KR100554490B1 - 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도 - Google Patents
분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 표적 단백질, 바람직하게는 인슐린 전구물질에 결합된 분자내 샤퍼론(IMC) 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 인슐린 전구물질에 결합된 IMC 유사 서열을 함유하는 부정확하게 폴딩된 키메라 단백질을 하나 이상의 카오트로픽(chaotropic) 보조제와 접촉시키는 것을 포함하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인슐린 전구물질에 결합된 IMC 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질을 사용하여 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시킬 수 있는 능력에 대해 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법에 관한 것이다.
Description
1. 발명의 배경
1.1. 기술 분야
본 발명은 표적 단백질에 결합된 분자내 샤퍼론(IMC) 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 인슐린 전구물질에 결합된 IMC 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 인슐린 전구물질에 결합된 IMC 유사 서열을 함유하는 부정확하게 폴딩된 키메라 단백질을 하나 이상의 카오트로픽(chaotropic) 보조제와 접촉시키는 것을 포함하여 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인슐린 전구물질에 결합된 IMC 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질을 사용하여 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시킬 수 있는 능력에 대해 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법에 관한 것이다.
1.2. 배경 기술
1.2.1. 분자내 샤퍼론 및 단백질 폴딩
분자 샤퍼론은 다른 폴리펩티드의 정확한 폴딩을 보조하는 단백질의 종류로서 규정되지만, 기능적으로 어셈블링된 구조를 갖는 성분은 아니다 [참조: Shinde and Inouye, TIBS, 1993, 18:442-446]. 분자내 샤퍼론(IMC)은 폴딩될 표적 단백질의 전구물질의 일부이며, 이들이 없는 경우, 표적 단백질 분자는 적절한 자체 폴딩에 대한 충분한 정보를 갖지 못한다 [참조: Inouye, Enzyme, 1991. 45:314-321]. IMC의 독특한 특징은, a) IMC와 표적 단백질이 펩티드 결합에 의해 결합되어 단일 폴리펩티드를 형성하고; b) IMC가 표적 단백질의 활성 입체형태의 형성에는 절대적으로 필요하지만, 표적 단백질의 기능을 위해서는 불필요하며; c) 단백질 폴딩의 완료시, IMC가 자체프로세싱 (autoprocessing) 또는 또 다른 엔도펩티다아제에 의해 분리되고; d) IMC가 촉매로서 기능하지 않으며, 즉, 하나의 IMC 분자는 표적 단백질중의 단 하나의 분자를 재폴딩(refold)시킬 수 있고; e) IMC가 표적 단백질에 대해서만 작용하는 고도로 특이적인 "테일러-메이드(tailor-made)" 폴리펩티드라는 점을 포함한다 [참조: Inouye, Enzyme, 1991, 45:314-321].
최근, IMC 또는 프로펩티드가 표적 단백질이 분자 사이에서 폴딩하도록 도울 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 즉, IMC 또는 프로펩티드는 펩티드 결합에 의해 표적 단백질에 결합되는 것이 아니라 별개의 펩티드로서 폴딩 반응에 첨가된다 [미국 특허 제 5,719,021호]. 그러나, 미국 특허 제 5,719,021호에서 사용된 프로펩티드가 표적 단백질의 천연 프로펩티드 또는 표적 단백질과 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드의 프로펩티드이고, 이러한 폴리펩티드가 표적 단백질과 유사한 아미노산 서열을 또한 갖는다는 것은 주목할 만하다. 또한, 미국 특허 제 5,719,021호에 기재된 분자간 반응은 소수성 상호작용에 유리한 완충된 이온성 수성 매질에서 수행되어야 한다.
IMC의 예로는 서브틸리신, α-리틱 프로테아제, 카르복시펩티다아제 Y 및 유비퀴틴의 프로펩티드가 있다 [참조: Shinde and Inouye, TIBS, 1993, 18:442-446]. 서브틸리신의 IMC 서열의 몇몇 특징은, a) IMC가 하전된 아미노산 잔기를 표적 단백질 보다 높은 비율로 함유하고; b) IMC내의 이러한 하전된 잔기의 분포는 극도로 불균일하며, 즉, N-말단 절반이 음 하전된 잔기 보다 양 하전된 잔기를 더 많이 함유하고 C-말단 절반이 양 하전된 잔기 보다 음 하전된 잔기를 더 많이 함유하며; c) IMC내의 Ser 및 Thr 잔기가 또한 불균일하게 분포되어 있고; d) IMC가 반응적으로 높은 함량의 방향족 잔기를 함유하며; e) IMC가 9개 잔기의 소수성 서열을 함유한다는 점을 포함한다 [참조: Inouye, Enzyme, 1991, 45:314-321]. 하전된 잔기쪽으로의 유사한 편향이 α-리틱 프로테아제 및 카르복시펩티다아제 Y에서도 관찰된다 [참조: Inouye, Enzyme, 1991, 45:314-321].
1.2.2. 성숙한 사람 성장 호르몬의 아미노산 서열
성숙한 사람 성장 호르몬(hGH)의 아미노산 서열은 이케하라(Ikehara) 등의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:5956-5960]에 기술되어 있다. 성숙한 hGH 또는 이것의 임의의 부분이 IMC 또는 프로펩티드로서 기능할 수 있다는 것은 당해 분야에 제시되어 있지 않다. 실제로, 성숙한 hGH 또는 이것의 임의의 부분은, 정의상, 임의의 프리, 프로, 또는 프리프로 서열이 성숙한 서열로부터 제거되어 있으므로 프로펩티드로 간주될 수 없다.
1.2.3. 사람 인슐린 구조
인슐린은 아미노산 서열과 구조적 특징이 공지된 잘 알려진 펩티드이다 [참조: Watson et al., Recombinant DNA-A Short Course; Scientific American Books, W. H. Freeman Co., New York, 1983, pp. 231-235; Norman and Litwack, In Hormones, Academic Press, New York, 1987, pp. 264-317]. 이러한 호르몬은 도 1B에 도시된 바와 같이 이황화물 가교에 의해 결합된 A 사슬(21개 아미노산)과 B 사슬(30개 아미노산)인 2개의 별개의 펩티드 사슬로 구성된다. 프로인슐린은 인슐린의 생물학적 전구물질이며, A와 B 사슬이 C 펩티드에 의해 연결되는 경우에 형성되는 단일 펩티드 사슬이다 (도 1a).
1.2.4. 재조합 방법에 의해 생성된 사람 인슐린
사람 인슐린은 사람 췌장 펩티드의 서열과 동일한 서열로 세균에서 제조된 최초의 동물 단백질이었다 [참조: Watson et al., Recombinant DNA--A Short Course: Scientific American Books, W. H. Freeman Co., New York, 1983, pp.231-235]. 실험실에서 사람 인슐린의 최초의 성공적 발현은 1978년에 발표되었고, 사람 인슐린은 1982년에 치료용 약제로서 승인되었다 [참조: Johnson, Science, 1983, 219:632-637].
1.2.4.1. 2-사슬 방법
이러한 방법에 따르면, 각각의 인슐린 사슬은 사람 인슐린의 A 또는 B 사슬을 엔코딩하는 DNA 서열을 각각 함유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 사용하는 별개의 발효공정에서 β-갈락토시다아제(β-gal) 융합 단백질로서 생성된다. 생성물은 세포내에 존재하며, 주요 세포질 봉입체에서 발견된다 [참조: Williams et al., Science, 1982, 215(5):687-689]. 대장균에서 생성된 재조합 단백질은 보통 전체 단백질의 10 내지 40%를 나타낸다 [참조: Burgess, Protein Engineering; Oxender. D.L., Fox, C.F., Eds.; Alan R. Liss, Inc.; New York, 1987; pp. 71-82].
일단 봉입체로부터 분리되면, β-갈락토시다아제와 A 또는 B 사슬 사이의 Met 잔기에서 CNBr에 의해 화학적으로 절단시킨 후 정제시켜서 각각의 A 및 B 펩티드를 분리한다. 그 후, 펩티드를 결합시키고, 제한된 양의 메르캅탄의 존재하에서 2:1의 A-B 사슬(S-술폰화된 형태)의 비로 폴딩되도록 유도하여 활성 호르몬을 수득한다 [참조: Chance et al., In Peptides: Synthesis-Structure-Function, Rich D. M. Gross, E., Eds., Pierce Chemical Co. Rockford, II 1981, pp.721-728; Frank and Chance, In Quo Vadis? Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering, Joyesuk et al., Eds., Sanoff Group, Toulouse-Labege, France, 1985, pp. 137-148]. 24시간 후, 수율은 사용된 B 사슬의 양을 기준으로 하여 약 60% 이다 [참조: Chance et al., In Insulines, Growth Hormone and Recombinant DNA Technology, Raven Press, New York, 1981, pp. 71-85; Johnson, Fluid Phase Equilib., 1986, 29:109-123]. 괴델(Goeddel) 등은 전체 세포 단백질의 20%가 A 또는 B 사슬 융합 단백질로서 발현되는 유사한 결과를 얻었다 [참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1979, 76(1):106-110]. S-술폰화된 사슬의 후속 폴딩은 50 내지 80%의 정확한 폴딩을 제공한다.
