HUT62328A - Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants - Google Patents

Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants Download PDF

Info

Publication number
HUT62328A
HUT62328A HU913724A HU372491A HUT62328A HU T62328 A HUT62328 A HU T62328A HU 913724 A HU913724 A HU 913724A HU 372491 A HU372491 A HU 372491A HU T62328 A HUT62328 A HU T62328A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
somatotropin
mutation
leu
helix
ctg
Prior art date
Application number
HU913724A
Other languages
English (en)
Other versions
HU913724D0 (en
Inventor
Deborah Tardy Chaleff
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of HU913724D0 publication Critical patent/HU913724D0/hu
Publication of HUT62328A publication Critical patent/HUT62328A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány olyan szomatotropin-analógokra vonatkozik, amelyek a szomatotropin a-hélix 3 és/vagy a-hélix 2 szakaszában más aminosav(ak)at tartalmaznak, mint a természetes szomatotropin, és eljárásokra, amelyek segítségével a rekombináns-technikával előállított polipeptidek vagy proteinek a-hélix 3, valamint egyéb régióiban ilyen aminosav-cserék előidézhetők. Exogén szomatotropin-adagolással különféle állatfajták, különösen a haszonállatok, például sertés, de bizonyos halfajták fejlődése is jelentősen fokozható. Az állatállomány e fokozott fejlődését rendszerint az izomtömeg-gyarapodás fokozódása jellemzi, a zsír egyidejű csökkenésével, amelynek következtében az állatok nagyobbak és soványabbak lesznek. Az exogén szomatotropinnal kezelt állatok takarmányhasznosítása is jelentősen fokozódik, ami a tömeggyarapodás növekedéséből és ezzel egyidejűleg a takarmányfogyasztás csökkenéséből adódik.
A szomatotropin exogén adagolása különféle módokon valósítható meg, például naponta injekciózással. Bizonyos esetekben azonban mésféle adagolási módok előnyösek. Bizonyos állatok kezelésére célszerű lehet például egy beültetett eszköz, amely meghatározott időtartamon keresztül biztosítja a szomatotropin nyújtott felszabadulását. Az adagolás még előnyösebb módja olyan implantált eszközzel valósítható meg, amely meghatározott időtartamon keresztül nyújt lassú hatóanyagfelszabadulást. Az ilyen eszköz igen nagy mennyiségű szomatotropint tartalmazhat, igen nagy koncentrációban (mintegy 500 mg/ml). Az ilyen adagolási módhoz olyan szomatotropin molekula szükséges, amelynek nagy az oldhatósága, és kevéssé hajlamos oldhatatlan, biológiailag inaktív aggregátumok képzésére.
A szomatotropinok négy α-hélixet tartalmaznak, amelyek együtt α-hélix-köteget alkotnak [Abdel-Meguid és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84., 6434-6437 (1987)]. A feltételezések szerint a fenti szerkezet magjában lévő aminosav-oldalláncok apolárosak, hidrofóbok és tömör elrendeződésűek, ezáltal megakadályozzák egy poláros oldószer (például víz vagy sóoldat) bejutását a köteg közepébe . A marha-szomatotropin esetében - amely elsődleges szekvenciáját tekintve a sertés-szomatotropinhoz hasonló - az a-hélix 3 hidrofób felületét (tyr^Q - leu^27 aminosavmaradékok) 1 mg/ml-t meghaladó protein-koncentrációnak kitéve előtérbe kerül az asszociatív intermedierek kialakulása, amely az aggregátum-képződésben feltételezetten a mag kialakulásnak egyik lépése [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986); és Brems, Biochemistry 27, 4541-4546 (1988)]. Ezek az asszociatív intermedierek az egyes szomatotropin molekulákból származó α-hélixek multimer szerkezetet eredményező réteges burkolat elrendeződését képviselhetik, amelyben a fenti hélix hidrofób felületei a vizes környezettől elzáródnak. Az asszociatív intermedierek kialakulása a-hélix 3tartalmú protein-fragmens feleslegének hozzáadásával megakadályozható [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986)]. Továbbá, a fenti hélix hidrofób felületének növelése a 112-es helyzetű lizin leucinra való cseréjével erősen erősen fokozza az asszociatív intermedierek kialakulásának tendenciáját [Brems, Biochemistry 27, 4541-4546 (1988)].
A találmány célja a szomatotropinok oldhatóságának javítása volt, a szomatotropinok a-hélix 3 régióinak megváltoztatásával. Közelebbről, in vitro fokozott oldat-stabilitású sertés-szomatotropinokat állítunk elő az a-hélix 3 hely-irányított mutagenezisével. A mutagenezis helye mind a hidrofób, mind a hidrofil felület lehet. A marha-szomatotropin a-hélix 3 régiójában újabban végrehajtott hely-irányított mutációk a mutáns szomatotropint expresszáló transzgén egerek növekedésgátlását eredményezték, amiből arra lehet következtetni, hogy az a-hélix 3 régió a biológiai aktivitás szempontjából fontos régió [Chen W.Y. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5061-5065 (1990)].
Ezenkívül kívánt esetben az a-hélix 3 mutációkat a hélix 1 vagy 2 régiójában végrehajtott mutációkkal és a DNSben a 183. és 191. helyzetű ciszteint kódoló kodonok kettős mutációjával kombináljuk, amikoris a cisztein kodonját az alanin vagy a glutaminsav kodonjával helyettesítjük. A 183. és 191. helyzetben végrehajtott kettős mutációkat ismerteti az EP 355 460 számú szabadalmi leírás. Az itt ismertetett mutációk alkalmazásával fokozott oldhatóságú (stabilitású) szomatotropinok állíthatók elő, amelyek ezáltal a nyújtott hatóanyagfelszabadulás szempontjából jobb tulajdonságokkal rendelkeznek. A sertés-szomatotropin különösen hasznos nyújtott hatóanyagfelszabadulást biztosító formában, ezért ez a szomatotropin áll az érdeklődés középpontjában.
A találmány szerinti mutációk különösen hasznos példája az I122L mutáció, amelyben az a-hélix 122. helyzetében
• · lévő izoleucint leucinnal helyettesítjük. A 183. és 191. helyzetben végrehajtott mutációkkal kombinálva, amikoris a ciszteineket alaninnal helyettesítjük, jelentős növekedést érünk el a protein egyetlen triptofán-maradékának átmeneti hőmérsékletében. Az átmeneti hőmérséklet a protein hőstabilitásának mértéke. Az egyik legelőnyösebb mutációval fokozott oldat-stabilitást érünk el akkor, ha az I122L mutációt olyan mutációkkal kombináljuk, amikor a cisztein-kodonokat a 183 és 191 helyzetben glutaminsav-kodonokkal helyettesítjük.
Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük.
1. ábra: Rekombináns sertés-szomatotropin (rpST) DNS restrikciós térképe
A széles, megszakítás nélküli vonal a rpST DNS aminosav-kódoló régióját jelenti; a keskeny vonal jelenti az 5’- és 31-végen a nem-kódoló DNS-szekvenciát. A hely-irányított mutagenezisnek alávetett rpST-gén régiókat beszámoztuk és megjelöltük a restrikciós térképen, 1 jelenti az α-hélix 1-et kódoló DNS-t, 2 az α-hélix 2-t kódoló DNS-t, 3 az α-hélix 3-at kódoló DNS-t és 4 a 183. és 191. helyzetben (kis hurokban) lévő ciszteint kódoló DNS-t.
A térkép feletti betűk jelölik a különféle restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek elhelyezkedését,
Rí jelentése EcoRI,
B jelentése BssHII,
X jelentése Xbal,
N jelentése Ndel,
S jelentése SacI, Sm jelentése Smal és
H jelentése Hindin.
2. ábra: pEFF-902 plazmid szerkezete és restrikciós térképe
Ez a plazmid tartalmazza a pBR322 replikációs origót (Őri) és ampicillin-rezisztencia gént, Pl promotert, a lambda-bakteriofágból a cll riboszóma-kötőhelyet és a cl represszor gént, az E. coli rrnB operonból a T3T2 transzkripciós terminátort, egy bázispárból álló, promoterek nélküli szekvenciát a deo regulátor régióból és az rpST gént, amelynek rövidítése pGH. A megfelelő restrikciós helyeket megjelöltük. Az rpST-t tartalmazó DNS-t ebből a plazmimdból vágjuk ki EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel végzett kezeléssel, és pGEM3z(f+) mutagén vektorba klónozzuk, az alábbiakban ismertetett módon.
3. ábra: pGHGEM3Z szerkezete és részleges restrikciós térké- pe
Ez a fagmid tartalmazza az fi DNS replikációs origót, a pBR322 replikációs origót (Őri) és ampicillin-rezisztencia gént, az SP6 és T7 promotereket, a lambda-bakteriofágból a lacZ gén cll riboszóma kötőhelyet és az rpST gént, amelynek rövidítése rpGH. Egyszálú fagmid DNS-t alkalmazunk templátként a hely-irányított mutagenezisben, az alábbiakban ismeretetett módon.
4. ábra: pROpST bakteriális expressziós vektor alkalmazása rekombináns sertés-szomatotropinok előállítására baktériumokban (E. coli)
A cll riboszóma-kötőhely az EcoRI és Ndel restrik- Ί ciós helyek között helyezkedik el. Az rpST transzlációs iniciáló kodonja az Ndel helybe van beágyazva. Az expressziót a Pl promoter segíti elő.
5. ábra: YEp352-pST-I122L élesztő expressziós plazmid szer- kezete
Ez a plazmid az YEp352 származéka, és az I122L mutációt tartalmazza, amelynek expresszióját a S. cerevisiae-ből származó, indukálható GAL1/GAL10 promoter segíti elő. A 3' nem-transzlatált DNS az élesztő STE génből származik. A 2 /xm-es elem segíti a plazmid-replikációt élesztőben, és az URA3 szelektív markert szolgáltat a transzformáns kiválasztására élesztőben. A plazmid tartalmazza a pBR322 replikációs origót (nincs bejelölve), és az ampicillin-rezisztencia gént is.
6. ábra: Rekombináns sertés-szomatotropin aminosav-szekven- ciája és a kódoló DNS-szekvencia
A találmány a szomatotropin molekula a-hélix 3 és/ /vagy a-hélix 2 régióiban megváltozott aminosav-szekvenciát tartalmazó szomatotropinokra vonatkozik. A találmány szerinti szomatotropin stabilabb (oldhatóbb), mint a szomatotropin natív formája, és biológiai aktivitását megtartja, ha a szomatotropint nyújtott hatóanyagleadású készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti szomatotropinok közelebbről humán-, marha-, sertés-, juh-, kecske-, ló-, hal- és szárnyas-szomatotropinok lehetnek. Szomatotropin alatt minden olyan szomatotropint értünk, amely a natív szomatotropin molekula egyéb részeiben aminosav-deléciót, -addíciót vagy
-cserét tartalmaz. Ilyenek például azok a módosított (szubsztituált vagy eliminált ciszteinek) vagy derivatizált szomatotropinok, amelyekben a cisztein-maradékok közül 1-4 az alábbi aminosavakból származó maradék(ok)kai van(nak) helyettesítve: arginin, lizin, aszparaginsav, glutaminsav, aszparagin, glutamin, hisztidin, alanin, glicin, izoleucin, leucin, valin, fenilalanin, triptofán, tirozin, metionin, szerin, treonin vagy prolin; vagy amelyekben mind a négy cisztein ciszteinsavvá van alakítva.
