JPH02193A - ムテイン，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、ｂＦａｒ
；’と略称することもある。）のムティン、該ムティン
をコードする組換えＤＮＡおよびその用途に関する。

従来の技術 ｂＦＧＦは主として下垂体より分泌される分子債約１７
０００の塩基性ポリペプチドホルモンであり、当初ＢＡ
ＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞などの線維芽細胞に強い増殖促進作
用を示す因子として分離された［Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａ
ｒｏｗｉｃｚ；ネイチ４ｖ　　（Ｎａｔｕｒｅ）２４９
：Ｉ　２３（＋　９７４）コ。しかし、その後中胚菓由
来の殆んど全ての細胞に対して増殖促進作用を示すこと
が判明した［Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　　ら
：ナショナル・キャンサー・インスティテユート・モノ
グラフ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅＭｏｎｏｇｒａｐｈ）４８；Ｉ　０９（１
９７Ｂ）コ。中でらｂＦＧＰの血管新生作用は細胞増殖
促進作用と相まって損傷の治療薬および血栓症、動脈硬
化症などの予防治療薬としての可能性を示すものである
。

ウシのｂＦＧＦは、プロシーデングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オプ・ザ・ユナイテッド・ステー
ブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ）、第８２巻　
第６５０７−６５１！頁（１９８５年）に発表され、ま
た、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３，５４５（１
９８６）には、ウシｂＦ’ＣＦのｃＤＮＡをクローン化
し、これから推測されるウシｂＦＧＦ’の構成アミノ酸
が示されている。

ヒトｂＦＧＦについては、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）、第１３５巻、５４Ｉ頁（１９８６年）には、人
の脳からヒトｂＦＧＦを抽出したことを報告している。

また、ＥＭＢＯジャーナル（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ　　Ｊｏｕｒｎａｌ）第５巻、２５２３頁（１９
８６年）およびＰＣＴ国際公開Ｎｏ、ＷＯ／　０１７２
８には、牛のｂＦＧＦ’をプローブとして用い、ヒトｂ
ＦＧＦのｃＤＮＡをクローン化し、これよりヒトｂＦＧ
Ｆ”の構成アミノ酸を推定している。

さらに、フエブス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ）　２１３．１８９（＋　９８７）には、ヒトｂＦＧ
ＦのｃＤＮＡをクローン化し、形質転換体の培養により
ヒトｂＦＧＦを製造することが記載されている。

ヒトｂＦＧＦは、ウシｂＦＧＦ’と比較すると、１１２
位がヒトのそれはＴｈｒでありウシのそれはＳｅｔであ
る。また１２８位はヒトのそれはＳｅｒでありウシのそ
れはＰｒｏである。（位置の番号は、Ｎ末端のＭｅｔは
数えないとした場合のそれを示す。）発明が解決しよう
とする課題 本発明者らは、アミノ酸配列を修飾することによって、
ｂＦＧＰの安定性、細胞における産生能。

分子当りの細胞増殖活性の上昇、さらに未知の生物活性
の賦活化がなされるであろうと考えた。

さらに、組換えＤＮＡ技術によって微生物学的につ（ら
れる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含有
しており、それらは活性に本質的なものではないが、分
子間または分子内の望ましくない結合を形成することが
ある。

組換えＤＮＡ技術によってｂＦ　Ｇ　Ｆをつくる過程で
高濃度のｂＦＧＦを含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｌ＋）抽出物中に、複数のヘテロなコン
フォメーションが見い出された。これらはランダムな分
子内ジサルファイド架橋形成のためと考えられ、ｂＦＧ
Ｆの精製を難しくし、回収率を低下させる原因となって
いる。

そこで本発明者らは、組換え型ｂＦＧＦのように微生物
学的につくられ生物活性のある蛋白質を、その活性に悪
影響を及ぼさないが蛋白質が望ましくない三次構造（例
えば蛋白質の活性を低下させるようなコンフォメーショ
ン）を取る結果になるような分子間架橋や分子内結合の
形成能力を減少ないし排除する形で改変することを考え
た。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組み換えＤＮＡ技術および特定部位指向
性変異（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）により、修飾されたｂＦＧＦのムティンを構
築し、安定性の向上、細胞内での産生能、活性の上昇お
よび生物活性の変化につき鋭意研究したところ、これら
の目的に叶うムティンを見い出し、これらの知見に基い
てさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ’）ムティン。

（２）、上記（１）のムティンをコードする塩基配列を
有する組換えＤＮＡ。

（３）、上記（１）のムティンをコードする塩基配列を
有する組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換
体、および （４）、上記（１）のムティンをコードする塩基配列を
有する組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換
体を培地に培養し、培養物中に該ムティンを生成蓄積せ
しめることを特徴とする該ムティンの製造法である。

本発明のムティンにおける変異させる前のｂＦＧＦとし
ては、温血哺乳動物のｂＦＧＦのいずれのものでもよい
。

その代表例としてはたとえば、ヒト、ウシ、ラットのｂ
ＦＧＦが挙げられる。

さらに具体的には、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−Ｉ　１ｅ−Ｈｉｓ
　−Ｐｒ。

Ａｓ＋）−Ｇ　＋ｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇ　ｔ
ｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１；１ｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ　　　［１］で示されるアミノ酸配列［１］
を含むポリペプチドが好ましい。

さらに、一般式 ％式％ ［１１］ 〔式中、ＸはＴｈｒまたはＳｅｒを示し、ＸがＴｈｒの
ときＹはＳｅｒを、Ｘ　ｈ＜　Ｓ　ｅｔのときＹはＰｒ
ｏをそれぞれ示す。〕で表わされるポリペプチド［１１
］が好ましい。

またさらに、 アミノ酸配列： Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙＧ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　１ｙＨｉｓ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｐ
　ｒｏ　−Ｌｙｓ　−ＡｒｇＬｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ＩｙＰｈ
ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
。

Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ　−ＡＳｐ　
−Ｇ　ｌｙ　−ＶａｌＡｒｇ　−Ｇ　　ｌｕ　−Ｌｙｓ
　−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ　−Ｐｒｏ　−ＨｉｓＶａｌ　−
Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｃｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ　−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ
　ｌｕ　−ＣｙｓＰｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｇ　
ｌｕ−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＴｙｒΔｒｇ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−ＳｅｒＴｒ
ｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｙｒ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−９ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ　−Ａ　
Ｉａ　−１１ｅ　−Ｌｅａ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐ
　ｒ。

Ｍｅｔ−Ｓｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ　　　　　　
［ＩＩ［］を含有するポリペプチド［ＩＩｌ］が好まし
い。

本発明におけるムティンとしては、本来、元のペプチド
あるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したしのであり、
したがって該変異としては、アミノ酸の付加、構成アミ
ノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のｂＦ
ＧＦ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のｂ
ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているも
のが挙げられる。

ｂＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているム
ティンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペ
プチドを発現する際に用いられる開始コドンに基因する
メチオニンや、シグナルペプチドは含まれないものであ
る。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ｂＦ　Ｇ　Ｐの特徴を失わない限り何個でも
よい。さらに好ましくは、ｂＦＧＦと相同性（ホモロジ
ー）が認められており、同様の活性を示すタンパクのア
ミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。

該付加されているアミノ酸の例としては、酸性ｔｌＡＱ
１１芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インターリューキン
１−α（ＩＬＩ−α）、インターリューキンｌβ（Ｉ　
Ｌ　Ｉ−β）、癌遺伝子群における１ｎｔ−２などにコ
ードされるタンパクのアミノ酸配列の一部あるいはすべ
てか挙げられろ。

該ａＦＧＦとしては、ヒト由来のもの、ウシ由来のもの
が挙げられる。該ｆＬ１−α、ＩＬＩ−βとしては、ヒ
ト由来のものが挙げられる。

該ウシａＦ　Ｇ　Ｐのアミノ酸配列としては、ＮＨｔ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙΔ５
ｎ−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ
　−Ｌｅａ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−’Ｉ”ｙｒ　
−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−１ｌｅ　−Ｌｅｕ　
−Ｐ　ｒ。

Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ　−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｎ−Ｈｉｓ　−＋　１ｅ−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ　−Ｃｙｓ−Ａｌａ　−Ｇ　！ｕ　−Ｓｅｒ　
−１１ｅ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｖａｌ　−Ｔｙ
ｒ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｍｅ
ｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｔｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｇ　Ｉｕ　−ＣｙｓＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｎ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒｌ　１ｅ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ａ　ｌ
ａ　−Ｇ　ｌｕＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ＬｙｓＬｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ　−１−１１ｓ−Ｐｈｅ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ａ　ｌａ　−Ｉ　１ｅ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−５ｅｒ−５ｅｒＡｓｐ−ＣＯＯＨ が挙げられる。

ヒトＩＬＩ−αのアミノ酸配列としては、ＮＨｚ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ
　−Ｐｈｅ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
　−ＡｓｎＣｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ
　−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　１ｕＡｓｐ　−Ｓｅｒ
　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−１１ｅ−Ａｓｐ−ＨｉｓＬｅ
ｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌｅｕ
　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ＩＹ　−Ｃｙｓ　−Ｍ
ｅｔＡｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｖａｔ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｓ　ｅｒｌ　１ｅ　−Ｓｅｒ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　
−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｇ　ｌｕ−９ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｙｓ　−Ｖ
ａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Δｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−９ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ　−９ｅ
ｒ　−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕＧ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｅ　ｌｅ　−Ａ　ｌａ　−
Ａｓｎ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ａｒｇ　−Ｓ　ｅｔ　
−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ｐ　ｈｅＬ、ｃｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−
Ｔｙｒ−Ａｓｎｒ’ｈｃ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ　−１１ｅ　
−１１ｅ　−Ｌｙｓ　−ＴｙｒＧ　ｌｕ　−Ｐｈｅ　−
１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　−Ａｓｐ　−Ａ　Ｉａ　
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｓｅｔ　−１１ｅ　
−１１ｅ　−Ａｒｇ　−Ａ　ｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−〇
　Ｉｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＴｈｒＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ａ
ｓｐＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｉ　１ｅ−ＴｈｒＶａｌ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ　−１１ｅ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ＡＩａＧｉｎ−
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−
Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｍｅｔ　−
Ｐｒｏ　−Ｇ　Ｉｕｌ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
　−１１ｅ−Ｔｈｒ−ｃｌｙＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ　−Ｔｒｐ　
−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｔｈ
ｒ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ｔｈ
ｒ　−５ｅｒ−ＶａｌＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＴｒｐＶａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

Ｐｒｏ−５ｅｒ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ｇｉｎｌ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｃｏｏ）Ｉが挙げられる。

ヒトＩＬＩ−βのアミノ酸配列としては、ＮＨｔ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−ＧｌｕＬｅｕ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−ＡｌａＴｙ
ｒ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｓｎ　−Ｇ
　ｌｕ　−ＡｓｐＡｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈ
ｅ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｍｅｔ　−Ｌｙｓ　
−Ｃｙｓ　−９ｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｓｐ
　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　１ｙ−１
１ｅＧｌｎ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−Ｉ　　１ｅ−Ｓｅｒ
　−Ａｓｐ　−夏（ｉｓＩＩ　ｉｓ　−’Ｉ’ｙｒ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｖ
ａｌ　−Ａｌａ　−Ｍｅｔ　−Ａｓｐ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｍｅｔ　−Ｌ、
ｅ、ｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−’Ｉ’ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ
　ｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−ＬｅｕＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｒ　ＩｅＰｈｅ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ−［１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕ−Ａ　　ｌａ　−１’ｙｒ　−Ｖａｌ　−Ｈｉｓ　−
Ａｓｐ　−Ａ　　ｌａ　−Ｐ　　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−
Ａｒｇ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　
−ＴｈｒＬｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ｇ
　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇ　
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｈ４５Ｌｅ
ｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｓｐ　−Ｍ
ｅｔ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ　−
Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−ＭｅｔＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−Ｇ　ｉｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　１ｕＳｅｒ
−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　−ｒ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌＡ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ
　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｈｒ
　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ＝　
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ　−ＶａｌＰｈｅ　−Ａ
ｓｎ　−Ｌｙｓ−１１ｅ　−Ｇ　ｌｕ　−１１ｅ　−Ａ
ｓｎＡｓｎ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｈｅ
　−Ｇ　ｌｕ　−５ｅｒＡ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−
Ｐ　ｒｏ−Ａｓｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒｌ　１ｅ−Ｓ　ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ
Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ
　１ｙＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｉ
ｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｍｅｔ−Ｇ　ＩｎＰｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−８ｅｒ−
ＣＯＯＨが挙げられる。

１ｎｔ−２にコードされるアミノ酸配列としては、ＮＨ
ｚ−Ｍｅｔ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｔｒｐ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ−Ｔｒｐ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　−Ａ　ｓ
ｐ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｒｇ
−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙＶａｌ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　
ｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌａ　
−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｈ１ｓＬｅｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ　−Ａｓｎ−５ｅｔ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−１
１ｅ−ＬｅｕＧｌｕ−ｒ　ｌｅ−’Ｉ”ｈｒ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＶａｌＧ　ｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ
　−Ａ　！ａ−Ｉ　ｌｅ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　ＩｙＬｅｕ
−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＬｅｕＡ
ｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−
Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｐｈｅ−Ｖａｔ　−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−１１ｅ
−１−１ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　−１’ｙｒ−
Ａｓｎ−１’ｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｔ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｓ
ｅｒＧ　１ｙ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｉａ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ＩｎＰ　ｒｏ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＰｈｅＬｙｓ−Ｔｈｒ　−Ａｒ
ｇ　−Ａｒｇ　−Ｔｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−９
ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｃｕ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｈｉｓ　−Ｌｙｓ　
−Ａｓｐ　−ＨｉｓＧ　ｌｕ−Ｍｅｔ　−Ｖａｌ　−Ａ
ｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ５ｅｒ　−５ｅｒ
−Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ　−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇＧ　Ｉｎ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　ＩｎＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＭｅｔ　−Ｇ　Ｉｕ　
−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ａ　ｒ
ｇ　＝Ａ　ｌａ　−Ｔｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｔ　
−Ｔｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−ＬｅｕＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＶａｌＡ　ｌａ−ＣＯＯ
Ｈ が挙げられる。

ｂＦＧＦの少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠
損しているムティンにおける欠損している構成アミノ酸
の数としては、ｂＦＧＦ’の有する特徴を失わない限り
何個でもよい。

該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦ’
ＧＦのアミノ末端側１０残基：Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ａ　Ｉａ　−Ｌｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａｓ
ｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ。

ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側１４残基：Ｍｅｔ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐＧ　ｌｙ　
−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。

ヒトｂＦＧＦ’のアミノ末端側４１残基：ヒトｂＦＧＦ
’のカルボキシル末端側６１残基：などか挙げられる。

ｂＦＧＦの少なくとも１個のｂＦ　Ｇ　Ｆ構成アミノ酸
が別のアミノ酸で置換されているムティンにおける置換
される前の少なくともＩａＩのｂＦＧＦ構成アミノ酸の
数としては、ｂｐｃｔ；’の特徴を失わない限り何個で
らよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のらのが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられろ。

置換される府の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン２メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸と１．では、スレオニン、
ロイシン、フェニルアラニン、セリン。

グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。

置換される萌の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたらのが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

本発明のムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つ
または３つが組み合わさったものでもよい。

本発明のムティンを製造するためには、従来の組換えＤ
ＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔ
ｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイザ
ー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及びジェイ・ビー・
レコック（１、ｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　）、ジェネテ
ィック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社（１９８３
年）第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオ
チドに指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ
、　　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌａｍ、　　
Ｓ、　）、ジェネティック・エンジニアリング：原理と
方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　ｌ−３２
頁に示されている。

本発明のムティンをコードする構造遺伝子を製造するた
めには、たとえば、 （ａ）ｂＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ
、突然変異性ヘテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのブライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチ
ドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオ
チドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば全
体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ）
は、エム・スミス及びニス・ギラム（萌掲）によって記
述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、
突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適化
するような長さであり、突然変異サイトから５′及び３
′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｔｏｎｓ）は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然
変異の編集をさけるのに部分な大きさとする。本発明に
従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは
、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ましくは約
１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは約１４個
ないし約１８個の塩基を含有する。これらは通常、変更
されるコドンの少なくとも約３個の塩基３′側を含有す
る。

たとえば、アミノ酸が付加されているムティンを得る目
的の場合における変異ｂＦＧＰ遺伝子を作る方法として
は、付加するアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成あ
るいは、制限酵素消化による断片とし、これをｂＦＧＦ
遺伝子の適当な箇所にＤＮＡリガーゼにより挿入あるい
は付加する。

またｂＦＧＦ遺伝子に適当な制限酵素の認識部位が存在
しない場合には、前述の特定部位指向性変異法により制
限酵素認識部位を新たに生成すればよい。

たとえば、ｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠損しているムティ
ンを得る目的の場合における変異ｂＦ’ＧＦ遺伝子を作
る方法としては、三つの場合が考えられる。ひとつはｂ
ＦＧＦのアミノ末端を欠損させる場合、二つめはｂＦＧ
Ｆの中央部分を欠損させる場合、三つにはｂＦ’ＧＦの
カルボキシル末端を欠損させる場合である。

アミノ末端を欠損させる場合には欠損させようとするア
ミノ酸配列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコ
ドンをＭｅｔをコードするＡＴＧに特定部位指向性変異
法を用いて変更し、さらにそのコドンの５′末端側に適
当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターと
の連結（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）を容易にさせる。

アミノ酸配列をその中央部分で欠損させる場合には欠損
させたい配列をコードする遺伝子の５′および３′末端
側にユニークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変
異法を用いて生成し、この部位を酵素によって消化して
抜きとり、再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的
の・アミノ酸を欠損したｂＦＧＦをコードする遺伝子が
でき上る。

このとき制限酵素消化により読み取り枠がずれないよう
にすることは云うまでもない。

カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠損させる場合に
は、欠損させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコー
ドする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によってス
トップコドンに変更すればよい。

たとえば、構成アミノ酸がシスティンであってこれを置
換したムティンを得る目的の場合において、変更ｂＦＧ
Ｆ遺伝子をつくる方法は、たとえば、Ｃｙｓを発現する
コドンを消失させるか、又はそれが別のアミノ酸を暗号
化するように変更させる合成ヌクレオチドプライマーを
使用して、Ｃｙｓを発現させるコドンＴＧＣまたはＴＧ
Ｔに特定部位指向性変異誘発を行なわせるものである。

