JP2010119322A - シャペロニン変異体およびこれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Abstract
【課題】ＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供する。
【解決手段】シャペロニン変異体を、特定のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、特定のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成する。また、特定の塩基配列からなるＤＮＡ、または、特定の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【選択図】なし
【解決手段】シャペロニン変異体を、特定のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、特定のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成する。また、特定の塩基配列からなるＤＮＡ、または、特定の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【選択図】なし
Description
本発明は、シャペロニン変異体およびこれをコードするＤＮＡに関する。
シャペロニンは、基質タンパク質の正しいフォールディングを介助するいわゆる分子シャペロンの１種である。シャペロニンファミリーは、分子量５０〜６０ｋＤａのタンパク質であり、リング状の複合体構造をとり、ＡＴＰ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助するという共通の特徴を有している。シャペロニンの中でも、ＧｒｏＥＬは大腸菌が有するシャペロニンであり、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的にタンパク質のフォールディングを介助することが明らかにされている。
シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。
シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。
基質タンパク質のフォールディングにおいては、まずシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットで構成されたリングの「入り口」に基質タンパク質が結合し、リングを構成するシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットに７つのＡＴＰがそれぞれ結合すると、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こって補因子であるＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合可能となる。次いで、ＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合すると、基質タンパク質がリングの空洞内に落とし込まれ、シャペロニン複合体を形成する。シャペロニン複合体ではリングの空洞内で落とし込まれた基質タンパク質のフォールディングが進行する。次いでリング内のＡＴＰが加水分解されるとＧｒｏＥＳが解離し、それと同時にリング内のフォールディングされた基質タンパク質も解離する。すなわち、ＡＴＰの加水分解の時間がシャペロニンＧｒｏＥＬの反応サイクルのタイマーになっている。
ＡＴＰの加水分解の時間は、野生型ＧｒｏＥＬでは約８秒である。一方、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに置換されたＧｒｏＥＬ変異体（以下、「ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）」ということがある）では、ＡＴＰの加水分解活性が野生型の２％以下となり複合体の半減期が３０分以上となることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．９７、ｐ３２５〜３３８、１９９９．
ＡＴＰの加水分解の時間は、野生型ＧｒｏＥＬでは約８秒である。一方、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに置換されたＧｒｏＥＬ変異体（以下、「ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）」ということがある）では、ＡＴＰの加水分解活性が野生型の２％以下となり複合体の半減期が３０分以上となることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．９７、ｐ３２５〜３３８、１９９９．
非特許文献１に記載のシャペロニン変異体は、シャペロニンによるフォールディング反応の生化学的解析に利用されているが、より詳細な解析等のため、半減期がより長いシャペロニン変異体が要望されている。
本発明は、従来のシャペロニン変異体よりもＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
本発明は、従来のシャペロニン変異体よりもＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
すなわち本発明の第１の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
また本発明の第２の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を少なくとも１つ含むシャペロニン変異体である。
すなわち本発明の第１の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
また本発明の第２の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を少なくとも１つ含むシャペロニン変異体である。
本発明の第３の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡである。前記ＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。
本発明の第４の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターである。また本発明の第５の態様は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明の第６の態様は、前記シャペロニン変異体および被内包物を接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記被内包物を内包すること、を含むシャペロニン複合体の製造方法である。
さらに本発明の第７の態様は、前記シャペロニン変異体と目的タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記タンパク質を内包することと、目的タンパク質の構造を解析することと、を含む目的タンパク質の構造解析方法である。
さらに本発明の第７の態様は、前記シャペロニン変異体と目的タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記タンパク質を内包することと、目的タンパク質の構造を解析することと、を含む目的タンパク質の構造解析方法である。
本発明によれば、従来のシャペロニン変異体よりもＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供することができる。