A találmány egyik célja tehát olyan új szomatotropinok előállítása volt, amelyek oldhatóbbak, mint a molekula natív formája, és így biológiailag hatásosak, ha gyógyászati készítménnyé, előnyösen nyújtott hatőanyagleadású készítménnyé alakítjuk. A találmány további célja hely-irányított mutációs technikák kidolgozása volt a találmány szerinti szomatotropinok, valamint egyéb, rekombináns úton előállított polipeptidek és/vagy proteinek előállítására. A találmány e további céljai a leírás alábbi részeiből világosan kitűnnek.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott plazmidok, DNS-szekvenciák és mikroorganizmusok az American Cyanamid Company törzsgyűjteményében (Princeton, New Jersey), és a Budapesti Szerződés értelmében az American Type Culture Collection-ben (ATCC) (Rockville, Maryland 20952, USA) is letétbe vannak helyezve, ha azt másként nem jelezzük.
Az alábbi DNS-eket 1988. augusztus 23-án helyeztük letétbe az ATCC-ben: pGEMpST-SX (ATCC 40482), pRO211 (ATCC 40483) és pEFF-902 (ATCC 40484). Szakemberek számára nyíl-
• · ·
- 9 vánvaló, hogy ezek a DNS-ek bármely megfelelő expressziós rendszerbe beépíthetők a találmány szerinti szomatotropinok vagy mutánsaik előállítására.
A találmány szerinti új állati szomatotropinok egy részét expresszáló E. coli K12 baktériumtörzseket szintén 1988. augusztus 23-án helyeztük letétbe az ATCC-ben. Ezek a baktériumtörzsek az alábbiak: E. coli 1655 (ATCC 67762), 1655/pROpSTA34 (ATCC 67763) 1655/pROpSTE34 (ATCC 67764) k655/pROpST (ATCC 67765), 4200 (ATCC 67766), 4200/pROpSTA34 (ATCC 67767), 4200/pROpSTE34 (ATCC 67768), 420/pROpST (ATCC 67769), 4255 (ATCC 67770), 4255/pROpSTA34 (ATCC 67771), 4255/pROpSTE34 (ATCC 67772), 4255/pROpST (ATCC 67773) és 4300 (ATCC 67774).
Az alábbi E. coli K12 törzseket szintén letétbe helyeztük az ATCC-nél 1990. szeptember 21-én: pROpST-SXE-Q21HH22R (ATCC 68410), pROpST-XSE-G121A (ATCC 68411), pROpST-XSE-A6TSHR (ATCC 68412), pROpST-SXA-S81,87L+I122L (ATCC 68413), pROpST-SXA-S81,87L (ATCC 68414), pROpST-SXA-L82,84Q+L115K (ATCC 68415), pROpST-SXA-L82,84Q (ATCC 68416), pROpST-SXE-I122L (ATCC 68417), pROpST-SXA-I122L (ATCC 68418), pST-SX (ATCC 68419), pROpST-SXA-L118E (ATCC 68420), pROpST-SXA-E119LQ123L (ATCC 68421), pROpST-SXA-I122E (ATCC 68422), pROpST-SXA-M126A (ATCC 68423) és pROpST-SXEA6TS11R+I122L (ATCC 68424) .
A találmány szerinti állati szomatotropinokat hely-irányított mutagenezissei állítjuk elő, de más módon is előállíthatjuk ezeket, például a peptidek és/vagy proteinek kémiai szintézisével. A DNS klónozott szegmensében lévő DNS10 • · · · ι· • · « «·« Ht · • · · · · · ·· '* «· ·«·
-szekvencia megváltoztatásához egy meghatározott helyen a jelenleg alkalmazott technikák szerint elő kell állítani ennek a DNS-nek az egyszálú formáját. Az egyszálú DNS-t egy szintetikus oligonukleotidhoz kapcsoljuk, amely ennek a DNS-nek egy részével komplementer, azzal az eltéréssel, hogy az oligonukleotidban van hibás párosítású régió is. Az nem oda illő régió rendszerint az oligonukleotid központi részében helyezkedik el. Bizonyos esetekben az oligonukleotid tartalmaz egy restrikciós endonukleáz felismerő helyet is a mutáció helyén, vagy annak közelében. A kapcsolt elegyet ezután kettős szálúvá alakítjuk és E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmense és dezoxinukleotid-trifoszfát hozzáadásával, T4 DNS-ligáz és adenozin-5'-foszfát jelenlében kovalensen zárjuk. A kettős szálú DNS-t ezután megfelelő E. coli törzsbe transzformáljuk, amely a DNS hibás párosítású régióját kijavítja és a DNS-t replikáija.
Két klón-populációt kapunk. Attól függően, hogy a javító (repair) szintézisben melyik szál szerepel templátként, a klón vagy a vad típust, vagy a megváltozott (mutáns) szekvenciát tartalmazza. Az oligonukleotid szekvenciájának megfelelő mutáns szekvenciát tartalmazó kiónokat a radioaktívan jelzett oligonukleotidokkal való hibridizálással szelektáljuk. Az oligonukleotid és a vad típusú szekvencia közötti hibás párosodás következtében a radioaktívan jelzett oligonukleotidok stabilabban kötődnek a mutáns szekvenciát tartalmazó kiónokhoz. Ezért megfeleleő hőmársékleten végzett inkubálás segítségével a vad típusú és a mutáns kiónok megkülönböztethetőek. Abban az esetben, ha az oligonukleotid
egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet is tartalmaz, a vizsgált kiónokat olyan endonukleázzal emésztve, amelyet ez a hely felismer, kiválaszthatjuk azokat a kiónokat, amelyek a mutáns szekvenciát tartalmazzák, ami újabb eszközt jelent a vad típusú és mutáns kiónok megkülönböztetésére. Az azonosított kiónokban bekövetkezett változásokat ezután az érintett régiók DNS-szekvenálásával erősíthetjük meg.
A kívánt mutáció(ka)t tartalmazó plazmid kiónok restrikciós fragmenseit ezután standard szubklónozási eljárásokkal expressziós plazmidokká alakítjuk, amelyek alkalmasak a mutáns gén termék expresszálására vagy baktériumban, vagy élesztőben (de mindkettőben nem).
A találmány szerinti módosított rekombináns szomatotropinok képviselőjeként a rekombináns sertés-szomatotropint (rpST), valamint az ennek előállítására szolgáló eljárást ismertetjük részletesen az alábbiakban, természetesen a korlátozás szándéka nélkül.
A rekombináns sertés-szomatotropin aminosav-szekvenciája és a kódoló DNS-szekvencia a 6. ábrán látható.
A legelőnyösebb sertés-szomatotropin 193 aminosavat tartalmazó polipeptid, amelyben az amino-terminális úgy van módosítva, hogy 3 további aminosavat (met, asp, gin) tartalmaz, és a hipofízis-eredetű sertés-szomatotropin bizonyos érett formáiból az első aminosav (ala) hiányzik. A találmány tárgyát képezik azonban a 191 aminosavból álló pST, valamint ennek egyéb származékai, például az NH^-végen végrehajtott delécióval vagy addícióval és/vagy a COOH-végen végrehajtott delécióval és/vagy addícióval nyert szomatotropinok is.
» ♦ ··· ·_ _ ___ '*'*** · · *· ·· ·»
- 12 Rekombináns pST: NH2-met-asp-gln-phe-pro-ala-185 aminosav-ala-phe-COOH hipofízis pST: NH2-ala-phe-prokala-185 aminosav-ala-phe-COOH
Ez a módosítás tisztán két aminosavval való növekedést jelent a rekombináns pST proteinben és az EP 355460 számú szabadalmi leírásban van ismertetve. A rekombináns sertés-szomatotropin mutagén származékainak elnevezésére alkalmazott számozási rendszer tükrözi ezt a növekedést, és szakember számára könnyen alkalmazható.
pGEMpST-SX DNS előállítása
Az összes mutagenezis reakcióban templát-DNS-ként használt egyszálú pGEMpST-SX DNS-t pGHGEM3Z DNS-ből állítjuk elő, hely-irányított mutagenezissel. A sertés-szomatotropin (rpST) gént pGEM-3z(f+) fagmidba klónozva pGHGEM3Z-t kapunk, az alábbi általános eljárás szerint. A sertés-szomatotropin (rpST) gént tartalmazó pGHGEM3Z DNS-fragmenst a pEFF-902 bakteriális expressziós plazmidból izoláljuk, EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel végzett hasítással (1. ábra). Az rpST-gént tartalmazó fragmenst ezután agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. A kettős szálú pGEM-3z(f+) fagmid-DNS-t EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, borjúbél EcoRI lúgos foszfatázzal kezeljük és a nagy fragmenst agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. A két tisztított fragmenst ezután összekeverjük és T4 DNS-ligázzal ligáijuk. Az elegyet baktériumokba transzformálva számos telepet kapunk. A plazmid DNS-t standard lúgos lizálással állítjuk elő és szerkezetét megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emész13 téssel határozzuk meg. A kívánt fragmenst tartalmazó kiónt izoláljuk és pGHGEM3Z-nek nevezzük.
pGEMpST-SX
Ezzel a mutációval célunk olyan rpST DNS szekvencia előállítása volt, amelyben az a-hélix 2 régiót kódoló DNS-szekvencia az 5'-oldalon (a DNS kódoló régiójának 225-230. helyzete) egy SacI restrikciós hellyel, és a 3'-oldalon (285-290. helyzet) egy Xbal restrikciós hellyel kapcsolódik. A DNS-szekvencia eme változásai nem változtatják meg az rpST protein aminosav-szekvenciáját. A fenti restrikciós endonukleáz hasítási helyek jelenléte egy hélix 2 kazettá-t hoz létre, ezáltal az α-hélix 2-t kódoló DNS-ben bekövetkezett mutációk kényelmesen és gyorsan kombinálhatok az α-hélix 3-at kódoló DNS megfelelő mutációival. A pf pGEMpSTSX szerkesztését az alábbiakban ismertetjük.
