Ergebnis der "Southern-Hybridisierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen genomische DNA aus verschiedenen Tierarten.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Hybridisierungssonde konnte der Syntheseort des Aphrodisins innerhalb des Harnster-Uterova¬ ginaltraktes genauer lokalisiert werden. Dazu wurde RNA aus verschiedenen Abschnitten des Uterovaginaltraktes (Ovarien, UterusSchenkel, Uterus, Vagina, Bartholinische Drüsen; extra¬ hiert. Hybridisierungsexperimente zeigten, daß das Aphrodisin hauptsächlich in vaginalem Gewebe, eventuell auch in den Bar¬ tholinischen Drüsen synthetisiere wird. Die Autoradiorramme der entsprechenden Hybridisierungsexperimente zeigen die Figu¬ ren 5 und 6.

Die Existenz aphrodisinspezifischer Gene in anderen Spezies konnte mittels der erfindungsgemäßen Hybridisierungssonde un¬ tersucht werden. Es wurde dazu genomische DNA aus Meerschwein¬ chen, Ratte, Tupaia (Streifenhörnchen-Primat) , Kaninchen sowie als Referenz Hamster extrahiert. Die Hybridisierungsbedingun- gen wurden etwas weniger stringent gewählt, um Basen- fehlpaarungen entsprechender Nukleinsäuren der anderen Spezies auszugleichen. Figur 7 zeigt das Ergebnis der Hybridisierungs¬ experimente, aus denen sich ergibt, daß in allen genannten Spezies Aphrodisin Gene ähnliche Nukleinsäuren vorhanden sein müssen.

Mit Hilfe einer Hamster-Aphrodisin-cDNA (wie oben beschrieben) als Hybridisierungsprobe konnten vier unabhängige Phagenklone aus einer gekauften Goldhamster-Genbank (Stratagene) isoliert werden, welche alle das Goldhamster-Aphrodisin-Gen enthielten. Fragmente dieses Gens wurden in das Plasmid pUC 18 "subklo- niert" und Teile davon sequenziert. Dabei ist es gelungen, zusammenhängende Sequenzdaten aus dem Bereich des Promotors- Exon I-Intron I zu erhalten. Neben den reinen Sequenzdaten (siehe anliegende Blätter Promotor-Region des "Goldhamster- Aphrodisin-Gens" und "Aphrodisin-Gen, Intron I") ergeben sich hieraus folgende Schlußfolgerungen:

Die aus der Sequenz des Exons I abgeleiteten, innerhalb des prozessierten Aphrodisins liegenden Aminosäuren, stimmen voll¬ kommen mit der Hamster-Sequenz überein (Gin Asp Phe Ala Glu) .

Das Goldhamster-Aphrodisin besitze in seiner unprozessierten Form (also sofort nach Translation der Botenribonukleinsäure) N-terminal zusätzlich nur ein 16 Aminosäuren langes Peptid, das eine für sekretorische Signalpeptide typische Sequenz auf¬ weist: Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala

In den Regionen des Promotors und des ersten Introns befinden sich einige kurze Sequenzen ("Motifs"), die typisch für Binde- steilen diverser genregulatorischer Proteine sind. Diese Be¬ reiche sind über- und unterstrichen und mit der Bezeichnung des Sequenz-"Motifs" oder des bindenden Proteins versehen (z. B. Oct-1, NF-I, AP-1 etc.).

Das Resultat einer "Northern-Hybridisierung" radioaktiv mar¬ kierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschiedenen Goldham¬ ster- und Rattengeweben findet sich in der anliegenden Abbil¬ dung. Hierbei ist im erwarteten Größenbereich ein Signal aus Ratten-Bartholini-Drüse zu sehen, was auf die dortige Synthese

eines Aphrodisin-verwandten Proteins hinweist.

Die Abbildung 8 zeigt "Northern-Hybridisierung" radioaktiv markierter Aphrodisin-cDNA gegen RNA aus verschiedenen Ham¬ ster- und Rattengeweben.

Spuren:

1 Hamster Vagina

2 Hamster Bartholini Drüse

3 Ratte Bartholine Drüse

4 Ratte Vagina Tier 1

5 Ratte Vagina Tier 2

6 Ratte Vagina Tier 3

7 Ratte Vagina Tier 4

Das Autoradiogramm zeigt die typischen, relativ starken Hybri- disierungssignale aus Hamster-Vagina und -Bartholini Drüse. Die Ratten-Bartholini Drüse zeigt ebenfalls eine Hybridisie- rungssignal in der für Aphrodisin-mRNA erwarteten Höhe, was darauf hindeutet, daß dort möglicherweise ein ähnliches Pro¬ tein synthetisiert wird.

Die Signale in Höhe der 18 S ribosomalen RNA sind wahrschein¬ lich durch eine oft beobachtete, konzentrationsbedingte Kreuz- hybridisierung mit dieser RNA zu erklären.

Das sekretorische Signalpeptid von 16 Aminosäuren ist vermut¬ lich verantwortlich für die Ausschleusung des Aphrodisins aus der Zelle, wobei üblicherweise sekretorische Signalpeptidasen das Peptid schneiden und dann ausschleusen. Eine DNA kodierend für Aphrodisin und zusätzlich für eine Signalsequenz kann von erheblicher praktischer Bedeutung sein bei der Gewinnung des Aphrodisins in eukarvonten Zellen, beispielsweise in Kulturen von Insektenzellen.

