PT91521B - Processo para a preparacao de um factor de regulacao de expressao genetica - Google Patents

Processo para a preparacao de um factor de regulacao de expressao genetica Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM FACTOR DE REGULAÇÃO DE EXPRESSÃO GENÉTICA
A presente invenção refere-se em geral à regulação de expressão genética. Em particular a presente invenção refere-se a uma molécula de ADN recombinante que codifica para uma proteina que possui a actividade de um factor 1 de regulação de interferão (IRF-1); a moléculas de ADN recombinante que codificam para uma proteína activa IRF-1 e a um promotor e uma sequência de regulação ligada funcionalmente a esta; ao uso de tais moléculas de ADN para transformar células hospedeiras que também são transformadas por moléculas de ADN que codificam para uma proteína pretendida e sob a regulação da proteína activa IRF-1 acima mencionada; a moléculas de ADN que incluem uma sequência que codifica para uma proteína farmaceuticamente activa e uma região promotora do ‘ gene da referida proteína incluindo um local de ligação para a molécula activa IRF-1 e/ou da referida proteína farmaceuticamente activa por meio de uma cultura de células hospedeiras apropriadas transformadas pelas moléculas de ADN referidas.
A transcrição de genes em células de mamíferos é regulada por mecanismos complexos nos quais as interacções das sequências de ADN de regulação com proteínas de ligação de ADN de acção trans desempenham um papel principal. No contexto da regulação de transcrição, os genes que codificam para os interferões (IFNs) apresentam um aspecto comum a muitos genes de citoquinas; a transcrição destes genes é induzida transitoriamente seguindo diversos sinais extracelulares. Encontra-se bem documentado o facto de que a transcrição dos genes para IFN-α e IFN-β é induzida de forma eficiente por vírus em várias células, enquanto que a do gene que codifica para IFN-γ é induzido em linfócitos T (células T) a seguir a estimulação mitogénica (para uma revisão ver Weissmann e Weber, 1986; Taniguchi, 1988).
IFN-β, uma citoquina que foi originalmente identificada pela sua potente actividade antiviral, parece também desempenhar um papel crucial na regulação do crescimento das células e na diferenciação. Neste aspecto, para além de vírus e de poli(rl):poli(rC) que são indutores bem conhecidos do gene do IFN-β, muitas citoquinas, tais como o factor 1 de estimulação de colónias (CSF-1) (Moore et al., 1984; Warren e Ralf, 1986; Resnitzky et al., 1986), o factor de necrose de tumores (TNF) (Onozaki et al., 1988), o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (Zullo et al., 1985) e IFNs (Kohase et al., 1987) parecem também induzir o IFN-β em certas células, sugerindo que podem transduzir sinais semelhantes ou idênticos nas células visadas.
Demonstrou-se que a indução do gene do IFN-β por vírus e por poli (rl) :poli (rC) ocorre ao ní-vel da transcrição (Raji e Pitha, 1983; Ohno e Taniguchi, 1983; Dinter et al. , 1983; Zinn et al., 1983). Deste modo as sequências de ADN que actuam em cis funcionando como intensificadores indutíveis foram identificadas dentro da região 5' de flanco do gene de. IFN-β humano (Fujita et al., 1985, 1987; Goobourn et al., 1985;
Dinter e Hauser, 1987). A região intensificadora indutível (isto é, -65 a -105 com respeito ao local de remate CAP) contém unidades hexanucleotídicas repetitivas; (AAGTGA)4. Os requerentes descobriram que o IRF-1 desempenha um papel essencial na activação induzida por vírus da transcrição do gene de IFN-β por interacção com os elementos cis identificados.
ADN
A presente invenção proporciona uma molécula de recombinante que é caracterizada por um gene estrutural possui a fórmula I abaixo indicada:
Fórmula I
20 30 40 50
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 120 130 140 150
T GGAGAT C C CAT GGAAGCAT GC T GCCAAGCATGGC T GGGACAT CAACAAG que
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300
C CAT GAAC T C C C T GC CAGATAT C GAGGAGG T GAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 330 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAAC CAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGC TAAGAGCA
410 420 ‘ 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650
GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG ou que possui a fórmula III abaixo indicada:
Fórmula III
ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAC ATG CAG ATT
AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG
ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC
AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA
TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC
TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA .GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT
CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG
CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA. GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC
CGA GAC ACT JAAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC
CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC
CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG
GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT
CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT
GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC
GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG
CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA
TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC
TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT
GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC
ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG ou um fragmento, ou uma variante degenerada da molécula ou do fragmento, que codifica para uma proteína que possui a actividade de um factor 1 de regulação de interferão (IRF-1).
A presente invenção também compreende uma sequência de ADN recombinente que hibrida para a versão de sentido inverso de uma molécula da presente invenção tal como definida anteriormente e que codifica para uma proteína que possui actividade de IRF-1.
A actividade de IRF-1 deve ser entendida como a capacidade das proteína para se ligarem à sequência oligómera repetida AAGTGA e aos elementos de regulação a montante do gene do IFN-β humano.
A molécula de ADN pode por exemplo ser caracterizada por um gene estrutural que apresenta a Fórmula I definida anteriormente e sequências de flanco a montante e a jusante contidas na Fórmula II que se apresenta em seguida:
Fórmula II
CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC
CGGCCGTGCCCGGCGGCCTTAAGAACCAGGCAACCACTGCCTTCTTCCCT
CTTCCACTCGGAGTCGCGCTTCGCGCGCCCTCACTGCAGCCCCTGCGTCG
CCGGGACCCTCGCGCGCGACCAGCCGAATCGCTCCTGCAGCAGAGCCAAC
20 30 40 50
ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 120 130 140 150
TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200
GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250
AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 330 340 350
AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400
GAACCAGAGAÃAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450
AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500
GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600
CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650
GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900
GGGGGGATAT T GGGC T GAGT C TACAGCG T G T C T T CACAGAT C T GAAGAAC
910 920 930 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCGTAGCAGGGCCCCTGGGCCCCTCTTA
TTCCTCTAGGCAAGCAGGACCTGGCATCATGGTGGATATGGTGCAGAGAA
GCTGGACTTCTGTGGGCCCCTCAACAGCCAAGTGTGACCCCACTGCCAAG
TGGGGATGGGCCTCCCTCCTTGGGTCATTGACCTCTCAGGGCCTGGCAGG
CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCTGGGA
AGATGAGGTTCTGAGACCAGTGTATCAGGTCAGGGACTTGGACAGGAGTC
AGTGTCTGGCTTTTTCCTCTGAGCCCAGCTGCCTGGAGAGGGTCTCGCTG
TCACTGGCTGGCTCCTAGGGGAACAGACCAGTGACCCCAGAAAAGCATAA
CACCAATCCCAGGGCTGGCTCTGCACTAAGAGAAAATTGCACTAAATGAA
TCTCGTTCCAAAGAACTACCCCTTTTCAGCTGAGCCCTGGGGACTGTTCC
AAAGCCAGTGAATGTGAAGGAAAGTGGGGTCCTTCGGGGCAATGCTCCCT
CAGCCTCAGAGGAGCTCTACCCTGCTCCCTGCTTTGGCTGAGGGGCTTGG
GAAAAAAACTTGGCACTTTTTCGTGTGGATCTTGCCACATTTCTGATCAG
AGGTGTACACTAACATTTCCCCCGAGCTCTTGGCCTTTGCATTTATTTAT
ACAGTGCCTTGCTCGGGGCCCACCACCCCCTCAAGCCCCAGCAGCCCTCA i
ACAGGCCCAGGGAGGGAAGTGTGAGCGCCTTGGTATGACTTAAAATTGGA
AATGTCATCTAACCATTAAGTCATGTGTGAACACATAAGGACGTGTGTAA
ATAT GTAC AT TTGTCTTTTTATAAAAAGTAAAATTGTT ou uma sua variante degenerada.