A szintetikus SacI293 és XbaI353 oligonukleotidok DNS-szekvenciája az 1. táblázatban található. A mutagenezis szubsztrátja az egyszálú pGHGEM3Z DNS, amelyet tisztított fágból állítunk elő standard eljárásokkal. 2000 ng fenti DNS-t 100 ng SacI293 és 100 ng XbaI353 oligonukleotiddal elegyítünk, amelyeket 5'-végükön adenozin-5'-trifoszfáttal és T4 polinukleotid-kinázzal foszforileztünk. Az elegyet 10 pl végtérfogatban tartalmazza az lxillesztő puffer (lxillesztő puffer összetétele: 75 mmól/1 KC1 és 5 mmól/1 Tris-HCl, pH 8,0). Az elegyet 65 °C-on 7 percen keresztül melegítjük, majd 10 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ez az eljárás lehetővé teszi azt, hogy az oligonukleotidok az egyszálú szubsztrát (templát) DNS-hez illeszkedjenek. A hoz záillesztett molekulákat betöltjük és kovalensen zárt, kettős szálú DNS-sé alakítjuk 22 μΐ H2O, 1 μΐ 20 mmól/1 koncentrációjú ATP, 2 egység T4 DNS-ligáz és 2 egység DNS-polimeráz I nagy fragmens [az egységek definíciója a New England Biolabs katalógusban (1989) található], 2 μΐ 20xdNTP (a négy dezoxiribonukleotid-5'-trifoszfát elegye, az egyes komponensek koncentrációja 2 mmól/1) és 4 μΐ lOx betöltő puffer (lxbetöltő puffer összetétele: 27,5 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5, 15 mmól/1 MgCl2, 2 mmól/1 DTT). Az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd a reakcióelegy felét ismert módon HB101 kompetens sejtekbe visszük. 37 °C-on egy éjszakán keresztül tartó inkubálás után láthatóvá válnak az egyes telepek. 24 telepből ismert eljárással plazmid DNS-t állítunk elő, és külön-külön SacI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Azokat a plazmid-DNS-eket, amelyek mindkét restrikciós helyet tartalmazzák - ami azt jelenti, hogy mind a SacI293, mind az XbaI353 oligonukleotid beépült az rpST génbe - HB101 kompetens sejtekbe való bevezetéssel a fent leírtak szerint tovább tisztítjuk. A plazmid DNS-t preparáljuk és a plazmid DNS-ben az egyes restrikciós helyek jelenlétének igazolására külön-külön Sacl-gyel és Xbal-gyel emésztjük, majd az rpST DNS megfelelő régióinak DNS-szekvencia-analízisével megerősítjük az eredményt.
1. táblázat: Mutagén oligonukleotidok
Név Szekvencia (5*-3') Mutáció
Sacl293 GACGTGGAGCTCCTGCGCTTCTCG hélix 2 kazetta
XbsI353 CAGTTCCTCTCTAGAGTCTTCACC hélix 2 kazetta
S81L TGCGCTTCTTGCTGCTGC S81,87L
S87L TCATCCAGTTGTGGCTCG S81,87L
Q8082 TGCGCTTCTCGCAGCTGCAGAT L82,84Q
CCAGTCGTGG
Q8082D TTCTCGCAGCTGCAGATGCAGT L82,84Q detektálási
próba
K113 CTACGAGAAGAAGAAGGACCTG L115K
E116 GCTGAAGGACGAGGAGGAGGGC L118E
K113E115 GTCTACGAGAAGAAGAAGGACG L115KL118E
AGGAGGAGGGCAT
K113E116D AGAAGAAGAAGGACGAGGAGGA K113E116 próba
E116K120 AAGCTGAAGGACGAGGAGGAGG L118EI122K
GCAAGCAGGCCCTGATG
E120 GGAGGAGGGCGAGCAGGCCCTG I112E
L120-3 GGAGGAGGGCCTGCAGGCCCTG I122L
A124-2 CAGGCCCTGGCACGGGAGCTGG M126A
E113EHD0116 CGCGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC(GC) L115E
A(GC)GAGGAGGGCATCCAG
E113D CGTCTACGAGAAGGAGAAGGAC L115E konstrukciós
próba
L115A CTACGAGAAGGCGAAGGACCTG
L118A GCTGAAGGACGCGGAGGAGGGC
1. táblázat (folytatás)
Név Szekvencia (5*—3*) Mutáció
L118TK CTGAAGGACA(CA)AGAGGAGGGCAT L118K
L118T CTGAAGGACACTGAGGAGGGC L118T
L117,121 GAAGGACCTGCTGGAGGGCAT E119LQ123L
CCTGGCCCTGATG
Leull7121D CCTGCTGGAGGGCATCCTGGCC E119LQ123L próba
K114R/ACC1 GACCGCGTATACGAGCGTCTGAAGGA K114R
G121A/Xmnl CTGGAGGAAGCTATTCAGGCCCTG G121A
K116R/BglII AGAAGCTGCGAGATCTGGAGGA K116R
A14D/Hindlii CCTTGTCAAGCTTATTTGACAACGCCG A14D
A6T TCAATTCCCAACCATGC A6T
S11RA14D/Sal ATGCCCTTGAGTCGACTAT S11RA14D
TTGACAACGCC
G21HH22R/Clal CCGGGCCCATCGATTGCACCAA Q21HH22R
PVUI1634 AGAAGGCAGAGCTGCTGTCCAC H22LpcR
Mutációk előállítása az α-hélix 1, 2 vagy 3 régióban
A pGEMpST-SX-ben lévő rpST gén mutagenezisét az alábbiak szerint végezzük. A mutagenezis célja olyan rpST molekula előállítása, amely kevésbé hajlamos aggregálódásra nagy (>100 mg/ml) protein-koncentrációk esetén. A célzott hely az a-hélix 3 régió hidrofób felülete, a 112-129. aminosav-maradékokat tartalmazó szakasz, amely feltételezetten kritikus az aggregálódási reakció kiváltásában [Brems és munkatársai, Biochemistry 25, 6539-6543 (1986)]. Mivel az • · * • · · * · · ·· · · · · ···
- 17 általunk alkalmazott rpST gén az amino-terminálison két további aminosav-kodont is tartalmaz, az aminosav-maradékok száma összesen 193, szemben a hipofízis-eredetű marha- és sertés-szomatotropinban talált 191 aminosav-maradékkal. A 112-129. maradékok a marha-szomatotropin 110-127. maradékának felelnek meg [Abdel-Meguid és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 6434-6437 (1987)]. A mutagenezis egyéb célzott régiói a molekulában az a-hélix 2 81-87. aminosav-maradéka, az a-hélix 3 hidrofil felülete és az α-hélix 1
6-11. aminosav-maradéka. A kombinált mutánsokat több lépésben kivitelezett mutagenezissel, vagy a megfelelő régiók szubklónozásával állítjuk elő. Az alábbiakban ismertetjük az L118E mutáció végrehajtására szolgáló alap-eljárást, és a többiek példáit. Az alap-eljárás különféle módosításait a megfelelő példákban adjuk meg.
Az egyszálú pGEMpST-SX szubsztrát DNS-t ugyanúgy állítjuk elő, mint a pGHGEM3Z-t. Az L118E mutáció létrehozásában alkalmazott szintetikus mutagén oligonukleotidot - amelynek DNS-szekvenciáját (E116) az 1. táblázat tartalmazza - az 5'-végen foszforilezzük, a SacI293-ra ismertetett módon. Az illesztési és betöltési reakciót is ugyanúgy hajtjuk végre, mint ahogy azt a pGHGEM3Z SacI293 mutagenezisére leírtuk. Miután a reakcióelegy felét HB101 kompetens sejtekbe bevittük és egy éjszakén keresztül 37 °C-on inkubáltuk, a kapott telepeket nitro-cellulóz szűrőkre visszük át és standard módszerekkel elvégezzük a hibridizálást. Az 5'-végen r-32p-ATP-vel és polinukleotid-kinázzal radioaktívan jelzett E116 oligonukleotidokat a mutáció detektálására is használ• · · • ·
- 18 juk. A hibridizálást egy éjszakén keresztül 37 °C-on végezzük, 5xSSC-ben (lxSSC összetétele: 0,15 mól/1 nátrium-klorid, 0,015 mól/1 nátrium-citrát, pH 7,0), lxDenhardt-oldat [0,02 vegyes% Ficoll, 0,02 vegyes% marha-szérumalbumin és 0,02 vegyes% poli (vinil-pirrolidon) ], 150 /xg/ml élesztő-tRNS és a radioaktívan jelzett próba jelenlétében.
A hibridizálás befejezése után a szűrőket legalább percen keresztül 37 °C-on 5xSSC-vel, majd kétszer 30 percen keresztül TAC-vel [TAC összetétele: 3 mól/1 tetrametil-ammónium-klorid, 50 mmól/1 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán pH 8,0, 1 mmól/1 EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), 0,1 vegyes% nátrium-dodecil-szulfát] mossuk a kívánt hőmérsékleten. Az utóbbi mosás inkubációs hőmérséklete meghatározza a specificitást, mivel az E116 oligonukleotid csak a teljesen komplementer klónokkal marad hibridizálva. Az E116 oligonukleotidok esetén a hőmérséklet 59,0 °C. Röntgenfilmes előhívással csak azok a kiónok válnak láthatóvá, amelyek az E116-tal teljesen komplementerek. Az így kapott több pozitív klónból preparáljuk a plazmid-DNS-t, újra HB101 sejtekbe visszük, és a fent ismertetett módon újra alávetjük a szűrővizsgálatnak. A második szűrővizsgálat után pozitívnak bizonyult több klónból preparáljuk a plazmid DNS-t, és szekvenciáját DNS-szekvencia-analízissel meghatározzuk; ily módon egyértelműen azonosítjuk az L118E mutációt tartalmazó DNS-eket. A fenti mutációt hordozó plazmidot pGEMpST-SX-L118E-nek nevezzük.
Az L118E mutációt tartalmazó rpST gén kiónokat kétféle expressziós vektorba, a pROpST-SX és pROpST-SXA vektor19 ba transzformáljuk, az alább ismertetett módon. Ezzel az a célunk, hogy a SacI és Xbal restrikciós helyekkel rendelkező a-hélix 2 kazettát tartalmazó rpST gént az rpST gén E. coliban való expresszálására alkalmas plazmid vektorba beépítsük. Másik célunk az volt, hogy a találmány szerinti mutációkat az rpST két különböző genetikai hordozójába is beépítsük. Az egyik természetes (vad) típus, mivel a 183. és 191. helyzetű cisztein-maradékok közül mindkettőt tartalmazza. A másik rpST gén alanint kódol cisztein helyett ugyanezekben a helyzetekben, és az EP 255460 számú szabadalmi leírásban ismertetik. A pROpSTA34 plazmid (4. ábra) a pRO211 expressziós plazmidba klónozva tartalmaz egy EcoRI/HindlII fragmenst. Ez az EcoRI/HindlII fragmens egy mutáns rpST gént hordoz, amelyben a 183. és 191. helyzetű ciszteinek kodonjai ezekben a helyzetekben az alanin kodonjára vannak kicserélve. így ez a gén ala,ala mutációkat hordoz. A pROpSTA34 plazmidot egyik reakcióelegyben EcoRI-gyel és HindlII-mal, másik reakcióelegyben EcoRI-gyel és Smal-gyel emésztjük. A vektort tartalmazó nagy fragmenst mindkét reakcióelegyből agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. Az a-hélix 2 kazettát egyébként vad típusú rpST génben tartalmazó pROpST-SX plazmidot a pGEMpST-SX-ből származó, tisztított EcoRI/HindlII fragmens ligálásával állítjuk elő. A ligációs elegyet N99cl baktériumtörzsbe visszük be. Ebben a törzsben a Pl promoter által hajtott rpST-expressziót a vad típusú represszor jelenléte gátolja. A kívánt szerkezetű plazmid kiónokat a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel azonosítjuk. A a-hélix 2 kazettát mutáns rpST génben tartalmazó pROpST-SXA plazmidot a pROpSTA34-ből tisztított EcoRI/Smal vektor fragmens és a pMEGpST-SX-ből tisztított EcoRI/Smal fragmens ligálásával állítjuk elő. A ligációs elegyet N99cl baktériumtörzsbe vezetjük és a kapott plazmid kiónokat a megfelelő restrikciós enzimekkel emésztve azonosítjuk a kívánt plazmid kiónokat.