たとえば、ヒトｂＦ’ＧＦのシスティン（２６位）をセ
リンに変えるために、プライマーをＦＧＦ遺伝子のセン
ス鎖と雑種形成させる。たとえば、好ましいヌクレオチ
ドプライマーとしては ５’　−ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴ
−３’ が挙げられる（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（７０位）をセリンに変えるときの好ましい
プライマーとしては ５’　−ＡＡＣＧＡＴＴＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣ−３′ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（８８位）をセリンに変えるときの好ましい
プライマーとしては ５’　−ＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴ
−３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（９３位）をセリンに変えるときの好ましい
プライマーとしては ５’　　−ＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣ
Ｃ−３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

Ｃｙｓ（２６位）で第一塩基のＴ−Ａの転位により、シ
スティンからセリンへの変化が起る。さらにＣｙｓ（７
０位）では第１塩基のＴ−Ａ、第２塩基のＴ−＋Ｃ転位
、Ｃｙｓ（８８位、９３位）では第２塩基のＧ→Ｃ転位
によりシスティンからせリンへの変化が起る。

特定部位指向性変異によりｂＦＧＦムティン蛋白質を産
生さ仕る時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異を行ってもよ
いこと、すなわち、アミノ酸に対応しているＤＮＡのコ
ドンは縮退していることを認識しておかなければならな
い。

たとえば、構成アミノ酸がシスティン以外のアミノ酸で
あってこれを他のアミノ酸に置換したムティンを得る目
的の場合における変異ｂＦＧＦ’遺伝子を作る方法とし
ては、システィンの場合と同様にして、オリゴヌクレオ
チドプライマーによるコドンの変更を行う。

ただしオリゴヌクレオチドプライマーのデザインはどの
アミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもない。

プライマーは、ｂＦＧＦ遺伝子の１本鎖がクローン化さ
れたＭ　Ｉ　３　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ、　
　Ｃ，。

Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、　３３　１０３１１９（１９８５）、Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ　　Ｊ、メソッズ・イン、エンジ−モロジー（Ｍ
ｅｔｂｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）＋０
１　２Ｏ−７８（１９８３））。

ｆｄ（Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、モレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジエネティック（Ｍｏ１．
　　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅ［、）、＋７７　２３１（１９８０））、又は
φＸ１７４　ＣＭ、　Ｓｍ１ｔｈ　　ａｎｄ　　Ｓ、　
　Ｇｉｌｌａｍ、ジエネティック・エンジニアリング（
Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。

Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ、３　、ｐｐｌ　
−３２（１９８１））のような１本鎖ファージへ雑種形
成される。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス
鎖のいずれでら運搬できることは認められる。ファージ
がアンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗
号づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一致
以外にもプライマーは突然変異さ仕るコドンを含有する
センス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合
があってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する
時には、欠損さ仕るコドンと対合をつくるトリブレット
中の適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有
するセンス鎖の領域に対して相捕的でない場合があって
もよい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及び
ニス・ギラム（前掲）によって記述されている。

温度は通常、約θ℃ないし７０℃、もっと一般的には約
１０℃ないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、プライ
マーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１１Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラーゼ
との反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ず
るｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリ
ガーゼでの処理によって閉鎖環ｄｓＤＮＡへ変換される
。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳｌエンドヌクレ
アーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異成形へテロニ量体は、被感染能力をもつ
宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿主
によるヘテロニ量体の複製では、双方の鎖から子孫がで
きる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から突然変
異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベ
クターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用する
。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のｐＨ１１３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）、　２　。

９５（＋　９７７）］、＋１Ｂ１０２５［ジーン、４，
１２１（１９７８）コ、ｐＵＣ１２［ジーン、＋９，２
５９（１９Ｂ　２）］、ｐＵＣＩ　３　［ジーン、１９
，２５９（１９８２）］、枯枯草由由のｐＵＢｌｌｏ［
バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　
　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　　Ｃ
ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、ｌ　　Ｉ　　２　．６　
７　　Ｂ（１９８３）］などが挙げられるが、その他の
ものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば
、いずれをも用いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　　コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）　、第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが
挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２゜ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢｌ　１０、ｐ
ＴＰ５．ｐＣＩ　９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐ
ＳＨｌ　９．ｐＳＨ１５）、あるいはλファージなどの
バクテリオファージおよびレトロウィルス。

ワタシニアウイルスなどの動物ウィルスなどがあげられ
る。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していでもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰＬ　　プロモーターＣｐｐプ
ロモーターなどが、宿主かバチルス属菌である場合は、
５ＰＯＩプｏモーター、５ＰＯ２プロモーター、　ｐｅ
ｎ　Ｐプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、Ｐ
　ｌ−１０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。

とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターまたはえＰＬプロモーターであることが
好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたムティンをコードする塩基配
列を有する組換えＤＮＡをを含むベクターを用いて、該
ベクターを保持する形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バヂルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　
Ｄ　Ｈ１［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、６０゜１６０（１９６８）コ、ＪＭＩ
０３　　［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、　（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）９，３
０９（１９８１）］、ＪＡ２２１［ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）ｌ　２０
゜５１７（１９７８）］、Ｆ（Ｂ１０１［ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、４１，４５９（１
９６９）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）、３　９，４　４　０（１９５４）コ、ＭＭ２
９４［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　　７３゜４　＋　７４（１９７６）］などが
挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・ザチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　
ｆ１１４［（ジーン、２４，２５５（１９８３）］、２
０７２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
　９５　、８７（１９８４）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシ
アエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）Ａ　１＋　２２　Ｒ″″、　ＮＡ３７−１１
Ａ、ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞Ｃ０８７、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスし細胞
、ヒトＰＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、６９゜２１１０（１９７２）、ジーン、１７，１０７
（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ）。

１６８．１１１（＋　９７９）などに記載の方法に従っ
て行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７５；
１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる
。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（
ＶｉｒｏｌｏｇＹ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ムティンをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換体が
得られる。

該形質転換体を培地に培養することにより、ムティンを
産生さ仕る。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチーブ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどがあげられる。また、酵母、ビタミン類、
生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスベリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジエネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３　、Ｃｏ１ｄ
　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　１９７２）］が好ましい
。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるた
めに、たとえば３β−インドリル　アクリル酸のような
薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常的１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常的３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　　Ｋ、　Ｌ、らＰｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、
７７゜４５０５（１９８０）］が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常的２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通
気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）１２２．５０
１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［ヴイロロジ−（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、８．３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ
１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーンヨン（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　
　ｏｒ　　ｔｈｅ　　Ａｌｌ１ｅｒｉｃａｎ　　Ｍｅｄ
ｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　　１９９．５１９
（１９６７）］。

１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メデイスン（Ｐ　ｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉｅ
ｔｙ　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｒｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）７３，１（１９５０）］などが挙げられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常的
３０〜４０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要
に応じて通気や攪拌を加えろ。

上記培養物からムティンを分離精製するには、例えば下
記の方法により行うことができる。

ムティンを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレン
チプレス、超音波、リゾチームおよび（または）凍結融
解によって菌体あるいは細胞を破壊・したのち、遠心分
離によりムティンを得る方法などが適宜用い得る。とり
わけ、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好まし
い。

上記上澄液からムティンを精製するには、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子ｍの差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセルロースな
どを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかける
ことにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くことが
できる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液をかけ、素
通り画分を集めることは有効である。また、さらに０Ｍ
セルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることにより、ムティンを担体に吸着さけ、
塩溶液を用いてこれを溶出させることができる。これら
の溶出液は透析後、凍結乾燥することができる。

０Ｍセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラ
フィーにより、菌体抽出液から直接、ｂＦＧＦムティン
を精製することもできる。たとえば、」二清液を、弱酸
性緩衝液（例、リン酸緩衝液）で平衡化したＣＭ−セル
ロースカラムにかけることにより、効率良く行なうこと
ができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラムを、塩
（例、ＮａＣ１）をさらに含有する緩衝液を用いて溶出
することにより、ｂＦＧＦムティンを溶出させることが
できる。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥することが
できる。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ｂＦＧＦムティンの精製
法として、抽出液中のｂＦＧＦムティン蛋白質にも適用
すると好都合である。たとえば中性附近のトリス、リン
酸などの緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロースカ
ラムに、上記溶出液をかけ、十分洗った後、ＮａＣｌな
どの直線勾配溶出を行うことによりｂＦＧＦムティン蛋
白質を精製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｐ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４．昭和電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近の
緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣ１など
の直線勾配溶出を行うと、ｂＦＧＦムティンはほぼ均一
な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙１デられる
。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なりＦＧＦムティンが得ら
れる。該実質的に純粋なりＦＧＦムティンとしては、蛋
白質含量としてｂＦＧＦムティンを９０％（Ｖ／Ｗ）以
上であるもの、さらに好ましくはｈｂＰＧＰを９５％（
ｗ／ｗ）以上であるものが挙げられる。

上記の方法により得られるｂＦＧＦムティンは線維芽細
胞の増殖を促進させる作用、血管内皮細胞の増殖を促進
させる作用、血管を新生させる作用を有し、安定性が高
く、毒性は低いので火傷。

創傷、術後組織などの治癒促進剤、あるいは血管新生作
用による血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いる
ことができる。また、細胞培養を促進させるための試薬
として用いることができる。特に、構成システィンのう
ち少なくとも一つがセリンに置換されたものは、安定性
が高いので好ましい。

本発明のムティンを医薬として用いるには、そのまま粉
末として、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦
形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤９錠剤、
カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（例、ヒト
、マウス、ラット、ハムスターウサギ、犬、ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうる。

本発明のムティンを上記した医薬として用いる場合には
、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１日量約１ｎｇないし１００μｇ／ｋｇの
中から適当量を選んで投与される。

また、本発明のムティンを細胞培養を促進させるための
試薬として用いる場合、培地１ｉ２あたり約ｏ、ｏｔ−
ｔｏμｇ１　さらに好ましくは約０．１〜１０μｇとな
るように培地に加えることが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　Ｉ　ＵＰＡＣＩ　Ｕ　Ｉ３　
　Ｃｏｍｍｊｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　　：ア
デニン Ｔ　　　二チミン Ｇ　　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ ｄＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ｄｒ ＤＴＡ ＤＳ ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ １ｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ Ｍｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ：デオキシアデノシン三リン酸 ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキシグアノシン三リン酸 ：デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：チミジン ；エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ニゲリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ：イソロイシン ：セリン ：スレオニン ：システィン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン へｒｇ：アルギニン ！−１ｉｓ　　　　：ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　：フエニールアラニン Ｔｙｒ　　　　：チロシン Ｔｒｐ　　　　：）リプトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 本明細書および図面において、ヒトｂＦＧＦの構成アミ
ノ酸の番号は、前述のアミノ酸配列［１１１］のＮ末端
にＭｅｔが付加したアミノ酸配列において、該Ｍｅｔを
第１番目として数えるものとする。

以下に示す参考例および実施例において製造された形質
転換体のうち、受託番号の付されているものは、財団法
人発酵研究所（ＩＦＯ）および通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（Ｆｌｌ）に寄託されている。それ
らの受託番号および受託日を次の第１表に示す。なお、
第１表において、ＦＥＲＭ　　Ｐ番号とＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ番号とが併記されているものは、当初国内寄託がなさ
れＰＥＲＭＰ番号で示される受託番号が付され、該奇計
はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて、ＰＥＲ
Ｍ　　ＢＰ番号で示される受託番号が付され同研究所（
ＦＲＩ）に保管されている。

（以　下　余　白） 後述の実施例３５　（３）（ｄ）において得られたマウ
スハイブリドーマＨｂＦ５２およびマウスハイブリドー
マＩ（ｂＦ’７８は、それぞれ昭和６２年８月１７日か
らＩＰ’Ｏに次の受託番号として寄託されている。

マウスＨｂＦ５２細胞： ＩＰＯ５０１４３ マウスＨｂＰ７８細胞： ＩＦＯ５０１４４ 実施例 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１　（ヒトｂＦＧＦをコードする遺伝子を含むプ
ラスミドの構築） （１）ＣＤＮＡ含有プラスミドの単離：ヒト包皮由来初
代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡをＩ）ＣＤベ
クター［Ｏｋａｙａｍａ　　ら、モレキュラー・セル・
バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ＣｅｌｌＢｉｏ
ｌｏｇｙ）、３，２８０（１９８３）参照］に組み込ん
で作成した大腸菌ｘ１７７Ｂを宿主としたｃＤＮＡライ
ブラリーをＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｔ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ
　　ｏｆＣｈｉｌｄ　　Ｈｅａｌｔｈ　　ａｎｄ　　Ｈ
ｕｍａｎ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＢｅｔｈｅｓｄ
ａ、　　Ｕ、　Ｓ　、　Ａ、の岡山博士より分与を受け
た。このｃＤＮＡライブラリーよりアルカリ法（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，＆　　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、　！　、　Ｉ　５１３　（
１９７９）］でプラスミドＤＮＡを抽出し、このＤＮＡ
を大腸菌ＤＨＩに感染させ、約２ＸＩ０６個のｃｌｏｎ
ｅよりなる大腸菌ＤＨＩを宿主としたｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。

上記大腸菌ＤＨＩを用いたｃＤＮＡライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、米国、ＨＡＴＦ
フィルター）上に約５　Ｘ　１０’　　ａｌｏｎｅ／フ
ィルターとなるように１０枚まき、このフィルターをマ
スターフィルターとしている各２枚ずつを１組としたレ
プリカフィルター計２０枚を作成した。このレプリカフ
ィルター上の大腸菌を０．５Ｎ　　ＮａＯＨ溶液で溶か
し、露出変性したプラスミドＤ　Ｎ　Ａをフィルター上
に固定した［Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、＆　Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ、Ｄ、　Ｓ、　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７２．
３９６１（１９７５）］。

一方、Ｆ　、　Ｅ　ｓｃｈらにより報告されている［Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　　８２゜６５０７（１９８５）］ウシ塩基性線維芽細
胞成長因子のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎｏ。

１３−２０　（Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｈｉ
ｓ　−ＰｂｅＬ　ｙｓ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｒｏ）およ
びアミノ酸Ｎｏ、８９−９６　（Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ）をもとに、これらのアミノ酸配列に対応する塩
基配列（一部のコドンは３番目の文字、Ａ を任意に固定した。それぞれ５０Ｇ　／Ｇ　ＴＴ　　　
　　　　　　　　　　　　　　ＡＣ／／ＣＴＴ　Ａ／Ｇ
ＡＡ　　／ＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧ、および５′ＴＣ
Ａ／Ｇ　ＡＡ　／ＧＡＡＡ／ＧＡＡ　　／／ＧＣＡ　′
ｒ／ＣＴＣＧＴＣＧＧＴ。

下線を引いた塩基は固定したものを示した。）を化学合
成した。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて５０μ
Ｑの反応液［オリゴヌクレオチド０．１μｇ、５０ａ＋
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８，０゜１０ｍＭ　　
ＭｇＣＬ、　　ｌ　ＯｍＭ　　メルカプトエタノール、
５０μＣｉγ−５″Ｐ　ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌｅ）、３ユニツト　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
］中で３７℃１時間反応させ、オリゴヌクレオチドの５
′末端を３ｔｐで標識した。

上記方法で標識したオリゴヌクレオチドニ種をプローブ
として、別々に、ＤＮＡを固定したレプリカフィルター
に会合させた。会合反応は、１０ＢＣ＋のプローブを含
む５ｘＳＳＰＥ［１８０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　　Ｎ
ａＨｔＰＯ，、ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ７、４）］、
　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　Ｏ、Ｉ％ＳＤＳ。

１００μｇ／ｌＲ１変性サケ精子ＤＮＡ溶液ＩＯ滅中で
、３５℃１６時間行い、反応後フィルターを５ｘＳＳＣ
［０，１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０１５ＭＳ　ｏｄｉｕ
ｓ　　ｃｉｔｒａｔｅｌ　Ｏ、１％ＳＤＳ溶液で室温で
３０分ずつ３回さらに４５℃３０分ずつ２回洗浄した［
’ｌ’、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　　Ｓｐｌｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｐ。

３０９（１９８２）］。

洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、二
種類のプローブの両方に対して反応する菌株を一組２枚
のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重ね合わ
せることにより探した。この方法により５　Ｘ　１０５
ｃｌｏｎｉｅｓより二種類のプローブに対して反応する
１株［Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　Ｋ　ｌ　
２　　ＤＨ１／ｐＴＢ６２７（Ｉ　ＦＯ１／１４９４．
ＦＥｒ（Ｍ　　ＢＰ−１２８０，）コを得た。

（２）、上記（１）で得た菌株［Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｔＫ１２　　ＤＩＩＩ／１）ＴＢ６２７
　　（ＩＦＯ！４４９４．ＦＥＲＭ　　ｒ３Ｐ−１２８
０）］よりプラスミドＤＮＡ（ｐＴＩ３６２７）をアル
カリ法〔ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　ｌ　、　
ｌ　５１３（１９７９））によって抽出精製した。

参考例２　（ヒトｂＦＧＦをコードする遺伝子の大腸菌
における発現） ヒトｂＦＧＦ発現用プラスミドｐＴ３６６９の構築： 前記参考例１（２）で得られたヒトｂＦＧＦｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＴＢ６２７を制限酵素Ａｖａｌおよび
Ｂａ１ｌで切断し、ヒトｂＦＧＦをコードする領域を含
む０．４４Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
のＢａ１ｌ切断部位（平滑末端）に、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼでＢｇｌＩＩリンカ−１）ＣＡＧＡＴＣＴＧを結合さ
せて、０．４４ＫｂのＡｖａ［ＢｇｌＩＩ　　ＤＮＡ断
片を分離した。この０．４４Ｋｂ　　Ａｖａｌ　−Ｂｇ
ｌＩ［ＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを反応させてＢ
ｇｌｌＩ切断部位どうしを結合させたのち、ｄＸＴＰ存
在下にＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ　ｌｅｎｏｗ　　フラグ
メント）反応を行いＡｖａ！切断部位を平滑化した。こ
のＤＮＡ断片に、リン酸化反応後の合成オリゴヌクレオ
チド”ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣ”およ
び”ＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧ”をＴ、ＤＮＡリ
ガーゼにより結合さ仕ＥｃｏＲＩ　−ＢｇｌＩＩで切断
して、約０．４６ＫｂＤＮＡ断片を調製した。一方、ｔ
ｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ７８１（
Ｋｕｒｏｋａｖａ、　Ｔ　、らニュークレイツク・アシ
ッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｊｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ、　）ｌ　Ｉ。

３０７７−３０８５（１９８３））ＤＮＡをＰｓｔｌで
切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応によって平滑化し
た。ＢｇｌＩＩリンカ−ｐＣＡＧＡＴＣＴＧをＴ４ＤＮ
Ａ４ＤＮＡリガーゼって平滑末端に結合させたのちＥｃ
ｏＲＩ　−Ｂｇｌ■で切断して、ｔｒｐプロモーター、
テトラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始
部位を含む約３．２ＫｂＤＮＡ断片を分離した。ヒトｂ
ＦＧｒ；’をコードする遺伝子領域を含む前記０．４６
Ｋｂ　　ＥｃｏＲ１［３ｇ１ＩＩＤＮＡ断片と、この３
．２Ｋｂ　　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼ
り結合さ仕ヒトｂｌ？ＧＦ発現用プラスミドｐＴ１３６
６９を構築した。

このプラスミドｐＴＢ６６９を用いて大腸菌Ｄ　ＨＩを
形質転換させることによりプラスミドｐＴＩ３６６９を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　１ＤＨ
Ｉ／Ｉ）ＴＩ３６６９を得た。

さらに、同様にして、ｐＴＢ６６９を用いて大腸閉　Ｋ
１２　　ＭＭ２９４．あるいはＣ６００を形質転換して
、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　ｌ　
２ＭＭ２９４／Ｉ）ＴＢ６６９（ＩＦＯ１４５３２゜Ｐ
ＥＲＭ　　ＢＰ　−Ｉ　２８１）、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　
　Ｃ６００／ｐＴＢ６６９をそれぞれ得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、それぞれ１％グルコース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／７−チトラサイクリンを
含むＭ９培地で培養し、Ｋｌｅｔｔ値が約２００の時点
で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／滅になる
ように添加し、さらに４時間培養した。

培養後、菌体を集め、ｌ／２０ｍの２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐｌ（７，６，ｌ　０％シュークロース溶液に
懸濁した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフル
オライド（ＰＭＳＰ）を１ｍＭ。

ＥＤＴＡをｌ　ＯｍＭ、ＮａＣｌをＯ，１Ｍ、スペルミ
ジン塩酸塩を１０ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／１ｎ
１（いずれも最終濃度）となるように添加し、０°Ｃ１
４５分放置後、３０秒間超音波処理を加えた。

この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ（サーバル遠心機、５Ｓ
３４０−ター）３０分間遠心して上清を得、菌体抽出液
とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 ヒトｂＦＧＦ活性はＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対する増
殖促進作用により、同じ活性を示す精製ウシ脳ＦＧＦ標
品（宝酒造株式会社製）のＭ量で表わした。

マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地でタンク９６穴マイクロタイクープレート（
平底）に１穴あたり２Ｘ１０３個を０゜２ｄの培地にて
播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

３日間培養したのち０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたり１０
８ｇ添加して、培養し、２０時間後に’ｌ−１−Ｔｄｒ
（５ＣＩ／ｍｍｏｌ、０．５ｍＣ１／ｄ　ＲＣＣＡ　ｍ
ｅｒｓｈａｍ）を各式に２μσずつ加えた。６時間後に
細胞を０，２％トリプシン−０，０２％ＥＤＴＡを含む
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）処理ではがし、タイターチック
セルハーベスタ−を用いて、グラスフィルター上に細胞
を捕集し細胞に取り込まれた３１４−Ｔｄｒ量をシンチ
レーションカウンターにて測定した。同様の操作で重量
既知のウシ脳ＦＧＦ（宝酒造製）活性を測定し、得られ
た検量曲線より、検体中のヒトｂＦＧＦ量を算出した。

結果は第２表に示した。

なお、対照として、プラスミドｐｔｒｐ７８１を用いて
大腸菌ＤＨＩを形質転換させて得られた形質転換体Ｅ、
　ｃｏｌｔ　　ＤＩ−１１／１）ｔｒｐ７８１のヒトｂ
ＦＧＦ産生量を測定した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／　ｐＴＢ６６９　　　　　　
　２　、９５　ｍｇＥ、　　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／　
ｐＴＢ６６９　　　　　　２３　、　Ｉ　　５Ｅ、　　
ｃｏｌｉ　Ｃ６００／ｐＴＢ６６９　　　　　　　　８
　、１５実施例１　（ムティンをコードする塩基配列を
有する組換えＤＮＡの製造） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭ１３ベクターのクロー
ニング： 参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢａｌｌｌｌ−１１で消化させた。ファ
ージベクターＭＩ３ｍｐ８（ジエイ・メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンジ−モロジー
１０１．２０〜７　Ｂ（１９８３））複製型（ＲＦ）Ｄ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ［で消化させ、
予めＥｃｏＲｒ及びＢａｍＬＩＩで消化させてあったｐ
ＴＢ６６９由来のヒトｂＦ’ＧＦ’　　ＤＮＡ断片と混
合した。次に混合物を７４ＤＮＡリガーゼで連結さけ、
連結ＤＮＡを大腸菌−ＪＭＩＱ５菌株の被感染能力のあ
る菌体中へ形質転換させ、Ｘｇａｌを指示柱とするプレ
ート上に播き〔ジエイ・メッシング等、二ニークレイツ
ク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ
ｓ　　Ｒｅｓ、　）　（１９８１）９巻３０９−３２１
頁〕、組換えファージを含有するプラーク（白いプラー
ク）を拾い上げ、組み換え部分の塩基配列をノブオキシ
ヌクレオチド合成鎖停＋ｈ法［Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　
　ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）９　、３０９（１
９８１）］によって決定して、ヒトｂＦＧＦＤＮＡが正
確に挿入されていることを確認した。

このＭ１３−ＰＯクローンから１本鎖ファージＤＮＡを
精製し、合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指
向性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノンン三燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリスＨＣＩ）
ｐＨ８、０，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在下
に、５０μＱ中で合成オリゴヌクレオチド ５’＞ＣＧＴ　　　ＴＣＴ　　　ＴＧＣＴＧＴ　　　　
ＡＧＡＧＣＣＧＣＴ　　＜３’ （Ｃｙｓ２６をＳｅｔに変更するためのプライマー（制
限酵素Ｒｓａｌの認識配列が消失する。）（第２図参照
）〕４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間
処理した。５０ｍＭ　　ＮａＣ１，Ｉ　、Ｏｎ＋Ｍトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０、１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ及び
ＩＯＩＩＩＭ　　β−メルカプトエタノールを含有する
混合物５０μρ中で、このキナーゼ処理されたプライマ
ー（１２ピコモル）を６７℃で５分、及び４２℃で２５
分加熱することによって１本鎖（ＳＳ）Ｍ１３−ＰＯＤ
ＮＡ５μｇに雑種形成させた。

アニーリングした混合物を次に水上で冷却し、０．５ｍ
Ｍ各デオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮ’ｌ’Ｐ）、８
０ｍＭトリスートＩＣｌ５　ｐＨ７，４、８ｍＭＭｇＣ
Ｌ、ｌ　００ｍＭ　　ＮａＣ１，ＤＮＡポリメラーゼＩ
　　Ｋｌｅｎｏｗ断片９Ｆ￥１位、０．５ｍＭ　　ＡＴ
Ｐ及びＴ４ＤＮＡリカーゼ２単位を含有する反応混合物
５０μρに添加し、３７℃で３時間及び２５’Ｃ７−’
２時間反応し、０．２ｍＭ　　ＥＤＴＡ２μ（！を加え
反応を停止した。披感染能力のあるＪＭ１０５細胞の形
質転換に使用し、菌を一夜成育させ、培養基上澄液から
５ｓＤＮＡを単離した。この５ｓＤＮＡをプライマー伸
長の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製された
ＲＦ型ＤＮＡを披感染能力のあるＪＭＩ０５細胞中へ形
質転換させ、寒天プレート上に播き、−夜培養するとフ
ァージプラークが得られた。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、システィン７０を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＡＡＣＧＡＴ　　ＴＡＧ　　ＣＧＣＴＣＡ　　Ｃ
ＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素ＨａｅＵの認識配列が生成される）
（第２図参照） （４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、システィン８８を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＧＴＡ　　ＡＣＡ　　ＧＡＣＴＴＡ　　　ＧＡＡ
　　ＧＣＴ　　ＡＧＴ　　＜３．’ とする。（制限酵素Ａｌｕｌの認識配列が生成される）
（第２図参照） （５）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、システィン９３を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるらので ５’＞ＴＣＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＧＡ
Ｃ’Ｉ”ＣＡ　　ｉ’ｃｃ　　＜３’ とする。（制限酵素１（ｉｎｆｌの認識配列が生成され
る）（第２図参照） （６）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定： 突然変異させたＭ１３−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（１）項）並びに突然変異しないＭ１３−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却
し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロー
ス円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥
フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルタ
ーの場合は１５分重ねて移した。次に０，２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍ）リス−１−Ｉ　Ｃ１，ｐＨ７、５、及び１．
５Ｍ　　ＮａＣｌに浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和
した。フィルター類を同様なやり方で２ｘＳＳＣ（標準
クエン酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し
、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィ
ルター類をフィルター当たり１０滅のＤＮＡ雑種形成緩
衝液（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐ）Ｉ７．０．４Ｘデンハ
ード液（ポリビニルピロリドンフィコール及び牛血清ア
ルブミン、１×＝各０．０２％）、０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
、ｐ）１７．０及び１００μｇ／ｄの、変性サケ精子Ｄ
ＮＡにより、５５℃で４時間、事前雑種形成させた。オ
リゴヌクレオチドプライマーを１０　’ｃｐｍ／！に４
２℃で２４時間装種形成させた。０．１％ＳＤＳと減少
潰のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中でそれぞれ３０分
、５０℃でフィルター類を洗った。フィルター類を、初
めに２ｘＳＳＣを含んだ緩衝液で洗い、突然変異化され
ないＭＩ３−ＰＯプラークを含有する対照フィルターは
ガイガー計数管を用いて放射能の存在について検査した
。５ｓｃｉａ度を段階的に低下さけ、未突然変異Ｍ１３
−ＰＯプラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放
射能が残らなくなるまでフィルター類を洗った。ＳＳＣ
の使用最低濃度は０．Ｉ　Ｘ５ＳＣであった。フィルタ
ーを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日露光してオートラ
ジオグラフをとった。突然変異したＭ［３−Ｐ、Ｏのプ
ラーク１００００個と突然変異されない対照プラーク１
００個をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブ
によってふるい分けた。対照プラークではプローブと雑
種形成したものが全く存在せず、一方突然変異されたＭ
１３ＰＯプラーク３〜ＩＯ個がプローブと雑種を形成し
た。

突然変異Ｍ１３−ＰＯプラークの１個を取り上げ、ＪＭ
１０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ベレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓＤＮＡを
使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣ（Ｃｙｓ２６）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴＣＣＹＳ７０）コ
ドンがＡＧＣ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと、ＴＧ
Ｔ（ＣＦＳ８８）コドンが、ＴＣＴ（Ｓａｒ）コドンへ
変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３）コドンがＴＣＴ
（Ｓｅｒ）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認され
た。

変異したＭＩ３−ＰＯファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６がＳｅｔになったものをＭ１３−ＰＩ。

コドンＣｙｓ−７０がＳｅｔになったものをＭ１３Ｐ２
．コドンＣｙｓ−８８がＳｅｔになったものをＭ１３−
Ｐ３．コドンＣｙｓ−９３がＳｅｔになったものをＭ１
３−Ｐ４とした。

実施例２　（ヒトｂＦＧＩ？’のムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７３９の構築 前記実施例！で得られたＭＩ３−ＰＩのレプリカティブ
フォーム（ｒ（Ｆ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびｐｓｔ
ｔで切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域
を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　（Ｋｕｒｏｋａｗａ、　Ｔ、　　らニュークレ
イツク・アンッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｊｃ　　Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）ＩＩ、　　３０７７−３０８５（
１９８３））ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで切断
して、ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐性遺伝
子およびプラスミド複製開始部位を含む約３．２Ｋｂ　
　ＤＮＡ断片を分ＪｉＩした。ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ’のム
ティンをコードする遺伝子領域を含む前記０，５Ｋｂ　
　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔｌ　　ＤＮＡ断片と、この３．
２Ｋｂ　　ＤＮＡ断片をＴ　４　Ｄ　ＮΔリガーゼ反応
により結合さけヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミ
ドｐＴＢ７３９を構築した（第７図）。

このプラスミドｐＴＢ７３９を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることにより第３図に示すムティンをコード
する遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７３９を含む菌
株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＤＨ１／ｐＴ
Ｂ７３９（ＩＦＯ１４５７５゜ＰＥＲＭ　　ＢＰ−１４
６１）を得た。

（２）　　ＩＡ体体用出液調製 前記形質転換体を、それぞれ１％グルコース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／ｙ４テトラサイクリンを
含むＭ９培地で培養し、Ｋ　Ｉｅｔｔ値が約２００の時
点で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／滅にな
るように添加し、さらに４時間培養した。

培養後、菌体を集め、ｌ／２０量の２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ７，６，１０％シュークロース溶液に懸濁
した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）を１ｍＭ。

ＥＤＴＡを１０ｍＭ、ＮａＣｌを０　、１　Ｍ、スペル
ミジン塩酸塩をｌ０ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／−
（いずれも最終濃度）となるように添加し、０℃。

４５分放置後、３０秒間超音波処理を加えた。

この溶液をＩ　Ｂ　０００ｒｐｍ（サーバル遠心機、５
９３４０−ター）３０分間遠心して上清を得、菌体抽出
液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地でタンク９６穴マイクロタイタープレート（
平底）に１穴あたり２Ｘ１０３個を０．２鑓の培地にて
播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

３日間培養したのち０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたり１０
μａ添加して、培養し、２０時間後ｉ：　３１１−Ｔｄ
ｒ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．５ｍＣ１／ｍ１２　　　Ｒ
ＣＣＡ　ｍｅｒｓｈａｍ）を各式に２μａずつ加えた。

６時間後に細胞を０．２％トリプシン−〇、０２％ＥＤ
ＴＡを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）処理ではがし、タイ
ターチックセルハーベスタ−を用いて、グラスフィルタ
ー上に細胞を捕集し細胞に取り込まれた’Ｈ−’ｒｄｒ
ｆｉをシンチレーションカウンターにて測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ／ｐＴＢ７３９の菌
体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位のＣｙｓがＳｅ
ｒに置換されたムティンＣ３１が得られた。

実施例３　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （＋）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７４２の構築 前記実施例Ｉで得られたＭ１３−Ｐ２のレプリカティブ
フォーム（Ｒ１；”）を制限酵素ＥｃｏＲ［およびＰｓ
ｔｌで切断し、ヒトｂＦ（１；Ｆのムティンをコードす
る領域を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　［で切断して、
ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐性遺伝子およ
びプラスミド複製開始部位を含む約３．２ＫｂＤＮＡ断
片を分離した。ヒトｂＦＧＰのムティンをコードする遺
伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔｌ
　　ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮΔリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦのムティ
ン発現用プラスミドｐＴＢ７４２を構築した（第８図）
。

このプラスミドｐＴＢ７４２を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることにより第４図に示すムティンをコード
する遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７４２を含む菌
株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＤＨＩ／ｐＴ
Ｂ７４２（ｆＦｏ　　１４５８４゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１６４２）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例１（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＣＩ””活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｊ　　Ｄｌｌｌ／ｐＴＢ７４２の
菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦ’の７０位のＣｙｓがＳ
ｅｔに置換されたムティンＣＳ２が得られた。

実施例４　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌におけろ発現） （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
ｎ７４３の構築 前記実施例１で得られたＭｆ３−Ｐ３のレプリカティブ
フォーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ
で切断し、ヒトｂＦＧＦ’のムティンをコードする領域
を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで切断して、
ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐性遺伝子およ
びプラスミド複製開始部位を含む約３．２ＫｂＤＮＡ断
片を分離した。ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔｌ
　　ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦのムティ
ン発現用プラスミドｐＴＢ７４３を構築した（第９図）
。

このプラスミドｐＴＢ７４３を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることにより第５図に示すムティンをコード
する遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７４３を含む菌
株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　１ＤＩ−１１
／Ｉ）’ｒＢ７４３（ＩＦＯ１４５８５゜ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１６４３）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例１（２）と同様の方法で培養
し、上滑を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＤＨ１／ｐＴＢ　７４３
の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの８８位のＣｙｓがＳａ
ｒに置換されたムティンＣ９３が得られた。

実施例５　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７４４の構築 前記実施例！で得られたＭＩ３−Ｐ４のレプリカティブ
フォーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ
で切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域を
含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　ｒで切断して
、ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびプラスミド複製開始部位を含む約３．２ＫｂＤＮＡ
断片を分離した。ヒトｂＦＧＦ’のムティンをコードす
る遺伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏＲ［−Ｐｓｉ
（ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤＮＡ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ反応により結合させヒトｂＦ’ＧＦのムティ
ン発現用プラスミドｐＴＢ７４４を構築した（第１０図
）。

このプラスミドｐＴＢ７４４を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることにより第６図に示すムティンをコード
する遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７４４を含む菌
株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｔ　１ＤＨＩ／ｐ
ＴＩ３７４４（ＩＦＯ１４５８６゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１６４４）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例１（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒ）ｂＦＧＦ’活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＤＨ１／ｐＴＢ　７４４
の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＰの９３位のＣｙｓがＳｅ
ｔに置換されたムティンＣ９４が得られた。

実施例６　（突然変異誘発厚化されたプラークのふるい
分けと同定） 実施例！で得られた突然変異させたＭ２Ｓ−Ｐ２ファー
ジプラークの入ったプレート類並びに実施例！で得られ
た突然変異しないＭＩ３−Ｐ２ファージプラークの入っ
た２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、
第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレー
ト上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて
移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，Ｉ　、５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸した厚
手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍトリス
−）［ＣＩ、ｐＨ７，５、及び１．５Ｍ　　ＮａＣ１に
浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィルター類
を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（［準クエン酸塩）に浸し
たフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で８
０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たり１０ｄのＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５ＸＳＳＣ）、ｐＩ−ｒ７．ｏ、４　Ｘ
デンハード液（ポリビニルピロリドン、フィコール及び
牛血清アルブミン、！×＝各０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ１４７．０及び　１００μｇ
／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間、
事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライマーを
１０５ｃｐｍ／蔵に４２℃で２４時時間様形成させた。

