WO2009020197A1 - 群青色蛍光タンパク質 - Google Patents

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WO2009020197A1
WO2009020197A1 PCT/JP2008/064266 JP2008064266W WO2009020197A1 WO 2009020197 A1 WO2009020197 A1 WO 2009020197A1 JP 2008064266 W JP2008064266 W JP 2008064266W WO 2009020197 A1 WO2009020197 A1 WO 2009020197A1
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WO
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amino acid
acid residue
fluorescent protein
protein
present
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PCT/JP2008/064266
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeharu Nagai
Wataru Tomosugi
Tomoki Matsuda
Original Assignee
National University Corporation Hokkaido University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent protein having improved fluorescence characteristics, and more particularly to a fluorescent protein that emits ultramarine blue.
  • a fluorescent protein derived from Equorea 'Aequorea victoria, a so-called luminescent jellyfish, so-called GFP (Green Fluorescence Protein) has a 395nm excitation spectrum peak and a 509mn emission spectrum peak, and emits green light. (Chalfie et al., Science, 1994, 263, 802-805). This Tanno mochi.
  • the presence of the fusion protein can be visually recognized by color development, and observation or confirmation of the localization of a specific substance in a living body or cell using an intact living body or cell, and also a specific It has made it possible to confirm gene expression, which has revolutionized molecular biology research.
  • Examples of the mutation sites and characteristics of GFP artificial mutants reported so far include the following examples.
  • the notation of artificial variants of GFP is, for example, tyrosine (Y, the 66th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence of wild type GFP). (Represented by ⁇ ) is represented as ⁇ 66 ⁇ , and mutants in which multiple amino acid residues are substituted at the same time indicate each substitution as high. It shall be tied with a dung (one).
  • Non-patent Document 1 a fluorescent protein that develops a blue color, with low fluorescence intensity, luminescence rapidly disappears.
  • V163A A fluorescent protein that emits blue light.
  • V163A-S175G has acquired heat resistance and has enhanced fluorescence intensity (Patent Document 1)
  • F64I, F64V, F64A, F64G, F64L Fluorescent proteins with no increase in emission wavelength but increased fluorescence intensity (Patent Document 2)
  • Non-patent literature l Heim et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91st pp. 12501-12504
  • Patent Document 1 International Publication No. 96/27675
  • Patent Document 2 US Pat. No. 6,172,188
  • Patent Document 3 US Patent No. 5777079
  • Patent Document 4 US Patent No. 6194548
  • Patent Document 5 Special Table 2005— 511027
  • Patent Document 6 Special Table 2000—509987
  • a first object of the present invention is to provide a novel fluorescent protein having a new maximum emission wavelength peak that has been reported so far.
  • the present invention also includes wild type GFP.
  • the fluorescence intensity of the conventional mutant fluorescent protein is highly dependent on the change in pH, and almost no fluorescence is lost under acidic conditions.Therefore, it has a new emission spectrum that has not been reported so far, and it is fluorescent to the change in pH.
  • a second object is to provide a novel fluorescent protein having a pH-independent fluorescence intensity whose intensity is not affected.
  • the present inventors have conducted research for the purpose of creating an artificial mutant of GFP that has a new light wavelength peak that has not been reported so far, and in particular, that the fluorescence intensity is stably maintained in a wide pH range.
  • L mutant GFP with a specific amino acid substitution of GFP S was found to exhibit such characteristics, and the following inventions were completed.
  • amino acid residue at position 66 is substituted with the amino acid residue at position 175, and at least one of the amino acid residue at position 72 or the amino acid residue at position 206
  • the amino acid residue at position 66 is vinylayun, the amino acid residue at position 175 is glycine, the amino acid residue at position 72 is alanine, the amino acid residue lysine at position 206, the amino acid at position 65
  • the amino acid residue at position 145 is replaced with glycine, the amino acid residue at position 148 with serine, the amino acid residue at position 46 with leucine, and the amino acid residue at position 203 with valine.
  • a fusion protein comprising the fluorescent protein according to any one of (1) to (12) and an arbitrary protein or polypeptide.
  • the fluorescent protein of the present invention first emits fluorescence having an emission wavelength peak of 424 nm, which can be distinguished from other fluorescent proteins with the naked eye as a group blue.
  • the fluorescent protein of the present invention which has a pH-independent fluorescence intensity, does not depend on the change in pH, and enables the use of the fluorescent protein in an acidic environment, which has been difficult in the past.
  • FIG. 1 GFP, known amino acid substitution mutant of GFP, and fluorescence of UMFP-1 of the present invention Indicates color.
  • FIG. 3 shows a pH titration curve regarding the luminescence intensity of the fluorescent protein of the present invention and known fluorescent protein variants (GFP and BFP).
  • FIG. 5 Fluorescence spectra when C ⁇ 11U FP-LE-N ⁇ 4ECFP (blue), UMFP-3 (red), and ECFP (cyan) are excited with 355 nm excitation light.
  • FIG. 7 An image showing that E. coli expressing Sirius (light blue) or EGFP (green) is taken up by cellular slime molds (differential interference image) by phagocytosis and digested.
  • the numbers at the top of the panel represent the time (in seconds) since E. coli was taken up by cellular slime molds.
  • FIG. 8 Simultaneous imaging of caspase 3 activation and Ca 2+ activity in living cells by SC-SCAT3 and SapRC2. The warmer the color, the higher the activity of caspase 3 and the higher the Ca 2+ concentration.
  • the numbers on the top of the panel represent the time of TNF a addition force.
  • the present invention relates to a variant of a fluorescent protein commonly referred to as GFP.
  • the variant of the present invention includes a fluorescent protein having an emission wavelength peak of 424 nm in which a specific amino acid residue of GFP derived from a jellyfish (genus Aequorea), for example, Aequorea victoria, is substituted,
  • this fluorescent protein is a fluorescent protein having an emission wavelength peak of 424 mn consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are further deleted, substituted or added.
  • This emission wavelength is visible to the naked eye as ultramarine, and can be clearly distinguished from the emission color of the blue fluorescent protein known in the art ( Figure 1).
  • the protein of the present invention that emits ultra-blue fluorescence is referred to as UMFP (Ultra Marine Fluorescence Protein).
  • UMFP Ultra Marine Fluorescence Protein
  • the UMFP of the present invention is a fluorescent protein in which an amino acid at a specific position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the wild-type GFP derived from IKOREA 'Victoria.
  • F at position 64 is L
  • position S at position 65 is exactly D
  • position Y at position 66 is W
  • position 146 The amino acid sequence is such that M at position 153 is replaced with T, V at position 163 is replaced with A, and H at position 231 is replaced with L.
  • the present invention provides a multiple substitution mutation in which an amino acid at a specific site is further substituted for a fluorescent protein comprising an amino acid sequence having a substitution mutation at the above-mentioned seven positions, compared to the amino acid sequence of wild-type GFP.
  • a fluorescent protein having The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was previously commercially available from Clontech under the name pECFP Vector (catalog number 632309).
  • the UMFP of the present invention comprises substitution of amino acid residues at positions 66 (W) and 175 (S), and further positions 72 (S) or 206 (A) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a substitution of at least one amino acid residue.
  • This UMFP is hereinafter referred to as UMFP-1.
  • UMFP-1 is preferably a protein comprising substitutions of 4 amino acid residues at positions 66, 175, 72 and 206 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In UMFP-1, the amino acid residue at position 66 was replaced with F, the amino acid residue at position 72 was replaced with A, the amino acid residue at position 175 was replaced with G, and the amino acid residue at position 206 was replaced with K.
  • fluorescent protein of the present invention is represented by the substitution position and the type of amino acid after substitution, in order to indicate that the fluorescent protein is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • the amino acid is prefixed with ECF P.
  • a preferred example of the above UMFP-1 is represented as ECFP—W6 6F—S72A—S175G—A206K.
  • the present invention provides the UMFP-1, wherein any one of the amino acid residues at positions 65 (T), 145 (148), and 148 ( ⁇ ) is preferably the residue of these 3 amino acids.
  • UMFP-2 is preferably a fluorescent protein in which three amino acid residues at positions 65, 145 and 148 are further substituted.
  • UMFP-2 is ranked 65th It is preferable that the amino acid residue is a fluorescent protein in which the amino acid residue at position 145, the amino acid residue at position 145 is replaced by G, and the amino acid residue at position 148 is substituted.
  • UMFP-2 has a fluorescence intensity that is higher than that of UMFP-1, in addition to the peak power of the emission wavelength of 24 nm. This fluorescence intensity can be further increased by further introducing a substitution, preferably F46L, at position 46 (F).
  • the UMFP containing the 46th substitution namely ECFP—F46L—W66F—S72A—S175G—A206K—T65Q—Y145G—H148S, is also a part of UMFP-2.
  • the present invention includes a fluorescent protein in which position 203 (T) is further substituted in UMFP-1 or UMFP-2.
  • the UMFP that includes this additional substitution at position 203 is hereinafter referred to as U MFP-3.
  • the preferred replacement in UMFP-3 is T203V.
  • the fluorescence wavelength of the protein of the present invention can be preferably measured by optical means, for example, a spectrophotometer, a fluorometer, a CCD imaging device, or the like.
  • Spectral characteristics can be measured as the excitation wavelength characteristics and emission wavelength characteristics of light emission by the protein of the present invention, and from these spectral characteristics, it is possible to confirm the wavelengths that are the peaks of the excitation wavelength and the emission wavelength.
  • the description “424 nm” is preferably used in the sense of including 424 earth 3 nm, preferably 424 earth 2 rmi).
  • the fluorescent protein of the present invention has an emission wavelength peak at about 424 mn or less, which is clearly different from known fluorescent proteins.
  • known fluorescent proteins have emission wavelength peaks of about 450 nm (e.g., BFP), about 470 nm (e.g., CFP), about 510 nm (e.g., eGFP), about 530 nm (e.g., YFP), about 600 mn (e.g., DsRed).
  • emission wavelength peaks that are clearly different from the known wavelength peaks provide luminescence with different colors (eg, the group blue of the present invention), which can be viewed with the naked eye ( Figure 1).
  • the fluorescent protein of the present invention also has an excitation wavelength peak at about 355 nm, which is clearly different from known fluorescent proteins.
  • known fluorescent proteins have excitation wavelength peaks of about 380 nm (e.g., BFP), about 430 nm (e.g., CFP), about 480 nm (e.g., eG FP), about 510 nm (eg, YFP), and about 550 nm (eg, DsRed). Therefore, it is possible to irradiate with excitation light having a wavelength at which known fluorescent proteins hardly react.
  • the fluorescent protein of the present invention such as UMFP-3
  • UMFP-3 has a feature that the fluorescence intensity is maintained high even under acidic conditions, in addition to the peak power S424nm of the emission wavelength.
  • Fluorescence intensity of wtGFP and other conventional GFP, for example, pH 5 or lower is significantly lower than that of neutral strength, weak alkaline conditions, such as pH 7 to pH 9 (usually 70% to 100% lower)
  • the fluorescence intensity under acidic conditions of UMFP-3 of the present application is at least 50% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% of the fluorescence intensity under neutral or weak alkaline conditions. The above is maintained.
  • the fluorescence intensity of the fluorescent protein of the present invention under acidic conditions is higher than that under alkaline conditions (preferably pH 7 or higher, more preferably pH 7 to pH 9). It may be strong. That is, in the fluorescent protein of the present invention, the relative fluorescence intensity normalized with respect to the fluorescence intensity at pH 9 is preferably within 50%, preferably within 25%, more preferably within the range of pH 3 to 9, for example. Can vary within 10%.
  • the fluorescence intensity that preferably changes within 50%, preferably within 25%, more preferably within 10% with respect to the change in pH as described above is expressed as pH-independent fluorescence intensity in the present specification.
  • “increased fluorescence intensity” means that the fluorescent protein of the present invention emits light per mole with respect to a certain amount of excitation light having a certain wavelength as compared with conventional fluorescent proteins. Means high.
  • An example of increasing the fluorescence intensity by introducing a mutation into the amino acid sequence of a fluorescent protein is a comparison between UMFP-1 and UMFP-3 of the present invention. In this example, excitation light at 355 nm is used. When irradiated to the respective fluorescent protein, UMFP-3 shows an increase of at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 40% over the original UMFP-1.
  • the fluorescent protein of the present invention since the fluorescent protein of the present invention has excitation light on the lower wavelength side as compared with known fluorescent proteins, it can provide a relatively high fluorescence intensity for lower wavelength excitation light.
  • ECFP—F46L—W66F—S72A—S175G—A one of UMFP-2 206K— T65Q—Y145G— UMFP-3 with further substitution of T203V in H148S, that is, ECFP—F46L—W66F—S72A—S175G—A206K—T65Q—Y145 V—H148S—T203V has an emission wavelength peak of 424 nm.
  • the change in intensity is within 50%, preferably within 25%, more preferably within 10%).
  • the present invention provides the above features of UMFP, for example, having an emission wavelength peak of about 424 nm, preferably having an emission wavelength peak of about 424 mn and an increased fluorescence intensity, more preferably an emission wavelength of 424 nm.
  • 5th position I also includes fluorescent proteins consisting of amino acid sequences in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added.