A molécula de ADN pode por exemplo ser caracterizada por um gene estrutural que apresenta a Fórmula III definida anteriormente e sequências de flanco a montante e a jusante contidas na Fórmula IV que se apresenta em seguida:
Fórmula IV
GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC
GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG
ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA
GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA
TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC
TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA
GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT
TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG
AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG
CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC
AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT
GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA
CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG
GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT
GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT
ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC
ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG
AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG
CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC ΑΑΎ GAG CCA
GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT ‘GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG
GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA
CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG
ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT
CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC
TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC
TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC
TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA
GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT
GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC
TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG
AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT
GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA
AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG
1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCATTTATTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082 ou uma sua variante degenerada.
A molécula de ADN pode incluir uma região promotora a qual é constitutiva ou indutível, por exemplo indutível por vírus, por exemplo por vírus da doença de Newcastle, ou é indutível por estimulação mitogénica, por exemplo utilizando Concanavalina A.
As sequências de ADN da presente invenção que codificam para proteínas que possuem actividade de IRF-I incluem sequências de ADN de uma origem eucariótica tal como, não só humana e de rato mas também, por exemplo de galinha, rã e levedura, que hibridam com as sequências de ADN do IRF-I humano ou de murino anteriores (Figs. I a IV) e que codificam para uma i
proteína que possui actividade de IRF-I.
Descreve-se em seguida o isolamento de moléculas de ADNc a partir de células humanas e de células de rato que codificam para o IRF-I humano e de murino e a partir de células de levedura que hibridam com o ADNc do IRF-I humano.
A molécula de ADN recombinante pode também conter uma sequência promotora e de regulação contida na seguinte fórmula V:
Fórmula V
PstI
CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG
-299 caixa GC 1 caixa GC 2
CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCCGGGGCGGTGGCGCGG
-251
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC
-193 caixa C7\AT
AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG
-135
Local de remate secundário I I I
GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21
Local de remate principal plRF-L ’Tt I
TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1
TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG + 39
CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97
CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155
PstI
TCGCTCCTGCAG +213 +225 ou uma sua variante degenerada.
A molécula de ADN recombinante pode também ser projectada para expressão de uma proteína farmaceuticamente activa tal como, por exemplo uma citoquina ou um activador de plasminogénio e nesta forma conterá de preferência um gene estrutural para uma proteína farmaceuticamente activa pretendida operativamente ligado a uma região promotora do gene para a referida proteína incluindo um local de ligação para a molécula activa de IRF-1.
Deste modo, uma molécula de ADN recombinante da presente invenção pode compreender uma sequência de ADN tal como definida acima e um gene estrutural para uma proteína farmaceutieamente activa pretendida sob a regulação da proteína activa IRF-I codificada pela sequência de ADN mencionada. Nestas moléculas de ADN recombinante, o gene que codifica para a molécula activa de IRF-I encontra-se preferivelmente sob a regulação de um promotor constitutivo ou de preferência de um promotor indutível. De preferência o gene para a proteína farmaceutieamente activa pretendida incluirá um local de ligação de IRF que contém sequências AAGTGA repetitivas.
A presente invenção compreende também uma célula hospedeira, por exemplo uma célula bacteriana, por exemplo E. coli, ou uma célula de levedura ou uma célula de mamífero, por exemplo uma célula CHO, ou uma célula de rato, por exemplo L929, transformada por uma molécula de ADN recombinante tal como definida acima. Seria ideal que a célula hospedeira fosse seleccionada a partir de uma linha de células que não tenha de todo ou substancialmente não tenha qualquer nível de actividade de IRF-I endógena.
Em alternativa, para a produção de uma proteína farmaceutieamente activa pode-se transformar uma célula hospedeira com uma primeira moléctila de ADN que contém uma sequência que codifica para uma proteína que possui a actividade de um IRF-I, e por uma segunda molécula de ADN distinta quê contém um gene que codifica para uma proteína farmaceutieamente activa pretendida sob a regulação da proteína activa IRF-I codificada pela primeira molécula de ADN. De preferência, a primeira molécula de ADN que codifica para a molécula activa de IRF-I inclui um promotor constitutivo ou melhor uma sequência promotora indutível operativamente ligada ao gene que codifica para o composto activo de IRF-I. Deste modo, de preferência a segunda molécula de ADN inclui um local de ligação para a proteína activa de IRF-I que contém sequências AAGTGA repetitivas.
A proteína activa IRF-I ou a proteína farmaceuticamente activa podem ser produzidas por cultura da célula transformada e isolamento da proteína produzida de uma forma convencional.
De forma apropriada as células hospedeiras são induzidas por tratamento de um modo adequado do promotor, o qual é operativamente ligado ao gene que codifica para o IRF-1 tal como é discutido abaixo.
A presente invenção compreende também uma proteína que possui a actividade de um IRF-1 obtida por cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de ADN tal como definida acima.
Uma proteína preferida que possui a actividade de um IRF-I apresenta a fórmula VI:
Fórmula VI
Met Pro Ile Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Met Gin Ile
Asn Ser Asn Gin Ile Pro Gly Leu Ile Trp Ile Asn Lys Glu Glu Met
Ile Phe Gin Ile Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His Gly Trp Asp Ile
Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser *Trp Ala Ile His Thr Gly Arg
Tyr Lys Ala. Gly Glu Lys Glu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn
Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale Glu Glu Vai Lys Asp
Gin Ser Arg Asn Lys Gly Ser Ser Ala Vai Arg Vai Tyr Arg Met Leu
Pro Pro Leu Thr Arg Asn Gin Arg Lys Glu Arg Lys Ser Lys Ser Ser
Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys Gly Asp Vai Ser
Pro Asp Thr Phe Ser Asp Gly Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp
His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin Gly Tyr Leu Gly Gin Asp Leu Asp Met
Glu Arg Asp Ile Thr Pro Ala Leu Ser Pro Cys Vai Vai Ser Ser Ser
Leu Ser Glu Trp His Met Gin Met Asp Ile Ile Pro Asp Ser Thr Thr
Asp Leu Tyr Asn Leu Gin Vai Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser Glu Ala
Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gly Lys Ile Ala Glu Asp Leu Met Lys
Leu Phe Glu Gin Ser Glu Trp Gin Pro Thr His Ile Asp Gly Lys Gly
Tyr Leu Leu Asn Glu Pro Gly Thr Gin Leu Ser Ser Vai Tyr Gly Asp
Phe Ser Cys Lys Glu Glu Pro Glu Ile Asp Ser Pro Arg Gly Asp Ile
Gly Ile Gly Ile Gin His Vai Phe Thr Glu Met Lys Asn Met Asp Ser
Ile Met Trp Met Asp Ser Leu Leu Gly Asn Ser Vai Arg Leu Pro Pro
Ser Ile Gin Ala Ile Pro Cys Ala Pro
Outra proteína preferida que possui a actividade de um IRF-I apresenta a fórmula VII:
Fórmula VII
MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet
GlnlleAsnSerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpIleAsnLysGluGluMetlleLeu
GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspIleAsnLysAspAlaCysLeu
PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro
LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspIleGluGluVal
LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro
LeuThrLysAsnGlnArgLysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys
AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer
SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu
ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuProAsp
TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal
SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAspGluAspGluGluGlyLysLeuPro
GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys
GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys
LysGluGluPróGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal
PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg
LeuProSerlleGlnAlalleProCysAlaPro
Descreve-se em seguida a clonagem molecular e a caracterização de ADNc de murino e humano que codifica para proteínas de ligação de ADN que possuem a actividade de IRF-1.
Uma conservação de sequência notável será vista entre moléculas de IRF-1 de murino e humanas tal como é revelado pela análise dos ADNc's clonados. Além disso, mostra-se que a expressão do gene que codifica para o IRF-1 é induzida pelo virus da doença de Newcastle (NDV) e pela Concanavalina A (Con A) em células de rato L929 e em linfócitos esplénicos respectivamente.
1. Clonagem e expressão de ADN de IRF-1 em E. coli
A. Isolou-se ARN poli (A)+ de células L929 de rato não induzidas e utilizou-se para sintetizar ADNc (segundo o procedimento de Aruffo e Seed, 1987) . 0 ADNc foi em seguida clonado num vector Àgtll cindido com EcoRI e construiu-se um banco de ADNc de acordo com o processo conhecido de Huynh et al., 1985, utilizando E. coli Y1090 como estirpe hospedeira.
