JPS63107996A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分！ｌ！ｆ） 本発明は、血圧降下作用等を有するアトリアルバンプ４
２チン様ペプチドに関する。

（従来の技術） 心房性ナトリウム利尿ペプチドについては、最近、種々
の報告がなされておシ、たとえばヒト心房よシヒョコ直
腸の弛緩作用を指標として３種類のペプチド、すなわち
、アミノ酸残基数で ２１、！１４及びｌ−６個である、α、β及びｊ−ｈ　
Ａ　Ｎ　Ｐ　（ｈｕｍａｎ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉ
ｕｒｅｔｉａ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）が見出されて
いる（代謝、ｖｏｌココＡ＆、３／ｊ頁、ｌ　？　ざ　
５　）　。

（発明が解決しよつとする問題点） 本発明者は、さきにアミノ酸残基数７２よりなシ、血圧
降下作用等を有するアトリアルバソデイラチン（Ａ　Ｖ
　Ｄ　）　（Ａｔｒｉａｌ　ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｎ　
）を見出したが（％開開Ａ／−４ｊθ６号公報参照ｐさ
らに検討を加え、アミノ酸残基数７タよりなるＡＶＤ様
ペジペプチドードするＤＮＡフラグメントな用いて、微
生物学的に蛋白を産生ずることにより・本発明に到達し
た。

（問題点を解決するための手ジ） すなわち、本発明の要旨は下記式（１）で示されるアミ
ノ酸配列を有するＡＶＤ様ペプチドにある。

Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖ
ｈｌＳｅｒ　Ａｓｎ　Ａ：ＬａＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ
　Ａｓｐ　Ｐｈｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
ＡｓｐＨ１ｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｕＬｙ８Ｍｅｔ　
Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＧｌｕＶａｌ　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　＋ｕｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　
Ｇ：ＬｕＰｒｏ　Ａｓｎ　ＧｌｕＧｌｕ　Ａｌ−ａ　Ｇ
１７　Ａｈａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＥｌｅｒＰｒｏ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＶａｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　
Ｔｈｒ　（ｌｙＧｌｕＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇ４）ｒ　ＧｌｙＡｌａ　
Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ａｒｇ　　　　　　　　・・―・・−
（１）以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に係るペプチドは、たとえば以下の方法により微
生物学的に製造しうる。

まず、本発明において用いられるＡＶＤ様ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡフラグメントの調
整方法の一例を示す。

ヒト心臓断片をグアジニルチオシアネートとともにホモ
ジナイズし、０ｅＯ１平衡密度勾配超ウィン（Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎ　）　　ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　　）／Ｉ、　　ｊｕｎ−１２ＰＦ、／
り７２）。

ついで、常法によシこれをオリゴ（ａＴ）　　セルロー
スカラムクロマトグラフィで精製し、ポリ（Ａｌ含有Ｒ
ＮＡを単離する（　ｍＲＮＡ原料）。

このｍＲＮＡ　　原料より、岡山とバーブ（Ｂθｒｇ）
の方法（モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジ
ー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃ！ｅｌｌｕｌａｒ
　ＢｉｏｌＯｇ）２、／ｌ／−／７０．／バー）によっ
て、Ｃ！ＤＮＡ　　ライプ２リーを得る。すなわち、ｐ
ＢＲ３２２とＳＶ弘Ｏのハイブリッドプラスミドを用い
て、ベクタープライマーとオリゴ（ａＧ）　　テールリ
ンカ−を得る。このベクタープライマーと上記ｍＲＮＡ
共存下に逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成し、そ
の後、制限酵素Ｈ１ｎ　ｄｌｌ　で消化し、ついで上記
リンカ−を用いて環化させる。

その後、ｍＲＮＡ　　部分をＤＮＡで置換して、ｃＤＮ
Ａフラグメント含有プラスミドを得る。

ついで、常法によシ、これを用いて大腸菌形質転換して
、ｃＤＮＡライブラリーを得る。

ついで、カルディオナトリン（Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−工１ｅ−Ｇ’１ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−８ｅｒ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ１．ｙ−Ｏｙｓ−ＡＢｐ−Ａｒｇ
−工］−ｅ−Ｇ４ｙ　　をコードするＤＮＡ配列に相補
性の下記塩基配列を有するヌクレオチドをプローブとし
て合成する。