  • one or several J relating to amino acid substitution, deletion and / or addition in the present invention means 1 to several tens of amino acids, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, and more.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. It can be expressed as an amino acid sequence having
  • amino acid sequences of proteins can tolerate highly conservative mutations in physicochemical properties such as charge, size, and hydrophobicity of amino acid residues.
  • amino acid residue substitution glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (lie), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gin), aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala, lysine (Lys) and arginine (Arg) and the like.
  • the essence of the protein is still 8 064266
  • all the amino acids except the amino acids other than the 46, 66, 72, 175, 206, 65, 145, 148 and 203 positions have the same amino acid strength as the amino acid sequence of wtGFP. Is also included.
  • the amino acid substitution ability at sites other than the 46, 66, 72, 175, 206, 65, 145, 148, and 203 positions may cause beneficial changes in properties such as improved enzyme stability and increased fluorescence intensity, and such fluorescent proteins are also included in the present invention.
  • the protein of the present invention has an advantage for fading of luminescence over time. That is, compared with known fluorescent proteins, the fluorescent protein of the present invention has a prolonged discoloration.
  • the fluorescent protein of the present invention when the luminescence intensity after 1000 seconds is measured with respect to the luminescence intensity immediately after pulse irradiation for 10 seconds, the fluorescent protein of the present invention is about 80% In the case of known EBFP, only about 10% can be maintained.
  • the fluorescent protein of the present invention is characterized in that it can provide a linear amber at least in the range of 1000 seconds after irradiation.
  • the protein of the present invention may be produced and used alone, but a protein or polypeptide other than the protein of the present invention is added to the N-terminal and the C-terminal of the protein of the present invention. It may be produced and used as a so-called fusion protein. Such a fusion protein containing the protein of the present invention is also an embodiment of the present invention.
  • the UM FP of the present invention can be used in place of conventional GFP and its mutants for the same purpose of use. For example, by expressing a fusion protein of a protein and the UMFP of the present invention in vivo or in a cell, the locality of the protein in a living body or in a cell can be examined.
  • the gene expression control mechanism in living organisms or cells can be examined using the expression of UMFP of the present invention as an index.
  • UMFP of the present invention
  • Akira Honjo's UMFP Since 3 has a pH-independent fluorescence intensity, the GFP, which is conventionally known, such as endosomes or lysosomes, cannot be used for its mutants, or It can be used to confirm the localization of proteins in acidic organelles, which were extremely difficult to use, to observe intracellular membrane behavior, and for other purposes.
  • the fluorescent protein of the present invention also has an emission wavelength peak and an excitation wavelength peak that are different from the respective peaks of known fluorescent proteins. Therefore, the fluorescent protein of the present invention should be used for applications using a plurality of fluorescent proteins at the same time. Is possible. For example, since the fluorescent protein of the present invention has an emission wavelength peak different from that of a known fluorescent protein, the fluorescent protein of the present invention (or its fusion protein) emits light and the known fluorescent protein (or its fusion protein) Luminescence can be distinguished with the naked eye ( Figure 1). In addition, since the excitation wavelength peak of the fluorescent protein of the present invention is different from that of the known fluorescent protein, a measurement system using a wavelength that cannot excite the known fluorescent protein is possible. Furthermore, due to the above-mentioned advantages, simultaneous use of the fluorescent protein of the present invention and the known fluorescent protein at the same time may enable simultaneous multi-angle analysis, which is more complicated and has a higher differential property than Z.
  • the fluorescent protein of the present invention differs from the known fluorescent protein as described above in both the excitation wavelength peak and the emission wavelength peak, the protein of the present invention or a fusion protein thereof and the known fluorescent protein or the same thereof.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • examples of its use are known to those skilled in the art, for example, Takemoto, K., Nag ai, ⁇ ., Miyawaki, ⁇ . & Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by ⁇ ndicator that is insensitive to environmental effects. J. Cell. Biol.
  • the fusion protein containing the protein of the present invention has the function of the functional protein, so that the protein of the present invention can be produced or used alone. Compared to the above, it has increased utility.
  • functional proteins include glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), protein A, and other proteins commonly used for the production of fusion proteins.
  • GST glutathione S transferase
  • MBP maltose binding protein
  • protein A protein A
  • the production of the protein of the present invention can be performed more advantageously by using a functional polypeptide that facilitates the production of a recombinant protein, particularly the purification of the recombinant protein, such as a FLAG tag, a histidine tag or a chitin binding sequence. be able to.
  • the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention may be added with an appropriate label compound such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary, or various chemically modified substances.
  • an appropriate label compound such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary, or various chemically modified substances.
  • a polymer such as polyethylene glycol can be bound, or the protein used in the present invention can be bound to an insoluble carrier.
  • Chemical modification methods targeting such proteins are widely known to those skilled in the art, and any modification and use may be made as long as the function of the protein of the present invention is not impaired.
  • the protein may be exposed to various reaction conditions, such as in an extraction operation or purification operation in the production of a fusion protein, or in an addition reaction of a labeling compound in the production of a labeled protein.
  • various reaction conditions such as in an extraction operation or purification operation in the production of a fusion protein, or in an addition reaction of a labeling compound in the production of a labeled protein.
  • the fluorescent protein of the present invention can maintain activity in a pH-independent manner, it is more tolerant in various reaction conditions than known fluorescent proteins, and this property is thought to promote the use of the protein of the present invention. .
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention.
  • Nucleic acids include RNA or DNA, and the forms include mRNA and cDNA as well as chemically synthesized DNA, but there are no particular restrictions.
  • a preferred nucleic acid of the present invention is DNA.
  • the nucleic acid of the present invention may be single-stranded or may be combined with a nucleic acid or RNA having a complementary sequence to form a double strand or triple strand.
  • the nuclear acid may be labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRPO), a radioisotope, a fluorescent material, a chemiluminescent material, or the like.
  • HRPO horseradish peroxidase
  • the nucleic acid of the present invention preferably the DNA encoding UMFP, which is the protein of the present invention, has a substitution site characterizing UMFP1 to 3 in the nucleotide sequence encoding GFP shown in SEQ ID NO: 2, ie, 46 Rank, 66th, 72nd, 175th, 206th, 65th, 145th, 1 Codon strength S other than positions 48 and 203 consists of a base sequence replaced with a codon corresponding to each amino acid substitution.
  • a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a base sequence that complies with the base sequence and encodes the UMFP of the present invention is also included in the nucleic acid of the present invention.
  • the stringent condition in the present invention is that a nucleic acid having a base sequence ability complementary to SEQ ID NO: 2 is hybridized in a 65 ° C buffer containing a salt concentration of 1.5 M, and a 2 X SSC solution at 50 ° C. This is the condition under which hybridization is maintained under conditions where DNA is washed with 0.1% [w / v] SDS (1 X SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate). Further, in terms of the identity (% :) of the base sequence, it is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 2. A nucleic acid consisting of a base sequence having the same identity. These methods ⁇ , eg xJ Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc. can be used.
  • the nucleic acid of the present invention is based on DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, specifically, DNA having a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 2, PCR, site-directed mutagenesis, etc. It can be prepared by general genetic engineering techniques. For the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, various vectors containing it are commercially available, and these can be used as they are. Genetic engineering techniques such as site-specific mutation are widely used by those skilled in the art, such as Mamatis T. et al. (Molecxilar Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). It is described in the experimental operation manual.
  • the nucleic acid of the present invention can also be directly produced by a chemical synthesis method such as the phosphoramidite method or a commercially available DNA synthesizer based on the nucleotide sequence information shown in SEQ ID NO: 2. it can.
  • DNA that is a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention can be incorporated into an appropriate expression vector, and the powerful expression vector is the protein of the present invention or the protein of the present invention. It is used for recombinant production of fusion proteins containing. Such recombinant vectors for protein production are also included in the present invention.
  • the vector of the present invention may be in the form of circular, linear, etc., or a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention. In addition, other base sequences may be included if necessary.
  • nucleotide sequences include an enhancer sequence, a promoter sequence, a ribosome binding sequence, a base sequence used for amplification of copy number, a base sequence encoding a signal peptide, a base sequence encoding another polypeptide, a poly sequence A additional sequences, splicing sequences, replication origins, base sequences of genes that serve as selection markers, and the like.
  • a suitable synthetic DNA adapter is used to add a translation initiation codon or translation termination codon to the nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention. It is also possible to newly generate or eliminate an appropriate restriction enzyme cleavage sequence in the base sequence. These are within the scope of work normally performed by those skilled in the art, and those skilled in the art can arbitrarily and easily process them based on the nucleic acid encoding the protein of the present invention or the fusion protein containing the protein of the present invention.
  • the vector holding the nucleic acid encoding the protein of the present invention or the fusion protein containing the protein of the present invention can be selected and used in accordance with the host used. It is also possible to use various viruses such as bacteriophage, baculovirus, retrovirus, vaccinia virus.
  • Such an expression promoter may be appropriately selected depending on the host and the purpose of expression.
  • the host is E. coli, the T7 promoter, lac promoter, trp promoter, LPL promoter, etc.
  • the PH05 promoter In some cases, the PH05 promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc.
  • the host is an animal cell, the SV40-derived promoter, retrovirus promoter, cytomegalovirus (H And CMV) IE (immediate early) gene promoter, meta-kineone promoter, heat shock promoter, SRa promoter, and the like.
  • An operation such as linking a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention, preferably DNA, to the promoter exemplified above or incorporating it into an expression vector is also applicable to the above Maniatis and other experimental operations. This can be done based on the description in the manual.
  • the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention may be prepared by, for example, Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-ptynoleoxycarboxyl method).
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-ptynoleoxycarboxyl method
  • the nucleic acid, in particular the DNA incorporated into the expression vector can be prokaryotic or eukaryotic. It is preferable to produce by introducing appropriate host cells selected from organisms into a suitable expression system.
  • Examples of host cells include bacteria of the genus Escherichia, bacteria of the genus Corynebacterium, bacteria of the genus Brevibacterium, bacteria of the genus Bacillus, the genus Serratia Bacteria, Pseudomonas genus bacteria, Arthrobacter genus bacteria, Erwinia genus bacteria, Methylobacterium genus bacteria, Rhodobacter genus bacteria, Streptomyces genus microorganisms Zymomonas) microorganisms, microorganisms such as Saccharomyces yeast, insect cells such as silkworms, HEK293 cells, MEF cells, Vero cells, Hela cells, CHO cells, WI38 cells, BHK cells, COS-7 cells, MDCK And animal cells such as cells, C127 cells, HKG cells, and human kidney cell lines.
  • Examples of methods for introducing an expression vector into a host cell include the methods described in the above-mentioned experimental operation manuals including Maniatis et al., For example, the electopore method, the protoplast method, the alkali metal method, calcium phosphate. The precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, particle gun method and the like can be used.
  • insect cells such as Sf9 and Sf2 1, please refer to Baculovirus' Expression 'Vectors, Laboratories 1 to Ma Yuanole, Double 1'Hitch' Freeman 'and' Company (W. H. Freeman and Company), New York, 1992) and BioZTechnology, 1988, Vol. 6, p. 47.
  • the protein of the present invention or the fusion protein comprising the protein of the present invention is expressed in the above host cell, and the target protein is recovered from the host cell or culture medium and purified. Can be obtained.
  • an appropriate method can be appropriately selected from methods generally used for protein purification. That is, salting-out method, ultrafiltration method, isoelectric precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, and other affinity chromatography, chromatofocusing Method, adsorption chromatography, reverse-phase chromatography, etc.
  • the strengths of methods that can usually be used are appropriately selected, and if necessary, purification can be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with a histidine tag, a FLAG tag, or the like, it is preferable to employ a purification method characteristic of the tag or the like.
  • the fusion protein can be cleaved with an appropriate protease (thrombin, trypsin, etc.) to recover the protein of the present invention.
  • Another method of genetic engineering production is to use recombinant DNA molecules to obtain cell-free synthetic methods.
  • the protein of the present invention can be prepared in the form of a single protein alone or in the form of a fusion protein with another protein, and the protein of the present invention is not limited to these. Furthermore, it can be converted into various forms. For example, various chemical modifications to proteins, conjugation with polymers such as polyethylene glycol, conjugation to insoluble carriers, and encapsulation into ribosomes can be considered by various techniques known to those skilled in the art.
  • antibodies that specifically bind to the protein of the present invention include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies, etc. Monoclonal antibodies are preferred. A powerful antibody is produced by immunizing a non-human animal and recovering serum and inducing a hybridoma cell producing a monoclonal antibody by a normal operation using the protein of the present invention as an antigen. To do You can.
  • FITC fluorescein isocyanate
  • a fluorescent substance such as tetramethylrhodamine isocyanate, a radioactive isotope, an alkaline phosphatase or an enzyme protein such as peroxidase.
  • the protein of the present invention is used as a marker protein that replaces the GFP or a mutant thereof in various molecular biological methods using the conventionally known le GFP or a mutant thereof as a marker. be able to.
  • ORF encoding GFP in various vectors that are used by those skilled in the art as vectors that can easily express a fusion protein with GFP, such as pR SETZEmGFP vector manufactured by Invitrogen. If a vector is prepared by replacing OR with an ORF encoding the protein of the present invention, a fusion protein of any protein and the protein of the present invention can be easily produced or used.
  • Measurement or confirmation can be performed by detecting or measuring fluorescence emission of the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a fusion protein containing the protein of the present invention is linked, and the fluorescence of the protein of the present invention or the fusion protein containing the protein of the present invention is linked.
