JP3208486B2 - 蛍光エネルギー転移を利用する分析物の検出 - Google Patents
蛍光エネルギー転移を利用する分析物の検出Info
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、総合医療科学の国家協会（National Insti
tute of General Medical Science）により付与された
認可番号GM31004及びGM19301、並びに神経性及び伝染性
疾患の国家協会（National lnstitute of Neurological
and Communicable Diseases）により付与された認可番
号NS27177のもとでの政府の援助によりなされた。政府
は本発明において一定の権利を所有する。
tute of General Medical Science）により付与された
認可番号GM31004及びGM19301、並びに神経性及び伝染性
疾患の国家協会（National lnstitute of Neurological
and Communicable Diseases）により付与された認可番
号NS27177のもとでの政府の援助によりなされた。政府
は本発明において一定の権利を所有する。
発明の背景 本発明は分析物濃度を決定するためのフルオロクロム
標識化タンパク質間のエネルギー転移に関し、そしてよ
り詳しくは標識化cAMP依存性タンパク質キナーゼを用い
るcAMP濃度の決定方法に関する。
標識化タンパク質間のエネルギー転移に関し、そしてよ
り詳しくは標識化cAMP依存性タンパク質キナーゼを用い
るcAMP濃度の決定方法に関する。
数多くの生物学的分子の機能はタンパク質及びタンパ
ク質複合体との相互作用を介して仲介されている。数多
くのこのような分子は生存細胞中で非常に微量にて見い
出せる。しかしながらそれらの濃度は生理学的刺激に応
答して過渡的に変化しうる。あらゆる場合において、細
胞の代謝状態、ホルモン応答及び一定の病気を診断する
ためにこのような分子の濃度を測定することが重要であ
る。このような微量濃度にてそのレベルがたとえ数倍変
化したとしても、このような変化は検出不能である。
ク質複合体との相互作用を介して仲介されている。数多
くのこのような分子は生存細胞中で非常に微量にて見い
出せる。しかしながらそれらの濃度は生理学的刺激に応
答して過渡的に変化しうる。あらゆる場合において、細
胞の代謝状態、ホルモン応答及び一定の病気を診断する
ためにこのような分子の濃度を測定することが重要であ
る。このような微量濃度にてそのレベルがたとえ数倍変
化したとしても、このような変化は検出不能である。
タンパク質相互作用を介して生物学的機能を仲介する
あるこのような重要な分子はサイクリックAMP（cAMP、
アデノシン３′,5′−サイクリック一リン酸）である。
サイクリックAMPは全ての原核及び有核動物細胞におい
て、現在までに研究された細胞内反応を調節する。これ
は遍在的な細胞内メディエーターとして、又は種々のホ
ルモン誘発作用の第二メッセンジャーとして働き、この
第一メッセンジャーは細胞外ホルモンである。cAMPレベ
ルの上昇により仲介されるこのようなホルモン誘発作用
には例えば、エピネフリン、副腎皮質刺激ホルモン（AC
TH）、グルカゴン又は甲状腺刺激ホルモン（TSH）によ
り誘発される脂肪組織におけるトリグリセリド分解；バ
ソプレシンによる腎臓における水吸収；筋肉及び肝臓に
おけるグリコーゲン分解；エピネフリンによる心拍数の
増大及び黄体形成ホルモンに対する応答における卵巣に
よるプロゲステロン分泌が含まれる。cAMPに対するこの
ような種々の応答は細胞表層でのホルモン−レセプター
相互作用により誘発され、そしてcAMPの細胞内合成をも
たらす。従って、種々の標的細胞は、異なるが特徴的な
方法においてcAMPレベルにおける上昇に応答する。
あるこのような重要な分子はサイクリックAMP（cAMP、
アデノシン３′,5′−サイクリック一リン酸）である。
サイクリックAMPは全ての原核及び有核動物細胞におい
て、現在までに研究された細胞内反応を調節する。これ
は遍在的な細胞内メディエーターとして、又は種々のホ
ルモン誘発作用の第二メッセンジャーとして働き、この
第一メッセンジャーは細胞外ホルモンである。cAMPレベ
ルの上昇により仲介されるこのようなホルモン誘発作用
には例えば、エピネフリン、副腎皮質刺激ホルモン（AC
TH）、グルカゴン又は甲状腺刺激ホルモン（TSH）によ
り誘発される脂肪組織におけるトリグリセリド分解；バ
ソプレシンによる腎臓における水吸収；筋肉及び肝臓に
おけるグリコーゲン分解；エピネフリンによる心拍数の
増大及び黄体形成ホルモンに対する応答における卵巣に
よるプロゲステロン分泌が含まれる。cAMPに対するこの
ような種々の応答は細胞表層でのホルモン−レセプター
相互作用により誘発され、そしてcAMPの細胞内合成をも
たらす。従って、種々の標的細胞は、異なるが特徴的な
方法においてcAMPレベルにおける上昇に応答する。
cAMPが第二メッセンジャーとして働くためには、その
細胞内濃度は厳びしくコントロールされていなくてはな
らず、且つホルモン−レセプター結合に応答して迅速に
変化可能でなければならない。通常、cAMPレベルは約１
μＭ以下であり、そしてホルモン刺激に基づいて約５倍
に上昇する。cAMPレベルにおける上昇は酵素アデニレー
トサイクラーゼによるATPからの合成に基づく。この過
渡的な上昇に続いて、cAMPレベルはホスホジエステラー
ゼの作用を介して正常レベルにまで急速に戻る。
細胞内濃度は厳びしくコントロールされていなくてはな
らず、且つホルモン−レセプター結合に応答して迅速に
変化可能でなければならない。通常、cAMPレベルは約１
μＭ以下であり、そしてホルモン刺激に基づいて約５倍
に上昇する。cAMPレベルにおける上昇は酵素アデニレー
トサイクラーゼによるATPからの合成に基づく。この過
渡的な上昇に続いて、cAMPレベルはホスホジエステラー
ゼの作用を介して正常レベルにまで急速に戻る。
cAMP依存性ホルモン応答及びその生理学的メカニズム
を効率よく研究するには、微量濃度のcAMPを正確に測定
する必要がある。より本質的には、遊離をcAMP濃度を測
定することが重要であり、なぜなら一般的に細胞内メッ
センジャーの生物学的活性は遊離なメッセンジャーの濃
度によりコントロールされ且つ関連するからであり、組
織破壊後に測定される総濃度は生物学的に無関係な部位
に結合した物質を含んでいる。cAMP濃度を測定する従来
の方法は伝統的な競合アッセイ、例えばラジオイムノア
ッセイを採用しており、そして数千又は数百万個の細胞
からの抽出操作及び調製を必要としている。このような
方法は尖った空間的及び時間的分析をもたらし、そして
全cAMP又は隔絶されたcAMP由来の遊離又は生物学的に活
性なcAMPレベルを区別することができない。更に、これ
らの方法は有害な腐敗し易いアイソトープの利用を必要
とし、そしてそれ故費用がかかる。
を効率よく研究するには、微量濃度のcAMPを正確に測定
する必要がある。より本質的には、遊離をcAMP濃度を測
定することが重要であり、なぜなら一般的に細胞内メッ
センジャーの生物学的活性は遊離なメッセンジャーの濃
度によりコントロールされ且つ関連するからであり、組
織破壊後に測定される総濃度は生物学的に無関係な部位
に結合した物質を含んでいる。cAMP濃度を測定する従来
の方法は伝統的な競合アッセイ、例えばラジオイムノア
ッセイを採用しており、そして数千又は数百万個の細胞
からの抽出操作及び調製を必要としている。このような
方法は尖った空間的及び時間的分析をもたらし、そして
全cAMP又は隔絶されたcAMP由来の遊離又は生物学的に活
性なcAMPレベルを区別することができない。更に、これ
らの方法は有害な腐敗し易いアイソトープの利用を必要
とし、そしてそれ故費用がかかる。
更に、cAMP以外の第二メッセンジャー、例えばサイク
リックGMP（cGMP）、カルシウム及びジアシルグリセロ
ール、並びにその他の有機分子、例えば腫瘍−促進ホル
ボールエステルはシグナル変換及び細胞生理において非
常に重要である。このような分子の生物学的に活性な濃
度の正確な測定はホルモン応答及び生理学的メカニズム
の効率的な研究にとっても重要である。しかしながら、
単純な無機イオン、例えばカルシウムを除いて、例えば
このような分子の生物学的に活性な濃度を測定する指標
システムはない。細胞内の遊離なcAMP濃度の測定につい
て依存しているこのような欠点のほとんどは、同様に上
記の分子についても存在している。
リックGMP（cGMP）、カルシウム及びジアシルグリセロ
ール、並びにその他の有機分子、例えば腫瘍−促進ホル
ボールエステルはシグナル変換及び細胞生理において非
常に重要である。このような分子の生物学的に活性な濃
度の正確な測定はホルモン応答及び生理学的メカニズム
の効率的な研究にとっても重要である。しかしながら、
単純な無機イオン、例えばカルシウムを除いて、例えば
このような分子の生物学的に活性な濃度を測定する指標
システムはない。細胞内の遊離なcAMP濃度の測定につい
て依存しているこのような欠点のほとんどは、同様に上
記の分子についても存在している。
従って、単独の生存細胞の中の遊離な細胞内cAMP濃度
及びその他の有機分子を迅速に、効率的に、且つ非破壊
的に測定するための方法の要望がある。このような発明
はホルモン調節の理解にとって重要である。本発明はこ
の要望を満たし、且つ同様に関連する利点を提供する。
及びその他の有機分子を迅速に、効率的に、且つ非破壊
的に測定するための方法の要望がある。このような発明
はホルモン調節の理解にとって重要である。本発明はこ
の要望を満たし、且つ同様に関連する利点を提供する。
発明の概要 本発明は、cAMP、その他の第二メッセンジャー及び有
機分子の存在を決定するのに適切な標識化タンパク質を
提供する。このタンパク質はフルオロクロムによって独
立して標識され、これらは密接に空間的に近位してい
る、好ましくは約6nm以下にあるとき、一方のフルオロ
クロムから他方へのエネルギー転移を介して相互作用す
る。
機分子の存在を決定するのに適切な標識化タンパク質を
提供する。このタンパク質はフルオロクロムによって独
立して標識され、これらは密接に空間的に近位してい
る、好ましくは約6nm以下にあるとき、一方のフルオロ
クロムから他方へのエネルギー転移を介して相互作用す
る。
課題の組成物（S1KA）n1（S2KD）n2を提供する（ここ
で、S1及びS2はある状態においては会合している二種類
のタンパク質であり、そして別の状態においては実質的
に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物の濃度に
よってコントロールされており、そしてＡ及びＤはフル
オロクロムであり、フルオロクロムＤの発光波長はフル
オロクロムＡの励起波長と重なっており、そしてＡとＢ
の距離はこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放
射性転移を十分に可能とするほど密接に近接してい
る）。ＡとＤは種々のアクセプター、ドナーペアー、例
えばフルオロセインとテトラメチルローダミン及びそれ
らの誘導体より選ばれうる。サンプル中の分析物、例え
ばcAMPの濃度は、サンプルを（S1KA）n1（S2KD）n2と接
触させ、Ｄの励起波長に近いエネルギーを提供し、そし
てＡ又はＤの蛍光を測定することによって決定されるこ
とができ、cAMP及びその他の前記分析物の濃度はＤの発
光対Ａの発光の比によって決定され、この比は既知の分
析物濃度の対照溶液によって予め検量しておく。
で、S1及びS2はある状態においては会合している二種類
のタンパク質であり、そして別の状態においては実質的
に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物の濃度に