０．１％ＳＯＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝
液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を洗った
。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液で
洗い、突然変異化されないＭＩ３−Ｐ２プラークを含有
する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射能の
存在について検査した。５ｓｃａ度を段階的に低下させ
、未突然変異Ｍ１３−Ｐ２プラークをもつ対照フィルタ
ー上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフィルター
類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．１　ｘＳＳＣ
であった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３
日露光してオートラジオグラフをとった。突然変異した
ＭＩ３−Ｐ２のプラーク１００００個と突然変異されな
い対照プラーク１００個をキナーゼ処理したオリゴヌク
レオチドプローブによってふるい分けた。対照プラーク
ではプローブと雑種形成したものが全くγを在せず、一
方突然変異されたＭＩ３−Ｐ２プラーク３〜ＩＯ個がプ
ローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３〜Ｐ２プラークの１個を取り上げ、ＪＭ
Ｉ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓＤＮＡを
使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣ（ＣｙＳ２Ｂ）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、　Ｔ　ｃ　Ｔ　（Ｃｙ　
５８８）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換された
こと、’Ｉ’ＧＴ（Ｃｙｓ９３）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｔ）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認された。

変異したＭ＋３−Ｐ２ファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６および−７０がＳｅｔになった乙のをＭ１３−ＰＩ
３．コドンＣｙｓ−７０および−８８がＳｅｔになった
ものをＭ１３−Ｐ２３．コドンＣｙｓ７０および−９３
がＳｅｔになったものをＭ１３−Ｐ２４とした。

実施例７　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦ’のムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ７６２の構築 前記実施ρｊ６で得られたＭ１３−Ｐ２３のレプリカテ
ィブフォーム（１’ｌＦ’）を、実施例２（１）と同様
に処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
Ｔ８７６２を構築した（第１２図）。

このプラスミドｐＴＢ７６２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第１１図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７６２を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ弦旦　ＭＭ２９４／
ｐＴＩ’３７６２（ＩＦＯ１４６１３、Ｆ’ＥＲＭ　　
ＢＰ−１６４５）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ　７
６２の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位および８８位の
ＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣＳ２３が得られ
た。

実施例８　（突然変異誘発厚化されたプラークのふるい
分けと同定） 実施例７で得られた突然変異させたＭＩ３−Ｐ２３ファ
ージプラークの入ったプレート類並びに実施例７で得ら
れた突然変異しないＭ１３−Ｐ２３ファージプラークの
入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートから
のプラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター上
へ、第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プ
レート上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重
ねて移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，Ｉ　、５ＭＮ
ａＣｌ及び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸した厚
手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍ）リス
−ＭＣＩ、ｐＨ７，５、及び１．５ＭＮａＣｌ１こ浸し
たろ紙上へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター
類をフィルター当たり１０滅のＤＮＡ雑種形成緩衝液（
５Ｘ　Ｓ　Ｓ　ｃ）、ｐｔ−ｒ　７．０　。

４×デンハード液（ポリビニルピロリドン、フィコール
及び牛血清アルブミン、■×＝各０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、１）Ｉ−１７，０及び１００μ
ｇ／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間
、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライマー
を１０　’ｃｐｍ／ａＪ！に４２℃で２４時間装種形成
させた。０．１％ＳＤＳと減少債のＳＳＣを含有する洗
浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類
を洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ
緩衝液で洗い、突然変異化されないＭ　Ｉ　３−　Ｐ　
２３プラークを含有する対照フィルターはガイガー計数
管を用いて放射能の存在について検査した。５ＳＣａ度
を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−Ｐ２３プラー
クをらつ対照フィルター上に検出可能な放射能が残らな
くなるまでフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃
度は０．１　Ｘ５ＳＣであった。フィルターを空気乾燥
し、−７０°Ｃで２〜３日露光してオートラジオグラフ
をとった。突然変異したＭ１３Ｐ２３のプラーク１００
００個と突然変異されない対照プラーク１００個をキナ
ーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによってふる
い分けた。

対照プラークではプローブと雑種形成したものが全く存
在せず、一方突然変異されたＭｌ　１−Ｐ２３プラーク
３〜１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異ＭＩ３−Ｐ２３プラークの１１を取り、４二げ
、ＪＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡ
をつくり、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつ
くった。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと５ｓＤ
ＮＡを使用して塩基配列を解析した。

ソノ結果、ＴＧＣ（Ｃｙｓ２６）：］トンがＴ　ＣＴ（
Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３
）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたことが
それぞれ確認された。

変異したＭｌ３−Ｐ２３ファージのうち、コドンＣｙｓ
−２６，−７０および−８８がＳｅｔになったものをＭ
ｌ３−ＰＩ２３．コドンＣｙｓ−７０゜８８および−９
３がＳｅｔになったものをＭＩ３Ｐ２３４とした。

実施例９　（ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦ’のムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ７６４の構築 前記実施例８で得られたＭｌ３−ＰＩ２３のレプリカテ
ィブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に処理
し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ７
６４を構築した（第１４図）。

このプラスミドｐＴ８７６４を用いて大腸菌ＭＭ２’９
４を形質転換させることにより第１３図に示すムティン
をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴ８７６４
を含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２
９４／ｐＴＢ７６４（ＩＰＯ１４６１４、ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１６４６）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６４
の菌体抽出液は、ＰＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位、７０位および
８８位ののＣｙｓがＳｅｒに置換されたムティンＣ９Ｉ
２３が得られた。

実施例１０　　（突然変異誘発厚化されたブラークのふ
るい分けと同定） 実施例８で得られた突然変異させたＭＩＩＰ１２３ファ
ージプラークの入ったプレート類並びに実施例８で得ら
れた突然変異しないＭ１３−Ｐ１２３ファーノブラーク
の入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートか
らのプラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター
上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天
プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分
重ねて移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　
　ＮａＣ＋及び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸し
た厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍ）
リス−ＨＣｌ、ｌ）！−（７，５、及び１．５ＭＮａＣ
１に浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィルタ
ー類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（ｆｉ準ツクエン酸塩
に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉
内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター類をフ
ィルター当たり１０ｄのＤＮＡ雑種形成緩衝液（５ｘＳ
ＳＣ）、ｐＨ７，０゜４×デンハード液（ポリビニルピ
ロリドン、フィコール及び牛血清アルブミン、ｌ×＝各
０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、０及び　１００μｇ／
−の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５°Ｃで４時間、
事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライマーを
Ｉ　Ｏ’ｃｐｓ／滅に４２℃で２４時間装種形成させた
。Ｏ，１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄用緩
衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を洗っ
た。フィルター類を、初めに２ｘＳＳＣを含んだ４１街
液で洗い、突然変異化されないＭ１３−Ｐ１２３プラー
クを含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて
放射能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度を段階的に
低下させ、未突然変異ＭＩＩＰＩ２３プラークを６つ対
照フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまで
フィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．１
ＸＳＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃
で２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。突然
変異したＭ１３−ＰＩ２３のプラーク１００００個と突
然変異されない対照プラーク＋００ｐ１をキナーゼ処理
したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい分けた
。対照プラークではプローブと雑種形成したものが全く
存在せず、一方突然変異されたＭ＋３−Ｐ１２３プラー
ク３〜１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−Ｐ１２３プラークの１個を取り上げ、
ＪＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡを
つくり、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつく
った。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと５ｓＤＮ
Ａを使用して塩基配列を解析した。

その結果、Ｔ　Ｇ　Ｔ　（Ｃｙｓ９３　）：ｌトンがＴ
　Ｃ’ｒ　（Ｓ　ｅｔ）コドンへ変換されたことがそれ
ぞれ確認された。

変異したＭ１３−Ｐ１２３ファージのうち、コドンＣｙ
ｓ−２６，−７０，−８８および−９３がＳｅｒになっ
たものをＭ１３−ＰＩ２３４とした。

実施例ＩＩ　　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｉ’３７６５の構築 前記実施例１０で得られたＭ１３−Ｐ１２３４のレプリ
カティブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７６５を構築した（第１６図）。

このプラスミドｐＴＢ７６５を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第１５図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７６５を
含む菌株Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ１ｉＭＭ２９４
／ｐＴＢ７６５（ＩＦＯ１４６１５、ＦＥＲＭ　　ＨＰ
−１６４７）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６
５の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＰＧＰの２６位、７０位。

８８位および９３位のＣｙｓがＳｅｔに置換されたムテ
ィンＣ５Ｉ２３４が得られた。

実施例１２　　（突然変異誘発原化されたプラークのふ
るい分けと同定） 実施例１の方法で、合成オリゴマー〔第２図（３）ない
しく４）〕を用いて突然変異させたＭＩ３ｐｔファージ
プラークの入ったプレート類並びに実施例１で得られた
突然変異しないＭＩ３−Ｐｌファージプラークの入った
２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプラ
ークを２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、第
一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレート
上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて移
した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，１，５ＭＮａＣ１及
び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸した厚手のろ紙
上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍトリス−ｙ（Ｃ
１，ｐＨ７，５、及び１．５ＭＮａＣｌに浸したろ紙上
へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ｘＳＳＣ（標準クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター
類をフィルター当たり！０成のＤＮＡ雑種形成緩衝液（
５ＸＳＳＣ）、ｐＨ７，０゜４×デンハード液（ポリビ
ニルピロリドン、フィコール及び牛血清アルブミン、■
×＝各０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び　１００μｇ／
　ｒｔ＆の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時
間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライマ
ーをＩ　０５ｃｐｓ／蔵に４２℃で２４時間装種形成さ
せた。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄
用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を
洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩
衝液で洗い、突然変異化されないＭ１３−ＰＩプラーク
を含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放
射能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度を段階的に低
下させ、未突然変異Ｍ１３−ＰＩプラークをもつ対照フ
ィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフィ
ルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．ｌＸ５
ＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２
〜３日露光してオートラジオグラフをとった。突然変異
したＭ１３Ｐ！のプラーク１００００１１１と突然変異
されない対照プラーク１００個をγ−３″Ｐ−ＡＴＰ存
在下でキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブに
よってふるい分けた。対照プラークではプローブと雑種
形成したものが全く存在せず、一方突然変異されたＭ１
３−ＰＩプラーク３〜！０個がプローブと雑種を形成し
た。

突然変異Ｍｌ　３−Ｐ　Ｉプラークの１個を取り上げ、
ＪＭ１０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡを
つくり、菌体ペレットから２本ｔａ　（ｄｓ）ＤＮＡを
つくった。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓ
ＤＮＡを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＴ（Ｃｙｓ　　８８）コドンがＴＣＴ（
Ｓｅｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３
）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたことが
それぞれ確認された。

変異したＭｌｌ−ＰＩファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６および−８８がＳｅｔになったものをＭ１３１’１
３．コドンＣｙｓ−２６および−９３がＳｅｒになった
らのをＭ１３−ＰＩ３とした。

実施例１３　（突然変異誘発原化されたプラークのふる
い分けと同定） 実施例！の方法で、合成オリゴマー〔第２図（２）ある
いは（３）〕を用いて突然変異させたＭ＋３−ＰＩ４フ
ァージプラークの入ったプレート類並びに実施例１２で
得られた突然変異しないＭＩ３Ｐ１４ファージプラーク
の入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートか
らのプラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター
上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天
プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分
重ねて移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐ）［７，５、及び１．５Ｍ
　　ＮａＣ１に浸１．たろ紙上へ更に５分重ねて中和し
た。フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標章ク
エン酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、
真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥さけた。重複フィル
ター類をフィルター当たり１０ｄのＤＮＡ雑種形成緩衝
液（５Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐＨ７，０，４ｘデンハード
ｔＬ（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、１×−各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び１００μｇ
／−の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間、
事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライマーを
１０５ｃｐｍ／ｚｎｌに４２℃で２４時間雑種形成させ
た。０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓと減少量のＳＳＣを含有する洗
浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類
を洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ
緩衝液で洗い、突然変異化されないＭ１３−ｐＨ４プラ
ークを含有する対照フィルターはガイガー計数管を用い
て放射能の存在について検査した。５ＳＣａ度を段階的
に低下させ、未突然変異ＭＩ３−ＰＩ４プラークをもつ
対照フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるま
でフィルター類を洗った。

ＳＳＣの使用最低濃度は０，１ｘＳＳＣであった。

フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日露光して
オートラジオグラフをとった。突然変異したＭ１３−ｐ
Ｈ４のプラーク１００００個と突然変異されない対照プ
ラーク１００個をγ−３１Ｐ−Ａ　Ｔ　Ｐ存在下でキナ
ーゼ処理したオリゴヌクレオヂドブローブによってふる
い分けた。対照プラークではプローブと雑種形成したも
のが全く存在せず、一方突然変異されたＭ１３−ＰＩ４
プラーク３〜ＩＯ個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ＋３−ＰＩ４プラークの！個を取り上げ、Ｊ
ＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつ
くり、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくっ
た。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓＤＮＡ
を使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＴ（Ｃｙｓ７０）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３）コ
ドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたことがそれ
ぞれ確認された。

変異したＭ１３−Ｐ１４ファージのうち、コドンＣｙｓ
−２６，−７０および−９３がＳｅｒになったものをＭ
１３−Ｐ１２４．コドンＣｙｓ−２６゜８８および−９
３がＳｅｔになったものをＭＩ３−Ｐ１３４とした。

実施例１４　（突然変異誘発厚化されたプラークのふる
い分けと同定） 実施例１の方法で、合成オリゴマー（第２図（４））を
用いて突然変異させたＭ＋３−Ｐ３ファージプラークの
入ったプレート類並びに実施例１で得られた突然変異し
ないＭＩ３−Ｐ３ファージプラークの入った２枚のプレ
ートを４℃に冷却し、各プレートからのプラークを２枚
のニトロセルロース円形フィルター上へ、第一フィルタ
ーの場合には乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分重
ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて移した。次に
０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　　ＮａＣｌ及び０．
２％トリトンＸ−１００に５分浸した厚手のろ紙上へフ
ィルター類を置き、次に０　、５　Ｍ　トリス−ＨＣＩ
、ｐｉ−１７、５、及び１．５Ｍ　　ＮａＣｌに浸した
ろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィルター類を同様
なやり方で２ＸＳＳＣ（標帛クエン酸塩）に浸したフィ
ルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で
２時間乾燥させた。重複フィルター類をフィルター当た
り１０ｄのＤＮＡ雑種形成緩衝液（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）
、ｐｌ−１７，０，４ｘデンハード液（ポリビニルピロ
リドン、フィコール及び牛血清アルブミン、＋×＝各０
．０２％）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐｔ−ｔ７．ｏ及
び　１００μｇ／成の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５
５℃で４時間、事前雑種形成さ仕た。オリゴヌクレオチ
ドブライマーを１０５ｃｐｍ／ｄに４２℃で２４時間雑
種形成させた。

０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝
液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を洗った
。フィルター類を、初めに２ｘＳＳＣを含んだ緩衝液で
洗い、突然変異化されないＭ１３−Ｐ３プラークを含有
する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射能の
存在について検査した。５ｓｃｉａ度を段階的に低下さ
せ、未突然変異Ｍ１３−Ｐ３プラークをもつ対照フィル
ター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフィルタ
ー類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０，１ｘｓｓｃ
であった。フィルターを空気乾燥し、７０℃で２〜３日
露光してオートラジオグラフをとった。突然変異したＭ
ｌｌ−Ｐ３のプラークｔｏｏｏｏ個と突然変異されない
対照プラーク１００個をγ−３ＭＰ−ＡＴＰ存在下でキ
ナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによってふ
るい分けた。対照プラークではプローブと雑種形成した
ものが全く存在せず、一方突然変異されたＭ１３−Ｐ３
プラーク３〜ＩＯ個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−Ｐ３プラークの１個を取り上げ、ＪＭ
１０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ペレットから２本鎖　（ｄｓ）ＤＮＡをつくっ
た。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと５ｓＤＮＡ
を使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧ’ｒ（Ｃｙｓ９３）］トンがＴＣＴ（Ｓ
　ｅｔ）コドンへ変換されたことが確認された。

変異したＭＩ３−Ｐ３ファージのうち、コドンＣｙｓ−
８８および−９３かＳｅｔになったものをＭＩ３−Ｐ３
４とした。

実施例１５　（ヒトｂＦｃ；Ｆのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦ’のムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ７７６の構築 前記実施例６で得られたＭＩ３−ＰＩ２のレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に処理し
、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ８７７
６を構築した（第１８図）。

このプラスミドｐＴ８７７６を用いて大腸菌ＭＩＶｆ２
９４を形質転換させることにより第１７図に示すムティ
ンをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７７
６を含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ
２９４／ｐＴＢ　７７６を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＣＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７７
６の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位、７０位。

のＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣ９Ｉ　２が得
られた。

実施例！６　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのムティン発現用プラスミド
ｐＴ８７７８の構築 前記実施例６で得られたＭ１３−Ｐ２４のレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ’）を、実施例２（Ｉ）と同様に処理
し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＩ３
７７８を構築した（第２０図）。

このプラスミドＩ）ＴＢ７７８を用いて大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換させることにより第１９図に示すムティン
をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴｎ７７８
を含む菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴ＋３７７８を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液と１．た。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７７８
の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位および９３位の
Ｃｙｓ＃＜　Ｓ　ｅｒに置換されたムティンＣＳ２４が
得られた。

実施例！７　　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂｒ；’ｃｒ’のムティン発現用プラス
ミドｐＴＢ７７９の構築 前記実施例１２で得られたＭ２Ｓ−ＰＩ３のレプリカテ
ィブフォーム（ＲＦ’）を、実施例２（１）と同様に処
理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７７９を構築した（第２２図）。

このプラスミドｐＴＩ３７７９を用いて大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換させることにより第２１図に示すムティン
をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７７９
を含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２
９４　／ｐＴＢ　７７９を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦ’ＧＦ活性上記（２）で得
られた菌体抽出液につき、実施例２（３）と同様の方法
でヒトｂＰ　Ｇ　Ｆ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７７
９の菌体抽出液は、ＰＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位および８８位の
ＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣ８■３が得られ
た。

実施例１８　　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （り　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ′
ｒｒ＞７６３の構築 前記実施例１２で得られたＭ２Ｓ−ＰＩ３のレプリカテ
ィブフォーム（ＩＮＦ）を、実施例２（Ｉ）と同様に処
理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７６３を構築した（第２４図）。

このプラスミドｐＴ８７６３を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第２３図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７６３を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｊａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ　７６３を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＰ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏＬｉ　　ＭＭ２９４　／ｐＴＢ７
６３の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位および９３位の
ＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣ５Ｉ４が得られ
た。

実施例！９　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７７７の構築 前記実施例１４で得られたＭ＋３−Ｐ３４のレプリカテ
ィブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（Ｉ）と同様に処理
し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ７
７７を構築した（第２６図）。