Ｔ ＯＴ Ｔ ＯＴ に のプローブを用いて、上述のｃＤＮＡライブラリーなス
クリーニングし同プローブとハイブリダイズするクロー
ンを選択する。そのクロー１ｉ、］細７ξの３二に−官
にｍ＝なし）ンよシ得られるｃＤＮＡ　　７ラグメント
はマキサム−ギルバード法（メンツズ　イン　エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎＺ７ｍＯＩＯ（
ｇ７　）坦を弘？？−ｔｔｏ、ｉり♂Ｏ）によって塩基
配列を決定する。

上記ｃＤＮＡフラグメントは必ずしも一定のヌクレオチ
ド配列及びヌクレオチド残基数を有することを要求され
ず、ＤＮＡによってコードされる物質がＡＶＤと同様の
生理活性を有するＡＶＤ様物質であれば、ヌクレオチド
配列の一部が置換もしくは削除されるかあるいはヌクレ
オチドが付加されたヌクレオチド配列であってもよい。

得られるｃＤＮＡ　　７ラグメントの塩基配列の４御　
　：Ｊｌ　　５呂　　５冒　　ミ；次に、このＤＮＡ７
ラグメントを用いて、発現に好適なプラスミドを構築す
る４態様について、さらに図面により説明する。すなわ
ち、グラスミドｐＨＡＮＦ　ｑｌ　（Ｎａ−ｔｕｒｅ　
３１０．ユ３．ｌｄ、９’ｇりよシ得られるＡＶＤを含
む３０／ｂｐフラグメ／トとメチオニンリンカ−を結合
させた後、制限酵Ｓ）を持つリンカ−とを結合し、制限
酵素碧Ｒ工で消化し、図コに示す、７　Ａ　、ｊｌ）ｐ
フラグメントを得る。これをプラスミドｐＵ０１ｒ（Ｐ
、ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇより購入）のＢａｍＨ１
部位に導入し、大腸菌を形質転換して、プラスミドｐＵ
ｃｃｄｆｆ（図３）を得る。

ついで、このｐＵＯｃｅＬｇを制限酵素ａｖａ　ｌで部
分消化シ、ターミネーション（（ＴｅｒｍＡＯＴＡＴＯ
）リンカ−を挿入し、プラスミドｐＵＯｃｃｌ　ｌ！：
Ｔｅｒｍを得る（図４１）。

ｔた、Ｔａｃグロモータを有するプラｙ−，ミドｐ　Ｄ
　Ｒｊ　ｆ　Ｏ（Ｐ、Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓよ
シ購入）を二匹Ｒ１、独４３で消化し、約Ｊり０ｂｐ７
ラグメントを、一方、上記プラスミドｐＵＯｄｇＴｅｒ
ｍをＡＬＬｌ−加ｌ　で消化し、コｌ、　Ｏｂｐ　フラ
グメントを得る。一方ｐＨＡＮＩＰ　ＩＩ　ｇの４徂Ｒ
１，憂ｌ消化後の大きい断片を得る。この三者を連結し
、大腸菌を形質転換して目的とするプラスミドｐｈＡＶ
Ｄ（図６）を得る。

プラスミドｐ　ＨＦ　００　／、　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　１０　、　　Ａ　９　ｊり
（／９ざコ））よシ得られる／　７１：　ｂｐ　　のＰ
ｓｔｌ　　断片とｐ　Ｓ　Ｐ　ｂ　ｙ　（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｈθ１ｍ社製）を制限酵素二重Ｉで消化
し、ついでアルカリホスファターゼで処理したものを結
合し、ｐｓＰ　６　Ｑ　ＯｍｐＦを得る（図り）・ｐｓ
Ｐ　４４１・ＯｍｐＦを制限酵素Ｈ１ｎｄｌで消化し、
Ｂａ１３１で消化した後ＴｆＤＮＡポリメラーゼで末端
を平滑化し、Ｊ（ｉｎｄｌｌｌ　！Ｊンカーを挿入して
ｐｓＰ＆　４Ｉ・ｏｍｐＦＡ　、７　Ｊを得る（図７）
。