Im folgenden wird beschrieben wie die komplette cDNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenz des Signalpeptides für eine Spe¬ zies, nämlich Feldhamster (Cricetus cricetus) ermittelt wurde. Diese Sequenz unterscheidet sich von der oben beschriebenen gemäß Anspruch 3 bzw. 12 dadurch daß diese Sequenz nicht aus dem Goldhamster-Gen ermittelt worden, sondern direkt aus der Feldhamster-cDNA.

Mit Hilfe der Primer Extension Analyse kann im Promotorbereich eines Gens der Transkriptionsstartpunkt und damit der Ξ'-ter- minale Beginn einer mRNA bestimmt werden.

Die Primer Extension Analyse wurde unter Standardbedingungen (Sambrook, J., Frisch, E.F. und Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor laboratory) mit Hilfe des Oligonuciεctides AP-13 TCC TGA GCA TGA GCC CGA durchgeführt.

Es wurden je 10 μg Gesamt-RNA aus Feldhamster-Uterovaginal- trakt und -Gehirn (Negativkontrolle) eingesetzt. Die erhaltene Fragmentgröße des Polymerisationsproduktes betruq 103 2-i cleo- ride, womit die beiden Adenosine in Position 298 und 299 der Figur 10 als Transkriptionsstartpunkte in Frage kommen. Diese beiden Adenosine weisen auch den erwarteten Abstand des inner¬ halb von Promotorregionen stark konservierten "TATA-Box"- Motifs auf. Weiterhin befinden sie sich innerhalb eines Blocks von Pyrimidinen, was ebenfalls typisch für Transkriptions¬ startpunkte ist.

Ausgehend von der Primer Extension Analyse wurde ein PCR-Pri- mer konstruiert RAP-2 GGA AAA GCA AAG TCA GGC ACC, der eine Amplifikation der noch fehlenden, 5' -terminalen, codierenden Region der Feldhamster-Aphrodisin-cDNA ermöglichte. Die diesem Primer entsprechende Region des Gens befindet sich zwischen dem Transkriptionsstart und dem ersten ATG-Codon, also dem Translationsstart. Der Primerbereich endet 3'-terminal 4 Nu- cleotide von dem ATG. Als "Gegenprimer" wurde das Oligonucleo- tid AP-8 GCA GTT TTT ATA ACA ATC AAT ATG konstruiert, dessen entsprechende cDNA-Region bereits innerhalb der Sequenz gemäß P 42 08 634 repräsentiert ist (Nucleotide von Position 85-108, revers komplementär) .

Mit 1 μl Feldhamster-cDNA aus Uterovaginaltrakt, die gemäß P42 08 634 hergestellt wurde (siehe dazu auch Abb. 9 und 11) , wur¬ de eine Vorverstärkung im analytischen (100 μl) Maßstab unter folgenden Bedingungen durchgeführt (Vorverstärkung mit 35 Zy¬ klen, Primerkombination RAP 2/AP 8) :

0 sec 96°C Denaturierung der DNA

30 sec 46°C Pri erhybridisierung ("Annealing")

1 min 72°C Elongation (Polymerisationsreaktion)

Aus diesem Vorverstärkungsansatz wurden 5 μl entnommen und in die Endverstärkung mit den PCR-Primern RAP-2 und AP-8 einge¬ setzt:

0 sec 96°C Denaturierung der DNA

1 min 55°C Primerhybridisierung ("Annealing") - I Q

1 min 72°C Elongation (Poly erisationsreaktion)

0 sec bedeutet in diesen experimentellen Ansätzen, daß sofort nach Erreichen von 96°C die Pri erhybridisierungstemperatur angesteuert wird. Die allgemeinen PCR-Bedingungen sind gemäß P 42 08 634 gewählt.

Das erhaltene, 198 Basenpaare große PCR-Fragment wurde elek- trophoretisch in einem 3%igen GTG-Agarose-Gel der Firma NuSie- ve von nicht umgesetzten Primern und anderen Komponenten des Ansatzes abgetrennt. Das Fragment wurde durch Fluoreszenz bei UV-Strahlung im Agarosegel lokalisiert, ausgeschnitten und über "Ultrafree-MC Filtereinheiten" (zuerst 0,45 μ Durapore, dann PTTK Polysulfon-Membran) der Firma Millipore gereinigt. Es lag zum Schluß in 50 μl Aqua bidest gelöst vor. Die Ausbeu¬ te betrug ca. 600 ng.

Das gereinigte Fragment wurde direkt, ohne Umweg einer Klo¬ nierung, mit Hilfe des Fluoreszenz-Sequenzers^' 373A und dem "Dye Terminator Sequencing Kit" der Firma Applied Biosystems nach dem Verfahren des Taq-Cycle-Sequencing sequenziert. Die Sequenzierung erfolgte in zwei Ansätzen von beiden Enden des Fragmentes, unter Verwendung der PCR-Primer RAP-2 bzw. AP-8 als Sequenzierprimer. Es wurden je 60 ng des Fragmentes in die Sequenzierung eingesetzt.

Da die erhaltene Sequenz mit der noch nicht ganz vollständigen DNA-Sequenz gemäß Anspruch 9 überlappt, konnte nun eine full- length-cDNA Sequenz erstellt werden, welche den vollständigen codierenden Bereich sowie die komplette "3' -nichttranslatierte Region" bis zum Poly(A)-Ende enthält (siehe Abb. 11 und 12) .

Mit Hilfe dieser Sequenz konnte durch Übersetzung des geneti¬ schen Codes die Aminosäuresequenz des Aphrodisin-Signalpepti- des aus Feldhamster ermittelt werden (siehe Abb. 12 und 13) . Im Vergleich zu der Goldhamster-Sequenz zeigt sich hier eine Abweichung in Posicion 6. Statt des Valins tritt ein Leucin in der Signalpeptidsequenz auf.