このプラスミドｐＴＢ７７７を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第２５図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７７７を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ　７７７を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 」二足（２）で得られた菌体抽出液Ｉこつき、実施例２
（３）と同様の方法でヒトｂＦ’ＣＩ？活性を測定した
。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７７７
の菌体抽出液は、Ｉ”　ＣＩ？活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦ’ＧＦの８８位および９３位
のＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣ９３４が得ら
れた。

実施例２０　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのムティン発現用プラスミド
ｐｉ’［３７８２の構築 前記実施例８で得られたＭ２Ｓ−Ｐ２３４のレプリカテ
ィブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に処理
し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用ブラスミドｐＴＢ７
８２を構築した（第２８図）。

このプラスミドｐＴＢ７８２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第２７図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴ８７８２を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｂｉａｃｏｌｔ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ７８２を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７８
２の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位、８８位および
９３位のＣｙｓがＳｅｒに置換されたムティンＣＳ２３
４が得られた。

実施例２１　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
Ｔｎ７８０の構築 前記実施例１３で得られたＭｌ　３−Ｐ　１２４のレプ
リカティブフォーム（ＲＩ？’）を、実施例２（１）と
同様に処理し、ヒトｂＦ’ＧＦのムティン発現用プラス
ミドｐＴＢ７８０を構築した（第３０図）。

このプラスミドｐＴＢ７８０を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第２９図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐ’Ｉ’ｒ３７
８０を含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ｍ
Ｍ２９４／ｐＴＢ７８０を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７８
０の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位、７０位および
９３位のＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣ３１２
４が得られた。

実施例２２　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７８１の構築 前記実施例１３で得られたＭｌ３−Ｐ１３４のレプリカ
ティブフォーム（ｒ（Ｆ）を、実施例２（１）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
８７８１を構築した（第３１図）。

このプラスミドｐＴＢ７８１を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第３２図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴ８７８１を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｊａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ　７８１を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／＋）ＴＢ７
８１の菌体抽出液は、Ｆ’ＣＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位、８８位および
９３位のＣｙｓｈ＜　Ｓ　ｅｔに置換されたムティンＣ
５Ｉ３４が得られた。

実施例２３　（ムティンの産生量） それぞれのムティンを含む菌体抽出液のＦ’ＧＦ活性を
参考例２（２）の方法に従って測定し各形質転換体にお
ける産生量を算出した。これらの値を第３表に示す。

第３表 産生遣 ｐＴＢ７４２　　　　　ＣＳ　２　　　　　　　　１０
．ＧｐＴＢ７４３　　　　ＣＳ３　　　　　　　　　Ｌ
３．３ｐＴＢ７４４　　　　　ＣＳ４　　　　　　　　
　０，８ｐＴ　Ｂ　７７６　　　　ＣＳ　１２　　　　
　　　　０　、２ｐＴＢ７７９　　　　　Ｃ５１３０，
ｉｐ’ｒＢ７６３　　　　Ｃ５Ｉ４　　　　　　　　０
．５ｐＴＢ７６２　　　　　ＣＳ２３　　　　　　　２
５．８ｐＴ　Ｂ　７７８　　　　　ＣＳ　２４　　　　
　　　　　０　、３ｐ’ｒＢ７７７　　　　　Ｃ５３４
０，５ｐＴ　Ｂ　７６４　　　　　ＣＳ　１２３　　　
　　　　　０　、３ｐＴ　Ｂ　７８０　　　　　ＣＳ　
１２４　　　　　　　　０　、４ｐＴ　Ｂ　７８１　　
　　　ＣＳ　１３４　　　　　　　　０　、２ｐＴＢ７
８２　　　　　ＣＳ２３４　　　　　　　　　１．４ｐ
Ｔ　Ｉ３７６５　　　　　ＣＳ　１２３４　　　　　　
　　０　、１ｐＴＢ６６９　　　　　ｒｈｂＦＧＰ　　
　　　　　　６．ＯｐＬｒｐ７ｇ１　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０実施例２４　　（ｈｂＦＧＦム
ティンの精製）参考例２で記した方法により、それぞれ
のムティンを産生ずる形質転換体を培養し、菌体抽出液
を調製した。この抽出液２５蔵（培養液５００１ｎＩｌ
より調製）を２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐｌ−
１７，４゜０．２ＭＮａＣ１溶液で平衡化したＤＥＡＥ
セルロース（ＤＥ５２．ワットマン社、英国）カラム（
径２ｘｌｏｃｍ）に通し、抽出液中の核酸成分を除去し
た。カラムからの素通り液および２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
ＨＣＩ、ｐＨ７，４，０，２Ｍ　ＮａＣ！溶液でのカラ
ム洗液を合わせて集めた（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ素通り画分ｅ
ｏ〃ａ）。

この両分をヘパリンカラムＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−
ｐａｋＨＲ−８９４（８ｍｍｌ　Ｄｘ　５ｃｍ、昭和電
工製）を装備した高速液体クロマトグラフィー装置（ギ
ルソン社、フランス）にかけた。カラムを、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐｒ１７．４溶液１次いで２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＩ−１７，４，０，５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１溶液で洗った後、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１
ｐＨ７，４、バッファー中、０．５Ｍから２ＭのＮａＣ
１の直線勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　　ｇｒａｄｉｅｎｔ
　　ｅｌｕｔｉｏｎ、　６０ｄ、流速＋　、　Ｏｄ／ｍ
１ｎ）を行った。

それぞれのムティンの溶出パターンを第３３図〜３５図
に示す。これらにおいて、縦軸は０Ｄ１１１゜の吸収値
、およびグラジェント中のＮａＣ１ａ度を示している。

横軸は時間を示しており、ｔ　ｉｍｅ　Ｏでグラジェン
ト溶出を開始した。ピーク画分を分取し、そのＦＧＦ活
性を検討した。これら精製後の比活性を第４表に示す。

第４表 比活性 ＣＳ　Ｉ Ｓ２ Ｓ３ Ｓ４ Ｓ１２ Ｓ１３ 　Ｓ　１４ Ｓ２３ Ｓ２４ 　Ｓ　３４ ＣＳ　１２３ ＣＳ　１２４ ＣＳ　１３４ ＣＳ　２３４ ＣＳ　１２３４ ０．４ Ｏ ！　０ ０．５ ０．５ ０．３ １、＋ ０．４ ０．１ ０．９ ０．１ 第４表において、比活性は宝酒造株式会社製の牛脳由来
Ｆ’ＧＴ；’（純度９５％以上）のＦ’ＣＦ’活性を基
学とした。

ｂＦＧＦ’のピーク１に相当するピークはすべてのムテ
ィンで溶出時間１５〜２５分の間に溶出された。これは
１７．２５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分子量的１７０００の位置に単一のバンドとして確認す
ることもできる。

実施例２５　　（ＦＧＦムティンの酸化）ヘパリンＨＰ
　Ｌ　Ｃカラムより溶出されたムティンおよびｂＦＧＦ
をｌ０００倍の体積の蒸留水に対して３時間ずつ２回、
４℃で透析し、さらに凍結乾燥した。乾燥標品２００μ
ｇ（蛋白量）を２００μＱの酸化反応液（５０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）１０．２Ｍ　ＮａＣ１
溶液ｍｇ／ｄＨ８Ａ／２０　ｍＭ　ｔ−ｔ　ｔｏ　ｔ　
）に溶かし、３７℃で３０分間酸化した。

この溶液をヘパリンＨＰ　Ｌ　Ｃカラムにかけて塩濃度
０．６〜２Ｍの勾配で溶出されるパターンを調べた結果
、第３６図に示すようになった。ｂＦＧＦはピークが全
体的に低くなるのに対し、Ｃ８２，Ｃ９３，ＣＳ２３で
はピークＩに相当するピークが高く、とくにＣＳ３．Ｃ
８２３では顕著である。

これはＣＳ３．Ｃ９２３が酸化に対して安定であること
を示唆する。またＣＳ２．Ｃ９３，Ｃ８２３のいずれも
ピークに溶出されたタンパクはＦＧＦ活性を示した。

実施例２６　（ＦＧＦムティンの還元）実施例２５と同
様にして得られた凍結乾燥標品２００μｇ（蛋白量）を
２００μｇの還元反応液〔５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（１）Ｈ８，５）１０．２ＭＮａＣ１ｌ＋＋＋ｇ／威
ＢＳＡ／２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））に溶
かし、３７℃で３０分間還元した。

この溶液をヘパリンＨＰ　Ｌ　Ｃカラムにかけて塩農度
０．６〜２Ｍの勾配で溶出されるパターンを調べた結果
、第３７図に示すようになった。

ｂＦ’ＧＦ、Ｃ９２はピークＩに相当するピークが顕著
になり、他のピーク（ピーク■−■）は酸化による乙の
であることが示唆された。さらにＣＳ３゜Ｃ９２３にお
いてはピークが酸化による影響を呈していないことが示
唆された。すなわち実施例２５に示される安定性を支持
するものである。なお、このピークに溶出されるｂｌ；
’Ｇｌ？’およびムティンはＦＧＦ’活性が確認されて
いる。

実施例２７　（ムティンをコードする塩基配列を有する
組換えＤＮＡの製？１） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭ１３ベクターのクロー
ニング： 参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９を制限酵素
Ｅｃｏ１１［及びＢａＩＩＩＨＩで消化させた。ファー
ジベクターＭＩ３ｍｐ８（ジェイ・メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンジ−モロジー
１０１．２０〜７８（１９８３））複製型（ＲＦ）ＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｒで消化させ、予
めＥｃｏＲｒ及びＢａｍ１−１１で消化させてあったｐ
Ｔ８６６９由来のヒトｂＦＧＰ　　ＤＮＡ断片と混合し
た。次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、連結
ＤＮＡを大腸菌−ＪＭ１０５菌株の披感染能力のある菌
体中へ形質転換させ、ｘｇａ＋を指示秤とするプレート
上に播き〔ジェイ・メッシング等、ニュークレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、　）　（ｌ　９８１　）９巻３０９−３２１
頁〕、組換えファージを含有するプラーク（白いプラー
ク）を拾い上げ、組み換え部分の塩基配列をジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　　
ら、ヌクレイツク・アシッズ。

リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、
　）９　、３０９（１９８１））によって決定して、ヒ
トｂＦＧＦＤＮＡが正確に挿入されていることを確認し
た。

このＭＩ３−ＰＯクローンから１本鎖ファージＤＮＡを
精製し合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指向
性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノシン酸燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリスＨＣ１）
ｐＨ８、０，１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在下
に、５０μρ中で合成オリゴヌクレオチ５’−ＣＧＧＧ
ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＴ３′ 〔塩基配列中に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を生成し
、さらにＰｒｏ１４をＭｅｔに変更するだめのブライマ
ー（第３８図（２）参照）〕 ４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間処理
した。５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１．０ｍＭトリス１−［
Ｃ１％Ｉ）Ｈ８，０、Ｉ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＩｔ及びｌ
０ｍＭ　　β−メルカプトエタノールを含有する混合物
５０μσ中で、このキナーゼ処理されたプライマー（１
２ピコモル）を６７℃で５分、及び４２°Ｃで２５分加
熱することによって１本鎖（ｓｓ）Ｍ　１３ＰＯＤＮＡ
５μｇに雑種形成させた。アニリングした混合物を次に
水上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三燐
酸（ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−ＨＣｌ％　Ｉ）Ｈ７
，４，８ｍＭ　　ＭｇＣＬ、＋　００ｍＭ　　ＮａＣ１
１ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｃｎｏｗ断片９単位、０．
５ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ　４ＤＮＡリ力−ゼ２単位を含
有する反応混合物５０μσに添加し、３７℃で３時間及
び２５℃で２時間反応し、０．２ｍＭ　　ＥＤＴＡ２μ
１２を加え反応を停止した。被感染能力のあるＪＭ１０
５細胞の形質転換に使用し、菌を一夜成育させ、培養基
上澄液から５ｓＤＮＡを単離した。この５ｓＤＮＡをプ
ライマー伸長の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル
精製されたＲＦ型ＤＮＡを被感染能力のあるＪＭＩ０５
細胞中へ形質転換させ、寒天プレート上に播き、−夜培
養するとファージプラークが得られた。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素Ｎ
ｃｏｌの認識部位を生成し、同時にＧＩｙ９をＴｈｒに
、５ｅｔ１０をＭｅｔに変更するもので、 ５’−ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣ３′ とする。（第３８図（１）参照） （４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素／
ＭＩＵの認識部位を生成し、同時にＬｙｓ８７をコード
するコドンを停止コドンに変更するもので ５　’−Ｔ　Ａ　Ａ　ＣＡ　ＣＣ’ｒ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ
　Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｇ−３′ とする。（第３８図（３）参照） （５）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素Ｈ
ｐａｌの認識部位を生成し、同時にＡｓｐ４２をＡｓｎ
に変更するもので ５’−ＣＣＧＧＡＣＴＣＣＧＴＴＡＡＣＴＣＧＧ３′ とする。（第３８図（４）参照） （６）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中の制限酵素Ｈ
ｐａｌＩの認識部位を消失させ、同時にＡｒｇ４５をＧ
ｉｎに変更するもので ５’−ＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧ’ｒＣＡＡ（
、−３’ とする。（第３８図（５）参照） （７゛）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分け
と同定： 突然変異させたＭ２Ｓ−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（＋）項）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却
し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロー
ス円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥
フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルタ
ーの場合は１５分重ねて移した。次に０．２Ｎ　　Ｎａ
０ｒ−Ｉ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍ）リス−ＨＣ１，ｐＨ７、５、及び１．５Ｍ　
　ＮａＣ１に浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター
類をフィルター当たり１０１４のＤＮＡ雑種形成緩衝液
（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐＨ７，０，４Ｘデンハード液
（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、■×＝各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏＳ）。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、０及び１００
μｇ／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時
間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライマ
ーをＩ　０５ｃｐｍ／滅に４２℃で２４時時間積形成さ
せた。０．Ｉ％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄
用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を
洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩
衝液で洗い、突然変異化されないＭ２Ｓ−ＰＯプラーク
を含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放
射能の存在について検査した。５ｓｃａ度を段階的に低
下させ、未突然変異ＭＩ３−ＰＯプラークをらつ対照フ
ィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフィ
ルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．１　ｘ
ＳＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で
２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。突然変
異したＭｌ３−ＰＯのプラークｔｏｏｏｏ個と突然変異
されない対照プラーク１００個を３２Ｐ−γ−ＡＴＰで
キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによって
ふるい分けた。対照プラークではプローブと雑種形成し
たものが全く存在せず、一方突然変異されたＭｌ３−Ｐ
Ｏプラーク３〜１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−ＰＯプラークの１個を取り上げ、ＪＭ
Ｉ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮΔをつく
り、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当なオリゴヌクレオチドブライマーとｓｓＤ　Ｎ　
Ａを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＧＧＣ（Ｇｌｙ−９）コドンがＡＣＣ（Ｔ　
ｈｒ）　コドンに変換されしかもＡＧＣ（Ｓｅｒｆ　Ｏ
）コドンがＡ　Ｔ　ｃ　（Ｍｅｔ）コドンへ変換された
こと；ＣＣＧ（Ｐｒｏ１４）コドンがＡ　Ｔ　Ｇ　（Ｍ
ｅｔ）コドンへ変換されたこと；　ＡＡＡ（Ｌｙｓ８７
）コドンがＴＡΔ（停止）コドンへ変換されたこと；　
ＧＡＣ（ＡＳｐ４２）コドンがＡＡＣ（Ａｓｎ４２）コ
ドンへ変換されたこと；　ＣＧＧ（Ａｒｇ４５）コドン
がＣＡＧ（Ｇｌｎ４５）コドンへ変換されたことがそれ
ぞれ確認された。

変異したＭｌ　３−ＰＯファージのうち、コドンＧｌｙ
−９がＴｈｒになりしかもコドン５ｅｒ１０がＭｅｔに
なったものをＭｌ３−ＰＮＩＯ（その塩基配列とこれが
コードするアミノ酸配列を第３９図に示す。）と、 コドンＰｒｏ１４がＭｅｔになったものをＭｌ３−ＰＮ
Ｉ４（その塩基配列とこれがコードするアミノ酸配列を
第４０図に示す。〕と、 コドンＬｙｓ８７が停止コドンになった乙のをＭｌ３−
ＰＣ８６（その塩基配列とこれがコードするアミノ酸配
列を第４１図に示す。〕と、コドンＡｓｐ４２がＡｓｎ
になったものをＭｌ３−ＰＤＮ４２　［その塩基配列と
これがコードするアミノ酸配列を第４２図に示す。］と
、 コドンＡｒｇ４５がＧｌｎになったものをＭｌ３−ＰＲ
Ｑ４５（その塩基配列とこれがコードするアミノ酸配列
を第４３図に示す。〕とそれぞれ称することとした。

実施例２８　（ムティンをコードする塩基配列を有する
組換えＤＮＡの製造） （１）　　サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノシン酸燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣＩ
）ｐＨ８，０，１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ、５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在下
に、５０μρ中で合成オリゴヌクレオチド ５’−ＣＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＧＧ＝　３
′ 〔塩基配列中の制限酵素Ｈｐａｌの認識部位を消失させ
、さらにＡｓｎ４２をＡｒｇに変更するためのブライマ
ー（第３８図（６）参照）〕 ４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間処理
した。５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１，０ｍＭトリス−■Ｉ
　ＣＩ、Ｉ）Ｉ−１８，０、ｌ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＩｔ
及び　１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノールを含有す
る混合物５０μρ中で、このキナーゼ処理されたブライ
マー（１２ピコモル）を６７℃で５分、及び４２°Ｃで
２５分加熱することによって１本鎖（ｓｓ）Ｍ　３ＰＤ
Ｎ４２　　ＤＮＡ５μｇに雑種形成させた。アニーリン
グした混合物を次に水上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキ
シヌクレオヂド三燐酸（ｄＮＴＰ）、８０ｍｔｖＮ−リ
ス−ＨＣｌ、　　ｐｉ（７，４、８ｍＭＭｇＣＩｔ、ｌ
００ｍＭ　　ＮａＣｌ、　ＤＮＡポリメラーゼｌ　　Ｋ
　ｌｅｎｏｗ断片９単位、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリカーゼ２単位を含有する反応混合物５０μｇ
に添加し、３７℃で３時間及び２５℃で２時間反応し、
０．２ｍＭ　　ＥＤ’ｒＡ２μ（を加え反応を停止した
。披感染能力のあるＪＭ１０５細胞の形質転換に使用し
、菌を一夜成育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮＡを単
離した。この５ｓＤＮＡをブライマー伸長の第二サイク
ルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ’型ＤＮＡ
を披感染能力のあるＪＭＩ０５細胞中へ形質転換させ、
寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージプラー
クが得られた。

