JP2002369690A - 蛍光蛋白質 - Google Patents
蛍光蛋白質Info
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 良好な成熟効率を有し、pHおよびCl-の両方
に対する感受性を低減させたGFP又はYEP変異体を作製す
ること。 【解決手段】 緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質又はそ
れらの変異体のアミノ酸配列において４６番目のフェニ
ルアラニン残基がロイシン残基に置換していることを特
徴とする、蛍光蛋白質。
に対する感受性を低減させたGFP又はYEP変異体を作製す
ること。 【解決手段】 緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質又はそ
れらの変異体のアミノ酸配列において４６番目のフェニ
ルアラニン残基がロイシン残基に置換していることを特
徴とする、蛍光蛋白質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、改善された特性を
有する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発
明は、緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質又はそれらの変
異体のアミノ酸配列において４６番目にロイシン残基を
有することを特徴とする蛍光蛋白質、並びにその利用に
関する。
有する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発
明は、緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質又はそれらの変
異体のアミノ酸配列において４６番目にロイシン残基を
有することを特徴とする蛍光蛋白質、並びにその利用に
関する。
【０００２】
【従来の技術】クラゲのエクオレア・ビクトリア（Aequ
orea victoria）に由来する緑色蛍光蛋白質（GFP）は、
生物系のための多数の用途を提供してきた（Tsien, R.
Y. (1998). Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544）。最近
数年において、ランダム突然変異誘発法および半合理的
(semi-rational)突然変異誘発法の両方によって、新た
な色、改善された折りたたみ特性、より高い輝度、そし
て改変されたpH感受性を有するGFP変異体が作製されて
いる。遺伝子操作によって、何百もの蛋白質をGFPに融
合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行
うことに成功している。GFPまたはGFP融合蛋白質が一定
のレベルにおいて異種的に発現される場合には、蛍光強
度は以下の条件に依存する： １）GFP蛍光団の絶対的輝度（モル吸光係数（ε）と蛍
光量子収率（Φ）との積により限定される） ２）新規に合成されたGFPポリペプチドの成熟効率 ３）環境因子によるGFP蛍光団の消光率。
orea victoria）に由来する緑色蛍光蛋白質（GFP）は、
生物系のための多数の用途を提供してきた（Tsien, R.
Y. (1998). Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544）。最近
数年において、ランダム突然変異誘発法および半合理的
(semi-rational)突然変異誘発法の両方によって、新た
な色、改善された折りたたみ特性、より高い輝度、そし
て改変されたpH感受性を有するGFP変異体が作製されて
いる。遺伝子操作によって、何百もの蛋白質をGFPに融
合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行
うことに成功している。GFPまたはGFP融合蛋白質が一定
のレベルにおいて異種的に発現される場合には、蛍光強
度は以下の条件に依存する： １）GFP蛍光団の絶対的輝度（モル吸光係数（ε）と蛍
光量子収率（Φ）との積により限定される） ２）新規に合成されたGFPポリペプチドの成熟効率 ３）環境因子によるGFP蛍光団の消光率。
【０００３】黄色蛍光蛋白質（YFP）は、最もよく使用
されるGFP変異体の1種であり、全てのクラゲ（Aequore
a）GFP変異体の中で最長波長の発光を示す。大部分のYF
PのεおよびΦは、それぞれ60,000〜100,000M-1cm-1お
よび0.6〜0.8である（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev.
Biochem. 67, 509-544）。これらの値は、一般的な蛍
光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値にほ
ぼ匹敵する。従ってYFPの絶対的輝度の改善は、限界に
達しているように思われる。
されるGFP変異体の1種であり、全てのクラゲ（Aequore
a）GFP変異体の中で最長波長の発光を示す。大部分のYF
PのεおよびΦは、それぞれ60,000〜100,000M-1cm-1お
よび0.6〜0.8である（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev.
Biochem. 67, 509-544）。これらの値は、一般的な蛍
光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値にほ
ぼ匹敵する。従ってYFPの絶対的輝度の改善は、限界に
達しているように思われる。
【０００４】新規に合成されたGFPポリペプチドは、蛍
光の放出前に適切に成熟する必要がある。この成熟に
は、蛋白質のほぼ天然のコンホメーションへの折りたた
み、および内部トリペプチドの環化とそれに続く酸化が
含まれる。GFPの成熟を改善する主要な突然変異が幾つ
か同定されている（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev. B
iochem. 67, 509-544）。例えば、F64L/M153T/V163A/S1
75Gは、多くの改良GFP変異体に導入されている共通の変
異である。M153TおよびS175Gは、βバレルの表面上に位
置し、表面疎水性を低減し、蛋白質の溶解性を高めるこ
とによって折りたたみ効率と安定性を高めていることが
知られている。しかしながら、酸化過程がGFP成熟化の
全過程における律速段階であるため、37℃で最終的な酸
化反応を促進する変異が非常に望ましいにも拘わらず、
そのような変異は明確には同定されていない。折りたた
み効率は改善されているにも関わらず、成熟が遅いこと
は、GFPの可視化の応用における重大な問題の一つであ
り、これは、37℃で発現する場合や特定のオルガネラに
ターゲティングする場合には、より大きな問題となる。
従って、より良好な成熟効率を有するGFP変異体の取得
が必要である。
光の放出前に適切に成熟する必要がある。この成熟に
は、蛋白質のほぼ天然のコンホメーションへの折りたた
み、および内部トリペプチドの環化とそれに続く酸化が
含まれる。GFPの成熟を改善する主要な突然変異が幾つ
か同定されている（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev. B
iochem. 67, 509-544）。例えば、F64L/M153T/V163A/S1
75Gは、多くの改良GFP変異体に導入されている共通の変
異である。M153TおよびS175Gは、βバレルの表面上に位
置し、表面疎水性を低減し、蛋白質の溶解性を高めるこ
とによって折りたたみ効率と安定性を高めていることが
知られている。しかしながら、酸化過程がGFP成熟化の
全過程における律速段階であるため、37℃で最終的な酸
化反応を促進する変異が非常に望ましいにも拘わらず、
そのような変異は明確には同定されていない。折りたた
み効率は改善されているにも関わらず、成熟が遅いこと
は、GFPの可視化の応用における重大な問題の一つであ
り、これは、37℃で発現する場合や特定のオルガネラに
ターゲティングする場合には、より大きな問題となる。
従って、より良好な成熟効率を有するGFP変異体の取得
が必要である。
【０００５】クラゲ（Aequorea）GFP変異体の中で、YFP
は、相対的に酸感受性であり、ハロゲン化物イオン（塩
素イオン(Cl-)を含む）により独特に消光される（Jayar
aman, S.,他 (2000) J. Biol. Chem. 275, 6047-6050；
及びWachter, 他(2000) J. Mol. Biol. 301, 157-17
1）。プロトン（H+）およびCl-はYFPの発色団の電荷状
態に対し協働的に影響を及ぼし、それによりその蛍光を
抑制する。これらのイオンの濃度は細胞内オルガネラの
中で様々であり、分泌性オルガネラにおいてH+は顕著に
蓄積する。また、それらの濃度は刺激により劇的に変化
する（Kuner, T. 他(2000) Neuron 27, 447-459）。例
えば、海馬ニューロンのグルタミン酸および電気的刺激
によって細胞内pHが約0.4だけ低減する。そして受容体
が媒介するCl-流入又は流出が嗅覚器官およびGABA作動
性ニューロンにおいて起こる。これらの状況においてYF
Pを十分かつ安定に発光させるために、pHおよびCl-の両
方に対する感受性を低減する突然変異が望ましい。
は、相対的に酸感受性であり、ハロゲン化物イオン（塩
素イオン(Cl-)を含む）により独特に消光される（Jayar
aman, S.,他 (2000) J. Biol. Chem. 275, 6047-6050；
及びWachter, 他(2000) J. Mol. Biol. 301, 157-17
1）。プロトン（H+）およびCl-はYFPの発色団の電荷状
態に対し協働的に影響を及ぼし、それによりその蛍光を
抑制する。これらのイオンの濃度は細胞内オルガネラの
中で様々であり、分泌性オルガネラにおいてH+は顕著に
蓄積する。また、それらの濃度は刺激により劇的に変化
する（Kuner, T. 他(2000) Neuron 27, 447-459）。例
えば、海馬ニューロンのグルタミン酸および電気的刺激
によって細胞内pHが約0.4だけ低減する。そして受容体
が媒介するCl-流入又は流出が嗅覚器官およびGABA作動
性ニューロンにおいて起こる。これらの状況においてYF
Pを十分かつ安定に発光させるために、pHおよびCl-の両
方に対する感受性を低減する突然変異が望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、良好な成熟
効率を有するGFP又はYEP変異体を作製することを解決す
べき課題とした。本発明はまた、pHおよびCl-の両方に
対する感受性を低減させたGFP又はYEP変異体を作製する
ことを解決すべき課題とした。
効率を有するGFP又はYEP変異体を作製することを解決す
べき課題とした。本発明はまた、pHおよびCl-の両方に
対する感受性を低減させたGFP又はYEP変異体を作製する
ことを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明者らは鋭意検討し、YFPの新規な変異体を構築
し、得られた変異体を用いて、エキソサイトーシス事象
の効率的なモニタリングに関しては分化したPC12細胞の
分泌小胞への該変異体のターゲティングにより、そして
FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）シグナルの直接検出に
関してはアクセプターとして該変異体を用いることによ
り、この変異体の利点を実証した。本発明の蛍光蛋白質
は、改善された成熟速度および成熟率を有し、さらにH+
およびCl -両方に対する耐性を有するため、幅広い用途
に利用可能であり、従来は不可能であった蛍光標識を可
能とするものでもある。
に本発明者らは鋭意検討し、YFPの新規な変異体を構築
し、得られた変異体を用いて、エキソサイトーシス事象
の効率的なモニタリングに関しては分化したPC12細胞の
分泌小胞への該変異体のターゲティングにより、そして
FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）シグナルの直接検出に
関してはアクセプターとして該変異体を用いることによ
り、この変異体の利点を実証した。本発明の蛍光蛋白質
は、改善された成熟速度および成熟率を有し、さらにH+
およびCl -両方に対する耐性を有するため、幅広い用途
に利用可能であり、従来は不可能であった蛍光標識を可
能とするものでもある。
【０００８】即ち、本発明によれば、緑色蛍光蛋白質、
黄色蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列にお
いて４６番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基に
置換していることを特徴とする、蛍光蛋白質が提供され
る。
黄色蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列にお
いて４６番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基に
置換していることを特徴とする、蛍光蛋白質が提供され
る。
【０００９】好ましくは、さらに緑色蛍光蛋白質、黄色
蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列において
６４番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基に、１
５３番目のメチオニン残基がトレオニン残基に、１６３
番目のバリン残基がアラニン残基に、そして１７５番目
のセリン残基がグリシン残基に置換している。
蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列において
６４番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基に、１
５３番目のメチオニン残基がトレオニン残基に、１６３
番目のバリン残基がアラニン残基に、そして１７５番目
のセリン残基がグリシン残基に置換している。
【００１０】本発明の蛍光蛋白質の一例としては、以下
の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられ
る。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又
は、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に
おいて１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付
加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の蛍光特性を有す
るアミノ酸配列：
の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられ
る。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又
は、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に
おいて１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付
加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の蛍光特性を有す
るアミノ酸配列：
【００１１】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。本発
明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ
を有する組み換えベクターが提供される。本発明のさら
に別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み
換えベクターを有する形質転換体が提供される。
明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。本発
明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ
を有する組み換えベクターが提供される。本発明のさら
に別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み
換えベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光
蛋白質が提供される。他の蛋白質は、好ましくは細胞内
に局在する蛋白質であり、例えば、細胞内小器官に特異
的な蛋白質である。本発明のさらに別の側面によれば、
上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させること
を特徴とする、細胞内における蛋白質の局在又は動態を
分析する方法が提供される。
た本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光
蛋白質が提供される。他の蛋白質は、好ましくは細胞内
に局在する蛋白質であり、例えば、細胞内小器官に特異
的な蛋白質である。本発明のさらに別の側面によれば、
上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させること
を特徴とする、細胞内における蛋白質の局在又は動態を
分析する方法が提供される。
【００１３】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明の蛍光蛋白質をアクセプター蛋白質又はドナー
蛋白質として用いてFRET（蛍光共鳴エネルギー転移）法
を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提
供される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の
蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体又
は融合蛋白質を含む、細胞内成分の局在の分析及び／又
は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。
た本発明の蛍光蛋白質をアクセプター蛋白質又はドナー
蛋白質として用いてFRET（蛍光共鳴エネルギー転移）法
を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提
供される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の
蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体又
は融合蛋白質を含む、細胞内成分の局在の分析及び／又
は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。（１）本発明の蛍光蛋白質 本発明の蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白
質又はそれらの変異体のアミノ酸配列において４６番目
のフェニルアラニン残基がロイシン残基に置換している
ことを特徴とするものである。
て詳細に説明する。（１）本発明の蛍光蛋白質 本発明の蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白
質又はそれらの変異体のアミノ酸配列において４６番目
のフェニルアラニン残基がロイシン残基に置換している
ことを特徴とするものである。
【００１５】本明細書で言う、緑色蛍光蛋白質（ＧＦ
Ｐ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体
とは、各々公知の緑色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質だけ
でなく、それらの変異体の全てを包含する意味である。
例えば、緑色蛍光蛋白質遺伝子は単離され配列も決定さ
れている(Prasher，D.C．ら(1992)，"Primary structur
e of the Aequorea victoria green fluorescent prote
in"，Gene 111：229−233)。その他の蛍光蛋白質又はそ
の変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例え
ば、Roger Y.Tsin, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-4
4、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋
白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれ
らの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、
エクオレア・ビクトリア（Aequoreavictoria））由来の
ものを使用できる。
Ｐ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体
とは、各々公知の緑色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質だけ
でなく、それらの変異体の全てを包含する意味である。
例えば、緑色蛍光蛋白質遺伝子は単離され配列も決定さ
れている(Prasher，D.C．ら(1992)，"Primary structur
e of the Aequorea victoria green fluorescent prote
in"，Gene 111：229−233)。その他の蛍光蛋白質又はそ
の変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例え
ば、Roger Y.Tsin, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-4
4、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋
白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれ
らの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、
エクオレア・ビクトリア（Aequoreavictoria））由来の
ものを使用できる。
【００１６】ＧＦＰ、ＹＦＰとそれらの変異体の一例を
以下に示す。なお、Ｆ９９Ｓという表示は、９９番目の
アミノ酸残基がＦからＳに置換していることを示し、他
のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。野
生型ＧＦＰ；Ｆ９９Ｓ，Ｍ１５３Ｔ，Ｖ１６３Ａのアミ
ノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有
するＧＦＰ；Ｆ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有す
るＧＦＰ；Ｓ６５Ｔ，Ｓ７２Ａ，Ｎ１４９Ｋ，Ｍ１５３
Ｔ，Ｉ１６７Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｓ２０
２Ｆ，Ｔ２０３Ｉのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｔ２
０３Ｉ，Ｓ７２Ａ，Ｙ１４５Ｆのアミノ酸変異を有する
ＧＦＰ；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｆのアミノ酸変
異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ
２０３Ｈのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；Ｓ
６５Ｇ，Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙの
アミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ，Ｑ
６９Ｋ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸
変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２
Ａ，Ｋ７９Ｒ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦ
Ｐ（ＹＦＰ）；
以下に示す。なお、Ｆ９９Ｓという表示は、９９番目の
アミノ酸残基がＦからＳに置換していることを示し、他
のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。野
生型ＧＦＰ；Ｆ９９Ｓ，Ｍ１５３Ｔ，Ｖ１６３Ａのアミ
ノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有
するＧＦＰ；Ｆ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有す
るＧＦＰ；Ｓ６５Ｔ，Ｓ７２Ａ，Ｎ１４９Ｋ，Ｍ１５３
Ｔ，Ｉ１６７Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｓ２０
２Ｆ，Ｔ２０３Ｉのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；Ｔ２
０３Ｉ，Ｓ７２Ａ，Ｙ１４５Ｆのアミノ酸変異を有する
ＧＦＰ；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｆのアミノ酸変
異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ
２０３Ｈのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；Ｓ
６５Ｇ，Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙの
アミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ，Ｑ
６９Ｋ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸
変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ）；Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２
Ａ，Ｋ７９Ｒ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦ
Ｐ（ＹＦＰ）；
【００１７】緑色蛍光蛋白質の変異体である増強緑色蛍
光蛋白質（Enhanced green fluorescent protein）のア
ミノ酸配列の一例を、本明細書の配列表の配列番号２に
記載し、また、黄色蛍光蛋白質の変異体である増強黄色
蛍光蛋白質（Enhanced yellow fluorescent protein）
のアミノ酸配列の一例を、本明細書の配列表の配列番号
３に記載する。
光蛋白質（Enhanced green fluorescent protein）のア
ミノ酸配列の一例を、本明細書の配列表の配列番号２に
記載し、また、黄色蛍光蛋白質の変異体である増強黄色
蛍光蛋白質（Enhanced yellow fluorescent protein）
のアミノ酸配列の一例を、本明細書の配列表の配列番号
３に記載する。
【００１８】なお、配列番号２および３に記載のアミノ
酸配列では、アミノ酸番号１と２の間にＶａｌが挿入さ
れているため、天然体の蛍光蛋白質における４６番目の
フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）は４７番目に記載され
ている。本発明の蛍光蛋白質は、４６番目のフェニルア
ラニン残基がロイシン残基に置換していることを特徴と
するものであるが、ここで言う「４６番目のフェニルア
ラニン残基」とは、配列番号２及び配列番号３のアミノ
酸配列においては、それぞれ４７番目のフェニルアラニ
ン残基（Ｐｈｅ）に対応するものである。
酸配列では、アミノ酸番号１と２の間にＶａｌが挿入さ
れているため、天然体の蛍光蛋白質における４６番目の
フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）は４７番目に記載され
ている。本発明の蛍光蛋白質は、４６番目のフェニルア
ラニン残基がロイシン残基に置換していることを特徴と
するものであるが、ここで言う「４６番目のフェニルア
ラニン残基」とは、配列番号２及び配列番号３のアミノ
酸配列においては、それぞれ４７番目のフェニルアラニ
ン残基（Ｐｈｅ）に対応するものである。
【００１９】従って、本発明の蛍光蛋白質の一例として
は、配列番号２又は配列番号３に記載のアミノ酸配列に
おいて、４７番目のフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）が
ロイシン残基に置換しているアミノ酸配列を有する蛋白
質が挙げられる。
は、配列番号２又は配列番号３に記載のアミノ酸配列に
おいて、４７番目のフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）が
ロイシン残基に置換しているアミノ酸配列を有する蛋白
質が挙げられる。
【００２０】本発明の好ましい態様では、緑色蛍光蛋白
質、黄色蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列
において４６番目のフェニルアラニン残基がロイシン残
基に置換していることに加えて、６４番目のフェニルア
ラニン残基がロイシン残基に、１５３番目のメチオニン
残基がトレオニン残基に、１６３番目のバリン残基がア
ラニン残基に、そして１７５番目のセリン残基がグリシ
ン残基に置換している。
質、黄色蛍光蛋白質又はそれらの変異体のアミノ酸配列
において４６番目のフェニルアラニン残基がロイシン残
基に置換していることに加えて、６４番目のフェニルア
ラニン残基がロイシン残基に、１５３番目のメチオニン
残基がトレオニン残基に、１６３番目のバリン残基がア
ラニン残基に、そして１７５番目のセリン残基がグリシ
ン残基に置換している。
【００２１】上記と同様に、上記で言う「６４番目」
「１５３番目」「１６３番目」及び「１７５番目」のア
ミノ酸残基はそれぞれ、配列番号２及び配列番号３で
は、「６５番目」「１５４番目」「１６４番目」及び
「１７６番目」のアミノ酸残基に対応する。
「１５３番目」「１６３番目」及び「１７５番目」のア
ミノ酸残基はそれぞれ、配列番号２及び配列番号３で
は、「６５番目」「１５４番目」「１６４番目」及び
「１７６番目」のアミノ酸残基に対応する。
【００２２】本発明の蛍光蛋白質の具体例としては、以
下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げら
れる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又
は、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に
おいて１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付
加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の蛍光特性を有す
るアミノ酸配列：
下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げら
れる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又
は、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に
おいて１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付
加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の蛍光特性を有す
るアミノ酸配列：
【００２３】本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の
欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」にお
ける「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例
えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好
ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特
に好ましくは１から３個程度を意味する。
欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」にお
ける「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例
えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好
ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特
に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２４】本明細書で言う「同等以上の蛍光特性を有
する」とは、同等以上の蛍光強度、同等の波長、同等以
上の成熟速度および成熟率、並びにH+およびCl-に対す
る同等以下の感受性を有することを意味する。
する」とは、同等以上の蛍光強度、同等の波長、同等以
上の成熟速度および成熟率、並びにH+およびCl-に対す
る同等以下の感受性を有することを意味する。
【００２５】本発明の蛍光蛋白質の取得方法については
特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよ
いし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白
質でもよい。組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず
当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要で
ある。本明細書の配列表の配列番号１〜３に記載したア
ミノ酸配列、及び配列番号４及び５に記載した塩基配列
（これらの塩基配列は、配列番号２及び３に記載のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列の一例である）の情報を
利用することにより適当なプライマーを設計し、それら
を用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤ
ＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本
発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することが
できる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部
の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製した
ＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結する
ことにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得
ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入する
ことにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができ
る。発現系での発現については本明細書中後記する。
特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよ
いし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白
質でもよい。組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず
当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要で
ある。本明細書の配列表の配列番号１〜３に記載したア
ミノ酸配列、及び配列番号４及び５に記載した塩基配列
（これらの塩基配列は、配列番号２及び３に記載のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列の一例である）の情報を
利用することにより適当なプライマーを設計し、それら
を用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤ
ＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本
発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することが
できる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部
の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製した
ＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結する
ことにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得
ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入する
ことにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができ
る。発現系での発現については本明細書中後記する。
【００２６】（２）本発明のＤＮＡ 本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードする遺伝
子が提供される。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮ
Ａの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられ
る。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ；又は（ｂ）配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置
換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番
号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の
蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
子が提供される。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮ
Ａの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられ
る。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ；又は（ｂ）配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置
換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番
号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の
蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
【００２７】本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイ
ト法などにより合成することができるし、特異的プライ
マーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の
作製方法については、本明細書中の上述した通りであ
る。
ト法などにより合成することができるし、特異的プライ
マーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の
作製方法については、本明細書中の上述した通りであ
る。
【００２８】また、所定の核酸配列に所望の変異を導入
する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変
異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核
酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知
の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮ
Ａを構築することができる。このような公知の技術は、
例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2
nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocolsin Molecu
lar Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)に記載されている。
する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変
異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核
酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知
の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮ
Ａを構築することができる。このような公知の技術は、
例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2
nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocolsin Molecu
lar Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)に記載されている。
【００２９】（３）本発明の組み換えベクター 本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用する
ことができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限
定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えば
プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入
された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれ
た染色体と共に複製されるものであってもよい。好まし
くは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。
発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な
要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されて
いる。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤ
ＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することがで
きる。
ことができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限
定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えば
プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入
された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれ
た染色体と共に複製されるものであってもよい。好まし
くは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。
発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な
要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されて
いる。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤ
ＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することがで
きる。
【００３０】細菌細胞で作動可能なプロモータとして
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus
maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミス
αアミラーゼ遺伝子(Bacilluslicheniformis alpha-amy
lase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BAN
アミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN am
ylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテ
アーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease
gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺
伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモー
タ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰ Lプロモー
タ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙
げられる。
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus
maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミス
αアミラーゼ遺伝子(Bacilluslicheniformis alpha-amy
lase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BAN
アミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN am
ylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテ
アーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease
gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺
伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモー
タ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰ Lプロモー
タ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙
げられる。
【００３１】哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例
としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオ
ネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主
後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロ
モータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０
プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘド
ロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス
即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイ
ルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母
宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解
糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-
4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能
なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたは
ｔｐｉＡプロモータなどがある。
としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオ
ネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主
後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロ
モータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０
プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘド
ロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス
即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイ
ルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母
宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解
糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-
4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能
なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたは
ｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３２】また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例
えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主につ
いてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネ
ータのような適切なターミネータに機能的に結合されて
もよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニ
レーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイ
ルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列
（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配
列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードする
もの）のような要素を有していてもよい。本発明の組み
換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製す
ることを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その
一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）が挙げられる。
えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主につ
いてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネ
ータのような適切なターミネータに機能的に結合されて
もよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニ
レーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイ
ルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列
（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配
列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードする
もの）のような要素を有していてもよい。本発明の組み
換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製す
ることを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その
一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）が挙げられる。
【００３３】本発明の組み換えベクターはさらに選択マ
ーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾ
サッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその
補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアン
ピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンの
ような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の
ＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータお
よび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これ
らを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知であ
る。
ーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾ
サッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその
補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアン
ピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンの
ような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の
ＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータお
よび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これ
らを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知であ
る。
【００３４】（４）本発明の形質転換体 本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導
入することによって形質転換体を作製することができ
る。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入され
る宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任
意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞
等が挙げられる。
入することによって形質転換体を作製することができ
る。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入され
る宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任
意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞
等が挙げられる。
【００３５】細菌細胞の例としては、バチルスまたはス
トレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラ
ム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロ
トプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を
用いることにより行なえばよい。哺乳類細胞の例として
は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられ
る。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮ
Ａ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレク
トロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェ
クション法等を用いることができる。
トレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラ
ム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロ
トプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を
用いることにより行なえばよい。哺乳類細胞の例として
は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられ
る。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮ
Ａ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレク
トロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェ
クション法等を用いることができる。
【００３６】酵母細胞の例としては、サッカロマイセス
またはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓa
ccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への
組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレク
トロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウ
ム法等を挙げることができる。
またはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓa
ccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への
組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレク
トロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウ
ム法等を挙げることができる。
【００３７】他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアス
ペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリ
コデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を
用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組
換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことがで
きる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知
の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えによ
り行うことができる。
ペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリ
コデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を
用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組
換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことがで
きる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知
の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えによ
り行うことができる。
【００３８】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculo
virus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及
びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記
載）。
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculo
virus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及
びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記
載）。
【００３９】バキュロウイルスとしては、例えば、ヨト
ウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman a
nd Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Tri
choplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビト
ロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイル
スを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベ
クターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、
例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等
を挙げることができる。
ウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman a
nd Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Tri
choplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビト
ロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイル
スを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベ
クターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、
例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等
を挙げることができる。
【００４０】上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構
築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培
養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋
白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法
を用いればよい。例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に
溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心
分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等
により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽
出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常
の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等によ
る塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルア
ミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファ
ルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ
トグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファ
ロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー
法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマ
トグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電
気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わ
せて用い、精製標品を得ることができる。
築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培
養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋
白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法
を用いればよい。例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に
溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心
分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等
により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽
出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常
の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等によ
る塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルア
ミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファ
ルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ
トグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファ
ロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー
法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマ
トグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電
気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わ
せて用い、精製標品を得ることができる。
【００４１】（５）本発明の蛍光蛋白質を含む融合蛍光
蛋白質とその利用 本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることによ
り、融合蛍光蛋白質を構築することができる。本発明の
蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質の種類は特に限定さ
れるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白
質、より具体的には、細胞内小器官に特異的な蛋白質な
どを挙げることができる。
蛋白質とその利用 本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることによ
り、融合蛍光蛋白質を構築することができる。本発明の
蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質の種類は特に限定さ
れるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白
質、より具体的には、細胞内小器官に特異的な蛋白質な
どを挙げることができる。
【００４２】本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法につい
ては特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質で
もよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え
蛋白質でもよい。組み換え蛋白質を作製する場合には、
先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必
要である。本明細書の配列表の配列番号１〜３に記載し
たアミノ酸配列、及び配列番号４及び５に記載した塩基
配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設
計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光
蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うこ
とにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構
築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。
また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片
も入手する。
ては特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質で
もよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え
蛋白質でもよい。組み換え蛋白質を作製する場合には、
先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必
要である。本明細書の配列表の配列番号１〜３に記載し
たアミノ酸配列、及び配列番号４及び５に記載した塩基
配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設
計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光
蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うこ
とにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構
築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。
また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片
も入手する。
【００４３】次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝
子組み換え技術により連結することにより、所望の融合
蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。こ
のＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明
の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
子組み換え技術により連結することにより、所望の融合
蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。こ
のＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明
の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
【００４４】上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白
質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合
蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニター
することにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態
を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光
蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフ
ェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞
内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析する
ことができる。
質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合
蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニター
することにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態
を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光
蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフ
ェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞
内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析する
ことができる。
【００４５】例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラ
に特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコン
ドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソーム
などの分布や動きを観察できる。また、例えば、神経細
胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく
複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラ
ベルすることにより動的解析が可能になる。
に特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコン
ドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソーム
などの分布や動きを観察できる。また、例えば、神経細
胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく
複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラ
ベルすることにより動的解析が可能になる。
【００４６】顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択でき
る。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場
合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の
詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場
合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡シ
ステムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネー
ションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。
正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際に
は水浸レンズを用いることができる。
る。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場
合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の
詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場
合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡シ
ステムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネー
ションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。
正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際に
は水浸レンズを用いることができる。
【００４７】フィルターセットは、蛍光蛋白質の蛍光波
長に応じて適切なものを選択できる。ＧＦＰの観察には
励起光４７０〜４９０ｎｍ、蛍光５００〜５２０ｎｍ程
度のフィルターを使用することが好ましい。ＹＦＰの観
察には、励起光４８０〜５００ｎｍ、蛍光５１０〜５５
０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
長に応じて適切なものを選択できる。ＧＦＰの観察には
励起光４７０〜４９０ｎｍ、蛍光５００〜５２０ｎｍ程
度のフィルターを使用することが好ましい。ＹＦＰの観
察には、励起光４８０〜５００ｎｍ、蛍光５１０〜５５
０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
【００４８】また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時
観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、
高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラ
は、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な
蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、
高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラ
は、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な
蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
【００４９】（６）本発明の蛍光蛋白質を利用したFRET
（蛍光共鳴エネルギー転移）法 本発明の蛍光蛋白質は、FRET（蛍光共鳴エネルギー転
移）法を用いた分析法に利用することができる。例え
ば、本発明の蛍光蛋白質が黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）の
変異体である場合、本発明の蛍光蛋白質をアクセプター
分子として使用し、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）をドナ
ー分子として使用して、両者の間でＦＲＥＴ（蛍光共鳴
エネルギー転移）を起こすことにより蛋白質間の相互作
用を可視化することができる。例えば、Ｃａ2+の濃度上
昇によって起こる蛋白質間の相互作用（例えば、カルモ
ジュリン等のカルシウム結合蛋白質と、Ｍ１３等のその
標的ペプチドとの結合）をＣＦＰからＹＦＰへのＦＲＥ
Ｔで可視化することが可能である。
（蛍光共鳴エネルギー転移）法 本発明の蛍光蛋白質は、FRET（蛍光共鳴エネルギー転
移）法を用いた分析法に利用することができる。例え
ば、本発明の蛍光蛋白質が黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）の
変異体である場合、本発明の蛍光蛋白質をアクセプター
分子として使用し、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）をドナ
ー分子として使用して、両者の間でＦＲＥＴ（蛍光共鳴
エネルギー転移）を起こすことにより蛋白質間の相互作
用を可視化することができる。例えば、Ｃａ2+の濃度上
昇によって起こる蛋白質間の相互作用（例えば、カルモ
ジュリン等のカルシウム結合蛋白質と、Ｍ１３等のその
標的ペプチドとの結合）をＣＦＰからＹＦＰへのＦＲＥ
Ｔで可視化することが可能である。
【００５０】カルシウム結合蛋白質としては、カルモジ
ュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン
軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン、ＶＩＬ
ＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレクエニ
ン、カルトラクチン、カルパイン・ラージ・サブユニッ
ト、Ｓ１００プロテイン、パルバルブミン、カルビンジ
ンＤ9K、カルビンジンＤ28K及びカルレチニンなどが挙
げられる。
ュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン
軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン、ＶＩＬ
ＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレクエニ
ン、カルトラクチン、カルパイン・ラージ・サブユニッ
ト、Ｓ１００プロテイン、パルバルブミン、カルビンジ
ンＤ9K、カルビンジンＤ28K及びカルレチニンなどが挙
げられる。
【００５１】また、カルシウム結合蛋白質の標的ペプチ
ドのアミノ酸配列は当業者であれば適宜選択することが
できる。例えば、カルシウム結合蛋白質がカルモジュリ
ンの場合には、カルモジュリンの標的物質として知られ
る各種の蛋白質やペプチド中に存在することが知られて
いるカルモジュリン結合ドメインのアミノ酸配列を、本
発明の融合蛍光蛋白質のＮ末端側に存在させることがで
きる。このようなカルモジュリン結合ドメインのアミノ
酸配列は、これまで１２００種類以上が知られている。
カルモジュリン結合ドメインデータベース( HYPERLINK
"http://calcium.oci.utoronto.ca/ctdb" http://calc
ium.oci.utoronto.ca/ctdb)で検索可能である。上記の
通り本発明の蛍光蛋白質は、細胞内のカルシウムイオン
濃度を測定したり、カルシウムイオン分布をモニターす
るために使用することができる。
ドのアミノ酸配列は当業者であれば適宜選択することが
できる。例えば、カルシウム結合蛋白質がカルモジュリ
ンの場合には、カルモジュリンの標的物質として知られ
る各種の蛋白質やペプチド中に存在することが知られて
いるカルモジュリン結合ドメインのアミノ酸配列を、本
発明の融合蛍光蛋白質のＮ末端側に存在させることがで
きる。このようなカルモジュリン結合ドメインのアミノ
酸配列は、これまで１２００種類以上が知られている。
カルモジュリン結合ドメインデータベース( HYPERLINK
"http://calcium.oci.utoronto.ca/ctdb" http://calc
ium.oci.utoronto.ca/ctdb)で検索可能である。上記の
通り本発明の蛍光蛋白質は、細胞内のカルシウムイオン
濃度を測定したり、カルシウムイオン分布をモニターす
るために使用することができる。
【００５２】（７）本発明のキット 本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合
蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体
から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴と
する、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質
の分析のためのキットが提供される。本発明のキット
は、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製
することができる。蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬
は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態
に調製することができる。溶媒としては、水、エタノー
ル、各種緩衝液などを用いることができる。以下の実施
例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例
によって限定されるものではない。
蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体
から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴と
する、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質
の分析のためのキットが提供される。本発明のキット
は、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製
することができる。蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬
は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態
に調製することができる。溶媒としては、水、エタノー
ル、各種緩衝液などを用いることができる。以下の実施
例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例
によって限定されるものではない。
【００５３】
【実施例】（１）実験方法 ペリカムにおけるランダム変異誘発 エラー・プローン（error-prone）PCR法（XX）を用いて
サーキュラーパーミューテーションを行ったYFP（H148D
/V163A/S175G/Y203F）(Nagai, T, 他 (2001) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 98, 3197-3202)の遺伝子にランダム
変異を導入した。PCR産物をPstIおよびKpnIを用いて消
化し、BamHI/PstIおよびKpnI/EcoRI部位にそれぞれM13
およびカルモジュリンの遺伝子を保持するpRSETB（Invi
trogen）にサブクローニングした。プレート上で37℃に
て増殖させた細菌コロニーの蛍光を、蛍光画像解析シス
テム（Sawano, A. 他 (2000) Nucleic Acids Research
28, e78）を用いて分析した。
サーキュラーパーミューテーションを行ったYFP（H148D
/V163A/S175G/Y203F）(Nagai, T, 他 (2001) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 98, 3197-3202)の遺伝子にランダム
変異を導入した。PCR産物をPstIおよびKpnIを用いて消
化し、BamHI/PstIおよびKpnI/EcoRI部位にそれぞれM13
およびカルモジュリンの遺伝子を保持するpRSETB（Invi
trogen）にサブクローニングした。プレート上で37℃に
て増殖させた細菌コロニーの蛍光を、蛍光画像解析シス
テム（Sawano, A. 他 (2000) Nucleic Acids Research
28, e78）を用いて分析した。
【００５４】遺伝子構築 既報のプロトコル（Sawano, A. 他 (2000) Nucleic Aci
ds Research 28, e78）を用いて、変異 F46LおよびF64L
/M153T/V163A/S175Gに関して、オリゴヌクレオチド特異
的変異誘発法を行った。pRSETB（pRSETB/EYFP）中のEYF
PのcDNAを出発物質として用いて、pRSETB/SEYFP、pRSET
B/EYFP（F46L）およびpRSETB/SEYFP（F46L）（= pRSETB
/Venus）を作製した。pEGFP-N1-NPY中のEGFP遺伝子はVe
nus遺伝子と置き換えて、NPY-Venusキメラ蛋白質をコー
ドするpVenus-N1-NPYを得た。Venusを黄色カメレオン3.
1（YC3.1）の遺伝子中のEYFP-V68L/Q69Kの代わりに置き
換えて、YC3.12遺伝子を作製し、これを細菌発現および
哺乳動物発現のためにそれぞれpRSETBおよびpCS2中にサ
ブクローニングした。
ds Research 28, e78）を用いて、変異 F46LおよびF64L
/M153T/V163A/S175Gに関して、オリゴヌクレオチド特異
的変異誘発法を行った。pRSETB（pRSETB/EYFP）中のEYF
PのcDNAを出発物質として用いて、pRSETB/SEYFP、pRSET
B/EYFP（F46L）およびpRSETB/SEYFP（F46L）（= pRSETB
/Venus）を作製した。pEGFP-N1-NPY中のEGFP遺伝子はVe
nus遺伝子と置き換えて、NPY-Venusキメラ蛋白質をコー
ドするpVenus-N1-NPYを得た。Venusを黄色カメレオン3.
1（YC3.1）の遺伝子中のEYFP-V68L/Q69Kの代わりに置き
換えて、YC3.12遺伝子を作製し、これを細菌発現および
哺乳動物発現のためにそれぞれpRSETBおよびpCS2中にサ
ブクローニングした。
【００５５】大腸菌における蛋白質の蛍光測定 細菌［JMI09（DE3）］のサンプルを50μg/mlアンピシリ
ンを含有するLB培地中で37℃にて増殖させ、回収し、最
終OD600が0.5となるようにPBS中に再懸濁した。レシオ
メトリックスペリカムおよびYFP変異体に関しては485 n
mにおける励起、カメレオン変異体に関しては435nmにお
ける励起により蛍光スペクトルを取得した。
ンを含有するLB培地中で37℃にて増殖させ、回収し、最
終OD600が0.5となるようにPBS中に再懸濁した。レシオ
メトリックスペリカムおよびYFP変異体に関しては485 n
mにおける励起、カメレオン変異体に関しては435nmにお
ける励起により蛍光スペクトルを取得した。
【００５６】蛋白質発現、インビトロ分光分析、及びpH
および塩化物滴定 蛋白質は、既報の通り、大腸菌で発現し、精製し、分光
分析により同定した（Miyawaki, A., 他 (1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）。YFP変異体の
量子収率はフルオレセインの収量（0.91）との比較によ
り求めた。モル吸光係数の計算のために、蛋白質濃度を
標準として牛血清アルブミンを用いてBradfordキット
（BioRad）を用いて測定した。pH滴定は、全てのバッフ
ァーに35 mM [Cl-] を含有させ、イオン強度をD-グルコ
ン酸カリウムを用いて150mMに調整した以外は、既報（N
agai, T,他(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 31
97-3202）の通り行った。塩化物滴定はpH 7.0にて行っ
た。蛋白質を０〜４００mMの範囲の特定の[Cl-]を含有
する10 mMのMOPS（pH7.0）中に溶解し、イオン強度をD-
グルコン酸カリウムを用いて400 mMに調整した。
および塩化物滴定 蛋白質は、既報の通り、大腸菌で発現し、精製し、分光
分析により同定した（Miyawaki, A., 他 (1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）。YFP変異体の
量子収率はフルオレセインの収量（0.91）との比較によ
り求めた。モル吸光係数の計算のために、蛋白質濃度を
標準として牛血清アルブミンを用いてBradfordキット
（BioRad）を用いて測定した。pH滴定は、全てのバッフ
ァーに35 mM [Cl-] を含有させ、イオン強度をD-グルコ
ン酸カリウムを用いて150mMに調整した以外は、既報（N
agai, T,他(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 31
97-3202）の通り行った。塩化物滴定はpH 7.0にて行っ
た。蛋白質を０〜４００mMの範囲の特定の[Cl-]を含有
する10 mMのMOPS（pH7.0）中に溶解し、イオン強度をD-
グルコン酸カリウムを用いて400 mMに調整した。
【００５７】YFP変異体のin vitroにおける再生および
再酸化 蛍光回復実験を既報の通り行った（Reid, B.G. 他 (199
7) Biochemistry 36,6786-6791）。変性YFPは、変性バ
ッファー（8M尿素および1 mM DTT）中で95℃にて５分間
蛋白質をインキュベートすることにより調製した。変性
／還元YFPの調製は、5 mM次亜硫酸塩を上記変性バッフ
ァーに添加した。蛍光の回復は、37℃において再生バッ
ファー（35 mM KC1、2 mM MgCl2、50 mM Tris pH 7.5、
1 mM DTT）で100倍希釈を行って開始した。530nmにおけ
る発光を515nmにおける励起によりモニタリングした。
再酸化 蛍光回復実験を既報の通り行った（Reid, B.G. 他 (199
7) Biochemistry 36,6786-6791）。変性YFPは、変性バ
ッファー（8M尿素および1 mM DTT）中で95℃にて５分間
蛋白質をインキュベートすることにより調製した。変性
／還元YFPの調製は、5 mM次亜硫酸塩を上記変性バッフ
ァーに添加した。蛍光の回復は、37℃において再生バッ
ファー（35 mM KC1、2 mM MgCl2、50 mM Tris pH 7.5、
1 mM DTT）で100倍希釈を行って開始した。530nmにおけ
る発光を515nmにおける励起によりモニタリングした。
【００５８】PC12細胞におけるNPY-融合蛋白質の発現 PC12細胞（理研細胞バンク）は、37℃および５％CO2下
にて増殖培地（DMEM、10％胎児ウシ血清、10％ウマ血
清、100 U/ml ペニシリン、0.1 mg/ml ストレプトマイ
シン）中に維持した。トランスフェクションの前日に、
細胞をガラス製カバースリップ上に載せた。画像化のた
めに、カバースリップをポリエチレンイミで被覆した。
Lipofect Amine 2000 （Gibco BRL）を使用して、細胞
にpVenus-N1-NPYまたはpEGFP-N1-NPYをトランスフェク
トした。続いて細胞を、培地中に神経成長因子（100 ng
/ml ヒト組換えNGF-b鎖、Calbiochem）を添加すること
により、分化させ、軸策を伸長させた。
にて増殖培地（DMEM、10％胎児ウシ血清、10％ウマ血
清、100 U/ml ペニシリン、0.1 mg/ml ストレプトマイ
シン）中に維持した。トランスフェクションの前日に、
細胞をガラス製カバースリップ上に載せた。画像化のた
めに、カバースリップをポリエチレンイミで被覆した。
Lipofect Amine 2000 （Gibco BRL）を使用して、細胞
にpVenus-N1-NPYまたはpEGFP-N1-NPYをトランスフェク
トした。続いて細胞を、培地中に神経成長因子（100 ng
/ml ヒト組換えNGF-b鎖、Calbiochem）を添加すること
により、分化させ、軸策を伸長させた。
【００５９】免疫組織化学 トランスフェクトしたPC12細胞をPBS(-)中の４％パラホ
ルムアルデヒドを用いて15分間固定した。0.1％TritonX
-100を含有するPBS中に希釈したGFPに対するポリクロー
ナル抗体（MBL, Japan）およびAlexa568結合抗ウサギIg
G（Molecular Probe）を用いて、VenusおよびEGFPに対
する免疫染色を実施した。染色した細胞は、Venusおよ
びEGFPの緑色蛍光に関しては470DF35（励起）およびHQ5
25／50（発光）を用いて、そしてAlexa568の赤色蛍光に
関しては550DF30（励起）および590DF35（発光）を用い
て観察した。
ルムアルデヒドを用いて15分間固定した。0.1％TritonX
-100を含有するPBS中に希釈したGFPに対するポリクロー
ナル抗体（MBL, Japan）およびAlexa568結合抗ウサギIg
G（Molecular Probe）を用いて、VenusおよびEGFPに対
する免疫染色を実施した。染色した細胞は、Venusおよ
びEGFPの緑色蛍光に関しては470DF35（励起）およびHQ5
25／50（発光）を用いて、そしてAlexa568の赤色蛍光に
関しては550DF30（励起）および590DF35（発光）を用い
て観察した。
【００６０】NPY融合蛋白質の分泌のモニタリング トランスフェクトしたPC12細胞を、37℃で５％CO2下に
て生理学的食塩水溶液（145 mM NaCl、5.6mM KCl、2.2m
M CaCl2、0.5mM MgC12、5.6mMグルコース、15mM HEPE
S、pH 7.4）中でインキュベートした。脱分極刺激は、
予め加温した高K+溶液（95mM NaCl、56mM KCl、2.2mM C
aC12、0.5mM MgC12、5,6mMグルコース、15mM HEPES、pH
7.4）と交換することにより開始した。細胞外溶液およ
び細胞溶解物の蛍光強度を、特定の時点において測定し
た。
て生理学的食塩水溶液（145 mM NaCl、5.6mM KCl、2.2m
M CaCl2、0.5mM MgC12、5.6mMグルコース、15mM HEPE
S、pH 7.4）中でインキュベートした。脱分極刺激は、
予め加温した高K+溶液（95mM NaCl、56mM KCl、2.2mM C
aC12、0.5mM MgC12、5,6mMグルコース、15mM HEPES、pH
7.4）と交換することにより開始した。細胞外溶液およ
び細胞溶解物の蛍光強度を、特定の時点において測定し
た。
【００６１】PC12細胞の単一の高密度コア顆粒の画像化 倒立顕微鏡（IX-70, オリンパス）を既報の通りエバネ
ッセント波励起のために改良した（Steyer, J. A. 他
(2001) Nature Reviews Mol. Cell Biol. 2, 268-27
5）。顕微鏡には、高開口数レンズ（UplanApo 60X NA1.
45,オリンパス）、二色鏡（505DRLP, オメガ）及び全体
内部反射蛍光顕微鏡用の照明器（TIRFM）（U-DP,オリン
パス）を備えつけた。レーザー（アルゴン,Omnichrom
e）及び照明器をシングルモードファイバーに接続し、
４８８ｎｍのレーザー光線を顕微鏡内に導入した。レー
ザー光線を対物レンズの出口孔に発射した。MetaMorph/
MetaFluor 4.0ソフトウエア（Universal Imaging）によ
り制御される１２ビット冷却CCDカメラ（MicroMax 1300
Y/HS, Roper Scientific）を用いて、画像を発光フィル
ター（HQ525/50, オメガ）を通じて取得した。画像取得
の速度は、30フレーム／秒（２×２binning）又は10フ
レーム／秒（１×１binning）の何れかとした。
ッセント波励起のために改良した（Steyer, J. A. 他
(2001) Nature Reviews Mol. Cell Biol. 2, 268-27
5）。顕微鏡には、高開口数レンズ（UplanApo 60X NA1.
45,オリンパス）、二色鏡（505DRLP, オメガ）及び全体
内部反射蛍光顕微鏡用の照明器（TIRFM）（U-DP,オリン
パス）を備えつけた。レーザー（アルゴン,Omnichrom
e）及び照明器をシングルモードファイバーに接続し、
４８８ｎｍのレーザー光線を顕微鏡内に導入した。レー
ザー光線を対物レンズの出口孔に発射した。MetaMorph/
MetaFluor 4.0ソフトウエア（Universal Imaging）によ
り制御される１２ビット冷却CCDカメラ（MicroMax 1300
Y/HS, Roper Scientific）を用いて、画像を発光フィル
ター（HQ525/50, オメガ）を通じて取得した。画像取得
の速度は、30フレーム／秒（２×２binning）又は10フ
レーム／秒（１×１binning）の何れかとした。
【００６２】黄色カメレオンを用いたHeLa細胞のＣａ2+
画像化 Superfect(Qiagen)を用いてHeLa細胞にpCS2-YC3.1又はp
CS2-YC3.12をトランスフェクションし、既報の通り画像
化した（Miyawaki, A.,他 (1999) Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 96, 2135-2140）。
画像化 Superfect(Qiagen)を用いてHeLa細胞にpCS2-YC3.1又はp
CS2-YC3.12をトランスフェクションし、既報の通り画像
化した（Miyawaki, A.,他 (1999) Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 96, 2135-2140）。
【００６３】（２）結果および考察 F46L：37℃において産生されるYFPの成熟を改善する新
規な変異 ペリカム（Ca2+を感知するように遺伝子操作されたサー
キュラーパーミューテーション（circular permutatio
n）を行ったGFP）（Nagai, T, 他 (2001) Proc.Natl. A
cad. Sci. USA 98, 3197-3202）におけるランダム変異
誘発の間に、Ca2 +感受性に影響を及ぼすことなく成熟を
改善するいくつかの変異が見つかった。特に関心がもた
れるものは、Phe-46のLeuへの変異であり、これは37℃
における発色団形成を大きく改善した。３種類のペリカ
ムの中で、このF46Lを有するインバースペリカム（inve
rse-pericam）およびレシオメトリックペリカム双方（r
atiometric-pericam）は、高いＣａ2+感受性を保持しつ
つ、37℃において非常に効率的に成熟することができ
た。図１Ａは、F46Lが大腸菌において37℃で産生される
レシオメトリックペリカムの蛍光発生に及ぼす顕著な影
響を示すが、折りたたみ効率を増大させることが同定さ
れた２つの変異V163AおよびS175Gは全く影響を及ぼさな
かった。フラッシュペリカム（flash-pericam）のCa2+
感受性はこの変異によって低下した。従って、フラッシ
ュペリカムはF46Lを担持せず、28〜30℃においてより良
好に産生される。
規な変異 ペリカム（Ca2+を感知するように遺伝子操作されたサー
キュラーパーミューテーション（circular permutatio
n）を行ったGFP）（Nagai, T, 他 (2001) Proc.Natl. A
cad. Sci. USA 98, 3197-3202）におけるランダム変異
誘発の間に、Ca2 +感受性に影響を及ぼすことなく成熟を
改善するいくつかの変異が見つかった。特に関心がもた
れるものは、Phe-46のLeuへの変異であり、これは37℃
における発色団形成を大きく改善した。３種類のペリカ
ムの中で、このF46Lを有するインバースペリカム（inve
rse-pericam）およびレシオメトリックペリカム双方（r
atiometric-pericam）は、高いＣａ2+感受性を保持しつ
つ、37℃において非常に効率的に成熟することができ
た。図１Ａは、F46Lが大腸菌において37℃で産生される
レシオメトリックペリカムの蛍光発生に及ぼす顕著な影
響を示すが、折りたたみ効率を増大させることが同定さ
れた２つの変異V163AおよびS175Gは全く影響を及ぼさな
かった。フラッシュペリカム（flash-pericam）のCa2+
感受性はこの変異によって低下した。従って、フラッシ
ュペリカムはF46Lを担持せず、28〜30℃においてより良
好に産生される。
【００６４】ペリカムは、Ｃａ2+感受性を保持するよう
にYFP変異体（EYFP-V68L/Q69K）から加工されたもので
あるため（Miyawaki, A.,他 (1999) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96, 2135-2140）、F46LがYFPに関しても成熟
効率を増大させるかどうかに興味をもった。F46Lの効果
を、最もよく使用されるYFP変異体であるEYFP（S65G/S7
2A/V68L/T203Y）において調べた。YFP変異体（S65G/S72
A/V68L/T203Y）（Wachter, R.M.,他(1999) Structure
6, 1267-1277）の結晶構造において、Phe-46のベンゼン
環は発色団の一部であるイミダゾリノンと隣接してい
る。F46LはYFPの発色団形成に影響を及ぼしていると考
えられる。F46Lの作用と共に、周知の折りたたみ変異で
あるF64L/M153T/V163A/T203YのEYFPに対する影響を調べ
た。なお、他のGFP変異体において折りたたみ効率を増
大させることは示唆されていたが、YFP変異体にこれら
の変異を導入する試みの報告はなかった。複数部位変異
誘発法に関するプロトコール（Sawano, A.他(2000) Nuc
leic Acids Research 28, e78）を用いて、４つの一般
的な折りたたみ変異を一度に全てEYFPに導入してSEYFP
（スーパーEYFP）（EYFP-F64L/M153T/V163A/S175G）を
作製した。続いて、F46LをEYFPおよびSEYFPに導入する
ことによりそれぞれEYFP-F46LおよびSEYFP-F46Lを得
た。最初に、これら４つのYFP変異体を大腸菌において
室温で産生させて、精製のために十分に成熟させた。精
製したYFP変異体は、正確に同一の励起スペクトルおよ
び発光スペクトルを示し、ほぼ同等のεおよびΦであっ
た（それぞれ78,700〜101,000M-1cm-1および0.56〜0.61
の範囲）（表１）。次に、４つのYFPを産生する大腸菌
クローンを37℃で培養し、細胞懸濁物の蛍光強度を比較
した（図１Ｂ）。F46Lは37℃においてYFPの成熟を大い
に促進した。図１Ｂは対数増殖期における１つの時点で
の相対蛍光強度を示すが、12時間のインキュベーション
後の細胞ペレットの蛍光強度は、EYFPに比べEYFP-F46L
の方が約20倍増大した。
にYFP変異体（EYFP-V68L/Q69K）から加工されたもので
あるため（Miyawaki, A.,他 (1999) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96, 2135-2140）、F46LがYFPに関しても成熟
効率を増大させるかどうかに興味をもった。F46Lの効果
を、最もよく使用されるYFP変異体であるEYFP（S65G/S7
2A/V68L/T203Y）において調べた。YFP変異体（S65G/S72
A/V68L/T203Y）（Wachter, R.M.,他(1999) Structure
6, 1267-1277）の結晶構造において、Phe-46のベンゼン
環は発色団の一部であるイミダゾリノンと隣接してい
る。F46LはYFPの発色団形成に影響を及ぼしていると考
えられる。F46Lの作用と共に、周知の折りたたみ変異で
あるF64L/M153T/V163A/T203YのEYFPに対する影響を調べ
た。なお、他のGFP変異体において折りたたみ効率を増
大させることは示唆されていたが、YFP変異体にこれら
の変異を導入する試みの報告はなかった。複数部位変異
誘発法に関するプロトコール（Sawano, A.他(2000) Nuc
leic Acids Research 28, e78）を用いて、４つの一般
的な折りたたみ変異を一度に全てEYFPに導入してSEYFP
（スーパーEYFP）（EYFP-F64L/M153T/V163A/S175G）を
作製した。続いて、F46LをEYFPおよびSEYFPに導入する
ことによりそれぞれEYFP-F46LおよびSEYFP-F46Lを得
た。最初に、これら４つのYFP変異体を大腸菌において
室温で産生させて、精製のために十分に成熟させた。精
製したYFP変異体は、正確に同一の励起スペクトルおよ
び発光スペクトルを示し、ほぼ同等のεおよびΦであっ
た（それぞれ78,700〜101,000M-1cm-1および0.56〜0.61
の範囲）（表１）。次に、４つのYFPを産生する大腸菌
クローンを37℃で培養し、細胞懸濁物の蛍光強度を比較
した（図１Ｂ）。F46Lは37℃においてYFPの成熟を大い
に促進した。図１Ｂは対数増殖期における１つの時点で
の相対蛍光強度を示すが、12時間のインキュベーション
後の細胞ペレットの蛍光強度は、EYFPに比べEYFP-F46L
の方が約20倍増大した。
【００６５】
【表１】
【００６６】Venus：37℃におけるYFPの最良の成熟形態 折りたたみ効率は、成熟発色団を用いた尿素変性蛋白質
の再生の際の蛍光獲得をモニタリングすることにより、
37℃にて評価した（Reid, B.G.他 (1997) Biochemistry
36, 6786-6791）。蛋白質は再生するに従い、成熟して
いる発色団がGFPのβバレル内に取り込まれて、蛍光が
回復する（図１Ｃ）。EYFPの蛍光回復率は、変性前の蛍
光強度から判断して30％未満であり、このことは変性処
置により多量の不溶性凝集物が形成することを示唆して
いる。全てのYFP変異体の再生は既報の通り２つの異な
る反応速度段階を介して進行した（Reid, B.G.他 (199
7)Biochemistry 36, 6786-6791）。初期段階の１次速度
定数はYFP変異体の中で様々であった（表１）。SEYFPお
よびSEYFP-F46Lはいずれも変異F64L/M153T/V163A/S175G
を含有し、それぞれ速度定数（Kfold）6.60×10-2S-1お
よび5.62×10-2S-1で非常に急速に回復した。F46L単独
の場合にはEYFPおよびSEYFPの回復速度および回復率が
高まるが、その影響は一般的な折りたたみ変異の影響よ
りも弱かった。変異F64L/M153T/V163A/S175Gは、37℃で
YFPの折りたたみを促進させるのに有意に効果があると
の結論になった。
の再生の際の蛍光獲得をモニタリングすることにより、
37℃にて評価した（Reid, B.G.他 (1997) Biochemistry
36, 6786-6791）。蛋白質は再生するに従い、成熟して
いる発色団がGFPのβバレル内に取り込まれて、蛍光が
回復する（図１Ｃ）。EYFPの蛍光回復率は、変性前の蛍
光強度から判断して30％未満であり、このことは変性処
置により多量の不溶性凝集物が形成することを示唆して
いる。全てのYFP変異体の再生は既報の通り２つの異な
る反応速度段階を介して進行した（Reid, B.G.他 (199
7)Biochemistry 36, 6786-6791）。初期段階の１次速度
定数はYFP変異体の中で様々であった（表１）。SEYFPお
よびSEYFP-F46Lはいずれも変異F64L/M153T/V163A/S175G
を含有し、それぞれ速度定数（Kfold）6.60×10-2S-1お
よび5.62×10-2S-1で非常に急速に回復した。F46L単独
の場合にはEYFPおよびSEYFPの回復速度および回復率が
高まるが、その影響は一般的な折りたたみ変異の影響よ
りも弱かった。変異F64L/M153T/V163A/S175Gは、37℃で
YFPの折りたたみを促進させるのに有意に効果があると
の結論になった。
【００６７】次に、尿素変性YFPの発色団を5mM次亜硫酸
塩を用いて還元した（Reid, B.G.他 (1997) Biochemist
ry 36, 6786-6791）。37℃において、尿素も次亜硫酸塩
も含有しないバッファーで希釈することにより再生およ
び再酸化を開始した。酸化は最も遅い過程であるため、
観察された蛍光回復の全体の速度は、環化発色団の酸化
速度を表すはずである。それらの初期段階の速度定数
（KoxS）を比較した（図１Ｄ）。SEYFPおよびSEYFP-F46
Lは同様のKfoldSを示したが、37℃における変性／還元
蛋白質からの再生速度および再生率は、F46Lにより有意
に改善された（図１Ｄ；表１におけるKox値、2.36×10
-3S-1対8.04×10-3S-1）。興味深いことに、この改善
は、実験を室温で行った場合には明確には観察されなか
った。またEYFP-F46Lは37℃においてSEYFPよりも速い再
酸化を示した（図１Ｄ）。封入体から再生されたYFPの
蛍光獲得速度から、de novo成熟（内部トリペプチドの
環化過程を含む）の速度論を得られるが（Reid, B.G.
他 (1997) Biochemistry 36, 6786-6791）、SEYFP及びS
EYFP-F46Lは細胞溶解後に不溶性ペレットからほとんど
単離されなかった。F46Lが環化に及ぼす影響を調べなか
ったが、上記の結果は、F46Lが酸化過程を促進し、37℃
においてYFPの蛍光発生の増大が導かれることを示して
いる。多分、Leu-46の側鎖は、酸素の接近可能性を促進
するだけではなく、発生した蛋白質の酸化反応に好まし
い立体配置状態への折りたたみをも促進している。この
議論は、F46L単独でも尿素変性蛋白質の再生が促進され
る（図１Ｃ）という事実と一致する。この点に関して、
折りたたみおよび発色団形成は共働的に生じるものと考
えるべきである。
塩を用いて還元した（Reid, B.G.他 (1997) Biochemist
ry 36, 6786-6791）。37℃において、尿素も次亜硫酸塩
も含有しないバッファーで希釈することにより再生およ
び再酸化を開始した。酸化は最も遅い過程であるため、
観察された蛍光回復の全体の速度は、環化発色団の酸化
速度を表すはずである。それらの初期段階の速度定数
（KoxS）を比較した（図１Ｄ）。SEYFPおよびSEYFP-F46
Lは同様のKfoldSを示したが、37℃における変性／還元
蛋白質からの再生速度および再生率は、F46Lにより有意
に改善された（図１Ｄ；表１におけるKox値、2.36×10
-3S-1対8.04×10-3S-1）。興味深いことに、この改善
は、実験を室温で行った場合には明確には観察されなか
った。またEYFP-F46Lは37℃においてSEYFPよりも速い再
酸化を示した（図１Ｄ）。封入体から再生されたYFPの
蛍光獲得速度から、de novo成熟（内部トリペプチドの
環化過程を含む）の速度論を得られるが（Reid, B.G.
他 (1997) Biochemistry 36, 6786-6791）、SEYFP及びS
EYFP-F46Lは細胞溶解後に不溶性ペレットからほとんど
単離されなかった。F46Lが環化に及ぼす影響を調べなか
ったが、上記の結果は、F46Lが酸化過程を促進し、37℃
においてYFPの蛍光発生の増大が導かれることを示して
いる。多分、Leu-46の側鎖は、酸素の接近可能性を促進
するだけではなく、発生した蛋白質の酸化反応に好まし
い立体配置状態への折りたたみをも促進している。この
議論は、F46L単独でも尿素変性蛋白質の再生が促進され
る（図１Ｃ）という事実と一致する。この点に関して、
折りたたみおよび発色団形成は共働的に生じるものと考
えるべきである。
【００６８】SEYFP-F46Lは37℃において非常に効率的に
折りたたまれ、発色団を形成し、最も鮮明な黄色光を与
えるものである。本書中、この変異体を「Venus」とも
称する。
折りたたまれ、発色団を形成し、最も鮮明な黄色光を与
えるものである。本書中、この変異体を「Venus」とも
称する。
【００６９】Venusのプロトンおよび塩化物イオンに対
する低感受性 YFPの発色団のプロトン付加およびCl-結合は共同的であ
る（Wachter, R.M.,他(2000) J. Mol. Biol. 301, 157-
171）。従って、４つのYFP変異体のH+およびCl-に対す
る感受性を調べた。pH滴定のために、35mMの[Cl-]（Cl-
濃度）を含有するバッファーを使用した。pH滴定曲線を
図１Ｅに示す。EYEPのpKaは6.9であり、生細胞中の蛍光
の定量的測定がpHに関連する人工物により障害を受ける
ことを示している。変異F46Lの付加してもEYFPのpH感受
性は変化しなかった。一方、SEYFPおよびVenusによって
滴定曲線のpKaが6.0となった。従って、F64L/M153T/V16
3A/S175Gのいくつかの変異によってYFPのpH感受性が低
減したものと考えられる。
する低感受性 YFPの発色団のプロトン付加およびCl-結合は共同的であ
る（Wachter, R.M.,他(2000) J. Mol. Biol. 301, 157-
171）。従って、４つのYFP変異体のH+およびCl-に対す
る感受性を調べた。pH滴定のために、35mMの[Cl-]（Cl-
濃度）を含有するバッファーを使用した。pH滴定曲線を
図１Ｅに示す。EYEPのpKaは6.9であり、生細胞中の蛍光
の定量的測定がpHに関連する人工物により障害を受ける
ことを示している。変異F46Lの付加してもEYFPのpH感受
性は変化しなかった。一方、SEYFPおよびVenusによって
滴定曲線のpKaが6.0となった。従って、F64L/M153T/V16
3A/S175Gのいくつかの変異によってYFPのpH感受性が低
減したものと考えられる。
【００７０】図１Ｆは、pH7.0における[Cl-]の増大とYF
Pの蛍光との依存関係を示す。EYFPおよびEYFP-F46LはCl
-に対し感受性であり、それぞれKd値が110mMおよび145m
Mであった。対照的に、SEYFPおよびVenusはアニオンに
対して感受性が低かった。pH7.0での生理学的な[Cl-]の
範囲内（150mM以下）において、それらの蛍光は影響を
受けなかった。従って、変異F64L/M153T/V163A/S175Gの
導入は、Cl-感受性を排除するのに有効であった。変異
のうちV163Aは重要であると考えられる。なぜなら、Val
163の側鎖がYFPの変異体のアニオン結合空隙の整列に関
与していることが示されているからである（Wachter,
R.M.,他 (2000) J. Mol. Biol. 301, 157-171）。
Pの蛍光との依存関係を示す。EYFPおよびEYFP-F46LはCl
-に対し感受性であり、それぞれKd値が110mMおよび145m
Mであった。対照的に、SEYFPおよびVenusはアニオンに
対して感受性が低かった。pH7.0での生理学的な[Cl-]の
範囲内（150mM以下）において、それらの蛍光は影響を
受けなかった。従って、変異F64L/M153T/V163A/S175Gの
導入は、Cl-感受性を排除するのに有効であった。変異
のうちV163Aは重要であると考えられる。なぜなら、Val
163の側鎖がYFPの変異体のアニオン結合空隙の整列に関
与していることが示されているからである（Wachter,
R.M.,他 (2000) J. Mol. Biol. 301, 157-171）。
【００７１】pHの低減によってYFPの511 nmにおける吸
光度が低くなる。また、Cl- によって、Φに影響を及ぼ
すことなくYFPの吸光度は低減した。Cl- によるYFP蛍光
の衝突（collisional）消光の証拠は全くない（Wachte
r, R.M.,他 (2000) J. Mol. Biol. 301, 157-171）。YF
Pは、FRETのアクセプターとして、ドナーとしてのCFPと
組み合わせて使用されることが多い（Tsien, R.Y. 他
(1998) Science 280, 1954-1955）。アクセプターの吸
光度はFRET効率を決定する重要な因子の１つであるた
め、YFPのpHおよびCl- 感受性は、FRETの信頼性のある
シグナルを獲得するために最小限に抑える必要がある
（Miyawaki, A.他 (2000) Methods Enzymol. 327, 472-
500）。成熟効率は別にしても、VenusはEYFPよりもFRET
受容体として適切である。
光度が低くなる。また、Cl- によって、Φに影響を及ぼ
すことなくYFPの吸光度は低減した。Cl- によるYFP蛍光
の衝突（collisional）消光の証拠は全くない（Wachte
r, R.M.,他 (2000) J. Mol. Biol. 301, 157-171）。YF
Pは、FRETのアクセプターとして、ドナーとしてのCFPと
組み合わせて使用されることが多い（Tsien, R.Y. 他
(1998) Science 280, 1954-1955）。アクセプターの吸
光度はFRET効率を決定する重要な因子の１つであるた
め、YFPのpHおよびCl- 感受性は、FRETの信頼性のある
シグナルを獲得するために最小限に抑える必要がある
（Miyawaki, A.他 (2000) Methods Enzymol. 327, 472-
500）。成熟効率は別にしても、VenusはEYFPよりもFRET
受容体として適切である。
【００７２】即ち、Venusは、２種の変異（すなわち、
i）変異F46Lによる37℃における発色団の改良された成
熟；並びに、ii）１つの変異セットF64L/M153T/V163A/S
175Gによる、37℃における改良された折りたたみと、H+
およびCl- による消光の低減）により、最も一般的なYF
PであるEYFPよりも輝度が高い。
i）変異F46Lによる37℃における発色団の改良された成
熟；並びに、ii）１つの変異セットF64L/M153T/V163A/S
175Gによる、37℃における改良された折りたたみと、H+
およびCl- による消光の低減）により、最も一般的なYF
PであるEYFPよりも輝度が高い。
【００７３】Venusを用いたPC12細胞における分泌性高
密度コア顆粒の蛍光標識 分泌性オルガネラは酸性環境を有し、大部分が高密度コ
ア蛋白質マトリックスである。従って、GFPによるオル
ガネラの蛍光標識は比較的難しい。改善された光学特性
および成熟特性を有するGFP変異体、例えばEGFP（増強G
FP, Clontech）は、PC12細胞の高密度コア分泌顆粒（La
ng, T., 他 (1997) Neuron 18, 857-863）およびINS-1
β細胞の巨大高密度コア分泌小胞（Tsuboi, T.,他 (200
0) Curr.Biol. 10, 1307-1310）にターゲティングした
が、GFPの蛍光とオルガネラに対する特異的ないくつか
のマーカーとの共局在性は不完全であった。これは、オ
ルガネラ中の組換え蛍光蛋白質のターゲティングに誤り
が生じていたり、該蛋白質が非蛍光性であることを示唆
している。
密度コア顆粒の蛍光標識 分泌性オルガネラは酸性環境を有し、大部分が高密度コ
ア蛋白質マトリックスである。従って、GFPによるオル
ガネラの蛍光標識は比較的難しい。改善された光学特性
および成熟特性を有するGFP変異体、例えばEGFP（増強G
FP, Clontech）は、PC12細胞の高密度コア分泌顆粒（La
ng, T., 他 (1997) Neuron 18, 857-863）およびINS-1
β細胞の巨大高密度コア分泌小胞（Tsuboi, T.,他 (200
0) Curr.Biol. 10, 1307-1310）にターゲティングした
が、GFPの蛍光とオルガネラに対する特異的ないくつか
のマーカーとの共局在性は不完全であった。これは、オ
ルガネラ中の組換え蛍光蛋白質のターゲティングに誤り
が生じていたり、該蛋白質が非蛍光性であることを示唆
している。
【００７４】本実施例では、神経ペプチドY（NPY）のＣ
末端に融合させたVenusをコードする哺乳動物発現プラ
スミドを構築し、NPY-Venusを産生した。このキメラ蛋
白質の機能は、次の２つの観点に従ってNPY-EGFPの機能
と比較して調べた。第１は、NPY融合蛋白質はどの程度
特異的に分泌性高密度コア顆粒にターゲティングするか
であり、第２は、正確にターゲティングされたNPY-融合
蛋白質はどの程度効率的に蛍光を発するかである。
末端に融合させたVenusをコードする哺乳動物発現プラ
スミドを構築し、NPY-Venusを産生した。このキメラ蛋
白質の機能は、次の２つの観点に従ってNPY-EGFPの機能
と比較して調べた。第１は、NPY融合蛋白質はどの程度
特異的に分泌性高密度コア顆粒にターゲティングするか
であり、第２は、正確にターゲティングされたNPY-融合
蛋白質はどの程度効率的に蛍光を発するかである。
【００７５】トランスフェクトしたPC12細胞は、神経成
長因子（NGF）による処理により、分化させ神経突起を
伸長させた。図２Ａは、NPY-Venusを発現する６つの細
胞の広視野の蛍光顕微鏡写真を示す。典型的な高倍率画
像を図２Ｂに示す。NYP-Venusからの光輝かつ点状の蛍
光は、高密度コア顆粒に富む神経突起に濃縮されている
ことが観察され、このことはNPY-Venusの正確なターゲ
ティングを示している。カバースリップ上でNPY-Venus
を発現する蛍光細胞のほとんど全てが類似の蛍光パター
ンを示したことに留意すべきである。対照的に、NPY-EG
FPを発現するPC12細胞は３つの別個のパターンを示し
た。約60％の蛍光細胞が、輝く神経突起（図２Ｃ；中央
の細胞）を有し、点状の蛍光パターンは高倍率顕微鏡写
真（図２Ｄ）により確認された。残りの40％の細胞は、
輝く網様のスポット（図２Ｃ、矢印で示す；図２Ｅ）ま
たは管状物（図２Ｆ）の、細胞質ゾル全体に渡るぼんや
りとした蛍光を示した。これは、NPY-EGFPのターゲティ
ングの誤りを示している。おそらくEGFPの異常な折りた
たみが、神経ペプチドの適切なプロセシングに影響を及
ぼしている。
長因子（NGF）による処理により、分化させ神経突起を
伸長させた。図２Ａは、NPY-Venusを発現する６つの細
胞の広視野の蛍光顕微鏡写真を示す。典型的な高倍率画
像を図２Ｂに示す。NYP-Venusからの光輝かつ点状の蛍
光は、高密度コア顆粒に富む神経突起に濃縮されている
ことが観察され、このことはNPY-Venusの正確なターゲ
ティングを示している。カバースリップ上でNPY-Venus
を発現する蛍光細胞のほとんど全てが類似の蛍光パター
ンを示したことに留意すべきである。対照的に、NPY-EG
FPを発現するPC12細胞は３つの別個のパターンを示し
た。約60％の蛍光細胞が、輝く神経突起（図２Ｃ；中央
の細胞）を有し、点状の蛍光パターンは高倍率顕微鏡写
真（図２Ｄ）により確認された。残りの40％の細胞は、
輝く網様のスポット（図２Ｃ、矢印で示す；図２Ｅ）ま
たは管状物（図２Ｆ）の、細胞質ゾル全体に渡るぼんや
りとした蛍光を示した。これは、NPY-EGFPのターゲティ
ングの誤りを示している。おそらくEGFPの異常な折りた
たみが、神経ペプチドの適切なプロセシングに影響を及
ぼしている。
【００７６】正確にターゲティングされたNPY-EGFPによ
って検出可能な蛍光が得られたが、その強度はNPY-Venu
sの蛍光よりも約１０倍低く、画像を得るための露出時
間は図２Ｂに関しては１００ミリ秒および図２Ｄに関し
ては１．０秒であった。NPY-Venusを含有する顆粒の輝
度は、改善されたVenusの成熟率または顆粒中のNYP-Ven
usの存在量のいずれかに起因するものであった。この２
つの可能性を区別するために、高密度コア顆粒に正確に
ターゲティングした組換え蛋白質の量を免疫組織化学的
に定量化した。pVenus-N1-NPYおよびpEGFP-N1-NPYを用
いてトランスフェクトしたPC12細胞を固定化し、抗GFP
抗体およびAlexa562結合２次抗体を用いて免疫染色法を
行った。VenusおよびEGFPからの緑色蛍光シグナルは、G
FP観察のための一般的なフィルターセットを用いて捕捉
し（それぞれ図２Ｇおよび２Ｊ）、Alexa562の赤色蛍光
は別のフィルターセットを用いて検出した（図２Ｈおよ
び２Ｋ）。図２Ｇおよび２Ｊまたは図２Ｈおよび２Ｋの
画像は、同じ光学条件下で撮り、同じグレースケールで
示す。同量の組換え蛋白質（図２Ｈおよび２Ｋ）にも関
わらず、Venusの蛍光は明確に可視化された一方（図２
Ｇ）、EGFPの蛍光はほとんど検出されなかった（図２
Ｊ）。組換え蛋白質１分子当たりの蛍光強度は、擬色比
画像において示し（図２Ｉおよび２Ｌ）、これは緑色蛍
光シグナルを免疫蛍光シグナルで割ることにより得た。
これらの結果は、Venusが成熟して、高密度コア顆粒に
おいてEGFPよりも効率的に蛍光を発しうることを示して
いる。
って検出可能な蛍光が得られたが、その強度はNPY-Venu
sの蛍光よりも約１０倍低く、画像を得るための露出時
間は図２Ｂに関しては１００ミリ秒および図２Ｄに関し
ては１．０秒であった。NPY-Venusを含有する顆粒の輝
度は、改善されたVenusの成熟率または顆粒中のNYP-Ven
usの存在量のいずれかに起因するものであった。この２
つの可能性を区別するために、高密度コア顆粒に正確に
ターゲティングした組換え蛋白質の量を免疫組織化学的
に定量化した。pVenus-N1-NPYおよびpEGFP-N1-NPYを用
いてトランスフェクトしたPC12細胞を固定化し、抗GFP
抗体およびAlexa562結合２次抗体を用いて免疫染色法を
行った。VenusおよびEGFPからの緑色蛍光シグナルは、G
FP観察のための一般的なフィルターセットを用いて捕捉
し（それぞれ図２Ｇおよび２Ｊ）、Alexa562の赤色蛍光
は別のフィルターセットを用いて検出した（図２Ｈおよ
び２Ｋ）。図２Ｇおよび２Ｊまたは図２Ｈおよび２Ｋの
画像は、同じ光学条件下で撮り、同じグレースケールで
示す。同量の組換え蛋白質（図２Ｈおよび２Ｋ）にも関
わらず、Venusの蛍光は明確に可視化された一方（図２
Ｇ）、EGFPの蛍光はほとんど検出されなかった（図２
Ｊ）。組換え蛋白質１分子当たりの蛍光強度は、擬色比
画像において示し（図２Ｉおよび２Ｌ）、これは緑色蛍
光シグナルを免疫蛍光シグナルで割ることにより得た。
これらの結果は、Venusが成熟して、高密度コア顆粒に
おいてEGFPよりも効率的に蛍光を発しうることを示して
いる。
【００７７】NPY-Venusの分泌に関する効率的モニタリ
ングおよび動的な可視化 NPY-Venusによって、PC12細胞の高密度コア顆粒のエキ
ソサイトーシスを理解するための２つの実験が可能とな
った。先ず、NPY-Venusの脱分極により誘導される分泌
を、培地の蛍光増大ならびに細胞性蛍光の消失を測定す
ることによりモニタリングした（図３Ａ）。これは、NP
Y-Venusによって、培養したPC12細胞の大集団の高密度
コア顆粒の特異的かつ強力な標識が得られるためであ
る。このような集団アッセイは、既報のプロインスリン
-GFPの使用ではほとんど不可能である。通常の生化学ま
たは電気生理学的アプローチ（Angleson, J. K.他 (199
7) Trends Neurosci. 20, 281-187）とは対照的に、培
地中に分泌されたNPY-Venusの蛍光測定によって、PC12
細胞のエキソサイトーシスの簡便、迅速かつ効率的なモ
ニタリングが可能となる。脱分極の30分後に、分泌され
たNPY-Venusの量は合計の約40％に達し、この分泌は、
細胞外および細胞内の両方のCa2+がEGTAおよびBAPTA-AM
によりキレート化された場合に妨げられた（図３Ｂ）。
分泌の時間プロフィールも容易に取得され、これにより
分泌の50％が最初の５分以内で起こったことが明らかと
なった（図３Ｃ）。
ングおよび動的な可視化 NPY-Venusによって、PC12細胞の高密度コア顆粒のエキ
ソサイトーシスを理解するための２つの実験が可能とな
った。先ず、NPY-Venusの脱分極により誘導される分泌
を、培地の蛍光増大ならびに細胞性蛍光の消失を測定す
ることによりモニタリングした（図３Ａ）。これは、NP
Y-Venusによって、培養したPC12細胞の大集団の高密度
コア顆粒の特異的かつ強力な標識が得られるためであ
る。このような集団アッセイは、既報のプロインスリン
-GFPの使用ではほとんど不可能である。通常の生化学ま
たは電気生理学的アプローチ（Angleson, J. K.他 (199
7) Trends Neurosci. 20, 281-187）とは対照的に、培
地中に分泌されたNPY-Venusの蛍光測定によって、PC12
細胞のエキソサイトーシスの簡便、迅速かつ効率的なモ
ニタリングが可能となる。脱分極の30分後に、分泌され
たNPY-Venusの量は合計の約40％に達し、この分泌は、
細胞外および細胞内の両方のCa2+がEGTAおよびBAPTA-AM
によりキレート化された場合に妨げられた（図３Ｂ）。
分泌の時間プロフィールも容易に取得され、これにより
分泌の50％が最初の５分以内で起こったことが明らかと
なった（図３Ｃ）。
【００７８】第２に、小さな単一蛍光高密度コア顆粒の
動特性を、エバネッセント波顕微鏡を使用し、時間的お
よび空間的に高解像で、NGF処理PC12細胞中で観察し
た。同様のエバネッセント波場蛍光画像化を、ヒトクロ
モグラニンＢに融合させたGFP突然変異体（GFPmut2）を
用いて行った（Lang, T., 他 (1997) Neuron 18, 857-8
63）。しかし、それらの画像は、未分化のPC12細胞中で
0.5 Hzにて大きな顆粒（直径約0.5μm）を観察したにす
ぎない。対照的に、本実施例においては、顆粒をサイズ
が低減した高密度コア顆粒（直径約0.2μm）になるよう
分化させた。NPY-Venusによる鮮明な標識のおかげで、
通常の冷却CCDカメラを用い、ビニングなしの場合は１
０Ｈｚで、ビニング２の場合はビデオレート（３０Ｈ
ｚ）で、このような小顆粒を見ることができた。図３Ｄ
〜Ｆは、脱分極により誘導された単一のエキソサイトー
シス事象を示す連続的画像である。原形質膜におけるド
ッキング後に、高密度コア顆粒中のNPY-Venusの蛍光
（図３Ｄにて矢印で示す）は、培地中に噴出し（図３
Ｅ）、続いて消滅した（図３Ｆ）。
動特性を、エバネッセント波顕微鏡を使用し、時間的お
よび空間的に高解像で、NGF処理PC12細胞中で観察し
た。同様のエバネッセント波場蛍光画像化を、ヒトクロ
モグラニンＢに融合させたGFP突然変異体（GFPmut2）を
用いて行った（Lang, T., 他 (1997) Neuron 18, 857-8
63）。しかし、それらの画像は、未分化のPC12細胞中で
0.5 Hzにて大きな顆粒（直径約0.5μm）を観察したにす
ぎない。対照的に、本実施例においては、顆粒をサイズ
が低減した高密度コア顆粒（直径約0.2μm）になるよう
分化させた。NPY-Venusによる鮮明な標識のおかげで、
通常の冷却CCDカメラを用い、ビニングなしの場合は１
０Ｈｚで、ビニング２の場合はビデオレート（３０Ｈ
ｚ）で、このような小顆粒を見ることができた。図３Ｄ
〜Ｆは、脱分極により誘導された単一のエキソサイトー
シス事象を示す連続的画像である。原形質膜におけるド
ッキング後に、高密度コア顆粒中のNPY-Venusの蛍光
（図３Ｄにて矢印で示す）は、培地中に噴出し（図３
Ｅ）、続いて消滅した（図３Ｆ）。
【００７９】CFPとVenusとの間のFRETのシグナルの直接
検出 GFPを用いたFRETのために、アクセプターGFPがドナーGF
Pよりも効率的に成熟することが好ましい。そうでない
と、過剰なドナー分子によって、FRETに関与しないドナ
ーからの発光によるFRETシグナルの希釈が生じる。黄色
カメレオン（Yellow cameleon；YC）は、CFP、カルモジ
ュリン、グリシルグリシンリンカー、ミオシン軽鎖キナ
ーゼのカルモジュリン結合ドメイン（M13）、およびYFP
から構成されるCa2+指示蛋白質である（Miyawaki, A.,
他 (1997). Nature 388, 882-887）。ドナーおよびアク
セプターの化学量論比は遺伝子レベルでは１：１である
が、YC3.1のアクセプターであるEYFP-V68L/Q69Kは37℃
または特定のオルガネラにおいてほとんど成熟しない
（Miyawaki, A., 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.US
A 96, 2135-2140）。YCのシグナルを全ての状況におい
て効率的に獲得するために、YC3.1のEYFP-V68L/Q69KをV
enusで置換することによりYC3.12を作製した。YC3.12お
よびYC3.1を産生する細菌サンプルを37℃で増殖させ、
それらの435nmでの励起による発光スペクトルを比較し
た（図４Ａ）。産生されたYC3.12の発光スペクトルは、
完全成熟形態の黄色カメレオンのスペクトルと等しく、
このことはYC3.12蛋白質がCa2+指示物質として作用する
能力があることを示している。対照的に、YC3.1は37℃
において成熟 EYFP-V68L/Q69Kを有しなかった。YC3.12
におけるVenusの効率的な成熟は、YC3.1におけるEYFP-V
68L/Q69Kの成熟と比較した場合にHeLa細胞においても確
認された（図４Ｂおよび４Ｃ）。Venusは遺伝子トラン
スフェクションの開始５時間後に強力な蛍光を発した。
次に、YC3.12のCa2+シグナルがどの程度の時間で検出可
能となるかに関心を持った。cDNAおよびSuperfect（Qia
gen）試薬と一緒に5.0時間HeLa 細胞をインキュベート
した後、大きな動的範囲でヒスタミン誘導性Ca2+を観察
することができ（図４Ｄ）、これは黄色カメレオンの通
常の性質と十分に一致している（Miyawaki, A.,他(199
9) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）。対照
的に、YC3.1は同条件下でほんのわずかなシグナルしか
示さなかった（図４Ｅ）。YC3.12の使用によって、時間
的制約を免れることができ、例えば、遺伝子銃を用いた
遺伝子導入後にマウスまたはラットの脳から即座にとっ
た切片の新鮮なニューロン細胞からの、Ca2+シグナルの
迅速な検出が可能となる。
検出 GFPを用いたFRETのために、アクセプターGFPがドナーGF
Pよりも効率的に成熟することが好ましい。そうでない
と、過剰なドナー分子によって、FRETに関与しないドナ
ーからの発光によるFRETシグナルの希釈が生じる。黄色
カメレオン（Yellow cameleon；YC）は、CFP、カルモジ
ュリン、グリシルグリシンリンカー、ミオシン軽鎖キナ
ーゼのカルモジュリン結合ドメイン（M13）、およびYFP
から構成されるCa2+指示蛋白質である（Miyawaki, A.,
他 (1997). Nature 388, 882-887）。ドナーおよびアク
セプターの化学量論比は遺伝子レベルでは１：１である
が、YC3.1のアクセプターであるEYFP-V68L/Q69Kは37℃
または特定のオルガネラにおいてほとんど成熟しない
（Miyawaki, A., 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.US
A 96, 2135-2140）。YCのシグナルを全ての状況におい
て効率的に獲得するために、YC3.1のEYFP-V68L/Q69KをV
enusで置換することによりYC3.12を作製した。YC3.12お
よびYC3.1を産生する細菌サンプルを37℃で増殖させ、
それらの435nmでの励起による発光スペクトルを比較し
た（図４Ａ）。産生されたYC3.12の発光スペクトルは、
完全成熟形態の黄色カメレオンのスペクトルと等しく、
このことはYC3.12蛋白質がCa2+指示物質として作用する
能力があることを示している。対照的に、YC3.1は37℃
において成熟 EYFP-V68L/Q69Kを有しなかった。YC3.12
におけるVenusの効率的な成熟は、YC3.1におけるEYFP-V
68L/Q69Kの成熟と比較した場合にHeLa細胞においても確
認された（図４Ｂおよび４Ｃ）。Venusは遺伝子トラン
スフェクションの開始５時間後に強力な蛍光を発した。
次に、YC3.12のCa2+シグナルがどの程度の時間で検出可
能となるかに関心を持った。cDNAおよびSuperfect（Qia
gen）試薬と一緒に5.0時間HeLa 細胞をインキュベート
した後、大きな動的範囲でヒスタミン誘導性Ca2+を観察
することができ（図４Ｄ）、これは黄色カメレオンの通
常の性質と十分に一致している（Miyawaki, A.,他(199
9) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）。対照
的に、YC3.1は同条件下でほんのわずかなシグナルしか
示さなかった（図４Ｅ）。YC3.12の使用によって、時間
的制約を免れることができ、例えば、遺伝子銃を用いた
遺伝子導入後にマウスまたはラットの脳から即座にとっ
た切片の新鮮なニューロン細胞からの、Ca2+シグナルの
迅速な検出が可能となる。
【００８０】
【発明の効果】本発明により、良好な成熟効率を有し、