Beispiel

Aus einem Hamster-Uterovaginaltrakt mit einem Naßgewicht von 600 mg wurden 165 μg Gesamt-RNA extrahiert .

Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit 5 μg der präparierten RNA unter Verwendung des selbst synthetisierten Primers UNIP 2 und MMLV- Reverser Transkriptase der Firma BRL durchgeführt . Der Primer besteht aus 17 Thymidin-Nukleotiden, die komplemen¬ tär zum Poly (A) -Schwanz eukaryonti scher Botenribonukleinsäuren sind und einer Region am 5 ' -Ende , welche drei Erkennungsse¬ quenzen für hexanukleotidspezifische Restriktionsendonukleasen besitzt .

CCT GAA TTC TAG AGC TCA (T) 17

Es wurden die folgenden Aphrodisin- PCR- Primer synthetisiert .

Bezeich- Sequenz { 5 ' - >3 ' } Variationen nung

AP-1 CCC TCT AGA ATT CAR GGN AAR TGG TAY ACN AT 128

AP-2 CCT CTA GAA TTC TAY GTN ATH ACN AAY AAY CAR TG 768

AP-3 AAT CTA GAA TTC TTN CCY TCR AAY AAY TGN GTY TG 256

AP-4 ACT CTA GAA TTC TTY TTY TCR TGN GCR AAY TGN AC 512

Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:

A = Adenin, R = A oder G, S = C oder G, K = A oder C oder T, V = A oder C oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, W= A oder T, G = Guanin, M= A oder C, T = Thymin, K = G oder T, B = C oder G oder T, D = A oder G oder T. 93/19173

21 -

Mit den genannten Primern bzw. Primerkombinationen wurde die Polymerase Chain Reaction durchgeführt. Je ein 1/15 des cDNA- Erststrangsyntheseansatzes wurden in vier Ansätzen mit unter¬ schiedlicher PCR-Primer-Kombination pipettiert:

Ansatz 1 PCR-Primer AP-1 und AP-3 Ansatz 2 PCR-Primer AP-1 und AP-4 Ansatz 3 PCR-Primer AP-2 und AP-3 Ansatz 4 PCR-Primer AP-2 und AP-4

Die PCR-Reaktionen wurden in Standardansätzen mit folgenden Zyklen gefahren:

94°C 30 sec "Aufschmelzen" der DNA-Doppelstränge 45°C 1 min Hybridisierung der Primer mit Ziel-

DNA

72°C 1 min "Elongation"=Polymerisations-Reaktion

Es wurden insgesamt 40 Zyklen gefahren und anschließend noch ein Zyklus unter gleichen Bedingungen, jedoch mit zehnminüti¬ ger Elongationszeit, um sicherzustellen, daß alle Polymerisa¬ tionsprodukte in voller Länge vorliegen.

Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurden je l/io der PCR-Ansät- ze zusammen mit einem DNA-Größenstandard elekrophoretisch in einem "Mini"-Agarosegel aufgetrennt mit Ethidiumbromid ange¬ färbt und bei Durchlicht (UV-Licht) photographiert. In allen vier Ansätzen waren homogene DNA-Banden erkennbar. Die Größen der entsprechende PCR-Produkte wurden mit Hilfe eine Regres- sionsprogrammes bestimmt und mit den zu erwartenden vorausbe¬ rechneten Größen verglichen. -

Die Amplifikation der korrekten Fragmente wurde verifiziert, indem ein Teil von Ansatz 2 mit den Primer AP-2 und AP-3 er¬ neut amplifiziert wurden entsprechend Ansatz 3. Da das Primer¬ paar A.P-2/AP-3 innerhalb der Region liegt, gegen weiche die Pri εr AP-1 und AP-4 aus Ansatz 2 hybridisieren, wäre im Falle eines Aphrodisin-spezifischen DNA-Fragments im Ansatz 2 aus der erneuten Amplifikation ein Ansatz 3 entsprechendes DNA-

Fragment zu erwarten. Dies konnte elektrophor^'etisch verifi¬ ziert werden. Das DNA-Fragment gemäß Ansatz 2 ist das größte der cDNA-Fragmente aller vier PCR-Ansätze und wurde für die Klonierung weiterverwendet. Die PCR-Produkte gemäß Ansatz 2 wurden elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt, prä- parativ isoliert und mit Hilfe eines Qiaex -DNA-Extraktions- kits der Firma Diagen aus dem Gel isoliert.

Homogene DNA-Einzelstrangenden wurden erzeugt durch Behandlung des PCR-Fragments unter Standardbedingungen mit der Restrik- tionsendonuklease Xba I von BRL (Bethesda Research Laborato¬ ries; . Jeder der verwendeten PCR-Primer besaß eine Erkennungs- sequenz für das Restriktionsenzym. DNA des Klonierungsvektors pUC-18 wurde mit dem gleichen Enzym zur Erzeugung Ligations- kompatibler Enden iinearisiert.