（２）突然変質誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定 実施例２６の方法で、合成オリゴマー（第３８図（６）
）を用いて突然変異させたＭｌ３−ＰＤＮ４２ファージ
プラークの入ったプレート類並びに実施例２６で得られ
た突然変異しないＭｌ　３−ＰＤＮ４２フアージプラー
クの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレート
からのプラークを２枚のニトロセルロース円形フィルタ
ー上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒
天プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５
分重ねて移した。次に０．２Ｎ　　Ｎａ０Ｉ−ｆ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ＋及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７、５、及び１．５Ｍ　
　ＮａＣ１に浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター
類をフィルター当たり１０〃ＩのＩ）　Ｎ　Ａ雑種形成
緩衝液（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐｌ−１７，０，４Ｘデ
ンハーＦ液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、ｌＸ−各０　、（１
２％）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び　１０
０μｇ／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４
時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライ
マーをＩＯ’ｃｐｍ／Ｊに４２℃で２４時間装種形成さ
せた。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄
用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を
洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩
衝液で洗い、突然変異化されないＭｌ　３−ＰＤＮ４２
プラークを含有する対照フィルターはガイガー計数管を
用いて放射能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度を段
階的に低下させ、未突然変異Ｍ＋３−ＰＤＮ４２プラー
クをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能か残らな
くなるまでフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃
度はｏ、Ｉｘｓｓｃであった。フィルターを空気乾燥し
、−７０℃で２〜３日露光してオートラジオグラフをと
った。

突然変異したＭｌ　３−ＰＤＮ４２のプラーク１０００
０個と突然変異されない対照プラーク１００個を３！Ｐ
−γ−ＡＴＰでキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプ
ローブによってふるい分けた。対照プラークではプロー
ブと雑種形成したものが全く存在せず、一方突然変異さ
れたＭ１３ＰＤＮ４２プラ一ク３〜１０個がプローブと
雑種を形成した。

突然変異Ｍｌ　１−ＰＤＮ４２プラークの１個を取り上
げ、ＪＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮ
Ａをつくり、菌体ベレットから２本鎖（（Ｉｓ）　Ｄ　
Ｎ　Ａをつくった。適当なオリゴヌクレオチドプライマ
ーと５ｓＤＮＡを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＡＡＣ（Ａｓｎ４２）コドンがＡＧＡ（Ａ　
ｒｇ）コドンへ変換されたことが確認された。

変異したＭｌ３−ＰＤＮ４２ファージのうち、コドンＡ
ｓｎ４２がＡｒｇになったものをＭｌ３−ＰＨ１０２と
弥することとした。その塩基配列とこれがコードするア
ミノ酸配列を第４４図に示す。

実施例２９　（ムティンＣＳ　２．ＣＳ　３．ＣＳ　２
３の安定性） ヘパリンＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製したヒトｂＦＧＦおよ
びムティンＣ９２，Ｃ９３，Ｃ８２３（いずれも実施例
２４で得られたもの。）を用いて酸性条件下における安
定性を調べた。すなわち、５０ｍＭ　Ｎａ−Ａｃｅｔａ
ｔｅ（ｐＨ４、０）中でＩμｇ／滅の濃度にしたムティ
ンとヒトｂｐｃｒ；’とをそれぞれ３７°Ｃでインキュ
ベートした。インキュベーションの時間を十分毎に１時
間まで変化させ、それぞれの活性をマウスＢ　Ａ　Ｌ　
Ｂ／ｃ３　’Ｉ’　３細胞の系（萌述）で測定した。イ
ンキュベーションを行わなかったらとの標品の活性を１
００％として、それぞれの時間における活性を百分率で
算出して、プロットすると第４５図に示すようになった
。第４５図において、−・−はヒトｂＦＧＦ’の、−ム
−はムティンＣＳ２の、−■−はムティンＣ９３の、−
〇−はムティンＣＳ２３の結果をそれぞれ示す。

ヒトｂＦＧＦ’は１０分でほとんど失活するのに対して
ムティンＣ９２，ＣＳ３．ＣＳ　２３の順で失活する時
間が伸びている。ムティンＣ８２３については、２０分
後でも約５０％の活性が保持されており、これらのムテ
ィンはヒトｂｐｃｒ；’よりも安定性が向上しているこ
とがわかった。

実施例３０　（ムティンのヒト鱗帯血管内皮細胞増殖活
性） ヘパリンＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製したヒトｂＦ’Ｇｆ；
’およびムティンＣＳ２．ＣＳ３．ＣＳ２３（いずれら
実施例２４で得られたもの。）用いて血管内皮細胞の増
殖活性を測定した。測定の方法は以下のとおりである。

ヒト血管内皮細胞はヒト腑帯静脈より、トリプシン酵素
溶液による潅流法により得られ、ＧＩＴ培地（大五栄養
化学株式会社製）に、２．５％ウシ胎児血清および２゜
Ｏｎｇ／ｙＪ！のヒトｂＦＧＦを添加した培養液にて継
代維持された。２ＸＩＯ’個のヒト血管内皮細胞の懸濁
液、１００μＱを、９６穴培養皿（Ｎ　ｕｎｃ、　Ｉ−
６７００８）に播種し、炭酸ガス恒温槽で培養した。翌
日、終濃度２　ｎｇ／厳になるようＦＧＦと、種々の濃
度の検体を含む培地、１００μｇを加えた。３日間培養
の後、検体を含む培養液を吸引除去し、Ｉ＋ｇ／Ｉ−の
ＭＴ′ｒ溶液（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリ
ル）２．５−ジフェニル−２０−テトラゾリウム・ブロ
マイドを培養液に溶解）を１００μｅ加え、４時間保温
した。その後、１００μａの１０％ＳＤＳ溶液（ソデイ
ウム・ドデシル・サルフェイト水溶液）を加えて５−６
時間保温して、細胞およびＭＴＴ色素を可溶化し、分光
光度計にて０Ｄｓｅ。

値を測定した。８．Ｏｎｇ／７のヒトｂＦＧＦにより得
られる最大増殖度を１００％として、各検体濃度の細胞
増殖率を算定し、増殖率５０％を与える濃度を標準ＦＧ
Ｆ濃度と比較して、比活性を求めた。比活性を次の第５
表に示す。

第５表 ＦＧＦ　　　　　　　比活性 ＣＳ２　　　　　　　１　６ ＣＳ３　　、　　　　　３．０ ＣＳ２３　　　　　　２　５ ヒトｂＦ”ＣＦ’　　　　　　　１．０この結果から、
ムティンは、ヒトｂＦＧＦよりも高い比活性が認められ
た。

実施例３１　　（ＣＡＭ法によるムティンの血管新生能
） ヘパリンＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製したヒトｂＦＧＦおよ
びムティンＣＳ　２．Ｃ８３，ＣＳ２３（いずれも実施
例２４で得られたらの。）を用いて１ｎｖｉｖｏでの血
管新生能を検討した、方法はＣＡＭ（Ｃｈｏｒｉｏ　　
Ａ１１ａｎｔｏｉｃ　　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）アッセイに
よった。ＣＡＭアッセイの手法はオウルバッハ（Ａ　ｕ
ｅｒｂａｃｈ）の方法［デベロブメンタル・バイオロジ
ー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ
）、　４１　、３９１　（１９７４）］に若干の変更を
加えた。即ち、ニラトリ有精卵を３日間３７℃でふ卵機
中インキュベー！・シたのち、卵殻をはずし、さらに１
週間３７℃でインキュベートした（ナプコ炭酸ガスイン
キュベーター６３００使用、　ＣＯｔ　：　０　％Ｈｔ
　Ｏ飽和）。

直径６ｍｍのポリプロピレン製ディスクに各タンパクの
水溶液を６．２５．＋２．５，２５．０゜５０．０ｎｇ
になるようにスポットし、クリーンベンヂ内で風乾後、
ニワトリ漿尿膜上に静置してさらに３日間３７℃でイン
キュベートし、血管形成の状況を実体顕微鏡で観察した
。得られた結果を第６表に示す。各サンプルについて１
８個の卵を使用し、血管形成の認められた個数をパーセ
ントで表示した。

第６表 血管新生能（％） ＣＳ　２　　　　　７７．８ ＣＳ　３　　　　　７２．２ ＣＳ　２３　　　７２．２ ヒトｂＦＧＦ　　９４．４ ４４．４　　２２．２　　０．０ ６１．１　　１６．７　　０．０ ５５．６　　２２．２　　０．０ ５０．０　　３３．３　　０．０ 第６表から、ｂＦＧＦムティンはコントロールのヒトｂ
ＦＧＦと比較してほぼ同等の血管新生能を有しているこ
とが分かる。

実施例３２　（ヒトｂＦ’ＣＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ８５４の構築 前記実施例２７で得られたＭＪ３−ＰＮＩＯのレプリカ
ティブフォーム（ＲＦ’）を、実施例２（Ｉ）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ８５４を構築した（第４６図）。

このプラスミドｐＴＢ８５４を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第３９図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５４を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ　８５４を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５４の
菌体抽出液は、ＦＧＦ’活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＧｌｙ９，５ｅｒ１０
がそれぞれＴｈｒ、Ｍａｒに置換されたムティンＴＭ９
１０が得られた。

実施例３３　（ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのムティンをコードす
る遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ８５２の構築 前記実施例３２で得られたプラスミドｐ’ｒｎｓ５４の
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで切断して
ヒトｂＦＧＦのＮ末端側約１０残基をコートする部分を
除去した。残りのＤＮＡの切断端の一本鎖部分をｄＡ　
Ｔ　Ｐ　、ｄＣＴ　Ｐ　、ｄＧ　Ｔ　Ｐ　、Ｔ　Ｔ　Ｐ
存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて修復して
、平滑末端とした後、’Ｉ’４ＤＮＡリガーゼ反応によ
り結合させ、ヒトｂＦＧＦムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ８５２をｕＲ築した（第４７図）。

このプラスミドｐＴＢ８５２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第４８図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５２を
含む菌株Ｅ、ｃｏ目　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５２を得た
。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上滑を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ　２９４　／ｐＴ
　Ｂ２Ｓ３の菌体抽出液は、Ｆ’ＣＦ’活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＰｒｏ２から５ｅｒ１
０までが欠損したムティンＮＩＯが得られた。

実施例３４　（ヒトｂＦ’ＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
ｒ３７９５の構築 前記実施例２７で得られたＭ＋３−ＰＨ１０のレプリカ
ティブフォーム（ＲＦ）を、実施Ｍ　２　＜　１　）と
同様に処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミ
ドｐＴＢ７９５を構築した（第４９図）。

このプラスミドｐＴＢ７９５を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第４０図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＩ３７９５
を含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ９且ＭＭ２９４／
ｐＴＩ３７９５（ＩＦ’０　１４７００、Ｆ’ＥＲＭ　
　ＢＰ−１６６０）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ活性上記（２）で
得られた菌体抽出液につき、実施例２（３）と同様の方
法でヒトｂｐｃｒ；’活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９５
の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＰｒｏ２からＰｒｏ１
４までが欠損したムティンＮＩ４が得られた。

実施例３５　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７９６の構築 前記実施例２７で得られたＭ＋３−ＰＣ８６のレプリカ
ティブフォーム（ＲＦ’）を、実施例２（Ｉ）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７９６を構築した（第５０図）。

このプラスミドｐＴＢ７９６を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第４１図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７９６を
含む菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ１ｉＭＭ２９４／
１）ＴＢ７９６（ＩＰＯ１４７０１、ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１６６１）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）上記（２）で得られた菌体抽出液につき、以下の
（ａ）〜（Ｄに示すモノクローナル抗体を用いる酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）（サンドイツチ法）を行った。その
結果、菌体抽出液中にＦＧＦの存在が認められた。この
ようにして、Ｌｙｓ８７以降のアミノ酸を欠損したムテ
ィンＣ８６が得られた。

（ａ）　　免疫 ＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀４週令）に対しフロイ
ント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）０．４ｄに溶
解させた１０μｇの抗原ヒトｂＦＧＦ（参考例２で得ら
れたしの。）を腹腔に注射した。３週間後に、フロイン
ド不完全アジュバント０，４成にとかした１０μｇの抗
原ｈｂＦＧＦを腹腔に再投与した。さらに３週間後に同
様の追加免疫を行い、その２週間後に生理食塩水に溶か
した１０μｇのヒトｂＦＧＦを腹腔内に接種した。

（ｂ）　　細胞融合 上記（ａ）で示した免疫マウスより、抗原最終投与の４
ＥＩ−後牌臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。

この細胞は、イスコツ培地とハムＦ１２培地をＩ：ｌの
比率で混合した培地（以下ｒ　Ｉ−１培地と略す）に懸
濁した。

マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩは、
１０％０％ラン血清を含むＲＰＭｆ１６４０培地で５％
炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。

細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法［ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン。

Ｃ１；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　　２５６　、　４
９５（１９７５）］に準じて行った。上記ミエローマ細
胞２．９ｘ　ｌ　Ｏ’個と上述した方法で得られた免疫
されたリンパ球１．５ＸＩ０８個を混合、遠沈し、０．
３ｄのＩＨ培地に溶解した４５％ポリエヂレングリコー
ル６０００（以下ＰＥＧ　６０００）を滴下した。ＰＥ
Ｇ　６０００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴
下した。５分後３７℃に予温したｒＨ培地１分間に０．
５滅ずつ加え１０滅とした後、室温で６００回転！５分
遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％仔牛血
清を含む【１−１培地２００Ｍｌに懸濁し、２４六マイ
クロプレート（リンプロ社）に２滅ずっ植えつけた。１
日後、ＨＡ　Ｔ　（ヒボキサンヂン！×１０″″４Ｍ、
アミノプテリン４　ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ、デミジンＩ　、
６　ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ）を含んだＩ　Ｈ培地（２０％仔
牛血清含有）（以下ＨＡＴ培地と称する。）を各ウェル
に１戒ずつ添加し、さらに３日後、培地の１／２　ｆｆ
ｉをｒ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地と交換した。このようにして生
育した細胞は雑種細胞である。

（ｃ）　　抗体産生細胞の検索 予め、ヒトｂＦ’ＧＦを固定したポリスチレン製９６穴
マイクロタイタープレートに、雑種細胞培養上清を１０
０μＱずつ加え室温で２時間インキュベートした。培養
上清を除去、洗浄後２次抗体として西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（マイ
ルス社）を加え室温で２時間インキュベートした。２次
抗体を除去し、よくウェル洗浄した後、反応基質を加え
た呈色反応を行った（ＥＩＡ法）。この方法により３つ
のウェルに強い結合価が観察された。

（ｄ）　　雑種細胞のクローニング これらのウェル中の細胞を、Ｉウェルあたり０．５個と
なるように、予め１０’個／ウェルのマウス胸腺細胞を
栄養細胞としてまいておいた９６穴マイクロタイタープ
レートにまき、クローニングを行い、マウスハイブリド
ーマＨｂＦ５２（ＩＦｏ　　５０１４３）、およびマウ
スハイブリドーマｔｒｂＦＧＦ７８（ＩＰＯ５０１１４
）を得た。

（ｅ）　　雑種細胞の腹水化 マウスハイブリドーマＨｂＦ５２およびマウスハイブリ
ドーマＨｂＦ７８の２Ｘ１０８個をそれぞれ予めミネラ
ルオイルを腹腔内投与しておいたマウスに接種した。１
０日後２−７匹の腹水を採取し、モノクローナル抗体Ｍ
ｏＡｂ５２およびモノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８をそ
れぞれ得た。

（４）　　モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８を腹水から
Ｓ　ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔらの方法〔ザ・ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、　　２５６巻９７５０−９７５４頁、
１９８１年〕に記載の方法により精製した。このように
して得られた抗体を２ｍｇ／威以上になるように濃縮し
、次いで溶媒を０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０
）になるよう透析した。２．８ｍｇ／ｄのモノクローナ
ル抗体ＭｏΔｂ７８　１．４ｄに対し、！　１　、５　
ｍｇ／ｄとなるようＮＮ’−ジメチルホルムアミド（Ｄ
　Ｍ　Ｆ　）に溶解したＳ−アセチルメルカプトサクシ
ニックアンヒドリド（Ａ　１ｄｒｉｃｈ社、米国）を５
０μＱ加えた。

反応器の空気を窒素ガスに置換し、密栓後、室温で一間
装攪拌し、ＳＨ基を導入した。未反応のＳ−アセチルメ
ルカブトサタンニックアンヒドリドを１３０μ（の０．
２Ｍ’ｒｒｉｓ−Ｉ−ＩＣ（（１３８７，０）。

１３μＱの０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ、１３０μσの２Ｍヒ
ドロキシアミン（ｐＨ７，０）を加え室温１０分処理し
、不活化した。モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８は、セ
ファデックスＧ−２５（径１　ｃｍＸ　８０　ＣＴ１１
゜ファルマシア社）を充填したゲルろ過カラムにより分
取した（流速２０蔵／ｈ）。

軸）西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰと称する
。ベーリンガーマンハイム社、西ドイツ。

Ｇｒａｄｅ　　ｒ　）　ｌ　Ｏｍｇを１．４−の０．１
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，８）に溶解した。Ｎ−（
４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル〔Ｎ Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　　ｅｓｔｅｒ
　ｏｆ　　Ｎ　−（４ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘ
ｙｌ　　Ｉｌｅｔｈｙｌ）ＩＩｌａｌｅｉｍｉｄｅ　）
　　１４　ｍｇを３３５μＱのＤＭＦに溶解し、このう
ち１００μｅをＨＲＰ溶液に加えた。反応器の空気を窒
素置換し、密栓後、室温で１時間攪拌した。この後、セ
ファデックスＧ−２５を充填したゲルろ過カラム（前出
）により、ＳＨ基を導入したモノクローナル抗体ＭｏＡ
ｂ７８画分を分取した。

（ｈ）　　上記（ｒ）においてＳ　Ｈ基を導入した抗体
Ｍ。

Ａｂ７８画分６ｄと上記（ｇ）においてマレイミド基を
導入したＨＲＰ画分２威を混合し、コロジオンバッグ（
ザルトリウス社製、西ドイツ）を用いて減圧下、１ｄに
濃縮し、４℃、２０時間反応させた。