Efectuou-se em seguida uma busca no banco de Xgtll com a sequência AAGTGA multimerizada (4 vezes) (seguidamente referida como oligómero Cl; Fujita et al., 1987) como sonda.
Neste processo de busca, inoculou-se E. coli Y1090 infectado pelos fagos Kgtll recombinantes em placas rectangulares de 10x13 cm. As placas foram em seguida incubadas a 12 °C durante 4 a 5 horas, após o que eram visíveis cerca de 20 000 colónias/placa.
Os filtros de membrana para a busca eram membranas de nylon (Nytran; Schleicher & Schnell) ou de nitrocelulose (Schleicher & Schnell). Os filtros foram mergulhados em IPTG 10 mM (para a indução do gene de expressão lacZ nas colónias de fagos apropriadas) e secos ao ar, em seguida foram cobertos sobrepostos nas placas e incubados a 37 °C durante
2,5 horas. As colónias apenas produzirão uma proteína codificada por ADNc se o ADNc estiver em concordância de quadro com o gene lacZ.
Os filtros foram em seguida removidos e arrefecidos a 4 °C durante 20 minutos e, sem secar, foram submetidos a selecção.
Os filtros de membrana foram em seguida preparados para análise tal como se segue:
Preparou-se um extracto nuclear de células L929 de rato e depositou-se (numa quantidade correspondente a cerca de 10 pg de proteína) sobre as membranas.
Antes de se efectuar a ligação de ADN utilizou-se um tampão de ligação constituído por Hepes 10 mM a pH 7,5, NaCl 5,0 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM e 5 % de glicerol. Adicionou-se 5 % de leite em pó magro (Yukijurishi Inc.) ao tampão e incubaram-se os filtros na mistura durante 1 hora a 4 °C e em seguida enxaguaram-se durante 1 minuto no mesmo tampão mas neste caso sem leite em pó.
Incubaram-se em seguida os filtros em tampão de ligação (1 ml) contendo 350 pg/inl de ADN de esperma de salmão com um comprimento médio de aproximadamente 300 pb e ADN oligomérico Cl sonda marcado com 32P (106 cpm/ml; actividade específica 2 000 cpm/fmol) (ver Fujita et al., 1987). A sonda dejADN foi marcada nas extremidades 5' com [γ-32Ρ]ΑΤΡ utilizando guinase T4.
Após a ligação, os filtros foram lavados à temperatura ambiente com o tampão de ligação durante 1 a 2 horas (filtro de 10 ml), mudando o tampão de ligação várias vezes durante esta operação. Os filtros foram em seguida secos ao ar e submetidos a auto-radiografia. Nesta análise, as membranas de nylon, ao contrário das membranas de nitrocelulose, deram um sinal positivo que era inibido de forma específica com a inclusão do oligómero Cl não marcado em excesso.
Seleccionaram-se desta forma cerca de l,4xl06 recombinantes. Entre os 32 clones fágicos positivos identificados na primeira selecção, verificou-se que um clone (designado por XL28-8) se ligava repetidamente com a sonda de ADN em selecções subsequentes.
2. Produção e purificação de proteína em E. coli transfectado
Prepararam-se clones bacterianos lisogénicos por transfecção de E. coli Y1089 com lL28-8. Em seguida inocularam-se os clones lisogénicos contendo ZL28-8 obtidos de um dia para o outro em 400 ml de meio L a 1 %. Cultivaram-se as bactérias a 31 °C até que a D060o alcançou o valor de 1. A temperatura foi então ajustada a 42 °C durante 20 min. Em seguida adicionou-se IPTG 10 mM e, após incubação a 38 °C durante mais 20 min, as culturas foram rapidamente centrifugadas e o agregado foi suspenso em 10 ml de tampão de lise constituído por Hepes 20 mM a pH 7,9, EDTA 0,2 mM, espermidina 0,5 mM, espermina 0,15 mM, DTT 0,1 mM, 10 % de glicerol, fluoreto de fenilmetionilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM, 1 pg/ml de pepstatina A, 1 μρ/πιΐ de leupeptina, L-l-tosilamida-2-feniletilclorometilbenzamida 500 μΜ, molibdato de sódio 10 mM, pírofosfato de sódio 2 mM e. ortovanadato de sódio 2 mM. Submeteram-se as suspensões das célula a três ciclos rápidos de congelamento - descongelamento e em seguida centrifugaram-se a 30 000 rpm durante uma hora a 4 °C utilizando um rotor Beckman 50 Ti. O sobrenadante foi utilizado directamente para uma análise de retardamento em gel (ver em seguida) ou em alternativa foi ainda purificado.
A purificação adicional foi levada a efeito como se segue:
Aplicaram-se aproximadamente 4 ml do sobrenadante numa coluna de poli(di-C): poii(di-C) com um volume de leito de 2 ml e equilibrada com um tampão de lise. Aplicou-se em seguida o material eluído (4 ml) a uma coluna DE 52 (Whatman) contendo um volume de leito de 2 ml equilibrada com tampão Z (Hepes 25 mM a pH 7,8, MgCl2 12,5 mM, DTT 1 mM, 20 % de glicerol, 0,1 % de Np-40 e PMSF 0,5 mM) . Eluiu-se a actividade de ligação de ADN com tampão Z contendo KC1 0,1 mM. O eluido foi novamente concentrado utilizando centricon-10 (Amicon). A concentração final da proteína era de 28 mg/ml.
3. Caracterização do produto proteico do clone 1L28-8:
(1) Análise de retardamento em gel
Prepararam-se clones bacterianos lisogénicos contendo XL28-8 por transfecção de E. coli Y1089 e induziram-se para expressar o ADNc clonado a altos níveis utilizando o procedimento de Huynh et al., 1985. Utilizaram-se para comparação clones lisogénicos preparados e tratados do mesmo modo com o fago não contendo inserido o ADNc (designado por λβ) .
Prepararam-se extractos contendo cada um 3 pg de proteína das culturas induzidas do lisogénio (quatro preparados designados por ZL28-8a, ÀL28-8b, À6a e À6b).
ΐ
Foi também preparado extracto nuclear (3 pg de proteína) a partir de células L929 de rato.
Os extractos foram incubados com um fmol de sonda oligomérica Cl marcada tal como descrito acima com uma actividade específica de 8 000 cpm/fmol.
Cada extracto foi também submetido a análises por competição, nas quais se adicionou um ADN competidor em várias concentrações à incubação.
Os resultados da análise são apresentados na Fig. 1, em que as diversas pistas possuem a seguinte correspondência:
Pista
Extracto nenhum
K6a
À6b
À6b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado λβb com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado*
4L28-8a
ÀL28-8b
ÀL28-8b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado
ÀL28-8b com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado* células L929 células L929 com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado células L929 com um excesso molar de 1000 vezes de oligómero C5A não marcado* * O oligómero C5A encontra-se descrito em Fujita et al. , 1985 e é uma sequência 6 vezes repetida de GAAA.
i
A partir da Fig. 1 é possível verificar que as sondas de ligação são detectáveis nas pistas 6, 7, 9, 10 e 12.
Tal como se mostra na Fig. 1, os extractos proteicos dos lisogénios de XL28-8 deram origem a bandas desviadas (pistas 6 e 7) , cujo aparecimento foi inibido por excesso de ADN do oligómero Cl não marcado mas não pela mesma quantidade do oligómero C5A (pistas 8 e 9).
Em contraste com as proteínas derivadas de 4L28-8, as que foram preparadas a partir do lisogénio derivado de λβ induzido não deram origem a essas bandas desviadas (pistas 2 a 5) . Pode-se verificar que as bandas modificadas são muito semelhantes às do IRF-1 natural de células de rato (pistas
e 12). Estas diferenças que existem nos dois conjuntos de bandas desviadas é considerado como uma consequência das diferentes quantidades de proteina ligada à sonda de ADN.