Das erhaltene cDNA-Fragment wurde in einem Standardverfahren unter Verwendung des Enzyms T4-DNA-Ligase (Firma Bethesda Re¬ search Laboratories) mir. der Vektor-DNA des Vektcrs oUC-2S ligiert. Ξ. coli DH5 -Zellen wurden mit dem Ligationsansatz transformiert und auf Ampicillin-hal igern L3-Nähragar ausplat¬ tiert. Hierauf können nur solche Zellen wachsen, welche ein Molekül des rekombinierten Vektors pUC-18 beinhalten. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden drei Klone (Bakterien¬ kolonien) mit rekombiniertem Vektor identifiziert und verein¬ zelt. Die Klone erhielten die Bezeichnung pPET-1, pPET-2 und pPET-3. Aus diesen Klonen wurde anschließend mit Hilfe des Qiagen -Miniprep-Kits der Firma Diagen jeweils ca. 5 μg Vek¬ tor-DNA präpariert. Von je 1 μg Vektor-DNA aller drei Klone wurden die Insertionen jeweils von beiden Enden ausgehend in üblicher Weise sequenziert. Aus der Sequenzierung wurde die Gesamtseσuenz des DNA-Fragments gemäß Ansatz 2 ermittelt.

Aus den erhaltenen Seσuenzdaten wurden zwei hochspezifische PCR-Primer synthetisiert, die im Gegensatz zu den Primern AP l - 4 nicht mehr bzw. gering variiert waren (nur aufgrund von Sequenz-Unsicherheit AP-6 zweifach variiert) , sondern genau der Aphrodisin-cDNA entsprachen. Ihre Sequenzen sind im fol¬ genden aufgelistet:

Bezeichnung Sequenz (5'->3')

AP-5 AAA TCT AGA ATT CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC ATT GG

AP-6 CGG TCT AGA ATT CGG AAA TGG AAC YTA CCA AAC CCA GTT TG

Bereiche, welche Erkennungssequenzen für Restriktionsendonu- kleasen enthalten, sind fett dargestellt.

Die Primer entsprechen den Regionen 158 - 182 bzw. 193 - 220 der cDNA. Mit ihrer Hilfe und dem Primer "UNIP-2" (komplemen¬ tär zum Poly(A)-Ende der mRNA) war eine Amplifikation des 3'- terminalen Restes der cDNA bis zum sogenannten "Poly(A)- Schwanz" möglich. Dies wurde in zwei Stufen analog zu dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit folgenden Modifikationen durchgeführt:

Ansatz 5 PCR-Primer AP-5 und UNIP-2 9 °C 30 sec "AufSchmelzer." 50°C l min Hybridisierung 72°C l min Elongation

Es wurden 10 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei im letzten Zyklus die Ξlongationszeit auf 10 min verlängert wurde. Aus Ansatz 5 wurde 1 μl entnommen und in Ansatz 6 mit den Primern AP-6, der weiter in Richtung 3'-Terminus hybridisiert, und UNIP 2 in 30 Zyklen unter gleichen Bedingungen "nachverstärkt" (erhöhte Spezifität durch 2 Amplifikationen mit unterschiedlichen Pri¬ mern) . Im letzten Zyklus wurde auch hier die Elongationszeit auf 10 Minuten verlängert.

Das Amplifikationsprodukt wurde elektrophoretisch überprüft. Die aus der Elektrophorese erhaltene Fragmentgroße (560 bp) stimmte erneut relativ gut mit der errechneten Größe (530 bp) überein (siehe Abb. 3 und Abb. 4) .

Das amplifizierte DNA-Fragment wurde weiterverarbeitet, wie oben beschrieben, mit dem Unterschied, daß 5 Klone isoliert

und sequenziert wurden. Diese Klone erhielten die Bezeichnung pPET 11 - 15.

Aus den Se uenzdaten konnte die Aphrodisin-cDNA-Sequenz bis zum Poly(A) -Schwanz ergänzt werden. Die aus der Sequenz abge¬ leitete Protein-Sequenz stimmte mit der bekannten Aminosäures- seσuenz (Figur 1) überein.

Um den Syntheseort des Aphrodisins innerhalb des Hamster-Ute- rovaginaltraktes genauer lokalisieren zu können wurde aus 5 Goldhamstern die RNA verschiedener Abschnitte des Uterovagi- naltraktes (Ovarien, Uterusschenkel, Uterus, Vagina, Bartholi- nische Drüsen) extrahiert. Von dieser RNA wurden einerseits je 5 g gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran (Amersham Hybond N+) übertragen ("Northern-Blotting") , ande- D

rerseits verschiedene Massen (0,02 - 2 g) direkt punktförmig auf Nylonmembran fixiert • "Dot-Blotting") . Die Membran-gebun¬ dene RNA wurde unter hochstringenten Bedingungen (42°C) gegen radioaktiv markierte Aphrodisin-cDNA des Klons pPET 1 hybridi¬ siert und danach unter stringenten Bedingungen gewaschen (Ca- sey, J. und Davidson, N. 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1539 - 1552) :

Hybridisierungslösung (10 ml) :

ca.

markierte

Aphrodisin-cDNA

Die Hybridisierung erfolgte über Nacht (ca. 16' Stunden) . Die Autoradiogramme sind in Figuren 5 und 6 gezeigt. Aus den Auto¬

radiogrammen ist ersichtlich, daß die Aphrodisin-cDNA unter den genannten Bedingungen nur gegen eine mRNA-Species hybridi¬ siert (nur eine homogene Bande in der Northern-Hybridisie¬ rung) . Weiterhin kann aus den "Northern"- und "Dot-Blot"- Hybridisierungen geschlossen werden, daß Aphrodisin hauptsäch¬ lich in vaginalem Gewebe, und in den Bartholinischen Drüsen synthetisiert wird.