得られるｐＳＰ　６１０ｍｐＦ　ＩＦｈ　３ＪをＰｓｔ
　（で消化しＴｅポリメラーゼで平滑化させ、墾１リン
カ−を挿入し、ｐｓＰ　ＡＩＯｍｐＦ−Ｈｐａｌを得る
（図に〕。このプラスミドｐｓＰＡ　４Ｉ−０ｍｐＦＨ
ｐａｌをＥｃｏＲｌ　、　Ｈｌｎｄｌで消化し約２００
　ｂｐ　の断片を得る。さらにＨｈａｌで消化しＯｍｐ
Ｆのシグナルペプチド領域を含むｆｆｊｂｐ　の断片を
得る。この断片に合成リンカ− を連結し・ｐＵＯｒをＥｃｏＲｌ　、Ｈｌｎｄｌｌで消
化したものに挿入してプラスミドｐＵｃ・Ｏｎ＋ｐＦ−
８＋　Ｍｅｔを得る（図、ｒ）。得られるｐＵＯ−０ｍ
ｐＦ−８＋　ＭｅｔをＨｌｎｄｌ　、　ＦｎｕＤｌで消
化してＯｍｐ？シグナルペプチド領蛾な含む７０　ｂｐ
　の断片とｐＨＡＮＦ　Ｑ　ｇにより得られるＡＶＤ遺
伝子領域を含むコロ９ｂｐ　　をさらに５ΔＩで消化し
た約ココθｂｐの断片を連結したものを、ｐｈＡＶＤを
Ｈｌｎｄｌｌ　、　磁１で消化して得られる大きい方の
断片に結合してプラスミドｐｈＡＶＤ・ΔＳＴを得る。

このプラスミドを人ｖａｌで消化して得られる大きい方
の断片とプラスミドｐｈＡＶＤをＡｖａｌで消化して得
られる小さい方の断片を連結しプラスミドｐｈＭＡＶＤ
　ｅａを得る（図？）゛。これをａｔｎａｚで消化し、
ＢＡＰ処理し、プラスミドｐｈＡＶＤをＨｌｎｄｌで消
化して得られるｔａｃプロモーター領域を含む１０４１
ｂｐを挿入し、プラスミドｐｈＭ　Ａ　Ｖ　Ｄを得る（
図ヂ）。

さらにこのプラスミドをＦｉｃ　ｏＲｌで消化し、ＢＡ
Ｐ処理し、プラスミドｐＭｏ？をＥｃｏＲｌで消化して
得られるＩａｃ　ｌ遺伝子を含む／、　７　Ｋｂｐの断
片を挿入しｐｈＭＡＶＤ・１ａｃ　ｌを得る。

ついで、このプラスミドｐｈＭＡＶＤ・１ａｃ　ｌを宿
主に導入し、形質転換された宿主を常法によ）培養する
ことによシ、目的とする蛋白を得ることができる。

宿主としては、大腸菌、酵母等の微生物のほか、動物細
胞を用いることもできる。

得られる蛋白は、上記式（１）で示されるアミノ酸配列
を有するＡＶＤ様ペグチドであシ、血管弛緩作用（血圧
降下作用）等を有する。

（実施例） 以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明する＠ 明細ｊの浄吉（内容に変更なし） なお、実施例中、制限酵素、修飾酵素等の処理は、これ
らの試薬の製造・販売者（宝酒造株式会社、Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂθ）の指示書にしたがって
行なった。

参考例１ く原料ＤＮＡフラグメントの調製〉 （１）　　ヒト心臓断片を液体窒素で破砕した後グアニ
ジウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズした
。得られたホモジネートを、チャーブウィン（Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎ　）　　らの方法（バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）／７．ｊコタ弘−！コタＦ、
／Ｐ７り）にしたがって、塩化セシウム平衡密度勾配超
遠心によって全ＲＮＡを分離した。ついで、常法によシ
これをオリゴ（ａＴ）　　セルロースカラムクロマトグ
ラフィーで精製し、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを単離し、ｍ
ＲＮＡ原料とした。