β-gal 융합 단백질의 거대한 크기는 수율을 제한하는데, 이는 β-gal(∼1000개 아미노산)과 인슐린 A 또는 B 사슬(각각 21개 또는 30개 아미노산)의 융합 단백질이 세포의 리보솜으로부터 분리되어(번역 도중의 조기 사슬 종결) 불완전한 인슐린 펩티드를 생성시키기 때문이다 [참조: Burnett, Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, Ed., Academic Press, New York, 1983, pp. 259-277; Hall, Invisible Frontiers--The Race to Synthesize a Human Gene, Atlantic Monthly Press, New York, 1987]. 이러한 방법에 대한 중요한 개선점은 lac 오페론(β-gal 시스템) 대신에 트립토판(Trp) 오페론을 사용하여 보다 작은 융합 단백질을 수득하는 것이다. Trp 오페론은 트립토판의 동화를 담당하는 효소를 순차적으로 합성하는 일련의 5개 세균 유전자로 구성된다. 이들 효소중의 하나인 Trp E는 β-gal의 1000개 아미노산과 비교하여 190개 아미노산만을 갖는다. 인슐린의 A 또는 B 사슬에 대한 유전자 전방에 위치한 Trp E 유전자는 융합 단백질 생성량을 전체 단백질의 5-10%에서 20-30%로 향상시키는 추가의 잇점을 갖는데[참조: Hall, Invisible Frontiers--The Race to Synthesize a Human Gene, Atlantic Monthly Press, New York, 1987], 이는 Trp 프로모터가 대장균에서 강력한 프로모터이기 때문이다. 폴리펩티드의 발현은 lac(즉, β-gal) 시스템과 비교하여 결과적으로 10배 이상 증가한다 [참조: Burnett, Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, Ed., Academic Press, New York, 1983, pp. 259-277]. Trp 오페론은 대장균 발효에 의해 트립토판이 고갈된 경우에 작동한다 [참조: Hall, Invisible Frontiers--The Race to Synthesize a Human Gene, Atlantic Monthly Press, New York, 1987: Etienne-Decent, In Genetic Biochemistry: From Gene to Protein, Ellis Horwood Limited, Chichester, U.K., 1988, pp. 125-127]. 이러한 특징은 먼저 세포량이 극대화될 수 있으므로 발효 도중에 유리하다. 따라서, 필요에 따라, 세포의 인슐린 생성 시스템은 발효 배지의 Trp을 고갈시킴으로써 작동될 수 있다.
발효가 완결된 후, 세포를 회수하여 분쇄시킨다. 그 후, 세포 파편을 봉입체와 분리시키고 봉입체를 용매에 용해시키지만, 상세한 사항은 공지되어 있지 않다 [참조: Wheelwright, Protein Purification, Oxford University Press; New York, 1991, p. 217]. 봉입체는 종종 6M 구아니딘 HCl 및 0.1mM 디티오트레이톨에 용해된다 [참조: Burgess, Protein Engineering, Oxender and Fox, Eds., Alan R. Liss, Inc., New York, 1987, pp. 71-82]. 그 후, Trp-LE-Met-A 사슬 및 Trp-LE-Met-B 사슬을 CNBr 절단시켜서 A 및 B 인슐린 사슬을 방출시킨다. A 및 B 사슬의 추가 변형으로는 조(crude) 인슐린을 생성시키는 산화적 술피톨리시스 (sulfitolysis), 정제 및 결합이 있다. 이러한 조 인슐린을 이온 교환, 크기 배제, 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP HPLC) 처리하여 정제된 재조합 사람 인슐린을 생성시킨다 [참조: Frank and Chance, Munch Med. Wischr, 1983, 125(Suppl. 1):514-520].
1.2.4.2. 프로인슐린 방법 (세포내)
사람 인슐린은 A 또는 B 사슬을 개별적으로 사용하는 대신 온전한 프로인슐린을 생성시키는 재조합 미생물로 또한 제조될 수 있다 [참조: Kroeff et al., J. Chromatogr, 1989, 481:45-61]. 먼저, mRNA를 cDNA로 복제시키고, 메티오닌 코돈을 화학 합성하여, 프로인슐린 cDNA의 5' 말단에 부착시킨다. cDNA를, 대장균으로 도입된 후 증식하는 플라스미드 벡터의 세균 유전자내로 삽입시킨다. 프로인슐린은 메티오닌 링커를 파괴시킴으로써 세균 효소(β-gal) 단편(또는 대안적으로 Trp-LE/Met 프로인슐린(Trp 프로인슐린))으로부터 방출될 수 있다. 프로인슐린 사슬은 폴딩 과정을 거쳐서 정확한 세포내 이황화물 가교를 형성한 후, C 펩티드가 효소에 의해 절단되어 사람 인슐린을 생성시킬 수 있다 [참조: Frank and Chance, Munch Med. Wschr., 1983, 125(Suppl.1):514-520]. 비교 결과, 이미 공지된 2-사슬 방법은 더욱 복잡하다.
도르스척(Dorschug) 등은 미니-프로인슐린이 함유된 융합 단백질(B-Arg-A)을 엔코딩하는 재조합 플라스미드를 작제하고, 융합 단백질을 대장균(봉입체) 및 효모(분비된 형태)에서 발현시키고, BrCN 절단과 산화적 술피톨리시스에 의해 정확히 폴딩된 미니-프로인슐린을 제조하고, 정확히 폴딩된 미니-프로인슐린을 트립신과 카르복시펩티다아제 B로 처리하여 사람 인슐린으로 전환시켰다 [참조: EP 0,347,781 B1; IL 9,562,511 B 및 AU 611,303 B2].
토트럽(Tottrup)과 칼센(Carlsen)[참조: Biotechnol, Bioeng, 1990, 35:339-348]은 최적화된 회분 공급식(batch-fed) 발효에서 효모 시스템을 사용하였고, 초과산화물 디스뮤타아제-사람 프로인슐린(SOD-PI)의 융합 단백질의 수율은 1500mg/L인 것으로 보고되었다. SOD-PI는 재조합 사람 인슐린의 생성을 위한 출발 물질일 것이지만; 최종 생성물의 수율은 보고되어 있지 않다.
최근에, 카스텔라노스-세라(Castellanos-Serra) 등[참조: FEBS Letters, 1996, 378:171-176]은 리신 잔기에 의해 프로인슐린의 N-말단에 결합된 변형된 인터류킨-2 N-말단 펩티드(1-22개 아미노산 잔기)가 함유된 프로인슐린 융합 단백질을 대장균에서 발현시켰다. 키메라 프로인슐린은 봉입체로부터 분리되고, 산화적 술피톨리시스에 의해 재폴딩된 후, 트립신과 카르복시펩티다아제 B를 사용한 연장된 반응에 의해 정확한 융합 단백질 인슐린으로 전환된다. IL-2 프로인슐린 융합체는 먼저 IL2 단편을 제거시키지 않고도 정확히 폴딩될 수 있으며, 이는 브롬화 시아노겐 및 관련된 정제 단계를 제거시킨다. 그러나, 산화적 술피톨리시스 단계 및 관련 정제 단계는 IL-2 프로인슐린 융합 단백질의 사용에 의해 회피될 수 없다.
1.2.4.3. 프로인슐린 방법 (분비된 형태)
빌라-코마로프(Villa-Komaroff) 등[참조: Proc. Natl. Acad, Sci. U.S., 1978, 75(8):3727-3731]은 대장균에서의 사람 프로인슐린에 대한 분비 시스템을 최초로 기술하였다. 팀(Thim) 등은 변형된 효모 교배 인자(mating factor) α1 리더 서열과 인슐린 전구물질이 함유된 융합 단백질을 엔코딩하는 재조합 플라스미드를 작제하였다 [참조: Thim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:6766-6770]. 리더 서열은 융합 단백질을 효모 세포의 분비 경로내로 유도시켜서, 융합 단백질을 Lys-Arg 프로세싱 효소 시스템에 노출시키는 역할을 한다. 또한, 부분 프로세싱은 프로인슐린 및 C 펩티드 대신에 짧은 스페이서 펩티드(6개 이상의 아미노산 잔기를 함유함)가 함유된 그 밖의 인슐린 전구물질내의 B와 A 사슬 사이의 2염기성 서열중의 하나 또는 둘 모두에서 발생하였다. 대조적으로, 인슐린 전구물질 분자, 예를 들어 B-Arg-Arg-A(A와 B는 각각 사람 프로인슐린의 A 및 B 사슬임) 중에 스페이서 펩티드가 없는 경우에는 프로세싱은 관찰되지 않았다. 이러한 타입의 단일-사슬 인슐린 전구물질은 트립신과 카르복시펩티다아제 B로 처리함으로써 효소적으로 인슐린으로 전환될 수 있다. 디어스(Diers) 등[참조: Drug Biotechnology Regulations (Scientific Basis and Practices), Chiu and Gueriguian, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1991, pp. 167-177]은 비폴딩된(unfolded) 펩티드를 리더 또는 프로세그먼트, Lys-Arg 서열, B 사슬(아미노산 1-29), 짧은 펩티드 가교 및 A 사슬(아미노산 1-21)의 순서로서 기술한다. 이러한 전구물질에 있어서, 인슐린의 B 사슬의 29번 아미노산이 A 사슬 근처에 있는 하나의 염기성 아미노산이 함유된 짧은 연결 펩티드에 의해 A 사슬의 1번 아미노산에 연결된다. 사람 인슐린은 펩티드전이반응후, 형성된 에스테르 결합의 가수분해를 통해 생성된다. 추가 정제를 위해 수 회의 크로마토그래피 단계가 수행된다.