Az L118E mutációt pROpST-SX és pROpST-SXA expressziós plazmidokba visszük be, oly módon, hogy a pGEMpST-SX-L118E DNS-t egyrészt EcoRI-gyel és HindlII-mal, másrészt EcoRI-gyel és Smal-gyel hasítjuk. Az egyes reakcióelegyekből származó, rpST-t hordozó kis fragmensek tartalmazzák az L118E mutációt, ezeket agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. A pROpST-SX plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk, és a vektort hordozó nagy fragmenst agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a fragmenst a pGEMpST-SX-L118Eből nyert, tisztított EcoRI/HindlII fragmenssel ligáivá kapjuk a pR0pST-SX-L118E plazmidot. A ligációs elegyet hőmérséklet-érzékeny 1 represszort tartalmazó 4300 expressziós törzsbe transzformáljuk. Ezekben a törzsekben az rpST expressziója a hőmérséklettől függ. 42 °C-on a ! represszor inaktív, így a !Pl promoter általi expresszió végbemehet. A pROpST-SX-L118E plazmidot hordozó baktériumtelepeket 42 °C-on rpST proteint termelő képességük alapján azonosítjuk (amely hőmérsékleten a ! represszor nem működik). A pROpST-SXA plazmidot mind az EcoRI, mind az Smal restrikciós enzimmel emésztjük, és a vektor nagy fragmensét agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a fragmenst a pGEMpST-SX-L118E-ből nyert, tisztított EcoRI/Smal fragmenssel ligái♦ ♦ *<· · « « 199 9 ·«· · · 4 · · ··
9 9 9 44
- 21 juk. A ligációs elegyet 4300 expressziós törzsbe transzformáljuk és a pROpST-SXA-L118E plazmidot hordozó baktériumtelepeket 42°C-on rpST proteint termelő képességük alapján azonosítjuk.
1. példa g-Hélix 2 kazetta előállítása két szintetikus oligonukleotid egyidejű alkalmazásával
Ezzel a mutációval olyan rpST DNS-szekvenciát kívántunk létrehozni, amelyben az α-hélix 2-t kódoló DNS-szekvencia az 5'-oldalon (a DNS kódoló régió 225-230. helyzetében) egy SacI restrikciós hellyel, és a 3'-oldalon (a 285-290. helyzetben) egy Xbal restrikciós hellyel kapcsolódik. A DNS-szekvencia fenti változtatásai nem befolyásolják az rpST aminosav-szekvenciáját. A fenti restrikciós endonukleáz hasítási helyek jelenléte miatt egy a-hélix 2 kazetta jön létre, ezáltal az α-hélix 2-t kódoló DNS-ben végrehajtott mutációk gyorsan és célszerűen kombinálhatok az a-hélix 3 régiót kódoló DNS-ben végrehajtott megfelelő mutációkkal. A pGEMpST-SX-et a fent ismertetett módon állítjuk elő.
2. példa
Hidrofób aminosavak helyettesítése az a-hélix 3 régióban a hélixet stabilizáló hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
Ezek a mutációk az alábbiak: L118E, L115K, L115KL118E és L118EI122K. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre. A fenti mutációkat hordozó plazmidok a jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-L118E, pGEMpST-SX-L115K, pGEMpST-SX-L115KL118E és « Λ · » · «·· ·«· ··· • · · · ·
- 22 pGEMpST-SX-L118EI122K.
Az rpST-ben az L115K mutációt az L118E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a K113 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk mind a mutagén, mind a hibridizációs reakcióban. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol.
Az rpST-ben az L115KL118E mutációt az L118E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a K113E116 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk a mutagén reakcióban, és a K113E116D oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) a hibridizációs reakcióban. A K113E116 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol, és a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol. Ez az oligonukleotid így kettős mutációt eredményez az rpST DNS-szekvenciában.
Az rpST-ben az L118EI122K mutációt az L118E mutációval kapcsolatban ismertetett módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy az E116I120 mutagén oligonukleotidot (lásd 1. táblázat) használjuk a hibridizációs reakciókban. Az E116K120 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol, és az izoleucin kodonja a 120. helyzetben ATC-ről AAG-re cserélődik, ami lizint kódol. Ez az oligonukleotid így kettős mutá23 • 4 * »·· • ·* »·4 ·«·* • » t · ··
4« ·· ···· ciót eredményez az rpST DNS-szekvenciában.
3. példa
Hidrofőb aminosavak helyettesítése az a-hélix 3 régióban hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
Ezek a mutációk az alábbiak: I122E, L118T, L118K és L115E. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-I122E, pGEMpST-SX-L118T, pGEMpST-SX-L118K és pGEMpST-SX-L115E. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a mutagén és hibridizációs reakciókban a megfelelő oligonukleotidokat alkalmazzuk, amelyek szekvenciáját az 1. táblázatban ismertetjük.
Az I122E mutációt az E120 mutagén oligonukleotid (1. táblázat) alkalmazásával hozzuk létre. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az izoleucin kodonja a 122. helyzetben ATC-ről GAG-re cserélődik, ami glutaminsavat kódol. Az E120 oligonukleotidot radioaktívan jelzett detektálási próbaként is alkalmazzuk a hibridizációs reakcióban, amely egyébként minden szempontból azonos az L118E-vel kapcsolatban leírtakkal, azzal az eltéréssel, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L118T mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a mind a mutagén, mind a hibridizációs reakcióban L118T oligonukleotidot (1. táblázat) használunk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről ATC-re cserélődik, ami treonint kódol. A kívánt mutációt tartalmazó plazmidokat a mutációt nem hordozó plazmidoktól úgy különböztetjük meg, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L115E mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a a mutagén reakcióban E113EHDQ116 mutagén oligonukleotidot (1. táblázat), a hibridizációs reakcióban E113D oligonukleotidot (1. táblázat) használunk. Az E113EHDQ116 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről GAG-re változik, ami glutaminsavat kódol, és a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről glutamisavat kódoló GAG-ra, aszparaginsavat kódoló GAC-re, hisztidint kódoló CAC-re vagy glutamint kódoló CAG-re változik. A 118. helyzetben bekövetkezett különféle mutációs változások annak következtében jönnek létre, hogy a mutagén oligonukleotid az oligonukleotid szintézise során keletkezett négy oligonukleotid elegye. Az E113D radioaktívan jelzett próbával hibridizáló plazmid kiónok DNS-szekvenciájának meghatározása azt mutatja, hogy ezek tartalmazzák az L115E mutációt, de egyetlen plazmid sem hordozza a 118. helyzet négy lehetséges mutációjának egyikét sem. így ez a mutációs eljárás egyetlen mutációt eredményez a 115. helyzetben.
Az L118K mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mutagén oligonukleotidként L118K oligonukleotidot (1. táblá zat) használunk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről a lizint kódoló AAG-re vagy a treonint kódoló CAG-re cserélődik. A 118. helyzet különféle mutációs lehetőségei azért jöhetnek létre, mert a mutagén oligonukleotid az oligonukleotid szintézise során keletkezett két oligonukleotid elegye. Az L118TK radioaktívan jelzett próbával hibridizáló plazmid kiónok DNS-szekvenciájának meghatározása azt mutatja, hogy ezek tartalmazzák az L115K mutációt, de egyetlen plazmid sem hordozza a 118. helyzet másik lehetséges mutációját, az L118T-t. így ez a mutációs eljárás egyetlen mutációt eredményez a 118. helyzetben.
4. példa
Hidrofil aminosavak helyettesítése az g-hélix régióban hidrofób aminosavakkal, mutagén oligonukleotid alkalmazásával
Ebbe a mutációs csoportba egyetlen kettős mutáns tartozik, az E119LQ123K. A fenti mutációt hordozó plazmid amelynek szerkezetét DNS-szekvenálással megerősítettük - a pGEMpST-SX-E119LQ123L jelölésű plazmid. A fenti kettős mutációt hordozó rpST gént az L118E mutációra leírtakkal azonos módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy az L117,121 mutagén oligonukleotidot (1. táblázat) alkalmazzuk. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glutaminsav kodonja a 119. helyzetben GAG-ről CTG-re cserélődik, ami leucint kódol, és a glutamin kodonja a 123. helyzteben CAG-ről CTG-re cserélődik, ami leucint kódol. A mutagén reakcióban ezt az oligonukelotidot alkalmaz zuk, míg a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként a Leull7121D oligonukleotidot használjuk, amelynek szekvenciáját szintén az 1. táblázat tartalmazza.
A fenti mutáció előidézésére ugyanazokat az eljárásokat alkalmazzuk, mint amelyeket az L118E-vel kapcsolatban fent ismertettünk, azzal az eltéréssel, hogy a nitro-cellulóz szűrőket a mutációt hordozó plazmidok azonosítására TAC pufferrel 58 °C-on inkubáljuk.
5. példa
Az a-hélix 3 nagy oldalláncú apoláros aminosaviainak helyettesítése kis oldalláncú apoláros aminosavakkal Ezek a mutációk az alábbiak: L115A, L118A és M126A.
A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-L115A, pGEMpST-SX-L118A, pGEMpST-SX-M126A. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
Az L115A mutáció létrehozására alkalmazott L115A szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 115. helyzetben CTG-ről az alanint kódoló GCG-re cserélődik. Az L115A oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az L118A mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban L118A oligonukleotidot alkalmazunk mutagén nukleotiáként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az L118A oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 118. helyzetben CTG-ről az alanint kódoló GCG-re cserélődik. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük pGEMpST-SX-L118A plazmidnak jelöljük.
Az M126A mutációt pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban A124-2 oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az A124-2 oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a metionin kodonja a 126. helyzetben ATG-ről az alanint kódoló GCA-ra cserélődik. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-M126A plazmidnak jelöljük.
- 28 6» példa
A 122-es helyzetű izoleucin helyettesítése leucinnal
Ezek a mutációk az alábbiak: I122L, I122LL118A és I122LM126A. A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-I122L, pGEMpST-SX-L122LL118A és pGEMpST-SX—I122LM126A. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
Az L225A mutáció létrehozására alkalmazott L120-3 szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az izoleucin kodonja a 122. helyzetben ATC-ről a leucint kódoló CTG-re cserélődik. Az L120-3 oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk. A kívánt mutációt hordozó plazmidokat úgy különböztetjük meg a mutációt nem hordozó plazmidoktól, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 56 °C-on inkubáljuk.
Az I122LL118A mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/ /szűrő reakcióban L118A oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, és a mutagenezisre templát DNS-ként pGEMpST-SX-I122L-t alkalmazunk. A templát DNS-t a pGEMpST-pST-SX DNS-re leírtak szerint állítjuk elő. A mutációt hordozó plazmidokat a nitro-cellulóz szűrők TAC pufferben, 56 °C-on végzett inkubálásával detektáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-L118AI122L plazmidnak jelöljük.
Az I122LM126A mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/ /szűrő reakcióban A124-2 oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, és a mutagenezisre templát DNS-ként pGEMpST-SX-I122L-t alkalmaazunk. A templát DNS-t a pGEMpST-pST-SX DNS-re leírtak szerint állítjuk elő. A mutációt hordozó plazmidokat a nitro-cellulóz szűrők TAC pufferben, 56 °C-on végzett inkubálásával detektáljuk. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-I122LM126A plazmidnak jelöljük.
7. példa
Aminosav-maradékok helyettesítése az α-hélix hidrofil felületén
Ezek a mutációk az alábbiak: G121A, K114R és K116R.