反応後、ＨＲＰが導入された抗体をウルトロゲルＡｃＡ
　４４　（ＬＫＢ社製、スエーデン、径１ｃｍＸ８０ｃ
ｍ）にかけ分離した（流速１０ｄ／ｈ）。溶出ピーク両
分のうち抗体１分子あたりのＨＲＰ数が最ら多い両分は
、２．４ＨＲＰ／抗体であった。これを次の（ｉ）のＥ
ＩＡに使用した。

（＋）　　モノクローナル抗体ＭｏＡｂ５２を上記Ｃｒ
）と同様の方法により精製した。モノクローナル抗体Ｍ
ｏＡｂ５２をＩＯμｇ／ｄ又は２０ｕｇ／ｒｎ１．とな
ろようＰＢＳで希釈し、イムノプレート（ヌンク社。

デンマーク）に＋００μＱ／穴注入し、４℃、−夜装置
することにより吸着させた。吸着しなかった抗体を除去
した後、ＰＢＳで３回洗浄し、００１％メルチオレート
、１％牛血清アルブミン（ＵＳＡ）を含むＰＢＳを２０
０　μＱ／穴加え４°Ｃ−夜装置した。

（Ｄ　　上記（２）で得たムティンＣ８６含有抽出液を
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。（ｉ）で作製
したプレートよりＵＳＡ溶液を取り除き、ＰＢＳで４回
洗浄後、希釈したムティンＣ８６含有抽出液を　１００
μｍ２／穴加え、４℃−夜吸着を行った。未反応のムテ
ィンＣ８Ｇを除去後、ＰＢＳで４回洗浄し、（ｈ）で作
製したＩＩ　ＲＰ結合抗体（Ｉ（ＲＰ−ＭｏＡｂ　　７
８）を０．１％ＢＳＡを含むＰｒ３Ｓテ１／３００希釈
し、１００μＭ穴加え、室温４時間反応させた。抗体を
除去後、ＰＢＳで６回洗浄し、パーオキシダーゼ基質（
ＢｉｏＲａｄ社、米国）を１００μａ／穴加えた。４１
５μｍの吸光度を測定することにより、定量したところ
、微量のムティン０８６が生成していることが確認され
た。

実施例３６　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７９７の構築 前記実施例２７で得られたＭ２Ｓ−ＰＤＮ４２のレプリ
カティブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７９７を構築した（第５１図）。

このプラスミドｐＴＢ７９７を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第４２図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７９７を
含む菌株Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ１ｉＭＭ２９４
／ｐＴＢ７９７（ＩＦＯ１４７０２、ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１６６２）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９７
の菌体抽出液は、Ｆ’ＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＡｓｐ４２がＡｓｎに
置換されたムティンＤＮ４２が得られた。

実施例３７　（ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのムティンをコードす
る遺伝子の大腸菌における発現） （＋）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７９９の構築 前記実施例２７で得られたＭ２Ｓ−ＰＲＱ４５のレプリ
カティプフォーム（ＲＦ’）を、実施例２（１）と同様
に処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
Ｔ１３７９９を構築した（第５２図）。

このプラスミドｐＴＢ７９９を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第４３図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７９９を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４／ｐＴＢ７９９を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＣＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９
９の菌体抽出液は、ＦＧＰ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＡｒｇ４５がＧｌｎに
置換されたムティンＲＱ４５が得られた。

実施例３８　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７９８の構築 前記実施例２８で得られたＭ２Ｓ−ＰＮＲ４２のレプリ
カティブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に
処理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
８７９８を構築した（第５３図）。

このプラスミドｐＴ８７９８を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換さけることにより第４４図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ７９８を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＭＭ　２
９４　／ｐＴＢ　７９８を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦ’ＣＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９
８の菌体抽出液は、Ｆ’ＣＦ’活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの４２位のＡｓｐがＡｒ
ｇに置換されたムティンＮＲ４２が得られた。

実施例３９　（ムティンをコードする塩基配列を有する
組換えＤＮＡの製造） （１）　　サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノシン酸燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキンメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣ１
）Ｉ）Ｈ８、０，１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、５＋＋＋Ｍ
ジチオスレイトール（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位
の存在下に、５０μσ中で合成オリゴヌクレオヂド ５’−ＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡ’ｒＣＣＧＴＴ−３
′ 〔塩基配列中の制限酵素Ｂａｍ）［の認識部位を生成さ
せ、さらにＶａ１４４をＳｅｒにおよびＡｒｇ４５をＬ
ｅｕに変更するためのプライマー（第３８図（７）参照
）〕４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間
処理した。５００１Ｍ　　ＮａＣｌ、１．０ｍＭ）リス
−ＨＣＬｐＨ８，０，１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ及び１０
ｍＭ　　β−メルカプトエタノールを含有する混合物５
０μＱ中で、このキナーゼ処理されたプライマー（１２
ピコモル）を６７℃で５分、及び４２℃で２５分加熱す
ることによって１本鎖（ｓｓ）Ｍ３−ＰＤＮ４２　　Ｄ
ＮＡ５μｇに雑種形成させた。アニーリングした混合物
を次に氷上で冷却し、０．５　ｍＭ各デオキシヌクレオ
チド三燐酸（ｄＮ’ｒ　ｐ　＞、８０ｍＭトリス−１１
ＣＩ、ｐＨ７，４，８ｍＭＭｇＣｌ、ｌ　ＯＯｍＭ　　
ＮａＣｌ、　ＤＮＡポリメラーゼｒ　　Ｋ　ｌｅｎｏｗ
断片９単位、０　、５　ｍＭ　　Ａ　Ｔ■〕及びＴ４Ｄ
ＮＡリカーゼ２単位を含有する反応混合物５０μＱに添
加し、３７℃で３時間及び２５℃で２時間反応し、０．
２ｍＭ　　ＥＤ’１’Ａ２μ（１を加え反応を停止した
。肢感染能力のあるＪＭ１０５細胞の形質転換に使用し
、菌を一夜成育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮＡを単
離した。この５ｓＤＮＡをプライマー伸長の第二サイク
ルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ型ＤＮＡを
披感染能力のあるＪＭ１０５ｗＪ胞中へ形質転換させ、
寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージプラー
クか得られた。

（２）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定 実施例２７の方法で、合成オリゴマー（上記した合成オ
リゴヌクレオチド）（第３８図（７））を用いて突然変
異させたＭ　ｌ　３−ＰＤＮ４２フアージプラークの入
ったプレート類並びに実施例２６で得られた突然変異し
ないＭｌ　３−ＰＤＮ４２フアージプラークの入った２
枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプラー
クを２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、第一
フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレート上
へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて移し
た。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，Ｉ　、５Ｍ　　ＮａＣ
１及び０．２％トリトンｘ−ｔ　ｏ　ｏに５分浸した厚
手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍトリス
−ＨＣ１，ｐＨ７、５、及び１．５Ｍ　　ＮａＣ１に浸
したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィルター類を
同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン酸塩）に浸した
フィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で８０
℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たり１０滅のＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、ｐＨ７，０，４ｘデンハ
ード液（ポリビニルピロリドン、フィコール及び牛血清
アルブミン、Ｉ　Ｘ＝各０．０２％）。

０」％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ燐
酸ナトリウム緩衝液、ｐｉ−１７，０及び　１００μｇ
／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間、
事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライマーを
ｌ　０５ｃｐｍ／１ｎ１に４２℃で２４時間装種形成さ
せた。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄
用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を
洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩
衝液で洗い、突然変異化されないＭｌ３−Ｐ２プラーク
を含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放
射能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度を段階的に低
下させ、未突然変異Ｍ１３−ＰＤＮ４２プラークをもつ
対照フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるま
でフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．
Ｉ　Ｘ５ＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７
０℃で２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。

突然変異したＭｌ３−ＰＤＮ４２のプラークｔｏｏｏｏ
個と突然変異されない対照プラーク１００個を３１Ｐ−
γ−ＡＴＰでキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプロ
ーブによってふるい分けた。対照プラークではプローブ
と雑種形成したものが全く存在せず、一方突然変異され
たＭｌ３−ＰＤＮ４２プラーク３〜１０個がプローブと
雑種を形成した。

突然変異Ｍｌ　３−ＰＤＮ４２プラークの１個を取り上
げ、ＪＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮ
Ａをつくり、菌体ペレットから２本鎖（ｄＳ）ＤＮＡを
つくった。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓ
ＤＮＡを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＧＴＣ（Ｖａ１４４）コドンとＣＧＧ（Ａｒ
ｇ４５）コドンがそれぞれＴＣＣ（Ｓｅｒ）コドンとＣ
ＴＧ（Ｌｅｕ）コドンへ変換されたことが確認された。

変異したＭｌ３−ＰＤＮ４２ファージのうち、コドンＶ
ａ１４４およびコドンＡｒｇ４５がそれぞれＳｅｔおよ
びＬｅｔ＋になったものをＭｌ　３−Ｐ　ＩＮＴと称す
ることとした。その塩基配列とこれがコードするアミノ
酸配列を第５４図に示す。

（３）ヒトｂＦ’ＧＰのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ８５３の構築 上記（２）で得られたＭｌ３−ＰＩＮＴのレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ）を、実施例２（１）と同様に処理し
、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ８５
３を構築した（第５５図）。

このプラスミドｐＴＢ８５３を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第５４図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５３を
含む菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＭＭ２
９４／ｐＴＢ８５３を得た。

（４）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（５）菌体抽出液のヒ１−ｂＦＧＦ活性上記（４）で得
られた菌体抽出液につき、実施例２（３）と同様の方法
でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５３
の菌体抽出液は、ＰＧＰ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＡｓり４２　、Ｖａ１
４４　、Ａｒｇ４５がそれぞれＡ　ｓｎ、　Ｓ　ｅｒ、
　Ｌ　ｅｕに置換されたムティンＦＩＮＴが得られた。

実施例４０　（ヒトＦ’ＧＦ’のムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ８５５の構築 前記参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９のＤＮ
Ａを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、ＥｃｏＲ１リンカ
−１）（５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３′）をＴ４
ＤＮＡリガーゼ反応によって結合させた。さらに制限酵
素ＥｃｏＲＩとＰＳｔｌで切断して、約０．３５ｋｂの
ＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ断片とプラスミドｐ
ｔｒｐ７８１をＥｃｏＲＩ−Ｐ　ｓｔ　Ｉで切断して得
られる約３　、２　ｋｂのＤＮＡ断片（実施例２（１）
）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させヒトＦ’Ｇ
Ｆムティン発現用プラスミドｐＴＢ８５５を構築した（
第５６図）。

このプラスミドｐＴＢ８５５を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第５７図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５５を
含む菌株Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＩ３８５
５を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例２（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定しに。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／Ｉ）Ｔａ２
０５の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＰｒｏ２からＶａ１４
１までが欠損したムティンＮ４１が得られた。

実施例４１　　（ヒトＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）ヒトｂｒ”ＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ８５６の構築 前記参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９のＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで部分的に切断し、ｂＦＧＦ遺
伝子遺伝島内ＢａｍＨＩ認識部位のみを切断した。切断
部位をｄＡ　Ｔ　Ｐ　、ｄＣＴ　Ｐ　、ｄＧ　Ｔ　Ｐ　
。

ｄＴＴＰ存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて
平滑末端とし、Ｎｈｅｌリンカ−ｐ（５′ＣＴＡＧＣＴ
ＡＧＣＴＡＧ−３’）をＴ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼり
結合させた。制限酵素Ｎｈｅｌで処理して、さらにＴ４
ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼり切断部位を結合させ、ヒトｂ
Ｆ’ＣＦのムティン発現用プラスミドｆ）Ｔ８８５６を
構築した（第５８図）。

このプラスミドｐＴＢ８５６を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより第５９図に示すムティンを
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５６を
含む菌株Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／Ｉ）ＴＢ　８
５６を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、実施例２（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例
３５（３）と同様のモノクローナル抗体を用いるＥＩＡ
（サイドイッチ法）を行った。

その結果、菌体抽出液中にｂＦＧＰムティンの存在が認
められた。

このようにして、Ｌｙｓ１３０以降のアミノ酸を欠損し
たムティンＣｌ２９が得られた。

実施例４２　ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の動物細胞における発現 （１）　ヒトｂＦＧＦムティン発現用プラスミドｐＴＢ
８３１．ｐＴＢ８３３．ｐＴＢ８３５の構築：前記実施
例７で得られたプラスミドＩ）ＴＢ７６２を、制限酵素
Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｂ　ａｍＨｒで切断し、ヒトｂＦＧＦ
ムティンＣＳ２３のコード領域を含む０．３８ｋｂＤＮ
Ａ断片を得た。また、特開昭６２１７５１８２号公報記
載のプラスミドｐＴＢ５０４をＣ１ａｌ　−ＥｃｏＲＩ
で切断し、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）ＬＴＲ領
域、ＳＶ４０由来プロモーターおよびスプライス領域、
およびヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）リーダー配
列を含む１．７ｋｂＤＮＡ断片を得た。

参考例！で得られたプラスミドｐＴＢ６２７を制限酵素
Ｃ１ａｌ　−ＥｃｏＲＩで切断し、２ｋｂのＤＮＡフラ
グメントを得た。一方、次に示すプラスミドｐＴ８３８
９を制限酵素Ｃ１ａｌ−ＥｃｏＲＩで切断し、２　、６
　ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。

このようにして得られた２ｋｂＤＮＡフラグメントと２
．６ｋｂＤＮＡフラグメントとを連結してヒトｂＦＧＦ
を発現するプラスミドｐＴＢ６７５を得た。なお、プラ
スミドｐＴＢ３８９は、特開昭６１−６３２８２号公報
に記載のプラスミドｐ’ｒＢｔｏｅのインターロイキン
−２遺伝子領域の５′末端側のＰｓｔＩ切断部位及び３
′末端側のＢａｍＨＩ切断部位をＥｃｏＲｌに変換しイ
ンターロイキン−２遺伝子領域を除去することにより得
られた。さらに、このようにして得られたプラスミドｐ
ＴＢ６７５をＣ１ａｌ　−ＢａｍＨＥで切断し、ヒトｂ
ＦＧＦのＣ末側のコード領域と３′非翻訳領域およびプ
ラスミドｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子およ
び大腸菌における複製開始点を含む　３．４ｋｂＤＮＡ
断片を得た。これら３種のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、プラスミドｐＴＢ８３１を得た（
第６０図）。

同様に、ｐＴ８７６２（ムティンＣ３２３を発現する。

）のかわりに、実施例１８で得られたプラスミドｐＴＢ
７６３（ムティンＣ３１４を発現する。）、または実施
例！ｌで得られたプラスミドｐＴ８７６５（ムティンＣ
５１２３４を発現する。）を用いて、プラスミドｐＴＢ
８３３およびプラスミドｐＴｎ８３５をそれぞれ得た。

（２）動物細胞における発現： サルＣ０９７細胞をｌθ％牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培
地で直径６ｃ＋ｎの組織培養用デイツシュに播種し、翌
日、同培地で培地交換した。４時間後にリン酸カルシウ
ム法［Ｇ　ｒａｈａｍら、ヴイーロロジ−（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）　５２　：４５６（１９７３）］によりプラス
ミドｐＴＢ８３１，８３３．または８３５のＤＮＡ　Ｉ
　ＯＨ２をトランスフェクトした。翌日１％牛脂児而清
を含むＤＭＥＭ培地に交換して培養を続け、４８時間後
に、培養液および細胞を集めた。細胞はＰＢＳで２回洗
ったのち、ＰＢＳにけんだくし、短時間の超音波処理の
のち、１５０００　ｒｐｍで１５分遠心し上滑液を得た
。これらプラスミド感染Ｃ０８７細胞の培養液と、細胞
抽出液について、実施例２（３）に記載の方法によりＦ
ＧＦ活性を測定した。結果を第７表に示す。