（２）一方、岡山とＢｅｒｇの方法（モレキュラーアン
ド　セ：ルラー　バイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａ
ｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　２．／
６１−／７０゜イブリッドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（ａＯ）　　テールリンカ−を得
た０ すなわち、ｐＢＲＪココと８Ｖ４ＡＯ（マツプユニット
０．７　／　−ＯＪ　４　）のハイブリッドプラスミド
４ｔＯＯμｇを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で
制限酵素Ｋｐｎ　ｌ　で３７℃、μ時間消化させた。

ついで、常法によジェタノール沈殿によってＤＮＡを回
収し、これをｄＴＴＰを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、３７℃で３０分間反応させて、制限酵素Ｋｐｎ　ｌ
の消化部位に約６０個のｄＴデテール付加させた後、エ
タノール沈殿によ！ＪＤＮＡを回収した。

ついで、とのＤＮＡをウシ血清アルブミンを含む緩衝液
中で、制限酵素Ｈｐａ　Ｉによシ消化した（７７℃、１
時間）。大きい方のＤＮＡフラグメントを、アガロース
ゲル電気泳動に明細δの浄書（内容に変更なし） よシ精製し、ガラスパウダー法（ボーゲルスティン　プ
ロシーデイングスオプザナショナルアカデミーオブザサ
イエン７ズオブザユーエスエイ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）７６．４１！−Ａ／り、ｌタッ
ク）　によって回収した。

その後、このＤ　Ｎ　Ａ　ｆ：０℃でオリゴ（ａＡ）セ
ルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エタノール
で回収し、オリゴ（ａＴ）　　テールを有するベクター
プライマーを得た。

他方、ｐＢＲｊココ　とＳｖ弘０（マツプユニット０．
７り〜ｏ、３２）とのノ・イブリッドプラスミド１００
μｇ　をウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵
素Ｐａｔ　ｌ　によシ消化した（３７℃、１時間半）。

ついで、ＩＩＮＡを回収し、ｄＧＴＰを含む緩衝液に溶
解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼを添加して、Ｊ７℃で１０分間反応させ、約１０
〜／′！のｄＧ　テールを付加させた。

回収したＤＮＡを、ウシ血清アルブミンを含せ（３７℃
、１時間）％ついでアガロースゲル（／、ｒ％）電気泳
動に付し、小さいオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡ
を抽出、回収した０ （３）　　岡山とＢｅｒｇの方法（モレキュラー　アン
ドセルラー　バイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ａ
ｎｄＣ！ｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　２．　
　／ｌ／−／７０．／Ｗｒコ）１（より、ｃＤＮＡ　ラ
イブラリーを得た。

すなわち、Ｔｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ１ｊ）、Ｈｇ０１＠
　。

Ｋ（’ｌ、　　ジチオスレイトール、ｄＡＴＰ％　ｄＴ
ＴＰ。

ｄＧＴＰ及び（！！ｐ）　　ｄｃＴＰ　を含む水溶液に
上記（１）で得られたｍ　ＲＮ　Ａ　Ｊ　Ｏ４ｇ　　と
上記（２）で得られたベクターブライマー１０μｇ　を
添加して、逆転写酵素の存在下に３７℃、２０分間反応
させ、プラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを合成し、これ
をエタノール沈殿しベレット状で回収した。このベレッ
トをｃｏｃｋ！、ジチオスレイトール、ポリ（Ａ゛）、
〔３諺Ｐ）　　ｄＴ：！ＴＩ’及びターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトラリ゛、細訝の浄書（内容に変更なし
） ンスフエラーゼを含有する緩衝液に溶解し、３７℃、１
０分間反応させ、末端あたシｄｃＭＰのｌＯ〜ｌｊの残
基を付加させた。

ついで、回収したオリゴ＜ｔＳａ）テールプラスミド−
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを含有するベレットをウシ血清アル
ブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ１ｎｄ［ｌ　
　で３７℃、１時間消化し、工／′ ７／′ 、／ ７・″ タノール沈殿によシ、エコｌ消化オリゴ（ａａ）テール
ｃＤＮＡ　：　ｍＲＮＡプラスミドを回収した。