  • the control mechanism of the functional nucleic acid can be investigated, or a substance that promotes or suppresses the function of the functional nucleic acid can be searched.
  • DNA encoding the ECFP (mutated fluorescent protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) retained in P cDNA3 manufactured by Invitrogen (ECFP gene) was excised with the restriction enzymes BamHI and EcoRI.
  • PRSETBZECFP was prepared by recombination with a plasmid vector pRSET B (Invitrogen) that was opened with a restriction enzyme. Using this plasmid vector as a saddle, and using the following primer DNA, according to the method of Asano et al. (Nu Acid Res., 2000, 28, 16, e78), S72A, S175G and A206K Three Amino acid mutations were introduced.
  • Primer 1 CAGTGCTTCAGCCGCTACCCC (SEQ ID NO: 3)
  • Primer 2 GAGGACGGCAGCGTGCAGCTC (SEQ ID NO: 4)
  • Primer 3 ACCCAGTCCGCCCTGAGCAAA (SEQ ID NO: 5) ie 500 ng pRSETB / ECFP, each lOpmol primer 1-3, 3.75 nm ol
  • 20 ⁇ L of dNTPs 1.25 U Pfu DNA polymerase, 20 U Pfu DNA ligase (STRA TAGENE), preincubate at 65 ° C for 5 min, Repair nick, then 95 ° C, 1 min DNA denaturation, 95 ° C, 10 sec DNA denaturation, 55 ° C, 30 sec annealing reaction and 65 ° C, 10 min extension 'ligation
  • a 20-cycle thermal cycle reaction was performed with one reaction cycle.
  • This vector was used as a saddle type, and a thermal cycle reaction was performed using the following primers: Primer 4: ACCCTGACCTTCGGCGTGCAG (SEQ ID NO: 6) The thermal cycle reaction conditions were the same as those shown above except for the primers used. The same conditions as the reaction.
  • a vector pRSETB / UMFP-1 encoding ECFP—W66F—S72A—S175G—A206K UMFP—1) to which a histidine tag was added was prepared.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of UMFP-1 are set forth in SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively.
  • Escherichia coli JM109 (DE3) transformed by the salt-calcium calcium method was cultured for 4 days at 23 ° C in 2 mL of LB liquid medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin. The cells were disrupted with a French press. The residue after crushing was removed by centrifugation. From the supernatant, ECFP—W66F—S72A—S175G—A206K with a histidine tag was added to the lOOmM imidazole and 300 using a nickel chelate column (Qiagen). Eluted with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 containing mM NaCl, recovered, and further desalted with PD-10.
  • the pRSETBZUMFP-1 prepared in Example 1 was used as a cage, and a thermal cycling reaction was performed using the following primer DNA.
  • Primer 5 ACCACCCTGCAATTCGGCGTG (SEQ ID NO: 7)
  • Primer 6 GAGTACAACGGGATCAGCCAC (SEQ ID NO: 8)
  • Primer 7 GGGATCAGCTCAAACGTCTAT (SEQ ID NO: 9) That is, 500 ng pRSETBZUMFP— 1, each lOpmol primer 5-7, 3.7 5mnol
  • 20 / iL containing 1.25U Pfu DNA polymerase, 20U Pi DNA ligase (S TRATAGENE), and pre-incubate at 65 ° C for 5 min.
  • Escherichia coli JM109 (DE3) was transformed by the calcium chloride method, and the DNA encoding the ECFP—W66F—S 72A—S 175G—A206K—T65Q—Y1 45V-H148S (SEQ ID NO: 19)
  • the plasmid vector PRSETB / ECFP—W66F—S72A—S175G—A206K—T65Q—Y1 45G—H148S having the number: 18) was obtained.
  • This vector was converted into a saddle type and subjected to thermal cycle reaction using the following primers to obtain pRSETBZUMFP-2.
  • Primer 8 ACCCTGAAGCTCATCTGCACC (SEQ ID NO: 10)
  • the reaction conditions for the thermal cycle are the same as the thermal cycle reaction shown above, except for the primer used.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of UMFP-12 are shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively.
  • the pRSETBZUMFP-2 prepared in Example 2 was used as a cage, and a thermal cycle reaction was performed using the following primer DNA to obtain pRSETB / UMFP-3.
  • Primer 9 TACCTGAGCGTCCAGTCCGCC (SEQ ID NO: 11)
  • the reaction conditions for the thermal cycle are the same as those for the thermal cycle reaction shown above, except for the primer used.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of UM FP-3 are set forth in SEQ ID NOs: 22 and 23, respectively.
  • UMFP prepared in Examples 1 to 3-1 to 3 // 50 mM HEPES buffer ⁇ 7.4 aqueous solution was diluted 100-fold with 50 mM HEPES buffer ( ⁇ 7.4), and the fluorescence spectrophotometer (HITACHI F — 2500) was used to measure excitation and fluorescence spectra.
  • HITACHI F fluorescence spectrophotometer
  • Surperfect Invitrogen
  • FIG. 4 shows the fluorescence intensity discoloration curves obtained by repeating the imaging of 10 seconds of excitation light on HeLa cells expressing UMFP-3 and EBFP fluorescent proteins. .
  • the fluorescent protein of the present invention maintains about 80% of the intensity of the known EBFP. Only about 10% can be maintained.
  • the fluorescent protein of the present invention can provide a linear amber color in the range of at least 1000 seconds after irradiation.
  • UMFP-3 with the C-terminal 11 amino acid deleted and mSECFP with the N-terminal 4 amino acid deleted are leucine, a recognition sequence for the restriction enzyme Xhol.
  • a chimeric protein was produced by connecting two amino acids of glutamic acid (hereinafter referred to as C ⁇ 11UMFP-and E-N ⁇ 4ECFP: As set forth in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively).
  • C ⁇ UUMFP cDNA was amplified by PCR using a sense primer containing the restriction enzyme BamHI recognition sequence and an antisense primer containing the restriction enzyme Xhol recognition sequence.
  • the NA4ECFP cDNA was amplified by PCR using a sense primer containing the restriction enzyme Xhol recognition sequence and an antisense primer containing the restriction enzyme EcoRI recognition sequence.
  • the restriction enzyme-treated product was introduced into pRSETB (Invitrogen), and the E. coli expression plasmid pRSETB / C ⁇ 11U MFP-LE-N ⁇ 4ECFP was prepared.
  • pRSETB / C ⁇ 11UMFP- LE-N ⁇ 4ECFP, pRSETB / UMFP-3, pRSETB / ECFP were introduced into E. coli JM109 (DE3), each recombinant protein was expressed at room temperature, and a polyhistidine tag was used. Purification was performed.
  • the F-2500 fluorescence spectrophotometer (HITACHI) was used to measure the fluorescence spectrum of the purified sample.
  • HITACHI fluorescence spectrophotometer
  • Figure 5 shows the fluorescence spectra when C ⁇ 11U FP-LE-N ⁇ 4 ECFP (blue), UMFP-3 (red), and ECFP (cyan) are excited with 355 nm excitation light. From this experiment, the FRET efficiency of CA llUMFP-LE-NA 4ECFP is calculated to be about 66%.
  • FRET efficiency for example, good power of FRE T efficiency.
  • CAMP indicator using the commonly used FRET pair of CFP-YFP (Sentence 18 ⁇ : Ponsioen, B. et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence cAIviP indicator. EMBO Rep. 5, 1176-1180 (2004).) describes that the FRET efficiency is about several percent as judged from the fluorescence spectrum. Therefore, this fluorescent protein pair was able to cause FRET with very high efficiency by excitation light having a wavelength lower than before.
  • UC-SCAT3 nucleotide and amino acid sequences are described in SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively.
  • the plasmid UC-SCAT3-pcDNA3.1 (—) expressing this indicator gene is a caspase 3 activity indicator using ECFP and Venus developed by Takemoto et al.
  • SCAT3 Takemoto K, Nagai T, Miyawaki A, et al .: Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J. Cell Biol.
  • the Venus gene was cleaved with restriction enzymes Kpnl and Hindlll, UMFP-3 was introduced into it, and the ECFP gene was further restricted with restriction enzymes BamHI and Kpnl. It was prepared by cutting with and introducing mSECFP there.
  • HeLa cells obtained by culturing UC-SCA T3-pcDNA3, l (—) in a 35 mm glass bottom dish were transfected using Surfefect (Invitrogen) and expressed in the cytoplasm. Imaging was performed one day after transfection.
  • UC-SCAT3 expressed in the cytoplasm of HeLa cells was excited in the 35 2-388 nm wavelength region. The fluorescence was detected using a bandpass filter with a wavelength range of 415 to 455 nm for UMFP-3 and a bandpass filter with a wavelength range of 459_499 ⁇ for ECFP.
  • FIG. 6 shows the change in the ratio of UMFP_3 / mSECFP with Caspase-3 activation within each circle frame (ROI: Region Of Interst) in the right figure.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time from the start of observation. This figure shows that it is possible to detect the activation of Caspase-3 accompanying the change in the fluorescence intensity ratio of UMFP-3 / mSECFP.
  • a plasmid vector encoding UMFP-3 (ECFP-F46L-T65Q-W66F-S72A-Y1 45G-H148S-S175G-A206K-T203V) prepared in Example 3, and pR SETBZUMFP-3 as a saddle type, and the following primer DNA The thermal cycle reaction was performed using
  • Primer 10 5 '-TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC-3' (SEQ ID NO: 12
  • Plasmid vector pRSETBZUMFP-4 carrying The nucleotide sequence opamino acid sequence of UMFP-4 is set forth in SEQ ID NOs: 28 and 29, respectively.
  • a nickel chelate column manufactured by Qiagen
  • ECFP—F46L—T65Q—W66F — Q69L— S72A— Y145G— H148S— S175 G— A206K— T203V (UMFP-4) was obtained in an amount of about 500 ⁇ gZniL.
  • Primer 11 5 '-TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC-3' (SEQ ID NO: 13
  • E. coli JM109 (DE3) transformed by the salt calcium method was cultured in 200 mL of LB liquid medium containing 100 ⁇ g ZmL of ampicillin at 23 ° C for 4 days. Cells were disrupted with a French press. ECFP—F46L—T65Q—W66F—Q69L—S72A—Y 145G—H148S—with a histidine tag using a nickel chelate column (manufactured by Qiagen) from the supernatant after removing the residue after centrifugation.
  • Example 11 Observation of phagocytosis of E. coli expressing Sirius by Dictyostelium Discoideu m using a two-photon excitation microscope
  • Cellular slime mold AX2 is cultured in 23.3 ° C, 10 mL of HL5 medium in advance, and the plasmid vector pRSETB / Sirius prepared in E. coli JM109 (D E3) foil Example 10> After transformation by the calcium chloride method, the cells were cultured at 37 ° C. for 12 hours in 2 mL of LB liquid medium containing 100 ⁇ g ZmL of ampicillin. Cellular slime mold AX2 was precipitated by centrifugation and then resuspended in BSS buffer, and E. coli JM109 (DE3) expressing Sirius was precipitated by centrifugation and resuspended in PBS buffer. Cell slime mold AX2 suspended in buffer and E.
  • coli JM109 (DE3) expressing Sirius were mixed on a 1% agarose gel on a 35 mm Petri dish. Thereafter, the mixture was incubated at room temperature for 1 hour, and the agarose gel on a 35 mm Petri dish was turned upside down, and E. coli JM109 (DE3) expressing the mixed cellular slime mold AX2 and Sirius was observed under a microscope.
  • the microscope used was a multiphoton excitation microscope Olympus Fluoview FV300, and the objective lens was an oil immersion lens with UHan FLN, 40x, numerical aperture 1.30 (Olympus).
  • the laser was Ti: sapphire (MAITAI, Spectra Physics), and Sirius was excited by 780nm excitation light, and fluorescence was observed.
  • Figure 7 shows the pattern in which E. coli expressing Sirius is taken up by cellular slime molds by phagocytosis and digested. This figure shows that Sirius, which is independent of fluorescence intensity power 3 ⁇ 4H, clearly shows the state of Escherichia coli incorporated into slime mold phagosomes under acidic conditions, rather than EGFP, which depends on fluorescence intensity power) H. This indicates that it can be confirmed.
  • Example 12 One-wavelength excitation, four-wavelength photometry, dual FRET observation using FRET pair with Sirius as donor, mSECFP as acceptor and FRET pair with Sap phire as donor and DsRed as acceptor
  • SC-SCAT3 which is an indicator of this caspase 3
  • S apRC2 which is a calcium ion indicator
  • two FRET pairs were expressed in HeLa cells.
  • 1 Suiperfect Invitrogen
  • 1 ugno dish pcDN A3.1 (1) / SC— SCAT3 and: cDNA3 / SapRC2 were introduced into HeLa cells cultured on a 35 mm glass bottom dish, This was done by co-expression.
  • the caspase 3 indicator SC-SCAT3 co-expressed in cells and the calcium ion indicator SapRC2 can be used to simultaneously observe activation of caspase 3 associated with induced cell death and temporal changes in calcium ion concentration. It is understood that is possible.
  • the fluorescent protein of the present invention first emits fluorescence having an emission wavelength peak of 424 nm, which is unprecedented, and can be distinguished from other fluorescent proteins with the naked eye as a group blue.
  • the fluorescent protein of the present invention which has a pH-independent fluorescence intensity that is not affected by the change in pH, enables the use of the fluorescent protein in an acidic environment that has been difficult in the past. Therefore, the fluorescent protein of the present invention is used for visually observing or confirming the localization of a specific substance in an organism or cell using an intact organism or cell, and confirming the expression of a specific gene. It is possible to provide fluorescent proteins that can be adapted to more diverse conditions, and research in molecular biology Can contribute greatly.

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Abstract

本発明は、新規な発光波長ピークを有するＧＦＰの人為的変異体を提供する。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、６６位のアミノ酸残基と１７５位のアミノ酸残基がそれぞれ置換され、さらに７２位のアミノ酸残基又は２０６位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質、又はさらに６５位、１４５位、１４８位、４６位、及び／又は２０３位の各アミノ酸残基が置換されている、発光波長ピークが４２４ｎｍであり、ｐＨ非依存性蛍光強度を有する蛍光タンパク質。本発明の蛍光タンパク質は４２４ｎｍという発光波長ピークの蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また、ｐＨの変化に蛍光強度が左右されない、ｐＨ非依存性の蛍光強度を有する。

Description

明 細 書
群青色蛍光タンパク質
技術分野
[0001] 本発明は、改良された蛍光特性を有する蛍光タンパク質、特に群青色に発光する 蛍光タンパク質に関する。
背景技術
[0002] 発光クラゲの一種であるイクォレア 'ビクトリア (Aequorea victoria)に由来する蛍 光タンパク質、いわゆる GFP (Green Fluorescence Protein)は、 395nmの励起 スペクトルピークと 509mnの発光スペクトルピークを有し、緑色に発光するタンパク質 である（Chalfieら、 Science, 1994年、第 263卷、第 802— 805頁）。このタンノヽ。ク 質は、高温で安定 (Tm= 78°C)である、カオトロピック試薬 (例えば 8M尿素）中で安 定である、他のタンパク質との融合タンパク質の形態で比較的安定に発現され、その 蛍光発色により当該融合タンパク質の存在が視認できる、などの利点を有しており、 無傷の生体あるいは細胞を用いた、生体或いは細胞内における特定の物質の局在 性の観察ないし確認、さらには特定の遺伝子発現の確認を行うことを可能とし、分子 生物学における研究に大きな変革をもたらした。
[0003] この蛍光タンパク質の有用性をさらに高める研究が盛んに行われており、 GFPの特 定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換させた人為的変異体が多数報告されている。 GFPの人為的変異体の構築の目的は、蛍光強度の増加と発光スペクトルの偏移に 大別される。特に、発光スペクトルが偏移した蛍光タンパク質を複数用いることで、複 数の異なる物質の局在性や複数の遺伝子発現を同時に確認することが可能となるこ とから、様々な蛍光色に努光する変異体が報告されるに至っている。
[0004] これまでに報告されている GFPの人為的変異体の変異部位と特徴は、例えば下記 の例を挙げることができる。なお、 GFPの人為的変異体変異体の表記は、例えば野 生型 GFPのアミノ酸配列の N末端から 66番目のアミノ酸残基であるチロシン (Y、以 下特に断らない限り、アミノ酸は 1文字表記で表す)が Ηに置換された変異体を Υ66 Ηと表し、複数のアミノ酸残基が同時に置換された変異体は、それぞれの置換をハイ フン（一）で結ぶこととする。
[0005] Y66H:青色に発色する蛍光タンパク質であり、蛍光強度は低ぐ発光は急速に消 失する (非特許文献 1)
V163A:青色に発光する蛍光タンパク質であり、さらに V163A—S175Gは耐熱 性を獲得し、高められた蛍光強度を有する (特許文献 1)
F64I、 F64V、 F64A、 F64G、 F64L:発光波長の変化はないが、蛍光強度が高 められた蛍光タンパク質 (特許文献 2)
F64L— S65T—Y66H— Y145F:青色に発光する力 蛍光強度は低ぐ発光が 急速に消失する蛍光タンパク質 (特許文献 3)
F64L— Y66H—Y145F— L236R、 F64L— Y66H— Y145F— V163A— S17 5G-L236R, Y66H— Y145F— V163A— S175G、 F64L— Y66H— Y145F : 光安定性を有する蛍光タンパク質 (特許文献 4)
F64L—Y66H— S175G:安定した蛍光特性を呈し、異なる励起スペクトルおよび Zまたは発光スペクトルを有する、青色蛍光タンパク質 (特許文献 5)
F64L— Y66H— V163A:より高められた蛍光強度を有する青色蛍光タンパク質（ 特許文献 6)。
非特許文献 l :Heimら、 1994年、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 91卷、第 12 501— 12504頁
特許文献 1：国際公開第 96/27675号
特許文献 2：米国特許第 6172188号
特許文献 3：米国特許第 5777079号
特許文献 4：米国特許第 6194548号
特許文献 5：特表 2005— 511027
特許文献 6 ··特表 2000— 509987
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、これまでに報告されてレ、なレ、、新たな最大発光波長ピークを有する新規 な蛍光タンパク質の提供を第一の目的とする。また本発明は、野生型の GFPを含め 、従来の変異蛍光タンパク質の蛍光強度が pHの変化に大きく依存し、酸性下では 蛍光が殆ど失われることから、これまでに報告のない新たな発光スペクトルを有し、か つ pHの変化に蛍光強度が左右されない、 pH非依存性の蛍光強度を有する新規な 蛍光タンパク質を提供することを第二の目的とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、これまでに報告のない新たな ¾光波長ピークを有し、特に蛍光強度 が幅広い pHで安定に保持された GFPの人為的変異体を創成することを目的として 研究を行レヽ、 GFPの特定のアミノ酸を置換した変異体力 Sかかる特性を発揮することを 見いだし、下記の各発明を完成した。
(1)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 66位のアミノ酸残基と 175位のアミ ノ酸残基がそれぞれ置換され、さらに 72位のアミノ酸残基又は 206位のアミノ酸残基 の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピーク 力 S424mnである蛍光タンパク質。
(2) 72位のアミノ酸残基及び 206位のアミノ酸残基がいずれも置換されている、 (1) に記載の蛍光タンパク質。
(3) 66位のアミノ酸残基がフエ二ルァラニンに、 72位のアミノ酸残基がァラニンに、 1 ァ5位のアミノ酸残基がグリシンに、及び 206位のアミノ酸残基カリジンにそれぞれ置 換されている、（2)に記載の蛍光タンパク質。
(4)さらに 65位のアミノ酸残基、 145位のアミノ酸残基又は 148位のアミノ酸残基の 少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されている（1)〜（3)の何れかに記載の蛍光タ ンパク質。
(5) 65位のアミノ酸残基、 145位のアミノ酸残基及び 148位のアミノ酸残基が何れも 置換されている、（4)に記載の蛍光タンパク質。
(6) 65位のアミノ酸残基がグルタミンに、 145位のアミノ酸残基がグリシンに、及ぴ 14 8位のアミノ酸残基がセリンに置換されている、 (5)に記載の蛍光タンパク質。
(7)さらに 46位のアミノ酸残基が置換されている、（4)〜（6)の何れかに記載の蛍光 タンパク質。
(8) 46位のアミノ酸残基力 イシンに置換されている、 (7)に記載の蛍光タンパク質。 (9)さらに 203位のアミノ酸残基が置換されている、 (1)〜（8)の何れかに記載の蛍 光タンパク質。
(10) 203位のアミノ酸残基力 Sパリンに置換されている、 (9)に記載の蛍光タンパク質
(11) 66位のアミノ酸残基がフエ二ルァラユンに、 175位のアミノ酸残基がグリシンに 、 72位のアミノ酸残基がァラニンに、 206位のアミノ酸残基力リジンに、 65位のアミノ 酸残基がグルタミンに、 145位のアミノ酸残基がグリシンに、 148位のアミノ酸残基が セリンに、 46位のアミノ酸残基がロイシンに、及び 203位のアミノ酸残基がバリンに置 換されている、（10)に記載の蛍光タンパク質。
(12) (1)〜（： L1)に記載の蛍光タンパク質において、さらに 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなる、発光波長ピーク力 24nmで ある蛍光タンパク質。
(13) (1)〜（12)の何れかに記載の蛍光タンパク質と任意のタンパク質又はポリぺプ チドとからなる融合タンパク質。
(14) (1)〜（13)の何れかに記載の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコ一ドする 核酸。
(15) (14)に記載の核酸によってコードされる蛍光タンパク質又は融合タンパク質を 発現するベクター。
(16) (15)に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフエクシヨンされた宿 主細胞。
発明の効果
[0008] 本発明の蛍光タンパク質は、第一にこれまでになレ、 424nmという発光波長ピーク の蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また 、 pHの変化に蛍光強度が左右されなレ、、 pH非依存性の蛍光強度を有する本発明 の蛍光タンパク質は、従来困難であった酸性環境下における蛍光タンパク質の利用 を可能にする。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]GFP、 GFPの既知のアミノ酸置換変異体及び本発明の UMFP— 1の蛍光の呈 色を示す。
[図 2]本努明の蛍光タンパク質と既知の蛍光タンパク質の吸収スペクトル及ぴ発光ス ベクトルを表す。図左が吸収スペクトル、図右が発光スペクトルである。
[図 3]本発明の蛍光タンパク質と既知の蛍光タンパク質変異体 (GFPと BFP)の発光 強度に関する pH滴定曲線を示す。
[図4]1]^«^-3 (赤色）、 EBFP (青色）を 355mnの励起光で励起した際の蛍光褪色曲 線を示す。
[図 5]C Δ 11U FP-LE-N Δ 4ECFP (青色）、 UMFP- 3 (赤色）、 ECFP (シアン色）を 355 nmの励起光で励起した際の蛍光スペクトルを示す。
[図 6]UC-SCAT3による生きた細胞内におけるカスパーゼ 3活性化のモニターリング。 縦軸が大きいほど、カスパ一ゼ 3が活性化してレ、ることを表す。横軸は TNF o;処理後 の時間を示す。
[図 7]Sirius (水色)または EGFP (緑色)を発現する大腸菌がファゴサイト一シスによつ て細胞性粘菌 (微分干渉像)に取り込まれ、消化されてレヽく画像を示す。パネルの上 の数字は大腸菌が細胞性粘菌に取り込まれてからの時間（秒)を表す。
[図 8]SC - SCAT3と SapRC2による生きた細胞内におけるカスパーゼ 3活性化と Ca2+動 態のの同時画像化。暖かい色彩ほどカスパーゼ 3の活性が高ぐ Ca2+の濃度が高レ、こ とを表す。また、パネル上段の数字は TNF aの添加力 の時間を表す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、一般に GFPと称される蛍光タンパク質の変異体に関する。本発明の変 異体は、ォワンクラゲ（ィクオレア属、 Aequorea属）生物、例えばィクオレア.ビクトリ ァ（Aequorea victoria)由来の GFPの特定のアミノ酸残基が置換された、発光波長 ピークが 424nmである蛍光タンパク質、またこの蛍光タンパク質においてさらに 1若 しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、発光波 長ピークが 424mnである蛍光タンパク質である。この発光波長は群青色（Ultra Ma rine)として肉眼で視認され、従来知られてレ、る青色蛍光タンパク質の発光色とは肉 眼によって明確に区別することが出来る（図 1)。以下、群青色の蛍光を発する本発 明のタンパク質を、 UMFP (Ultra Marine Fluorescence Protein)と表すこととす る。
[0011] 本発明の UMFPは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列における特定の位置のアミ ノ酸が置換されてなる蛍光タンパク質である。この配列番号 1に示されるアミノ酸配列 は、ィクオレア'ビクトリア由来の野生型 GFPのアミノ酸配列において、 64位の Fが L に、 65位の Sが丁に、 66位の Yが Wに、 146位の N力 に、 153位の Mが Tに、 163位 の Vが Aに、 231位の Hが Lに、それぞれ置換されてなるアミノ酸配列である。従って 本発明は、野生型 GFPのアミノ酸配列にぉレ、て前記 7つの位置に置換変異を有する アミノ酸配列からなる蛍光タンパク質に対して、さらに特定の部位のアミノ酸を置換し てなる、多重置換変異を有する蛍光タンパク質である。なお、配列番号 1に示される アミノ酸配列は、以前 Clontech社から pECFP Vectorの名称（カタログ番号 63230 9)で市販されていた。
[0012] 本発明の UMFPは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 66位 (W)及び 175位（S)のアミノ酸残基の置換と、さらに 72位（S)又は 206位 (A)のアミノ酸残基 の少なくとも一つのアミノ酸残基の置換とを含むタンパク質である。この UMFPを、以 下、 UMFP— 1と表す。 UMFP— 1は、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 66位、 175位、 72位及び 206位の 4アミノ酸残基の置換を含むタンパク質であること が好ましレ、。また、 UMFP— 1は、 66位のアミノ酸残基が F、 72位のアミノ酸残基が A 、 175位のアミノ酸残基が Gに、及ぴ 206位のアミノ酸残基が Kにそれぞれ置換され た蛍光タンパク質であることが好ましい。以下、本発明の蛍光タンパク質を置換位置 と置換後のアミノ酸の種類で表すときは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列を基にし たことを表すために、ハイフンで結ばれる置換位置と置換後のアミノ酸の先頭に ECF Pを付けて表すこととする。例えば、上記の UMFP— 1の好ましい例は、 ECFP— W6 6F— S72A— S175G—A206Kと表される。
[0013] また本発明は、上記 UMFP— 1において、 65位 (T)、 145位 (Υ)、又は 148位（Η) の何れかのアミノ酸残基のいずれかが、好ましくはこれら 3アミノ酸残基の全てがさら に同時に置換された蛍光タンパク質を含む。このさらなる置換を含む UMFPを、以下 、 UMFP— 2と表す。 UMFP— 2は、 65位、 145位、及ぴ 148位の 3アミノ酸残基が さらに置換された蛍光タンパク質であることが好ましい。特に、 UMFP— 2は、 65位 のアミノ酸残基が Q、 145位のアミノ酸残基が G、及び 148位のアミノ酸残基力 にそ れぞれ置換された蛍光タンパク質であることが好ましレヽ。前記 3アミノ酸残基がそれぞ れ好適なアミノ酸残基に置換された本発明の UMFP— 2の特に好ましい例は、 ECF P— W66F— S72A—S175G— A206K— T65Q— Y145G— H148Sと表される。 UMFP— 2は、発光波長ピーク力 24nmであることに加え、 UMFP— 1よりも高めら れた蛍光強度を有する。この蛍光強度は、 46位 (F)に、好ましくは F46Lという置換 をさらに導入することで、より蛍光強度を高めることが出来る。この 46位の置換を含む UMFP,すなわち ECFP— F46L— W66F— S72A— S175G— A206K— T65Q — Y145G— H148Sも、 UMFP— 2の一^ である。
[0014] さらに本発明は、前記 UMFP— 1又は UMFP— 2において、 203位 (T)が更に置 換された蛍光タンパク質を含む。この更なる 203位の置換を含む UMFPを、以下、 U MFP— 3と表す。 UMFP— 3における好ましレ、置換は T203Vである。
[0015] 本発明のタンパク質の蛍光波長は、好適には光学的手段、例えば分光光度計、蛍 光計 CCD撮像素子などにより測定することができる。スペクトル特性は、本発明のタ ンパク質による発光の励起波長特性および発光波長特性として測定され得、これら のスペクトル特性から、励起波長および発光波長それぞれのピークとなる波長を確認 すること力できる。特に明記しない限り、例えば本発明において「424nm」との記載は 、好ましくは 424土 3nmはり好ましくは 424土 2rmi)を含む意味で用レ、られる。
[0016] 上記のアミノ酸置換によって、本発明の蛍光タンパク質は、公知の蛍光タンパク質と は明確に異なる、約 424mn以下に発光波長のピークを有する。例えば、公知の蛍光 タンパク質は、発光波長ピークが約 450nm (例えば、 BFP)、約 470nm (例えば、 C FP)、約 510nm (例えば、 eGFP)、約 530nm (例えば、 YFP)、約 600mn (例えば、 DsRed)などのピークを有する。これら公知の波長ピークとは明確に異なる発光波長 ピークは、異なる色彩を有する発光 (例えば、本発明の群青色）を提供し、これによつ て肉眼によって視¾>することが可能である（図 1)。
[0017] 本発明の蛍光タンパク質はまた、公知の蛍光タンパク質とは明確に異なる、約 355 nmに励起波長のピークを有する。例えば、公知の蛍光タンパク質は、励起波長ピー クが約 380nm(例えば、 BFP)、約 430nm (例えば、 CFP)、約 480nm (例えば、 eG FP)、約 510nm (例えば、 YFP)、約 550nm (例えば、 DsRed)などのピークを有す る。したがって、公知の蛍光タンパク質がほとんど反応できない波長の励起光を照射 することが可能である。
[0018] また、本発明の蛍光タンパク質、例えば UMFP— 3は、発光波長のピーク力 S424nm であることに加え、その蛍光強度が酸性条件下でも高く維持されるという特徴を有す る。 wtGFPその他の従来の GFPの酸性条件下、例えば pH5以下の蛍光強度は、中 性力 弱アルカリ性条件下、例えば pH7〜pH9で示す蛍光強度に対して著しく低下 する（通常、 70%〜100%低下する）のに対して、例えば本願の UMFP— 3の酸性 条件下の蛍光強度は、中性力 弱アルカリ性条件下における蛍光強度の少なくとも 5 0%以上、好ましくは 75%以上、より好ましくは 90%以上が維持される。さらに、本発 明の蛍光タンパク質の酸性条件下（好ましくは pH5以下、より好ましくは pH3〜pH5) における蛍光強度は、アルカリ性条件下 (好ましくは pH7以上、より好ましくは pH7〜 pH9)における蛍光強度より強くてもよい。すなわち、本発明の蛍光タンパク質にお いて、 pH9における蛍光強度に対して正規ィ匕した相対蛍光強度は、例えば pH3〜9 の範囲内において、好ましくは 50%以内、好ましくは 25%以内、より好ましくは 10% 以内で変化し得る。上記のような、 pHの変化に対して好ましくは 50%以内、好ましく は 25%以内、より好ましくは 10%以内で変化する蛍光強度を、本明細書中では pH 非依存性蛍光強度と表す。
[0019] 本明細書において、「高められた蛍光強度」とは、従来の蛍光タンパク質よりも、ある 波長を有する一定の光量の励起光に対して、本発明の蛍光タンパク質はモル当たり の発光量が高いことを意味する。蛍光タンパク質のアミノ酸配列中に変異を導入する ことによって蛍光強度が上昇する例としては、本発明の UMFP— 1と UMFP— 3との 比較が挙げられ、この例の場合は、 355nmの励起光をそれぞれの蛍光タンパク質に 照射した場合、 UMFP— 3は元の UMFP— 1よりも少なくとも 20%、好ましくは少なく とも 30%、さらに好ましくは少なくとも 40%の上昇を示す。また、本発明の蛍光タンパ ク質は、公知の蛍光タンパク質と比較して励起光が低波長側にあるため、より低波長 の励起光に対して比較的高い蛍光強度を提供できる。
[0020] 例えば、 UMFP— 2の一つである ECFP— F46L— W66F— S72A— S175G— A 206K— T65Q—Y145G— H148Sにさらに T203Vの置換を導入した UMFP— 3 、すなわち ECFP— F46L— W66F—S72A— S175G— A206K— T65Q— Y145 V—H148S— T203Vは、 424nmの発光波長ピークを有し、 UMFP— 1よりも少なく とも 20%、好ましくは少なくとも 30%、さらに好ましくは少なくとも 40%だけ高められた 蛍光強度を有し、かつ酸性条件下でもその蛍光強度が大きく変化しない (例えば、蛍 光強度の変化が 50%以内、好ましくは 25%以内、より好ましくは 10%以内である）と いう特徴を有している。
] 本発明は、 UMFPの前記特徴、例えば、約 424nmの発光波長ピークを有する、好 ましくは約 424mnの発光波長ピークと高められた蛍光強度とを有する、さらに好まし くは 424nmの発光波長ピーク、および高められた蛍光強度と pH非依存性蛍光強度 とを有する特徴を示す、本発明の UMFPを特徴付ける変異部位、すなわち 46位、 6 6位、 72位、 175位、 206位、 65位、 145位、 148位及ぴ 203位以外の音 |5位 Iこおレヽ て、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる 蛍光タンパク質も含む。本発明におけるアミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加に関 する「1若しくは数個 Jとは、 1〜数十アミノ酸以内、好ましくは 1〜70個、より好ましく 【ま1〜50個、更 ίこ好ましく ί±1〜30個、特 ίこ好ましく ίま 1〜： L5個、 1〜14個、 1— 13 個、 1〜12個、 1〜11個、 1〜10個、 1〜9個、：!〜 8個、 1〜7個、 1〜6個、 1〜5個、 1〜4個、 1〜3個、 1〜2個または 1個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配 列の同一性（％)で表せば、配列番号 1で示されるアミノ酸配列に対して 80%以上、 好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の同一性を 有するアミノ酸配列として表すことができる。
] タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的 性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。 例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン (Gly)とプロリン (Pro)、 Glyとァラ ニン (Ala)またはバリン (Val)、ロイシン (Leu)とイソロイシン (lie)、グルタミン酸（Glu )とグルタミン (Gin)、ァスパラギン酸 (Asp)とァスパラギン (Asn)、システィン（Cys) とスレオニン (Thr)、 Thrとセリン（Ser)または Ala、リジン (Lys)とアルギニン (Arg) 等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質 8 064266
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的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者にぉレ、て経験されるところである 。従って、 UMFPにおける置換部位として特定される 46位、 66位、 72位、 175位、 2 06位、 65位、 145位、 148位及び 203位以外の部位において、配列番号 1に記載さ れたアミノ酸配列の 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、'及び Z又は付加したアミ ノ酸配列力もなるタンパク質であっても、 UMFPとしても前記特徴を有する場合もあり 、これらは本発明の一態様として理解される。例えば、前記 46位、 66位、 72位、 175 位、 206位、 65位、 145位、 148位及ぴ 203位以外の部位におけるアミノ酸以外は すべて wtGFPのアミノ酸配列と同一のアミノ酸力 なる蛍光タンパク質も含まれる。ま た、前記 46位、 66位、 72位、 175位、 206位、 65位、 145位、 148位及び 203位以 外の部位におけるアミノ酸の置換力 本発明の UMFPが特徴とする上記の機能を損 なうことなぐさらに酵素の安定性向上や蛍光強度の増加等の有益な特性変化をもた らすこともあり、その様な蛍光タンパク質も本発明に含まれる。
[0023] さらにまた本発明のタンパク質は、時間の経過に伴う発光の褪色に対しても利点を 有する。すなわち、公知の蛍光タンパク質と比較して、本発明の蛍光タンパク質は、 褪色が長期化される。例えば本明細書中の実施例 6および図 4に示されるように、 10 秒間のパルス照射した直後の発光強度の対する 1000秒後の発光強度を測定すると 、本発明の蛍光タンパク質はその約 80%を維持してレ、る力 公知の EBFPの場合は 約 10%しか維持できなレ、。また、本発明の蛍光タンパク質は、少なくとも照射後 100 0秒の範囲で線形型の褪色を提供できることも特徴とする。
[0024] 本発明のタンパク質は、単独で製造し、使用してもよいが、本発明のタンパク質の N 末端及ぴノ又は C末端に、本発明のタンパク質以外のタンパク質又はポリペプチドを 付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、又利用してもよい。この様な本発 明のタンパク質を含む融合タンパク質も、本発明の一態様である。特に本発明の UM FPは、従来の GFPやその変異体と同じ使用目的において、それらに換えて利用す ることが出来る。例えば、あるタンパク質と本発明の UMFPとの融合タンパク質を生 体或いは細胞内で発現させることで、当該タンパク質の生体あるいは細胞内での局 在性を調べることができる。また、本発明の UMFPの発現を指標として、生体あるい は細胞内での遺伝子発現制御機構を調べることも出来る。特に、本樂明の UMFP— 3は pH非依存性蛍光強度を有していることから、エンドソームゃリソソームなどの、従 来知られてレ、る GFPあるレ、はその変異体を利用することができなレ、か、またはその利 用が非常に困難であった酸性オルガネラにおけるタンパク質の局在性の確認、細胞 内膜挙動の観察、その他の目的に利用することができる。
[0025] 本発明の蛍光タンパク質はまた、発光波長ピークおよび励起波長ピークの各々が、 公知の蛍光タンパク質が有する各々のピークとは異なるため、同時に複数の蛍光タ ンパク質を用いる用途に利用することが可能である。例えば、本発明の蛍光タンパク 質は発光波長ピークが公知の蛍光タンパク質とは異なるため、本発明の蛍光タンパ ク質 (またはその融合タンパク質）による発光と、公知の蛍光タンパク質 (またはその 融合タンパク質）による発光とを肉眼によって識別可能である（図 1)。また、本発明の 蛍光タンパク質の励起波長ピークが公知の蛍光タンパク質とは異なるため、公知の 蛍光タンパク質を励起できなレヽ波長利用する測定システムも可能である。さらにまた これら上記の利点によって、本発明の蛍光タンパク質および公知の蛍光タンパク質を 同時に利用すると、従来よりも複雑であり、かつ Zまたはより示差性に優れた、同時 多重角军析が可能となり得る。
[0026] さらに本発明の蛍光タンパク質は、上記のように公知の蛍光タンパク質とは励起波 長ピークおよび発光波長ピークが共に異なるため、本発明のタンパク質またはその 融合タンパク質と、公知の蛍光タンパク質またはその融合タンパク質とを適切に組合 わせることによって、従来とは異なる波長において蛍光共鳴エネルギー移動（Fluores cent Resonance Energy Transfer: FRET)を利用するシステムの構築が可能である。 F RETおよびその利用例については当業者に公知であり、例えば、 Takemoto, K.， Nag ai, Γ., Miyawaki, Α. & Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by ι ndicator that is insensitive to environmental effects. J. Cell. Biol. 160, 235-243 (200 3) ;Mizuno, H., Sawano, A., Eli, P., Hama, H. & Miyawaki, A. Red fluorescent protei n from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance resonanc e energy transfer. Biochemistry. 40, 2502-2510 (2001).などに記載される。
[0027] また、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、当該機能性タンパク質が示す 機能が付加される点で、本発明のタンパク質を単独で製造し、あるいは使用する場 合に比べて、高められた有用性を有する。その様な機能性タンパク質の例としては、 グルタチオン Sトランスフェラーゼ（GST)、マルトース結合タンパク質（MBP)、プロテ イン A、その他の、融合蛋白質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。 また、 FLAGタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質 の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にする機能性ポリペプチドを利用す れば、本発明のタンパク質の製造をより有利に行うことができる。
[0028] さらに、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質には、 必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識ィ匕合物を付加したり、種々の 化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能で あり、あるいは本発明で使用されるタンパク質を不溶性担体へ結合させたりすることも 可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られて おり、本発明のタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい
[0029] 特に、融合タンパク質の製造における抽出操作又は精製操作など、または標識ィ匕 タンパク質の製造における標識ィ匕合物の付加反応等において、タンパク質は様々な 反応条件に晒され得る。本発明の蛍光タンパク質は pH非依存性に活性を維持でき るため、公知の蛍光タンパク質よりも様々な反応条件において寛容であり、この特性 によって、本発明のタンパク質の利用が促進されると考えられる。
[0030] 本発明は、本 明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコ —ドする核酸を提供する。核酸は RNA又は DNAを含み、その形態としては mRNA 、 cDNAの他、化学合成 DNAなどが含まれるが、特に制限はなレヽ。本発明の好まし い核酸は DNAである。また本発明の核酸は 1本鎖であっても、それに相補的な配列 を有する核酸や RNAと結合して 2重鎖、 3重鎖を形成していても良い。また、当該核 酸は、ホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRPO)等の酵素や放射性同位体、蛍 光物質、化学楽光物質等で標識されていてもよい。
[0031] 本発明の核酸、好ましくは本発明のタンパク質である UMFPをコードする DNAは、 配列番号 2に示される GFPをコードする塩基配列において、前記 UMFP1〜3を特 徴付ける置換部位、すなわち 46位、 66位、 72位、 175位、 206位、 65位、 145位、 1 48位及び 203位以外のコドン力 S、それぞれのアミノ酸置換に応じたコドンに置き換え られた塩基配列からなる。また、係る塩基配列と相捕する塩基配列からなる核酸にス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ本発明の UMFPをコードする核酸も 本発明の核酸に含まれる。本発明におけるストリンジヱントな条件とは、塩濃度 1. 5 Mを含む 65°Cの緩衝液中で配列番号 2に相補的な塩基配列力 なる核酸にハイブ リダィズし、 50°Cの 2 X SSC溶液 (0. 1% [w/v] SDSを含む）で DNAを洗浄する条 件（1 X SSCは 0. 15M NaCl、0. 015Mクェン酸ナトリウムである）でハイブリダィズ が維持される条件を言う。また、塩基配列の同一性（％：)で示せば、配列番号 2の塩 基配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、更に好 ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸であればょレ、。これらの 手法 { 、例 xJ Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987 - 1997などに記載されている方法を利用することができる。
[0032] 本発明の核酸は、配列番号 1に示されるアミノ酸配列をコードする DNA、具体的に は配列番号 2に示される塩基配列力もなる DNAを基に、 PCR、部位特異的変異法 その他の一般的な遺伝子工学的手法によって調製することができる。配列番号 2に 示される塩基配列からなる DNAは、これを含むベクターが種々市販されており、これ らをそのまま利用すればよい。また部位特異的変異等の遺伝子工学的手法は、例え は Mamatis T.等 (MolecxilarCloning, a Laboratory Manual, Cold Sprin g harbor Laboratory, New York, 1982年）その他の、当業者に広く利用され てレ、る実験操作マニュアル書に記載されている。なお、本発明の核酸は、配列番号 2 に示される塩基配列情報を基にして、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法によ り、あるいは市販の DNAシンセサイザ一等を用いて直接製造することもできる。
[0033] 本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核 酸である DNAは、適当な発現ベクターに組み込むことができ、力かる発現ベクター は本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の組換え的生 産に利用される。この様なタンパク質の生産用の組み換えベクターも本発明に含まれ る。本発明のベクターは、環状、直鎖状等レ、かなる形態のものであってもよぐまた本 発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸に 加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、ェンハンサ 一配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用 される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコード する塩基配列、ポリ A付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーと なる遺伝子の塩基配列等のことである。
[0034] 遺伝子組み換えに際しては、適当な合成 DNAアダプターを用いて翻訳開始コドン や翻訳終止コドンを本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパ ク質をコードする核酸に付加したり、あるレ、は塩基配列内に適当な制限酵素切断配 列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者 が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本 明のタンパク質又は本発明のタンパ ク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を基に任意かつ容易に加工することがで きる。
[0035] また本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードす る核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使 用すればよぐプラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウィルス、レトロウイルス、 ワクシニアウィルス等の種々のウィルスを用いることも可能である。
[0036] 利用可能な市販の発現ベクターとしては、 PcDM8 (フナコシ社製）、 pcDNAI (フ ナコシ社製）、 cDNAI/AmP (Invitrogen社製）、 EGFP- CI (Clontech社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、: GBT— 9(Clontech社製)、等を例示することができる 。本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の発現は、該タ ンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることがで きる。あるいは、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質 をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用するこ ともできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択 すればよぐ例えば宿主が大腸菌である場合には T7プロモーター、 lacプロモーター 、 trpプロモーター、 ； L PLプロモーターなどが、宿主が酵母である場合には PH05プ 口モーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等力 宿主が動物細胞である場 合には SV40由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、サイトメガロウィルス（ヒ ト CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ一、メタ口チォネインプロモ一 ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等を挙げることができる。本発明 のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸、好ま しくは DNAを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに 組み込む等の操作も、前記 Maniatisちその他の実験操作マニュアル書の記載に基 づいて行うことができる。
[0037] 本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、例えば Fm oc法 (フルォレニルメチルォキシカルボニル法)や tBoc法 (t―プチノレォキシカルボ- ル法)等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を 用いて製造することもできる力 遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現 ベクターに組み込まれた DNAを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿 主細胞を用レ、た好適な発現系に導入することによって製造することが好ましレ、。
[0038] 宿主細胞の例としては、ェシエリヒア（Escherichia)属細菌、コリネバクテリゥム（Co rynebacterium)属細菌、ブレビバタテリゥム（Brevibacterium)属細菌、パチラス（ Bacillus)属細菌、セラチア（Serratia)属細菌、シユードモナス（Pseudomonas)属 細菌、アースロバクタ一（Arthrobacter)属細菌、エルゥニァ（Erwinia)属細菌、メ チロバクテリゥム（Methylobacterium)属細菌、ロドパクター（Rhodobacter)属細 菌、ストレプトミセス（Streptomyces)属微生物、ザィモモナス（Zymomonas)属微 生物、サッカロミセス（Saccharomyces)属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞 、 HEK293細胞、 MEF細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 CHO細胞、 WI38細胞、 BH K細胞、 COS— 7細胞、 MDCK細胞、 C127細胞、 HKG細胞、ヒト腎細胞株等の動 物細胞を挙げることができる。
[0039] 宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記の Maniatisらを初めとす る実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、 プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、 DEAEデキストラン法、 マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。 Sf9や Sf2 1等の昆虫細胞の利用については、バキュロウィルス'エクスプレッション 'ベクターズ 、ァ.ラボラトリ1 ~·マ-ユアノレ、ダプリュ一'ェイチ 'フリーマン 'アンド'カンパニー (W. H. Freeman and Company)、 New York、 1992年)や BioZTechnology、 19 88年、第 6巻、第 47頁等に記載されている。
[0040] 本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、前記の発 現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタ ンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方 法としては、蛋白質の精製に通常使用されてレヽる方法の中から適切な方法を適宜選 択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過 法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロ マトグラフィ一等の各種ァフィ二ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、 吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中 力 適切な方法を適宜選択し、必要により HPLCシステム等を使用して適当な順序 で精製を行えば良い。
[0041] また、本発明のタンパク質をヒスチジンタグや FLAGタグ等との融合タンパク質とし て発現させた場合には、そのタグ等に特徴的な精製法を採用することが好ましい。融 合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本 発明のタンパク質を回収することができる。また、組換え DNA分子を利用して無細胞 系の合成方法で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の 1つである。
[0042] この様に本発明のタンパク質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白 質の形態でも調製することができる力 S、これらのみに制限されるものではなぐ本発明 のタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に 対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体 への結合、リボソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が 考えられる。
[0043] また、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、 ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を 挙げることができる力 特にモノクローナル抗体が好ましい。力かる抗体は、本発明の タンパク質を抗原として用いた通常の操作により、非ヒト動物を免疫し、血清を回収し て、あるレ、はモノクローナル抗体を産生するハイブリド一マ細胞を誘導して製造するこ とができる。また、定法に従って、例えば、 FITC (フルォレセインイソシァネート）ゃテ トラメチルローダミンイソシァネート等の蛍光物質、放射性同位元素、アルカリホスファ ターゼゃペルォキシダーゼ等の酵素タンパク質で標識してもよい。
[0044] 本発明のタンパク質は、従来知られてレ、る GFPあるいはその変異体をマーカーとし て利用した各種分子生物学的な方法において、当該 GFPあるいはその変異体に換 わるマーカータンパク質として利用することができる。例えば、 Invitrogen社製の pR SETZEmGFPベクター等のように、 GFPとの融合タンパク質を簡便に発現させるこ とのできるベクターとして当業者に利用され、あるいは市販されている各種ベクターに おける GFPをコードする ORFを、本発明の蛋白質をコードする ORFに置き換えたべ クタ一を用意すれば、任意のタンパク質と本発明のタンパク質との融合タンパク質を 簡便に製造し、或いは利用することができる。この様なベクターを用いることで、当該 任意のタンパク質の生体内あるいは細胞内での発現、細胞および Zまたは細胞外局 在性の測定ないし確認、方法を測定することもできる。測定ないし確認は、本発明の タンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の蛍光発光を検出ないし 測定することで行う事ができる。
[0045] また、任意の機能性核酸の制御下に本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質 を含む融合タンパク質をコードする核酸を連結し、本発明のタンパク質又は本発明の タンパク質を含む融合タンパク質の蛍光発光を検出ないし測定することで、当該機能 性核酸の制御機構を調べたり、当該機能性核酸の機能を促進あるいは抑制すること の物質を探索したりすることもできる。
実施例
[0046] く実施例 1 >UMFP— 1 (ECFP— W66F—S72A— S175G—A206K)の作製
Invitrogen社製の PcDNA3に保持されて V、る ECFP (配列番号 1に示されるァミノ 酸配列からなる変異蛍光タンパク質)をコードする DNA(ECFP遺伝子)を、制限酵 素 BamHIと EcoRIで切り出し、同制限酵素で開環させたプラスミドベクター pRSET B (Invitrogen社）に組み換えて、 pRSETBZECFPを作製した。このプラスミドべク ターを鑤型とし、下記のプライマー DNAを用いて、 Asanoらの方法 (Nu Acid Re s. , 2000年、第 28巻、第 16号、 e78)に従って、 S72A、 S175G及び A206Kの 3 箇所のアミノ酸変異を導入した。
プライマー 1： CAGTGCTTCAGCCGCTACCCC (配列番号： 3) プライマー 2： GAGGACGGCAGCGTGCAGCTC (配列番号： 4) プライマー 3： ACCCAGTCCGCCCTGAGCAAA (配列番号： 5) すなわち、 500ngの pRSETB/ECFP、各 lOpmolのプライマー 1〜3、 3. 75nm olの dNTPs、 1. 25Uの Pfu DNAポリメラーゼ、 20Uの Pfu DNAリガーゼ（STRA TAGENE社）を含む 20 μ Lを準備し、 65°C、 5分のプレインキュベーションを行って Pfu DNAリガーゼによる铸型 DNAのニックを修復し、その後、 95°C、 1分の DNA 変性の後、 95°C、 10秒の DNA変性、 55°C、 30秒のアニーリング反応及び 65°C、 1 0分の伸長'連結反応を 1サイクルとした 20サイクルのサーマルサイクル反応を行つ た。サーマルサイクル反応後の反応溶液 20 μ Lに、 0. 4 L(8U)の Dpnl (New En gland BioLabs社)を加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、さらにフエノールクロロホ ルム抽出を行って DNAを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌 JM109 (DE 3)を形質転換し、 ECFP— S72A— S175G—A206K (配列番号： 15)をコードする DNA (配列番号： 14)を有するプラスミドベクタ一 pRSETBノ mSECFPを得た。
[0047] このベクターを铸型とし、下記のプライマーを用いてサーマルサイクル反応を行った プライマー 4： ACCCTGACCTTCGGCGTGCAG (配列番号： 6) サーマルサイクルの反応条件は、用いるプライマーを除き、先に示したサーマルサ イタル反応と同じ条件である。この反応により、ヒスチジンタグが付加された ECFP— W66F— S72A— S175G— A206K UMFP— 1)をコードするベクター pRSETB /UMFP— 1を作製した。 UMFP— 1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、そ れぞれ配列番号：16および 17に記載される。
[0048] このベクターを用いて、塩ィ匕カルシウム法により形質転換した大腸菌 JM109 (DE3 )を 100 μ g/mLのアンピシリンを含む LB液体培地 2mLで、 23°Cで 4日間培養し、 得られた細胞をフレンチプレスにより破砕した。破砕後の残渣を遠心分離で除去した 上清液から、ニッケルキレートカラム（Qiagen社製）を用いてヒスチジンタグが付加さ れた ECFP— W66F—S72A— S175G— A206Kを lOOmMイミダゾール及ぴ 300 mM NaClを含む 50mMトリス塩酸緩衝液 pH7. 4により溶出して回収し、さらに PD —10脱塩.バッファー交換用カラム（GE Healthcare Bio— Sciences社）により、 5 OmM HEPESバッファー pH7. 4に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグが付加された ECFP— W66F— S72A—S175G— A206K (UMFP— 1) (約 7.5mgZmL)を得 た。
[0049] く実施例 2 > UMFP— 2 (ECFP— F46L— W66F— S72A— S175G— A206K -T65Q-Y145G-H148S)の作製
実施例 1で作製した pRSETBZUMFP— 1を鎳型とし、下記のプライマー DNAを 用レヽてサ一マルサイクル反応を行った。
プライマー 5： ACCACCCTGCAATTCGGCGTG (配列番号： 7) プライマー 6： GAGTACAACGGGATCAGCCAC (配列番号： 8) プライマー 7： GGGATCAGCTCAAACGTCTAT (配列番号： 9) すなわち、 500ngの pRSETBZUMFP— 1、各 lOpmolのプライマー 5〜7、 3. 7 5mnolの dNTPs、 1. 25Uの Pfu DNAポリメラーゼ、 20Uの Pi DNAリガーゼ（S TRATAGENE社）を含む 20 /i Lを準備し、 65°C、 5分のプレインキュベーションを 行って Pfu DNAリガーゼによる鍚型 DNAのニックを修復し、その後、 95°C、 1分の DNA変性の後、 95°C、 10秒の DNA変性、 55°C、 30秒のアニーリング反応及ぴ 65 °C、 10分の伸長-連結反応を 1サイクルとした 20サイクルのサーマルサイクル反応を 行った。サーマルサイクル反応後の反応溶液 20 Lに、 0. 4 L(8U)の Dpnl (New England BioLabs社)を加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、さらにフエノールクロ 口ホルム抽出を行って DNAを精製した後、塩ィ匕カルシウム法により、大腸菌 JM109 ( DE3)を形質転換し、 ECFP— W66F— S 72A— S 175G— A206K— T65Q— Y1 45V-H148S (配列番号： 19)をコードする DNA (配列番号： 18)を有するプラスミ ドベクター PRSETB/ECFP—W66F— S72A— S 175G— A206K— T65Q— Y1 45G— H148Sを得た。
[0050] このベクターを鎵型とし、下記のプライマーを用いてサーマルサイクル反応を行い、 pRSETBZUMFP - 2を得た。
プライマ 8： ACCCTGAAGCTCATCTGCACC (配列番号： 10) サーマルサイクルの反応条件は、用レ、るプライマーを除き、先に示したサーマルサ ィクル反応と同じ条件である。 pRSETB/UMFP一 2を用レ、て実施例 1と同様の操 作を行い、
Figure imgf000022_0001
を得た。 UMFP 一 2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号: 20および 21に記 载される。
[0051] <実施例3〉UMFP—3 (ECFP—F46L—W66F— S72A—S175G—A206K— T65Q-Y145G-H148S-T203V)の作製
実施例 2で作製した pRSETBZUMFP— 2を铸型とし、下記のプライマー DNAを 用レ、てサ一マルサイクル反応を行い、 pRSETB/UMFP— 3を得た。
プライマー 9： TACCTGAGCGTCCAGTCCGCC (配列番号：11) サ一マルサイクルの反応条件は、用レ、るプライマーを除き、先に示したサーマルサ ィクル反応と同じ条件である。この： RSETB/UMFP— 3を用!/、て実施例 1と同様の 操作を行い、ヒスチジンタグが付カ卩された UMFP— 3 (約 9.3mgZmL)を得た。 UM FP— 3のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号： 22および 23 に記載される。
[0052] <実施例 4 >UMFPの励起波長ピーク及び発光波長ピークの測定
実施例 1〜3で調製した UMFP— l〜3//50mM HEPESバッファー ρΗ7· 4の水 溶液を 50mMの HEPESバッファー（ρΗ7. 4)を用いて 100倍希釈し、蛍光分光光 度計 (HITACHI F— 2500)を使用して、励起スペクトル及び蛍光スペクトルを測定 した。また、同時に wtGFP、既知の GFPの人為的変異体である BFP (Heimら、前 記非特許文献 1)、 CFP (Heimら、 Curr. Biol.、 1996年、第 6卷、第 178— 182頁 ；)、 YFP (Ormoeら、 1994年、 Science,第 273卷、第 1392— 1395)及び DsRed( Terskikhら、 2000年、 Science,第 290卷、第 1585— 1588頁）の励起スペクトル 及び蛍光スペクトルを、 UMFPと同一条件で測定した。各蛍光タンパク質の最大輝 度を 1に規格化した蛍光スペクトルを図 2に示す。 UMFP1〜3は、いずれも励起波 長のピークが約 355mnであり、発光波長のピークが約 424nmであった。
[0053] <実施例 5〉UMFP— 3の pH非依存性蛍光強度
50mM Glycine— HC1緩衝液 (pH3. 0〜3. 4)、 50mM NaOAc (pH3. 8—5. 4)、 50mM MES (pH5. 8—6. 2)、 50mM MOPS (pH6. 6—7. 0)、 50mM H EPES (PH7. 4~7. 8)、 50mM Glycine (pH8. 6〜9. 0)を用レヽて pH3. 0〜9. 0の範囲の緩衝液を調製し、 2 μ Mの UMFP— 3/各緩衝液 20mMの蛍光を測定し 、各 pHにおける蛍光強度を計算した。また、 GFPと BFPについても同様の測定を行 つた。この結果を図 3に示す。
[0054] GFPと BFPいずれも、酸性環境下で蛍光強度が 1/2以下に減少した。一方、 UM FP— 3の蛍光強度は、広レ、 pH範囲（pH3. 0〜9. 0)において一定であった。
[0055] <実施例 6 >UMFP— 3の光安定性
UMFP - 3及び、比較のための EBFPを HeLa細胞に一過性発現させることにより、光 安定性の測定を行った。 35mmのガラスボトムディッシュに培養した HeLa細胞に、 pcD NA3/UMFP-3, pcDNA3/EBFPそれぞれを、 Surperfect(Invitrogen)を用いてトランス フエクシヨンした。トランスフエクシヨン 1日後、それぞれの組み換えタンパク質が細胞 質に正常に発現していることを確認し、光安定性の測定を行った。顕微鏡は Nikon T E - 2000E倒立顕微鏡を用レ、、対物レンズは Flour、 40倍、開口数 1.30の油浸対物レン ズを用いた。 UMFP- 3、 EBFPの蛍光は、 340— 380nmの波長域で励起し、 435— 485η mの波長域のバンドパスフィルターを用いて検出した。図 4は、 UMFP- 3、 EBFPそれ ぞれの蛍光タンパク質を発現した HeLa細胞に 10秒間励起光を当てて撮影をする作 業を繰り返して得た、蛍光強度の褪色曲線を示したものである。図 4に示されるように 、 10秒間のパルス照射した直後の発光強度の対する 1000秒後の発光強度を測定 すると、本発明の蛍光タンパク質はその約 80%を維持している力 公知の EBFPの 場合は約 10%しか維持できない。またこの図は、本発明の蛍光タンパク質が少なくと も照射後 1000秒の範囲で線形型の褪色を提供できることも示している。
[0056] く実施例 7 > UMFP - 3をドナー、 ECFPをァクセプターとした FRETペアの作製と FRET 効率の検討
UMFP - 3と ECFPの蛍光スペクトル及ぴ FRET効率を測定するにあたり、 C末端 11アミ ノ酸を削った UMFP - 3と、 N末端 4アミノ酸を削った mSECFPを制限酵素 Xholの認識配 列であるロイシン、グルタミン酸の 2つのリンカ一アミノ酸でつなげたキメラタンパクを作 製した（以下 C Δ 11UMFP -し E - N Δ 4ECFP:ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、 それぞれ配列番号： 24および 25に記載される）。 C Δ UUMFPの cDNAは制限酵素 B amHIの認識配列を含むセンスプライマーと、制限酵素 Xholの認識配列を含むアンチ センスプライマーを用いて PCRを行うことで増幅させた。また、 N A4ECFPの cDNAは 制限酵素 Xholの認識配列を含むセンスプライマーと、制限酵素 EcoRIの認識配列を 含むアンチセンスプライマーを用いて PCRを行うことで増幅させた。制限酵素処理を した産物を pRSETB (Invitrogen)に導入し、大腸菌発現プラスミドの pRSETB/C Δ 11U MFP-LE-N Δ 4ECFPを作製した。 pRSETB/C Λ 11UMFP- LE - N Δ 4ECFP、 pRSETB/ UMFP-3, pRSETB/ECFPを大腸菌 JM109 (DE3)に導入し、それぞれの組み換えタン ノ ク質を室温で発現させ、ポリヒスチジンタグを用いた精製を行った。精製したサンプ ルの蛍光スペクトルの測定は、 F- 2500蛍光分光光度計（HITACHI)を使用した。測定 は、 50mM HEPES (pH7.4)に濃度 2 Mのサンプルを溶解させたものを用いた。図 5は C Δ 11U FP-LE-N Δ 4ECFP (青色）、 UMFP- 3 (赤色）、 ECFP (シアン色）を 355nmの 励起光で励起した際の蛍光スペクトルを表している。この実験より、 C A llUMFP - LE - N A 4ECFPの FRET効率は約 66%と計算される。 FRET効率に関して、例えば、 FRE T効率の良さ力 一般的に使われる CFP-YFPの FRETペアを用レ、た cAMP指示薬（文 18^： Ponsioen, B. et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence res onance energy transfer: Epac as a nove】 cAIviP indicator. EMBO Rep. 5， 1176—1180 (2004). )は、蛍光スペクトルから判断して、 FRET効率が数％程度であることが記載 されている。したがって、本蛍光タンパク質ペアは従来よりも低い波長の励起光によ つて、非常に高い効率で FRETを起こすことが可能であった。
く実施例 8 >UMFP - 3と mSECFPの FRETペアを用いた SCAT type指示薬による Casp ase - 3活性化のリアルタイムイメージング
UMFP- 3から mSECFPへの FRETを用レ、てシスティンプロテアーゼであるカスパーゼ 3の活性ィ匕指示薬 UC - SCAT3 (ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配 列番号： 26および 27に記載される）を作成した。本指示薬遺伝子を発現するプラスミ ド UC - SCAT3- pcDNA3.1(—)は竹本らが開発した ECFPと Venusを FRETペアとして利 用したカスパーゼ 3活性ィ匕指示薬である SCAT3 (Takemoto K, Nagai T, Miyawaki A, et al.： Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J. Cell Biol. 160: 235 - 243, 2003.)の Venus遺伝子を制限 酵素 Kpnlと Hindlllで切断し、そこに UMFP - 3を導入し、さらに ECFP遺伝子を制限酵 素 BamHIと Kpnlで切断し、そこに mSECFPを導入することによって作製した。 UC- SCA T3- pcDNA3, l(—)を 35mmのガラスボトムディッシュに培養した HeLa細胞に、 Surperfe ct(Invitrogen)を用いてトランスフエクシヨンし、細胞質に発現させた。トランスフヱクショ ンして 1日後にイメージングを行った。なお、アポトーシスを誘導するために、イメージ ングを行う 90分前に 50ng/ml TNF aと 10 μ g/mlのシクロへキシミドで細胞を処理した 。観察は、 Nikon TE- 2000E倒立顕微鏡を用い、対物レンズは Apo- VC、 60倍、開口 数 1.35、の油浸対物レンズを用いた。 HeLa細胞の細胞質に発現した UC- SCAT3を 35 2— 388nmの波長域で励起した。蛍光の検出は、 UMFP- 3については 415— 455nmの 波長域のバンドパスフィルタ一を用いて検出し、 ECFPについては 459_499ηπιの波 長域のバンドパスフィルターを用いて検出した。図 6の左図は、右図の各円枠内（ROI ： Region Of Interst)における Caspase- 3の活性化に伴う UMFP_3/mSECFPのレシオ の変化を示したものである。横軸は、観察開始時からの経過時間を示している。この 図から、 UMFP-3/mSECFPの蛍光強度比の変化に伴う、 Caspase- 3の活性化を検出 することが可能であることが分かる。
く実施例 9〉UMFP— 4 (ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A— Y 145G— H148S— S175G—A206K— T203V)の作製
実施例 3で作製した UMFP— 3 (ECFP— F46L— T65Q— W66F—S72A— Y1 45G—H148S— S175G— A206K— T203V)をコードするプラスミドベクター、 pR SETBZUMFP— 3を鎳型とし、下記のプライマー DNAを用いてサーマルサイクル 反応を行った。
プライマー 10 : 5' - TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC - 3 ' (配列番号： 12
)
すなわち、 50ngの pRSETB/UMFP— 3、 lOpmolのプライマ一 10、 3. 75nmo 1の dNTPs、 1. 25Uの Pfu DNAポリメラーゼ、 20Uの Pfu DNAリガーゼ（STRAT AGENE社）を含む を準備し、 65°C、 5分のプレインキュベーションを行って P fu DNAリガーゼによる铸型 DNAのニックを修復し、その後、 95°C、 1分の DNA変 性の後、 95°C、 10秒の DNA変性、 55°C、 30秒のアニーリング反応及び 65°C、 10 分の伸長'連結反応を 1サイクルとした 20サイクルのサーマルサイクル反応を行った 。サーマルサイクル反応後の溶液 20 i Lに、 0. 4 i L(8U)の DpnI (New England BioLabs社)を加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、さらにフエノールクロ口ホルム抽 出を行って DNAを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌 JM109 (DE3)を形 質転換し、 ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A— Y145G— H148S 一 S175G— A206K— T203V UMFP— 4)をコードする DNAを有するプラスミド ベクター pRSETBZUMFP— 4を得た。 UMFP— 4のヌクレオチド配列おょぴァミノ 酸配列は、それぞれ配列番号： 28および 29に記載される。
[0059] このベクター pRSETBZUMFP_4を用いて、塩化カルシウム法により形質転換し た大腸菌 JM109 (DE3)を 100 μ gZmLのアンピシリンを含む LB液体培地 200mL で、 23°Cで 4日間培養し、得られた細胞をフレンチプレスにより破碎した。破砕後の 残渣を遠心分離で除去した上清液から、ニッケルキレートカラム (Qiagen社製)を用 いて、ヒスチジンタグが付加された ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72 A—Y145G— H148S— S175G— A206K— T203Vを lOOmMイミダゾール及び 300mM NaClを含む 50πιΜトリス塩酸緩衝液 pH7. 4によって回収した。さらに PD —10脱塩-バッファー交換用カラム（GE Healthcare Bio— Sciences社）により、 5 OmM HEPESバッファー pH7. 4に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグが付加された 、 ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A— Y145G— H148S— S175 G— A206K— T203V(UMFP— 4)を約 500 μ gZniL得た。
[0060] く実施例 10>Sirius (ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L—S72A— Y145 G— H148S— S175G— A206K—T203V— F223S)の作製
く実施例 9>で作製した ECFP-F46L— T65Q—W66F— Q69L— S72A— Y1 45G—H148S— S175G— A206K— T203Vをコードするプラスミドベクター、 pRS ETB UMFP— 4を鍚型とし、下記のプライマー DNAを用いてサーマルサイクル反 応を行った。
プライマー 11 : 5' -TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC- 3 ' (配列番号： 13
) すなわち、 50ngの pRSETB/UMFP— 4、 lOpmolのプライマー 11、 3. 75nmol の dNTPs、 1. 25Uの Pfu DNAポリメラーゼ、 20Uの Pfu DNAリガーゼ（STRAT AGENE社）を含む 20 /X Lを準備し、 65°C、 5分のプレインキュベーションを行って P fu DNAリガーゼによる铸型 DNAのニックを修復し、その後、 95°C、 1分の DNA変 性の後、 95°C、 10秒の DNA変性、 55°C、 30秒のァユーリング反応及び 65°C、 10 分の伸長.連結反応を 1サイクルとした 20サイクルのサーマルサイクル反応を行った 。サーマルサイクル反応後の溶液 20 に、 0. 4 μ L(8U)の Dpnl (New England BioLabs社)を加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、さらにフエノールクロ口ホルム抽 出を行って DNAを精製した後、塩ィヒカルシウム法により、大腸菌 JM109 (DE3)を形 質転換し、 ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A— Y145G— H148S — S175G— A206K— T203V— F223S (Sirius)をコードする DNAを有するプラス ミドベクター pRSETB/Siriusを得た。 Siriusのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列 は、それぞれ配列番号： 30および 31に記載される。
[0061] このベクター pRSETBZSiriusを用いて、塩ィヒカルシウム法により形質転換した大 腸菌 JM109 (DE3)を 100 μ gZmLのアンピシリンを含む LB液体培地 200mLで、 23°Cで 4日間培養し、得られた細胞をフレンチプレスにより破砕した。破碎後の残渣 を遠心分離で除去した上清液から、ニッケルキレートカラム（Qiagen社製)を用いて、 ヒスチジンタグが付加された ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A—Y 145G— H148S— S175G— A206K— T203V— F223S (Sirius)を lOOmMイミ ダゾール及ぴ 300mM NaClを含む 50mMトリス塩酸緩衝液 pH7. 4によって回収し た。さらに PD— 10脱塩'バッファー交換用カラム（GE Healthcare Bio -Sciences 社）により、 50mM HEPESバッファー： H7. 4に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグ が付加された ECFP— F46L— T65Q— W66F— Q69L— S72A—Y145G— H14 8S— S175G— A206K— T203V— F223S (Sirius)を約 得た。
[0062] <実施例 11 >二光子励起顕微鏡を用レヽた細胞性粘菌 Dictyostelium Discoideu mによる Siriusを発現する大腸菌 E. Coliのファゴサイト一シスの観察
細胞性粘菌 AX2は予め 23. 3°C、 10mLの HL5培地で培養し、大腸菌 JM109 (D E3)はく実施例 10>で作製したプラスミドベクター pRSETB/Siriusを用いて、塩 化カルシウム法により形質転換させた後、 100 μ gZmLのアンピシリンを含む LB液 体培地 2mLで、 37°C、 12時間培養した。細胞性粘菌 AX2は、遠心により沈殿させ た後、 BSSバッファーで再び懸濁し、 Siriusを発現する大腸菌 JM109 (DE3)は、遠 心により沈殿させた後、 PBSバッファーで再ぴ懸濁した。 35mmペトリディッシュ上の 1 %ァガロースゲルの上で、バッファーで懸濁した細胞性粘菌 AX2と Siriusを発現す る大腸菌 JM109 (DE3)を混合した。その後室温で 1時間インキュベートし、 35mm ペトリディッシュ上のァガロースゲルを裏返しにして、混合した細胞性粘菌 AX2と Siri usを発現する大腸菌 JM109 (DE3)を顕微鏡観察した。顕微鏡は、多光子励起顕微 鏡 Olympus Fluoview FV300を用レヽ、対物レンズは UHan FLN、 40倍、開口数 1. 30 (Olympus)の油浸レンズを用いた。レーザーは Ti: sapphire (MAITAI, Spe ctra Physics社）を用い 780nmの励起光によって Siriusを 2光子励起して蛍光観察 した。図 7は、 Siriusを発現する大腸菌がファゴサイト一シスによって細胞性粘菌に取 り込まれ、消化されてレ、く模様をを示している。この図は、蛍光強度力 ¾H非依存性で ある Siriusが、蛍光強度力 )Hに依存する EGFPよりも、酸性条件下にある粘菌のフ ァゴソームの中に取り込まれた大腸菌の様子を明確に確認することが可能であること を示している。
[0063] く実施例 12 >Siriusをドナー、 mSECFPをァクセプターとする FRETペア及ぴ Sap phireをドナー、 DsRedをァクセプターとする FRETペアを同時に用いた、 1波長励 起 4波長測光 Dual FRET観察
始めに、 Siriusから mSECFPへの FRETを用レ、てシスティンプロテアーゼである力 スパーゼ 3の活性ィヒ指示薬 SC_SCAT3 (ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、 それぞれ配列番号: 32および 33に記載される。）を作成した。本指示薬遺伝子を発 現するプラスミド SC— SCAT3— pcDNA3. 1(一)はく実施例 8〉で作成した UC— SCAT3の UMFP— 3遺伝子を制限酵素 Kpnlと Hindlllで切断し、そこに Siriusを 導入することによって作製した。
[0064] このカスパーゼ 3の指示薬である SC— SCAT3と、カルシウムイオン指示薬である S apRC2 (Mizuno H, Sawano A, iyawaki A, et al.: Red Fluorescent Protein from Dis cosoma as a Fusion Tag and a Partner for Fluorescence Resonance Energy Transfer. Biochemistry. 40： 2502-2510, 2001.)の二組の FRETペアを、 HeLa細胞内で発現 させた。すなわち、 4 μ 1の Suiperfect (Invitrogen)を用いて、 1 u gノ dishの pcDN A3. 1 (一） /SC— SCAT3と： cDNA3/SapRC2を 35mmガラスボトムディッシュ 上で培養した HeLa細胞に導入し、共発現させることにより、行った。
[0065] 観察は、プラスミドベクターを導入して力 2日後に行った。なお、 HeLa細胞にアポ トーシスを誘導するために、イメージングを行う直前に、 50ngZml TNF αと 10 g /mlシクロへキシミドで細胞を処理した。 Wide— field蛍光観察は、 TE—2000E倒 立顕微鏡（Nikon)で行い、対物レンズは、 Apo— VC、 60倍、開口数 1. 35の油浸 レンズ（Nikon)を用いた。また、干渉フィルタ一は、すべて Semrock社のものを使 用した。
[0066] SC— SCAT3、 SapRC2の発光観察はともに、水銀アークランプを光源とし、 FF0 1— 370ノ36の励起フィルタ一及び、 CFW—DiOi— Clinのダイクロイツクミラーを用 いて励起した。 Sirius、 mSEECFP, Sapphire, DsRedの蛍光の検出は、それぞれ FF01— 435Z40、 FF01/479/40, FF01— 525,39、 FF01— 585,40のフ ィルターを通して行った。図 8はアポト一シス過程の HeLa細胞内におけるカスパーゼ 3の活性化と Ca2+の動態を同時にタイムラプス観察した画像を示す。この図より、細胞 に共発現させたカスパーゼ 3指示薬の SC— SCAT3とカルシウムイオン指示薬の Sa pRC2により、誘導された細胞死に伴うカスパーゼ 3の活性化及び、カルシウムイオン 濃度の時間変化を同時に観察することが可能であることが分かる。
産業上の利用可能性
[0067] 本発明の蛍光タンパク質は、第一にこれまでにない 424nmという発光波長ピーク の蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また 、 pHの変ィヒに蛍光強度が左右されない、 pH非依存性の蛍光強度を有する本発明 の蛍光タンパク質は、従来困難であった酸性環境下における蛍光タンパク質の利用 を可能にする。したがって、本発明の蛍光タンパク質によって、無傷の生体あるいは 細胞を用いた、生体或いは細胞内における特定の物質の局在性の目視による観察 ないし確認、さらには特定の遺伝子発現の確 などを行うための、より多様な条件に 適合可能な蛍光タンパク質を提供することが可能になり、分子生物学における研究 などに大きく貢献し得る。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 66位のアミノ酸残基と 175位のアミノ酸 残基がそれぞれ置換され、さらに 72位のアミノ酸残基又は 206位のアミノ酸残基の 少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが 424nmである蛍光タンパク質。
[2] 72位のアミノ酸残基及び 206位のアミノ酸残基がいずれも置換されている、請求項 1 に記載の蛍光タンパク質。
[3] 66位のアミノ酸残基がフヱ二ルァラニンに、 72位のアミノ酸残基がァラニンに、 175 位のアミノ酸残基がグリシンに、及び 206位のアミノ酸残基がリジンにそれぞれ置換さ れている、請求項 2に記載の蛍光タンパク質。
[4] さらに 65位のアミノ酸残基、 145位のアミノ酸残基又は 148位のアミノ酸残基の少な くとも一つのアミノ酸残基が置換されている、請求項 1〜3の何れかに記載の蛍光タン パク質。
[5] 65位のアミノ酸残基、 145位のアミノ酸残基及び 148位のアミノ酸残基が何れも置換 されている、請求項 4に記載の蛍光タンパク質。
[6] 65位のアミノ酸残基がグルタミンに、 145位のアミノ酸残基がグリシンに、及び 148位 のアミノ酸残基がセリンに置換されている、請求項 5に記載の蛍光タンパク質。
[7] さらに 46位のアミノ酸残基が置換されている、請求項 4〜6の何れかに記載の蛍光タ ンパク質。
[8] 46位のアミノ酸残基がロイシンに置換されている、請求項 7に記載の蛍光タンパク質
[9] さらに 203位のアミノ酸残基が置換されている、請求項:!〜 8の何れかに記載の蛍光 タンパク質。
[10] 203位のアミノ酸残基力 Sバリンに置換されている、請求項 9に記載の蛍光タンパク質
[II] 66位のアミノ酸残基がフエ-ルァラニンに、 175位のアミノ酸残基がグリシンに、 72 位のアミノ酸残基がァラニンに、 206位のアミノ酸残基力 Sリジンに、 65位のアミノ酸残 基がグルタミンに、 145位のアミノ酸残基がグリシンに、 148位のアミノ酸残基がセリン に、 46位のアミノ酸残基がロイシンに、及ぴ 203位のアミノ酸残基がバリンに置換さ れている、請求項 10に記載の蛍光タンパク質。
[12] 請求項 1〜11に記載の蛍光タンパク質において、さらに 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなる、発光波長ピークが 424nmであ る蛍光タンパク質。
[13] 請求項 1〜12の何れかに記載の蛍光タンパク質と任意のタンパク質又はポリべプチ ドとからなる融合タンパク質。
[14] 請求項 1〜13の何れかに記載の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードする核 酸。
[15] 請求項 14に記載の核酸によってコードされる蛍光タンパク質又は融合タンパク質を 発現するベクター。
[16] 請求項 15に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフエクシヨンされた宿 主細胞。
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