1.2.5. 인슐린 전구물질의 폴딩
사람 인슐린은 2개의 아미노산 사슬을 갖는 단백질로서, 전체 아미노산 잔기가 51개이다. 6개의 시스테인 잔기가 2개의 아미노산 사슬에 존재하며, 각각의 경우, 2개의 시스테인 잔기는 이황화물 결합에 의해 서로 결합된다. 통계적으로, 하나의 사람 인슐린 분자내에서 이황화물 가교를 형성할 수 있는 가능성은 15가지이다. 그러나, 15가지 가능성 중 하나만이 1) A6-A11; 2) A7-B7; 및 3) A20-B19의 이황화물 가교를 갖는 생물학적으로 활성인 사람 인슐린에 존재한다.
사람 인슐린에 존재하는 이황화물 가교의 형성은 중간물질을 경유하여 수행되며, 사람 인슐린의 시스테인 잔기에는 황 보호기, 예를 들어 S-술포네이트(-S-SO3
-)기가 제공된다 [참조: EP 0,037,255]. 또한, 시스테인 잔기가 티오 잔기(-SH)로서 존재하는 돼지 프로인슐린은 정확히 결합된 시스테인 가교를 갖는 프로인슐린을 수득하는데 사용되어 왔다 [참조: Biochemistry, 1968, 60:622-629]. 오베르메이어(Obermeier) 등은 메르캅탄, 카오트로픽 보조제 및 소수성 흡수제 수지의 존재하에서 1ℓ 당 0.05 내지 0.3g의 농도로 상응하는 프로인슐린 아미노산 사슬로부터 정확히 결합된 시스테인 가교를 갖는 프로인슐린을 수득하는 방법을 기술하였다 [참조: 미국 특허 제 5,473,049호]. 산화적 술피톨리시스의 단계는 미국 특허 제 5,473,049호에 기재된 방법에서는 제거된다. 그러나, 인슐린 단백질은 저농도에서 폴딩될 수 있을 뿐이므로, 이러한 방법의 상업적 가치를 매우 떨어뜨린다. 또한, 대량의 메르캅탄과 소수성 흡수제 수지를 사용하면, 공정의 복잡성과 다운-스트림 정제 비용이 증가한다. 미국 특허 제 5,473,049호의 기재 내용을 살펴보면, 산화적 술피톨리시스 단계의 제거와 관련된 잇점이 다운-스트림 정제 비용 증가를 능가하는 지가 불명확하다.
상기 문헌을 인용하는 것은 이들 문헌이 본 발명의 종래 기술이라는 승인으로서 해석되지 않아야 한다.
2. 발명의 요약
본 발명은, N-말단으로부터 C-말단 방향으로, a) 사람 성장 호르몬(hGH) 단백질의 적어도 처음 20개의 N-말단 아미노산이 함유된 도메인과 40% 이상의 동일성을 갖는(동일성 비율은 hGH의 도메인과 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정됨) 아미노산 서열로 구성된 제 1의 펩티드 단편; b) Arg 잔기, 또는 Lys 잔기, 또는 펩디드 단편중의 대부분의 C-말단 아미노산 잔기가 Arg 또는 Lys인, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 제 2의 펩티드 단편; 및 c) hGH 단백질의 일부가 아닌, 2개 초과의 시스테인(Cys) 잔기가 함유된 아미노산 서열로 구성된 제 3의 펩티드 단편을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제 3의 펩티드 단편이 인슐린 전구물질인 키메라 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 수성 매질 중에서, 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기에 의해 인슐린 전구물질로부터 분리된 분자내 샤퍼론(IMC) 유사 펩티드 단편으로 구성된 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린-전구물질 함유 키메라 단백질을, 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 것을 포함하여, 정확하게 폴딩된 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법으로서; 상기 IMC 유사 펩티드 단편이 a) 약 20개 내지 약 200개의 아미노산 잔기를 함유하고, b) 인슐린 전구물질 또는 이것의 일부가 아니며, c) 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 카오트로픽 보조제와 접촉되는 경우 정확하게 폴딩된 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질의 수율이 상기 IMC 유사 펩티드 단편을 함유하지 않는 부정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질이 동일한 카오트로픽 보조제와 접촉되는 경우의 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질의 수율 보다 높게 되도록, 인슐린 전구물질 폴딩을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (a) 인슐린 전구물질을 함유하는 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질의 제 1의 펩티드 단편의 아미노산 서열을 변화시키고, 상기 변화가 일어난 키메라 단백질을 수득하며, 상기 변화가 일어난 키메라 단백질을, 이러한 키메라 단백질이 정확하게 폴딩되기에 충분한 조건과 시간 동안 수성 매질중에서 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 상기 변화가 일어난 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 사용되지만 단계 (a)에 기술된 임의의 아미노산 서열 변화가 일어나지 않은 키메라 단백질을 수득하고, 단계 (a)에 기술된 임의의 아미노산 서열 변화가 일어나지 않은 키메라 단백질을 단계 (a)에서와 동일한 조건과 시간을 사용하여 수성 매질에서 동일한 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; (c) 단계 (a)와 (b)에서 각각 측정된 키메라 단백질의 폴딩 수율을 비교하는 단계를 포함하여, 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시킬 수 있는 능력에 대해 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법으로서, 단계 (a)에서 측정된 수율이 단계 (b)에서 측정된 수율과 실질적으로 동일하거나 이 보다 큰 경우, 아미노산 서열이 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시키는 것으로 지시하는 방법에 관한 것이다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1a 및 1b는 프로인슐린 및 이황화물 가교가 정확하게 형성된 성숙한 인슐린의 구조를 도시한다. 도 1a는 프로인슐린의 구조를 도시한다. 도 1b는 이황화물 가교가 정확하게 형성된 성숙한 인슐린의 구조를 도시한다.
도 2는 hGH-미니-프로인슐린(서열 번호: 6) 발현 벡터(pZRhi-1)의 맵을 도시한다.
4. 발명의 상세한 설명
재조합 방법은 미생물에서 사람 프로인슐린, 또는 천연 사람 인슐린과는 다른 아미노산 서열 및/또는 아미노산 사슬 길이를 갖는 프로인슐린을 생성시킬 수 있게 해준다. 사람 프로인슐린 또는 이것의 유도체를 대장균과 같은 미생물에서 생성시키는데 있어서의 한 가지 중요한 문제점은 세포내 분해이다 [참조: Ladisch and Kohlmann, Biotechnol. Prog., 1992, 2:469-478]. 또한, 미생물에서 재조합적으로 생성된 사람 프로인슐린 또는 이것의 유도체는 정확하게 결합된 시스테인 가교를 갖지 못한다 [참조: 미국 특허 제 5,473,049호].
본 발명 이전에, 사람 인슐린을 재조합적으로 수득하는 공지된 방법은 하기 절차를 기초로 하였다: 1) 사람 프로인슐린 또는 이것의 유도체를 함유하는 융합 단백질을 발현시키는 벡터로 형질전환된 미생물의 발효; 2) 세포 분쇄; 3) 융합 단백질의 분리; 4) 브롬화 시아노겐에 의한 융합 단백질의 절단; 5) 프로인슐린 서열을 갖는 절단 생성물의 분리; 6) 산화적 술피톨리시스; 7) 정확하게 결합된 시스테인 가교의 형성; 8) 프로인슐린의 탈염; 9) 정확하게 결합된 시스테인 가교를 갖는 프로인슐린의 크로마토그래피 정제; 9) 프로인슐린 용액의 농축; 10) 농축된 프로인슐린 용액의 크로마토그래피 정제; 11) 사람 인슐린을 수득하기 위한 프로인슐린의 효소적 절단; 12) 생성된 사람 인슐린의 크로마토그래피 정제 [EP 0,055,945]. 이러한 방법의 단점은 많은 절차 단계와 정제단계에서의 손실이며, 이는 인슐린의 낮은 수율을 야기시킨다. 분리된 융합 단백질을 브롬화 시아노겐 절단, 술피톨리시스 및 정제를 거쳐 프로인슐린으로 전환시키는 단계로부터, 40% 이하의 프로인슐린의 손실이 예상된다 [EP 0,055, 945]. 다른 한편, 재조합적으로 생성되는 인슐린 또는 이것의 유도체의 수율은 필요한 절차 단계의 수가 현저히 감소되면 현저히 증가할 수 있다.
본 발명의 한 가지 목적은 보다 적은 필수 절차 단계를 사용하여 정확하게 결합된 시스테인 가교를 갖는 사람 인슐린을 수득하는 재조합 방법을 개발하여, 사람 인슐린을 고수율로 생성시키는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에서 사용될 수 있는 인슐린-전구물질 함유 키메라 단백질을 개발하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 펩티드 결합에 의해 인슐린 전구물질에 결합되는 경우 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시키는 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법을 개발하는데 있다.