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するタンパク質である。
かかる構成のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列における５２番目と３９８番目のアスパラギン酸がアラニンに変異しているため、ＡＴＰの加水分解活性が顕著に低下している。このため、これを含んで構成されるシャペロニン変異体の反応サイクルを従来のシャペロニン変異体、例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）と比べて、フォールディング活性を低下させることなく、飛躍的に延ばすことができる。
かかる構成のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列における５２番目と３９８番目のアスパラギン酸がアラニンに変異しているため、ＡＴＰの加水分解活性が顕著に低下している。このため、これを含んで構成されるシャペロニン変異体の反応サイクルを従来のシャペロニン変異体、例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）と比べて、フォールディング活性を低下させることなく、飛躍的に延ばすことができる。
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異体における５２番目のアスパラギン酸をアラニンにさらに変異させることで、相乗的にＡＴＰの加水分解活性が低下するという本発明者らが初めて見出した知見に基づいて完成されたものである。
尚、本明細書においては、ＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ」、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体」、「シャペロニンＧｒｏＥＬ」と基質タンパク質等との複合体を「シャペロニン複合体」と称する。
尚、本明細書においては、ＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ」、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体」、「シャペロニンＧｒｏＥＬ」と基質タンパク質等との複合体を「シャペロニン複合体」と称する。
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、ＡＴＰの加水分解活性が低下しているものであれば特に制限はない。
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列のうち５２番および３９８番のアラニン以外の位置における、アミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１５以下、より好ましくは１０以下であり、さらに好ましくは５以下である。
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列のうち５２番および３９８番のアラニン以外の位置における、アミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１５以下、より好ましくは１０以下であり、さらに好ましくは５以下である。
前記アミノ酸の置換としては、以下のような例が挙げられる。
一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は好ましく許容される。
一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は好ましく許容される。
本発明におけるアミノ酸の置換は、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体に機能を追加するものであってもよい。新たな機能を付加する置換の具体例としては、例えば、野生型ＧｒｏＥＬの４９０番のアスパラギン酸をシステインに変異させた変異体（Nat. Biotechnol., 2001 Sep; 19(9): 861-5.）が挙げられる。かかる変異は、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体をガラス基板等に固定化することを可能にする。また、２６５番のアスパラギンをアラニンに変異させた変異体（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Jan 27; 267(3): 842-9.）を挙げることもできる。かかる変異は変性タンパク質をより強固にシャペロニンＧｒｏＥＬ変異体に結合することを可能にする。
また前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体において、さらにアミノ酸が欠失、付加（挿入）された変異体は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体と同様の機能を有するものであっても、さらに機能が追加されたものであってもよい。これらの具体例としては、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニットにおけるＣ末端の繰返し配列を欠失、付加した変異体（Cell, 2006 Jun 2; 125(5): 903-14.）を挙げることができる。かかる変異は、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の空洞の体積を変化させることを可能とする。
更に本発明におけるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、用途に応じて、１以上のアミノ酸がさらに付加したものであってもよい。このような付加可能なアミノ酸としては、シグナルペプチド、タグ配列等を挙げることができる。
更に本発明におけるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、用途に応じて、１以上のアミノ酸がさらに付加したものであってもよい。このような付加可能なアミノ酸としては、シグナルペプチド、タグ配列等を挙げることができる。
本発明における配列番号１のアミノ酸配列中、５２番と３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬ変異体サブユニットとしては、前記具体例として挙げた変異以外の変異を有するものであってもよい。そのような変異としては例えば、Cell. 2002 Dec 27; 111(7): 1027-39．等に記載された特定のタンパク質をより効率的にフォールディングすることを可能にする変異や、Cell. 1995 Nov 17; 83(4): 577-87.等に記載された単一のリングからなる７量体を形成することを可能にする変異等をあげることができる。
本発明におけるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを通常用いられる方法で発現させることで製造することができる。具体的には、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを、組換えベクターに応じて選択される宿主細胞に感染させて、宿主細胞を培養することで製造することができる。
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡに、対応する変異を導入することで得ることができる。導入する変異は少なくともアミノ酸配列における５２番目と３９８番目のアスパラギン酸をアラニンに変異するものであればよい。
変異の導入方法としては、通常用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲを用いる方法や、部位特異的突然変異導入キット（例えば、Stratagene社製等）を用いる方法等を挙げることができる。