Um die Existenz Aphrodisin-spezifischer Gene in anderen Spe¬ zies als Hamster zu überprüfen, wurde genomische DNA aus Meer¬ schweinchen, Ratte, Tupaja (Streifenhörnchen-Primat) , Kanin¬ chen und auch Hamster extrahiert. Je 5 g der DNA wurde mit dem Hexanukleotid-spezifischen Restriktionsenzym Hind III hydro- lysiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf Nvlonmembran (Amersham Hybond N+) übertragen. Da mit Basenfehlpaarungen in anderen Species als Hamster zu rechnen war, wurde die Membran- gebundene DNA unter Bedingungen nur mittlerer Stringenz (37°C, siehe Formamid-Konzentration* in Hybridisierlösung) über Nacht (ca. 16 Stunden) gegen radioaktiv markierte Aphrodisin-cDNA hybridisiert und danach unter stringenten Bedingungen gewa¬ schen (Casey, J. und Davidson, N. 1977, Nucl. Acids Res. , 4, 1539-1552) :

Hybridisierungslösung (10 ml) :

ca.

Aphrodisin-cDNA

*Die Formamid-Konzentration ist mitbestimmend für die Stringenz einer Hybridisierung: Je höher die Konzentra¬ tion, desto höher die Stringenz.

Das Autoradiogramm (Figur 7) zeigt, daß die Stringenz ausrei¬ chend hoch war, um mit Ausnahme der Kaninchen-DNA nur jeweils 1 Signal in allen Spezies zu ergeben. Es zeigt vor allem, daß in allen untersuchten Spezies Aphrodisin-Gen ähnliche Gene vorhanden sein müssen, die möglicherweise Pseudogene oder In- tergen-Sequenzen sind. Das Signal im niedermolekularen Bereich der Kaninchen-DNA stellt keinen Widerspruch zu ausreichender Stringenz dar, da sich eine Kind III-Ξrkennungssequenz im Aphrodisin-Gen entsprechenden Bereich der Kaninchen-DNA befin¬ den könnte. Dies würde nach Hind III-Hydrolyse zur Bildung von zwei hybridisierenden Fragmenten führen- Die Größen der hy¬ bridisierenden Hind III-DNA-Fragmente konnten durch Vergleich mit einem Größenstandard wie folgt abgeschätzt werden: Hamster, Kaninchen, Tupaja ca. 8000 Basenpaare

Ratte > 8000 Basenpaare

Meerschweinchen ca. 3500 Basenpaare

Die Größenübereinstimmung bei Hamster, Kaninchen und Tupaja zeigt ebenfalls die Spezifität der Hybridisierung.

- 26 -

SEQUENZPROTOKO:

(1) ALGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Forssmann, Wolf-Georg

(B) STRASSE: Feodor-Lynen-Strasse 5

(C) ORT: Hannover

(E) LAND : Germany

(F) POSTLEITZAHL : W-3000

(ii) ANMELDETITEL: Fuer Aphrodisin kodierende DNA (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 22

(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC coπroatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1 :

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 501 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..501

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT CAT GCT 48 Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 5 10 15

CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GTC ATT GCT 96 Gin ASD Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lvs Tro Tyr Thr Ile Val Ile Ala 20 25 30

GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA TTC TAT 144 Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Glv Gly Pro Leu Arg Phe Tyr 35 40 ^" 45

TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GAA ATC ACA 152 Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lvs Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr 50 55 60

TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC ATT GGG 24C Phe Tyr Val Iiε Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val Ile Gly 65 70 75 80 TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GGT AAC AAT 288 Tvr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gly Asn Asn 85 90 95

ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TTT ACC AAC 336 Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 110

AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GTT GTT GCT 384 Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Ala 115 120 125

GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT GTG CAA 432 Glv Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin 130 135 140

TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT ATT CTT 480 Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu 145 150 155 160

GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA 501

Ala Thr Asp Thr Cvs Pro Glu 165

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 167 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 5 10 15

Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys TΓD Tyr Thr Ile Val Ile Ala 20 25 ^* 30

Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg Phe Tyr 35 40 45

Phe Arg His Ile ASD Cvs Tyr Lvs Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr 50 55 60

Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val Ile Gly 65 70 75 80

Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Glv Asn Asn

85 90 ^" 95

Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser ASD LVS Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 HO

Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Ala 115 120 125

Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin 130 135 140 Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu 145 ^" 150 155 160

Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 165

•!2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 501 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..501

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT CAT GCT 48 Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 5 10 15

CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GTC ATT GCT 96 Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Txp Tyr Thr Ile Val Ile Ala 20 25 30

GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA TTC TAT 144 Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg Phe Tyr 35 40 45

TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GAA ATC ACA 192 Phe Arg His Ile A^ Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr 50 55 60

TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC ATT GGG 240 Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val Ile Gly 65 70 75 80

TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GGT AAC AAT 288 Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gly Asn Asn 85 90 95

ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TTT ACC AAC 336 Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 110

AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GTT GTT GCT 384 Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Ala 115 120 125

GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT GTG CAA 432 Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin 130 135 140 TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT ATT CTT 480 Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu 145 150 155 160

GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA 501

Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 165

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4 :

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 167 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala

1 5 10 15

Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Val Ile Ala 20 25 30

Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg Phe Tyr 35 40 45

Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr 50 55 60

Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val Ile Gly 65 70 75 80

Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gly Asn Asn

85 90 95

Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lvs Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 ^' HO

Lys Asn Met ASD Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Ala 115 120 125

Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin 130 135 140

Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu 145 150 155 160

Ala Thr ASD Thr Cvs Pro Glu 165

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 747 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: IS..519

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

GCAAAGTCAG GCACCACC ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT 51

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe 1 5 10

AGT CTG GCT CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT 99 Ser Leu Ala His Ala Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr 15 20 25

ACC ATT GTC ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA 147 Thr Ile Val Ile Ala Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly 30 35 40