본 출원인은 인슐린 서열을 미생물 숙주에 의한 세포내 분해로부터 보호할 뿐만 아니라, 기존의 사람 인슐린 발현 시스템과 비교하여 펩티드 결합에 의해 인슐린 전구물질에 결합되는 경우 1) 융합된 인슐린 전구물질의 폴딩을 촉진시키고; 2) 융합 단백질의 용해를 촉진하여 융합 단백질 사이의 분자간 상호작용을 감소시킴으로써 융합된 인슐린 전구물질이 상업적으로 매우 높은 농도로 폴딩될 수 있도록 하며; 3) 브롬화 시아노겐 절단, 산화적 술피톨리시스 및 관련된 정제 단계의 절차 단계를 제거시키고; 4) 고농도 메르캅탄 또는 소수성 흡수제 수지의 사용을 제거시키는 잇점을 갖는 펩티드 서열을 조사해 왔다.
본 출원인은 놀랍게도 IMC 유사 서열을 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기에 의해 인슐린 전구물질에 결합시키면 본 발명의 목적이 달성됨을 발견하였다. IMC 유사 서열은 표적 단백질 폴딩을 돕고, 하전된 아미노산 잔기를 그 표적 단백 질 보다 높은 비율로 함유하며, 하전된 아미노산 잔기의 분극된 분포를 갖고, 표적 단백질에 대해 "테일러-메이드"되는 것으로 여겨지는 서열을 갖는 것과 같은 IMC 서열의 몇몇 특징을 갖는다. 그러나, 본 발명에 사용되는 IMC 유사 서열은 몇몇 중요한 일면에서 IMC 서열과 다르다. 첫째, IMC 유사 서열은 표적 단백질에 대해 이종성이며, 즉, 표적 단백질의 프로펩티드가 아니다. 예를 들어, 인슐린 전구물질이 폴딩될 표적 단백질인 경우, IMC 유사 서열은 인슐린 전구물질 또는 이것의 일부가 아니다. 또한, IMC 유사 서열의 크기는 약 20개 내지 약 200개 아미노산 잔기이다.
또한, 종래 기술[참조: Castellanos-Serra et al., FEBS Letters, 1996, 378:171-176]의 기술내용과 대조적으로, 본 출원인은 IMC 유사 서열과 인슐린 전구물질을 분리시키는 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기와 동일한 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기를 IMC 유사 서열내에 포함시키면 폴딩 후에 IMC 유사 서열을 단편화 제거시켜서 다운-스트림 정제 단계를 단순화시킬 수 있음을 놀랍게도 발견하였다.
제한이 아닌 개시의 명확성을 위해, 본 발명의 상세한 설명을 다음과 같은 서브섹션으로 나누었다.
4.1. 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 핵산
본 발명은 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
한 가지 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 서열 번호: 6의 아미노산 서열 을 갖는 키메라 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 키메라 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
한 가지 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자를 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 DNA의 제 1, 제 2 및 제 3의 펩티드 단편을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있는 분리된 핵산을 제공한다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 임의의 단편, 유사체 또는 유도체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 당 분야에 공지된 임의의 방법(들)에 의해 수득될 수 있다. 핵산은 전체가 화학 합성될 수 있다. 대안적으로, 키메라 단백질의 각각의 단편, 즉, 제 1, 제 2 또는 제 3의 펩티드 단편을 엔코딩하는 핵산은 분자 클로닝에 의해 수득될 수 있거나 원하는 세포로부터 정제될 수 있다. 그 후, 키메라 단백질의 각각의 단편을 엔코딩하는 핵산은 화학적으로 또는 효소적으로 함께 연결되어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것 의 임의의 단편, 유사체 또는 유도체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 형성할 수 있다.
임의의 사람 세포는 잠재적으로 hGH 핵산의 분리를 위한 핵산 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 임의의 포유동물 세포는 잠재적으로 인슐린 핵산의 분리를 위한 핵산 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 인슐린을 엔코딩하는 핵산 서열은 포유동물, 사람, 돼지, 소과 동물, 고양이과 동물, 조류, 말, 개과 동물 뿐만 아니라 추가의 설치류 또는 영장류 공급원 등으로부터 분리될 수 있다.
DNA는, 클로닝된 DNA(예를 들어, DNA "라이브러리")로부터 당 분야에 공지된 표준 절차에 의해, 화학 합성에 의해, cDNA 클로닝에 의해, 또는 원하는 세포로부터 정제된 게놈 DNA, 또는 이것의 단편의 클로닝에 의해 수득될 수 있다 [참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I,II.]. 게놈 DNA로부터 유도된 클론은 조절 및 인트론 DNA 영역 뿐만 아니라 코딩 영역도 함유할 수 있으며; cDNA로부터 유도된 클론은 엑손 서열만을 함유할 것이다. 공급원이 무엇이든지 간에, 유전자는 유전자의 증식을 위한 적당한 벡터내에 분자적으로 클로닝되어야 한다.
cDNA로부터 유전자를 분자 클로닝하는 경우, cDNA는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 전체 세포 RNA 또는 mRNA로부터 생성된다. 유전자는 게놈 DNA로부터 또한 수득될 수 있고, 여기에서 DNA 단편이 생성되며(예를 들어, 제한 효소를 사용하거나 기계적 전단에 의해), 이중 몇몇은 원하는 유전자를 엔코딩할 것이다. 그 후, 선형 DNA 단편은 아가로오스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 크기에 따라 분리될 수 있다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질 또는 이것의 임의의 단편, 유사체 또는 유도체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 수득되면, 이것의 실체는 핵산 서열화(당 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해) 및 공지 서열과의 비교에 의해 확인될 수 있다. DNA 서열 분석은 하기 방법을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다: 막삼(Maxam)과 길버트(Gilbert)의 방법[Maxam and Gilbert, 1980, Meth. Enzymol., 65:499-560], 생거(Sanger) 디데옥시 방법[Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
74:5463], T7 DNA 중합효소의 사용[Tabor and Richardson, U.S.Patent No. 4,795,699], 자동 DNA 시쿼네이터(sequenator)의 사용[참조: Applied Biosystems, Foster City, CA] 또는 PCT 공개 WO 97/15690에 기재된 방법.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 임의의 단편, 유사체 또는 유도체을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 하이브리드화될 수 있는 핵산은 낮은, 높은 또는 적당한 엄격성 조건하에서 핵산 하이브리드화에 의해 분리될 수 있다 [참조: Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:6789-6792].
4.2. 키메라 단백질
본 발명은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, a) 사람 성장 호르몬(hGH) 단백질의 적어도 처음 20개의 N-말단 아미노산이 함유된 도메인과 40% 이상의 동일성을 갖는(동일성 비율은 hGH의 도메인과 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정됨) 아미노산 서열로 구성된 제 1의 펩티드 단편; b) Arg 잔기, 또는 Lys 잔기, 또는 펩디드 단편중의 대부분의 C-말단 아미노산 잔기가 Arg 또는 Lys인, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 제 2의 펩티드 단편; 및 c) hGH 단백질의 일부가 아닌, 2개 넘는 시스테인(Cys) 잔기가 함유된 아미노산 서열로 구성된 제 3의 펩티드 단편을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 1의 펩티드 단편이 hGH 단백질의 도메인과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 1의 펩티드 단편이 항-hGH 항체에 의해 결합될 수 있는, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 1의 펩티드 단편이 서열 번호: 1의 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 1의 펩티드 단편이 서열 번호: 2의 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 2의 펩티드 단편이 서열 번호: 3의 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 제 3의 펩티드 단편이 인슐린 전구물질인, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 인슐린 전구물질이 사람 기원을 갖는, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 사람 인슐린 전구물질이 항-사람 인슐린 항체에 의해 결합될 수 있는, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 사람 인슐린 전구물질이 서열 번호: 4의 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 사람 인슐린 전구물질 중에서 사람 인슐린 전구물질의 B 사슬과 A 사슬이 하나의 아미노산 잔기 또는 2개 내지 34개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 단편에 의해 분리된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 사람 인슐린 전구물질이 서열 번호: 5의 아미노산 서열로 구성된, 상기 기술된 키메라 단백질을 제공한다.
한 가지 가장 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된 키메라 단백질을 제공한다.
또 다른 가장 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 서열 번호: 7의 아미노산 서열로 구성된 키메라 단백질을 제공한다.
4.3. 섹션 4.2에 기술된 키메라를 수득하는 방법
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섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 및 이것의 유도체, 유사체 및 단편은 재 조합 발현 방법, 천연 공급원으로부터의 정제, 및 화학 합성을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당 분야 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질은 재조합 단백질 발현 기술에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현의 경우, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 유전자 또는 이것의 일부는 특정 숙주 세포에서의 발현에 적합한 클로닝 벡터내로 삽입된다. 당해 분야에서 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 가능한 벡터로는 플라스미드 또는 변형 바이러스가 있고 이들에 제한되지 않지만, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 양립가능해야 한다. 이러한 벡터로는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터 (Stratagene)가 있지만 이들에 제한되지 않는다. 클로닝 벡터내로의 삽입은, 예를 들어 DNA 단편을 상보적 부착성 말단을 갖는 클로닝 벡터내로 연결시킴으로서 달성될 수 있다. 그러나, DNA를 단편화시키는데 사용되는 상보적 제한 부위가 클로닝 벡터내에 존재하지 않는 경우, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 원하는 임의의 부위는 누클레오티드 서열(링커)를 DNA 말단상으로 연결시킴으로써 생성될 수 있고; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도누클레아제 인식 서열을 엔코딩하는 특정한 화학 합성된 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 분자는 형질전환, 트랜스펙션, 감염, 일렉트로포레이션 등에 의해 숙주 세포내로 도입되어, 유전자 서열의 다수의 복사체를 생성시킬 수 있다.