変異の導入方法としては、通常用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲを用いる方法や、部位特異的突然変異導入キット（例えば、Stratagene社製等）を用いる方法等を挙げることができる。
本発明においてＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。
本発明における配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、対応するＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列のうち５２番目と３９８番目に相当するアスパラギン酸がアラニンに変異しているタンパク質をコードすることが必要である。
本発明における配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、対応するＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列のうち５２番目と３９８番目に相当するアスパラギン酸がアラニンに変異しているタンパク質をコードすることが必要である。
またストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６５℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
本発明の組換えベクターは、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードするＤＮＡを含む。また本発明の形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されたものである。かかる組換えベクター、および形質転換体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の製造に好適に用いることができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードするＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。前記ＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp50等)などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに前記ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。本発明において前記ＤＮＡは、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、前記ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）等が挙げられる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的ＤＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。またサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母も挙げられる。さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞や、Ｓｆ９等の昆虫細胞も挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) ＤＨ５α、Ｙ１０９０、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また前記プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
宿主細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
宿主細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J.Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J.Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。
目的ＤＮＡが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常用いられる条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物（例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等）が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で行う。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
宿主の培養後、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抽出することができる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を単離精製することができる。
本発明のシャペロニン変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体の少なくとも１種を含む。
すなわち、本発明のシャペロニン変異体を構成する７以上（好ましくは１４）のＧｒｏＥＬサブユニットのうち、少なくとも１つは上記のＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
すなわち、本発明のシャペロニン変異体を構成する７以上（好ましくは１４）のＧｒｏＥＬサブユニットのうち、少なくとも１つは上記のＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
かかる構成のシャペロニン変異体は、従来知られているシャペロニン変異体（例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ））と比べて顕著にＡＴＰの加水分解活性が低下して、この変異体が基質タンパク質等と形成するシャペロニン複合体の保持時間を延長することを可能としながら、フォールディング活性は低下していないという優れた効果を奏する。さらに本発明のシャペロニン変異体は、シャペロニン変異体を構成する２つのリング（空洞）に同時に被内包物（例えば、タンパク質）を内包することができるため、より効率的に被内包物をシャペロニン複合体内に内包することができる。
本発明のシャペロニン変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニットの数は、被内包物を内包可能であれば特に制限はないが、７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。またこれらのサブユニットのうち、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと同等のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体の数は少なくとも１であるが、ＡＴＰの加水分解活性の観点から、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。
尚、本発明のシャペロニン変異体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニットの集合から、通常の条件下、例えば、ＡＴＰ依存的（Nature, 1990 Nov 22; 348(6299): 339-42）に形成される。