CCA CTG AGA TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT 195 Pro Leu Arg Phe Tyr Phe Arg His Ile ASD Cys Tvr Lys Asn Cvs Ser 45 50 ~ 55

GAA ATG GAA ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG 243 Glu Met Glu Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys 60 65 70 75

ACC ACA GTC ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG 291 Thr Thr Val Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin

80 85 90

TTT GAA GGT AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG 339 Phe Glu Gly Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys 95 100 105

ATT TTC TTT ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC 387 Ile Phe Phe Thr Asn Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn 110 115 120

ATG ATT GTT GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT 435 Met Ile Val Val Ala Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn 125 130 135

GAA ATA CTT GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC 483 Glu Ile Leu Val Gin Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn 140 145 150 155

ATT CTC AAT ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA TAAAGGCCTT 529

Ile Leu Asn Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cvs Pro Glu 160 165

CCGTAGGTGA GAACAGGATG GCAATTAGGC ATCATATCCT CTTGATCATG GAATCAGCAT 589

CACAAATAAA TCACCATTTC ATTCTACATG AATTGTCCCA TCTCCTGTAG AGCCAGGATA 649

CCACATATCA AATTCCTGGC TTAGCTTTCC TTTCCCATCA CATGATGTAT TACCTGTTCT 709

TATTTTTTTG ACTGATTAAA TAAATTGTTT CAAGAAGC 747 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6: li) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 157 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala

1 ^" 5 10 15

Gin ASD Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trr> Tyr Thr Ile Val Ile Ala 20 25 30

Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg Phe Tyr 35 40 45

Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lvs Asn Cys Ser Glu Met Glu Ile Thr 50 55 ^" 60

Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lvs Thr Thr Val Ile Gly 65 70 75 80

Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tvr Gin Thr Gin Phe Glu Gly Asn Asn 85 ^' 90 95

Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 HO

Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val Val Ala 115 120 125

Gly Lvs Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu Val Gin

130 135 140

Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn Ile Leu

145 150 155 160

Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 165

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 48 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..48 (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SΞQ ID NO: 7:

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT CAT GCT 48 Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 ^" 5 10 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 5 10 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: S:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 48 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

• (C) STRANGFORM: nicht bekannt (D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS^": DNS (genomisch)

(iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..48

(Xi) ΞEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT CAT GCT 48 Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 5 10 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure CD} TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Met Val Lvs Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala His Ala 1 ^* 5 10 15 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 713 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

TCTAGAATTC ARGGNAARTG GTAYACNATT GTCATTGCTG CTGACAATCT TGAAAAGATA 60

GAAGAAGGAG GACCACTGAG ATTCTATTTT CGTCATATTG ATTGTTATAA AAACTGCAGT 120

GAAATGGAAA TCACATTTTA TGTCATTACA AACAACCAGT GCTCCAAGAC CACAGTCATT 180

GGGTACTTGA AAGGAAATGG AACCTACCAA ACCCAGTTTG AAGGTAACAA TATATTTCAA 240

CCTTTGTATA TAACATCAGA CAAGATTTTC TTTACCAACA AGAACATGGA TAGAGCTGGC 300

CAGGAAACGA ACATGATTGT TGTTGCTGGA AAAGGTAATG CTTTGACACC TGAAGAAAAT 360

GAAATACTTG TGCAATTTGC TCATGAAAAG AAAATTCCAG TGGAAAACAT TCTCAATATT 420

CTTGCTACAG ATACTTGTCC TGAATAAAGG CCTTCCGTAG GTGAGAACAG GATGGCAATT 480

AGGCATCATA TCCTCTTGAT CATGGAATCA GCATCACAAA TAAATCACCA TTTCATTCTA 540

CATGAATTGT CCCATCTCCT GTAGAGCCAG GATACCACAT ATCAAATTCC TGGCTTAGCT 600

TTCCTTTCCC ATCACATGAT GTATTACCTG TTCTTATTTT TTTGACTGAT TAAATAAATT 660

GTTTCAAGAA GCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 713

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 35 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 32 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..28

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: CCCTCTAGAÄ TTCARGGNAA RTGGTAYACN AT 32

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 35 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) A TISENSE: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: CCTCTAGAAT TCTAYGTNAT HACNAAYAAY CARTG 35

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 35 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..29 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: AATCTAGAAT TCTTNCCYTC RAAYAAYTGN GTYTG 35

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 35 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..29

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16: ACTCTAGAAT TCTTYTTYTC RTGMGCRAAY TGMAC 35

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTIΞENSE: NEIN

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17: AAATCTAGAA TTCAGTGCTC CAAGACCACA GTCATTGG 38

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 41 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ÄNTISENSE: NEIN ( ix) MERKMALE :

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..41

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18: CGGTCTAGAA TTCGGAAATG GAACYTACCA AACCCAGTTT G 41

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 453 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..288

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

CARGAYTTYG CNGARYTNCA RGGNAARTGG TÄYACNATHG TNATHGCNGC NGAYAAYYTN 60

GARAARATHG ARGARGGNGG NCCNYTNMGN TTYTAYTTYM GNCAYATHGA YTGYTAYAAR 120

AAYTGYWSNG ARATGGARAT HACNTTYTAY GTNATHACNA AYAAYCARTG YWSNAARACN 180

ACNGTNÄTHG GNTÄYYTNÄA RGGNAÄYGGN ACNTAYCARA CNCARTTYGA RGGNAAYAAY 240

ATHTTYCARC CNYTNTÄYAT HACNWSNGAY AARATHTTYT TYACNÄAYAA RAAYATGGAY 300

MGNGCNGGNC ARGARACNAA YATGATHGTN GTNGCNGGNA ARGGNAAYGC NYTNACNCCN 360

GARGARAAYG ÄRATHYTNGT NCARTTYGCN CAYGARAÄRA ARATHCCNGT NGARAAYATH 420

YTNAÄYATHY TNGCNACNGA YACNTGYCCN GAR 453 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 25 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20: AGCAGTTTTT ATAACAATCA ATATG 25