A fenti mutációkat hordozó plazmidok jelölése az alábbi: pGEMpST-SX-G121A, pGEMpST-SX-K114R és pGEMpST-SX-K116R. A fenti mutációkat pontosan az L118E mutációra ismertetett alapeljárással hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, és adott esetben a TAC-vel végzett mosás hőmérsékletétől.
A G121A mutáció létrehozására alkalmazott G121A/XmnI szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja • ·
- 30 meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glicin kodonja a 121. helyzetben GGC-ről az alanint kódoló GCT-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy XmnI restrikciós felismerési helyet (5'-GAAGCTATTC-31) is bevisz az rpST DNS szekvenciába. A G121A mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosav-szekvenciájában. A G121A/ /XmnI oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk, a hibridizálást egyébként a fent ismertetett módon hajtjuk végre. A kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az XmnI hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidokban jelen van, és így a G121A mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-G121A plazmidnak jelöljük.
A K114R mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban K114R/AccI oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. A K114R/AccI oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a lizin kodonja a 114. helyzetben AAG-ről az arginint kódoló CGT-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy AccI restrikciós felismerési helyet (5'-GT31
ATAC-3') is bevisz az rpST DNS szekvenciába. A K114R mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosav-szekvenciájában. A G121A-hoz hasonlóan a kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az új AccI hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidokban jelen van, és így a K114R mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-K114R plazmidnak jelöljük.
A K116R mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs/szűrő reakcióban K116R/BglII oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. A K116R/BglII oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a lizin kodonja a 116. helyzetben AAG-ről az arginint kódoló CGA-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy BglII restrikciós felismerési helyet (5'-AGATCT-3') is bevisz az rpST DNS szekvenciába, a 342-347. helyzetbe. A K116R mutációtól eltekintve a többi nukleotidcsere nem eredményez változást az rpST protein aminosav-szekvenciájában. A G121A-hoz hasonlóan a kívánt mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 57,5 °C-on inkubáljuk, és az új BglII hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligo- • · 4 ·» · · ··· ··· ··· · • · · · · *
- 32 nukleotidokban jelen van, és így a K116R mutáció plazmidban való jelenlétének kimutatására alkalmas. A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS-szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-K116R plazmidnak jelöljük.
8. példa
Hidrofil aminosav-maradékok helyettesítése hidrofób aminosav-maradékokkal az a-hélix 2 régióban, két szintetikus oliqonukleotid egyidejű alkalmazásával A fenti típusú mutáció az S81,87L kettős mutáció.
A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNSszekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-S81,87L plazmidnak jelöljük.
Az S81,87L kettős mutáns létrehozására alkalmazott S81L és S87L szintetikus mutagén oligonukleotidok szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az S81L és S87L oligonukleotidok annyiban változtatják meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a szerin kodonja a 81. és 87. helyzetben TCG-ről leucint kódoló TTG-re cserélődik. A fenti kettős mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a mutagén reakcióban mind a két mutagén oligonukleotidot egyidejűleg alkalmazzuk. Az S81L oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk, a hibridizálást egyébként az L118E mutáció esetében ismertetett módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a szűrőket TAC pufferben 54 °C-on mossuk. A vélelmezett pozitív, mutációt hordozó plazmid kiónokat tartalmazó transzformált bak• ·<
- 33 tóriumokat szelektáljuk, nitro-cellulóz szűrőre visszük és hibridizáljuk. Ebben a második szűrővizsgálatban az S87L oligonukleotidot használjuk radioaktívan jelzett próbaként, és a szűrőket TAC pufferben 54 °C-on mossuk.
9. példa
Hidrofób aminosav-maradékok helyettesítése hidrofil aminosav-maradékokkal az a-hélix 2 régióban
A fenti típusú mutáció az L82,84Q kettős mutáció.
A fenti mutációt hordozó plazmidot - amelynek szerkezetét DNS -szekvencia-analízissel megerősítettük - pGEMpST-SX-L82,84Q plazmidnak jelöljük.
Az L82,84Q kettős mutáció létrehozására alkalmazott Q8082 szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a leucin kodonja a 82. és 84. helyzetben CTG-ről, illetve CTC-ről glutamint kódoló CAG-re cserélődik. A mutációt hordozó plazmidok detektálására a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 58 °C-on mossuk.
10. példa
Kombinált mutáció létrehozása az α-hélix 2-ben és a-hélix 3-ban
Az a-hélix 3-ban létrehozott I122L, M126A és E119LQ123L mutánsokat, amelyek vagy megtartják (I122L, M126A0) vagy növelik (E119LQ123L) az a-hélix 3 hidrofób felületének hidrofób jellegét, az alábbi szubklónozási reakciókkal kombináljuk az α-hélix 2-ben végrehajtott S81,87L kettős mutációval .
»·♦
- 34 A pGEMpST-SX-S81,87L plazmidot Xbal-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk. A kis fragmenst agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk, ez a fragmens tartalmazza az S81,87L mutációt. A pROpST-SXA-I122L plazmidot is hasítjuk egymás után Xbal-gyel és EcoRl-gyel, és a nagy fragmenst a fentiekhez hasonlóan tisztítjuk. A nagy fragmens hordozza a pROpST expressziós vektor komponenseket, és a pST I122L mutációt, valamint alanin szubsztitúciókat a 183. és 191. helyzetű ciszteinek helyett. Ezt a nagy fragmenst és a kis S81,87L fragmenst T4 DNS-ligáz és ATP jelenlétében összekapcsoljuk. A reakcióelegy felét 4300 expressziós törzsbe visszük, amelyet CaC12~ -os kezeléssel kompetenssé tettünk. A transzformált sejteket egy éjszakán keresztül 30 °C-on tenyésztjük. A plazmidot hordozó sejteket a pST expressziójával mutatjuk ki a 12. példában leírtak szerint; a fenti g-hélix 2/g-hélix 3 kombinációt tartalmazó plazmidokat pROpST-SXA-S81,87L+I122L plazmádnak jelöljük.
A pROpST-SXA-S81,87L+M12A és pROpST-SXA-S81,87L+ +E119LQ123L kombinált mutánsokat a pROpST-SXA-S81,87L+I122L előállítására ismertetett eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hoyg az expressziós vektor komponensek forrásaként pROpST-SXA-M126A illetve pROpST-SXA-E119EQ123L plazmidokat és az g-hélix 3 mutánsokat alkalmazzuk.
Az L82,84Q g-hélix 2 mutációt az L115K g-hélix 3 mutációval az S81,87L+I122L mutációra leírtak szerint kombináljuk, azzal az eltéréssel, hogy g-hélix 2 mutáns DNS forrásként pGEMpST-SXA-82,84Q plazmidot, és g-hélix 3 L115K mutáns forrásként pROpST-SXA-L115K plazmidot alkalmazunk. A • 49
- 35 fenti kombinációt tartalmazó plazmidot pROpST-SXA-L82,84Q+ +L115K plazmidnak jelöljük.
11. példa
Hidrofőb aminosavak helyettesítése az α-hélix 1 régióban vagy annak közelében hidrofil aminosavakkal, mutagén oligonukleotidok alkalmazásával
A fenti mutációk célja az rpST amino-terminális részében található hidrofób aminosav-maradékok helyettesítése olyan hidrofil aminosav-maradékokkal, amelyek a humán növekedési hormonban hasonló relatív helyzetben vannak jelen.
Az rpST fenti mutációi az alábbiak: Q21HH22R kettős mutáció, S11RA14D kettős mutáció, illetve A6T és A14D szimpla mutációk. A fenti mutációkat hordozó plazmidokat - amelyek szerkezetét DNS-szekvencia analízissel megerősítettük pGEMpST-SX-Q21HH22R, pGEMpST-SX-SHRA14D, pGEMpST-SX-A6T és pGEMpST-SX-A14D plazmidnak jelöljük.
A fenti mutációkat az L118E mutációra leírtakkal azonos módon hozzuk létre, eltekintve az alkalmazott mutagén oligonukleotidoktól, a nitro-cellulóz szűrők TAC pufferben való inkubálásának hőmérsékletétől és a pozitív, mutációt hordozó plazmidok kimutatására szolgáló szűrővizsgálatban az adott esetben alkalmazott restrikciós endonukleázos emésztésétől.
A Q21HH22R kettős mutáció létrehozására alkalmazott Q21HH22R/ClaI szintetikus mutagén oligonukleotid szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez az oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a glutamin kodonja a 21. helyzetben CAG-ről a hisztidint kódoló
CAT-re, és a hisztidin kodonja a 22. helyzetben CAC-ről az arginint kódoló CGA-ra cserélődik. A fenti mutánsokba be van ágyazva egy Call restrikciós endonukleáz hasítási hely (51-ATCGAT-3') is, amely az egyetlen ilyen hely az rpST génben. A Q21HH22R/ClaI oligonukleotidot a hibridizációs reakciókban radioaktívan jelzett próbaként is alkalmazzuk, a hibridizálást egyébként a fent ismertetett módon hajtjuk végre. A fenti mutánst egyébként minden tekintetben az E118E előállítására ismertetett módon hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy a szűrőket TAC pufferben 56 °C-on mossuk. A mutációt hordozó kiónok kimutatására a kiónokat a Clal hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, amely a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így a Q21HH22R kettős mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
Az A6T mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban A6T oligonukleotidot alkalmazunk mutagén oligonukleotidként, amelynek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az A6T oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST szekvenciáját, hogy az alanin kodonja a 6. helyzetben GCC-ről treonint kódoló ACC-re cserélődik. A hibridizálást követően a baktériumot tartalmazó nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 52 °c-on mossuk.
Az S11RA14D mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban S11RA14D/Sall mutagén oligonukleotidot alkalma zunk, és a nitro-cellulóz szűrőket TAC pufferben 64 °C-on mossuk. Az S11RA14D/Sall oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy a szerin kodonja a 11. helyzetben AGC-ről az arginint kódoló CGA-ra, és az alanin kodonja a 14. helyzetben GCC-ről az aszparaginsavat kódoló GAC-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy Sáli restrikciós felismerési helyet (5’-GTCGAC-3') is bevisz az rpST DNS szekvencia 29-34. helyzetébe. Az S11R és A14D mutációktól eltekintve a további nukelotidcserék nem okoznak változást az rpST protein aminosav-szekvenciájában. A mutációt vélhetően hordozó kiónokat az új Sáli restrikciós hely megszerzése szempontjából vizsgáljuk, ami a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így az S11RA14D kettős mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
Az A14D mutációt az rpST génben pontosan az L118E mutációra ismertetett eljárással hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy mind a mutagén, mind a hibridizációs reakciókban A14D/HindIII mutagén oligonukleotidot alkalmazunk. Az A14D/HindIII oligonukleotid annyiban változtatja meg az rpST gén szekvenciáját, hogy az alanin kodonja a 14. helyzetben GCC-ről az aszparaginsavat kódoló GAC-re cserélődik. Ez az oligonukleotid abban is különbözik az rpST DNS szekvenciától, hogy egy HindlII restrikciós felismerési helyet (51-AAGCTT-3') is bevisz az rpST DNS szekvencia 30-35. helyzetébe. Az A14D mutációtól eltekintve a további nukelotidcserék nem okoznak változást az rpST protein aminosav-szekvenciájában. A vélhetően mutációt hordozó kiónokat úgy mu tatjuk ki, hogy a nitro-cellulóz szűrőket TAC-ben 62 °C-on inkubáljuk és az új HindlII restrikciós hely megszerzése szempontjából is vizsgáljuk, ami a mutagén oligonukleotidban jelen van, és így az A14D mutáció plazmid kiónban való jelenlétének kimutatására alkalmas.