한 가지 또 다른 방법에 있어서, 원하는 유전자는 "숏 건(shot gun)" 방법에 서 적합한 클로닝 벡터내로 삽입된 후에 확인되고 분리될 수 있다. 원하는 유전자를, 예를 들어 크기 분별에 의해 풍부하게 하는 단계는 클로닝 벡터내로 삽입되기 전에 수행될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 숙주 세포를, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 분리된 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열이 삽입된 재조합 DNA 분자로 형질전환시키면, 유전자의 다수의 복사체가 생성될 수 있다. 따라서, 유전자는 형질전환체를 증식시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리시키고, 필요에 따라, 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 대량으로 수득될 수 있다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 및 이것의 유도체, 유사체 및 단편, 또는 이것의 기능적으로 활성인 유사체 또는 단편 또는 기타 유도체를 코딩하는 누클레오티드 서열은 적합한 발현 벡터, 즉, 삽입된 단백질-코딩 서열의 전사와 번역에 필수적인 요소가 함유된 벡터내로 삽입될 수 있다. 다수의 숙주-벡터 시스템이 단백질-코딩 서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 이들 숙주-벡터 시스템으로는 바이러스(예를 들어, 우두 바이러스, 아데노바이러스 등)에 의해 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스 (예를 들어, 바쿨로바이러스)에 의해 감염된 곤충세포 시스템; 효모 벡터가 함유된 효모와 같은 미생물, 또는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아가 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 벡터의 발현 요소는 이들의 능력과 특이성에 따라 다르다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소중의 어느 하나가 사용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터내로 삽입시키는 것으로 이미 공지된 방법 중의 어느 한 방법을 이용하여 적합한 전사/번역 조절 신호와 단백질 코딩 서열로 구성된 키메라 유전자가 함유된 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)가 있을 수 있다. 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 및 이것의 유도체, 유사체 및 단편을 엔코딩하는 핵산 서열의 발현은, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질이 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 발현하게 되도록 제 2의 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질의 발현은 당 분야에 공지된 임의의 프로모터/증강제 요소에 의해 조절될 수 있다. 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 프로모터로는 SV40 초기 프로모터 영역[참조: Bernoist and Chambon, 1981, Nature
290:304-310], Rous 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터[참조: Yamamoto, et al., 1980, Cell
22:787-797], 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터[참조: Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열[참조: Brinster et al., 1982, Nature
296:39-42]; β-락타마아제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터[참조: Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-3731], tac 프로모터[참조: DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25]; 또는 Trp E 프로모터[참조: Hall, Invisible Frontiers--The Race to Synthesize a Human Gene, Atlantic Monthly Press, New York, 1987; "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94]; 효모 또는 기타 균류로부터의 프로모터 요소, 예를 들어 Gal 4 프로모터, ADC(알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나아제) 프로모터, 알칼리성 포스파타아제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 형질전환된 동물에서 사용되어 온 하기 동물 전사 조절 영역이 있지만, 이들에 제한되지 않는다: 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[참조: Swift et al., 1984, Cell
38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology
7:425-515]; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역[참조: Hanahan, 1985, Nature 315:115-122], 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역[참조: Grosschedl et al., 1984, Cell
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234:1372-1378].
예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 핵산에 작동적으로 결합된 프로모터, 하나 이상의 복제 기원, 및 임의로, 하나 이상의 선택성 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유사체 또는 유도체를 엔코딩하는 유전자 삽입체가 함유된 발현 벡터는 3가지 방법, 즉, (a) 핵산 하이브리드화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 여부, 및 (c) 삽입된 서열의 발현에 의해 확인될 수 있다. 첫 번째 방법에 있어서, 발현 벡터에 삽입된, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 유전자의 존재는 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 삽입된 유전자에 상동인 서열을 포함하는 프로브를 사용하는 핵산 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다. 두 번째 방법에 있어서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 유전자를 벡터에 삽입시킴으로써 야기되는 특정한 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생제 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서의 폐색체(occlusion body) 형성 등)의 존재 여부를 기초로 하여 확인되고 선택될 수 있다. 예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 유전자가 벡터의 마커 유전자 서열내에 삽입되면, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질을 엔코딩하는 삽입체가 함유된 재조합체가 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 세 번째 방법에 있어서, 재조합 발현 벡터는 재조합체에 의해 발현된 키메라 단백질을 검정함으로써 확인될 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들어, 시험관내 검정 시스템에서의 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질의 물리적 또는 기능적 성질, 예를 들어 항-hGH 또는 항-인슐린 항체와의 결합을 기초로 할 수 있다.
특정한 재조합 DNA 분자가 확인되고 분리되면, 당해 분야에서 공지된 몇몇 방법이 이를 증식시키기 위해 사용될 수 있다. 적당한 숙주 시스템 및 증식 조건이 설정되면, 재조합 발현 벡터가 증식되어 대량으로 제조될 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터로는 하기 벡터 또는 이들의 유도체가 있으나, 이에 한정되지 않는다: 우두 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 바쿨로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들어, 람다), 및 예를 들 수 있지만 적은 플라스미드와 코스미드 DNA 벡터.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변화시키고 프로세싱하는 숙주 세포 스트레인이 선택될 수 있다. 특정한 프로모터로부터의 발현은 특정한 유도제의 존재하에 상승될 수 있으므로; 섹션 4.2에 기술된 유전 공학처리된 키메라 단백질의 발현은 조절될 수 있다. 또한, 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역후 프로세싱 및 수식(예를 들어, 글리코실화, 인산화)에 대해 고유하고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 원하는 수식 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 세균 시스템에서의 발현은 글리코실화되지 않은 코어 단백질 생성물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 효모에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 생성시킬 것이다. 포유동물 세포에서의 발현은 이종 단백질의 "천연" 글리코실화를 보장하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 다수의 벡터/숙주 발현 시스템은 프로세싱 반응을 상이한 정도로 수행할 수 있다.
cDNA와 게놈 서열 둘 모두는 클로닝되고 발현될 수 있다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유사체 또는 유도체는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도를 포함하는 표준 방법에 의해 또는 단백질 정제용의 임의의 기타 표준 기술에 의해 또한 분리되고 정제될 수 있다. 기능적 성질은 임의의 적합한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유사체 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산 서열은 시험관내에서 또는 생체내에서 변이되어, 번역, 개시, 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴시키거나, 코딩 영역을 변화시킬 수 있다. 시험관내 특정부위의 변이유발[참조: Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem.
253:6551], TAB 링커의 사용(Pharmacia), 변이 함유 PCR 프라이머 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당해 분야에서 공지된 임의의 변이유발 기술이 사용될 수 있다.
변이유발과 관련된 실험은 주로 특정부위의 변이유발에 후속한 변화된 유전자 생성물의 표현형 시험으로 구성된다. 더욱 보편적으로 사용되는 특정부위의 변이유발 프로토콜중의 몇몇은 필요에 따라 단일 가닥 뿐만 아니라 이중 가닥 DNA를 제공할 수 있는 벡터를 이용한다. 일반적으로, 이러한 벡터를 사용한 변이유발 프로토콜은 다음과 같다. 변이유발성 프라이머, 즉 변화될 서열에 상보적이지만 하나 또는 소수의 변화, 첨가, 또는 결실된 염기로 구성된 프라이머를 합성한다. 프라이머를 DNA 중합효소에 의해 시험관내에서 연장시키고, 약간의 추가 조작 후, 이러한 이중 가닥 DNA를 세균 세포내로 트랜스펙션시킨다. 그 후, 다수의 방법에 의해, 원하는 변이된 DNA를 확인하고, 원하는 단백질을 변이된 서열을 함유하는 클론으로부터 정제시킨다. 긴 서열의 경우, 긴 삽입체(2kb 보다 긴)가 이들 벡터에서 불안정하므로 추가의 클로닝 단계가 종종 필요하다. 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있고, 특정부위의 변이유발용 키트는 생물공학 공급 회사, 예를 들어 아머샴 라이프 사이언스, 인코포레이티드(Amersham Life Science, Inc.; Arlington Heights, IL) 및 스트라타진 클로닝 시스템스(Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA)로부터 쉽게 구입할 수 있다.
또한, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유사체 또는 유도체는 화학 합성될 수 있다 [참조: Clark-Lewis et al., 1991, Biochem.
30:3128-3135 및 Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc.
85:2149-2156]. 예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유도체 및 유사체는 고체상 기술에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, 제조용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다 [참조: Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co. N.Y., pp. 50-60]. 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유도체 및 유사체는 펩티드 합성기를 사용함으로써 또한 합성될 수 있다. 합성 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열화(예를 들어, 에드만(Edman) 분해 절차)에 의해 확인될 수 있다 [참조: Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49].