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 19 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21: ATCCTGAGCA TGAGCCCGA 19

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 22 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22: AGGAAAAGCA AAGTCAGGCA CC 22

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 480 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: nicht bekannt

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

ATTTTAAGAA GCACAGTGAC CTTTACCCAA CAGTATAGTT CTGGAAGGAA AATTATTATT 60

TGTATGCTCA AACAAGATAG TTCTTTGTTT CTAACAGGAA TGCTCAATTT TCAGACAAAC 120

ATAACCTGAC CTTACCTGCT AATCACATTA GTTTTTGAGA TATGAGGTCA TACATCATTT 180

GGCAGGGCCA AAGAGGAAAC ACTAGACAGA TGTAGCTTAG TGTAGATCAA ACTGATTGGT 240

TCCGTGAAAC TCCCTCTAAC TATCTGTATA AAAAGCTTTG TCAGTTGAGT TCTTTTCAAC 300

CACTCACCTC TTCGAGCTTC TGTGGAAAAG CAAAGTCAGG CACCACCATG GTAAAGATTC 360

TGGTGCTGGC TTTGGTCTTT AGTCTGGCTC ATGCTCAGGA TTTTGCAGAG GTAAATTCAT 420

TTGCTCTAAT CATATATCTT AGCTTCATCA ACAGCATATT TCTGTGGATG TGACACATCA 480

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. DNA kodierend für Aphrodisin mit N-terminalem Signalpep¬ tid.

2. DNA nach Anspruch 1 kodierend für Aphrodisin mit Signal¬ peptid der Nukleinsäureseguenz :

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT 9 18 27 36

CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GTC

51 60 69 78 87

ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA

99 108 117 126 135

TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT- GAA ATG GAA

147 156 165 174 183

ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC

195 204 213 222 231

ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GGT

243 252 261 270 279

AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TTT

291 300 309 318 327

ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GTT

339 348 357 366 375

GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT

387 396 405 414 423

GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT

435 444 453 462 471

ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA 483 492 501

DNA nach Anspruch 1 kodierend für Aphrodisin r.it Signa peptid der folgenden Nukleinsäureseguenz: ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT 9 18 27 36

CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA TGG TAT ACC ATT GTC

51 60 69 78 87

ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA

99 108 117 126 135

TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GAA

147 156 165 174 183

ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC

195 204 213 222 231

ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA ACC CAG TTT GAA GGT

243 252 261 270 279

AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG ATT TTC TTT

291 300 309 318 327

ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT GTT

339 348 357 366 375

GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT

387 396 405 414 423

GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT

435 444 453 462 471

ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA 483 492 501

4. DNA kodierend für ein Signalpeptid für Aphrodisin mit de Nukleinsäureseguenz:

ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT

9 18 27 36

CAT GCT

5. DNA kodierend für ein Signalpeptid für Aphrodisin mit de

Nukleinsäureseσuenz : ATG GTA AAG ATT CTG GTG CTG GCT TTG GTC TTT AGT CTG GCT

9 18 27 36

CAT GCT

6. cDNA kodierend für Feldhamster-Aphrodisin mit 3' - nic translatierter Region nachstehender Nukleotid-Sequenz:

GCA AAG TCA GGC ACC ACC ATG GTA AAG ATT CTG CTG CTG GCT TTG GT

TTT AGT CTG GCT CAT GCT CAG GAT TTT GCA GAG CTT CAA GGA AAA T

TAT ACC ATT GTC ATT GCT GCT GAC AAT CTT GAA AAG ATA GAA GAA GG

GGA CCA CTG AGA TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT TGT TAT AAA AAC TG

AGT GAA ATG GAA ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC CAG TGC TC

AAG ACC ACA GTC ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA AC

CAG TTT GAA GGT AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GA

AAG ATT TTC TTT ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA AC

AAC ATG ATT GTT GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GA

AAT GAA ATA CTT GTG CAA TTT GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GA

AAC ATT CTC AAT ATT CTT GCT ACA GAT ACT TGT CCT GAA TAA AGG CC

TCC GTA GGT GAG AAC AGG ATG GCA ATT AGG CAT CAT ATC CTC TTG AT

ATG GAA TCA GCA TCA CAA ATA AAT CAC CAT TTC ATT CTA CAT GAA T

TCC CAT CTC CTG TAG AGC CAG GAT ACC ACA TAT CAA ATT CCT GGC T

GCT TTC CTT TCC CAT CAC ATG ATG TAT TAC CTG TTC TTA TTT TTT T CTG ATT AAA TAA ATT GTT TCA AGA AGC.

7. DNA-Fragmente aus der DNA-Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, die für Fragmente des Aphrodisins und/oder Fragmente des Signalpeptids kodieren.

8. Nukleinsäure, die mit der DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

9. Nukleinsäure gemäß Anspruch 8, erhältich durch Hybridisie¬ rung mit der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter stringenten Bedingungen und Isolierung des entsprechenden Komplexes.