12. példa pST mutációk bevitele megfelelő bakteriális expreszsziós plazmidokba
A megváltozott (mutációt hordozó) kiónokat a pR0211 bakteriális expressziós plazmidban (173280 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett plazmid) rekontruáljuk, amelyeket pROpST, pROpSTA34 és pROpSTE34 plazmidnak jelölünk.
A pROpST plazmid pST DNS-t tartalmaz a pR0211 expressziós vektorba klónozva, és cisztein-kodont tartalmaz a 183. és 191. helyzetben; a pROpSTA34 alanin-kodont és a pROpSTE34 glutamin-kodont tartalmaz ugyanezen helyzetekben.
A pGEMpST mutáns kiónokat EcoRI-gyel és Smal-gyel emésztjük és a pST mutációt hordozó kis fragmenst izoláljuk. A pROpSTA34 DNS-t hasonló módon kezeljük, és a vektort tartalmazó nagy DNS-fragmenst izoláljuk. Az így kapott tisztított fragmenseket T4 DNS-ligázzal összekötjük és megfelelő baktériumtörzsbe (például 4300-ba) transzformáljuk. Ez a törzs tartalmaz egy hőmérséklet-érzékeny represszort (cl857), így a PL promoter általi expresszió 30 °C-on gátolt, de 42 °C-on végbemehet, mivel ezen a hőmérsékleten a represszor inaktiválódik. A mutáns pGEMpST DNS-fragmensek bevitelét a pROpSTE34 DNS-be pontosan a pROpSTA34-re leírt módon végezzük. A mutáns pGEMpST DNS-fragmensek bevitelét a pROpST DNS-be szintén a pROpSTA34-re leírt módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy mind a pGEMpST, mind a pROpSTA34 plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk. A 2. táblázat tartalmazza azokat a bakteriális expressziós plazmidokat, amelyekbe a mutáns pST géneket bevittük. Az A6T, S11RA14D és Q21HH22R pST mutánsokat egy pROpSTE34 származékba visszük be, a pROpSTE34-re ismertetett módon. Ez a származék, a pROpSTE34TxT2, egy kb. 1 kb Hindin fragmenst tartalmaz a pST-t kódoló DNS 3'-végén, ami az E. coli rrnB operon (riboszomális RNS B operon) ΤχΤ2 transzkripciós terminátorát tartalmazza.
2. táblázat: Expressziós vektorok aminosav-komponensei a
183. és 191. helyzetben
183. és 191. helyzetben kódolt aminosav
Mutáció cisztein alanin glutaminsav
1122L + + +
L115K + + +
L118E + +
L115KL118E + +
L118E1122K + +
L115E +
1122E + +
L118T
L118K +
2. táblázat (folytatás)
Mutáció 183. és 191. helyzetben kódolt aminosav
cisztein alanin glutaminsav
E119LQ123L + +
L115A + +
L118A + +
M126A + +
L118A1122L +
11221M126A + + +
S81,87L +
L82,84Q +
S81,87L+E119LQ123L +
S81,87L+1122L +
S81,87L+M126A +
L82,84Q+L115K +
A14D
A6T +*
S11RA14D +*
Q21HH22R +*
A6TS11R +*
A6TS11R+1122L +
P8TS11R+1122L +
P8TS11R +
* az E. coli rrnB operon T^T2 transzkripciós terminátor szekvenciáját is tartalmazza
13. példa
A6T11R+E34 és P8TS11R+E34 α-hélix 1 kombinációs mutánsok előállítása
Az A6TS11R kettős mutációt (amelyben a 6. helyzetű alanin treoninnal, és a 11. helyzetű szerin argininnel van helyettesítve) a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett E34 mutációval (amelyben a 183. és 191. helyzetű cisztein-kodonokat glutaminsav-kodonok helyettesítik) kombináljuk. A kapott rpST gén ezért az rpST DNS-nek mind az amino-terminálist (A6TS11R), mind a karboxil-terminálist kódoló régiójában (E34) tartalmaz mutációkat. A kapott plazmidot pR0pSTE-A6TSHR-nek jelöljük. A pML/pGH14-ből származó megváltoztatott, rpST-t tartalmazó kis EcoRI/Smal fragmenst - amely az A6TS11R mutációt tartalmazza - a pROpSTE-TiT2 nagy EcoRI/Smal fragmensével kapcsoljuk Össze. Az utóbbi plazmid a pST expressziós plazmid, amely az rpST-t kódoló DNS 3'-végén egy erős transzkripciós terminátort is tartalmaz az E. coli rrnB operonból (TfT2)·
Egy másik kettős mutációt, a P8TSllR-t (amelyben a
8. helyzetű prolin kodonja treonin-kodonra, és a 11. helyzetű szerin kodonja arginin kodonnal van helyettesítve) a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett E34 mutációval (amelyben a 183. és 191. helyzetű cisztein kodonokat glutaminsav-kodonok helyettesítik) kombináljuk. A kapott rpST gén ezért az rpST DNS-nek mind az amino-terminálist (P8TS11R), mind a karboxil-terminálist kódoló régiójában (E34) tartalmaz mutációkat. A kapott plazmidot pROpSTE-P8TSllR-nek jelöljük. A pR0pSTE-P8TSHR előállítására u• ·
- 42 gyanazt a stratégiát alkalmazzuk, mint a pR0pSTE-A6TSHR esetében, azzal az eltéréssel, hogy a p8TSHR kettős mutációt tartalmazó pML/pGH18 plazmidot alkalmazzuk megváltoztatott rpST DNS forrásként.
A6TS11R+I122L+E34 és P8TS11R+I112L+E34 mutációk
A fent ismertetett I122L a-hélix 3 mutációt mindkét, A6TS11R és P8T11R α-hélix 1 mutációval és az E34 mutációval is kombináljuk. A kapott plazmidok jelölése: pROpST-SXE-A6TS11R+I122L, illetve pML/pGH18-SXE-I122L.
A pROpST-SXE-A6TSHR+I122L plazmid előállítáásra az I122L-t tartalmazó kis BssHII/HindlII fragmenst a pROpSTEA6TSllR-ből tisztított nagy BssHII/HindlII fragmenssel kapcsoljuk össze. A kapott plazmid tartalmazza a SacI és Xbal restrikciós helyekkel definiált a-hélix 2 kazettát, amely restrikciós helyek az α-hélix 2-t kódoló DNS 5’- és 31-végét határolják a fent ismertetett módon, de nem tartalmaz T]^T2 transzkripciós terminátort.
A pML/pGH18-SXE-I122L plazmidot a fentiek szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a nagy fragmens forrásaként a P8TS11R kettős mutációt hordozó pML/pGH18 plazmidot alkalmazzuk. Az így kapott plazmid mutáns nem tartalmaz T^T2 transzkripciós terminátort, viszont tartalmazza az a-hélix 2 kazettát.
14. példa
A módosított, rekombináns szomatotropinok stabilitási profilja
A stabilitási profil meghatározását az alábbiak szerint végezzük. A rekombináns (állati) szomatotropinból ·« ·
- 43 koncentrált, 100 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,4), amelynek összetétele: 3,4 g NaH2PO4-H2O, 3,55 g Na2HPO4, 9,50 g NaCl, 1000 ml desztillált vízben oldva. Az oldatot MilliporeR steril Millex-0,22μιη szűrőegységen átszűrjük és 0,1 ml alikvotokat kémcsövekbe mérünk. A kémcsöveket 43 °C-os termosztátba helyezzük és meghatározott időpontokban onnan kivesszük. A kémcső tartalmát ekkor foszfáttal pufferolt sóoldattal hígítjuk. A felülúszóban HPLC-eljárással meghatározzuk a monomer- és dimer-tartalmat. Tömegmérleget készítünk. A csapadékképződést feljegyezzük. Az eredményeket a kiindulási koncentrációkkal összehasonlítjuk és megállapítjuk a stabilitási profilt.
A pH 7,4 értéken kisebb oldhatóságú szomatotropinszármazékok oldását kevésbé előnyös pH-η (pH 4-10) is elvégezzük, vagy szuszpenzióként értékeljük ki.
A módosított rpST proteinek oldatban mutatott stabilitásának vizsgálati eredményeit a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat: Mutáns rpST proteinek oldhatósága in vitro
Mutáció Oldhatóság (%) Inkubációs idő 43 °C-on (nap)
A34 32 14
1122L+A34 44 14
E34 70,0(3) 14
• 67 17
1122L+E34 62,0(2 ) 14
66,3(3) 17
A6TS11R+E34 68,5(2) 14
P8TS11R+E34 62 14
A6TS11R+1122L+E34 36 14
P8T511R+1122L+E34 2 14
L118K+A34 0 3
E119LQ123L+A34 0 3
L115A+A34 0 3
L118A+A34 10 7
M126A+A34 18 3
L118A1122L+A34 2 7
1122LM126A+A34 22 (2) 19
S81,87L+A34 0 3
S81,87L+E119LQ123L+A34 0 7
S81,87L+1122L+A34 8 7
S81,87L+M126A+A34 0 3
oldatban maradt anyag
Oldhatóság -----------------------x 100 (%) összes oldott anyag (lásd 14. példa). Ha egynél több meghatározást végzünk, az átlagos oldhatóságot tüntetjük fel, és az egymástól függetlenül végzett meghatározások számát zárójelben megadjuk. Az rpST mutánsok vagy A34-, vagy E34-alapúak. Az A34 rpST a 183. és 191. helyzetben alanint tartalmaz cisztein helyett, míg az E34 rpST a 183. és 191. helyzetben glutaminsavat tartalmaz cisztein helyett.
15. példa
Rekombináns (állati) szomatotropin-származékokkal kezelt állatok fejlődésének vizsgálata hipox patkányokon
A találmány szerinti rekombináns állati szomatotropinok hatását az állatok fejlődésének serkentésére hipofízisirtott (hipox, RRA) patkányon vizsgáljuk. A hipofízis-irtott patkányban nem termelődik saját szomatotropin, és érzékeny a beinjektált szomatotropinra. A növekedési választ 10 napon keresztül mérjük, és az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük, a minden egyes vizsgálatban pozitív kontrollként alkalmazott rpST biológiai aktivitásának %-ában.
16. példa
Mái-radioreceptor vizsgálat a megváltoztatott, rekombináns szomatotropin szomatotropin-receptorokhoz való kötődésének vizsgálatára, in vitro
In vitro radioreceptor vizsgálatot alkalmaztunk a találmány szerinti rekombináns szomatotropinok 125I-rpSTvel folytatott versengésének kimutatására a tisztított máj
-membránok szomatotropin-receptor kötőhelyeiért. A fenti vizsgálatok eredményeit a 4. táblázatban közöljük.
4. táblázat: Hipox patkányon mért biológiai adatok és az rpST mutáns proteinek hőstabilitása
Mutáció RRAa RRAb Tm (°C)
A34 112,8 173,5 n. v.