尚、本発明のシャペロニン変異体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニットの集合から、通常の条件下、例えば、ＡＴＰ依存的（Nature, 1990 Nov 22; 348(6299): 339-42）に形成される。
本発明のシャペロニン複合体の製造方法は、前記シャペロニン変異体と、被内包物とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記被内包物を内包し、被内包物が内包されたシャペロニン複合体を形成することを含む。
本発明においては、シャペロニン変異体のＡＴＰ加水分解活性が低下していることで、被内包物を内包したシャペロニン複合体の状態を長時間維持することができる。
本発明においては、シャペロニン変異体のＡＴＰ加水分解活性が低下していることで、被内包物を内包したシャペロニン複合体の状態を長時間維持することができる。
本発明における被内包物は、シャペロニン変異体が内包可能なものであれば特に制限はない。具体的には例えば、タンパク質、凝集性の有機化合物等を挙げることができる。さらに例えば、Nature 2003 Jun 5; 423(6940): 628-32.等に記載されているような半導体ナノ粒子（量子ドット）等であってもよい。
また本発明における被内包物は、シャペロニン変異体に内包されることから、例えば、タンパク質の場合、６０ｋＤａ以下の大きさであることが好ましい。
また本発明における被内包物は、シャペロニン変異体に内包されることから、例えば、タンパク質の場合、６０ｋＤａ以下の大きさであることが好ましい。
本発明のシャペロニン複合体においては、シャペロニン変異体が、特定の変異を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されているため、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）に比べて遥かに長時間にわたって被内包物をシャペロニン変異体内に内包した状態を維持することができる。具体的には例えば、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニンにおいては８秒程度の内包時間であり、公知の変異体であるＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）サブユニットからなるシャペロニン変異体においては１時間程度であるのに対して、本発明のＧｒｏＥＬ（Ｄ５２、３９８Ａ）サブユニットからなるシャペロニン変異体においては５日以上と圧倒的に長時間にわたってシャペロニン複合体の維持が可能となる。
このように安定なシャペロニン複合体は種々の用途に適用することができる。例えば、凝集性の目的タンパク質の製造に適用することで、該目的タンパク質を凝集させることなく、正しいフォールディング状態で安定に製造することができる。また、被内包物の構造解析、被内包物の徐放、被内包物の分散等に用いることができる。
本発明のシャペロニン複合体の製造方法においては、前記シャペロニン変異体と被内包物とを接触させてシャペロニン変異体内に被内包物を内包させることを含むが、シャペロニン変異体と被内包物を接触させる際に、ＡＴＰと、ＧｒｏＥＳタンパク質と、金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）をさらに共存させることが好ましい。これにより、より効率的に被内包物をシャペロニン変異体内に内包することができる。
前記ＧｒｏＥＳタンパク質は、シャペロニンＧｒｏＥＬの補因子として作用し、被内包物をシャペロニンＧｒｏＥＬの空洞内に閉じ込めることができる。本発明においてＧｒｏＥＳタンパク質は、野生型のＧｒｏＥＳタンパク質であっても、ＧｒｏＥＳ変異体であってもよい。またＧｒｏＥＳタンパク質に蛍光ラベル等を常法により付加したものであってもよい。前記蛍光ラベル等には通常用いられる蛍光ラベル等を特に制限なく用いることができる。
また本発明においては、前記ＡＴＰの代わりにＡＴＰ代替化合物を用いてもよい。ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体のＡＴＰ結合部位に結合可能で、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の構造変化を引き起こすことが可能な化合物であれば特に制限はない。例えば、ＡＤＰ、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物（J. Biol. Chem., 279, 45737-45743 (2004).）、ＡＤＰとフッ化アルミニウムやフッ化ガリウムの付加物（J. Mol. Biol., 2003 May 23; 329(1): 121-34.）等を挙げることができる。
ＡＴＰ代替化合物として、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ加水分解部位で加水分解されない化合物（例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物等）を用いることで、さらに長時間にわたって被内包物が内包されたシャペロニン複合体を維持することができる。
ＡＴＰ代替化合物として、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ加水分解部位で加水分解されない化合物（例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物等）を用いることで、さらに長時間にわたって被内包物が内包されたシャペロニン複合体を維持することができる。
本発明のシャペロニン複合体の製造方法で得られるシャペロニン複合体においては、任意のタイミングで被内包物を放出させることができる。具体的にはシャペロニン複合体を構成する金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）の濃度を、通常用いられる方法（例えば、金属キレート化合物を用いる方法）で低下させることでシャペロニン複合体から被内包物を放出することができる。
また、本発明のシャペロニン複合体の製造方法で得られるシャペロニン複合体においては、シャペロニン複合体を構成するＡＴＰの加水分解に伴って、徐々に（例えば、半減期５日以上）被内包物を放出することもできる。
このようなシャペロニン複合体の徐放性は、例えば、被内包物の構造解析、フォールディングされたタンパク質の製造方法、ドラッグデリバリーシステム等に応用することができる。
このようなシャペロニン複合体の徐放性は、例えば、被内包物の構造解析、フォールディングされたタンパク質の製造方法、ドラッグデリバリーシステム等に応用することができる。
本発明の目的タンパク質の構造解析方法は、本発明のシャペロニン変異体と、タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記目的タンパク質を内包することを含む。
本発明のシャペロニン変異体内に目的タンパク質を内包することで、目的タンパク質の構造を正しいフォールディング状態で構造解析を行うことができる。また、目的タンパク質の内包状態を長時間維持可能であることから、通常用いられる種々の構造解析方法を適用することが可能となる。
本発明のシャペロニン変異体内に目的タンパク質を内包することで、目的タンパク質の構造を正しいフォールディング状態で構造解析を行うことができる。また、目的タンパク質の内包状態を長時間維持可能であることから、通常用いられる種々の構造解析方法を適用することが可能となる。
本発明の目的タンパク質の構造解析方法は、シャペロニン変異体と前記シャペロニン変異体に内包された目的タンパク質とを含むシャペロニン複合体を用いるものであれば特に制限はなく、通常用いられるタンパク質の構造解析方法を適用することができる。具体的には例えば、Ｘ線等を用いる結晶構造解析方法、電子顕微鏡法、ＮＭＲ等を挙げることができる。