第７表 ＦＧＦ活性（ｎｇ／デイツシュ） ｐＴＢ８３１　　　Ｃ３２３１１５４２０ｐＴＢ８３３
　　Ｃ５１４Ｇ、２　　　　　　３５ｐＴＢ８３５　　
Ｃ３１２３４１，１２０発明の効果 本発明のムティンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用、
血管内皮細胞増殖促進作用、血管新生作用を有しており
、また安定性が高い。とりわけ、構成アミノ酸がシステ
ィンであるものを別のアミノ酸に置換すると、安定性が
向上する。そのため、火傷などの治癒促進剤、血栓症や
動脈硬化症などの治療薬として、また細胞培養促進剤と
して有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトｂＦＧＦをコードする塩基配列と、それ
から推測されるアミノ酸配列とを示す。 第２図は、ＣｙｓをコードするコドンをＳｅｔをコード
するコドンに変異させるためにブライマーとして用いろ
合成オリゴマーを示す。 第３図は、実施例２で得られたプラスミドｐ’ｒｎ７３
９が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＣＳｌをコード
する塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦのムテ
ィンＣＳＩのアミノ酸配列を示す。変異した塩基に下線
を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲む。 第４図は、実施例３で得られｔこプラスミドｐＴＩ３７
４２が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＣ８２をコー
ドする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦのム
ティンＣＳ２のアミノ酸配列を示す。変異した塩基に下
線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲む
。 第５図は、実施例４で得られたプラスミドｐＴＢ７４３
が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＣ８３をコードす
る塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦ’のムテ
ィンＣ８３のアミノ酸配列を示す。変異した塩基に下線
を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲む。 第６図は、実施例５で得られたプラスミドｐＴＢ７４４
が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＣ８４をコードする
塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦのムティン
Ｃ９４のアミノ酸配列を示す。変異した塩基に下線を付
し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲む。 第７図は、実施例２（１）におけるプラスミドｐＴＢ７
３９の構築図を示す。 第８図は、実施例３（１）におけるプラスミドｐＴＢ７
４２の構築図を示す。 第９図は、実施例４（１）におけるプラスミドＰＴＢ７
４３の構築図を示す。 第１Ｏ図は、実施例５（１）におけるプラスミドｐＴＩ
３７４４の構築図を示す。 第１１図は、実施例７で得られたプラスミドｐ’ｒｒ３
７Ｇ２が保持するヒトｂＦ’　ＣＦ（１）ＬティンＣＳ
２３をコードする塩基配列と、それがコードするヒトｂ
Ｆ’ＣＦのムティンＣＳ２３のアミノ酸配列を示す。変
異した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領
域を四角で囲む。 第１２図は、実施例７（１）におけるプラスミドｐＴＢ
７６２の構築図を示す。 第１３図は、実施例９で得られたプラスミドｐＴＢ７６
４が保持するヒトｂＦ’ＣＦ’のムティンＣ８１２３を
コードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦ
のムティンＣ５Ｉ２３のアミノ酸配列を示す。変異した
塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四
角で囲む。 第１４図は、実施例９（呈）におけるプラスミドｐＴｒ
３７６４の構築図を示す。 第１５図は、実施例１１で得られたプラスミドｐＴ８７
６５が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＣＳ　Ｉ　２
３４をコードする塩基配列と、それがコードするヒトｂ
ＦＧＦのムティンＣ５１２３４のアミノ酸配列を示す。 変異した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む
領域を四角で囲む。 第１６図は、実施例１１（１）におけるプラスミドｐＴ
Ｂ７６５の構築図を示す。 第１７図は、実施例１５で得られたプラスミドｐＴＢ７
７６が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＣ５１２をコー
ドする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＰのム
ティンＣ５１２のアミノ酸配列を示す。変異した塩基に
下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲
む。 第１８図は、実施例１５（１）におけるプラスミドｐＴ
Ｂ７７６の構築図を示す。 第１９図は、実施例！６で得られたプラスミドｐＴＢ７
７８が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＣＳ２４をコ
ードする塩基配列と、それかコードするヒトｂＦＧＰの
ムティンＣ９２４のアミノ酸配列を示す。変異した塩基
に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で
囲む。 第２０図は、実施例１６（１）におけるプラスミドｐＴ
　ｒ３７７８の構築図を示ず。 第２１図は、実施例！７で得られたプラスミドｐＴＩ３
７７９が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＣ５Ｉ３をコ
ードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦ’ＣＦ
のムティンＣ９１３のアミノ酸配列を示す。変異した塩
基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角
で囲む。 第２２図は、実施例１７（１）におけるプラスミドｐＴ
Ｉ３７７９の構築図を示す。 第２３図は、実施例１８で得られたプラスミドｐＴｎ７
６３か保持するｋｌ−ｂＦ’ＧＦ’（７）ムティンＣ８
Ｉ４をコードする塩基配列と、それがコードするヒトｂ
ＦＧＦのムティンＣ９Ｉ４のアミノ酸配列を示す。変異
した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域
を四角で囲む。 第２４図は、実施例１８（＋）におけるプラスミドｐＴ
８７６３の構築図を示す。 第２５図は、実施例１９で得られたプラスミドｐＴＢ７
７７が保持するヒトｂＦ’ＣＦのムティンＣ５３４をコ
ードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦ　Ｇ　
ＦのムティンＣ５３４のアミノ酸配列を示す。変異した
塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四
角で囲む。 第２６図は、実施例１９（１）におけるプラスミドｐＴ
Ｂ７７７の構築図を示す。 第２７図は、実施例２０で得られたプラスミドｐＴＢ７
８２が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＣ８２３４をコ
ードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦ’ＣＦ
’のムティンＣＳ２３４のアミノ酸配列を示す。変異し
た塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を
四角で囲む。 第２８図は、実施例２０（１）におけるプラスミドｐＴ
Ｂ７８２の構築図を示す。 第２９図は、実施例２１で得られたプラスミドｐＴ８７
８０が保持するヒトｂＦ’ＧＦ’のムティンＣ５１２４
をコードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧ
ＦのムティンＣ５１２４のアミノ酸配列を示す。変異し
た塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を
四角で囲む。 第３０図は、実施例２１（１）におけるプラスミドｐＴ
８７８０の構築図を示す。 第３１図は、実施例２２で得られたプラスミドｐ’ｒｎ
７８１が保持するヒトｂＦ’ＧＦのムティンＣ８１３４
をコードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦ’
ＧＦのムティンＣ５１３４のアミノ酸配列を示す。変異
した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域
を四角で囲む。 第３２図は、実施例２２（１）におけるプラスミドｐＴ
８７８１の構築図を示す。 第３３図〜第３５図は、実施例２４で得られたムティン
の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示す。 第３６図は、実施例２５で得られたムティンの酸化物の
高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示す。 第３７図は、実施例２６で得られたムティンの還元物の
高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示す。 第３８図は、ムティンをコードするＤＮＡを作成するた
めにプライマーとして用いる合成オリゴマーを示す。 第３９図は、実施例２７て得られたファージＭ１３−Ｐ
ＮＩＯの塩基配列とこれがコードする実施例３２で得ら
れたムティンＴＭ９１０のアミノ酸配列を示す。 第４０図は、実施例２７で得られたファージＭ１３−Ｐ
Ｎ１４の塩基配列とこれがコードする実施例３４で得ら
れたムティンＮ１４のアミノ酸配列を示す。 第４１図は、実施例２７で得られたファージＭ１３−Ｐ
Ｃ８６の塩基配列とこれがコードする実施例３５で得ら
れたムティン０８６のアミノ酸配列を示す。 第４２図は、実施例２７で得られたファージＭ１３−Ｐ
ＤＮ４２の塩基配列とこれがコード実施例３６で得られ
たムティンＤＮ４２のするアミノ酸配列を示す。 第４３図は、実施例２７で得られたファージＭ１３−Ｐ
ＲＱ４５の塩基配列とこれがコードする実施例３７で得
られたムティンＲＱ４５のアミノ酸配列を示す。 第４４図は、実施例２８で得られたファージＭ１３−Ｐ
ＮＲ４２の塩基配列とこれがコードする実施例３８で得
られたムティンＮＲ４２のアミノ酸配列を示す。 第４５図は、実施例２９で得られた、ムティンＣ９２，
ＣＳ３およびＣＳ２３の安定性の結果を示す。 第４６図は、実施例３２におけるプラスミドｐＴＩ”（
８５４の構築図を示す。 第４７図は、実施例３３におけるプラスミドｐＴＩＬ８
５２の構築図を示す。 第４８図は、実施例３３で得られたプラスミドｐＴ＋３
８５２が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＮ１０をコー
ドする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦ’ＣＦの
ムティンＮＩＯのアミノ酸配列を示す。変異した塩基に
下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角で囲
む。 第４９図は、実施例３４におけるプラスミドｐ’ｒＢ７
９５の構築図を示す。 第５０図は、実施例３５におけるプラスミドｐＴＢ７９
６の構築図を示す。 第５１図は、実施例３６におけるプラスミドｐＴＢ７９
７の構築図を示す。 第５２図は、実施例３７におけるプラスミドｐＴＢ７９
９の構築図を示す。 第５３図は、実施例３８におけるプラスミドｐＴＢ７９
８の構築図を示す。 第５４図は、実施例３９で得られたプラスミドｐＴ１３
８５３が保持するヒトｂＦ’ＧＰのムティンＦＩＮＴを
コードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦ
のムティンＦＩＮＴのアミノ酸配列を示す。変異した塩
基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角
で囲む。 第５５図は、実施例３９におけるプラスミドｐＴＢ８５
３の構築図を示す。 第５６図は、実施例４０におけるプラスミドｐＴＢ８５
５の構築図を示す。 第５７図は、実施例４０で得られたプラスミドｐＴＢ８
５５が保持するヒトｂＦＧＦ’のムティンＮ４１をコー
ドする塩基配列と、それがコードするヒトｂｒ；’ＣＦ
’のムティンＮ４１のアミノ酸配列を示す。変異した塩
基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角
で囲む。 第５８図は、実施例４１におけるプラスミドｐｉ’ｎ８
５６の構築図を示す。 第５９図は、実施例４１で得られたプラスミドｐ’ｌ’
８８５６が保持するヒトｂＦＧＦのムティンＣｌ２９を
コードする塩基配列と、それがコードするヒトｂＦＧＦ
のムティンＣ１２９のアミノ酸配列を示す。変異した塩
基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含む領域を四角
で囲む。 第６０図は、実施例４２におけるプラスミドｐＴ１３８
３１の構築図を示す。 第 図 ＧＡＴＴＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＣ−３’Ｈａｅ　Ｉ　
Ｉ ５°−ＴＣＧ 第 図 ＭｅｔＰｒｏＡｌａＬｅｕＰｒｏＧｌｕＡｓｐＧｌｙＧ
ｌｙｓｅｒＧｌｙＡｌａＰｈｅＰｒｏＰｒｏＧｌｙＨｉ
ｓＰｈｅＬｙｓＡｓｐＡＴＧ（”ＣＡＧＣＡｉ’ＴＧＣ
ＣＣＧＡＧＧＡ’ｌ”ＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣ
ＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＰ
ｒｏＬｙｓＡｒｇＬｅｕＴｙｒＣｙｓＬｙｓＡｓｎＧｌ
ｙＧｌｙＰｈｅＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧ１’ＡＣＴＧ
ＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＣｉＣＴＴｃＶａｌＡｓｐＧｌ
ｙＶａｌＡｒｇＧ１ｕＬｙｓＳｅｒＡｓｐＰｒｏＨｉｓ
（ｉ’［’ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡ
ＧＣＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣ’Ｉ”ＡＣＡＡ
ＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＣ
ＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＡｉ”ＧＴＧ’ｌ’ＴＡＣＧＧＡ
ＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＴＧ
ＧＡＡＳｅｒＡｓｎＡｓｎＴｙｒＡｓｎＴｈｒ’ｌ”ｙ
ｒＡｒ　ｇＳｅｒＡｒｇＬｙｓＴｙｒＴｈｒＳｅｒＴｒ
ｐＴｙｒＶａＩＡｌａＬｅｕＬｙｓＴＣＴＡＡｉ’ＡＡ
Ｃ１’ＡＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡ
ＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧ
ＡＡＡＡｒｇｉ’）＋ｒＧｌｙＧＩｎＴｙｒＬｙｓＬｅ
ｕＧｌｙｓｅｒＬｙｓＴｈｒＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧ１ｎ
ＬｙｓＡｌａＩｌｅＬｃｕＰｈｅＣＧＡＡＣ１’ＧＧＧ
ＣＡＧＴＡ１’ＡＡＡＣ’ｒＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣ
ＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＴ
１’ｌ”Ｉ’ＬｅｕＰｒｏＭｅｔＳｅｒＡｌａＬｙｓＳ
ｅｒｔｒｍＣＴＴＣＣＡＡ’ｌ’ＧＴＣＴＧＣＴＡＡＧ
ＡＧＣＴＧＡ第 図 ＡｌａＰｈｅＰｒｏＰｒｏＧｌｙＨｉｓＰｈｅＬｙｓＡ
ｓｐＧＣＣＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡ
ＧＧＡＣＰｈｅＬｅｕＡｒｇＩｌｅＨｉｓＰｒｏＡｓｐ
Ｇ１ｙＡｒｇＴ’ｌ”ＣＣＴＧＣＧＣＡ’ｌ’ＣＣＡＣ
ＣＣＣＧＡＣＧＧＣＣＧＡＩｌｅＬｙｓＬｅｕＧｌｎＬ
ｅｕＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｕＧ’ｒＴＧＡＣＧＧＣ７
ＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣ１’ＣＡＣ
Ａｉ”にＡＡＧＣ’ｒＡＣＡＡＣＴ’ｒＣＡＡＧＣＡＧ
ＡＡＧＡＧＡｒｇＧｌｙＶａｌＶａｌｓｅｒｌｌｅＬｙ
ｓＧｌｙＶａＩＣｙｓＡｌａＡｓｎＡｒｇＴｙｒＬｅｕ
ＡｌａＭｅｔＬｙｓＧｌｕＡｓｐＡＧＡＧＧＡＧｉ”Ｉ
’Ｇｉ’Ｇ’ｌ’Ｃ’ｌ”Ａ’ｌ”ＣＡＡＡＧＧＡＧＴ
ＧＴＧＴＧＣ１’ＡＡＣＣＧ’ｒ’ｌ’ＡＣＣ’ＴＧＧ
ＣＴＡ’ｆ’ＧＡＡＧＧＡＡＧＡ’ｒＧｌｕｃｙｓＰｈ
ｅＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｕＧＡＧ’ｒＧ
ＴＴ１”ＣＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＴＧＧＡＡＴｙ
ｒＴｈｒＳｅｒＴｒｐＴｙｒＶａＩＡｌａＬｅｕＬｙｓ
ＴＣＴＡＡ１’ＡＡＣＴＡＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧ
ＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡ’ｌ
’ＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡｒｇＴｈｒＧｌｙＧｌｎ
’ｌ’ｙｒＬｙｓＬｅｕＧｌｙｓｅｒＬｙｓＴｈｒＧｌ
ｙＰｒｏＧｌｙＧｌｎＬｙｓＡｌａＩｌｅＬｅｕＰｈｅ
ＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴ
ＣＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣ
’ｌ”Ａｉ”ＡＣＴＴ’ｌ”ｒ’ｌ’ＬｅｕＰｒｏＭｅ
ｔＳｅｒＡｌａＬｙｓｓｅｒｔｒｍＣＴＴＣＣＡＡ１’
ＧＴＣ’ｌ’ＧＣＴＡＡＧＡＧＣ’ｒ’ＧＡ竿 図 集 ？ 図 竿 ？ 図 竿 図 竿 図 竿 ノダ 図 εＣＯＲＩ 竿 図 竿 ノ？ 図 竿 二〇 図 竿２２ 図 第２ダ図 第２４図 第２？図 竿 図 竿 ３ユ 図 第３ケ図 第３３図 第３５図 ６゜ ｍ　ｉ　ｒｚ　− 第３７図 第ダＯ図 ＧＡＡＴ 第グ／図 ＭｅｔＰｒｏＡｌａＬｅｕＰｒｏＧｌｕＡｓｐＧｌｙＧ
ｌｙｓｅｒＧｌｙＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＣＣＧＡ
ＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＰｒｏＬｙｓＡｒｇ
ＬｅｕＴｙｒＣｙｓＬｙｓＡｓｎＧｌｙＧｌｙＰｈｅＣ
ＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧ
ＧＧＧＣＴＴＣＶａｌＡｓｐＧｌｙＶａｌＡｒｇＧｌｕ
ＬｙｓＳｅｒＡｓｐＰｒｏＨｉｓＧＴＴＧＡＣＧＧＧＧ
ＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡｒ
ｇＧ１ｙＶａＩＶａｌｓｅｒＩｌｅＬｙｓＧｌｙＶａｌ
ｃｙｓＡｌａＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡ
ＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣＴＡ
ＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣ
ＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣ
ＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＣ
ＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴ
ＡＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＴＣＴＧＣＴＡ
ＡＧＡＧＣＴＧＡ第４５図 ＥｃｏＲｌ　＋　Ｎｃｏｌ　） 竿 郊 図 竿 縛 図 竿知 図 竿 ５”ノ 図 竿！２図 竿１３ 図 竿ｒ！図 第 イ そ 図 に そ ６゜ 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ムテイ
   ン。 （２）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠損
   している請求項１記載のムテイン。 （３）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が別の
   アミノ酸で置換されている請求項１記載のムテイン。 （４）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります。】 を含むポリペプチドである請求項１記載のムテイン。 （５）、ｂＦＧＦ構成アミノ酸がシステインである請求
   項３記載のムテイン。 （６）、別のアミノ酸が中性アミノ酸である請求項３記
   載のムテイン。 （７）、少なくとも１個の構成アミノ酸であるシステイ
   ンがセリンに置換されている請求項１記載のムテイン。 （８）、置換される元の構成アミノ酸がアスパラギン酸
   、アルギニン、グリシン、セリンおよび／またはバリン
   である請求項３記載のムテイン。 （９）、少なくとも１個のＮ末端構成アミノ酸が欠損し
   ている請求項２記載のムテイン。（１０）、少なくとも
   １個のＣ末端構成アミノ酸が欠損している請求項２記載
   のムテイン。 （１１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ムテ
   インをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ。 （１２）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠
   損している請求項１１記載の組換えＤＮＡ。 （１３）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が別
   のアミノ酸で置換されている請求項１１記載の組換えＤ
   ＮＡ。 （１４）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります。】 を含むポリペプチドである請求項１１記載の組換えＤＮ
   Ａ。 （１５）、ｂＦＧＦ構成アミノ酸がシステインである請
   求項１３記載の組換えＤＮＡ。 （１６）、別のアミノ酸が中性アミノ酸である請求項１
   ３記載の組換えＤＮＡ。 （１７）、少なくとも１個の構成アミノ酸であるシステ
   インがセリンに置換されている請求項１１記載の組換え
   ＤＮＡ。 （１８）、置換される元の構成アミノ酸がアスパラギン
   酸、アルギニン、グリシン、セリンおよび／またはバリ
   ンである請求項１３記載の組換えＤＮＡ。 （１９）、少なくとも１個のＮ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項１２記載の組換えＤＮＡ。 （２０）、少なくとも１個のＣ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項１２記載の組換えＤＮＡ。 （２１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ムテ
   インをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含む
   ベクターを保持する形質転換体。 （２２）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠
   損している請求項２１記載の形質転換体。 （２３）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が別
   のアミノ酸で置換されている請求項２１記載の形質転換
   体。 （２４）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります。】 を含むポリペプチドである請求項２１記載の形質転換体
   。 （２５）、ｂＦＧＦ構成アミノ酸がシステインである請
   求項２３記載の形質転換体。 （２６）、別のアミノ酸が中性アミノ酸である請求項２
   ３記載の形質転換体。 （２７）、少なくとも１個の構成アミノ酸であるシステ
   インがセリンに置換されている請求項２１記載の形質転
   換体。 （２８）、置換される元の構成アミノ酸がアスパラギン
   酸、アルギニン、グリシン、セリンおよび／またはバリ
   ンである請求項２３記載の形質転換体。 （２９）、少なくとも１個のＮ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項２２記載の形質転換体。 （３０）、少なくとも１個のＣ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項２２記載の形質転換体。 （３１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ムテ
   インをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含む
   ベクターを保持する形質転換体を培地に培養し、培養物
   中に該ムテインを生成蓄積せしめることを特徴とする該
   ムテインの製造法。 （３２）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が欠
   損している請求項３１記載の製造法。 （３３）、少なくとも１個のｂＦＧＦ構成アミノ酸が別
   のアミノ酸で置換されている請求項３１記載の製造法。 （３４）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります。】 を含むポリペプチドである請求項３１記載の製造法。 （３５）、ｂＦＧＦ構成アミノ酸がシステインである請
   求項３３記載の製造法。 （３６）、別のアミノ酸が中性アミノ酸である請求項３
   ３記載の製造法。 （３７）、少なくとも１個の構成アミノ酸であるシステ
   インがセリンに置換されている請求項３１記載の製造法
   。 （３８）、置換される元の構成アミノ酸がアスパラギン
   酸、アルギニン、グリシン、セリンおよび／またはバリ
   ンである請求項３３記載の製造法。 （３９）、少なくとも１個のＮ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項３２記載の製造法。 （４０）、少なくとも１個のＣ末端構成アミノ酸が欠損
   している請求項３２記載の製造法。