1122L+A34 97,4 225,8 79
E34 90,52(5) 51,4(7) 62,0(6)
1122L+E34 66,66(5) 80,28(5) 62,67(5)
L115K 0,3 1,2 >83
L115K+E34 0,8 0,9 79
L118K 1,8 43,9 36
E119LQ123L 3,8 80,2 49
L115A 88,6 163 50
L118A 64(3) 49,5 57
M126A 100 122 55
L118AI122L 38,9 57,9 56
I122LM126A 66,25(2) 82,55(2) 63
S81,87L 46,9 194 40
S81,87L+E119LQ123L 40,4 177,9 38
S81,87L+I122L 71,3 165 47
S81,87L+M126A 79,7 186 47
L82,84Q 9,7(2) 3,4 n. v.
K114R+E34 121,3 53,2 62
A6TS11R+E34 80,7(4) 135,0(4) 64,0(4)
P8TS11R+E34 129,7 78,5 65
4. táblázat (folytatás)
Mutáció RRAa RRAb Tm (°c)
A6TS11R+I122L+E34 116,7 112,8 61
P8TS11R+I122L+E34 127,9 89,3 64
RRAa a hipox patkányon mért eredményeket a pozitív kontrollként alkalmazott standard rpST aktivitásának %-ában adjuk meg
RRAb a máj-radioreceptor vizsgálat eredményeit a standard rpST aktivitásának %-ában adjuk meg
n.v. nem határoztuk meg
Ha egynél több vizsgálatot végeztünk, az átlagot adtuk meg, és a meghatározások számát zárójelben feltüntettük.
17. példa
I122L+E34 mutáns rpST-vel végzett nitrogén-mérleg kísérletek
Az I122L mutációt hordozó rpST protein biológiai aktivitásának in vivő kiértékelésére nitrogén-mérleg kísérletet végeztünk a 355460 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett módon. pST szubkután adagolása fejlődésben lévő sertéseknek növeli a testben, főleg az izmokban lerakodott protein mennyiségét. Nitrogén-mérleg vizsgálat alkalmazásával mérhető az állatban lerakodott protein mennyiségének változása. Mivel a protein meghatározott mennyiségű nitrogént tartalmaz, az elfogyasztott táplálék és a szervezetből kiürült anyagok nitrogéntartalmának meghatározásával pontosan kiszámítható a lerakodott protein mennyisége. így a nitrogén-mérleg a visszatartott (lerakódott) protein mennyiségét adja meg a táplálékkal elfogyasztott nitrogén és a vizelettel és széklettel kiürült nitrogén mennyiségének különbségeként. A nitrogén-visszatartást legpontosabban mint a visszatartott nitrogén mennyiségét adhatjuk meg, a megemésztett nitrogén (elfogyasztott nitrogén mínusz székletben lévő nitrogén) mennyiségének százalékában. Ebben a vizsgálatban a a 183. és 191. helyzetű ciszteinek, vagy az rpST L122L mutáns glutaminsavval van helyettesítve. A fenti analízis eredményei a megváltoztatott rpST molekula teljes biológiai aktivitását bizonyítják az rpST kontrolhoz viszonyítva.
18. példa
Hőstabilitás meghatározása fluoreszcenciás spektroszkópia alkalmazásával
A megváltozott rpST protein hőstabilitását úgy határozhatjuk meg, hogy mérjük az intrinsic triptofán fluoreszcenciát a hőmérséklet függvényében. Az rpST molekula egyetlen triptofán-maradékot tartalmaz, amelynek intrinsic fluoreszcenciája natív állapotban szigorúan kioltódik. A hőmérséklet növelése vagy a pH csökkentése a fluoreszcencia jellegzetes növekedését okozza, ami feltehetőleg a szerkezet felbomlásának következtében jön létre, legalábbis az egyébként betemetett triptofán-maradék közvetlen közelében. A fluoreszcenciát a növekvő hőmérséklet függvényében ábrázolva szigmoid görbe formájában olvadási profil-t kapunk, amelyben a fluoreszcencia rejtve marad egy bizonyos hőmérsékletig, ami az adott rpST-re jellemző érték. Ezután a fluoresz• ·
- 49 cencia egy meglehetősen szűk hőmérséklet-tartományban élesen növekedik. A fenti fluoreszcencia-növekedés középpontjához tartozó hőmérsékletet (átmeneti hőmérséklet) Tm-nek jelöljük, és ez jellemző a protein hőstabilitására. A találmány szerinti rpST Tm-jét Burger és munkatársai módszerével határozzuk meg [Burger H.G., Edelhoch H. és Condliffe P.G., Endocrinology 78., 98-102 (1966)], azzal az eltéréssel, hogy gerjesztett hullámhosszként 295 nm-t alkalmazunk és az emissziós fluoreszcenciát 355 nm kizárásos szűrő alkalmazásával olvassuk le. A találmány szerinti rpST Tm értékeit a 4. táblázat tartalmazza. Ezen adatok szerint az I122L Tm-je erősen, 79 °C-ra növekszik.
19. példa
I122L mutáció létrehozása polimeráz láncreakció módszerrel
Az I122L mutációt hely-irányított mutagenezissei visszük be az rpST génbe, a Sarkar és Sommer által ismertetett polimeráz láncreakciós módszer alkalmazásával [Sarkar és Sommer, Biotechniques 8, 404-407 (1990)]. A három alkalmazott oligonukleotid primer, a SacI293, L120-3 és PvuII634 oligonukleotid szerkezete az 1. táblázatban látható. Templátként a pGEMpST-SX plazmidból származó rpST gént tartalmazó EcoRI/HindlII fragmenst használjuk. 15 polimeráz láncreakció ciklust (továbbiakban PRC) hajtunk végre 1 ng rpST DNS-templáton, 1-1 μιηόΐ/ΐ L120-3 és PvuII634 oligonukleotid primerrel, dNTP-kkel és Tag oligonukleotid polimerázzal, a gyártó előírásai szerint. A reakció eredményeként L122L mutációt tartalmazó 227 bp DNS-fragmenst kapunk. Ezt a « ·
- 50 fragmenst agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk és PCR primerként használjuk a SacI293 oligonukleotid-primerrel és az rpST-t tartalmazó EcoRI/HindlII templát fragmenssel kombinálva, egy újabb 15 ciklusból álló PCR-ben. A kapott, 361 bp fragmentumot SacI és PvuII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, agaróz-gél-elektroforézissel tisztítjuk és gélen tisztított, nagy SacI/PvuII pGEMpST-SX DNS-fragmenshez ligáljuk. A ligációs elegyet HB101 kompetens sejtekbe transzformáljuk. A kapott transzformánsok plazmid-DNS-ét az I122L mutáció jelenléte szempontjából vizsgáljuk, pontosan az L118E esetében ismertetett módon, azzal az eltéréssel, hogy radioaktívan jelzett hibridizációs próbaként L120-3 oligonukleotidot használunk, és a szűrővizsgálatot csak egyszer végezzük el. Az I122L mutáció jelenlétét és a PCR reakciókkal bevezetett további mutációk hiányát DNS-szekvencia analízissel erősítjük meg. A fenti mutációt hordozó plazmidot pGEMpST-SX-I122LpCR-nek jelöljük.
20. példa
I122L rpST mutánció létrehozása élesztőben expreszszálható plazmidban
Az I122L mutációt hordozó rpST gén Saccharomyces cerevisiae élesztőgombában való expresszálására az rpST-t kódoló DNS-t élesztőből származó promoterhez kell működőképesen kötni. A pROpST-SXE-I122L-ből származó, rpST-t hordozó kis Ndel/HindlII fragmens végeit a DNS polimeráz I nagy Klenow-fragmensével való kezeléssel tesszük ragadóssá, miután a plazmidot Ndel-gyel és HindlII-mal hasítottuk. Ezt a fragmenst gél-elektroforézissel tisztítjuk, és az YEp352-2 plaz mid nagy Sall/Sphl fragmensével kapcsoljuk. Az utóbbi fragmens végeit SÍ nukleázos kezeléssel tesszük tompává. Ez a plazmid YÉp352-származék, amely úgy van módosítva, hogy tartalmazza a divergens GAL1/GAL10 promotert [Johnston és Davis, Molecular and Cellular Biology 4, 1440-1448 (1984)], és az STE7 génből származó nem-transzlatált 3’-régiót [Teague és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83. 7371-7375 (1986)] is. A kapott plazmidot YEp352-pST-I122L plazmidnak (5. ábra) jelöljük.
A fenti mutáns rpST élesztőben való expresszálására a fenti plazmiddal transzformált élesztősejteket uracil nélküli szintetikus komplett tápközegben tenyésztjük, amely egyetlen szénforrásként galaktózt tartalmaz [Sherman F., Fink
G.R. és Hicks J.B., Laboratory Course Manual fór Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 163-168. oldal (1986)], 30 °C-on, néhány órán keresztül, annyi ideig, hogy maximális rpST gén indukciót és rpST termelést érjünk el. Gazdasejtként minden olyan élesztősejt alkalmazható, amely az URA3 génben mutációt hordoz, előnyösen olyan élesztősejtet alkalmazunk, amely nem termel proteázt és GAL+, ilyen például a BJ5457 (MATa pep4::HIS3 prbl-! trpl ura3-52 leu2-! his3-l lys2-801 canl GAL+ genotípus) Ezt a törzset BJ5457 számon helyeztük letétbe a Yeast Genetic Stock Center-ben (University of California).
• ·

Claims (6)

1. Alfa-hélix 3 régiójában mutációt tartalmazó szomatotropin, amely ezáltal a natív szomatotropinnál jobban oldódik, míg nyújtott hatású készítményben biológiai aktivitását megtartja.
2.ábra
2. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin humán, marha, sertés, juh, kecske, ló, hal vagy szárnyas eredetű.
3. ábra » ·
6/4
A. ábra
6/5 • · 1 < · ♦·· · ·♦ ·«· • · · · ·
3. A 2. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az a-hélix 3 régió mutációja I122L, L115E, L115K, L115KL118E, L118E, L118T, L118K, L118EI122K, I122E, E119LQ123L, M126A, L118A, G121A, K114R, K116R, I122LM126A vagy I122LL118A.
