JP2002045189A - シアン−グリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 広範囲なｐＨ条件下においても優れた蛍光特
性を示すグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の提供。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードする遺伝子。 （ａ）エクオレア（Ａｅｑｏｒｅａ）属由来の特定のア
ミノ酸配列からなるタンパク質。 （ｂ）上記アミノ酸配列における少なくとも１個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から
なり、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能を有する
タンパク質。上記と異るエクオレア属由来の特定のタン
パク質をコードする２種類の遺伝子。これら一連の遺伝
子によりコードされるシアン−グリーン蛍光タンパク
質。上記遺伝子を組換ベクターとした形質転換体による
該蛍光タンパク質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、自発的な蛍光特性
を有する、全く新規なシアン−グリーン蛍光タンパク質
をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】エクオレア（Aeqorea）属が産生する自
発的蛍光タンパク質としては、グリーン蛍光タンパク質
（以下、GFP）と呼ばれる２３８個のアミノ酸からなる
ものが知られている。GFP等の自発的蛍光タンパク質
は、細胞小器官（オルガネラ）におけるタンパク質局在
を定量的にモニタリングする際に使用することができ
る。すなわち、モニタリング対象のタンパク質をGFP等
の自発的蛍光タンパク質を用いて蛍光標識することがで
き、当該タンパク質の細胞内小器官等における挙動を画
像化することができる。

【０００３】自発的蛍光タンパク質のなかでもGFPは、
高温で安定であり（Tm＝７８℃）、カオトロピック試薬
（８Mウレア）中で安定であり、且つ、タンパク質分解
に対しても安定であるといった性質を有している。しか
しながら、GFPは、ｐＨ、イオン濃度及びタンパク質濃
度といったいくつかの要因によって影響を受けることが
知られている。特に、GFPは、酸性条件下で蛍光特性が
劣化してしまい、非常に限られたｐＨ範囲でしか使用す
ることができない。このため、例えば、GFPを使用して
細胞内におけるタンパク質の挙動をモニタリングしよう
とする際には、ｐＨを注意深くチェックする必要があっ
たり、また、ｐＨを厳密に制御しなければならい。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、上
述したような従来の問題に鑑み、広範囲なｐＨ条件下に
おいても優れた蛍光特性を有するシアン−グリーン蛍光
タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的と
する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ために本発明者らが鋭意検討した結果、GFP及びGFPを改
変した自発的蛍光タンパク質における所定のアミノ酸を
置換することによって、広範囲のｐＨ条件下においても
優れた蛍光特性を維持できるといった知見を得て、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）、
（２）及び（３）の遺伝子である。 （１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードす
る遺伝子。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
を有するタンパク質。 （２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードす
る遺伝子。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
を有するタンパク質。 （３）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードす
る遺伝子。 （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。 （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
を有するタンパク質。

【０００７】また、本発明は、（１）乃至（３）いずれ
か１記載の遺伝子によりコードされるシアン−グリーン
蛍光タンパク質である。さらに、本発明は、（１）乃至
（３）いずれか一記載の遺伝子を有する組換えベクター
である。

【０００８】さらにまた、本発明は、上記組換えベクタ
ーを有する形質転換体である。さらにまた、本発明は、
上記形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク
質を採取することを特徴とするシアン−グリーン蛍光タ
ンパク質の製造方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、図面を参
照して詳細に説明する。先ず、本発明のシアン−グリー
ン蛍光タンパク質は、エクオレア（Aeqorea）属が産生
するグリーン蛍光タンパク質（以下、GFP）、GFPを改変
した増強グリーン蛍光タンパク質（以下、EGFPと呼
ぶ。）又はEGFPを改変した増強シアン蛍光タンパク質
(以下、ECFPと呼ぶ。)をコードする遺伝子に対して、所
定の部位に突然変異を導入することよって得ることがで
きる。

【００１０】ここで、このEGFPをコードする遺伝子（配
列番号４）は、GFPをコードする遺伝子（配列番号５）
と比較してコドン使用頻度を変更し、また、GFPにおけ
る１番目のメチオニンと２番目のセリンとの間にバリン
をコードするコドンを付加することによって宿主内での
発現が増強されたものである。また、EGFP（配列番号６
にアミノ酸配列を示す。）は、GFP（配列番号７にアミ
ノ酸配列を示す。）の６４番目（EGFPにおける６５番
目）のフェニルアラニンがロイシンに、６５番目（EGFP
における６６番目）のセリンがトレオニンに置換された
ものである。本明細書において、アミノ酸を表記する場
合は、全てGFPのアミノ酸配列に基づいて数えられた数
値とする。言い換えると、GFPを除くアミノ酸配列にお
いては、２番目に位置するバリンを抜かして数えた数値
を用いて、特定のアミノ酸の位置を表記する。したがっ
て、例えば「EGFPの６６番目のチロシン」と記載する場
合には、配列番号６における６７番目に位置するアミノ
酸を意味している。

【００１１】ECFP（配列番号８にアミノ酸配列を示
す。）は、EGFP（配列番号６）と比較して６６番目（す
なわち、配列番号８及び６における６７番目を意味す
る。以下同様。）のチロシンがトリプトファンに、１４
６番目のアスパラギンがイソロイシンに、１５３番目の
メチオニンがトレオニンに、１６３番目のバリンがアラ
ニンに、１６４番目のアスパラギンがヒスチジンに置換
されたものである。ECFPは、このような変異を有するこ
とによって、EGFPと比較してタンパク質の折り畳等の高
次構造の形成及びタンパク質の成熟を助けることができ
る。

【００１２】先ず、シアン−グリーン蛍光タンパク質と
しては、ECFPのアミノ酸配列（配列番号８）の２０３番
目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に置換することに
よって得ることができる。このシアン−グリーン蛍光タ
ンパク質をECGFPと呼び、そのアミノ酸配列を配列番号
１に示す。