Além disso, verificou-se que as bandas desviadas foram detectadas apenas com as proteina induzidas por IPTG das células Y1089 transfectadas com XL28-8.
(ii) Análise do rasto de ADNase
Efectuou-se uma análise de rasto a fim de verificar as
propriedades de ligação da proteína codificada por ADN de
ÀL28-8 a um ADN que codifica para a região a montante do
gene do IFN-β.
A proteina codificada pelo ADN de ZL28-8 foi extraída do lisogénio induzido e parcialmente purificada por cromatografia em coluna tal como descrito acima e ensaiada para verificação das suas propriedades em relação a um ADN contendo a região a montante do gene do IFN-β.
Prepararam-se sondas de ADN sob1' a forma de fragmentos Sall-HindlII isolados a partir de p-125cat (contendo o tipo selvagem do gene de IFN-β) e de p-125DPcat (contendo um gene de IFN-β mutante). O plasmídeo p-125cat foi construído como o p-105cat (Fujita et al., 1987), excepto em que se utilizou o fragmento BamHI (-125)-TagI ( + 19) de pSE-125 (Fujita et al.,
Cell, Vol. 41, págs. 489-496, 1985). 0 plasmídeo p-125DPcat, contendo mutações pontuais no interior dos elementos reguladores do IFN-β, foi obtido por mutagénese dirigida de oligonucleótidos sintéticos em P-125cat, tal como descrito em Hatakeyama et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 83, págs. 9640-9654, 1986). Ambos os ADNs foram marcados no local HindIII por meio de (γ-32Ρ]ΑΤΡ utilizando quinase T4.
Incubaram-se 4 fmol da sonda de ADN (actividade específica 3 000 cpm/fmol) na mistura reaccional de 20 μΐ contendo Tris-HC1 25 mM a pH 7,9, MgCl2 6,25 mM, KC1 50 mM, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM, 10 % de glicerol e 2 % de álcool polivinílico na presença ou na ausência de 280 μς de proteína purificada.
Na análise adicionaram-se 5xl0-4 unidades de ADNase I (Worthington) e incubou-se durante 1 min a 25 °C.
A Fig. 2 mostra auto-radiogramas dos fragmentos de ADN obtidos a partir de amostras obtidas realizando os procedimentos seguintes. No lado esquerdo da Fig. 2 encontra-se parte da sequência de ADN da sonda de IFN-β de tipo selvagem e do lado direito da Fig. 2 encontra-se parte da sequência de ADN da sonda de IFN-β mutante.
1. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi de A+G (ver Methods in Enzymology, Vol. cindida 65, págs por reacçoes . 499-560) -
o resultado é apresentado na pista 1.
2. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi digerida parcialmente
por ADNase I sem protecção - o resultado é apresentado na pista 2.
3. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi feita reagir com a proteína e em seguida digerida com ADNase I - o resultado é apresentado na pista 3.
4. A sonda de IFN-β de tipo selvagem foi feita reagir com a proteína na presença de um excesso molar de 1000 vezes de oligómero Cl não marcado e em seguida digerida com ADNase I - o resultado é apresentado na pista 4.
5. A sonda de IFN-β mutante foi feita reagir com a proteina e em seguida digerida com ADNase I - o resultado é apresentado na pista 5.
6. A sonda de IFN-β mutante foi cindida por reacções A+G - o resultado é apresentado na pista 6.
Na Fig. 2 as regiões protegidas tal como são reveladas nas pistas 3 e 5 são indicadas respectivamente nas sequências apresentadas nos lados esquerdo e direito do auto-radiograma. Os motivos hexaméricos estão inscritos num rectângulo.
A partir dos resultados na Fig. 2 poder-se-á ver que as regiões protegidas correspondem aos nucleótidos -100 a -64, sendo esta a região que se descobriu ser protegida pelo IRF-1 obtido a partir das célula L929. A protecçâo foi anulada pelo uso do oligómero Cl não marcado em excesso (pista 4). Verificou-se também, utilizando concentrações baixas de proteina, que ocorre protecçâo preferencial na região que contém o motivo AAGTGA (-80 a -70).
Estes resultados indicam que a proteina possui uma alta afinidade para a região que contém ‘o motivo AAGTGA e uma baixa afinidade para a região circundante.
O segmento de gene de IFN-β mutante transporta mutações T- G nas posições -106, -100, -73 e -67. Na comparação das pistas 5 e 2 sob as mesmas condições de análise, a protecçâo ganha pelas proteínas recombinantes parece restrita à região não mutada (pista 2) . Esta observação está em conformidade com a observação de que a introdução destas mutações tem como resultado uma drástica redução (20 vezes) da indutibilidade da transcrição por NDV em células L929 e que a ligação in vitro do IRF-1 ao gene IFN-β mutante era notável apenas na região não mutada.
l^-
Para além disso, a utilização do oligómero Cl revela que a proteína protege especificamente a região que contém as sequências oligoméricas. Esta protecção corresponde de forma idêntica à obtida por IRF-1 nativo derivado de células L929.
3. Análise de competição de ADN
Esta análise foi levada a efeito para se examinar a afinidade da proteína recombinante em relação a várias sequências de ADN incluindo algumas das sequências de ADN de regulação de transcrição conhecidas. Procedeu-se do seguinte modo:
Isolou-se o fragmento HindIII-SalI da sonda de IFN-β a partir de p-125 cat (ver Fujita et al., 1987); este fragmento contém a sequência do gene de IFN-β humano de +19 a -125. 0 ADN foi marcado nas extremidades 3’ terminais por preenchimento em ambas as extremidades com [a-32P]dCTP utilizando o fragmento de Klenow.
A actividade específica da sonda de ADN era de 8 000 cpm/fmol.
ι
As análises de retardação em gel foram levadas a efeito sob as condições acima descritas.
Na realização das análises de competição, o ADN foi feito reagir com a proteína na presença de diversas concentrações de ADNs em competição nas misturas de ligação tal como indicado na Fig. 3.
nível de formação do complexo foi quantificado por análise densitométrica do auto-radiograma. A formação do complexo na ausência de ADN competidor foi tomada como 100 %.
A estrutura dos ADNs competidores era a seguinte:
a) AP-1: um ADN sintético com a seguinte sequência:
5'CTAGA(TGACTCA)6G 3'
3'T(ACTGAGT)6CCTAG 5'
b) TNF: 37 pb de ADN sintético que abrange desde +1162 a +2116 (ver Nadwin et al., 1985) do primeiro intrão de TNF-a;
c) H2-Dd de murino: 37 pb de ADN sintético que abrange o elemento IRS (-159 a -123) tal como descrito por Korber et al., 1988;
d) IFN-α humano: 4 6 pb de ADN sintético que correspondem ao Elemento de Resposta de virus, ver Ryals et al., 1985.
e) Sequências hexaméricas Cl, C2, C3, C4 e C5a.
As sequências Cl e C5a encontram-se descritas acima. As sequências C2, C3 e C4 são tal como publicado em Cell, 49, 352-367 (1987); representam as sequências
AAATGA C2
AAGGGA C3 e
AAAGGA C4 respectivamente
f) A sequência do gene de IFN-β de +19 a -66.
Na Fig< 3 o painel do lado esquerdo mostra os resultados obtidos quando as repetições do hexâmero foram utilizadas como competidores. O painel do meio mostra os resultados quando os segmentos do gene de IFN humano foram utilizados como competidores e o painel do lado direito mostra os resultados correspondentes utilizando diversos segmentos de ADN tal como indicado dentro do painel.
A partir dos resultados apresentados na Fig. 3 ver-se-á que o aparecimento da banda desviada foi eliminado por competição pelas sequências hexaméricas pela ordem de eficiência Cl- C2- C3- C4, mas não foi eliminado de forma significativa por competição por C5a.
Também se pode observar que os segmentos de ADN sintético que abrangem os elementos regulatórios de ambos os genes de IFN-al humano e de H-2Dd de murino deram origem a uma actividade competitiva. Este facto é particularmente interessante uma vez que o segmento de ADN do gene de H-2Dd contém a chamada sequência de resposta IFN (IRS) que funciona como um intensificador quando as células respondem ao IFN (Sujita et al., 1987; Israel et al., 1986; Korber et al., 1988) .