またpHおよびCl-の両方に対する感受性を低減させた新
規なGFP又はYEP変異体が提供されることになった。
またpHおよびCl-の両方に対する感受性を低減させた新
規なGFP又はYEP変異体が提供されることになった。
【００８１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Fluorescent proteins <130> A11247MA <160> 5
【００８２】 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant Protein <400> 1 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235
【００８３】 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant Protein <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235
【００８４】 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant Protein <400> 3 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235
【００８５】 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant DNA <400> 4 atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235
【００８６】 <210> 5 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant DNA <400> 5 atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ttc ggc tac ggc ctg cag tgc ttc gcc cgc tac ccc gac cac atg aag 240 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc tac cag tcc gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235
【図１】図１は、YFP変異体の蛍光特性の比較特性評価
を示す。（Ａ）37℃において大腸菌で産生されたラシオ
メトリックペリカム（rペリカム）の蛍光発光スペクト
ルを示す。（Ｂ）37℃において大腸菌で産生されたYFP
変異体：すなわちEYFP、EYFP-F46L、SEYFP、SEYFP-F46L
（Venus）の蛍光発光スペクトルを示す。（Ｃおよび
Ｄ）４つのYFP変異体の、それらの変性状態（Ｃ）およ
び変性／還元状態（Ｄ）からの蛍光回復の時間経過を示
す。EYFP（上向き三角）、EYFP-F46L（菱形）、SEYFP
（下向き三角）およびSEYFP-F46L（＝Venus）（丸）の
蛍光のpH感受性（Ｅ）および塩化物感受性（Ｆ）を示
す。
を示す。（Ａ）37℃において大腸菌で産生されたラシオ
メトリックペリカム（rペリカム）の蛍光発光スペクト
ルを示す。（Ｂ）37℃において大腸菌で産生されたYFP
変異体：すなわちEYFP、EYFP-F46L、SEYFP、SEYFP-F46L
（Venus）の蛍光発光スペクトルを示す。（Ｃおよび
Ｄ）４つのYFP変異体の、それらの変性状態（Ｃ）およ
び変性／還元状態（Ｄ）からの蛍光回復の時間経過を示
す。EYFP（上向き三角）、EYFP-F46L（菱形）、SEYFP
（下向き三角）およびSEYFP-F46L（＝Venus）（丸）の
蛍光のpH感受性（Ｅ）および塩化物感受性（Ｆ）を示
す。
【図２】図２は、NPY-Venus（ＡおよびＢ）ならびにNPY
-EGFP（Ｃ〜Ｆ）を発現するPC12細胞の蛍光顕微鏡写真
を示す。低倍率の顕微鏡写真は、NPY-Venusを発現する
蛍光細胞が全て神経炎において鮮明な蛍光を発した
（Ａ）のに対し、NPY-EGFPの蛍光はいくつかの細胞中の
サイトゾルまたは核周辺領域において検出された（Ｃ、
矢印で示す）ことを示す。正確にターゲティングされた
NPY-Venus（Ｂ）およびNPY-EGFP（Ｄ）、ならびに誤っ
てターゲティングされたNPY-EGFP（ＥおよびＦ）を有す
る細胞の高倍率の顕微鏡写真を示す。NPY融合蛋白質の
正確なターゲティングを示している典型的な細胞におい
ては、それぞれNPY-VenusおよびNPY-EGFPからの緑色蛍
光シグナル（ＧおよびＪ）ならびに赤色免疫蛍光シグナ
ル（ＨおよびＫ）が検出された。画像の緑色と赤色との
比は、NPY-Venus（Ｉ）およびNPY-EGFP（Ｌ）に対する
擬色で示される。スケールバー＝10μm。
-EGFP（Ｃ〜Ｆ）を発現するPC12細胞の蛍光顕微鏡写真
を示す。低倍率の顕微鏡写真は、NPY-Venusを発現する
蛍光細胞が全て神経炎において鮮明な蛍光を発した
（Ａ）のに対し、NPY-EGFPの蛍光はいくつかの細胞中の
サイトゾルまたは核周辺領域において検出された（Ｃ、
矢印で示す）ことを示す。正確にターゲティングされた
NPY-Venus（Ｂ）およびNPY-EGFP（Ｄ）、ならびに誤っ
てターゲティングされたNPY-EGFP（ＥおよびＦ）を有す
る細胞の高倍率の顕微鏡写真を示す。NPY融合蛋白質の
正確なターゲティングを示している典型的な細胞におい
ては、それぞれNPY-VenusおよびNPY-EGFPからの緑色蛍
光シグナル（ＧおよびＪ）ならびに赤色免疫蛍光シグナ
ル（ＨおよびＫ）が検出された。画像の緑色と赤色との
比は、NPY-Venus（Ｉ）およびNPY-EGFP（Ｌ）に対する
擬色で示される。スケールバー＝10μm。
【図３】図３は、エキソサイトーシス事象の観察を示
す。（Ａ）脱分極（高K+）刺激を与えるかまたは与えな
い場合における培養PC12細胞（黒塗りの棒）および培地
（白抜きの棒）から回復したNPY-VenusまたはNPY-EGFP
の蛍光強度を示す。（Ｂ）脱分極刺激により誘導される
NPY-Venus分泌のCa2+依存性を示す。（Ｃ）脱分極刺激
を与えるかまたは与えない場合における、培地中のNPY-
Venusの蓄積の時間経過を示す。（Ｄ〜Ｆ）NPY-Venusに
より可視化された単一高密度コア顆粒の分泌を示す（Ｄ
において矢印で示す）。画像は、100ミリ秒毎に連続的
に捕獲した。スケールバー＝10μm。
す。（Ａ）脱分極（高K+）刺激を与えるかまたは与えな
い場合における培養PC12細胞（黒塗りの棒）および培地
（白抜きの棒）から回復したNPY-VenusまたはNPY-EGFP
の蛍光強度を示す。（Ｂ）脱分極刺激により誘導される
NPY-Venus分泌のCa2+依存性を示す。（Ｃ）脱分極刺激
を与えるかまたは与えない場合における、培地中のNPY-
Venusの蓄積の時間経過を示す。（Ｄ〜Ｆ）NPY-Venusに
より可視化された単一高密度コア顆粒の分泌を示す（Ｄ
において矢印で示す）。画像は、100ミリ秒毎に連続的
に捕獲した。スケールバー＝10μm。
【図４】図４は、YC3.12（Venusを含む黄色カメレオ
ン）の性能を示す。（Ａ）37℃にてYC3.12およびYC3.1
を産生する細菌サンプルの蛍光発光スペクトルを示す。
（ＢおよびＣ）それぞれYC3.12およびYC3.1の受容体で
あるVenus（Ｂ）およびEYFP-V68L/Q69K（Ｃ）の蛍光発
生を示す。これらの画像は、トランスフェクション試薬
の添加の５時間後に励起フィルター490DF10および発光
フィルター535DF25を用いて取得した。スケールバー＝1
0μm。（ＤおよびＥ）5.0時間にわたる、YC3.12（Ｄ）
およびYC3.1（Ｅ）を発現するHeLa細胞におけるサイト
ゾル非含有Ca2+濃度の測定を示す。535nmと480nmでの発
光比は、５秒毎にサンプリングした。右側の縦座標がR
max（矢印）およびRmin（矢じり）を示す。
ン）の性能を示す。（Ａ）37℃にてYC3.12およびYC3.1
を産生する細菌サンプルの蛍光発光スペクトルを示す。
（ＢおよびＣ）それぞれYC3.12およびYC3.1の受容体で
あるVenus（Ｂ）およびEYFP-V68L/Q69K（Ｃ）の蛍光発
生を示す。これらの画像は、トランスフェクション試薬
の添加の５時間後に励起フィルター490DF10および発光
フィルター535DF25を用いて取得した。スケールバー＝1
0μm。（ＤおよびＥ）5.0時間にわたる、YC3.12（Ｄ）
およびYC3.1（Ｅ）を発現するHeLa細胞におけるサイト
ゾル非含有Ca2+濃度の測定を示す。535nmと480nmでの発
光比は、５秒毎にサンプリングした。右側の縦座標がR
max（矢印）およびRmin（矢じり）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 21/64 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 DA08 EA01 FA01 FA02 FA03 FA06 GA28 GB16 HA01 HA05 JA02 KA02 KA05 KA09 LA03 4B024 AA20 BA80 CA02 DA02 HA01 HA11 4B065 AA90Y AA91X AB01 CA24 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA50 EA50 EA65 FA74
Claims (12)
- 【請求項１】 緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質又はそ
れらの変異体のアミノ酸配列において４６番目のフェニ
ルアラニン残基がロイシン残基に置換していることを特
徴とする、蛍光蛋白質。 - 【請求項２】 さらに緑色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質
又はそれらの変異体のアミノ酸配列において６４番目の
フェニルアラニン残基がロイシン残基に、１５３番目の
メチオニン残基がトレオニン残基に、１６３番目のバリ
ン残基がアラニン残基に、そして１７５番目のセリン残
基がグリシン残基に置換していることを特徴とする、請
求項１に記載の蛍光蛋白質。 - 【請求項３】 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍
光蛋白質。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又
は、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に
おいて１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付
加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質と同等以上の蛍光特性を有す
るアミノ酸配列： - 【請求項４】 請求項１から３の何れかに記載の蛍光蛋
白質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡを有する組み換
えベクター。 - 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡ又は請求項５に
記載の組み換えベクターを有する形質転換体。 - 【請求項７】 請求項１から３の何れかに記載の蛍光蛋
白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。 - 【請求項８】 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質で
ある、請求項７に記載の融合蛋白質。 - 【請求項９】 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋
白質である、請求項７又は８に記載の融合蛋白質。 - 【請求項１０】 請求項７から９の何れかに記載の融合
蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内
における蛋白質の局在または動態を分析する方法。 - 【請求項１１】 請求項１から３の何れかに記載の蛍光
蛋白質をアクセプター蛋白質又はドナー蛋白質として用
いてFRET（蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特
徴とする、生理活性物質の分析方法。 - 【請求項１２】 請求項１から３の何れかに記載の蛍光
蛋白質、請求項４に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の組
み換えベクター、請求項６に記載の形質転換体、又は請
求項７から９の何れかに記載の融合蛋白質を含む、細胞
内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のた
めのキット。
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