【００１３】ECFPのアミノ酸配列（配列番号８）の２０
３番目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に置換する方
法としては、特に限定されず、ECFPの２０３番目のトレ
オニンをコードするコドンをチロシンをコードするコド
ンに特異的に変異させたECFP-T203Y遺伝子を発現させる
方法が挙げられる。ECFP-T203Yを作製する方法として
は、ECFP遺伝子（配列番号９）を鋳型とした通常用いら
れている部位特異的突然変異法を挙げることができる。
部位特異的突然変異法としては、例えば、QuikChange^TM
Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Joll
a, CA, USA)を挙げることができる。

【００１４】次に、シアン−グリーン蛍光タンパク質と
しては、EGFPにおける６６番目のチロシン（Y）をトリ
プトファン（W）に、２０３番目のトレオニン（T）をチ
ロシン（Y）に置換することによって得ることができ
る。このシアン−グリーン蛍光タンパク質をEGFP-Y66W/
T203Yと呼び、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。E
GFP-Y66W/T203Y遺伝子を作製する方法としては、EGFP遺
伝子を鋳型とする以外はECGFP遺伝子と同様に、通常用
いられている部位特異的突然変異法を挙げることができ
る。

【００１５】次に、シアン−グリーン蛍光タンパク質と
しては、GFPにおける６６番目のチロシン（Y）をトリプ
トファン（W）に、２０３番目のトレオニン（T）をチロ
シン（Y）に置換することによって得ることができる。
このシアン−グリーン蛍光タンパク質をGFP-Y66W/T203Y
と呼び、そのアミノ酸配列を配列番号３に示す。

【００１６】GFP-Y66W/T203Y遺伝子を作製する方法とし
ては、GFP遺伝子を鋳型とする以外はECGFP遺伝子及びEG
FP-Y66W/T203Y遺伝子と同様に、通常用いられている部
位特異的突然変異法を挙げることができる。ところで、
これらECGFP遺伝子、EGFP-Y66W/T203Y遺伝子及びGFP-Y6
6W/T203Y遺伝子を、以下の方法に従って作製することも
できる。

【００１７】まず、EGFP遺伝子を鋳型として、EGFP-Y66
W/T203Y遺伝子を作製する方法を説明する。本方法で
は、図１に示すように、「突然変異鎖の合成」を行う第
１の工程と、「DpnIによる消化」を行う第２の工程と、
「メガプライマーを用いた相補鎖の合成」を行う第３の
工程とを経て所定の遺伝子に突然変異を導入する。

【００１８】（１）「突然変異鎖の合成」 先ず、既知のEGFPをコードする遺伝子の塩基配列（配列
番号４）における所定の部位に変異を導入するための突
然変異導入用プライマーを準備する。具体的に、突然変
異導入用プライマーとしては、例えばEGFPアミノ酸配列
における６６番目のチロシン（Y）をトリプトファン
（W）に突然変異させるためのPri-1（5'-GCACTGCACGCCC
CAGGTCAGGGTGGT-3'：配列番号１０）及びEGFPアミノ酸
配列における２０３番目のトレオニン（T）をチロシン
（Y）に突然変異させるためのPri-2（5'-GGGCGGACTGGTA
GCTCAGGTAGTGG-3'：配列番号１１）を例示できる。

【００１９】これらPri-1及びPri-2の５'末端は、例え
ば、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化して
おく。なお、Pri-1及びPri-2の５'末端をリン酸化する
酵素としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼに限定され
ず、プライマーの５'末端をリン酸化するものであれば
いかなる酵素も使用することができる。

【００２０】また、EGFPをコードする遺伝子を有するプ
ラスミドを準備する。このプラスミドとしては、例え
ば、T7発現系を有するpRSET_B（インビトロジェン(Invit
rogen)社製）を使用することができる。このとき、従来
公知の手法を用いることによって、EGFPをコードする遺
伝子を有するpRSET_B（pRSET_B/EGFP）を構築することが
できる。なお、ここで使用されるpRSET_B/EGFPはメチル
化されている。

【００２１】突然変異鎖を合成する際には、これらPri-
1及びPri-2及びpRSET_B/EGFPを用いたPCR法を行う。この
PCR法において、pRSET_B/EGFPを鋳型としたPri-1及びPri
-2からの伸長反応は、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラー
ゼを用いる。この耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ
は、TaqＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼと比較して約１０倍の忠実性を有するものであり、
伸長鎖の３'末端に１塩基程度を余分に付加する活性が
ほとんどないため、pRSET_B/EGFPに対する相補鎖をほぼ
間違えることなく合成することとができる。耐熱性高忠
実度ＤＮＡポリメラーゼとしては、Pfu ＤＮＡポリメラ
ーゼ(ストラタジーン社製, La Jolla, CA)を使用するこ
とができる。なお、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ
としては、Pfu ＤＮＡポリメラーゼに限定されず、高忠
実度を有し、且つ伸長鎖の３'末端に１塩基程度を余分
に付加する活性がほとんどないものであればいかなるも
のを使用しても良い。

【００２２】このPCR法においては、耐熱性高忠実度Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応の後、Pri-1及びPri
-2の５'末端と伸長したＤＮＡ鎖の３'末端とを、耐熱性
ＤＮＡリガーゼにより連結する。耐熱性ＤＮＡリガーゼ
としては、特に限定されないが、例えば、Taq DNAリガ
ーゼ(New England BioLabs)を使用することができる。
本方法においては、Pri-1及びPri-2の５'末端をリン酸
化しているため、上述したような連結反応を行うことが
できる。

【００２３】PCR法におけるサーマルサイクラーは以下
の通りプログラムした。すなわち、先ず、65℃、５分の
プレインキュベーションを行ってTaq DNAリガーゼによ
る鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、95℃、２分の
最初の変性を行う。続いて、95℃、30秒のＤＮＡ変性、
55℃、30秒のアニーリング反応、及び65℃、７分の伸長
・連結反応を１サイクルとして18サイクル行う。最後
に、75℃、７分のポストインキュベーションを行う。こ
のプログラムにおいて、６５℃の伸長・連結反応を長く
設定することによって、特に、Taq DNAリガーゼによる
連結反応を完全に行うことができる。

【００２４】このようなプログラムによって、EGFP遺伝
子に、Pri-1及びPri-2が有する突然変異を導入してなる
EGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有する単鎖プラスミドＤＮＡ
のみを増幅することができる。具体的に、突然変異導入
用プライマーとしてPri-1及びPri-2を用いて合成された
EGFP-Y66W/T203Y遺伝子がコードするアミノ酸配列を配
列番号２に示す。

【００２５】なお、このPCR法の最終反応液中には、EGF
P-Y66W/T203Y遺伝子を有する１本鎖プラスミドＤＮＡ
と、鋳型となったpRSET_B/EGFPに由来する一本鎖ＤＮＡ
と、鋳型となったpRSET_B/EGFPと、EGFP-Y66W/T203Y遺伝
子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡ及び鋳型となったpR
SET_B/EGFPに由来する一本鎖ＤＮＡがアニールしてなる
２本鎖ＤＮＡとを含んでいる。

【００２６】（２）「DpnIによる消化」 ここでは、上述したように得られた反応液中に、少なく
とも、EGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有する１本鎖ＤＮＡ以
外のＤＮＡを消化する酵素を添加し、所定のＤＮＡのみ
を消化して除去する。例えば、使用可能な酵素として
は、所定の塩基配列（5'-G^m6ATC-3'）を認識して切断す
るDpnIを挙げることができる。

【００２７】反応溶液中にDpnIを添加した場合、反応溶
液中に残存するメチル化したpRSET_B/EGFPと、反応溶液
中に残存するEGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有する一本鎖プ
ラスミドＤＮＡ及び鋳型となったpRSET_B/EGFPに由来す
る一本鎖ＤＮＡがアニールしてなるヘミメチル化した２
本鎖ＤＮＡとが選択的に切断されることとなる。これに
より、反応溶液中には、EGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有す
る１本鎖ＤＮＡと、微量ながらも存在する鋳型となった
pRSET_B/EGFPに由来する一本鎖ＤＮＡのみが環状のＤＮ
Ａとして存在する。

【００２８】（３）「メガプライマーを用いた相補鎖の
合成」 ここでは、上記（２）で切断されたＤＮＡ断片をメガプ
ライマーとし、EGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有する一本鎖
プラスミドＤＮＡを鋳型として、２本鎖ＤＮＡを合成す
る。すなわち、この反応においては、DpnIにより切断さ
れたＤＮＡ断片を変性して１本鎖ＤＮＡ断片とし、EGFP
-Y66W/T203Y遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡに
該１本鎖ＤＮＡ断片をアニーリングさせ、該１本鎖ＤＮ
Ａ断片をメガプライマーとして伸長反応を行う。これに
より、EGFP-Y66W/T203Y遺伝子を有する一本鎖プラスミ
ドＤＮＡに相補的な塩基配列が合成され、所定の位置に
突然変異が導入されたEGFP遺伝子を有する２本鎖プラス
ミドＤＮＡを構築することができる。

【００２９】具体的に、95℃、30秒の熱変性によりメガ
プライマーを１本鎖とし、次いで、95℃、30秒の熱変
性、55℃、1分のアニーリング及び70℃、７分の伸長反
応を１サイクルとして２サイクル行うことによって、２
本鎖ＤＮＡを合成することができる。

【００３０】ここで、pRSET_B/EGFPをDpnI処理して得ら
れるＤＮＡ断片のなかには、変異を導入する前の野生型
の塩基を有するものが含まれる。変異を導入する箇所が
野生型の塩基配列であるＤＮＡ断片をメガプライマーと
して使用すると、合成した相補鎖に変異が導入されてい
ないこととなってしまう。したがって、この工程では、
補助的プライマーを大量に加え、当該ＤＮＡ断片のアニ
ーリングを防止した状態で２本鎖ＤＮＡを合成すること
が好ましい。

【００３１】補助的プライマーとしては、EGFP遺伝子の
クローニング部位近傍に存在する配列と相補的なT7プラ
イマーを使用することができる。T7プライマーを反応溶
液中に添加することによって、T7プライマーが優先的に
アニールすることとなり、変異を導入する箇所が野生型
の塩基配列であるＤＮＡ断片のアニールを防止すること
ができる。

【００３２】また、この反応では、上記（１）における
PCRから引き継がれたPfuＤＮＡポリメラーゼ、Taq DNA
リガーゼ、dNTPs及びNADも利用することができる。すな
わち、本方法では、上記（１）及び（２）の各反応に引
き続いて同一の反応溶液中で反応を行うことができるた
め、ＤＮＡ断片の精製等の煩雑な工程を経ることなく、
所望の２本鎖プラスミドＤＮＡを合成することができ
る。

【００３３】以上のように、上述した（１）、（２）及
び（３）の工程を経ることによって、EGFP遺伝子の所定
の部位に突然変異を導入してなるEGFP-Y66W/T203Y遺伝
子を有する２本鎖プラスミドを構築することができる。
そして、当該２本鎖プラスミドを有する反応液を用いて
所定の細胞を形質転換することによって、EGFP-Y66W/T2
03Y遺伝子を有するプラスミドを備える形質転換細胞を
得ることができる。

【００３４】ここで使用可能な細胞としては、大腸菌や
枯草菌等の細菌、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞及び植
物細胞等、いずれを使用しても良く、変異を導入する遺
伝子の由来や使用するプラスミド等に応じて適宜選択さ
れる。また、形質転換には、一般的に行われている手
法、例えば、コンピテントセル使用する方法、電気的パ
ルスを引加する手法等を適用することができる。

【００３５】突然変異を導入したEGFP-Y66W/T203Y遺伝
子は、得られた形質転換細胞を培養することにより発現
することができる。例えば、pRSET_B/EGFPを鋳型ＤＮＡ
として用いた場合には、大腸菌JM109(DE3)を形質転換
し、イソプロピルβ-D-チオガラクシド（IPTG）を培地
中に添加することによって、EGFP-Y66W/T203Yの発現を
誘導することができる。

【００３６】形質転換細胞中に発現した変異タンパク質
は、一般的に行われているタンパク質精製工程を経るこ
とによって精製することができる。変異タンパク質の精
製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィやゲ
ル濾過等の手法を使用することができる。

【００３７】一方、ECGFP遺伝子又はGFP-Y66W/T203Y遺
伝子を作製する際にも、上述した手法を適宜応用するこ
とができる。特に、GFP-Y66W/T203Y遺伝子を作製する際
には、配列番号５に示したGFP遺伝子の塩基配列に基づ
いて鋳型となるpRSET_B/GFPを構築し、GFP遺伝子の塩基
配列に基づいて突然変異導入用プライマーを設計する。
そして、pRSET_B/GFP及び突然変異導入用プライマー（Pr
i-1,Pri-2）を用いることによって、上述した方法に準
じて、GFP-Y66W/T203Y遺伝子を作製することができる。

【００３８】また、ECGFP遺伝子を作製する際には、配
列番号９に示したECFP遺伝子の塩基配列に基づいて、２
０３番目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に置換する
ような突然変異導入用プライマーを作製するとともに、
ECFP遺伝子を有するpRSET_B/ECFPを構築する。そして、
これらpRSET_B/ECFP及び突然変異導入用プライマーを用
いることによって、上述した方法に準じて、ECGFP遺伝
子を作製することができる。

【００３９】ところで、本発明に係るシアン−グリーン
蛍光タンパク質は、以下の方法によって作製することが
できる。すなわち、上記（１）「突然変異鎖の合成」に
おいて、縮重プライマーを用いて所定の塩基配列にラン
ダムな突然変異を導入し、ランダムな突然変異を有する
群の中から所望の変異を有する遺伝子を選択する手法で
ある。

【００４０】具体的には、鋳型ＤＮＡとしてpRSET_B/ECF
Pを構築し、ECFPアミノ酸配列における２０３番目のト
レオニン（T）をランダムに突然変異させるための縮重
プライマーとしてPri-3（5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-
3'：配列番号１２）を合成する。なお、Pri-3の塩基配
列（配列番号１２）における「N」は、A、G、C又はTを
意味し、例えば、等モル濃度のA、G、C及びTを有するヌ
クレオシドホスホロアミダイドを用いることによって合
成することができる。

【００４１】上記（１）「突然変異鎖の合成」において
Pri-3を用いることによって、ECFPにおける２０３番目
のトレオニンをランダムに変異させた様々な変異ECFP遺
伝子を構築する。そして、これら様々な変異ECFP遺伝子
から目的の変異が導入された遺伝子、すなわち、ECGFP
遺伝子を選択する際には、変異が導入された部位を含む
領域の塩基配列を決定することによって行うことができ
る。

【００４２】以上のように作製されたシアン−グリーン
蛍光タンパク質は、従来にない全く新しい蛍光特性を有
する。すなわち、シアン−グリーン蛍光タンパク質は、
EGFPのグリーン蛍光とECFPのシアン蛍光との中間に近い
蛍光特性を示し、これらEGFP及びECFPとは明らかに異な
る蛍光特性となっている。このため、細胞小器官（オル
ガネラ）におけるタンパク質局在を定量的にモニタリン
グする際に、シアン−グリーン蛍光タンパク質をEGFP及
びECFPとともに用いることによって、より他種類のタン
パク質をモニタリングすることができる。

【００４３】また、シアン−グリーン蛍光タンパク質
は、EGFP及びECFPとは異なり、広範囲のｐＨ条件下にお
いて非常に安定的に蛍光特性を示すことができる。特
に、酸性ｐＨにおいては、EGFP及びECFPの蛍光特性が劣
化するのに対して、シアン−グリーン蛍光タンパク質で
は優れた蛍光特性を維持することができる。したがっ
て、このシアン−グリーン蛍光タンパク質は、酸性細胞
小器官におけるタンパク質局在を定量的にモニタリング
する際に好ましく用いられる。

【００４４】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定さ
れるものではない。 ［実施例１］ １）突然変異導入用プライマー及び鋳型プラスミドＤＮ
Ａの準備 本実施例は、EGFPアミノ酸配列における６６番目のチロ
シン（Y）をトリプトファン（W）に、２０３番目のトレ
オニン（T）をチロシン（Y）に突然変異させてなるEGFP
-Y66W/T203Yである。突然変異導入用プライマーとし
て、６６番目のチロシン（Y）をトリプトファン（W）に
突然変異させるためのPri-1（5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCA
GGGTGGT-3'：配列番号１０）及び２０３番目のトレオニ
ン（T）をチロシン（Y）に突然変異させるためのPri-2
（5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3'：配列番号１１）
を設計して合成した。これらPri-1及びPri-2の５'末端
を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン
酸化した。鋳型プラスミドＤＮＡとして、EGFP遺伝子を
プラスミドベクターpRSET_B（インビトロジェン社製(Inv
itrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミドＤ
ＮＡを「pRSET_B/EGFP」とする。