4- Q oVojoldciL·
Aktaszámunk: 73833-1846
Ügyintézőnk: dr. Kiss Ildikó
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
6/1 a n
E cn cn CD-
OC
-O o “Ld CH — Ί N -<
m θ
C3 σ í_ JD -σ • · «
4. A 3. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az a-hélix 3 régió mutációja I122L.
5. ábra ·· ·*·
6/6 • V 4949 * · 44 * •β ······ * » · ·4
49·»
AT G Met l GAT Asp CAA G l n TTC P h e CCA Pro 5 GCC A l a ATG Met CCC Pro TTG Leu TCC Ser 1 0 AGC Ser CT A Leu TTT Phe GCC A l a AAC A s n 1 5 45 GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC 90 Alá Va t Leu Arg Alá G l n H i s Leu H i s G l n Leu A l a A t a Asp Thr 20 25 30 TAC AAG GAG TTT GAG CGC GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC 135 T y r Lys G l u Phe G l u Arg A l a Tyr I l e Pro G l u G l y Gin Arg Tyr 35 30 35 T cc A T C C AG AAC GCC CAG G C T GCC TTC TCC TTC TCG GAG ACC ATC 180 Ser I l e G l n A s n Alá G l n A l a A l a Phe cy,s Phe Ser G l u Thr I l e 50 5 5' 60 CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA TCG GAC GTG 225 Pro Alá Pro Thr G l y Lys Asp G l u A l a G l n G l n Arg Ser Asp Va l 65 70 75 GAG CTG CTG CGC TTC T CG CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTC GGG 270 G l u Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu I l e G l n Ser T r p Leu G l y 80 85 90 C C C GTG C AG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTT 3 1 5 Pro Va l G l n Phe Leu Ser Arg Va l Phe Thr A s n Ser Leu Va l Phe 95 1 00 1 05 GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG 360 G l y Thr Ser Asp Arg Va l Tyr G l u Lys Leu Lys Asp Leu G l u G l u 1 1 0 1 1 5 120 GGC ATC C AG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG 405 G l y I l e G l n A l a Leu Met Arg G l u Leu G l u Asp oly Ser Pro Arg 125 130 135 GCA GGA C AG ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC A AA TTT GAC ACA AAC 450 A l a G l y G l n 1 l e Leu Lys G l n Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr A s n 140 1 4 5 150 TTG CGC AGT GAT GAC GCG CTG C T T AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC 495 Leu Arg Ser Asp Asp Alá Leu Leu Lys A s n Tyr G l y Leu Leu Ser 155 160 165 TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC 540 Cys P h e L ys Lys Asp Leu H i s Lys A l a G l u Thr Tyr Leu Arg Va l 170 175 180 ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC TTC 579 Met Lys Cys Arg Arg Phe Va l G l U Ser Ser Cys A l a Phe
185 190
5. A 4. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin sertés vagy marha eredetű.
6. Az 5. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin sertés eredetű.
7. Alfa-hélix 2 régiójában mutációt tartalmazó szomatotropin, amely ezáltal a natív szomatotropinnál jobban oldódik, míg nyújtott hatású készítményben biológiai aktivitását megtartja.
8. A 7. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin humán, marha, sertés, juh, kecske, ló, hal vagy szárnyas eredetű.
9. A 8. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az α-hélix 2 régió mutációja S81,87L vagy L82,84Q.
10. A 9. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin sertés vagy marha eredetű.
11. A 10. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin sertés eredetű.
12. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amely a-
-hélix 2 régiójában is tartalmaz mutációt.
13. A 12. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a szomatotropin humán, marha, sertés, juh, kecske, ló, hal vagy szárnyas eredetű.
14. A 13. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az a-hélix 2 régió mutációja S81,87L vagy L82,84Q.
15. A 14. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az a-hélix 3 régió mutációja I122L, L115E, L115K, L115KL118E,
L118E, L118T, L118K, L118EI122K, I122E, E119LQ123L, M126A,
L118A, G121A, K114R, K116R, I122LM126A vagy I122LL118A.
16. A 15. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben az a-hélix 3 régió mutációja I122L.
17. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a 183. és 191. helyzetű ciszteinek glutaminsavval vannak helyettesítve.
18. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a kis hurokban levő kettő és a nagy hurokban levő kettő, összesen négy cisztein-maradék közül legalább egy hiányzik.
19. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben négy cisztein-maradék ciszteinsav-maradékkal van helyettesítve.
20. Az 1. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben * · ♦
- 54 a 183. és 191. helyzetű cisztein-maradékok glutaminsav-maradékkal vannak helyettesítve.
21. A 4. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a kis hurokban levő kettő és a nagy hurokban levő kettő, összesen négy cisztein-maradék közül legalább egy hiányzik.
22. A 4. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben négy cisztein-maradék ciszteinsav-maradékkal van helyettesítve.
23. A 7. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a 183. és 191. helyzetű cisztein-maradékok glutaminsav-maradékkal vannak helyettesítve.
24. A 7. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a kis hurokban levő kettő és a nagy hurokban levő kettő, összesen négy cisztein-maradék közül legalább egy hiányzik.
25. A 7. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben négy cisztein-maradék ciszteinsav-maradékkal van helyettesítve.
26. A 12. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a 183. és 191. helyzetű cisztein-maradékok glutaminsav-maradékkal vannak helyettesítve.
27. A 12. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben a kis hurokban levő kettő és a nagy hurokban levő kettő, összesen négy cisztein-maradék közül legalább egy hiányzik.
28. A 12. igénypont szerinti szomatotropin, amelyben négy cisztein-maradék ciszteinsav-maradékkal van helyettesítve.
29. Eljárás hely-irányított mutegenezis létrehozására rekombináns eredetű proteinben vagy polipeptidben, az• ♦ • ··
- 55 zal jellemezve, hogy
- egy DNS-szegmenst klónozunk úgy, hogy előállítunk egy, a DNS egy részével komplementer szintetikus oligonukleotidhoz illesztett egyszálú DNS-t, amely oligonukleotid egy, a DNS-hez nem illő régiót tartalmaz;
- a DNS-t kettős szálúvá alakítjuk;
- a kapott kettős szálú DNS-t szaporításra alkalmas gazdasejtbe transzforrnáÍjuk;
- hibridizálással kiválasztjuk az oligonukleotidnak megfelelő mutáns szekvenciákat;
- a kiválasztott szekvenciákat expressziós plazmidba viszszük; és
- a kapott rekombináns-eredetú protent vagy polipétidet expresszáljuk.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szintetikus oligonuklukleotid egy restikciós endonukeáz felismerő helyet is tartalmaz a mutáció helyéhez közel.
31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a restrikciós endonukeáz felismerő helyeket tartalmazó kiónokat a kívánt restrikciós endonukleázzal hasítjuk.
32. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns eredetű protein vagy polipeptid egy szomatotropin.
33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomatotropin humán, marha, sertés, juh, kecske, ló, hal vagy szárnyas eredetű.
34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid SacI293,
Xbal353, S87L, Q8082, K113, E116, K113E116, E116K120, E120,
L120-3, A124-2, E113EHDQ116, E113D, L115A, L118A, L118TK,
L118T, L117,121, Leull7121D, K114R/AccI, G121A/XmnI,
K116R/BglII, A14D/HindIII, AQ6T, S11RA14D/Sal, Q21HH22R/ClaI vagy PvuII634.
A meghatalmazott:
dcloL.
6. ábra - - -. >
HU913724A 1990-11-30 1991-11-29 Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants HUT62328A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/621,197 US5310882A (en) 1990-11-30 1990-11-30 Somatotropins with alterations in the α-helix 3 region

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU913724D0 HU913724D0 (en) 1992-02-28
HUT62328A true HUT62328A (en) 1993-04-28

Family

ID=24489157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU913724A HUT62328A (en) 1990-11-30 1991-11-29 Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5310882A (hu)
EP (1) EP0488279A3 (hu)
JP (1) JPH0570497A (hu)
KR (1) KR920009414A (hu)
AU (1) AU662492B2 (hu)
CA (1) CA2056564A1 (hu)
FI (1) FI915655A (hu)
HU (1) HUT62328A (hu)
IE (1) IE914154A1 (hu)
IL (1) IL100170A0 (hu)
NO (1) NO914720L (hu)
NZ (1) NZ240720A (hu)
PT (1) PT99647A (hu)
TW (1) TW205045B (hu)
ZA (1) ZA919452B (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4805393A (en) * 1992-08-07 1994-03-03 Pitman-Moore, Inc. Improving the body composition of fish via the administration of porcine somatotropin (pst)
ZA936811B (en) * 1992-10-28 1995-03-15 Upjohn Co Somatotropin modifications
WO2002026967A2 (en) * 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
CA2498319A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
US20070225176A1 (en) * 2006-03-27 2007-09-27 Pope Gary A Use of fluorocarbon surfactants to improve the productivity of gas and gas condensate wells
US7772162B2 (en) * 2006-03-27 2010-08-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of fluorocarbon surfactants to improve the productivity of gas and gas condensate wells
US20080047706A1 (en) * 2006-08-23 2008-02-28 Pope Gary A Method of obtaining a treatment composition for improving the productivity of hydrocarbon producing wells
US20100181068A1 (en) * 2007-03-23 2010-07-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and System for Treating Hydrocarbon Formations
EP2137280A4 (en) * 2007-03-23 2010-09-08 Univ Texas METHOD FOR TREATING A FRACTURED FORMATION
WO2008118241A1 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for treating a water blocked well
CN101809044B (zh) * 2007-03-23 2013-12-04 德克萨斯州立大学董事会 用于处理水堵井的组合物和方法
CN104017063A (zh) * 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0355460B1 (en) * 1988-08-24 2000-12-27 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization
EP0397834B1 (en) * 1988-10-28 2000-02-02 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
DK0482124T3 (da) * 1989-07-10 1994-04-25 Upjohn Co Somatotropinanaloger
ATE195339T1 (de) * 1989-10-12 2000-08-15 Univ Ohio Antagonisten von wachstumshormonen

Also Published As

Publication number Publication date
AU8829391A (en) 1992-06-04
HU913724D0 (en) 1992-02-28
EP0488279A2 (en) 1992-06-03
CA2056564A1 (en) 1992-05-31
ZA919452B (en) 1992-08-26
FI915655A (fi) 1992-05-31
US5310882A (en) 1994-05-10
IE914154A1 (en) 1992-06-03
JPH0570497A (ja) 1993-03-23
IL100170A0 (en) 1992-08-18
NZ240720A (en) 1995-07-26
KR920009414A (ko) 1992-06-25
NO914720D0 (no) 1991-11-29
PT99647A (pt) 1992-10-30
NO914720L (no) 1992-06-01
EP0488279A3 (en) 1993-02-24
FI915655A0 (fi) 1991-11-29
AU662492B2 (en) 1995-09-07
TW205045B (hu) 1993-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yelverton et al. Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon
EP0518587B1 (en) A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
HUT62328A (en) Somatotropins modified in their alfa-helix 3 and alfa-helix 2 region, as well as their combination with each other and with other mutants
Milla et al. P22 Arc repressor: Enhanced expression of unstable mutants by addition of polar C‐terminal sequences
JPH0568480B2 (hu)
EP0152333A2 (en) Cardiac atrial peptides
US5548068A (en) Somatotropins with alterations in the alpha-helix 1 region, and combinations with other mutations
JP2001008697A (ja) Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法
KR100554490B1 (ko) 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도
US20030228665A1 (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
EP0571743B1 (en) Factor regulating gene expression
JPH05271279A (ja) ヒト副甲状腺ホルモンムテインおよびその製造法
WO1989005857A1 (en) A METHOD OF SIMULTANEOUSLY PRODUCING A LARGE NUMBER OF Leu17-VIP-ANALOGS AND NEW Leu17-VIP-ANALOGS
KR970009158B1 (ko) 돼지 성장호르몬 동족체
NZ260176A (en) Method for site directed mutagenesis on recombinantly derived polypeptide or protein and its application on somatotropin
Negro et al. Genetic construction, properties and application of a green fluorescent protein-tagged ciliary neurotrophic factor.
HU213162B (en) Process for producing factor controlling gene expression
US5654177A (en) Production of human somatomedin C
JP2605902B2 (ja) ルシフェラーゼ、それをコードする遺伝子およびルシフェラーゼの生産方法
JPH051800B2 (hu)
JPH069692A (ja) 新規ペプチド、該ペプチドをコードする組換えｄｎａおよび該組換えｄｎａにより形質転換された微生物

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee