JPH0296597A - 発光蛋白アクアリンの生合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術の分野］ 本発明は、プラスミドｐＡＱ　４４ｏならびにこのもの
を有効成分とするＤＮＡ運搬ベクターに関する。

さらに詳しくは、クラゲの発光蛋白アクアリンの生金性
法に関する。

［発明の背景］ アクアリンは、アメリカ西海岸北部に生育する発光クラ
ゲの発光蛋白質であり、アクアリン１分子が特異的に２
分子のＣａ２・と結合する際にｙｌミツターであるセレ
ンテラジンを還元して発光する。一方、アクアリンの発
光にはＣａ２・が不可欠なことからアクアリンを用いて
Ｃａ２°を特異的に定徴することができ、１０−ＩＭ程
度の微着なＣａ２・濃度の測定が可能である。

現在、生体内においてＣａ２・依存性の酵素が多く、Ｃ
ａ２’欠乏による甚大な疾病をひきおこす可使性から、
このアクアリンは臨床検査に広く用いられる可能性もあ
り、さらに細胞内に注入することにより細胞内Ｃａ２・
の濃度測定や冷熱光源などへの応用も可能である。

しかしながら、このクラゲは、その生ＹＴ場所がアメリ
カ西海岸北西部に限られること、発生する季節も夏季の
みであること、１０，０００匹より１腸８程度の収量し
かなく、その生産量は充分でなく。

定の供給が保証され得ない、そこで、本発明者は、前述
の問題を解決すべく鋭意研究を行い、遺伝子光学の技術
を用いてアクアリン蛋白の生成を実質的に特定するアク
アリン遺伝子をＯｋａｙａｍａＢｅ　ｒｇ法により層Ｒ
ＮＡよりｃＤＮＡクローンとして単離調製した。

すなわち、組換え型ＤＮＡ手順を用いてクラゲ発光蛋白
アクアリンのｃＤＮＡクローンを作成し、このｃＤＦＩ
ＡクローンをプラスミドｐＡＱ　４４０と名付けた。

［発明の構成］ 本発明のプラスミドｐＡＱ　４４０のヌクレオチド配列
は、第１図のとおりである。さらに本発明は、上述のプ
ラスミドｐＡＱ　４４０および／または上述のヌクレオ
チド配列の機能的同等物を有効成分とするＤＮＡ　Ｊ！
Ｉ！搬ベクターを包含する。ここで機能的同等物とは、
適当な宿主によるクラゲ発光蛋白アクアリンの生産にお
いて実質的に同じ結果を得るために実質的に同じ方法で
使用できるヌクレオチド配夕ｑをいう。

本発明をさらに説明すると、第２図は、クローニングさ
れたプラスミドｐＡＱ　４４０の制限酵素地図を示す０
図において二二はアクアリン遺伝子を有する部分を−Ｉ
は　ｐＢＩｌｌ　３２２のＡｍｐ’部分を示し、　　　
　部分は、岡山−バーブのベクタ一部分を示す。

制限酵素による切断箇所および切断箇所数は表１のとお
りである。

表　　−１ 第３図は、プラスミドｐＡＱ　４４０にクローニングさ
れたアクアリン遺伝子の詳細な制限酵素地図およびマキ
サム・ギルバート法によるｔｌノ人配列の決定の方向を
示す０図において、ｃＤＮＡクローンであるプラスミド
ｐＡＱ　４４０は、クラゲ発光蛋白アクアリンの全体遺
伝子並びに５°および３°フランキング配列の数百のヌ
クレオチドを含有する。

上述の第１図に明らかにされたアクアリン遺伝子のヌク
レオチド配列は９５８ｂｐ　　（ベース対）で、５８８
ｂｐのオープンリーディングフレーム（翻訳部分）を含
有している。

本発明のｃＤＮＡクローンであるｐＡＱ　４４０の調製
法を第４，５図にもとづいて詳細に説明する。

クラブ（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　）の傘
縁より、グアニジン塩酸法°により全ＲＮＡを抽出する
。ついでオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィ
ーによりｐｏｌｙＡ　’　ｍＲＮＡを精製し、Ｏｋａｙ
ａｍａ−Ｂｅｒｇ法。

によりｃＤＮＡライブラリーを作成した（注零Ｈ，Ｏｋ
ａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
　２，１６１（＋９８２））（以上第４図■）。

−・力、クラブより抽出したアクアリン蛋白のＮ末端近
傍のアミノ酸配列及びブロモシアン分解後のアミノ酸配
列を決定し、それに対応するＤＮＡ１１！　）、’；、
配列を有する１４ヌクレオチドを化学合成し、に述のｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプローブ
として用いた。塩基配列の決定を行い、アクアリン蛋白
のアミノ酸配列およびアミノ醜組成よりアクアリン遺伝
子と同定した（以上第４図■）。

以Ｆの説明に係る第５図■において用いたＯｋａ２ａｍ
ａ−Ｂｅｒｇのベクター及びＯｌｉｇｏ（ｄＧ）　ｌ１
ｎｋｅｙは、第５図の■および■に示す方法で調製した
。

［発明の効果］ 前述したように、本発明の７クアリンｃＤＮＡクローン
ｐＡＱ　４４０により製造される発光蛋白アクアリンは
、微量のＣａ２・定量用の臨床医薬若しくは試薬として
有用であることは明白である。そして、該アクアリンの
合成を行わせるためにこのクローンの宿主として原核細
胞宿主（たとえば大腸菌）若しくは真核細胞宿主（たと
えば培養細胞系）を用いることができる。このような宿
主は、同業者に周知のものである。また、本発明に係る
ｃＤＮＡクローンｐＡＱ　４４０に含有されるアクアリ
ン遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法で
他のベクター若しくは宿主へクローン化することにも利
用できる。

本発明によれば適当な宿主のよるクラブ発光蛋白アクア
リン生産を行う場合、前述の手法で、クローニングした
。アクアリンｃＤＮＡ遺伝子を用いることにより、容易
に達成できる。該遺伝子をクローニングすることにより
、アクアリン蛋白のアミノ酸配列（蛋白の一次構造）を
本発明で明らかにした。すなわちアクアリン遺伝子を特
定することにより、アクアリン蛋白のアミノ酸配列を特
定することがｏｆ能である。このことは分子生物学の領
域では自明のことである。さらに、１個の特定のアミノ
酸を特定する遺伝ｆ−は、複数のアミノ酸コドン（３個
のヌクレオチド）で決定されることも自ＩＩであり、未
発！夛１でＩＪＩらかにしたアクアリン蛋白の一次構造
と機能的同等物（発光能を有するアクアリン蛋白）は、
同一のアミノ酸コドンを用いて作成したものと同一とな
る。

［実施例］ 以下実施例によって本発明を説明する。

実施例１ ■　ｃＤＮＡライブラリーの作成：第４図に従って説明
する。

（ステップ１　：　ｃＤＮＡの合成） クラブの傘縁１１６ｇをグアニジン塩酸法酸法によって
処理し、全ＲＮＡ５ｍｇを得た。このものを５０．ｇの
オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフ２人により
、５．１　弘ｇのｐｏｌｙＡ・メツセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）を得た。

このうち３．８　ｇ　ｇノｐｏ１７Ａ°ＲＮＡを凍結乾
燥し、１０鉢文の５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪＬ　（ｐ
Ｈ８，３）　ｂｕｆｆｅｒに溶解し、９０℃で１分間イ
ンキュベーションした０次に３７℃で５分間ブレインキ
ュベートし、１０＃Ｌ文の反応液（後述）を加え、逆転
写酵素（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ社製）を１．ＯＵ加
え３７℃で６０分間インキュベートした。

前述の反応液の組成は、５００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）Ｉ
Ｃｉ　（ｐＨ８．３）　　ｂｕｆｆｅｒ、８０　　ｍＭ
　　　ＭｇＣ１１２，３００ｍＭ　　ＫＣＩ　　；２ｈ
Ｑ　、２０ｍＭｄＮＴＰ　　；２ｇｌ、　　１．４　　
ｇｇ　　　ＬｇｌＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　　ｐｒｉ
ｍｅｒ−ＤＮＡ　　；　　ｌ　　ｇｌ　　、；　　Ｈ２
Ｏ；　　２μｆＬ　　、３０００Ｃ：ｉ／＋ｓｍｏｌ　
　ａ−［３２Ｆ］−ｄＣＴＰ　　；１　　ｇｌ　　。

６ｍＭジチオスレイトール；１ル交である。

上述の反応後２ル立の２５０５Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｌ壓
旦の１０％ＳＯＳを添加して反応を停＋Ｌ　Ｌ、該反応
系と同１、ｔのフェノールクロロホルムで抽出し、該抽
出物のＩｚ　Ｖ＋’ｉの４１４のＡ＋ｓｍａｍｉｕｍ　
ａｃｅｔａｔｅを力１１え、エタノール沈殿し、該沈殿
を７５％エタノールで洗浄後真空デシケータ−中で乾爆
させた。

（ステップ２：ｄＣ鎖付加） ステップｌで得られた沈殿に１．４．１の反応液（後述
）を加えて溶解させた後１＝文（＋５Ｕ　）のターミナ
ルトランスフェラーゼ（Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅ腸１ｃａ
ｌ　Ｉｎｃ製）を加え３７℃で３分間反応させ、ＥＤＴ
ＡＳＤＳを加え該反応を停止した後フェノール・クロロ
ホルムで抽出する常法によりＤＮＡを回収した。

前述の反応液の組成は、１．４Ｍカコジル酸−０，３Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８，８）パー／　７　ｙ　　
；　１．５　ｋｌ　、　１０ｍＭＣａＣｌ２；　　１．
５ｐｆｌ、　　１ｍＭ　　ｄＣＴＰ　　；　　ｌ　　ｇ
ｌ、　　ａ［”　　Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ　　　
１　ｍｍｏｌ）；　１　　ｇ　ｌ　　、Ｈ２Ｏ；５．５
ｐｉ、１ｍＭ　　ジチオスレイトール、１．５．１であ
る。

（ステップ３　：　ＨｉｎｄＩＩＩ消化）ステップ２で
得られた回収ＤＮＡに１弘文の反応液（後述）、木８ｇ
ｌ、Ｈｉｎｄｍ　（２０Ｕ　／　Ｐ　ｌ　）ｌｕ、ｌを
加え３７℃で６００分間反応せたのち常法によりＤＮＡ
を回収した。前述の反応液の組成は２００　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｕ　（ｐＨ７，５）　、７０１１ＭにｇＣ１
２，８００１１ＭＮａＣ文である。

（ステップ４　：　ＲＮＡ鎖からＤＮＡ鎖への変成）ス
テップ３で旧ｎｄｍ消化したｃＤＮＡ−ｐｒ　ｉｍｅｒ
ＤＮＡ溶液１ｇ文に１０用文の反応液（後述）を加え、
６５℃で２分間、４２℃で３０分間インキュベート後水
冷し、ｄＧｆｉを有する１ｉｎｋｅｒ　ＤＮＡとｃＤＮ
Ａ　ｐｒｉｍｅｒ　ＩＩＩＮＡを７ニーリングした。

前述の反応液の組成は、　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
見（ｐＨ７，５）　　、１　　　ｍＨＥＤＴＡ、　　０
．１　　Ｍ　　ＮａＣＪｌｊ、　　７ｎｇ　　　Ｏｎ　
　：９０（ｄＧ）　ｔａｉｌｅｄ　１ｉｎｋｅｒである
。

ト述のアニーリング後、下記の条件で１２℃で１１晩放
置した。

反１４ｊ八ツファ−１０ル文 ２００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｕ　　ｐＨ７，５４０ｍ
ＭＮｇＣ文？ １００　ｍＭ　（ＮＨａ）２ｓＯ４ ５ｍＭβ−ＭＡＤ・　　　　　　　　　　２　μ立木 ７．６　ｗ見 ４００　ｗ文／ｍ旦 ０．７　ル立 Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｉｉｇａｓｅ さらにド記のものを順次加えて１２℃で１時間反応させ
た後、２５℃でさらに３時間インキュベートした。

４ｍＭｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　１　　ｇ
ｌ５　　ｍＭβ−ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　ｌ　
　鋳文３５０　　Ｕ／　ｐＬ　Ｉ　　Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ　　　　　　　　　　０．８　　ｇ１４６０Ｕ／ｇ
ＱＲＮａｓｅＨｌ　　ｇｌ（ステップ５：形質転換） ステップ４で（１）られた環状ＤＮＡを常法壽により調
製されたコンピテントセルＤＨ１にトランスホーメーシ
ョンを行い、約１５，０００個のトランスホーマントを
得た。

（＋１木り、Ｈａｎａｋａｎ、Ｊ、　）ｌｏｌ、　Ｂｉ
ａｌ、　１６６５５７（１９８３））以上のステップ１
〜５ＩこよってクラブのｃＤＮＡライブラリーを得た。

（２）　　アクアリン遺伝子のスクリーニング法：クラ
ブより？ｎ＃したアクアリン蛋白のアミノ酸配列を決定
した。

該蛋白のＮ末端は Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ（）（）　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａ
ｓｐ　Ａｓ５Ｐｒｏ・・φ ブロモシアン処理後は Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　
Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　ＧｌｙＮｅｔ（Ｐｈｅ
）Ａｓｎ　　（Ｐｈｅ）Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｖａｔ　
　Ａｓｎ（）ＡＳｎ　　ｃ１７　　・・・ である。

次に上記のアミノ酸に対応する４種のＤＮＡを合成装置
を用いて作成した。

ＡＱ　： ＡＱＩ ＡＱ２ ＡＱ３ ＡＱ４ ＧＡＴ　　　ＴＴＴ ＣＣ ＡＴＧ　　　ＧＡＴ ＧＡＴ ＣＴ ＧＡＴ 　Ｃ Ｇ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＡ Ｇ ＡＴＧ ＡＣ ＣＴ Ｇ ＡＴＧ ＡＣ ＣＡ Ｇ 以１−の４種のＤＮＡ末端を下記の条件で５°を３２ｐ
でラベルしてプロ ブとして用いた。

ｌｐｇ：ＤＮＡ １　０　　、１　　：　　（０，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ　　
ＨＣＩ　　、ｐＨ７，６，０，１ＭＭｇＣＩ２５０ｍＭ
　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ１履Ｍ　
　ＥＤＴＡ） ５０　ル交　：　γ−３２Ｐ　−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ
／ｓ＋　　■ｏｌ）５００ルＣ１ ４０ル交：水 ２　　＃Ｌ　ｌ：　　丁ａ　　ｐｏｌｔｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ　　Ｋｉｎａｓｅ（ＴａｋａｒａＦ−１） このプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーより常法１
のコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グを行い（ポジティブな）クローンｐ　ＡＱ　４４０を
得た。

（註木Ｒ，Ｂ、Ｗａｌｌａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　”４この（ポジティブな
）クローンにｐ　ＡＱ　４４０についテＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法によりそ（７）ａ！基配列を決定し、ア
ミノ酸配列その他タンパク質的性質をクラゲ発光蛋白と
比較したところ一致した。

実施例２ 実施例１でクローニングしたｃＤＮＡクローンｐＡＱ４
４０を用いたアクアリン蛋白の製造法は以下のとおりで
ある。

ｃＤＮＡ　クローンｐＡＱ４４０プラスミドを含む大腸
菌株ＤＨＩをアンピシリン、５０ｐｇ　／ｍｌの濃度で
含むνＢ培ＪＩＩ！（バクトドリプトン（１０ｇ）、イ
ーストエキス（５ｇ）　　、　　ＮａＣ又（５ｇ）、を
木ｔｉに含む。