これを前記（２）で得られたオリゴ（ａＧ）テールリン
カ−ＤＮＡを含む緩衝液に溶解し、Ａ　！　’Ｃ、コ分
間インキュベートし、さらにリコ℃、３０分間保持し、
０６ＣＶｃ冷却した。

ついで、β−ＮＡＤ　にコチンアデニンジヌクレチド）
存在下、大腸菌（１４匹上）ＤＮＡリガーゼを加えて・
−夜インキユベートした。

その後、ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ％ａＯＴＰ
、β−Ｎ　Ａ　Ｄ　。

ＬＯｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポ
リメラーゼ及びＥ、Ｃ０１１ＲＮａ５ｅ　Ｈを添加して
、この浪合物を７２℃、１時間、次いで室温で１時間イ
ンキュベートした後、冷却し、反応を停止させ目的とす
る（！　ＤＮＡフラグメント含有プラスミドを得た。

ついで、このプラスミドを用いて宮法により・大腸菌（
Ｅ、　ｃ！；Ｌ、Ｌ）　ＨＢ　／θｌを形質転換した０ （４）一方、カルデイオナトリンのＭｅ　ｔ−Ａｓ　ｐ
−Ａｒｇ、祠、；ンノ、Ｉ：≧バＦ’ｊ’Ｑに変更なし
ンー工１ｅ−０４７をコードするＤＮＡ配列に相補性の
ヌクレオチドをλつのグループとして合成した。

Ｔ ＣＴ Ｔ ＣＴ ついで、このオリゴＩ、ＩＩをプローブとしてｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングし、μθ、０００のトラ
ンスフォーマントより同プローブとハイブリダイズする
／、２個のクローンを選択した。この７２個のクローン
よシ、ｃＤＮＡフラグメントを抽出し、制限酵素地図を
作成し、それに基づいて、マキサム−ギルバート法（メ
ンツズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　）　　６！、ＩＩり
Ｐ−！ｔＯ。

を決定した（　ｐＨＡＮＦｌ？　）。

（Ｎａｔｕｒｅ　３１０．λ！、ｒ；Ｆ？　　’♂ｌ）
。

なおＡＶＤのＤＮＡ配列は、その分子量７、ｊｏｏから
推定されるアミノ酸数が７２でア）、かつ生体内でプロ
セシングされやすいアルギニンの位置から推定した。

上記ヒト由来のＡＶＤは、上述のブタ由来のＡ４Ｄ　（
アナトミー　アンド　エンブリオロジ−（Ａｎａｔｏｍ
ｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏ］−ｏｇｙ　）　／　６１　
、　Ｊ　０７−３１！、１Ｐｒｙ）　　と比較し、Ｎ端
ｇｙＩ３０備のアミノ酸配列は、４を箇所相違する。

〈プラスミドｐｈＡ　Ｖ　ＤのｙＩ製〉（１）　　ｐＨ
ＡＮＦ４りをｐｖＪとＲｓａｌで消化し、ＡＶＤを含む
３０　／　ｂｐ　７ラグメントを得る。

これをメチオニノリ／カーとＴ弘ＤＮＡリガーゼによシ
結合させ（ｒ”ｃ、ｉμ待時間、ついで制限酵素Ｈ１ｎ
ｄｌｌｌ　　で消化しく３７℃、２時間）、Ｊ！Ｊｂｐ
７ラグメントを得る。この７−ｙグメントと図／に示す
リポソーム結合品によシ連結しくｒ”ｃ、／ｕ待時間、
　さらにＢａｍＨｌで消 化しく３７℃、コ時間）、図−に示すｊＡｊｂｐ７ラグ
メントを得た。

一方、プラスミドｐＵＯｆｆを制限酵素、ジ■ｔｅｌで
消化しく３７℃、一時間）・上記ＪＡｊｂｐ７ラグメン
トをこのＢａｍＨ１部位に導入した。

ついで、大腸菌、ＴＭ／θｊを形質転換し、７Ｕａ１上
の白コロニーを選択し、プラスミドｐ［ＪＯｃｄＪ（図
３）を得た。

上記プラスミドを制限酵素Ａｖａ　ｌで部分消化しく３
７℃、３０分）、停止コドンを含む上記したリンカ−（
ターミネーションリンカ−）をＴ＃ＤＮＡポリメラーゼ
存在下で連結させプラスミドｐ［Ｔｏ　ｃｄ　ｇ　ｔｅ
ｒｍを得た（囚り）。