De facto, encontram-se em muitas das sequências promotoras dos genes indutíveis por IFN motivos sequenciais idênticos ou semelhantes a estes encontrados no gene de IFN-β em que os factores nucleares parecem ligar-se de modo específico (Korber et al., 1988; Lery et al., 1988).
Os resultados apresentados na Fig. 3 são aproximadamente semelhantes aos obtidos quando a análise é repetida sob condições idênticas utilizando proteína natural produzida a partir de células L929.
Estrutura dO ADNc que codifica para IRF-1 de murino
A sequência de ADN dos ADNs clonados foi determinada por um método didesoxi (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) ou pelo método normal Maxam-Gilbert (Maxam e Gilbert, 1980).
Isolou-se a inserção de ÀL28-8 em E. coli Y1089 como se segue: preparou-se o ADN fágico por procedimentos normais e digeriu-se o ADN por EcoRI, em seguida isolou-se o ADNc cindido do ADN fágico e sequenciou-se pelo método didesoxi (Sequenase; United States Biochemical, Inc.). Verificou-se que o ADNc inserido em ÀL28-8 tinha 1,8 kb de comprimento. A análise de sequência nucleotídica revelou um grande quadro de leitura livre ligado em fase com o gene do β-galactósido.
Para seleccionar os clones que continham as inserções de ADNc maiores, sintetizou-se ADNc de cadeia dupla com ARN poli (A)+ derivado de células L929 e clonado no vector CDMB de acordo com o processo publicado de Aruffo e Seed (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84, pág. 8573, 1987) e Seed (Nature, Vol.
329, págs. 840-842, 1987).
Os plasmideos recombinantes foram introduzidos na estirpe de E. coli MC1061/p3 (de acordo com o processo de Aruffo e Seed; tal como descrito acima) , submeteram-se os clones de ADNc a selecção utilizando a sonda de ADNc derivada de ÀL28-8 (marcado com 32P) sob condições pouco rígidas para hibridação de ADN-ADN (Kashima et al., Nature, Vol. 313, págs. 402-404, 1985) e seleccionou-se um clone pIRF-L para estudo posterior.
A inserção de ADNc de pIRF-L pretendida foi obtida por digestão com HindIII e Xbal e foi sequenciada pelos métodos descritos acima. A sequência é apresentada na fórmula IV e na Fig. 4. ‘
Verificou-se que a sequência de ADNc de XL28-8 contém uma sequência idêntica na região de sobreposição com a excepção de que faltava um resíduo de A entre os nudeótidos 1773 e 1781.
As extremidades terminais 5' e 3' do ADNc derivado de ÀL28-8 estão marcadas por flechas na Fig. 4. As sequências ATTTATTTA e ATTTA que possivelmente conferem instabilidade ao ARNm estão inscritas em rectângulos.
Tal como se verifica a partir da Fig. 4A, o ADNc de murino derivado do pIRF-L era mais longo em 198 pb e 20 pb do que o ADNc de ÀL28-8 nas regiões 5' e 3' respectivamente.
Por análise da sequência de ADN genómico que contém a região promotora deste gene verifica-se que no ADNc de pIRF-L faltam cerca de 30 pb do local de remate principal, ver abaixo, fórmula V e Fig. 7.
A sequência imediatamente a montante do primeiro codão ATG, GGACCATGC, concorda bem com a sequência de consenso de Kozak GCCag CCATGG para o local de início de tradução.
Não se encontrou qualquer sequência ATG em concordância de quadro na sequência a montante da sequência ATG acima mencionada confirmando que esta é de facto o codão de início para o ARNm de IRF-I.
Tal como foi referido acima, não se detectou qualquer diferença na sequência de nucleótidos entre os ADNc's de ÀL28-8 e pIRF-L dentro das regiões sobrepostas, excepto um nucleótido na região não codificadora 3'.
Verificou-se deste modo que o IRF-I de murino era constituído por 329 ácidos aminados com um P.M. calculado de 37,3 kD. Não se encontraram locais de N-glicosilação canónicos no interior da sequência.
Não se detectou qualquer homologia significativa com outras proteína conhecidas por meio de busca na base de dados Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) e em sequências mais recentemente publicadas.
Uma análise da hidropatia registada em gráfico de acordo com Kyte e Doolittle, 1982, indica que a proteína no seu conjunto é altamente hidrofílica (Fig. 4B) .
Por inspecção da sequência primária deduzida do IRF-I de murino detectaram-se as seguintes caracteristicas:
A metade terminal amina que se prolonga até ao ácido aminado (a.a.) 140 é rica em lisina (Lys) e arginina (Arg) . De facto, do total de 39 resíduos Lys e Arg estão localizados nesta região. No painel inferior da Fig. 4B representa-se um sumário diagramático da localização dos ácidos aminados básicos (Arg e Lys) (colunas ascendentes) e ácidos aminados acídicos (Asp e Glu) (colunas descendentes).
Como se apresenta na Fig. 4B, esta região mostra uma forte hidrofilicidade e é considerada como a região responsável em primeiro lugar pela ligação de IRF-I às sequências de ADN específicas.
Nestas circunstâncias, os motivos caracteristicos para muitas proteínas que se ligam a ADN, tais como dedos de zinco e motivos de hélice-volta-hélice (Pabo e Sauer, 1984, Evans e Hollenberg, 1988) não foram detectáveis na proteína IRF-I.
Pelo contrário, o resto da molécula (isto é, a metade terminal carboxilo) apresenta uma abundância relativa de ácido aspártico (Asp), ácido glutãmico (Glu), serina (Ser) e treonina (Thr) . De 89 ácidos aminados (do á.a. 140 ao 329), 33 (17 %) representam ácidos aminados acídicos e 36 (19 %) representam
Ser e Thr. É notável que se encontre um grupo de 5 ácidos aminados acídicos consecutivos nos a.a. 227 a 231. Com respeito a Ser e Thr, muitos aparentam formar aglomerados (região nos a.a. 153 a 156, 190 a 192, 206 a 208 e 220 a 222; aqui referidas como as regiões S-T). As regiões S-T são representadas por pequenos rectângulos abertos no painel inferior da Fig. 4B.
Estrutura do ADNc que codifica para o IRF-I humano
Seguindo um procedimento semelhante ao descrito acima para o IRF-I de murino, clonou-se e sequenciou-se o ADNc de IRF-I humano.
Preparou-se um banco de ADNc humano por síntese de ADNc utilizando poli(A)+ARN de uma linha de células T humana Jurkat. A síntese de ADN de cadeia dupla e a subsequente clonagem para o vector plasmídico CDM8 foram levadas a cabo de acordo com o processo de Aruffo e Seed (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84, págs. 8573-8577, 1987) e Seed (Nature, Vol. 329, págs. 840-842, 1987) .
Introduziram-se os plasmídeos recombinantes numa estirpe de E. coli MC1061/p3 utilizando o procedimento de Aruffo e Seed tal como mencionado acima.
Procedeu-se a uma busca dos clones de ADNc que hibridam por reacção cruzada com ADNc de IRF-I de rato utilizando ADNc (marcado com 32P) de ÀL28-8 como sonda sob condições pouco críticas para hibridação de ADN-ADN. As condições empregues foram exactamente como descritas por Kashima et al. (Nature, Vol. 313, págs. 402-404, 1985).
Dos clones positivos, seleccionou-se o clone pHIRF31
contendo a inserção de ADNc mais longa. í
A sequência de ADNc pretendida do clone pHIRF31 foi
isolada por digestão do ADN plasmídico por Xhol a após
isolamento foi submetida a sequenciação pelos métodos descritos acima. A estrutura do gene de IRF-I humano é apresentada na fórmula II e na Fig. 8.
As sequências deduzidas para o IRF-I de murino e humano são apresentadas justapostas para comparação na Fig. 5.