本発明におけるシャペロニン複合体は、長時間安定な状態で存在できるため、シャペロニン複合体として結晶化させることが可能である。かかるシャペロニン複合体結晶の構造と目的タンパク質を含まないシャペロニン変異体結晶の構造の差異から、目的タンパク質の正しいフォールディング状態での構造を解析することが可能となる（例えば、Nat. Struc. Mol. Biol., 2008 Jul; 15(7): 754-60）。
また本発明におけるシャペロニン複合体は、通常は凝集体を形成しやすい目的タンパク質を正しいフォールディング状態で長時間にわたって徐放することが可能であるため、例えば、ＮＭＲを用いた溶液状態での目的タンパク質の構造解析や結晶構造解析のための目的タンパク質の結晶成長が可能となる。
また本発明におけるシャペロニン複合体は、通常は凝集体を形成しやすい目的タンパク質を正しいフォールディング状態で長時間にわたって徐放することが可能であるため、例えば、ＮＭＲを用いた溶液状態での目的タンパク質の構造解析や結晶構造解析のための目的タンパク質の結晶成長が可能となる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。また、本実施例で市販のキットを用いる場合は、そのキットの取扱説明書に従って操作を行った。
１．ＧｒｏＥＬサブユニット変異体ＤＮＡの調製
出発遺伝子材料として、Escherichia coliのシャペロニンＧｒｏＥＬをコードする遺伝子断片を含有するプラスミドｐＥＴ−ＥＬ(Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000))を用いた。ｐＥＴ−ＥＬプラスミドの１本鎖ＤＮＡは、大腸菌ＣＪ２３６にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７(Amersham Pharmacia Biotech)を感染させることで調製した。
次いで、下記表１に示した合成ＤＮＡ１（配列番号３）を用いて、kunkel法(Methods Enzymol. 154, 367-382)により、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を作製した。
出発遺伝子材料として、Escherichia coliのシャペロニンＧｒｏＥＬをコードする遺伝子断片を含有するプラスミドｐＥＴ−ＥＬ(Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000))を用いた。ｐＥＴ−ＥＬプラスミドの１本鎖ＤＮＡは、大腸菌ＣＪ２３６にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７(Amersham Pharmacia Biotech)を感染させることで調製した。
次いで、下記表１に示した合成ＤＮＡ１（配列番号３）を用いて、kunkel法(Methods Enzymol. 154, 367-382)により、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を作製した。
次に、下記表１に示した合成ＤＮＡ２（配列番号４）および合成ＤＮＡ３（配列番号５）を用い、Quick Change site-directed mutagenesis法 (Stratagene社製)により、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、５２番のアスパラギン酸がアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２Ａ）をコードする遺伝子を持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２Ａ）を作製した。
得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片を切り出し、上記で得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片と入れ替えることで、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を作製した。
得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片を切り出し、上記で得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片と入れ替えることで、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を作製した。
２．シャペロニン変異体の調製
上記で得られたプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地中、３７℃の温度条件で、６００ｎｍにおける吸光度が０．８になるまで培養し、１ｍＭのisopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを加えてさらに２時間培養した。
遠心により集菌し、超音波破砕用緩衝液（25mM Tris(pH 7.5)、1mM EDTA、1mM dithiothreitol(DTT)、1mM 4-(2-aminoethyl)-benzene-sulfonyl fluoride hydrochloride）で懸濁した後、超音波破砕した。遠心分離した上清をBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で精製し、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異したシャペロニンＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体を得た。
また、補因子であるＧｒｏＥＳタンパク質は、ＧｒｏＥＳ発現用プラスミドｐＥＴ−ＥＳ２を用いてBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で調製した。
上記で得られたプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地中、３７℃の温度条件で、６００ｎｍにおける吸光度が０．８になるまで培養し、１ｍＭのisopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを加えてさらに２時間培養した。
遠心により集菌し、超音波破砕用緩衝液（25mM Tris(pH 7.5)、1mM EDTA、1mM dithiothreitol(DTT)、1mM 4-(2-aminoethyl)-benzene-sulfonyl fluoride hydrochloride）で懸濁した後、超音波破砕した。遠心分離した上清をBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で精製し、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異したシャペロニンＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体を得た。
また、補因子であるＧｒｏＥＳタンパク質は、ＧｒｏＥＳ発現用プラスミドｐＥＴ−ＥＳ２を用いてBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で調製した。
３．ＡＴＰ加水分解活性の測定
シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体からのＡＤＰの解離を、ＡＴＰ再生法（Mol. Cell 114,423-434(2004)）を用いて測定することで、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体のＡＴＰ加水分解活性を測定した。
反応溶液はＨＫＭ緩衝液（20mM HEPES-KOH (pH 7.4)、100mM KCl、5mM MgCl2）中に0.2mM NADH、5mM phosphoenolpyruvate、100μg/ml pyruvate kinase、100μg/ml lactate dehydrogenase、5mM dithiothreitol(DTT)、20μM lactalbumin、および、０．２μＭ ＧｒｏＥＬと０．６μＭ ＧｒｏＥＳ（図１）または２．５μＭ ＧｒｏＥＬと５μＭ ＧｒｏＥＳ（図２）を含む。
反応液に１ｍＭのＡＴＰを加えることで反応を開始し、ＮＡＤＨの酸化に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を連続的に計測した。
結果を図１および図２に示した。なお、図１はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が０．２μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が０．６μＭの結果を示し、図２はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が２．５μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が５μＭの結果を示す。
シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体からのＡＤＰの解離を、ＡＴＰ再生法（Mol. Cell 114,423-434(2004)）を用いて測定することで、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体のＡＴＰ加水分解活性を測定した。
反応溶液はＨＫＭ緩衝液（20mM HEPES-KOH (pH 7.4)、100mM KCl、5mM MgCl2）中に0.2mM NADH、5mM phosphoenolpyruvate、100μg/ml pyruvate kinase、100μg/ml lactate dehydrogenase、5mM dithiothreitol(DTT)、20μM lactalbumin、および、０．２μＭ ＧｒｏＥＬと０．６μＭ ＧｒｏＥＳ（図１）または２．５μＭ ＧｒｏＥＬと５μＭ ＧｒｏＥＳ（図２）を含む。
反応液に１ｍＭのＡＴＰを加えることで反応を開始し、ＮＡＤＨの酸化に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を連続的に計測した。
結果を図１および図２に示した。なお、図１はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が０．２μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が０．６μＭの結果を示し、図２はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が２．５μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が５μＭの結果を示す。
図１および図２から、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は、野生型ＧｒｏＥＬの２５％であり、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は野生型ＧｒｏＥＬの７．０％であることが分かる。これに対して、本発明のＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は野生型ＧｒｏＥＬの３．６％にまで低下していることが分かる。
４．基質タンパク質のフォールディング活性の測定
自発的にフォールディングできないタンパク質であるRhodaneseを用いて、以下のようにしてＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体のフォールディング活性を測定した。
６Ｍ 塩酸グアニジンと１ｍＭ ＤＴＴを含む溶液中で変性したRhodaneseを、１μＭ ＧｒｏＥＬ変異体、２μＭ ＧｒｏＥＳ、２０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で４０倍に希釈して反応液とした。
それぞれの時間で反応液５μＬをサンプリングし、７５０μＬのアッセイ溶液(１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に添加して、反応を停止した。
Rhodanese活性の測定は、チオ硫酸イオンに由来するチオシアン酸イオンと硝酸鉄とによるチオシアン酸鉄の生成を４６０ｎｍの吸光度で計測する方法で行った(Acta Chem. Scand.7,1129-1136(1953))。天然型Rhodaneseは、チオ硫酸イオンとシアン化物からチオシアン酸イオンを生成する反応を触媒するが、変性Rhodaneseはこの反応を触媒することができない。従って生成したチオシアン酸鉄の濃度を測定することで、シャペロニン変異体における変性Rhodaneseから天然型Rhodaneseへのフォールディング活性を測定できる。
結果を図３に示した。図３より、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、野生型ＧｒｏＥＬと全く変わらないRhodaneseフォールディング活性を示したことがわかる。
自発的にフォールディングできないタンパク質であるRhodaneseを用いて、以下のようにしてＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体のフォールディング活性を測定した。
６Ｍ 塩酸グアニジンと１ｍＭ ＤＴＴを含む溶液中で変性したRhodaneseを、１μＭ ＧｒｏＥＬ変異体、２μＭ ＧｒｏＥＳ、２０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で４０倍に希釈して反応液とした。
それぞれの時間で反応液５μＬをサンプリングし、７５０μＬのアッセイ溶液(１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に添加して、反応を停止した。
Rhodanese活性の測定は、チオ硫酸イオンに由来するチオシアン酸イオンと硝酸鉄とによるチオシアン酸鉄の生成を４６０ｎｍの吸光度で計測する方法で行った(Acta Chem. Scand.7,1129-1136(1953))。天然型Rhodaneseは、チオ硫酸イオンとシアン化物からチオシアン酸イオンを生成する反応を触媒するが、変性Rhodaneseはこの反応を触媒することができない。従って生成したチオシアン酸鉄の濃度を測定することで、シャペロニン変異体における変性Rhodaneseから天然型Rhodaneseへのフォールディング活性を測定できる。
結果を図３に示した。図３より、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、野生型ＧｒｏＥＬと全く変わらないRhodaneseフォールディング活性を示したことがわかる。
５．シャペロニン複合体の解析
上記で得られたＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体が形成するシャペロニン複合体の構造を以下のようにしてゲルろ過クロマトグラフィーを用いて解析した。
上記で得られたＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体が形成するシャペロニン複合体の構造を以下のようにしてゲルろ過クロマトグラフィーを用いて解析した。
（１）ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）とＧｒｏＥＳの結合比率の評価
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰとを含むＨＫＭ緩衝液中で、０．３μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と０．３μＭ ＧｒｏＥＳ（常法によりＣｙ３にて蛍光ラベルしたＧｒｏＥＳ、以下、「Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ」という）と混合し、ＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離した。結果を図４Ａに示した。
図４Ａから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、ＧｒｏＥＳと１：１の弾丸型複合体を形成していることがわかる。
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰとを含むＨＫＭ緩衝液中で、０．３μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と０．３μＭ ＧｒｏＥＳ（常法によりＣｙ３にて蛍光ラベルしたＧｒｏＥＳ、以下、「Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ」という）と混合し、ＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離した。結果を図４Ａに示した。
図４Ａから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、ＧｒｏＥＳと１：１の弾丸型複合体を形成していることがわかる。
次に、１ｍＭ ＤＴＴを含むＨＫＭ緩衝液中で、０．３μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体と０．６μＭ Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳと混合し、１ｍＭ ＡＤＰまたは１ｍＭ ＡＴＰを加えて、ＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）でそれぞれ分離した。結果を図４Ｂに示した。
図４Ｂから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体とＧｒｏＥＳとは、ＡＤＰ存在下では弾丸型複合体を形成するが、ＡＴＰ存在下ではＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）：ＧｒｏＥＳ＝１:２のフットボール型複合体を形成することがわかる。
このようなフットボール型複合体は基質タンパク質を閉じ込めてフォールディングするチャンバー（空洞）が２つとも活性化された高効率の複合体である(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。
図４Ｂから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体とＧｒｏＥＳとは、ＡＤＰ存在下では弾丸型複合体を形成するが、ＡＴＰ存在下ではＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）：ＧｒｏＥＳ＝１:２のフットボール型複合体を形成することがわかる。
このようなフットボール型複合体は基質タンパク質を閉じ込めてフォールディングするチャンバー（空洞）が２つとも活性化された高効率の複合体である(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。
（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価
次に、シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合に要する時間を以下のようにして測定した。
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で１．５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と３μＭのＧｒｏＥＳ（非蛍光ラベル体）と混合することでフットボール型複合体を形成した（ｔ＝０とする）。３０秒のインキュベーションの後、複合体をゲルろ過クロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、GE Healthcare社製）で精製した。
複合体濃度を０．５μＭに調製し、１μＭ Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳと１ｍＭ ＡＴＰを加えた後、所定時間ごとにＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離し、新たなＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）の結合をＣｙ３の蛍光を測定して観察した（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）。結果を図５に示した。
次に、シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合に要する時間を以下のようにして測定した。
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で１．５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と３μＭのＧｒｏＥＳ（非蛍光ラベル体）と混合することでフットボール型複合体を形成した（ｔ＝０とする）。３０秒のインキュベーションの後、複合体をゲルろ過クロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、GE Healthcare社製）で精製した。
複合体濃度を０．５μＭに調製し、１μＭ Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳと１ｍＭ ＡＴＰを加えた後、所定時間ごとにＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離し、新たなＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）の結合をＣｙ３の蛍光を測定して観察した（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）。結果を図５に示した。
上記において、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の代わりにＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を用いた以外は、上記と同様にして新たなＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）の結合をＣｙ３の蛍光を測定して観察した（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）。さらに同様にしてＣｙ３−Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ（常法によりＣｙ３で蛍光ラベルしたＲｈｏｄａｎｅｓｅ、基質タンパク質）との結合を測定した。結果を図６Ａおよび図６Ｂに示した。
図５、図６Ａ、および図６Ｂから、ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）の場合には、３０分後から基質タンパク質または新たなＧｒｏＥＳの結合が確認できるのに対して、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の場合には、５日後から新たなＧｒｏＥＳとの結合が観察されたことがわかる。
新たなＧｒｏＥＳとの結合は、フットボール型複合体の２つのチャンバー（空洞）の少なくとも一方の反応サイクルが一巡して、ＧｒｏＥＳが解離することにより起こることがわかっている(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。したがって、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体では、反応開始５日後から最初に結合したＧｒｏＥＳが解離し始めることが示された。
新たなＧｒｏＥＳとの結合は、フットボール型複合体の２つのチャンバー（空洞）の少なくとも一方の反応サイクルが一巡して、ＧｒｏＥＳが解離することにより起こることがわかっている(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。したがって、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体では、反応開始５日後から最初に結合したＧｒｏＥＳが解離し始めることが示された。
（３）シャペロニン複合体におけるＡＴＰ加水分解活性の評価
２μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）、４μＭ ＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４を混合し、５分後にTSK-GEL guard column(Tosoh社製)でシャペロニン複合体を単離した。
所定時間経過ごとに、１．０％過塩素酸で処理して上清をＫ２ＣＯ３で中和し、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、Ｔｏｓｏｈ社製）でＡＤＰとＡＴＰを分離して、２６０ｎｍにおける吸光度から、ＡＴＰとＡＤＰとをそれぞれ定量し、全ヌクレオチド中のＡＴＰおよびＡＤＰの割合を計算し、結果を図７に示した。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にしてＧｒｏＥＳの結合量の相対値を計算した。結果を図７に示した。
２μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）、４μＭ ＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４を混合し、５分後にTSK-GEL guard column(Tosoh社製)でシャペロニン複合体を単離した。
所定時間経過ごとに、１．０％過塩素酸で処理して上清をＫ２ＣＯ３で中和し、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、Ｔｏｓｏｈ社製）でＡＤＰとＡＴＰを分離して、２６０ｎｍにおける吸光度から、ＡＴＰとＡＤＰとをそれぞれ定量し、全ヌクレオチド中のＡＴＰおよびＡＤＰの割合を計算し、結果を図７に示した。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にしてＧｒｏＥＳの結合量の相対値を計算した。結果を図７に示した。
上記において、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の代わりに、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を用いた以外は、上記と同様にしてＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）複合体におけるＡＴＰの加水分解活性を評価した。ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）１分子あたりのＡＴＰおよびＡＤＰの結合量を計算し、結果を図８に示した。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にして、ＧｒｏＥＳおよび基質タンパク質（Ｃｙ３−Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ）の結合量を計算した。結果を図８に示した。尚、空のＧｒｏＥＬ(Ｄ３９８Ａ)へのＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合量をそれぞれ２００％、１００％とした。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にして、ＧｒｏＥＳおよび基質タンパク質（Ｃｙ３−Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ）の結合量を計算した。結果を図８に示した。尚、空のＧｒｏＥＬ(Ｄ３９８Ａ)へのＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合量をそれぞれ２００％、１００％とした。
図７および図８から、ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）シャペロニン複合体においては、シャペロニン複合体に結合した１４のＡＴＰのうち、半分が加水分解してＡＤＰになるのに要する時間が３０分であるのに対して、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）シャペロニン複合体では結合したＡＴＰのうち半分が加水分解するのに５日以上を要することが示された。さらにＡＴＰの加水分解と同じくして最初のＧｒｏＥＳが解離し、次のＧｒｏＥＳの結合が可能となることが示された。
以上の結果から、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニン変異体においては、ＡＴＰの加水分解活性が低下してシャペロニン複合体の状態を長時間にわたって維持できたことがわかった。また、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニン変異体においては、基質タンパク質のフォールディング活性が低下していなかったことがわかった。
Claims (8)
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、
配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体。 - 請求項１に記載のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を少なくとも１つ含むシャペロニン変異体。
- 請求項１に記載のＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。 - 請求項３または請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項２に記載のシャペロニン変異体および被内包物を接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記被内包物を内包すること、を含むシャペロニン複合体の製造方法。
- 請求項２に記載のシャペロニン変異体と目的タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記目的タンパク質を内包することと、前記目的タンパク質の構造を解析することと、を含む目的タンパク質の構造解析方法。
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