さらに、Ｔａｃプロモータを有するプラスミドｐＤＲｊ
ｌＩＯを制限酵素ＥｃｏＲ１％　ＢａｍＨｌで消化しく
３７℃、一時間）、約Ｊ　７０　’ｂ　ｐフラグメント
を得る（図ｊ）。一方、上記プラスミドｐＵＯｃｄ　ｇ
　ｔｅｒｍを亙己１　、　Ｂａｍ）１７で消化しく３７
℃、２時間）、２ＡＯｂｐフラグメントを得た（図ｊ）
。

アンピシリン耐性遺伝子を含有する大きいフラグメント
を得た（図り。

このようにして得た三つの７ラグメントをＴ弘Ｄ　Ｎ　
Ａ　ＩＪガーゼで連結した後（１”Ｃ３Ｉ弘時間）、得
られたプラスミドで大腸菌：ｒｙｖｏｒを形質転換し、
形質転換株よりグラスミドｐｈＡＶＤ　（図乙）を得た
。

プラスミドｐＨＦＯＯ４（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲ
ｅｓｅａｃｈ１０、　６１１７（／９０））を制限酵素
Ｐｓｔ　Ｉ　テ消化し／７ｒｂｐのｐｓｔｉ断片を得た
。

一方、プラスミドｐｓＰ４Ｆ（ベイリンガーマンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　）　　社製
）を制限酵素ｐｓｔｉで消化し、ついでアルカリホスフ
ァターゼで処理した後、上記ｐｓｔＩ断片と結合させ、
プラスミドｐＳＰ　＆　４ｔ・ＯｍｐＦ　を得た（図７
）。

このプラスミドｐｓＰ　Ａ　ＩＩ・ＯｍｐＦを制限酵素
’Ｈ１ｎａｌｌで消化し、Ｂａ１Ｊ／　　で消化した後
、Ｔ弘ＤＮＡ　　ポリメラーゼで末端を平滑化した。

で消化し、その後リガーゼで閉環させた。

ついで、このプラスミドで大腸菌を形質転換させ、得ら
れる形質転換株からプラスミドＤＮＡを分離した。この
プラスミドをａｔｎａｌ、ヱｓｔｌで消化し、／！Ｏｂ
ｐより小さい断片を選択シ、クローン＆３３を選んだ（
シ１ｔｌ−１痣ｄｌ消化断片は／ＪＯｂｐ　）（図７）
。

得られたプラスミドｐｓＰ　１．４Ｚ・ＯｍｐＦ　Ａ　
３　、？をＰｓｔ　■で消化し、Ｔｌ／ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑化させ、ジ登Ｉリンカ−を統合し、その後Ｉ
Ｉで消化し、リガーゼで閉環しプラスミドｐｓＰＡ　Ｕ
・ＯｍｐＦ−Ｈｐａ　ｌを得た（図ｇ）。

くプラスミドｐＵｏ−ＯｍｐトＳ＋Ｍｅｔの構築〉（１
）　　プラスミドｐＵｏ　ｇをｌ曵Ｒ１、ついで臥蓼ｌ
で消化し、Ａｍｐ’の遺伝子をもつＫｃｏＲｌ　−Ｈ１
ｎｄｌ断片を得た〇 （２）　　プラスミドｐＳＰ＆＆　・ＯｍｐＦ弓ｐａ　
ｌをＫｃｏＲトついでＨｌｎｃＬｌで消化し、約２００
ｂｐの断片を得た。さらにＨｈａ　（で消化し、Ｏｍｐ
Ｆシグナルペプチド領域を含むにｊｂｐ断片を得た。

上記（１）（２）で得られたコつの断片と合成リンカ− とをＴ４ｆＤＮＡリガーゼによ多連結しプラスミドｐＵ
ｏ−ＯｍｐＦ−Ｅｌ　十Ｍｅ　ｔを得た（図ｔ）・くプ
ラスミドｐｈＭＡＶＤの構築〉 プラスミドｐＵ０・ＯｍｐＦ−８＋ＭｅｔをＨｌｎｄ、
Ｆｎ　ｕＤ　ｌで消化し、Ｏｍｐ？ｍｐＦルペプチド領
域を含む約りＯｂｐの断片を得た。