10 Nukleinsäurefragment des Aphrodisins mit der folgenden Nukleotid-Sequenz:

TCT AGA ATT CAR GGN AAR TGG TAY ACN ATT GTC ATT GCT GCT. GAC AAT 9 18 27 36 45

CTT GAA AAG ATA GAA GAA GGA GGA CCA CTG AGA TTC TAT TTT CGT CAT ATT GAT 57 66 75 84 93 102

TGT TAT AAA AAC TGC AGT GAA ATG GAA ATC ACA TTT TAT GTC ATT ACA AAC AAC

111 120 129 138 147 156

CAG TGC TCC AAG ACC ACA GTC ATT GGG TAC TTG AAA GGA AAT GGA ACC TAC CAA

165 174 183 192 201 210

ACC CAG TTT GAA GGT AAC AAT ATA TTT CAA CCT TTG TAT ATA ACA TCA GAC AAG

219 228 237 246 255 264 ATT TTC TTT ACC AAC AAG AAC ATG GAT AGA GCT GGC CAG GAA ACG AAC ATG ATT

273 282 291 300 309 318

GTT GTT GCT GGA AAA GGT AAT GCT TTG ACA CCT GAA GAA AAT GAA ATA CTT GTG

327 336 345 354 363 372

CAA TTT- GCT CAT GAA AAG AAA ATT CCA GTG GAA AAC ATT CTC AAT ATT CTT GCT

381 390 399 408 417 426

ACA GAT ACT TGT CCT GAA TAA AGG CCT TCC GTA GGT GAG AAC AGG ATG GCA ATT

435 444 453 462 471 480

AGG CAT CAT ATC CTC TTG ATC ATG GAA TCA GCA TCA CAA ATA AAT CAC CAT TTC

489 498 507 516 525 534

ATT CTA CAT GAA TTG TCC CAT CTC CTG TAG AGC CAG GAT ACC ACA TAT CAA ATT

543 552 561 570 579 588

CCT GGC TTA GCT TTC CTT TCC CAT CAC ATG ATG TAT TAC CTG TTC TTA TTT TTT

597 606 615 624 633 642 TGA CTG ATT AAA TAA ATT GTT TCA AGA AGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 651 660 669 678 687 696

AAA AAA AAA AAA AAA AA 705

Folgende Buchstabenkürzel wurden verwendet:

A = Adenin, R = A oder G, N = A oder C oder G oder T, C = Cytosin, Y = C oder T, G = Guanin, T = Thymin, .

11. Polypeptid erhältlich durch Expression der Nukleinsäuren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 in geeigne- ten Expressionssysteme .

12. Polypeptid mit der Struktur von Aphrodisin mit Signalse¬ quenz:

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

10 His Ala Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Va

20 3

Ile Ala Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Ar

40 Phe Tyr Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Gl

50 60

Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Va

70 Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gl

80 90

Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Ph

100 11

Thr Asn Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Va

120 Val Ala Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Le

130 140

Val Gin Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu As

150 Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 160 167

13. Polypeptid mit der Struktur von Aphrodisin mit Signalpepti abgeleitet aus der Nukleinsäureseguenz gemäß Anspruch 3

Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

10 His Ala Gin Asp Phe Ala Glu Leu Gin Gly Lys Trp Tyr Thr Ile Val

20 30

Ile Ala Ala Asp Asn Leu Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly Pro Leu Arg

40 Phe Tyr Phe Arg His Ile Asp Cys Tyr Lys Asn Cys Ser Glu Met Glu

50 60

Ile Thr Phe Tyr Val Ile Thr Asn Asn Gin Cys Ser Lys Thr Thr Val

70 Ile Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Gly Thr Tyr Gin Thr Gin Phe Glu Gly

80 90

Asn Asn Ile Phe Gin Pro Leu Tyr Ile Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe

100 110

Thr Asn Lys Asn Met Asp Arg Ala Gly Gin Glu Thr Asn Met Ile Val

120 Val Ala Gly Lys Gly Asn Ala Leu Thr Pro Glu Glu Asn Glu Ile Leu

130 140

Val Gin Phe Ala His Glu Lys Lys Ile Pro Val Glu Asn Ile Leu Asn

150 Ile Leu Ala Thr Asp Thr Cys Pro Glu 160 167

14. Signalpeptide für Aphrodisin abgeleitet aus den Nukleinsä resequenzen gemäß Ansprüchen 4 und 5

Met Val Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

His Ala sowie Met Val Lys Ile Leu Val Leu Ala Leu Val Phe Ser Leu Ala

His Ala

15. Arzneimittel enthaltend eine wirksame Menge des Poly¬ peptids oder ein pharmazeutisches Polypeptid-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 13 oder 14.

16. Diagnostikmittel enthaltend ein Polypeptid oder Poly- peptidfragment oder einen Antikörper oder Fragmente eines Antikörpers gegen Epitope des Polypeptids oder Polypeptid-Fragments nach einem der Ansprüche 11 bis 14 und/oder mindestens eine Nukleinsäureseguenz, die als Hybridisierungssonde zum Aufspüren von Nukleinsäuren, die für Aphrodisin und/oder ein Signalpeptid kodieren, geeignet ist.

17. Diagnostikmittel nach Anspruch 16 enthaltend mono- oder polyklonale Antikörper/-fragmente, die zu Epitopen so¬ wohl des Aphrodisins wie des Signalpeptids idiotyp sind.

18. Antiidiotype Antikörper zu Antikörpern gemäß Anspruch 17 oder deren Fragmente zur Diagnose von Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten gegen Aphrodisin.

19. Verwendung von Aphrodisin zur Herstellung eines Arznei¬ mittels gegen Potenzstörungen bei Säugern.

20. Verwendung von Aphrodisin zur Herstellung eines Mittels zur Züchtung von Nutztieren.