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유도체 및 유사체는 아미노산 잔기의 순차적 첨가에 의해 이들 전체가 합성되거나, 예를 들어 단편 축합과 같은 당 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 합쳐질 수 있는 단편 부성분(subcomponent)으로서 합성될 수 있다 [참조: Shin et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem.
56:404-408; Nyfeler et al., 1992, Peptides, Proc. 12th Amer. Pep. Soc., Smith and Rivier (eds), Leiden, pp 661-663; 및 Nokihara et al., 1990. Protein Research Foundation, Yanaihara (ed), Osaka, pp 315-320].
한 가지 덜 바람직한 구현예에 있어서, 섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질, 또는 이것의 단편, 유도체 및 유사체는 단백질을 가수분해시킨 후, 상기 기술된 방법과 같은 표준 방법(예를 들어, 면역친화성 정제)을 사용하여 정제시킴으로써 수득될 수 있다.
4.4. 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질의 수득
본 발명은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수성 매질에서 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 단계를 포함하여, 정확하게 폴딩된 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질은 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기에 의해 인슐린 전구물질과 분리된 분자내 샤퍼론(chaperone)(IMC) 유사 펩티드 단편으로 구성되고; 상기 IMC 유사 펩티드 단편은: a) 약 20 내지 약 200개 아미노산 잔기를 함유하고; b) 인슐린 전구물질 또는 그의 단편은 아니며; c) 인슐린 전구물질 폴딩을 개선시켜, 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 카오트로픽 보조제와 접촉되는 경우 정확하게 폴딩된 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질의 수율은 상기 IMC 유사 펩티드 단편을 함유하지 않는 부정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질이 동일한 카오트로픽 보조제와 접촉하는 경우의 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질의 수율 보다 높아진다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "사람 인슐린 전구물질"은 1) 사람 인슐린 A사슬 및 B 사슬, 또는 이들의 유사체, 유도체 및 단편을 함유하고, 2) 6개의 시스테인 잔기를 함유하며, 3) 인슐린 A 사슬 및 B 사슬에 결합된 제거가능한 연결 부분을 가지고, 4) 항 사람 인슐린 항체에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 사람 인슐린 전구물질의 예로는 문헌 [Ladisch and Kohlmann, Biotechnol. Prog., 1992, 8: 469-478; Thim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 6766-6770]; 미국 특허 제 5,473,049호; 미국 특허 제 5,457,066호; 및 EP 0,347, 781 B1에 기술된 것들이 있지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "정확하게 폴딩된" 사람 인슐린 전구물질 또는 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질은, 사람 인슐린 전구물질이 천연의 생물학적 활성인 사람 인슐린에서 발견되는 바와 같은 이황화물 가교, 즉 a) A-6 및 A-11, b) A-7 및 B-7, c) A-20 및 B-19사이에 형성된 이황화물 가교 및 입체형태를 가진 분자로 지칭된다. 용어 "부정확하게 폴딩된" 사람 인슐린 전구물질 또는 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질은 사람 인슐린 전구물질이 천연의 생물학적으로 활성인 사람 인슐린에서 발견되는 것과 같은 이황화물 가교, 입체 형태, 또는 양자 모두가 부족한 분자를 지칭한다.
한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 인슐린 전구물질이 사람 유래의 것인 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또한, 사람 인슐린 전구물질은 항 사람 인슐린 항체에 의해 결합될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 사람 인슐린 전구물질은 서열 번호: 4의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 더우기, 사람 인슐린 전구물질에서, 사람 인슐린 전구물질의 B 사슬 및 A 사슬은 하나의 아미노산 잔기 또는 2 내지 34개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 단편에 의해 분리되는 것이 바람직하다. 사람 인슐린 전구물질이 서열 번호: 5의 아미노산 서열로 구성되는 것이 보다 바람직하다.
한 바람직한 구현예에서는, 본 발명은 IMC 유사 펩티드 단편이 하전된 아미노산 잔기를 인슐린 전구물질 보다 높은 비율로 함유하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또한, IMC 유사 펩티드 단편에서, N-말단 절반은 음으로 하전된 아미노산 잔기 보다 양으로 하전된 아미노산 잔기를 더 많이 함유하고 C-말단 절반은 양으로 하전된 아미노산 잔기 보다 음으로 하전된 아미노산 잔기를 더 많이 함유하는 것이 바람직하다. 또한, IMC 유사 펩티드 단편은 사람 성장 호르몬(hGH) 단백질의 적어도 처음 20개의 N-말단 아미노산을 함유한 도메인과 40% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하며, 여기서 동일성 비율은 hGH의 도메인과 동일한 크기의 아미노산 서열에 대하여 결정된다. IMC 유사 펩티드 단편이 사람 성장 호르몬(hGH) 단백질의 적어도 최초 20개의 N-말단 아미노산을 함유한 도메인과 60% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열로 구성되는 것이 더욱 바람직하다. IMC 유사 펩티드 단편은 항-hGH 항체에 의해 결합될 수 있는 것이 바람직하다. IMC 유사 펩티드 단편은 서열 번호: 1의 아미노산 서열로 구성되는 것이 더욱 바람직하다. 또한, IMC 유사 펩티드 단편이 서열 번호: 2의 아미노산 서열로 구성되는 것이 보다 바람직하다.
한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 절단가능한 아미노산 잔기가 Arg 또는 Lys 잔기인, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또한, 절단가능한 아미노산 잔기가 서열 번호: 3의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
한 특정 구현예에서, 본 발명은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질에서, IMC 유사 펩티드 단편이 상기 키메라 단백질의 N-말단에 위치하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또 다른 이러한 특정한 구현예에서, IMC 유사 펩티드 단편은 상기 키메라 단백질의 C-말단에 위치한다. 또 다른 이러한 특정 구현예에서, IMC 유사 펩티드 단편은 인슐린 전구물질의 B 사슬 및 A 사슬 사이에 위치한다.
한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 IMC 유사 펩티드 단편이 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질에서 IMC 유사 펩티드 단편 및 인슐린 전구물질을 분리시키는 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기와 동일한 하나 이상의 절단가능한 아미노산 잔기를 함유하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 보다 바람직하게는, 절단가능한 아미노산 잔기는 Arg 또는 Lys 잔기이다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또한, 가장 바람직하게는 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 서열 번호: 7의 아미노산 서열로 구성된다.
카오트로픽 보조제는 수용액에서 수소 결합을 파괴하는 화합물이다. 한 특정한 구현예에서, 본 발명은 카로트로픽 보조제가 구아니딘 하이드로클로라이드, 에틸렌 카보네이트, 티오시아네이트, 디메틸 술폭시드 및 우레아로 구성된 군으로부터 선택되는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 카오트로픽 보조제는 우레아이다. 보다 바람직하게는, 우레아는 약 2.0 내지 약 8.0M의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게는, 우레아는 약 3.0 내지 약 6.0M의 농도로 존재한다.
또 다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수성 매질에서 약 8.0 내지 약 10.5의 pH 및 약 0.05 내지 약 15.0g/ℓ의 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질 농도에서 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 것을 포함하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. pH는 약 9.0 내지 약 10.0으로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 약 0.5 내지 약 5.0g/ℓ의 농도로 존재한다. 보다 바람직하게는, 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 약 2.0 내지 약 3.0g/ℓ의 농도로 존재한다.
메르캅탄은 물에 용해성이며 하나 이상의 -SH기를 함유한 화합물이다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질의 시스테인 잔기당 5 미만의 메르캅탄의 -SH 라디칼을 산출시키는 양의 메르캅탄과 접촉시키는 단계를 포함하여, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 또 다른 특정 구현예에서, 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질이 메르캅탄 및 카오트로픽 보조제와 동시에 접촉된다. 또 다른 특정 구현예에서, 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질은 메르캅탄 및 카오트로픽 보조제와 연속하여 접촉된다. 바람직하게는, 메르캅탄의 양은 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질의 시스테인 잔기당 약 0.07 내지 약 1.0의 메르캅탄의 -SH 라디칼을 산출시킨다. 또한, 바람직하게는 메르캅탄은 디티오트레이톨, 디티오에리트롤, 2-메르캅토에탄올, 시스테인, 메틸 티오글리콜레이트, 3-메르캅토-1,2-프로판디올 및 3-메르캅토프로피온산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 메르캅탄은 2-메르캅토에탄올이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 정확하게 폴딩된 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 부정확하게 폴딩된 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질으로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 제 1의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질은 한외여과에 의해 제 2의 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질으로부터 분리된다. 보다 바람직하게는, 한외여과는 약 8.0 내지 약 11.0의 pH에서 수행된다. 가장 바람직하게는, 한외여과는 약 9.0 내지 약 10.0의 pH에서 수행된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 정확하게 폴딩된 인슐린 전구물질 함유 키메라 단백질을 제공한다.