一方、参考例／で得られたプラスミドｐＨＡＮＦ’＜ｔ
ｒをＡｌｕ　ｌで消化し、ＡＶＤ遺伝子領域を含むコＡ
？ｂｐの断片を得、さらにＡｐａｌで消化し・約−２１
ｉｌ）ｂｐの断片を得た。

この両断片を連結し、これをさらに参考例で得られたｐ
ｈＡＶＤを且１ｎｄｌ　、　ン阻１で消化して得られた
大きい方の断片と、Ｔ＆ＤＮＡＩｊガーゼにより連結し
、プラスミドｐｈＡＶＤ・ΔＳＴを得た（図９）。

得られたグラスミドをＡｖａ　ｌで消化して得られる大
きい方の断片とプラスミドｐｈＡＶＤをＡｖａｉで消化
して得られる小さい方の断片とをＴ４／　ＤＮＡリガー
ゼによシ連結し、プラスミドｐｈＭＡＶＤ・ΔＰを得た
（図９）。

これをＨｌｎｄｌで消化し、ＢＡＰ処理したプラスミド
Ｉ／ＣｐｈＡＶＤをＪ（ｉｎｄｌ　テ消化してＨｆｃｉ
ｏ＜ｔｂｐのｔａｃプロモーターを挿入しグラスミドｐ
ｈＭＡ’ＶＤを得る（図９）。

これをＥｃｏＲ，ｌで消化し、ＢＡＰ処理し、一方プラ
スミドｐＭｏデをＥｃｏＲ，ｌで消化し、ｘａｃｌ遺伝
子を含む／、　７　Ｋｂｐの断片を得、両者を結合して
プラスミドｐｈＭＡｖ］）ｌａｃ　ｌを得た（図１θ）
。

くペプチドの産生〉 プラスミドｐｈＭＡＶＤ・ｌａｃ　ｌで形質転換した大
腸菌ＹＡコｌをＬ−ブロス中で培養（３７℃、３時間）
した後、インデューサーとしてＪｍＭ工ＰＴ（）　（イ
ソプロピルチオガラクトサイド）を加え、さらにす時間
培養し集菌した。

その培養上清をＨＰＬＯに付しメインバンドを分取し、
アミノ酸配列及びアミノ酸組成を調べてＡＶＤＩＣＧｌ
ｙ及びＡｒ、ｐが付加されたＡＶＤ様ペジペプチドるこ
とを確認した。

産生量は約／ｍ９／ｌであった。

（発明の効果） 本発明に係るペプチドは、血管弛緩作用（血圧降下作用
）を有する。

【図面の簡単な説明】

図ノ、ダ、ｊ、？、ざ、？及び１０は、本発明において
用いられるプラスミドの製造工程例の概略図であシ、図
コは図／における。？Ａｊ’ｂｐ７ラグメントの制限酵
素切断地図を示し、図３はプラスミドｐＵＯｃｄｆｆの
切断地図を示し、図６はプラスミドｐｈＡ／￥Ｄの切断
地図を示す。 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　長谷用　　− ほか１名 図面の浄書（内容に変更なし） 図１ ｐｌＪＣｃｄｆ）　（６３ヘ） ３ｂ５ｂｐ□ 図　３ 区４ ｐｌ／Ｃｃｊ８ｆｅｒｍ 図５ 図６ Ｉ出Ｉ　　　　　　　　　　　ＶｓｔｌＬ勤ｄＭ １　Ｂα１３／及び゛ＤＱＡボソメラーセ゛１工河ｄｌ
ｌルカー １崩ｄ”ｌｌ １　リガ−ビ ｔｉｉｎｄＩｌｌ ↓ ！　Ｅ；２ＲＩ 図１０ 手続ネｎ１正書（方式） 昭和６１年１２月７２日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（ I ）のアミノ酸配列を有するペプチド
   。 【アミノ酸配列があります】・・・・・・・（ I ）
2. （２）微生物学的に製造された特許請求の範囲第１項記
   載のペプチド。