Por análise do ADN humano verificou-se que este IRF-I é mais curto que o IRF-I de murino em quatro ácidos aminados.
Pode verificar-se a ocorrência de forte conservação das sequências de ácidos aminados entre as duas moléculas de IRF-I.
Em particular pode ver-se que 133 de entre 145 ácidos aminados (95 %) das metades terminais de amina são idênticos.
Tomada no seu conjunto, a observação anterior indica que o IRF-I é uma nova classe de proteína de ligação de ADN.
Também se deve notar que as sequências ATTTATTTA e ATTTA, encontradas em muitas citoquinas e ARNm's de proto-oncogenes, estão presentes no interior da região não traduzida 3' do ADNc de IRF-I de murino e, de forma idêntica, a sequência ATTTA encontra-se no interior da região correspondente ao ADNc de IRF-I humano. Crê-se que estas sequências desempenham um papel na regulação de pós-transcrição da expressão genética conferindo instabilidade ao ARNm (Shaw e Kamen, 1986; Caput et al., 1986).
plasmídeo pIRF-L foi transfectado para E. coli MC1061/p3, que foi depositado como E. coli MC1061/p3 (pIRF-L) na Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japão, sob os termos do Tratado de Budapeste em 19 de Agosto de 1988 sob o n°. FERM BP-2005.
O plasmídeo pIRF31 foi transfectado de forma semelhante para E. coli MC1061/p3 que foi depositado como E. coli MC1061/p3 (pIRF-31) na FRI sob os termos do Tratado de Budapeste em 19 de Agosto de 1988 sob o n°. FERM BP-2006.
Regulação do gene do IRF
1, Expressão do ARNm de IRF-I
Tendo em vista o facto de que o IRF-I manifesta afinidades com sequências de regulação de genes diferentes do gene do IFN-β e que se encontra deste modo envolvido na regulação de um conjunto de genes em diversos tipos de células, efectuou-se um exame da expressão do ARNm de IRF-I em células de rato
derivadas de diversos tecidos e órgãos utilizando ADNc de murino como sonda. Para preparar esta sonda, utilizou-se ADN do fago M13 mplO (ver abaixo) contendo a cadeia de sentido directo do fragmento PstI do gene do IRF-I como matriz para sintetizar o ADN de sentido inverso marcado com 32P, digeriu-se o produto por EcoRI e isolou-se a sonda de ADN tal como descrito por Fujita et al., (1985).
ARN total foi isolado pelo processo estabelecido de Aruffo e Seed, 1987.
Em seguida efectuou-se uma análise de mancha essencialmente como descrito por Thomas (1980), sendo a película de raios X exposta durante 3 dias, e os resultados são apresentados na Fig. 6A. As várias pistas representam os resultados de ensaios efectuados utilizando ARN integral de células dos seguintes tecidos:
Pista 1 cérebro
Pista 2 coração
Pista 3 fígado t
Pista 4 pulmão
Pista 5 baço (não estimulado)
Pista 6 timo
Pista 7 rim
Pista 8 músculo
Pista 9 intestino
Pista 10 baço (estimulado)
Pista 11 Con A - baço estimulado
Para o ensaio em cada pista utilizaram-se 5 μρ de ARN integral das células, excepto na pista 8, para a qual se utilizaram apenas 1,2 μg de ARN.
,/
Pode verificar-se a partir da Fig. 6A que se detectou uma banda correspondente a cerca de 2.0 kb na maioria das amostras de ARN através desta análise de mancha apesar do nivel de expressão do ARNm parecer baixo. É de notar que o nivel de expressão de ARNm nos linfócitos derivados de baço foi aumentado drasticamente a seguir a estimulação por Con A (Pista 11) .
Numa análise adicional induziram-se células L929 de rato por NDV tal como descrito anteriormente (Fujita et al., 1985) e extraiu-se o ARN citoplasmático, pelo processo de Aruffo e Seed, 1987, de três em três horas após a infecção.
Prepararam-se ADNs sonda a partir de várias sequências que se seguem e marcaram-se pela reacçâo de marcação de iniciador múltiplo (Amersham), nomeadamente (i) um fragmento EcoRI de 1,8 kb de XL28-8 (actividade específica 2xl08 cpm/pg);
(ii) um fragmento BamHI-BglII de 0,5 kb de um clone genòmico de IFN-β (actividade específica 5íxl08 cpm/pg) e (iii) um fragmento BamHI-PvuII de 2,0 kb de um clone contendo J pseudogene de β-actina humana (actividade específica 5xl08 cpm/pg).
Os resultados são apresentados na Fig. 6B. Realizaram-se análises de mancha tal como descrito acima, utilizando o procedimento de Thomas (1980).
Em cada pista depositaram-se 10 pg do ARN citoplasmático. A película de raios X foi exposta durante 3 horas. Verificou-se por meio de análises densitométricas que o ARNm de IRF-I aumentou cerca de 25 vezes 9 a 12 horas após a infecção por NDV.
Se bem que o aumento de ARNm seja muito elevado, é também transitório, com um pico entre as 9 e as 12 horas e baixando cerca de 15 horas após a indução. A acumulação de ARNm precede a acumulação de ARNm de IFN-Β; como se pode ver na Fig. 6B, a indução de ARNm de IRF-I pode ser observada 3 horas após a infecção de NDV enquanto que o ARNm de IFN-β só é detectável após 6 horas sob condições de análise de mancha idênticas para ambos os ARNs.
promotor de IRF-I
Tal como demonstrado acima, a transcrição do gene de IRF-I é regulada por vários agentes tais como vírus e mitogenes.
Por análise de mancha de Southern do ADN cromossomal verificou-se que o gene de IRF-I pode ser emendado e não transformado em membros múltiplos no rato.
Submeteu-se um banco do fago λ contendo ADN de rato recém-nascido a uma busca para seleccionar os clones que contêm a sequência promotora de IRF-I utilizando a mesma sonda de ADNc derivada de ÀL28-8 utilizada anteriormente. Identificaram-se quatro clones positivos, tendo-se verificado que todos eles contêm o mesmo ADN genómico e utilizou-se um deles, kgl4-2, para análises adicionais. Sub-clonou-se um fragmento PstI no interior
-/ do local PstI de pUC19 para construir o vector pl9IRFP.
Clonou-se em seguida o mesmo ADN no interior do local PstI de M13mpl0 e M13mpll, que foram utilizados para gerar ADN para análises de sequência.
A análise de sequência de nucleótidos do fragmento PstI dos clones referidos foi efectuada tal como descrito anteriormente. Identificaram-se locais de remate principal e secundário por análises de mapeação SI.
Na Fig. 7A apresenta-se a sequência determinada. Como se pode verificar, a sequência a jusante do ADN emparelha perfeitamente coma do ADNc derivado de pIRF-L.
A análise de nuclease SI indica a presença de dois locais de remate para o ARNm de IRF-I, estando o local principal cerca de 20 nucleótidos a montante do local secundário. Não se encontram sequências caixa TATA típicas presentes no interior da região a montante do gene. Em vista da abundância inusitada de sequência CpG, esta região constitui provavelmente uma ilha HTF (Bird, 1986).
A região promotora contém duas caixas GC e uma caixa CAAT (ver Fig. 7A) ; as caixas referidas em primeiro lugar devem ligar Spl (Kadogan et al·., 1986) e a última CP-1 ou CP-2 (Chodosh et al., 1988).
fragmento PstI que contém as sequências promotoras foi em seguida ensaiado para determinação da sua reactividade em resposta a sinais extracelulares, por exemplo indutibilidade por vírus, do seguinte modo:
Construiu-se um gene quimérico no ‘ qual se justapôs um gene relator, nomeadamente um gene de acetiltransferase de cloranfenicol bacteriano (CAT), a jusante do segmento PstI. Esta construção foi feita através da amputação de um fragjnento PstI de P19IRPF (ver acima) por BamHI e HindIII e da clonagem do fragmento resultante no interior do fragmento da estrutura BglII-HindIII de pA10cat2 (Rosenthal et al., 1983) a fim de construir o vector pIRFcat.