ｐＨ７，２）で、−中夜３７℃で培養する。その後、５
、ＯＯＯｒｐｍで１０分間の遠心分離υ−により、１０
ｍ文の培香菌体の集菌を行う、集菌体を３０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−８０１゜ｐｌ（７，８，ｌＱｍＭ　ＥＤＴＡを含
むバッファ　−１ｍ　ｆｌに溶かし１．ｔｆｌ音波処理
（プランソン社、ソニファイヤーで１０秒間隔６回）に
より菌体を破砕し、１０．００Ｏｒｐｍ、１０分間の遠
心分路によりそのに清液を取得する。このｌ害＋’ｊ　
府について、アクアリン活性を測定する。

ａ１喝定組成は Ｌニー　７＋’ｉ液　　　　　　　　　　　　　１００
用文バー／　７７−　（３０１１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ７，６゜ｌｏａＭ　ＥＤＴＡ　　）　　　　　　　
　　　　　９００弘　文セレンテラジン（１鉢ｇ／ｍｉ
）　　　５川交２−メルカプトエタノール（和光製）　
　５鉢文であり、４℃、２時間放置後この１００鉢文に
１ｍ交ＣａＣ交２　（３０ｍ　ＡＬ）の添加を行い、生
成する発光をフォトマルで検出する。

コントロールとして、アクアリン遺伝子を含まないｐＢ
Ｒ３２２プラスミドを用いてその発光を検出した。

その結果を下表に示した。

ｃＤＮＡクローンＰＡＱ４４０によるアクアリンの製造
（培養液１ｍ文当り） ｐＢＲ３２２ ０、Ｏ Ｏ、Ｏ 明らかに、ｃＤＮＡクローンｐＡＱ４４０を用いて発光
能を有するアクアリン蛋白を生産することが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプラスミドｐ　ＡＱ　４４０のヌクレ
オチド配列を示す。 第２図はクローニングされたプラスミドＰ　ＡＱ　４４
０のアクアリン遺伝子の制限酵素地図を示す。 第３図はクローニングさらたアクアリン遺伝子の詳細な
制限酵素地図およびマキサム・ギル／ヘト法による塩基
配列の決定の方向を示す。 第４図■はｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒ７作成法を示す工程
図であり 第４図■はｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙからアクアリン遺
伝子のスクリーニング法を示す工程図である。 第５図■はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　Ｖｅｃｔｏｒの
調製法を示し、 第５図■は旧ｉｇｏ（ｄＧ）　ｔａｉｌｅｄ　ｔｉｎｋ
ｅｒ　（７）調製法を示す。 以」二 特許

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の発光蛋白アクアリンのデオキシリボヌクレ
   オチド配列若しくはこのヌクレオチド配列の機能的同等
   物を含有するように修飾された宿主を培養することを特
   徴とするクラゲ発光蛋白アクアリンの製法。 【遺伝子配列があります】 ここで５′〜３′のストランドは、アミン末端および各
   トリプレット番号が示されているアミノ酸ではじまり、
   そして各三つ組において、 Ａはデオキシアデニルであり、 Ｔはデオキシチミジルであり、 Ｇはデオキシグアニルであり、 Ｃはデオキシトシルであり、 Ｇｌｙはグリシンであり、 Ａｌａはアラニンであり、 Ｖａｌはバリンであり、 Ｌｅｕはロイシンであり、 Ｉｌｅはイソロイシンであり、 Ｓｅｒはセリンであり、 Ｔｈｒはチロシンであり、 Ｔｒｐはトリプトファンであり、 Ｃｙｓはシステインであり、 Ｍｅｔはメチオニンであり、 Ａｓｐはアスパラギン酸であり、 Ｇｌｕはグルタミン酸であり、 Ｌｙｓはリジンであり、 Ａｒｇはアルギニンであり、 Ｈｉｓはヒスチジンであり、 Ｐｒｏはプロリンであり、 Ｇｌｕはグルタミンであり、 Ａｓｎはアスパラギン である。
2. （２）宿主が真核細胞である特許請求の範囲第（１）項
   に記載の方法。
3. （３）宿主が細菌である特許請求の範囲第（１）項に記
   載の方法。
4. （４）細菌が大腸菌である特許請求の範囲第（３）項に
   記載の方法。