4.5. 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시키는 아미노산 서열의 스크리닝
본 발명은 (a) 4.2 섹션에서 기술된 키메라 단백질의 제 1의 펩티드 단편의 아미노산 서열을 변화시키고, 상기 변화를 가진 상기 키메라 단백질을 수득하고, 상기 변화를 가진 상기 키메라 단백질을 상기 키메라 단백질이 정확하게 폴딩되기에 충분한 시간 동안 및 조건하에서 수성 매질에서 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 상기 변화를 가진 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 사용된 키메라 단백질과 동일하지만, 단계 (a)에서 기술된 어떠한 아미노산 서열 변화도 없는 키메라 단백질을 단계 (a)에서 사용된 동일한 조건하에서 및 동일한 시간 동안 수성 매질에서 단계 (a)에서 사용된 동일한 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)에서 각각 측정된 키메라 단백질의 폴딩 수율을 비교하는 단계를 포함하며, 단계 (a)에서 측정된 수율이 단계 (b)에서 측정된 수율과 실질적으로 동일하거나 이 보다 큰 경우 아미노산 서열이 인슐린 전구물질의 폴딩을 개선시킨 것으로 지시하는, 인슐린 전구물질의 폴딩 개선능에 대하여 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법을 제공한다.
섹션 4.2에 기술된 키메라 단백질의 제 1의 펩티드 단편의 아미노산 서열은 당해 기술 분야에서 공지된 어떠한 변이유발 기술, 바람직하게는 단락 4.3에 기재된 변이유발 기술에 의해서 변화될 수 있다.
상기 검정의 한 바람직한 구현예에서, 키메라 단백질은 서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된다.
상기 검정의 다른 바람직한 구현예에서, 키메라 단백질은 서열 번호: 7의 아미노산 서열로 구성된다.
상기 검정의 다른 바람직한 구현예에서, 카오트로픽 보조제는 우레아이다.
상기 검정의 또 다른 바람직한 구현예에서, 검정은 단계 (a) 및 (b) 각각에서 키메라 단백질을 키메라 단백질의 시스테인 잔기당 5 미만의 메르캅탄의 -SH 라디칼을 산출시키는 양의 메르캅탄과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 메르캅탄은 2-메르캅토에탄올이다.
한 특정 구현예에서, 상기 검정법의 생성물이 제공된다.
5. 실시예
서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된 hGH 미니 프로인슐린을 엔코딩하는 DNA 단편을 화학적으로 합성시켰다. DNA 단편을 Trp 프로모터의 조절하에서 세균성 발현 벡터내로 클로닝시켰다. hGH 미니 프로인슐린을 함유한 발현 벡터를 대장균 PR1 균주내로 형질전환시켰고 재조합 세포를 미량 원소의 존재하에서 M9-CA 배지에서 배양시켰다. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 봉입체로부터 회수하여 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질내에서, 정확하게 폴딩된 사람 프로인슐린에서 형성되는 것과 같이 이황화물 가교가 형성되는, 즉 A-6-A11, A7-B7 및 A20-B19의 이황화물 가교가 형성되게 하는 조건하에서 폴딩시켰다. 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 100K 한외여과에 의해 비폴딩된 융합 단백질로부터 분리시켰다. 분리된 정확하게 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 트립신으로 소화시켜 정확하게 폴딩된 Arg(B31)-사람 인슐린을 형성시켰다. Arg(B31)-사람 인슐린을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 순도로 정제시켰다. 그 다음에, 정제된 Arg(B31)-사람 인슐린을 카르복시펩티다아제 B로 소화시켜 정확하게 폴딩된 사람 인슐린을 형성시켰고, 이후에 역상 HPLC에 의해 정제시켰다. 이렇게 생성된 순수한 사람 인슐린을 N-말단 서열 분석, 분자량 측정 및 펩티드 맵핑에 의해 특징화하였다.
5.1 hGH 미니 프로인슐린 발현 벡터의 작제
서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된 hGH 미니 프로인슐린를 엔코딩하는 DNA 단편을 문헌 [Gan et al., Gen, 1989, 79: 159-166]에 기술된 방법에 따라 화학적으로 합성하였다. 5' ClaⅠ부위 및 3' HindⅢ 부위를 합성된 DNA 단편에 포함시켰다. 간단하게는, 서열 번호: 6의 아미노산 잔기 51 및 52를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 절단하는 5' ClaⅠ내지 3' KpnⅠ의 단편, 및 5' KpnⅠ내지 3' HindⅢ의 단편을 화학적으로 합성하였고, 각각 pUC18 벡터내로 서브클로닝하였다. 후속하여, 서열 번호: 6의 전체 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA 단편을 변형된 pATH2 벡터내로 서브클로닝하여 Trp 프로모터 및 SD 서열의 조절하에서 hGH 미니 프로인슐린을 발현시켰다. 결과물인 벡터 pZRhi-1(도 2)을 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 발현시키기 위하여 사용하였다.
5.2. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질의 발현
hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질 발현 벡터를 대장균 균주 RR1 또는 K12 W3110내로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 세포를 미량 원소의 존재하에서 M9-CA 배지에서 배양시켰다. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질의 발현 수준을 진탕 플라스크 및 발효기 모두에서 측정하였다. 두 경우에서, 총 대장균 단백질의 20 내지 25%에 이르는 높은 수준의 발현이 관찰되었다.
5.3. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질의 재폴딩
hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 "봉입체"로 불리는 불용성 형태로서 발현시켰다. 봉입체를 유리시키기 위하여, 대장균 세포를 고압 균질기에 의해 800바아에서 파괴시켰다. 세포 파편 및 가용성 대장균 단백질을 10,000g에서 원심분리에 의해 제거하였다. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 함유한 봉입체 펠릿을 물로 3회 세척하였다. hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질의 순도가 약 90%인 생성된 봉입체 펠릿을 폴딩용 출발 물질로 사용하였다. 봉입체를 2 내지 6mM 메르캅토에탄올의 존재하에서 20 내지 30mg/ml의 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질 농도로 8M 우레아, pH 10.4에서 용해시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. 상등액을 저농도 우레아로 10배 희석시켜 우레아 최종 농도를 3 내지 6M, pH 9 내지 10, 및 메르캅토에탄올 최종 농도를 0.2 내지 0.6mM에 이르도록 하였다. 4℃, 3.2M의 우레아 농도, pH 9.3에서 통상적인 폴딩을 수행하였다. 폴딩 과정을 0.1% 인산 완충액 중에서 30 내지 47% 아세토니트릴 구배를 사용한 C4 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 이러한 크로마토그래피 조건하에서, 정확하게 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린의 유지시간은 약 23분이었다. 폴딩을 24시간 내에 종료할 수 있었다. 재폴딩 수율은 약 70%였다.
폴딩 혼합물을 100K 한외여과에 의해 분획화하였다. 여액 분획에서 얻은 정확하게 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질을 10K 한외여과 시스템에 의해 농축시켰다. 우레아를 pH 3.5에서 물로 제거하였다. 한외여과 단계의 수율은 85%를 초과하였다.
5.4. 정확하게 재폴딩된 hGH 미니 프로인슐린의 트립신소화성 절단
트립신소화성 절단에 있어서, 정확하게 폴딩된 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질의 농도는 약 10 내지 12mg/ml, 바람직하게는 10mg/ml로 존재하였다. 트립신 및 hGH 미니 프로인슐린 융합 단백질간의 비는 약 1:60 내지 약 1:125, 바람직하게는 1:100의 범위였다. pH를 약 10 내지 약 11, 바람직하게는 10.8로 유지시켰다. 절단을 4℃에서 약 1 내지 약 5시간 진행시켰고, 바람직하게는 약 3.5시간 동안 수행하였다. 절단 반응을 인산염 완충액으로 pH를 3.5까지 조정함으로써 중지시켰다. 역상 HPLC 분석은 이 절단 단계에 대한 수율이 95%를 초과하였음을 나타내었다. 10 초과의 pH에서, 트립신은 하기 Arg 잔기에 대하여 작용한다: 사람 미니 프로인슐린 B 및 A 사슬 사이의 Arg 잔기, hGH 단편 및 미니 프로인슐린 단편 사이의 Arg 잔기, hGH 단편내의 Arg 잔기. 트립신 소화는 hGH 단편, 및 Arg(B31)-사람 인슐린으로 불리는 B 사슬의 C말단에 여분의 Arg를 가진 사람 인슐린으로부터 수개의 작은 파편을 산출한다. 사람 인슐린의 Arg(B22) 잔기는 상기 조건하에서 절단되지 않았고, 이는 아마 3차원 구조에 의한 장애 때문인 것으로 추정된다.
Arg(B31)-사람 인슐린을 10mM 시트레이트 완충액의 존재하에 용리제로서 NaCl을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 Arg(B31)-사람 인슐린의 순도는 90%를 초과하였다.
5.5. Arg(B31)사람 인슐린의 사람 인슐린으로의 전환
Arg(B31)-사람 인슐린의 C-말단에서 Arg(B31)을 카르복시펩티다아제 B에 의해 제거하였다. 정확하게 폴딩된 Arg(B31)-사람 인슐린의 농도는 약 10mg/ml로 존재하였다. 카르복시펩티다아제 B 및 Arg(B31)-사람 인슐린간의 비를 약 1:1000으로 유지시켰다. 절단을 50mM Tris-HCl 완충액, pH 8 중에서 37℃에서 약 1시간 진행시켰다. 인산염 완충액으로 pH를 3.5까지 조정함으로써 절단 반응을 중지시켰다. 사람 인슐린의 수율은 99%를 초과하였다.
5.6. 사람 인슐린의 정제
카르복시펩티다아제 B 소화로부터 생성된 사람 인슐린을 0.1% 인산염 완충액, pH 3.0으로 평형화시킨 C8 역상 HPLC 컬럼에 로딩하였다. 사람 인슐린을 pH 3.0에서 0.1% 인산염 완충액, pH 3.0 중에서 17% 내지 35%의 아세토니트릴 구배에 의해 용리하였다. 인슐린 분획을 풀링하고 아세트산을 첨가하여 0.125 내지 0.2M의 농도, pH 6.0에 이르도록 하였다. 이렇게 생성된 인슐린을 4℃에서 결정화시켰다. 사람 인슐린의 순도는 99%를 초과하였다.
5.7. 정제된 사람 인슐린의 특징화
정제된 사람 인슐린 및 WHO 표준 사람 인슐린의 최초 15개 N-말단 아미노산을 표준 Edman 분해에 의해 결정하였다. 정제된 사람 인슐린의 A 및 B 사슬 모두의 N-말단 서열은 WHO 표준 사람 인슐린의 서열과 동일하다.
정제된 사람 인슐린의 분자량 및 WHO 표준 사람 인슐린의 분자량을 VG 플랫폼 질량 분광 분석에 의해 결정하였다. 양 샘플은 모두 5807.7의 M/Z을 나타내었다.
정제된 사람 인슐린 및 WHO 표준 사람 인슐린 모두를 V8 프로테아제로 소화시켰다. 소화된 단편을 C18 역상 HPLC에 의해 분석하였다. 양 샘플은 모두 동일한 펩티드 맵핑 패턴을 나타냈다[참조: Thim et al., Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Hershberger et al., Ed. American Society for Microbiology, 1989, p322-328].
본 발명은 기탁된 미생물 또는 본원에 기재된 특정 구현예에 의한 범주에 한정되지 않는다. 사실, 본원에 기재된 것 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형물은 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에서 명백할 것이다. 이러한 변형물은 첨부된 청구범위의 범주내인 것으로 간주된다.
본원에서는 그 전문이 참조문헌으로 삽입된 다양한 문헌이 인용되어 있다.
6. 서열 목록
(1) 일반 정보
(ⅰ) 출원인: 간, 지.아르.
(ⅱ) 발명의 명칭: 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및 이것의 인슐린 제조용 용도
(ⅲ) 서열의 수: 7
(ⅳ) 통신 주소
(A) 수신인:
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(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 3.5인치 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC
(C) 작업 시스템: DOS
(D) 소프트웨어: WordPerfect 5.1
(ⅵ) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호: 양도
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(ⅶ) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(ⅷ) 변호사/변리사 정보:
(A) 성명:
(B) 등록번호:
(C) 참조/명세서 번호:
(ⅸ) 통신 정보:
(A) 전화:
(B) 팩스:
(C) 텔렉스:
(2) 서열 번호: 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 49개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자의 타입: 단백질
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 1:
(3) 서열 번호: 2에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 92개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 2:
(4) 서열 번호: 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 3:
(5) 서열 번호: 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 86개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 4:
(6) 서열 번호: 5에 대한 정보
(ⅰ) 서열의 특징
(A) 길이: 52개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 5:
(7) 서열 번호: 6에 대한 정보
(ⅰ) 서열의 특징
(A) 길이: 107개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 6:
(8) 서열 번호: 7에 대한 정보
(ⅰ) 서열의 특징
(A) 길이: 150개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ⅹi) 서열 기재: 서열 번호: 7:
Claims (117)
- N-말단에서 C-말단 방향으로,길이가 49개 아미노산 내지 92개 아미노산이며, 이와 동일한 길이의 서열 번호: 2의 N-말단 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 지닌 N-말단의 제 1 펩티드 단편;아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 또는 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기인 C-말단 잔기를 지닌 트립신 절단가능한 펩티드 단편인 링커; 및길이가 1개 내지 34개 잔기인 제거가능한 펩티드 부분에 의해 분리된 포유동물 인슐린의 B 사슬 및 A 사슬로 구성된 인슐린 전구체 펩티드 단편을 포함하는 키메라 단백질로서,링커는 제 1 펩티드 단편과 포유동물 인슐린 전구체 펩티드 단편을 연결시키고, 키메라 단백질이 카오트로픽 보조제와 접촉시에 제 1 펩티드 단편은 포유동물 인슐린 전구체 펩티드 단편의 정확하게 폴딩된 입체형태의 형성을 매개할 수 있는 키메라 단백질.
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- 제 1항에 있어서, 제 1 펩티드 단편의 길이가 49개 아미노산임을 특징으로 하는 키메라 단백질.
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- 제 1항에 있어서, 인슐린 전구체 펩티드 단편이 서열 번호: 4의 1번 내지 30번의 아미노산 서열을 지닌 인간 인슐린의 B 사슬, 길이가 1개 내지 34개 잔기인 제거가능한 펩티드 부분, 및 서열 번호: 4의 66번 내지 86번의 아미노산 서열을 지닌 인간 인슐린의 A 사슬로 구성되며, B 사슬과 A 사슬이 제거가능한 펩티드 부분에 의해 분리됨을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제 11항에 있어서, 인간 인슐린 전구체 펩티드 단편의 아미노산 서열이 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5의 아미노산 서열임을 특징으로 하는 키메라 단백질.
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- 제 1항에 있어서, 링커가 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기임을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제 1항에 있어서, 링커가 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제 11항에 있어서, 키메라 단백질이 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 동일함을 특징으로 하는 키메라 단백질.
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- 제 1항, 제 7항, 제 11항, 제 12항, 제 17항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항의 키메라 단백질을 엔코딩하는 단리된 핵산.
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- 제 21항의 핵산을 함유하는 재조합 세포.
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- 제 1항, 제 7항, 제 11항, 제 12항, 제 17항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제 1 펩티드 단편은 이러한 단편이 결여된 동일한 재조합 단백질을 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 경우에 형성된 인슐린 전구체 펩티드 단편의 생체활성 입체형태의 수율과 비교하여 재조합 단백질을 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 경우에 형성된 인슐린 전구체 펩티드 단편의 생체활성 입체형태의 수율을 증가시킬 수 있는 단계; 및재조합 단백질을 카오트로픽 보조제를 포함하는 수성 매질과 접촉시켜서, 재조합 단백질이 정확하게 폴딩되게 하는 단계를 포함하여, 정확하게 폴딩된 인슐린 전구체를 지닌 제 1항의 키메라 단백질을 제조하는 방법.
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- 인슐린 전구체의 폴딩을 개선시키는 능력에 대해 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법으로서,(a) 제 1항의 키메라 단백질의 제 1 펩티드 단편의 아미노산 서열을 변화시키고, 변화된 키메라 단백질을 수득하고, 변화된 키메라 단백질을 이러한 키메라 단백질이 정확하게 폴딩되게 하는 조건하에서 충분한 시간 동안 수성 매질 중의 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 변화된 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 사용된 키메라 단백질과 동일하지만 단계 (a)에 기술된 아미노산 서열 변화가 없는 키메라 단백질을 수득하고, 단계 (a)에 기술된 아미노산 서열 변화가 없는 키메라 단백질을 단계 (a)에 기재된 조건과 동일한 조건하에서 동일한 시간 동안 수성 매질 중의 하나 이상의 카오트로픽 보조제와 접촉시키고, 키메라 단백질의 폴딩 수율을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b) 각각에서 측정된 키메라 단백질의 폴딩 수율을 비교하여, 단계 (a)에서 측정된 수율이 단계 (b)에서 측정된 수율과 실질적으로 동일하거나 그 이상인 경우에 아미노산 서열이 인슐린 전구체의 폴딩을 개선시킴을 나타내는 단계를 포함하는, 인슐린 전구체의 폴딩을 개선시키는 능력에 대해 아미노산 서열을 스크리닝하는 검정법.
- 제 113항에 있어서, 단계 (a)가 제 7항, 제 11항, 제 12항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항의 키메라 단백질의 제 1 펩티드 단편의 아미노산 서열을 변화시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항, 제 7항, 제 11항, 제 12항, 제 17항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항의 키메라 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제 1 펩티드 단편은 이러한 단편이 결여된 동일한 재조합 단백질을 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 경우에 형성된 인슐린 전구체 펩티드 단편의 생체활성 입체형태의 수율과 비교하여 재조합 단백질을 카오트로픽 보조제와 접촉시키는 경우에 형성된 인슐린 전구체 펩티드 단편의 생체활성 입체형태의 수율을 증가시킬 수 있는 단계; 및재조합 단백질을 카오트로픽 보조제를 포함하는 수성 매질과 접촉시켜서, 인슐린을 정확하게 폴딩시키는 단계; 및링커를 절단하여, 정확하게 폴딩된 인슐린 폴리펩티드를 방출시키는 단계를 포함하여, 정확하게 폴딩된 인슐린 폴리펩티드를 수득하는 방법.
- 삭제
- 제 1항, 제 7항, 제 11항, 제 12항, 제 17항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항의 키메라 단백질을 엔코딩하는 핵산.
- 제 117항의 핵산을 함유하는 재조합 세포.
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