Prepararam-se várias outras construções do seguinte modo:
Preparou-se o vector pIRFÁcat por digestão do fragmento BamHI-HindlII derivado de pl9IRFP com HaelII cujo único local de reconhecimento se localiza a desde -30 até -35 do local de remate principal (Fig. 5A). Ligou-se o fragmento HaellI-HindIII com o fragmento de estrutura BglIII-HindIII de pA10cat2 e o ADN sintético seguinte
5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3'
3’GATCTAAAGAAGCGC 5’
Deste modo tanto o vector pIRFcat como o pIRFÁcat continham sequências até -320 e -48 respeetivamente do local de remate principal.
O vector p-125cat contém a sequência promotora do gene IFN-β humano tal como descrito por Fujita et al., 1987.
O vector pSV2cat encontra-se descrito em Gorman et al., Science, Vol. 221, págs. 551-553.
Como gene de referência utilizou-se pRSVgtp (ver Gorman et al., acima).
Os vários genes foram transfectados para células L929 de rato utilizando o método de fosfato de cálcio (Fujita et al., 1985). Transfectaram-se 5xl06 células com 7,5 pg do plasmídeo de ensaio contendo o gene relator CAT e 2,5 pg de pRSVgtp. As células foram induzidas por NDV ou por indução falsa e em seguida foram submetidas à análise enzimática conforme descrito por Fujita eJt al., 1985.
Ao calcular a actividade relativa de CAT, a actividade de CAT das células induzidas falsamente transfectadas com pSV2cat foi tomada como 100 %. Cada actividade de CAT foi normalizada pelo Ecogtp (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 78, págs. 2072-2076) das amostras respectivas. As amostras em que o CAT se encontrava abaixo do nível de fundo foram marcadas b.b. (below background).
Os resultados são apresentados na Fig. 7B.
Verifica-se que a transfecção do vector pIRFcat em L929 de rato deu origem à expressão de baixo nível de actividade de CAT. 0 nível de expressão de CAT foi intensificado quando as células transfectadas foram estimuladas por NDV. A supressão da sequência de 300 pb a jusante do gene IRF-I (pIRFAcat) virtualmente aboliu as expressões tanto constitutiva como induzida do gene CAT. Este facto demonstra que a sequência promotora se encontra no interior da região de 300 pb a jusante e é indutível por vírus.
Construção de plasmídeos de expressão
1. Digeriu-se ADN fágico do clone XL28-8 por EcoRI e recolheu-se o ADNc da inserção. Os locais EcoRI do ADNc foram alinhados por meio de polimerase de ADN T4 e em seguida foram ligados com ADNs adaptadores sintéticos possuindo as sequências pGATCCATTGTGCTGG e pCCAGCACAATG de acordo com Aruffo e Seed, 1987.
Após remoção dos ADNs sintéticos por centrifugação com um gradiente, de 5 a 20 % de acetato de potássio (Aruffo e Seed, 1987), ligou-se o ADNc de IRF-I com os ADNs adaptadores fixados a ambas as extremidades com ADN do vector CDMB cindido por BstXI (Seed, B, Nature, Vol. 329, págs. 840-842, 1987) . Iéolaram-se os plasmídeos pIRF-S e pIRF-A contendo o ADNc de IRF-I na orientação de sentido directo e de sentido inverso com respeito ao promotor CMV respectivamente.
Cada ADN plasmídico foi transfectado quer com p-55cat quer com p55ClB (Fujita et al., 1987) em célula L929 e determinou-se o nível de expressão de CAT.
Os resultados são apresentados no Quadro 1 abaixo:
Quadro 1
Plasmídeos transfectados Indução por NDV Actividade de CAT (% de conversão)
Exp. 1 pIRF-S p-55cat - < 1 %
pIRF-S p-55CIB - 50 %
pIRF-A p-55cat - < 1 %
pIRF-A - < 1 %
Exp. 1 pIRF-S p-55CIB - 1,7 %
pIRF-S p-55CIB + 3,6 %
pIRF-A p-55CIB - <0,1%
pIRF-A p-55CIB + < 0,1 %
A eficiência da transfecçao do ADN varia em função do estado das células receptoras (neste caso células L929 de rato). A eficiência foi muito mais baixa na Exp. 2 em comparação com a Exp 1. Deste modo, o nível de expressão de CAT é relativamente mais baixo na Exp. 2.
Como se pode verificar no quadro anterior, apenas foi detectada actividade de CAT significativa em células transfectadas por p-55CIB e pIRF-S. Estes dados demonstram que o IRF-I se liga com as sequências AAGTGA repetidas (8 vezes) presentes a montante do gene CAT em p-55CIB e por isso promove a transcrição do gerue CAT distai.
Os resultados mostram ainda que o nível de expressão de CAT é aumentado (mais de duas vezes) por infecção das células z/ transfectadas com NDV (Quadro 1), demonstrando gue é possível controlar a expressão dos genes por diversos estímulos tais como vírus.
2. Construiu-se do modo exposto seguidamente um plasmídeo de expressão para a produção de uma proteína constituído pelo domínio de ligação de ADN de IRF-I e pelo domínio de activação de transcrição da levedura GAL4:
Digeriu-se o plasmídeo pIRF-S por HindIII e PstI e isolou-se a inserção do ADNc. Digeriu-se o ADNc por DralII e recuperou36
-se o fragmento HindIII-DralII (cerca de 550 pb) , tendo sido designado como fragmento A.
Digeriu-se o vector de expressão CDM8 por HindIII e Xbal e isolou-se o ADN estrutural, tendo sido designado como fragmento
B.
Isolou-se o ADN que codifica para o domínio de activação de transcrição da levedura GAL4 a partir do plasmídeo pRB968 (Ma e Ptashne, 1987) como se segue:
Em primeiro lugar digeriu-se o ADN de pRB968 por HindIII e alinharam-se as extremidades por polimerase de ADN T4. Adicionou-se ADN ligante de Xbal sintético ao ADN e subsequentemente digeriu-se o ADN por PvuII e Xbal.
Recuperou-se o fragmento resultante de ADN PvuII-Xbal de cerca de 600 pb e designou-se como fragmento C.
Além disso, preparou-se um ADN sintético com a seguinte sequência:
í (5')GTGTCGTCCAG(3') (3')GCACACAGCAGGTC(5') designado como fragmento D.
Construiu-se um vector de expressão pIRFGAL4 por ligação dos fragmentos A, B, C e D. Como plasmídeo de regulação construiu-se o plasmídeo pIRFÁGAL4 por ligação dos fragmentos A, B e C e de um ADN sintético com a seguinte sequência:
(5')GTGTCTGACAG(3') (3')GCACACAGACTGTC(5’)
Uma vez que está presente um tripleto terminador, TGA, em concordância de quadro entre as sequências de IRF-I e GAL4 no plasmídeo pIRFA GAL4, na proteína expressa deve faltar o domínio de activação GAL4.
A fim de verificar as propriedades funcionais dos factores de transcrição quiméricos codificados pelo plasmídeo, co-transfectou-se cada um dos plasmídeos pIRFGAL4 e pIRFÁGAL4com p-55CIB em células e verificou-se se ocorria a expressão de CAT. Os resultados são apresentados no Quadro 2 que se segue:
Quadro 2
Plasmídeo transfectado Actividade de CAT (% de conversão)
pIRF-S p-55CIB 2,0 %
pIRF-A p-55CIB < 0,2 %
pIRFGAL 4 p-55CIB 1,4 %
PIRFAGAL4 p-55CIB < 0,2 %
Célula hospedeira, células L929 de rato.
As células não foram induzidas por NDV.
Os resultados mostram que a expressão de um gene visado (tais como os genes que codificam para uma interleuquina, um interferão (α, β e γ) , um activador de plasminogénio, a eritropoietina, o factor de estimulação de colónias de granulócitos, a insulina, a hormona de crescimento humana ou a dismutase dê superóxido (ou mutantes dos genes humanos)) pode !
ser aumentada por IRF-I.
Os genes visados como mencionado acima, tais como genes de interferão, por exemplo IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ómega, e de activadores de plasminogénio, por exemplo t-PA, pro-uroquinase ou uroquinase, etc., podem ser expressos mais eficientemente também por inclusão para esse fim de promotores fundidos com diversos comprimentos de sequências de reconhecimento para IRF-I, por exemplo AAGTGA.
Por exemplo os genes visados podem ser introduzidos em várias células hospedeiras, juntamente com IRF-I intacto ou com genes de IRF-I quiméricos. Aumentando o comprimento do ADN de local de reconhecimento do IRF-I, por exemplo por aumento do número de repetições AAGTGA e o nível de expressão do factor de transcrição, pode-se alcançar um alto nível de expressão dos genes visados.
Por exemplo as sequências de repetição AAGTGA podem ser postas em contacto com um promotor apropriado tal como o promotor de IFN-β ou o promotor precoce de vírus SV40. Um gene visado, por exemplo um gene de t-PA ou um gene de IFN-β, pode ser ligado a jusante de um promotor como os referidos; a estrutura de um gene construído deste modo seria (AAGTGA)X (Promotor) (gene visado, p. ex. gene do t-PA).
Este gene poderia então ser introduzido e amplificado em células CHO, por exemplo célula CHO DXBII (estirpe dhfr) (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 77, págs. 4216-4220, 1980).
Idealmente, tal como discutido acima, uma célula hospedeira será escolhida a partir de uma célula que não possui qualquer actividade de IRF-I endógena ou que não possui esta actividade Ja um nível substancial. O gene de IRF-I, de preferência com um promotor forte tal como um promotor CMV ou um promotor indutível tal· como um promotor de um gene de metalotioneno, pode ser introduzido no interior das diversas células hospedeiras de um modo convencional.
O gene de IRF-I pode ser co-introduzido e amplificado juntamente com o gene visado. Em alternativa, o gene de IRF-I e o gene visado podem ser introduzidos separadamente no interior da célula hospedeira.
Em células transfectadas conforme descrito, o IRF-I pode ser produzido quer constitutivamente (no caso por exemplo do promotor de CMV) quer de modo induzido (no caso por exemplo do promotor de metalotioneno é induzido por metais divalentes tais como zinco) . O IRF-I expresso liga-se às repetições AAGTGA e aumenta o gene visado distai, por exemplo o gene de t-PA ou o gene de IFN.
Esta expressão pode ser ainda aumentada por indução virai, por exemplo por NDV, tal como se pode ver no Quadro 1, Experiência 2. Esta indução aumenta a actividade do IRF-I.
ADNc do genoma de levedura que hibrida com uma sequência de
ADNc de IRF-I humano
Preparou-se ADN de levedura pelo processo normal e digeriu-se com EcoRI. Depositaram-se 5 μς do ADN digerido em gel de agarose a 0,8 % e submeteram-se a electroforese e a análise de mancha de ADN por processos normais.
Tratou-se o filtro com as manchas exactamente como descrito no exemplo precedente para isolamento do ADN de rato que hibrida com IRF-I de murino excepto no que se segue:
Na fase (3) / a temperatura de incubação foi de 55 °C e na fase (4) a incubação foi também efectuada a 55 °C e a sonda radioactiva foi o ADNc de IRF-I humano isolado a partir de pHIRF31 por digestão do plasmídeo com Xhol, sendo esta sonda marcada conforme descrito no exemplo anterior para o IRF-I de murino. O filtro foi lavado a 55 °C em 2xSSC. Os clones positivos foram identificados por auto-radiografia (ver Fig. 9) ·
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Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a preparação de uma molécula de recombinante que contém um gene estrutural da fórmula
    ADN
    10 20 30 40 50
    ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
    60 70 80 90 100
    TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
    110 120 130 140 150
    TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
    160 170 180 190 200
    GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
    210 220 230 240 250
    AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
    260 270 280 290 300
    CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
    310 320 330 340 350
    AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
    360 370 380 390 400
    GAAGCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
    410 420 430 440 450
    AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
    460 470 480 490 500
    GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
    510 520 530 540 550
    AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
    560 570 580 590 600
    CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
    610 620 630 640 650
    GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
    660 670 680 690 700
    GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGC-ATGAGGAAGGGAAATTAC
    710 720 730 740 750
    CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
    760 770 780 790 800
    GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
    810 820 830 840 850
    TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
    860 870 880 890 900
    GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
    910 920 930 940 950
    ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
    960 970
    CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG ou
    ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT ΆΆΑ GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC ΆΑ<2 AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA1' GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG. ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG 'GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA
    GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG
    ou um fragmento, ou uma variante degenerada da molécula ou do fragmento, que codifica para uma proteína que possui a actividade de um factor 1 de regulação de interferão (IRF-1), caracterizado por se isolarem sequências de ADN que codificam para proteínas que possuem actividade de IRF-I a partir de uma origem eucariótica, como por exemplo de origem humana ou com origem em ratos, galinhas, rãs ou em leveduras, e se seleccionarem por hibridação com as sequências de ADN para um IRF-I humano ou para um IRF-I murino que codificam para uma proteína que possui actividade de IRF-I.
  2. 2. Processo para a preparação de uma molécula de ADN recombinante que híbrida com a versão de sentido inverso da molécula definida de acordo com a reivindicação 1 e que codifica para uma proteína que possui actividade de IRF-1, caracterizado por se utilizar como matriz uma cadeia de sentido directo que contém um fragmento do gene do IRF-I.
  3. 3. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a molécula de ADN recombinante preparada compreender uma sequência promotora e reguladora contida na seguinte fórmula:
    PstI
    CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299
    Caixa GC 1 Caixa GC 2
    CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAGGGGCGGGCCCGCGGTAGCCCCGGGGCGGTGGCGCGG
    -251
    GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC
    -193
    Caixa CAAT
    AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG
    -135
    Local de remate secundário »fl
    GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21
    Local de remate principal plRF-L
    TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1
    TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG + 39
    CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97
    CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155
    PstI
    TCGCTCCTGCAG +213 +225
  4. 4. Processo para a preparação ;de uma molécula de ADN recombinante caracterizado por se incorporar uma sequência de ADN preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 e um gene estrutural· para uma proteína farmaceuticamente activa pretendida sob a regulação da proteína IRF-I codificada pela referida sequência de ADN.
  5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o gene que codifica para a molécula dotada de actividade de IRF-I estar sob a regulação de um promotor constitutivo ou de um promotor indutível.
  6. 6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5 caracterizado por o gene para a proteína farmaceuticamente
    -Λ_ activa pretendida incluir um local de ligação de IRF-I contendo uma pluralidade de sequências AAGTGA repetidas.
  7. 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6 caracterizado por a proteína farmaceuticamente activa pretendida ser uma citoquina ou um activador de plasminogénio.
  8. 8. Processo para a preparação de uma célula hospedeira transformada caracterizado por se utilizar para a transformação uma molécula de ADN recombinante preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por se utilizar para a transformação uma primeira molécula de ADN contendo a sequência que codifica para uma proteína que possui a actividade de um IRF-I e uma segunda molécula de ADN contendo um gene que codifica para uma proteína farmaceuticamente activa pretendida sob a regulação da proteína IRF-I codificada pela primeira molécula de ADN.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o gene que codifica para a molécula com actividade de IRF-I estar sob a regulação de um promotor constitutivo ou de um promotob indutível.
  11. 11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 ou 9 ou 10 caracterizado por o gene para a proteína farmaceuticamente activa pretendida incluir um local de ligação para a proteína activa IRF-I que inclui uma pluralidade de sequências AAGTGA repetidas.
  12. 12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 11 caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula bacteriana ou uma célula de uma levedura ou uma célula de mamífero.
  13. 13. Processo para a preparação de uma proteína farmaceuticamente activa pretendida caracterizado por compreender uma fase de efectuar uma cultura de uma célula hospedeira preparada de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 12.
  14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por a proteína preparada ter uma estrutura definida por um gene estrutural conforme definido por qualquer das reivindicações 1 ou 2.
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