【００４５】２）突然変異鎖の合成 以下の組成の反応溶液50μlを準備しPCRを行った。 pRSET_B/EGFP 50ng Pri-1 14pmol Pri-2 14pmol dNTPs 10nmol Pfu DNAポリメラーゼ 2.5U Taq DNAリガーゼ 20U

【００４６】なお、Pfu DNAポリメラーゼは、ストラタ
ジーン社製であり、0.5×Pfuポリメラーゼ反応バッファ
ー中に溶解したものである。また、Taq DNAリガーゼ
は、NewEngland BioLabs社製であり、50nmolのNADを含
む0.5×Taq DNAリガーゼバッファー中に溶解したもので
ある。

【００４７】サーマルサイクラーは以下の通りプログラ
ムした。すなわち、先ず、65℃、５分のプレインキュベ
ーションを行ってTaq DNAリガーゼによる鋳型ＤＮＡの
ニックを修復し、その後、95℃、２分の最初の変性を行
った。続いて、95℃、30秒のＤＮＡ変性、55℃、30秒の
アニーリング反応及び65℃、７分の伸長・連結反応を１
サイクルとして18サイクル行った。最後に、75℃、７分
のポストインキュベーションを行った。

【００４８】３）DpnIによる消化 以下の条件に従ってDpnIを用いて、メチル化又はヘミメ
チル化したプラスミドＤＮＡを選択的に消化した。すな
わち、上記PCR後の反応溶液50μlに、1μl(20U)のDpnI
(New England BioLabs社製)を加え、37℃で１時間イン
キュベートした。

【００４９】DpnIは、(5'-G^m6ATC-3')を認識して２本鎖
ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。DpnIによ
れば、3672bpのプラスミドpRSET_B/EGFPを完全切断する
と、6、8、11、12、17、18、24、31、36、38、46、47、
75、78、105、133、148、160、258、341、506、740、78
9塩基対の23のＤＮＡ断片を生じる。

【００５０】４）メガプライマーを用いた相補鎖の合成 DpnIによる消化後の反応溶液51μlを用い、２）で合成
した突然変異鎖の相補鎖を以下の条件により合成した。
すなわち、該反応溶液51μlについて、95℃、30秒の変
性、次いで95℃で30秒、55℃で1分、70℃で７分を２サ
イクル行った。このとき、３）で得られたＤＮＡ断片２
３のうちいくつかがメガプライマーとして作用する。

【００５１】５）形質転換及び変異EGFPの発現 ４）の反応後のサンプルの２μlを用いて、Ca²⁺共沈法
により大腸菌(E.coli)コンピテントセル(JM109(DE3))を
形質転換した。そして、形質転換した大腸菌細胞を、10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB固体培地で37℃にて培
養し、生育した単一コロニーをピックアップして100μg
/mlのアンピシリンを含むLB培養液２ml中へ移し、37℃
で一晩培養して増殖させた。

【００５２】変異を導入したEGFPは、T7発現系(pRSET_B/
JM109(DE3))を用いて発現させた。すなわち、培養液の1
00倍希釈物を作製し、該培養物を濃度がおよそOD₆₀₀=0.
5に達するまで室温で増殖させ、次いで最終濃度0.2mMの
イソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)によって変
異EGFPの発現を誘導し、その後、更に18時間培養した。
得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた
上清液から、ニッケルキレートカラム(Qiagen社製)を用
いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。さら
に、この溶出液(100mMイミダゾール、50mM Tris/Cl pH
7.5、300mM NaCl)中のタンパク質サンプルをCentricon
10(Amicon)によって濃縮し、ゲル濾過によりさらに精製
した。

【００５３】６）結果 １．得られたタンパク質が所望の突然変異を２カ所同時
に導入したものであることを、該タンパク質の励起波長
及び発光波長を測定するとともに既存のタンパク質（野
生型EGFP等）の励起波長及び発光波長と比較することに
より確認した。

【００５４】得られたタンパク質の励起波長を測定し、
規格化したものを図２（Ａ）中曲線Ａで示す。また、得
られたタンパク質の発光波長を測定し、正規化したもの
を図２（Ｂ）中曲線Ａで示す。なお、図２（Ａ）及び
（Ｂ）には、比較のために、野生型EGFP、野生型EGFPの
６６番目のチロシンをトリプトファンに変異させてなる
EGFP-Y66W及び野生型EGFPの２０３番目のトレオニンを
チロシンに変異させてなるEGFP-T203Yについて励起波長
及び発光波長を併せて示す。図２（Ａ）及び（Ｂ）にお
いて、野生型EGFPは曲線Ｂで示し、EGFP-Y66Wは曲線Ｃ
で示し、EGFP-T203Yは曲線Ｄで示す。

【００５５】図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、上述
した方法で変異を導入したタンパク質は、励起波長のピ
ークが458nmであり、発光波長のピークが504nmであるこ
とがわかる。これに対して、野生型EGFPは、励起波長の
ピークが488nmであり、発光波長のピークが509nmであ
る。EGFP-Y66Wは、６６番目のチロシンをトリプトファ
ンに置換することによってインドールを有する新たな発
色団を生じるため、励起波長のピークが450nmであり、
発光波長のピークが494nmである。EGFP-T203Yは、２０
３番目のトレオニンをチロシンに置換することによって
６６番目のチロシンとの間でπ−π相互作用を生じるた
め、励起波長のピークが514nmであり、発光波長のピー
クが524nmである。

【００５６】得られたタンパク質は、６６番目のチロシ
ンをトリプトファンに変異させるとともに２０３番目の
トレオニンをチロシンに変異させてなる（EGFP-Y66W/T2
03Y）ため、上述したインドールを有する発色団とπ−
π相互作用とを生じるため、シアン色−グリーン蛍光を
示している。

【００５７】２．一方、アンピシリン添加LB固体培地上
に生育したコロニーの蛍光を測定することによって、突
然変異導入率を算出した。当該コロニーのスペクトル特
性を、Bairdらの報告（Baird,G.S., Zacharias,D.A. an
d Tsien,R.Y. (1999) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96,
11241-11246）に基づいて改変した蛍光イメージ解析シ
ステムを用いて測定した。蛍光イメージ解析システムで
は、LBプレート（直径9cm）上に生育したコロニーを、1
50Wのキセノンランプ光によって励起する。励起波長は
回折格子モノクロメーター(CT-10, JASCO社製)によって
選択することができる。具体的には、回折格子モノクロ
メーターによる励起波長を４５０ｎｍ及び４９０ｎｍと
する（図２（Ａ）中、直線ａ及びｂで示す。）。

【００５８】また、このシステムでは、LBプレート全体
を均一に照らすために、１対の光ファイバー（１m）を
用いた。コロニーからの蛍光イメージは、干渉バンド透
過フィルター（Omega社製, 535DF25 直径１インチ）を
介して、レンズ(Nikon社製,AF NIKKOR)で集光された。
そのイメージはSenSys冷却CCDカメラ(Photometrics社
製)によって取り込まれ、MetaMorph 3.0ソフトウェア(U
niversal Imaging社製,West Chester, PA)を用いて解析
された。具体的に、比率イメージとしては、490nmイメ
ージを450nmイメージで除することによって得られた。
図２（Ａ）に示した励起スペクトルから予測されるよう
に、該比率値は、EGFP-T203Y > 野生型EGFP > EGFP-Y66
W/T203Y > EGFP-Y66Wであった。

【００５９】このとき、干渉バンド透過フィルターを用
いて比較する場合、回折格子モノクロメーターを使用す
ると、励起波長を非常に狭い幅で変化させ、選択するこ
とができた。したがって、このシステムでは当該モノク
ロメーターを使用した励起によって、近接した励起スペ
クトルを示す野生型EGFP、EGFP-T203Y、EGFP-Y66W及びE
GFP-Y66W/T203Yをそれぞれ確実に区別することができ
た。

【００６０】その結果、アンピシリン添加LBプレート上
に生育した42個のコロニーのうち、32個はシアン-グリ
ーン蛍光を示し(EGFP-Y66W/T203Y)、２部位同時の突然
変異誘発率は76％と算出された。残りのコロニーのう
ち、４個がイエロー蛍光を示し（EGFP-T203Y）、４個が
シアン蛍光を示し（EGFP-Y66W）２個がグリーン蛍光を
示した（野生型EGFP）。なお、非蛍光のコロニーは存在
しなかった。

【００６１】さらに、上述した実験を４回繰り返し、シ
アン-グリーン蛍光を示すコロニーの割合、すなわち、
２部位同時の突然変異誘発率を算出した。その結果、
（シアン-グリーン蛍光を示すコロニー数）／（全コロ
ニー数）がそれぞれ、21/30、42/50、50/72及び32/40で
あり、２部位同時の突然変異誘発効率が75.8％±4.2％
(n=5)であった。さらにまた、シアン-グリーン蛍光を示
すコロニーから精製したプラスミドのDNA配列決定によ
り、Pri-1及びPri-2以外の部位で突然変異は導入されて
いないことが明らかになった。

【００６２】さらにまた、４）でメガプライマーとして
作用する２３個のＤＮＡ断片のうち506塩基対及び148塩
基対のセンス鎖には、それぞれ６６番目のアミノ酸残基
及び２０３番目のアミノ酸残基をコードする領域を含ん
でいる。このため、これら506塩基対及び148塩基対のＤ
ＮＡ断片は、メガプライマーとしてはたらかないように
することが好ましい。本例において、クローニング部位
の外側にアニールするコモンセンスプライマー(T7プラ
イマー14pmol)をDpnI消化後に加えると、これら506塩基
対及び148塩基対のＤＮＡ断片のアニーリングを防止す
ることができるため、突然変異誘発効率を90％を超える
までに増大させることができる。具体的には、200個の
コロニーのうち、196個がシアン-グリーン蛍光を示し
た。

【００６３】［実施例２］本実施例は、縮重プライマー
を用いてECFPアミノ酸配列における２０３番目のトレオ
ニン（T）をランダムに突然変異させる方法を用いて作
製してなるECGFPである。突然変異導入用プライマーと
して、２０３番目のトレオニン（T）をランダムに突然
変異させるための縮重プライマーPri-3（5'-GCGGACTGNN
NGCTCAGGTAG-3'：配列番号１２）を合成する。なお、Pr
i-3の塩基配列（配列番号１２）における「N」は、A、
G、C又はTを意味する。そして、これらPri-3の５'末端
を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン
酸化した。

【００６４】鋳型プラスミドＤＮＡとして、ECFP遺伝子
をプラスミドベクターpRSET_B（インビトロジェン社製(I
nvitrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミド
ＤＮＡを「pRSET_B/ECFP」とする。なお、このECFP遺伝
子は、実施例１で使用したEGFP遺伝子と比較して、タン
パク質の折り畳みおよび成熟を助けるための更なる置換
（N146I、M153T、V163A及びN164H）を有し、且つ、６６
番目のチロシンがトリプトファンに置換（Y66W）されて
いる。実施例２では、縮重プライマーとしてPri-3及び
鋳型ＤＮＡとしてpRSET_B/ECFPを使用した以外は実施例
１と同様に実験を行った。

【００６５】１）結果 本例では、実施例１と同様に形質転換を行って形質転換
大腸菌細胞をアンピシリン添加LBプレート上に生育させ
た。該LBプレート上に生育した62個のクローンをランダ
ムにピックアップし、配列決定した。その結果、28個の
クローンは、Thr203をK、N、H、R、Lで置換した突然変
異が導入されており、非蛍光タンパク質を産生した。一
方、３４個のクローンは、蛍光タンパク質を産生し、そ
のうち23個のクローンは、２０３番目のトレオニンを
P、V、I、W、F、S、C、Yで置換した突然変異体を含んで
いた。

【００６６】これら３４個のクローンから選択されたEC
GFPにおいては、顕著なスペクトル変化を観察すること
ができた。この突然変異は、その励起および発光のスペ
クトル全体がECFPとEGFPのものの中間であるため、シア
ンとグリーンとの中間の蛍光特性を示した。

【００６７】ECGFPの蛍光励起スペクトル及び発光スペ
クトルを、ECFP及びEGFPの蛍光励起スペクトル及び発光
スペクトルを併せて図３に示す。図３において、ECGFP
の蛍光励起スペクトルを曲線Ａ（波線）で示し、ECGFP
の発光スペクトルを曲線Ｂ（実線）で示す。また、図３
において、EGFPの蛍光励起スペクトルを曲線Ｃ（波線）
で示し、EGFPの発光スペクトルを曲線Ｄ（実線）で示
し、ECFPの蛍光励起スペクトルを曲線Ｅ（波線）で示
し、ECFPの発光スペクトルを曲線Ｆ（実線）で示す。

【００６８】この図３から判るように、ECGFPの励起ピ
ーク（455nm）及び発光ピーク（506nm）はECFPにおける
長波長成分の励起ピーク（452nm）及び発光ピーク（505
nm）とかなり近接していた。変異によって、π-π相互
作用はより長波長が優位を占める量子状態を促進するこ
とが示唆される。また、図３に示すように、ECGFP及びE
GFPは同程度の発光ピークを有する（ECGFPは506nm、EGF
Pは511nm）が、ECGFPではより大きなストークスシフト
（励起ピーク及び発光ピークの間隔）を示している。EC
GFPにおいては、ECFP及びECGFPと比較してストークスシ
フトが大きいため、落射蛍光観察において、蛍光シグナ
ルと励起光とを容易に分離することができる。

【００６９】一方、ECGFP、EGFP及びECFPについて、ｐ
Ｈ抵抗性を検討した。ここでは、先ず、50mM酢酸塩(pH
3.8〜5.6)、Na₂HPO₄-Na₂H₂PO₄(pH5.5〜7.0)、2-(N-モル
ホリノ)エタンスルホネート(pH5.5〜6.0)、3-(N-モルホ
リノ)プロパンスルホネート(pH6.5〜7.0)、ヘペス(pH7.
0〜7.9)、グリシン(pH9.0〜10.0)及びリン酸塩(pH11)の
いずれかを用いて、pH値3.8〜11の範囲となるような一
連のpHバッファーを調製した。ｐＨ抵抗性を検討する溶
液は、先ず、タンパク質を弱緩衝溶液中に濃縮し、当該
弱緩衝溶液を、所定のｐＨバッファー溶液と等量混合し
て調製した。

【００７０】得られた溶液を用いて吸収波長スペクトル
及び発光波長スペクトルを測定した結果を図４及び図５
に示す。なお、図４において、（Ａ）はEGFPの吸収スペ
クトルを示し、（Ｂ）はEGFPの発光スペクトルを示し、
（Ｃ）はECFPの吸収スペクトルを示し、（Ｄ）はECFPの
発光スペクトルを示し、（Ｅ）はECGFPの吸収スペクト
ルを示し、（Ｆ）はECGFPの発光スペクトルを示す。ま
た、図５において、（Ａ）は図４（Ａ）、（Ｃ）及び
（Ｅ）のスペクトルをプロットし直したものであり、
（Ｂ）は図４（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）のスペクトルを
プロットし直したものである。

【００７１】また、EGFP、ECFP及びECGFPに関して、量
子収率(Φ)及びモル吸光係数(ε)を測定した。量子収率
(Φ)及びモル吸光係数(ε)の値は、50mMのヘペス(pH7.
5)中で測定した。ECGFPの量子収率(Φ)は、標準（フル
オレセイン(Φ=0.91)およびECFP(Φ=0.40)）との比較に
より決定した。モル吸光係数を算出するためのタンパク
質濃度の測定には、標準物質としてBSA(ウシ血清アルブ
ミン)を用いたBradfordアッセイキット(Bio Rad)を使用
した。結果を表１に示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】なお、この表１において、λabsはナノメ
ーター単位での吸光度スペクトルのピークを表してい
る。（ε）は10³M^-1cm^-1単位でのモル吸光係数である。
λemはナノメーター単位での発光スペクトルのピークを
表している。（Φ）は量子収率である。また、Kaは酸解
離定数であり、pKa=-log₁₀Kaで求められる。pKaは図５
（Ｂ）から算出した。絶対輝度はε及びΦの積で算出さ
れ、ECGFPは中性pH付近で、EGFP及びECFPよりも光が弱
いことが表１より判る。なお、GFP突然変異体のほとん
どすべては酸性pHによりいくらか光が弱まることが知ら
れている。

【００７４】一方、図４（Ａ）及び（Ｂ）から判るよう
に、EGFPは、488nmにおける吸光度ピークが酸性化に依
存した低下を示すとともに398nmにおける吸光度ピーク
は増大した。EGFPにおいては、発光（511nmピーク）お
よび励起（488nmピーク）スペクトルはpHが低下するに
つれて低下したが、蛍光励起スペクトルは398nmでの補
償的増加を示さなかった。このことから、398nmでの吸
光種は非蛍光性であることがわかる。また、EGFPは、図
４（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、その吸光スペクトル
及び発光スペクトルの両方についてpKa6.0を示し、図５
（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、その吸光度はpH感受性
であるが量子収率はpH感受性でない。

【００７５】また、ECFPは、図４（Ｃ）及び（Ｄ）に示
すように、EGFPと比較してｐＨの影響が小である。pHの
低下した条件下においても、その吸光度スペクトル(図
４Ｃ）にほとんど影響を与えず、発光スペクトルのみが
弱めたられた。このことは、ECFPにおいては、図５
（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、量子収率が酸性により
低下させられる。

【００７６】一方、ECGFPに関しては、図４（Ｅ）及び
（Ｆ）に示すように、広いpH範囲(pH4〜12)において安
定であった。言い換えると、このECGFPは、図５（Ａ）
及び（Ｂ）に示すように、いかなるｐＨ条件下において
も、変わらない蛍光特性を有していることが判った。EC
GFPの蛍光を使用することによって、例えば、分泌およ
びエンドサイトーシスオルガネラといった、酸性オルガ
ネラの細胞内膜挙動の解析に際して、画像化した分子種
を正確に報告することが可能となる。

【００７７】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明に係
るシアン−グリーン蛍光タンパク質は、従来にない全く
新しい蛍光特性を示し、且つ、広範囲なｐＨ条件下にお
いても蛍光特性を安定して維持することができる。

【００７８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A gene coding cyan-green fluorescent protein <130> RJH12-054N ＜１４０＞ ＜１４１＞ ＜１６０＞ １２ ＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｖｅｒ． ２．０ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ２３９ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＜４００＞ １ Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 3 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Aequorea victoria <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 4 atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Aequorea victoria <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <400> 5 atg agt aaa gga gaa gaa ctt ttc act gga gtt gtc cca att ctt gtt 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 gaa tta gat ggt gat gtt aat ggg cac aaa ttt tct gtc agt gga gag 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 ggt gaa ggt gat gca aca tac gga aaa ctt acc ctt aaa ttt att tgc 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 act act gga aaa cta cct gtt cca tgg cca aca ctt gtc act act ttc 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 tct tat ggt gtt caa tgc ttt tca aga tac cca gat cat atg aaa cag 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 cat gac ttt ttc aag agt gcc atg ccc gaa ggt tat gta cag gaa aga 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 act ata ttt ttc aaa gat gac ggg aac tac aag aca cgt gct gaa gtc 336 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 aag ttt gaa ggt gat acc ctt gtt aat aga atc gag tta aaa ggt att 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 gat ttt aaa gaa gat gga aac att ctt gga cac aaa ttg gaa tac aac 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 tat aac tca cac aat gta tac atc atg gca gac aaa caa aag aat gga 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 atc aaa gtt aac ttc aaa att aga cac aac att gaa gat gga agc gtt 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 caa cta gca gac cat tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtc ctt tta cca gac aac cat tac ctg tcc aca caa tct gcc ctt tcg 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aaa gat ccc aac gaa aag aga gac cac atg gtc ctt ctt gag ttt gta 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 aca gct gct ggg att aca cat ggc atg gat gaa cta tac aaa taa 717 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 6 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 238 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 7 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 8 <211> 239 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 8 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 9 <211> 720 <212> DNA <213> Aequorea victoria <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 9 atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac agg ttc agc gtg tcc ggc 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ctg acc tgg ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac atc agc cac aac gtc tat atc acc gcc gac aag cag aag aac 480 Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gcc cac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528 Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 gcactgcacg ccccaggtca gggtggt 27 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 11 gggcggactg gtagctcagg tagtgg 26 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Degenerate <222>(9),(10) and (11) <223> "n" is a, t, c or g <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 12 gcggactgnn ngctcaggta g 21

【００７９】

【配列表フリーテキスト】配列番号１０〜配列番号１２
は、合成プライマーである。配列番号１２，第９塩基、
第１０塩基及び第１１塩基のｎは、ａ、ｔ、ｃ又はｇで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る突然変異導入方法のプロトコール
を説明するための概略図である。

【図２】EGFP、ECFP、EYFP及びEGFP-Y66W/T203Yの蛍光
励起スペクトル(A)及び発光(B)スペクトルを示す特性図
である。

【図３】ECFP、ECGFP、EGFPの励起スペクトル（波線）
及び発光スペクトル（実線）を示す特性図である。

【図４】EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光スペクト
ル及び発光スペクトルのｐＨ依存性を示す特性図であ
り、（Ａ）がEGFPの吸光スペクトルであり、（Ｂ）がEG
FPの発光スペクトルであり、（Ｃ）がECFPの吸光スペク
トルであり、（Ｄ）がECFPの発光スペクトルであり、
（Ｅ）がECGFPの吸光スペクトルであり、（Ｆ）がECGFP
の発光スペクトルである。

【図５】EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光ピーク及
び発光ピークのｐＨ依存性を示す特性図であり、（Ａ）
が吸収ピークとｐＨとの関係を示し、（Ｂ）が蛍光ピー
クとｐＨとの関係を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA06 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 GA25 4B064 AG01 CA19 CC24 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 CA50 EA50 FA72 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードする遺伝子。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における少な
   くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
   するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
   を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードする遺伝子。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質。 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における少な
   くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
   するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
   を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードする遺伝子。 （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質。 （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における少な
   くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、シアン−グリーン蛍光特性を有
   するとともに、酸性領域で安定した蛍光特性を示す機能
   を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３いずれか一項記載の遺伝
   子によりコードされるシアン−グリーン蛍光タンパク
   質。
5. 【請求項５】 請求項１乃至３いずれか一項記載の遺伝
   子を有する組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターを有する
   形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物からタンパク質を採取することを特徴とす
   るシアン−グリーン蛍光タンパク質の製造方法。