よってコントロールされており、そしてＡ及びＤはフル
オロクロムであり、フルオロクロムＤの発光波長はフル
オロクロムＡの励起波長と重なっており、そしてＡとＢ
の距離はこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放
射性転移を十分に可能とするほど密接に近接してい
る）。ＡとＤは種々のアクセプター、ドナーペアー、例
えばフルオロセインとテトラメチルローダミン及びそれ
らの誘導体より選ばれうる。サンプル中の分析物、例え
ばcAMPの濃度は、サンプルを（S1KA）n1（S2KD）n2と接
触させ、Ｄの励起波長に近いエネルギーを提供し、そし
てＡ又はＤの蛍光を測定することによって決定されるこ
とができ、cAMP及びその他の前記分析物の濃度はＤの発
光対Ａの発光の比によって決定され、この比は既知の分
析物濃度の対照溶液によって予め検量しておく。
図面の簡単な説明 図１はcAMPを測定するために蛍光エネルギー転移の利
用を表わした図解である。
用を表わした図解である。
図２は種々の濃度のcAMPでの標識化cAMPdPKの発光ス
ペクトルを示し、そして挿入図は種々のcAMP濃度での52
0nm対580nmでの発光の比をプロットしている。
ペクトルを示し、そして挿入図は種々のcAMP濃度での52
0nm対580nmでの発光の比をプロットしている。
図３は平滑筋細胞を膜浸透性cAMP類似体によって処理
した際のcAMP濃度の上昇を示す。
した際のcAMP濃度の上昇を示す。
図４は種々のβ２−アドレナリン産生作動薬及び拮抗
薬によって処理した際の単独の細胞内のcAMPの測定を示
す。
薬によって処理した際の単独の細胞内のcAMPの測定を示
す。
発明の詳細な説明 本明細書で用いる語「タンパク質」又は「サブユニッ
ト」は、生物学的機能を示すアミノ酸の線状配列を表わ
す。この線状配列には天然タンパク質、タンパク質のド
メイン及びその機能が維持されている限りタンパク質の
フラグメントが含まれる。この語はポリペプチド及びペ
プチドも含む。
ト」は、生物学的機能を示すアミノ酸の線状配列を表わ
す。この線状配列には天然タンパク質、タンパク質のド
メイン及びその機能が維持されている限りタンパク質の
フラグメントが含まれる。この語はポリペプチド及びペ
プチドも含む。
本明細書で用いる語「会合」とは、二種類のタンパク
質例えば酵素のサブユニットが互いに接触し合っている
ことを意味する。この接触領域は二つの分子の全て又は
一部を含みうる。従って、「実質的に解離」又は「解
離」なる語は、全ての接触領域の欠如を含む、結合領域
間の接触の欠如、即ち、タンパク質が完全に分離してい
ること、並びにある領域での接触が欠如してタンパク質
の本体がもはや互いに密接に近接していないがしかしな
がら互いにつながれていることを意味する。本明細書で
用いる「複合体」なる語はタンパク質又はサブユニット
が会合状態にあるときを意味する。この複合体は２種類
のタンパク質のそれぞれの分子を複数個含みうる。
質例えば酵素のサブユニットが互いに接触し合っている
ことを意味する。この接触領域は二つの分子の全て又は
一部を含みうる。従って、「実質的に解離」又は「解
離」なる語は、全ての接触領域の欠如を含む、結合領域
間の接触の欠如、即ち、タンパク質が完全に分離してい
ること、並びにある領域での接触が欠如してタンパク質
の本体がもはや互いに密接に近接していないがしかしな
がら互いにつながれていることを意味する。本明細書で
用いる「複合体」なる語はタンパク質又はサブユニット
が会合状態にあるときを意味する。この複合体は２種類
のタンパク質のそれぞれの分子を複数個含みうる。
本明細書で用いる「cAMPdPK」なる語は、本明細書に
参考として組入れたAlbertsら（1989）のMolecular Bio
logy of the Cell,Garland Publishing,Inc.及びSlice
とTaylor,（1989）,J,Biol.Chem.264;20940−20946に詳
細のサイクリックAMP依存性タンパク質複合体を意味す
る。この複合体は二種類のタンパク質より構成され、こ
れらは調節及び触媒機能を示す。この語は調節及び触媒
性タンパク質の全てのアイソタイプを含むことを意図す
る。
参考として組入れたAlbertsら（1989）のMolecular Bio
logy of the Cell,Garland Publishing,Inc.及びSlice
とTaylor,（1989）,J,Biol.Chem.264;20940−20946に詳
細のサイクリックAMP依存性タンパク質複合体を意味す
る。この複合体は二種類のタンパク質より構成され、こ
れらは調節及び触媒機能を示す。この語は調節及び触媒
性タンパク質の全てのアイソタイプを含むことを意図す
る。
本明細書で用いる語「フルオロクロム」は、一定の波
長範囲でエネルギーを吸収することができ、そしてこの
吸収範囲以外の波長範囲でエネルギーを放出することの
できる分子を意味する。従って、「励起波長」とはフル
オロクロムがエネルギーを吸収する波長の範囲を意味す
る。「発光波長」なる語は、フルオロクロムがエネルギ
ー又は蛍光を放出する波長の範囲である。フルオロクロ
ムなる語はその誘導体、例えばタンパク質への結合のた
めの化学成分も含んでいる。フルオロクロムの例はフル
オロセイン及びテトラメチルローダミンである。それぞ
れの誘導体はフルオロセインイソチオシアネート及びテ
トラメチルローダミンイソチオシアネートである。
長範囲でエネルギーを吸収することができ、そしてこの
吸収範囲以外の波長範囲でエネルギーを放出することの
できる分子を意味する。従って、「励起波長」とはフル
オロクロムがエネルギーを吸収する波長の範囲を意味す
る。「発光波長」なる語は、フルオロクロムがエネルギ
ー又は蛍光を放出する波長の範囲である。フルオロクロ
ムなる語はその誘導体、例えばタンパク質への結合のた
めの化学成分も含んでいる。フルオロクロムの例はフル
オロセイン及びテトラメチルローダミンである。それぞ
れの誘導体はフルオロセインイソチオシアネート及びテ
トラメチルローダミンイソチオシアネートである。
本明細書で用いる語「サンプル」は、分析物を含むと
予測される材料、例えば溶液、抽出物又は完全細胞を意
味する。
予測される材料、例えば溶液、抽出物又は完全細胞を意
味する。
本明細書で用いる語「標識化」は化学成分、例えばフ
ルオロクロムのタンパク質への結合化を意味する。この
結合は典型的には共有結合を介するが、しかし同様に非
共有相互作用も含みうる。従って、「標識化タンパク
質」なる語は化学成分、例えばフルオロクロムが結合さ
れているタンパク質を意味する。
ルオロクロムのタンパク質への結合化を意味する。この
結合は典型的には共有結合を介するが、しかし同様に非
共有相互作用も含みうる。従って、「標識化タンパク
質」なる語は化学成分、例えばフルオロクロムが結合さ
れているタンパク質を意味する。
本発明は（S1KA）n1（S2KD）n2を含んで成る課題の組
成物を提供し、ここでS1及びS2は二種類のタンパク質で
あり、それらはある状態において会合しており、そして
別の状態において実質的に解離しており、そしてＤ及び
Ａは異なるフルオロクロムであり、一方のフルオロクロ
ムの発光波長は他方のフルオロクロムの励起波長と重複
しており、ＤとＡの距離はフルオロクロム間のエネルギ
ーの無放射性転移を可能とするほど十分に密接に近づい
ており、そしてn1及びn2は前記タンパク質の化学量数を
示し、そしてここでS1又はS2は分析物Ｘと結合すること
が可能であり、Ｘの結合はS1及びS2の互いに対する親和
性に影響を及ぼす。
成物を提供し、ここでS1及びS2は二種類のタンパク質で
あり、それらはある状態において会合しており、そして
別の状態において実質的に解離しており、そしてＤ及び
Ａは異なるフルオロクロムであり、一方のフルオロクロ
ムの発光波長は他方のフルオロクロムの励起波長と重複
しており、ＤとＡの距離はフルオロクロム間のエネルギ
ーの無放射性転移を可能とするほど十分に密接に近づい
ており、そしてn1及びn2は前記タンパク質の化学量数を
示し、そしてここでS1又はS2は分析物Ｘと結合すること
が可能であり、Ｘの結合はS1及びS2の互いに対する親和
性に影響を及ぼす。
二種類のタンパク質S1及びS2であってフルオロクロム
により標識されているものは典型的には酵素のサブユニ
ットであるが、会合及び実質的解離状態を示す任意の二
種類のタンパク質を含みうる。このようなタンパク質ペ
アーの例には、cAMP依存性タンパク質キナーゼ（cAMPdP
K）に関するサブユニット、GTP−結合性タンパク質のサ
ブユニット、カルモジュリン及びカルモジュリンタンパ
ク質キナーゼ、並びにタンパク質キナーゼＣの調節及び
触媒性ドメインである。
により標識されているものは典型的には酵素のサブユニ
ットであるが、会合及び実質的解離状態を示す任意の二
種類のタンパク質を含みうる。このようなタンパク質ペ
アーの例には、cAMP依存性タンパク質キナーゼ（cAMPdP
K）に関するサブユニット、GTP−結合性タンパク質のサ
ブユニット、カルモジュリン及びカルモジュリンタンパ
ク質キナーゼ、並びにタンパク質キナーゼＣの調節及び
触媒性ドメインである。
会合状態にあるとき、このサブユニットはタンパク質
複合体、例えばホロ酵素を形成する。この複合体におけ
るタンパク質の数はS1とS2との化学量数に依存して変化
しうる。更に、この複合体はS1及びS2以外のタンパク質
を含みうる。この複合体におけるこのようなその他のタ
ンパク質は、それらがS1又はS2のいづれかとの安定な会
合を維持している限り、S1又はS2の成分として考えられ
うる。
複合体、例えばホロ酵素を形成する。この複合体におけ
るタンパク質の数はS1とS2との化学量数に依存して変化
しうる。更に、この複合体はS1及びS2以外のタンパク質
を含みうる。この複合体におけるこのようなその他のタ
ンパク質は、それらがS1又はS2のいづれかとの安定な会
合を維持している限り、S1又はS2の成分として考えられ
うる。
解離状態にあるとき、このタンパク質のうちの少なく
とも一方は他方のタンパク質からのその距離が実質的に
変化したであろう。例えば、cAMPdPKに関する解離状態
は遊離な触媒性と調節タンパク質又はサブユニットより
成る。同様に、GTP−結合性タンパク質はアルファーと
ベーター−ガンマーサブユニットへと解離し、カルモジ
ュリン依存性タンパク質キナーゼはカルモジュリンから
解離し、そしてタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性
ドメインはまず離ればなれになり、そしてタンパク質分
解によってその後分離する。
とも一方は他方のタンパク質からのその距離が実質的に
変化したであろう。例えば、cAMPdPKに関する解離状態
は遊離な触媒性と調節タンパク質又はサブユニットより
成る。同様に、GTP−結合性タンパク質はアルファーと
ベーター−ガンマーサブユニットへと解離し、カルモジ
ュリン依存性タンパク質キナーゼはカルモジュリンから
解離し、そしてタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性
ドメインはまず離ればなれになり、そしてタンパク質分
解によってその後分離する。
無放射性エネルギー転移はフルオロクロムの生物物理
学的性質を基礎とする。これらの原理はLakowicz,J.,
（1983）のPrinciples of Fluorescence Spectroscopy,
Plenum Prcss,New York及びJovinとJovin（1989）の、C
ell Structure and Function by Microspectrofluorome
try（E.KobenとJ.G.Hirschberg編、Academic Press）に
記載されており、両方とも本明細書に参考として組入れ
ている。簡単に述べると、フルオロクロムは特定の波長
で光エネルギーを吸収する。この波長は励起波長として
も知られている。フルオロクロムにより吸収されるエネ
ルギーはその後種々の径路を介して放出され、その一つ
は蛍光を提供する光子の放射である。放射される光の波
長は発光波長として知られ、そしてこれは特定のフルオ
ロクロムの固有の特徴である。無放射性エネルギー転移
は、一方のフルオロクロムの励起状態でのエネルギーが
第二のフルオロクロムへと事実上光子放射を伴わずに転
移される量子力学過程である。次にこのエネルギーはそ
の後第二フルオロクロムの発光波長で放出されうる。第
一フルオロクロムは一般にドナー（供与体）（Ｄ）と呼
ばれ、そしてアクセプター（受容体）（Ａ）と呼ばれる
第二のフルオロクロムよりも高いエネルギーの励起状態
を有する。この過程の本質的な特徴は、ドナーの発光ス
ペクトルとアクセプターの励起スペクトルが重複してお
り、そしてこのドナーとアクセプターが十分に近いこと
にある。無放射性エネルギー転位が有効となる距離は、
ドナーの蛍光量子効率、アクセプターの吸光係数、これ
らに対応するスペクトルの重複の程度、媒体の屈折率及
び二種類のフルオロクロムの遷移モーメントの相対的配
向を含む数多くの要因に依存するが、典型的なドナー及
びアクセプターの好ましいペアーにとってはそれは４〜
6nmである。分子間距離の最適範囲を超えると、距離の
６乗の逆数としてこのエネルギー転移効率は低下する。
学的性質を基礎とする。これらの原理はLakowicz,J.,
（1983）のPrinciples of Fluorescence Spectroscopy,
Plenum Prcss,New York及びJovinとJovin（1989）の、C
ell Structure and Function by Microspectrofluorome
try（E.KobenとJ.G.Hirschberg編、Academic Press）に
記載されており、両方とも本明細書に参考として組入れ
ている。簡単に述べると、フルオロクロムは特定の波長
で光エネルギーを吸収する。この波長は励起波長として
も知られている。フルオロクロムにより吸収されるエネ
ルギーはその後種々の径路を介して放出され、その一つ
は蛍光を提供する光子の放射である。放射される光の波
長は発光波長として知られ、そしてこれは特定のフルオ
ロクロムの固有の特徴である。無放射性エネルギー転移
は、一方のフルオロクロムの励起状態でのエネルギーが
第二のフルオロクロムへと事実上光子放射を伴わずに転
移される量子力学過程である。次にこのエネルギーはそ
の後第二フルオロクロムの発光波長で放出されうる。第
一フルオロクロムは一般にドナー（供与体）（Ｄ）と呼
ばれ、そしてアクセプター（受容体）（Ａ）と呼ばれる
第二のフルオロクロムよりも高いエネルギーの励起状態
を有する。この過程の本質的な特徴は、ドナーの発光ス
ペクトルとアクセプターの励起スペクトルが重複してお
り、そしてこのドナーとアクセプターが十分に近いこと
にある。無放射性エネルギー転位が有効となる距離は、
ドナーの蛍光量子効率、アクセプターの吸光係数、これ
らに対応するスペクトルの重複の程度、媒体の屈折率及
び二種類のフルオロクロムの遷移モーメントの相対的配
向を含む数多くの要因に依存するが、典型的なドナー及
びアクセプターの好ましいペアーにとってはそれは４〜
6nmである。分子間距離の最適範囲を超えると、距離の
６乗の逆数としてこのエネルギー転移効率は低下する。
S1又はS2のいづれかと結合することのできる分析物Ｘ
は例えば第二メッセンジャー、例えばcAMP、カルシウ
ム、cGMP及びジアシルグリセロール；関連ホルモンレセ
プター複合体；又は有機分子、例えばホルボールエステ
ルでありうる。このような分子と結合したとき、S1及び
S2は会合又は解離状態のいづれかとなりうる。
は例えば第二メッセンジャー、例えばcAMP、カルシウ
ム、cGMP及びジアシルグリセロール；関連ホルモンレセ
プター複合体；又は有機分子、例えばホルボールエステ
ルでありうる。このような分子と結合したとき、S1及び
S2は会合又は解離状態のいづれかとなりうる。
本発明は、S1及びS2が複合体、例えばホロ酵素のタン
パク質又はサブユニットである課題の組成物を提供す
る。このようなホロ酵素は例えばcAMPdPK、GTP−結合タ
ンパク質、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ及
びタンパク質キナーゼＣでありうる。
パク質又はサブユニットである課題の組成物を提供す
る。このようなホロ酵素は例えばcAMPdPK、GTP−結合タ
ンパク質、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ及
びタンパク質キナーゼＣでありうる。
ある態様において、本発明はS1がcAMPdPKの調節サブ
ユニットであり、そしてS2がcAMPdPKの触媒性サブユニ
ットであり、且つそれらが異なるフルオロクロムであっ
て一方の発光波長が他方の励起波長と重複しているもの
により標識されている課題の組成物も提供する。
ユニットであり、そしてS2がcAMPdPKの触媒性サブユニ
ットであり、且つそれらが異なるフルオロクロムであっ
て一方の発光波長が他方の励起波長と重複しているもの
により標識されている課題の組成物も提供する。
例えばcAMPの非存在下においては、cAMPdPKの調節
（Ｒ）及び触媒性（Ｃ）サブユニットは図１において示
すR2C2の化学量数を有する。この複合体はキナーゼとし
ては不活性であり、なぜならＲサブユニットはＣサブユ
ニットのキナーゼドメインを阻害せしめるからである。
ＲへのcAMPの結合に基づき、ＲサブユニットはＣサブユ
ニットから解離し、この後者の生物学的活性が示される
ようになる。本発明は、Ｒサブユニットを一方のフルオ
ロクロムによって、且つＣサブユニットを別のフルオロ
クロムによって標識化せしめることを含み、従って完全
R2C2複合体における一方のフルオロクロムによって吸収
された光エネルギーは無放射性エネルギー転移の過程に
よって他のフルオロクロムへと転移される。この現象
は、一方のフルオロクロム、即ちドナー（Ｄ）由来の蛍
光発光の波長が他のフルオロクロム、即ちアクセプター
（Ａ）の励起波長と重複し、且つＤ及びＡ成分がこのフ
ルオロクロムペアー間のエネルギーの無放射性転移を可
能とするほど十分に密接に近づていることを必要とす
る。フルオロセイン及びテトラメチルローダミンの場合
において、この距離は約４〜6nm以下である。その他の
フルオロクロムのペアーに関しては、この距離は当業者
によって決定されうる。Ｄ及びＡに関する適切な選択が
なされることを条件として、この密接な近位の条件はホ
ロ酵素複合体、例えばcAMPdPKに関して現実的によく満
足され、従ってかなりの効率性を伴ってエネルギー転移
が生ずる。
（Ｒ）及び触媒性（Ｃ）サブユニットは図１において示
すR2C2の化学量数を有する。この複合体はキナーゼとし
ては不活性であり、なぜならＲサブユニットはＣサブユ
ニットのキナーゼドメインを阻害せしめるからである。
ＲへのcAMPの結合に基づき、ＲサブユニットはＣサブユ
ニットから解離し、この後者の生物学的活性が示される
ようになる。本発明は、Ｒサブユニットを一方のフルオ
ロクロムによって、且つＣサブユニットを別のフルオロ
クロムによって標識化せしめることを含み、従って完全
R2C2複合体における一方のフルオロクロムによって吸収
された光エネルギーは無放射性エネルギー転移の過程に
よって他のフルオロクロムへと転移される。この現象
は、一方のフルオロクロム、即ちドナー（Ｄ）由来の蛍
光発光の波長が他のフルオロクロム、即ちアクセプター
（Ａ）の励起波長と重複し、且つＤ及びＡ成分がこのフ
ルオロクロムペアー間のエネルギーの無放射性転移を可
能とするほど十分に密接に近づていることを必要とす
る。フルオロセイン及びテトラメチルローダミンの場合
において、この距離は約４〜6nm以下である。その他の
フルオロクロムのペアーに関しては、この距離は当業者
によって決定されうる。Ｄ及びＡに関する適切な選択が
なされることを条件として、この密接な近位の条件はホ
ロ酵素複合体、例えばcAMPdPKに関して現実的によく満
足され、従ってかなりの効率性を伴ってエネルギー転移
が生ずる。
この転移されたエネルギーはＤにより吸収される波長
での励起によって容易に検出され、なぜならＤからの発
光は消光し、そしてその代りとしてＡの発光の特徴であ
る長めの波長にてエネルギーが現れるからである。
での励起によって容易に検出され、なぜならＤからの発
光は消光し、そしてその代りとしてＡの発光の特徴であ
る長めの波長にてエネルギーが現れるからである。
サブユニットRKDとCKAが（RKD）２（CKA）２をなすよ
うに組合されることができ、又はRKAとCKDが（RKA）２
（CKD）２へと組合されることができ、ここでＫは表示
のフルオロクロムが連結されていることを表わしてい
る。cAMPがＲをＣから解離させたら、これによってＤ及
びＡは互いから広く隔てられ、そしてＤからＡへのエネ
ルギーの転移がされなくなる。サブユニットが解離する
ことにより、Ｄにより吸収される波長での照光はＡでは
なく単にＤからの蛍光発光をもたらし、従って複合発光
スペクトルはＤの短めの波長へとシフトする。
うに組合されることができ、又はRKAとCKDが（RKA）２
（CKD）２へと組合されることができ、ここでＫは表示
のフルオロクロムが連結されていることを表わしてい
る。cAMPがＲをＣから解離させたら、これによってＤ及
びＡは互いから広く隔てられ、そしてＤからＡへのエネ
ルギーの転移がされなくなる。サブユニットが解離する
ことにより、Ｄにより吸収される波長での照光はＡでは
なく単にＤからの蛍光発光をもたらし、従って複合発光
スペクトルはＤの短めの波長へとシフトする。
前記した通りに二種類のフルオロクロムにより標識さ
れたホロ酵素は、天然のホロ酵素と本質的に同じcAMPに
対する感受性を有することが見い出せた。この特性はタ
ンパク質複合体例えばcAMPdPKの利用を、種々の生物学
的分子のための測定因子又はセンサーとして利用できる
ことを可能にする。更に、このセンサーはこのような生
物学的分子例えばcAMPに対して最適な親和性を有するこ
とが保障され、なぜなら天然のホロ酵素はcAMPにとって
の主要な内因性センサーであり、そして対象物の濃度は
まさにこの酵素に影響を及ぼすものであるからである。
更に、cAMPによる刺激に基づくキナーゼとしての標識化
酵素の活性は、同様に刺激された天然のホロ酵素と同じ
であることが見い出された。この特性は有用であり、な
ぜならこれは、このセンサーが導入されている細胞内に
おけるcAMPの生物学的効率の任意の変動を最小にするか
らである。もしこのセンサーが有効なキナーゼでないな
らば、それに結合している任意のcAMPは生物学的活性を
及ぼすことが阻止され、従ってこのセンサーは活性が測
定されようとされているシグナル経路を固有に妨害する
ことになるであろう。しかしながら、もしこのセンサー
が正常なキナーゼなら、これに結合したcAMP分子は生物
学的に完全に有効であり、従ってこのような現象の仲介
からはずされることはない。
れたホロ酵素は、天然のホロ酵素と本質的に同じcAMPに
対する感受性を有することが見い出せた。この特性はタ
ンパク質複合体例えばcAMPdPKの利用を、種々の生物学
的分子のための測定因子又はセンサーとして利用できる
ことを可能にする。更に、このセンサーはこのような生
物学的分子例えばcAMPに対して最適な親和性を有するこ
とが保障され、なぜなら天然のホロ酵素はcAMPにとって
の主要な内因性センサーであり、そして対象物の濃度は
まさにこの酵素に影響を及ぼすものであるからである。
更に、cAMPによる刺激に基づくキナーゼとしての標識化
酵素の活性は、同様に刺激された天然のホロ酵素と同じ
であることが見い出された。この特性は有用であり、な
ぜならこれは、このセンサーが導入されている細胞内に
おけるcAMPの生物学的効率の任意の変動を最小にするか
らである。もしこのセンサーが有効なキナーゼでないな
らば、それに結合している任意のcAMPは生物学的活性を
及ぼすことが阻止され、従ってこのセンサーは活性が測
定されようとされているシグナル経路を固有に妨害する
ことになるであろう。しかしながら、もしこのセンサー
が正常なキナーゼなら、これに結合したcAMP分子は生物
学的に完全に有効であり、従ってこのような現象の仲介
からはずされることはない。
本発明は更に、サンプル中の分析物の濃度を決定する
方法であって： （ａ）タンパク質S1及びS2をフルオロクロムＡ及びＤ
によって標識して（ここでS1又はS2はこの分析物に結合
することが可能であり、且つS1及びS2はある状態におい
て会合しており、そして他の状態においては実質的に解
離しており、その平衡は遊離なこの分析物の濃度によっ
てコントロールされ、このフルオロクロムは一方のフル
オロクロムの発光波長が他方のフルオロクロムの励起波
長と重複するように選ばれる）標識化タンパク質（S
1D）n1（S2A）n2又は（S1A）n1（S2D）n2を形成せし
め； （ｂ）この標識化タンパク質をこのサンプルと接触せ
しめ； （ｃ）Ｄ又はＡの励起波長付近のエネルギーを提供せ
しめ； （ｄ）Ａ及びＤそれぞれの発光波長にて発せされら蛍
光を測定し、そしてＤからＡへのエネルギー転移の程度
をその発光増幅の比によって、又はＤの蛍光寿命によっ
て、又はＤの光漂白化（photobleaching）の速度によっ
て決定することを含んで成る方法を提供する。全てのこ
れらのパラメーター、しかしながら最も好都合には発光
増幅の比は、既知の分析物濃度サンプルにより確率した
検量曲線によって分析物濃度へと換算されうる。
方法であって： （ａ）タンパク質S1及びS2をフルオロクロムＡ及びＤ
によって標識して（ここでS1又はS2はこの分析物に結合
することが可能であり、且つS1及びS2はある状態におい
て会合しており、そして他の状態においては実質的に解
離しており、その平衡は遊離なこの分析物の濃度によっ
てコントロールされ、このフルオロクロムは一方のフル
オロクロムの発光波長が他方のフルオロクロムの励起波
長と重複するように選ばれる）標識化タンパク質（S
1D）n1（S2A）n2又は（S1A）n1（S2D）n2を形成せし
め； （ｂ）この標識化タンパク質をこのサンプルと接触せ
しめ； （ｃ）Ｄ又はＡの励起波長付近のエネルギーを提供せ
しめ； （ｄ）Ａ及びＤそれぞれの発光波長にて発せされら蛍
光を測定し、そしてＤからＡへのエネルギー転移の程度
をその発光増幅の比によって、又はＤの蛍光寿命によっ
て、又はＤの光漂白化（photobleaching）の速度によっ
て決定することを含んで成る方法を提供する。全てのこ
れらのパラメーター、しかしながら最も好都合には発光
増幅の比は、既知の分析物濃度サンプルにより確率した
検量曲線によって分析物濃度へと換算されうる。
ある態様において、例えばＣサブユニットにおいてフ
ルオロセインにより標識され、そしてＲサブユニットに
おいてテトラメチルローダミンにより標識されたホロ酵
素が試験管内及び生体内でのcAMPの濃度の測定に利用す
ることができる。前者に関しては、490〜500nmでの励起
に随行するこの酵素の蛍光発光を測定しながらこれをcA
MPによって滴定する。既知濃度のcAMPに対する発光比の
プロット（520:580nmが最適波長である）が、同じ条件
のもとでの未知溶液におけるcAMP濃度の決定のための標
準曲線として用いることができる。生存細胞内の生体内
cAMP濃度を測定するためには、マイクロインジュクショ
ン、エレクトロポレーション、リポフェクション、ビー
ズ装入、スクレープ装入又は任意のその他の同等且つよ
く知られた技術による対象の細胞の中への標識化ホロ酵
素の取り込ませを必要とする。このような方法はRiabow
olら（1988）Cold Spring Harbor Symposin on Quantit
ative Biology 53:85−90;SambrookらのMolecular Clon
ing:ALaboratory Manual（1989）Cold Spring Harbor L
aboratory、及びAsubelらCurrent Protocols in Molecu
lar Biology（1987）,John Wiley and Sonsに詳細され
ており、これらは本明細書に参考として組入れた。蛍光
顕微鏡のもとでの490〜500nmでの励起及び二種類の最適
波長（520及び580nm）付近の発光の検出はホトメーター
又はテレビジョンカメラによって行われる。最小及び最
大比の値の検量は、ホロ酵素の解離を阻害するcAMP拮抗
薬アデノシン−３′,5′−サイクリックモノホスホチオ
エート、RP−異性体（RP−cAMP）の添加によってまずゼ
ロのcAMP濃度値を設定することにより行われる。このcA
MP拮抗薬のその後の除去及び膜浸透性cAMP類似体の添加
は完全な解離を提供し、それ故中間のcAMP値は試験管内
試験に由来する標準曲線を用いて決定できる。
ルオロセインにより標識され、そしてＲサブユニットに
おいてテトラメチルローダミンにより標識されたホロ酵
素が試験管内及び生体内でのcAMPの濃度の測定に利用す
ることができる。前者に関しては、490〜500nmでの励起
に随行するこの酵素の蛍光発光を測定しながらこれをcA
MPによって滴定する。既知濃度のcAMPに対する発光比の
プロット（520:580nmが最適波長である）が、同じ条件
のもとでの未知溶液におけるcAMP濃度の決定のための標
準曲線として用いることができる。生存細胞内の生体内
cAMP濃度を測定するためには、マイクロインジュクショ
ン、エレクトロポレーション、リポフェクション、ビー
ズ装入、スクレープ装入又は任意のその他の同等且つよ
く知られた技術による対象の細胞の中への標識化ホロ酵
素の取り込ませを必要とする。このような方法はRiabow
olら（1988）Cold Spring Harbor Symposin on Quantit
ative Biology 53:85−90;SambrookらのMolecular Clon
ing:ALaboratory Manual（1989）Cold Spring Harbor L
aboratory、及びAsubelらCurrent Protocols in Molecu
lar Biology（1987）,John Wiley and Sonsに詳細され
ており、これらは本明細書に参考として組入れた。蛍光
顕微鏡のもとでの490〜500nmでの励起及び二種類の最適
波長（520及び580nm）付近の発光の検出はホトメーター
又はテレビジョンカメラによって行われる。最小及び最
大比の値の検量は、ホロ酵素の解離を阻害するcAMP拮抗
薬アデノシン−３′,5′−サイクリックモノホスホチオ
エート、RP−異性体（RP−cAMP）の添加によってまずゼ
ロのcAMP濃度値を設定することにより行われる。このcA
MP拮抗薬のその後の除去及び膜浸透性cAMP類似体の添加
は完全な解離を提供し、それ故中間のcAMP値は試験管内
試験に由来する標準曲線を用いて決定できる。
現状好ましいフルオロクロムの選択は、ドナー色素に
とってはフルオロセインであり、これは約510〜550nmの
発光波長を有し、そしてアクセプターにとってはテトラ
メチルローダミンであり、これは約510〜550nmの励起波
長を有し、両者ともリジンへの好適な反応のための条件
のもとでイソチオシアネートを介してサブユニットに連
結されている。しかしながら、フルオロクロムＤの発光
波長がフルオロクロムＡの励起波長と重なり、そしてＤ
からＡへのエネルギー転移をもたらす限り、種々のフル
オロクロム及びその誘導体が利用されうる。例えば、Ｄ
とＡのフルオロクロムペアーは７アミノクマリンとジピ
ロメテン−ボレート、インドカルボシアニンとローダミ
ンＸ、又はフィトエリトリンとアロフィコシアニンであ
りうる。
とってはフルオロセインであり、これは約510〜550nmの
発光波長を有し、そしてアクセプターにとってはテトラ
メチルローダミンであり、これは約510〜550nmの励起波
長を有し、両者ともリジンへの好適な反応のための条件
のもとでイソチオシアネートを介してサブユニットに連
結されている。しかしながら、フルオロクロムＤの発光
波長がフルオロクロムＡの励起波長と重なり、そしてＤ
からＡへのエネルギー転移をもたらす限り、種々のフル
オロクロム及びその誘導体が利用されうる。例えば、Ｄ
とＡのフルオロクロムペアーは７アミノクマリンとジピ
ロメテン−ボレート、インドカルボシアニンとローダミ
ンＸ、又はフィトエリトリンとアロフィコシアニンであ
りうる。
本発明は更に、タンパク質サブユニットS1及びS2を含
んで成る複合体（このサブユニットS1及びS2はある状態
においては会合しており、そして他の状態においては実
質的に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物Ｘの
濃度によってコントロールされ、そしてここでS1又はS2
はこの分析物に結合することができる）を製造する方法
であって： （ａ）フルオロクロムＡをS1に結合させ（ここで該フ
ルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重
なる励起波長を有する）；（ｂ）この第二フルオロクロ
ムＤをS2に結合させ；（ｃ）この標識されたサブユニッ
トを混合して複合体を形成せしめ（ここでこのフルオロ
クロムは、このフルオロクロム間のエネルギーの無放射
性転移を可能にするよう十分密接に近づいている）；そ
して（ｄ）複合体としてのこの標識化サブユニットを回
収することを含んで成る方法を提供する。
んで成る複合体（このサブユニットS1及びS2はある状態
においては会合しており、そして他の状態においては実
質的に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物Ｘの
濃度によってコントロールされ、そしてここでS1又はS2
はこの分析物に結合することができる）を製造する方法
であって： （ａ）フルオロクロムＡをS1に結合させ（ここで該フ
ルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重
なる励起波長を有する）；（ｂ）この第二フルオロクロ
ムＤをS2に結合させ；（ｃ）この標識されたサブユニッ
トを混合して複合体を形成せしめ（ここでこのフルオロ
クロムは、このフルオロクロム間のエネルギーの無放射
性転移を可能にするよう十分密接に近づいている）；そ
して（ｄ）複合体としてのこの標識化サブユニットを回
収することを含んで成る方法を提供する。
ある態様において、Ｒ及びＣを独立して組換タンパク
質として、例えばE.コリ（E.coli）における発現から入
手し、その後これを標識することができる。ところで、
標識の操作がホロ酵素への再会合又はその後のcAMP感受
性及びキナーゼ活性を阻害しないような反応条件の慎重
なる調整が必要である。従来の論文は、フルオロセイン
イソチオシアネートによって標識単離せしめたＣはＲと
組合さるその能力が損傷されていることを述べている；
しかしながら、以下に記載の通り温和な条件のもとでは
Ｃは損傷を受けない。
質として、例えばE.コリ（E.coli）における発現から入
手し、その後これを標識することができる。ところで、
標識の操作がホロ酵素への再会合又はその後のcAMP感受
性及びキナーゼ活性を阻害しないような反応条件の慎重
なる調整が必要である。従来の論文は、フルオロセイン
イソチオシアネートによって標識単離せしめたＣはＲと
組合さるその能力が損傷されていることを述べている；
しかしながら、以下に記載の通り温和な条件のもとでは
Ｃは損傷を受けない。
本発明は更にタンパク質サブユニットS1及びS2を含ん
で成る複合体を製造する方法を提供し（ここでS1及びS2
はある状態においては会合しており、そして他の状態に
おいては実質的に解離しており、その間の平衡は遊離な
分析物Ｘの濃度によりコントロールされ、そしてここで
S1又はS2はこの分析物と結合することが可能である）、
この方法は：（ａ）フルオロクロムＡを、S1及びS2を含
んで成る混合物に連結させ（ここで該フルオロクロムＡ
は第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を
有する）；（ｂ）この第二フルオロクロムＤを、S1及び
S2を含んで成る第二複合体に連結させ；（ｃ）前記第一
及び第二複合体のサブユニットを分離させて標識化サブ
ユニットS1KD,S2KD,S1KA及びS2KAを獲得し；そして
（ｄ）標識複合体（S1KD）n1（S2KA）n2又は（S1KA）n1
（S2KD）n2を形成するため（ここでn1及びn2はこの標識
化サブユニットの化学量数を表わす）この標識化サブユ
ニットを混合する（ここで前記フルオロクロムは、この
フルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能と
するよう十分に密接に近づいている）ことを含んで成る
方法を提供する。
で成る複合体を製造する方法を提供し（ここでS1及びS2
はある状態においては会合しており、そして他の状態に
おいては実質的に解離しており、その間の平衡は遊離な
分析物Ｘの濃度によりコントロールされ、そしてここで
S1又はS2はこの分析物と結合することが可能である）、
この方法は：（ａ）フルオロクロムＡを、S1及びS2を含
んで成る混合物に連結させ（ここで該フルオロクロムＡ
は第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を
有する）；（ｂ）この第二フルオロクロムＤを、S1及び
S2を含んで成る第二複合体に連結させ；（ｃ）前記第一
及び第二複合体のサブユニットを分離させて標識化サブ
ユニットS1KD,S2KD,S1KA及びS2KAを獲得し；そして
（ｄ）標識複合体（S1KD）n1（S2KA）n2又は（S1KA）n1
（S2KD）n2を形成するため（ここでn1及びn2はこの標識
化サブユニットの化学量数を表わす）この標識化サブユ
ニットを混合する（ここで前記フルオロクロムは、この
フルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能と
するよう十分に密接に近づいている）ことを含んで成る
方法を提供する。
これに代わる方法は、予め形成せしめたホロ酵素R2C2
をＤによって標識することであり、これによってＲとＤ
との相互作用部位が固有に保護されている（RKD）２（C
KD）２が製造される。R2C2の別のバッチをＡによって同
様に標識化して（RKA2）（CKA）２を作る。次に標識化
Ｒと標識化Ｃを解離させ、そしてcAMPアフィニティーカ
ラムに通過させて標識化Ｃが素通りする間に標識化Ｒが
これに吸着することによって分ける。Ｒは遊離cAMPによ
る溶出によってこのカラムから回収できる。この分離を
各バッチに適用したとき、RKD,CKD,RKA及びCKAを獲得す
ることができ、これらはその後一方の調製品としての
（RKD）２（CKA）２、そして他のものとしての（RKA）
２（CKD）２を作るよう異なる組合せにおいて再び組合
せられる。
をＤによって標識することであり、これによってＲとＤ
との相互作用部位が固有に保護されている（RKD）２（C
KD）２が製造される。R2C2の別のバッチをＡによって同
様に標識化して（RKA2）（CKA）２を作る。次に標識化
Ｒと標識化Ｃを解離させ、そしてcAMPアフィニティーカ
ラムに通過させて標識化Ｃが素通りする間に標識化Ｒが
これに吸着することによって分ける。Ｒは遊離cAMPによ
る溶出によってこのカラムから回収できる。この分離を
各バッチに適用したとき、RKD,CKD,RKA及びCKAを獲得す
ることができ、これらはその後一方の調製品としての
（RKD）２（CKA）２、そして他のものとしての（RKA）
２（CKD）２を作るよう異なる組合せにおいて再び組合
せられる。
CAMPdPKのホロ酵素又は個々のサブユニットは、例え
ば本明細書に参考として組入れたBubisら（1985）Bioch
emistry,24:2163−2170、及びZickらJ.Biol.Chem.,（19
82）257:2287−2293に詳細の通り哺乳類起源から調製す
ることができる。もし組換又は哺乳類起源由来のサブユ
ニットをホロ酵素の調製のために用いたなら、再構成は
実施例に詳細の通りに行うことができる。
ば本明細書に参考として組入れたBubisら（1985）Bioch
emistry,24:2163−2170、及びZickらJ.Biol.Chem.,（19
82）257:2287−2293に詳細の通り哺乳類起源から調製す
ることができる。もし組換又は哺乳類起源由来のサブユ
ニットをホロ酵素の調製のために用いたなら、再構成は
実施例に詳細の通りに行うことができる。
以下の実施例は本発明の例示であって限定ではない。
例Ｉ cAMP−依存性タンパク質キナーゼ調節サブユニットの組
換発現及び精製 試薬は以下の会社から購入した：ヒストンII A、フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）及び牛血清アルブ
ミン（Sigma,St.Louis,Mo）;Nα−Ｐ−トシル−Ｌ−リ
ジンクロロメチルケトン及びcAMP（United States Bioc
hemical Corp.,Cleveland,OH）;2,8−〔3H〕cAMP（27Ci
/mmol）及び８−N3〔32P〕cAMP（20〜30Ci/mmol）（IC
N）；セファデックスＧ−150及びcAMP−アガロース（N6
−エタンスペーサー）（Pharmacia,Pleasant Hill,C
A）；ニトロセルロース（0.45μｍ）及び電気泳動試薬
（Bio−Rad,Richmond,CA）；及びシトシント（cytoscin
t）（West Chem）。DNA操作において用いた酵素はBethe
sda Research Laboratories（Gaithersberg,MD）又はBo
ehringer Mannheim（Indianapolis,IN）のいづれからよ
り入手し、そして製造者の仕様書に従って用いた。蛍光
標識物はMolecular Probes（Eugene,OR）より入手し、
そしてcAMP類似体はBiolog（La Jolla,CA）より入手し
た。全てのその他の試薬は分析用である。
換発現及び精製 試薬は以下の会社から購入した：ヒストンII A、フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）及び牛血清アルブ
ミン（Sigma,St.Louis,Mo）;Nα−Ｐ−トシル−Ｌ−リ
ジンクロロメチルケトン及びcAMP（United States Bioc
hemical Corp.,Cleveland,OH）;2,8−〔3H〕cAMP（27Ci
/mmol）及び８−N3〔32P〕cAMP（20〜30Ci/mmol）（IC
N）；セファデックスＧ−150及びcAMP−アガロース（N6
−エタンスペーサー）（Pharmacia,Pleasant Hill,C
A）；ニトロセルロース（0.45μｍ）及び電気泳動試薬
（Bio−Rad,Richmond,CA）；及びシトシント（cytoscin
t）（West Chem）。DNA操作において用いた酵素はBethe
sda Research Laboratories（Gaithersberg,MD）又はBo
ehringer Mannheim（Indianapolis,IN）のいづれからよ
り入手し、そして製造者の仕様書に従って用いた。蛍光
標識物はMolecular Probes（Eugene,OR）より入手し、
そしてcAMP類似体はBiolog（La Jolla,CA）より入手し
た。全てのその他の試薬は分析用である。
pBR322において牛R1の全長cDNAを含むプラスミド62C1
2（Leeら（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,80:3608−
3612;これは本明細書に参考として組入れる）をcDNA発
現のためにpUC 7（Vieraら（1982）Gene,19:259−268、
これは本明細書に参考として組入れる）の中にサブクロ
ーンせしめた。
2（Leeら（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,80:3608−
3612;これは本明細書に参考として組入れる）をcDNA発
現のためにpUC 7（Vieraら（1982）Gene,19:259−268、
これは本明細書に参考として組入れる）の中にサブクロ
ーンせしめた。
サブクローニングに関するDNA操作は、本明細書に参
考として組入れたManiatisら（1982）Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,Cold Spring Habor Laborator
y,Cold Spring Harbor,NYに従って実施した。簡単に述
べると、62C12をNar Iにより消化し、そしてcDNAを含む
3.6キロベース（kb）フラグメントを単離する。Nco Iに
よる部分的消化の後、二種類の大きなフラグメント、即
ち全長cDNAフラグメント（1155塩基対（bp））及び短縮
型フラグメント（1020塩基対）を混合物として単離し、
クレノウフラグメントにより補完し、そしてHinc IIに
より線状化せしめたpUC7にリゲートした。135塩基対フ
ラグメントも単離し、〔ガンマー32P〕ATPにより放射性
標識し、そしてこの全長インサートを含むこれらのクロ
ーンを同定するために用いた。20個のクローンを選別
し、次いでそれぞれに由来するDNAを調製し、そしてBg/
Iによって消化してこのインサートの方向性を樹立せし
めた。３個のクローン由来のDNAが、lacZ′遺伝子と関
連して適切な方向においてこのR1コード化セグメントが
挿入されていることを示唆する制限パターンを示した。
これらのクローンをタンパク質の発現のために更に特徴
付けした。
考として組入れたManiatisら（1982）Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,Cold Spring Habor Laborator
y,Cold Spring Harbor,NYに従って実施した。簡単に述
べると、62C12をNar Iにより消化し、そしてcDNAを含む
3.6キロベース（kb）フラグメントを単離する。Nco Iに
よる部分的消化の後、二種類の大きなフラグメント、即
ち全長cDNAフラグメント（1155塩基対（bp））及び短縮
型フラグメント（1020塩基対）を混合物として単離し、
クレノウフラグメントにより補完し、そしてHinc IIに
より線状化せしめたpUC7にリゲートした。135塩基対フ
ラグメントも単離し、〔ガンマー32P〕ATPにより放射性
標識し、そしてこの全長インサートを含むこれらのクロ
ーンを同定するために用いた。20個のクローンを選別
し、次いでそれぞれに由来するDNAを調製し、そしてBg/
Iによって消化してこのインサートの方向性を樹立せし
めた。３個のクローン由来のDNAが、lacZ′遺伝子と関
連して適切な方向においてこのR1コード化セグメントが
挿入されていることを示唆する制限パターンを示した。
これらのクローンをタンパク質の発現のために更に特徴
付けした。
E.コリにおいてはcAMPの基底値は高いため、外因性cA
MPに影響されない粗抽出物におけるＲの正確な検出のた
めに以下の方法を考え出した。この方法は迅速なスクリ
ーニングに利用できうる。ドデシル硫酸ナトリウムを含
む12.5％のポリアクリルアミドゲル（1.5mm）上でタン
パク質サンプルをLaemmli（1970）Nature 227:680−685
の方法に従って電気泳動させた。次にエレクトロブロッ
ティング装置（Hoefer Scientific Instruments）を用
いてタンパク質をニトロセルロースフィルターに移し
た。ゲルは20mMのトリス、154mMのグリシン、20％のメ
タノール（pH8.3）の中で500mAにて４〜６時間エレクト
ロトランスファーせしめた。このニトロセルロースを室
温にて、150mMの塩化ナトリウム及び10mMのトリス（pH
7.5）中で0.05％ツイーン20と１時間インキュベート
し、次いでツイーン20を除く同じ緩衝液で室温にて洗っ
た。このフィルターを同じ緩衝液の中で８−N3〔32P〕c
AMP（20nM）と、室温にて暗室の中でインキュベートし
た。氷冷緩衝液で洗浄した後、このフィルターをUV Ｓ
−11ランプ（254nm）により５分間照射せしめ、再び洗
い、吸い取り乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに
かけた。Ｒ−サブユニットを、本明細書に参考として組
入れたKerlavageら（1982）J.Biol.Chem.257:1749−175
4に詳細の通りに、2,8−〔3H〕cAMPを用いたミリポア濾
過によって検出した。
MPに影響されない粗抽出物におけるＲの正確な検出のた
めに以下の方法を考え出した。この方法は迅速なスクリ
ーニングに利用できうる。ドデシル硫酸ナトリウムを含
む12.5％のポリアクリルアミドゲル（1.5mm）上でタン
パク質サンプルをLaemmli（1970）Nature 227:680−685
の方法に従って電気泳動させた。次にエレクトロブロッ
ティング装置（Hoefer Scientific Instruments）を用
いてタンパク質をニトロセルロースフィルターに移し
た。ゲルは20mMのトリス、154mMのグリシン、20％のメ
タノール（pH8.3）の中で500mAにて４〜６時間エレクト
ロトランスファーせしめた。このニトロセルロースを室
温にて、150mMの塩化ナトリウム及び10mMのトリス（pH
7.5）中で0.05％ツイーン20と１時間インキュベート
し、次いでツイーン20を除く同じ緩衝液で室温にて洗っ
た。このフィルターを同じ緩衝液の中で８−N3〔32P〕c
AMP（20nM）と、室温にて暗室の中でインキュベートし
た。氷冷緩衝液で洗浄した後、このフィルターをUV Ｓ
−11ランプ（254nm）により５分間照射せしめ、再び洗
い、吸い取り乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに
かけた。Ｒ−サブユニットを、本明細書に参考として組
入れたKerlavageら（1982）J.Biol.Chem.257:1749−175
4に詳細の通りに、2,8−〔3H〕cAMPを用いたミリポア濾
過によって検出した。
調節サブユニットの精製は、アンピシリン（50μg/m
l）を含むＬ−培地5mlに最も発現性の高い形質転換体を
接種し、そして細胞密度がOD550:0.1−0.5に達するまで
37℃で増殖することによって行った。次にこの培養物
を、アンピシリンを含むＬ−培地１リットルに移し、そ
してインキュベートした（12〜16時間）。何らかの記載
がない限り、その後の全ての工程は４℃で行った。細胞
を5,000xgで30分間遠心し、そして得られるペレットを
緩衝液Ｉ（20mMのリン酸カリウム、5mMのEDTA、5mMの２
−メルカプトエタノール、15mg/のＮα−Ｐ−トシル
−Ｌ−リジンクロメチルケトン及び15mg/のフェニル
メチルスルホニルフルオリド）の中に再懸濁させた。こ
の懸濁物をフレンチ加圧セルに２回通し、次いで5,000
×ｇで20分間遠心した。このペレットを同一の緩衝液に
より再抽出せしめた。ゆっくりと硫酸アンモニウムを加
えて、プールした上清液画分を70％の濃度にした。１時
間後、沈殿したタンパク質を12,000×ｇで30分間の遠心
によって回収し、緩衝液Ｉに再溶解させ、そして同一の
緩衝液に対して一夜透析した。画分を〔3H〕cAMP結合性
についてアッセイし、そしてポリアクリルアミドゲル電
気泳動、それに続く前記した光標識によって分析した。
次のこの透析したサンプルをcAMP−アガロースに加え、
そしてゆっくりと一夜回転させた。上清溶液を除去した
後、この樹脂を2MのNaClを含む緩衝液Ｉで洗って280nm
での吸光度が０に達するようにし、次いで緩衝液Ｉで再
び洗った。Ｒ−サブユニットも緩衝液Ｉ中のcAMP2容量
で30℃にて１時間溶出させた。この溶出は少なくとも一
回繰り返した。
l）を含むＬ−培地5mlに最も発現性の高い形質転換体を
接種し、そして細胞密度がOD550:0.1−0.5に達するまで
37℃で増殖することによって行った。次にこの培養物
を、アンピシリンを含むＬ−培地１リットルに移し、そ
してインキュベートした（12〜16時間）。何らかの記載
がない限り、その後の全ての工程は４℃で行った。細胞
を5,000xgで30分間遠心し、そして得られるペレットを
緩衝液Ｉ（20mMのリン酸カリウム、5mMのEDTA、5mMの２
−メルカプトエタノール、15mg/のＮα−Ｐ−トシル
−Ｌ−リジンクロメチルケトン及び15mg/のフェニル
メチルスルホニルフルオリド）の中に再懸濁させた。こ
の懸濁物をフレンチ加圧セルに２回通し、次いで5,000
×ｇで20分間遠心した。このペレットを同一の緩衝液に
より再抽出せしめた。ゆっくりと硫酸アンモニウムを加
えて、プールした上清液画分を70％の濃度にした。１時
間後、沈殿したタンパク質を12,000×ｇで30分間の遠心
によって回収し、緩衝液Ｉに再溶解させ、そして同一の
緩衝液に対して一夜透析した。画分を〔3H〕cAMP結合性
についてアッセイし、そしてポリアクリルアミドゲル電
気泳動、それに続く前記した光標識によって分析した。
次のこの透析したサンプルをcAMP−アガロースに加え、
そしてゆっくりと一夜回転させた。上清溶液を除去した
後、この樹脂を2MのNaClを含む緩衝液Ｉで洗って280nm
での吸光度が０に達するようにし、次いで緩衝液Ｉで再
び洗った。Ｒ−サブユニットも緩衝液Ｉ中のcAMP2容量
で30℃にて１時間溶出させた。この溶出は少なくとも一
回繰り返した。
cAMP−アガロース樹脂からの溶出液はしばしば全長Ｒ
の他に若干のＲのタンパク質分解生成物を含むので、こ
の全長Ｒを25mMのリン酸カリウム、5mMの２−メルカプ
トエタノール、5mMのEDTA及び150mMのNaCl（pH6.5）に
より平衡化し且つ溶出せしめる70cmセファデックスＧ−
150カラムに基づいて分離させた。画分（2ml）は7ml/時
間の流速で集めた。Ｒ−サブユニットはボイドボリュー
ム付近で溶出し、従って35−kDaのタンパク質分解フラ
グメントからよく分離された。
の他に若干のＲのタンパク質分解生成物を含むので、こ
の全長Ｒを25mMのリン酸カリウム、5mMの２−メルカプ
トエタノール、5mMのEDTA及び150mMのNaCl（pH6.5）に
より平衡化し且つ溶出せしめる70cmセファデックスＧ−
150カラムに基づいて分離させた。画分（2ml）は7ml/時
間の流速で集めた。Ｒ−サブユニットはボイドボリュー
ム付近で溶出し、従って35−kDaのタンパク質分解フラ
グメントからよく分離された。
組換cAMP依存性調節サブユニットをApplied Biosyste
ms気相シーケンサーでシーケンス化した。２ナノモルの
Ｒ−サブユニットをシーケンス化し、そしてフェニルチ
オヒダントイン誘導体を、本明細書に参考として組入れ
た。HunkapillarとHoodの（1983）Methods Enymol.,91:
486−493の手順に従うシアノカラム（IBM）を用いるBec
kman HPLCシステムで分析した。
ms気相シーケンサーでシーケンス化した。２ナノモルの
Ｒ−サブユニットをシーケンス化し、そしてフェニルチ
オヒダントイン誘導体を、本明細書に参考として組入れ
た。HunkapillarとHoodの（1983）Methods Enymol.,91:
486−493の手順に従うシアノカラム（IBM）を用いるBec
kman HPLCシステムで分析した。
例II cAMP−依存性タンパク質キナーゼ触媒性サブユニットの
組換発現及び精製 ネズミcAMP−依存性タンパク質キナーゼ（Uhlenら、
（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1300−1304;本明
細書に参考として組入れる）のα−触媒性サブユニット
に関する全長クローンを含むプラスミドpMCOを突然変異
誘発のためにM13mp18にサブクローンした。組換発現の
ために細菌性発現ベクターpT7−７（TaborとRichardso
n,（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1074−1078;本
明細書に参考として組入れる）を用いた。触媒性サブユ
ニットを発現させるために用いたE.コリ株は:JM101,22
2,K38及びBL21（DE3）である。
組換発現及び精製 ネズミcAMP−依存性タンパク質キナーゼ（Uhlenら、
（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1300−1304;本明
細書に参考として組入れる）のα−触媒性サブユニット
に関する全長クローンを含むプラスミドpMCOを突然変異
誘発のためにM13mp18にサブクローンした。組換発現の
ために細菌性発現ベクターpT7−７（TaborとRichardso
n,（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1074−1078;本
明細書に参考として組入れる）を用いた。触媒性サブユ
ニットを発現させるために用いたE.コリ株は:JM101,22
2,K38及びBL21（DE3）である。
この触媒性サブユニット遺伝子に、その開始メチオニ
ンにて固有Nde I制限部位を導入する前に、この触媒性
サブユニットに関するコード領域を含むpMCO由来の1.9
−キロベースSac Iフラグメントを切り出し、そしてM13
mp18のSac I部位に再リゲートせしめた。本明細書に参
考として組入れたZollerとSmith（1984）DNA 3:479−48
8に詳細の手順に従って一本鎖DNAを調製し、そして24−
塩基オリゴヌクレオチド（５′−CACGCCGCCCATATGGGCAA
CGCC−３′）によるオリゴヌクレオチド特異的突然変異
誘発のための鋳型として用いた。突然変異は本明細書に
参考として組入れたSangerら（1980）J.Mol.Biol.143:1
61−178に従うジデオキシシーケンシング及び制限酵素
による地図化によって確認した。
ンにて固有Nde I制限部位を導入する前に、この触媒性
サブユニットに関するコード領域を含むpMCO由来の1.9
−キロベースSac Iフラグメントを切り出し、そしてM13
mp18のSac I部位に再リゲートせしめた。本明細書に参
考として組入れたZollerとSmith（1984）DNA 3:479−48
8に詳細の手順に従って一本鎖DNAを調製し、そして24−
塩基オリゴヌクレオチド（５′−CACGCCGCCCATATGGGCAA
CGCC−３′）によるオリゴヌクレオチド特異的突然変異
誘発のための鋳型として用いた。突然変異は本明細書に
参考として組入れたSangerら（1980）J.Mol.Biol.143:1
61−178に従うジデオキシシーケンシング及び制限酵素
による地図化によって確認した。
pLWS−３の作製は、前記したM13作製体から1988塩基
フラグメントをNde I及びHind IIIにより切り出し、ア
ガ−ゲルより精製し、そしてPT7−７のNde I−Hind III
制限部位にリゲートすることによって行った。このリゲ
ーション混合物を、前記したManiatisらにより詳細され
た手順を利用して、E.コリJM101を形質転換させるため
に用いた。
フラグメントをNde I及びHind IIIにより切り出し、ア
ガ−ゲルより精製し、そしてPT7−７のNde I−Hind III
制限部位にリゲートすることによって行った。このリゲ
ーション混合物を、前記したManiatisらにより詳細され
た手順を利用して、E.コリJM101を形質転換させるため
に用いた。
Nde I及びHind IIIにより消化せしめたcDNAインサー
トを含むプラスミドDNAに関する形質転換体を選別しそ
してスクリーンした。DNAをこのプラスミドpLWS−３か
ら単離し、そしてこの配列を制限酵素による地図化及び
配列分析によって確認した。次にこのプラスミドをE.コ
リBL21（DE3）の形質転換のために用い、そしてこの形
質転換体をポリアクリルアミドゲル電気泳動の後の38−
40KDaのバンドの出現をモニターすることによって触媒
性サブユニットの発現についてスクリーンした。
トを含むプラスミドDNAに関する形質転換体を選別しそ
してスクリーンした。DNAをこのプラスミドpLWS−３か
ら単離し、そしてこの配列を制限酵素による地図化及び
配列分析によって確認した。次にこのプラスミドをE.コ
リBL21（DE3）の形質転換のために用い、そしてこの形
質転換体をポリアクリルアミドゲル電気泳動の後の38−
40KDaのバンドの出現をモニターすることによって触媒
性サブユニットの発現についてスクリーンした。
触媒性サブユニットの発現のため、アンピシリンを含
む１リットルのＬ−培地（10％のトリプトン、５％の酵
母抽出物及び５％のNaCl）に、pLWS−３により形質転換
せしめたBL21（DE3）の定常期培養物5mlを接種し、そし
て590nmで0.5の吸光度が達せられるまで強く撹拌しなが
ら37℃で増殖させた。最終濃度0.5nmとなるまでイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えた後、
この細胞を37℃で更に３時間増殖させ、次いで遠心によ
って集めた。
む１リットルのＬ−培地（10％のトリプトン、５％の酵
母抽出物及び５％のNaCl）に、pLWS−３により形質転換
せしめたBL21（DE3）の定常期培養物5mlを接種し、そし
て590nmで0.5の吸光度が達せられるまで強く撹拌しなが
ら37℃で増殖させた。最終濃度0.5nmとなるまでイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えた後、
この細胞を37℃で更に３時間増殖させ、次いで遠心によ
って集めた。
組換触媒性サブユニットの精製は、このペレットを４
℃にて6mlの溶解緩衝液（30mMのMES、pH6.45、50mMのKC
L、1mMのEDTA、及び5mMのβ−メルカプトエタノール）
に再懸濁させ、次いでフレンス加圧セルに２回通すこと
により行った。更に溶解緩衝液を加えて全容量を30mlに
した。12,000×ｇで15分間４℃で遠心後、この上清液を
取り出し、そして氷冷水で希釈して導電率を1.3mmhos以
下にした。希釈した上清液を緩衝液Ｉ（30mMのMES、pH
6.45、1mMのEDTA）により平衡にしたホスホセルロース
カラム（Whatman P11,2.0×0.8cm）に適用した。吸光度
が280nmで０となるまで平衡緩衝液で洗浄後、触媒性サ
ブユニットを、緩衝液Ｉ（50）mlから0.5Mのリン酸カリ
ウムpH7.0（50ml）に至る線状勾配によって溶出させ
た。2mlの画分を集め、そしてキナーゼ活性を含むもの
をプールした。タンパク質は固形NH4SO4を常に撹拌しな
がらこの溶液が80％飽和となるまでバッチ式に添加する
ことにより沈殿させた。この沈殿物を12,000×ｇで20分
間の遠心により集め、次いで0.8mlのH2Oに再懸濁させ
た。溶解していない物質を遠心によって除去した後、こ
のタンパク質溶液を25mMのリン酸カリウムpH6.8により
平衡にした。
℃にて6mlの溶解緩衝液（30mMのMES、pH6.45、50mMのKC
L、1mMのEDTA、及び5mMのβ−メルカプトエタノール）
に再懸濁させ、次いでフレンス加圧セルに２回通すこと
により行った。更に溶解緩衝液を加えて全容量を30mlに
した。12,000×ｇで15分間４℃で遠心後、この上清液を
取り出し、そして氷冷水で希釈して導電率を1.3mmhos以
下にした。希釈した上清液を緩衝液Ｉ（30mMのMES、pH
6.45、1mMのEDTA）により平衡にしたホスホセルロース
カラム（Whatman P11,2.0×0.8cm）に適用した。吸光度
が280nmで０となるまで平衡緩衝液で洗浄後、触媒性サ
ブユニットを、緩衝液Ｉ（50）mlから0.5Mのリン酸カリ
ウムpH7.0（50ml）に至る線状勾配によって溶出させ
た。2mlの画分を集め、そしてキナーゼ活性を含むもの
をプールした。タンパク質は固形NH4SO4を常に撹拌しな
がらこの溶液が80％飽和となるまでバッチ式に添加する
ことにより沈殿させた。この沈殿物を12,000×ｇで20分
間の遠心により集め、次いで0.8mlのH2Oに再懸濁させ
た。溶解していない物質を遠心によって除去した後、こ
のタンパク質溶液を25mMのリン酸カリウムpH6.8により
平衡にした。
ウルトロゲル（Ultrogel）AcA44（LKB）ゲル濾過カラ
ム（1.0×116cm）に添加した。キナーゼ活性を含む画分
を混ぜ合わせ、そしてAmicon装置及びPM−30膜を用いる
限外濾過によって1mg/mlへと濃縮した。本明細書に参考
として組入れたLaemmli（1970）Nature 227:680−685に
従うドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下において
実施したポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づき、こ
の組換触媒性サブユニットはほぼ均質であり、そしてそ
の収量は3.5〜4.0mg/培養物のリットルであった。
ム（1.0×116cm）に添加した。キナーゼ活性を含む画分
を混ぜ合わせ、そしてAmicon装置及びPM−30膜を用いる
限外濾過によって1mg/mlへと濃縮した。本明細書に参考
として組入れたLaemmli（1970）Nature 227:680−685に
従うドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下において
実施したポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づき、こ
の組換触媒性サブユニットはほぼ均質であり、そしてそ
の収量は3.5〜4.0mg/培養物のリットルであった。
組換触媒性サブユニットを20mMのトリス、pH7.5によ
って0.04mg/mlに希釈した。50mlのアリコートを氷上に
保ち、次いで49℃の湯浴に入れた。表示した時間にこの
チューブを取り出し、氷の上に置き、そして組換タンパ
ク質の安定性についてアッセイした。
って0.04mg/mlに希釈した。50mlのアリコートを氷上に
保ち、次いで49℃の湯浴に入れた。表示した時間にこの
チューブを取り出し、氷の上に置き、そして組換タンパ
ク質の安定性についてアッセイした。
プレ−キャストLKBアンホリンパグプレートpH3.5〜9.
5を伴うLKBマルチフォアモデル2117を用いて等電点電気
泳動を行った。標準品は牛カルボニックアンヒドラーゼ
（pI 6.57）、ミオグロビン（pI 6.67及び7.16）並びに
ラクテートデヒドロゲナーゼ（pI 8.55）とした。
5を伴うLKBマルチフォアモデル2117を用いて等電点電気
泳動を行った。標準品は牛カルボニックアンヒドラーゼ
（pI 6.57）、ミオグロビン（pI 6.67及び7.16）並びに
ラクテートデヒドロゲナーゼ（pI 8.55）とした。
組換触媒性サブユニットの分子量はLKBウルトロゲルA
cA44カラム（１×116cm）を用いるゲル濾過により決定
した。泳動緩衝液は25mMのリン酸カリウム（pH6.8）、2
00mMのKCL、及び0.2％のアジ化ナトリウムとした。標準
品及びその対応のＭ値は、リボヌクレアーゼＡ（13,70
0）、チモトリプシノーゲンＡ（25,000）、豚触媒性サ
ブユニット（38,000）、卵アルブミン（43,000）及び牛
血清アルブミン（67,000）である。
cA44カラム（１×116cm）を用いるゲル濾過により決定
した。泳動緩衝液は25mMのリン酸カリウム（pH6.8）、2
00mMのKCL、及び0.2％のアジ化ナトリウムとした。標準
品及びその対応のＭ値は、リボヌクレアーゼＡ（13,70
0）、チモトリプシノーゲンＡ（25,000）、豚触媒性サ
ブユニット（38,000）、卵アルブミン（43,000）及び牛
血清アルブミン（67,000）である。
組換触媒性サブユニットを例Ｉに詳細の通りにApplie
d Biosystems気相シーケンサーでシーケンス化した。
d Biosystems気相シーケンサーでシーケンス化した。
例III 哺乳類触媒性サブユニットの精製 豚の心臓（心臓40個）をホモジナイズし、次いで遠心
した。この上清液（導電率3mmho）を、15mMのリン酸カ
リウム、pH6.5、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタ
ノールにおいて平衡にした。DE−23カラム（4L樹脂）に
直接通した。タンパク質は緩衝液Ｅ（40mMのリン酸カリ
ウム、pH6.5、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタノ
ール）によってこの樹脂から溶出させた。プールしたキ
ナーゼピークを直ちに4mmhoの導電率に調整し、この時
点にて1.5のDE−52樹脂を加え、そしてその全てを２
時間機械的に撹拌した。この上清液を注ぎ出し、そして
この樹脂をカラムに注ぎ入れ、次いで緩衝液Ｅによりよ
く洗い、その後緩衝液Ｆ（17mMのリン酸カウリム、pH6.
1、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタノール）によ
りよく洗った。次にＣ−サブユニットを３の220mMのc
AMP、それに続く８の緩衝液Ｆにより溶出させ、そし
てこの溶出液をCM−セファロースカラム（50ml容量）に
通し、その後10％グリセロール（250ml）から200mMのリ
ン酸カリウム、pH6.1、10％のグリセロール、2mMのEDT
A、5mMのβ−メルカプトエタノール（250ml）を含む緩
衝液Ｆの線状勾配により溶出させた。
した。この上清液（導電率3mmho）を、15mMのリン酸カ
リウム、pH6.5、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタ
ノールにおいて平衡にした。DE−23カラム（4L樹脂）に
直接通した。タンパク質は緩衝液Ｅ（40mMのリン酸カリ
ウム、pH6.5、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタノ
ール）によってこの樹脂から溶出させた。プールしたキ
ナーゼピークを直ちに4mmhoの導電率に調整し、この時
点にて1.5のDE−52樹脂を加え、そしてその全てを２
時間機械的に撹拌した。この上清液を注ぎ出し、そして
この樹脂をカラムに注ぎ入れ、次いで緩衝液Ｅによりよ
く洗い、その後緩衝液Ｆ（17mMのリン酸カウリム、pH6.
1、2mMのEDTA、5mMのβ−メルカプトエタノール）によ
りよく洗った。次にＣ−サブユニットを３の220mMのc
AMP、それに続く８の緩衝液Ｆにより溶出させ、そし
てこの溶出液をCM−セファロースカラム（50ml容量）に
通し、その後10％グリセロール（250ml）から200mMのリ
ン酸カリウム、pH6.1、10％のグリセロール、2mMのEDT
A、5mMのβ−メルカプトエタノール（250ml）を含む緩
衝液Ｆの線状勾配により溶出させた。
例IV 標識化cAMP−依存性タンパク質キナーゼの調製 （ａ）サブユニットの標識化： 哺乳類cAMP−依存性タンパク質キナーゼの組換触媒性
及び調節サブユニット（約0.5−2.0mg/ml）を例Ｉ及びI
Iに詳細の通りに精製し、そして別々に25mMのバイシン
（bicine）pH8.0、0.1mMのEDTAに対して０℃で４〜５時
間透析した。この触媒性ユニットを、キナーゼ活性の不
活性化を防ぐための8mMのMgCl2及び5mMのATPの存在下の
において0.3mMのフルオロセイン５′−イソチオシアネ
ート（FITC;Molecular Probes.Eugene,OR）により標識
した。調節サブユニットは0.5mMのテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（TRITC;異性体G;Molecular Pr
obes.Eugene,OR）により標識した。標識化は共に室温に
て30分続け、次いで5mMのグリシンを10〜15分間加える
ことによって消光せしめた。各タンパク質溶液をセファ
デックスＧ−25カラム（3ml）に通し、25mMのリン酸カ
リウムpH6.8、2mMのEDTA、5mMの２−メルカプトエタノ
ール、10％のグリセロールによって溶出させることによ
り、過剰の色素を除去した。最初の着色、又は蛍光バン
ドを集めた。
及び調節サブユニット（約0.5−2.0mg/ml）を例Ｉ及びI
Iに詳細の通りに精製し、そして別々に25mMのバイシン
（bicine）pH8.0、0.1mMのEDTAに対して０℃で４〜５時
間透析した。この触媒性ユニットを、キナーゼ活性の不
活性化を防ぐための8mMのMgCl2及び5mMのATPの存在下の
において0.3mMのフルオロセイン５′−イソチオシアネ
ート（FITC;Molecular Probes.Eugene,OR）により標識
した。調節サブユニットは0.5mMのテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（TRITC;異性体G;Molecular Pr
obes.Eugene,OR）により標識した。標識化は共に室温に
て30分続け、次いで5mMのグリシンを10〜15分間加える
ことによって消光せしめた。各タンパク質溶液をセファ
デックスＧ−25カラム（3ml）に通し、25mMのリン酸カ
リウムpH6.8、2mMのEDTA、5mMの２−メルカプトエタノ
ール、10％のグリセロールによって溶出させることによ
り、過剰の色素を除去した。最初の着色、又は蛍光バン
ドを集めた。
次にFITC−標識化触媒性及びTRITC−標識化調節サブ
ユニット（等重量）を混合し、そして25mMのリン酸カリ
ウムpH6.8、0.5mMのMgCL2、0.1mMのATP、5mMの２−メル
カプトエタノール、５％のグリセロールに対して３〜５
日間４℃で透析した。ホロ酵素の形成は、基質としてケ
ンプチド（Kemptide）を用いて測定するキナーゼアッセ
イにより示されうる（Slice ＆ Taylor、前記）。
ユニット（等重量）を混合し、そして25mMのリン酸カリ
ウムpH6.8、0.5mMのMgCL2、0.1mMのATP、5mMの２−メル
カプトエタノール、５％のグリセロールに対して３〜５
日間４℃で透析した。ホロ酵素の形成は、基質としてケ
ンプチド（Kemptide）を用いて測定するキナーゼアッセ
イにより示されうる（Slice ＆ Taylor、前記）。
（ｂ）ホロ酵素の標識化： 哺乳類触媒性及び組換調節サブユニットより調製した
cAMP−依存性タンパク質キナーゼホロ酵素（0.5−1.0mg
/ml）を25mMのバイシンpH8.0、0.1mMのEDTAに対して４
℃で透析した。MgCl2及びATPを加えてそれぞれ最終濃度
8mM及び5mMとした。このタンパク質をフルオロセイン
５′−イソチオシアネート又はテトラメチルローダミン
イソチオシアネート（異性体Ｇ）のいづれかにより、最
終濃度0.1〜0.5mMにて室温で20〜30分間標識化し、次い
で5mMのグリシンpH8.0で10分間消光せしめた。過剰の遊
離色素は、このタンパク質溶液をセファデックスＧ−25
（3ml）のカラムに通し、10mMのリン酸カリウムpH6.7、
150mMのKCl、5mMの２−メルカプトエタノール、0.1mMの
EDTA（緩衝液Ｉ）により溶出させ、次いで最初の着色化
蛍光バンドを集めることにより（部分的に）除去した。
cAMP−依存性タンパク質キナーゼホロ酵素（0.5−1.0mg
/ml）を25mMのバイシンpH8.0、0.1mMのEDTAに対して４
℃で透析した。MgCl2及びATPを加えてそれぞれ最終濃度
8mM及び5mMとした。このタンパク質をフルオロセイン
５′−イソチオシアネート又はテトラメチルローダミン
イソチオシアネート（異性体Ｇ）のいづれかにより、最
終濃度0.1〜0.5mMにて室温で20〜30分間標識化し、次い
で5mMのグリシンpH8.0で10分間消光せしめた。過剰の遊
離色素は、このタンパク質溶液をセファデックスＧ−25
（3ml）のカラムに通し、10mMのリン酸カリウムpH6.7、
150mMのKCl、5mMの２−メルカプトエタノール、0.1mMの
EDTA（緩衝液Ｉ）により溶出させ、次いで最初の着色化
蛍光バンドを集めることにより（部分的に）除去した。
次にこの標識化ホロ酵素をcAMPアフィニティーカラム
（0.25ml）（Wolfgang.W.ら、FEBS Lett.99,62（197
9））に約0.1ml/分の流速で通し、そして２カラム容量
の緩衝液Ｉによって４℃で溶出させた。集めた画分は標
識化触媒性サブユニットを含んでいた。このカラムを1M
のKCLを含む緩衝液Ｉ（２カラム容量）、次いで再び緩
衝液Ｉ（２カラム容量）で溶出させた。この洗浄液は若
干の異なる標識化触媒性サブユニットを含みうる。標識
化調節サブユニットを回収するため、カラムを緩衝液Ｉ
中の30mMのcAMP（４カラム容量）により室温にて２時間
かけてゆっくり溶出させた。
（0.25ml）（Wolfgang.W.ら、FEBS Lett.99,62（197
9））に約0.1ml/分の流速で通し、そして２カラム容量
の緩衝液Ｉによって４℃で溶出させた。集めた画分は標
識化触媒性サブユニットを含んでいた。このカラムを1M
のKCLを含む緩衝液Ｉ（２カラム容量）、次いで再び緩
衝液Ｉ（２カラム容量）で溶出させた。この洗浄液は若
干の異なる標識化触媒性サブユニットを含みうる。標識
化調節サブユニットを回収するため、カラムを緩衝液Ｉ
中の30mMのcAMP（４カラム容量）により室温にて２時間
かけてゆっくり溶出させた。
異なって標識されたサブユニットを適当なドナー−ア
クセプターペアーに再組合せし、そして25mMのリン酸カ
リウムpH6.8,0.5mMのMgCl2,0.1mMのATP,5mMの２−メル
カプトエタノール、５％のグリセロールに対して数回交
換しながら３〜５日間４℃で透析した。cAMPdPKホロ酵
素の形成はキナーゼ活性の消失によりモニターされるこ
とができ、これはサイクリックAMPの添加により復帰し
うる。
クセプターペアーに再組合せし、そして25mMのリン酸カ
リウムpH6.8,0.5mMのMgCl2,0.1mMのATP,5mMの２−メル
カプトエタノール、５％のグリセロールに対して数回交
換しながら３〜５日間４℃で透析した。cAMPdPKホロ酵
素の形成はキナーゼ活性の消失によりモニターされるこ
とができ、これはサイクリックAMPの添加により復帰し
うる。
例Ｖ 試験管内での標識化ホロ酵素によるcAMPの滴定 触媒性サブユニットに基づいて５′−フルオロセイン
イソチオシアネート（５′−FITC）により標識され、そ
して調節サブユニットに基づいてテトラメチルローダミ
ンイソチオシアネート（異性体Ｇ）により標識されたホ
ロ酵素（20nM）を135mMのKCl,10mMのKKMOPS pH7.2,2mM
のMgCl2,1mMのATP中に室温で溶解させた。20,50,100,20
0,400nM,1及び50μＭのcAMPの添加の前後にて、495nmで
の励起に続く蛍光発光を測定した（図２）。明確にする
ため、0,50,200,1000nMのcAMPスペクトルのみを図１に
示す。0cAMPでの比に較正した520nm対580nmでの発光の
計算比を、図２（挿入図）においてcAMP濃度に関してプ
ロットし、この比における中間最大変化は約100nMのcAM
Pであることを示している。
イソチオシアネート（５′−FITC）により標識され、そ
して調節サブユニットに基づいてテトラメチルローダミ
ンイソチオシアネート（異性体Ｇ）により標識されたホ
ロ酵素（20nM）を135mMのKCl,10mMのKKMOPS pH7.2,2mM
のMgCl2,1mMのATP中に室温で溶解させた。20,50,100,20
0,400nM,1及び50μＭのcAMPの添加の前後にて、495nmで
の励起に続く蛍光発光を測定した（図２）。明確にする
ため、0,50,200,1000nMのcAMPスペクトルのみを図１に
示す。0cAMPでの比に較正した520nm対580nmでの発光の
計算比を、図２（挿入図）においてcAMP濃度に関してプ
ロットし、この比における中間最大変化は約100nMのcAM
Pであることを示している。
例VI 単独平滑筋細胞におけるcAMPの生体内測定 平滑筋細胞（BC3H1細胞系）に、Ｃサブユニットにお
いて５′FITCによりそしてR1サブユニットにおいてTRIT
Cにより標識されているホロ酵素60μＭを、本明細書に
参考として組入れたRiabowol,Gilman ＆ FeramiscoのCo
ld Spring Harbor Symposia on Quantitative Biolgy,5
3:85−90（1988）に記載の通りにマイクロインジェクト
せしめた（図３）。15〜20分後、この細胞に、蛍光顕微
鏡の台の上で490nmの光を室温にて照射した。発光され
る光は、500〜530nmのバントパスフィルター又は580nm
のロングパスフィルターのいづれかに通した後にシリコ
ーン増感ターゲットカメラ（Dage−NTI）によって抜出
した。時間点（time point）当り２枚の像をイメージプ
ロセッサーによりディジタル化し、500−530nm対＞580n
mの比を各画素にて計算し、そしてテレビモニター上の
擬似色（シュードカラムー）において表わした。代表細
胞における平均比を図３に示す各時点にて決定した。時
点１にて、250μＭのジブチリルcAMP、即ち膜浸透性cAM
P類似体を加えるとこの比における徐々な上昇がもたら
され、これは細胞内でのcAMP類似体の上昇を示唆する。
いて５′FITCによりそしてR1サブユニットにおいてTRIT
Cにより標識されているホロ酵素60μＭを、本明細書に
参考として組入れたRiabowol,Gilman ＆ FeramiscoのCo
ld Spring Harbor Symposia on Quantitative Biolgy,5
3:85−90（1988）に記載の通りにマイクロインジェクト
せしめた（図３）。15〜20分後、この細胞に、蛍光顕微
鏡の台の上で490nmの光を室温にて照射した。発光され
る光は、500〜530nmのバントパスフィルター又は580nm
のロングパスフィルターのいづれかに通した後にシリコ
ーン増感ターゲットカメラ（Dage−NTI）によって抜出
した。時間点（time point）当り２枚の像をイメージプ
ロセッサーによりディジタル化し、500−530nm対＞580n
mの比を各画素にて計算し、そしてテレビモニター上の
擬似色（シュードカラムー）において表わした。代表細
胞における平均比を図３に示す各時点にて決定した。時
点１にて、250μＭのジブチリルcAMP、即ち膜浸透性cAM
P類似体を加えるとこの比における徐々な上昇がもたら
され、これは細胞内でのcAMP類似体の上昇を示唆する。
別の実験において、BC3H1細胞をマイクロインジェク
トし、そして上記の通りに発光比を測定した。以下のも
のの添加を行い、それを図４に示す。（１）100nMのイ
ソプロテレノール（２）100nMのプロプラノロール
（３）50μＭのフォスコリン（４）250μＭのジブチリ
ルcAMP。イソプロテレノール、即ちβ２−アドレナリン
産生作動薬の添加は発光比、それ故細胞内のcAMP濃度の
急速な上昇を誘発し、これはプロパラノロール（β２−
アドレナリン産生拮抗薬）によりその後減少した。フォ
ルスコリンによるアデニレートサイクラーゼの直接的な
活性化は最大発光比をもたらし、膜浸透性cAMP類似体で
あるジブチリルcAMPによっては何ら更なる効果は見られ
なかった。
トし、そして上記の通りに発光比を測定した。以下のも
のの添加を行い、それを図４に示す。（１）100nMのイ
ソプロテレノール（２）100nMのプロプラノロール
（３）50μＭのフォスコリン（４）250μＭのジブチリ
ルcAMP。イソプロテレノール、即ちβ２−アドレナリン
産生作動薬の添加は発光比、それ故細胞内のcAMP濃度の
急速な上昇を誘発し、これはプロパラノロール（β２−
アドレナリン産生拮抗薬）によりその後減少した。フォ
ルスコリンによるアデニレートサイクラーゼの直接的な
活性化は最大発光比をもたらし、膜浸透性cAMP類似体で
あるジブチリルcAMPによっては何ら更なる効果は見られ
なかった。
本発明を現状好ましい態様で詳細してきたが、あらゆ
る改良が本発明の範囲を逸脱することなくなされうる。
従って本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定され
る。
る改良が本発明の範囲を逸脱することなくなされうる。
従って本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定され
る。
フロントページの続き (72)発明者 テイラー，スーザン，エス. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92014，デルマール，ビア アルタ 1408 (72)発明者 アダムス，スティーブン，アール アメリカ合衆国，カリフォルニア 92064，ポーウェイ，コムナ ドライブ 13562 (72)発明者 ジー，ユィング アメリカ合衆国，カリフォルニア 92122，サンディエゴ，＃26，カーギル アベニュ 8155 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/48 G01N 21/64 G01N 33/58 G01N 33/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (14)
- 【請求項１】S1はアデノシン３′,5′−サイクリック一
燐酸依存性タンパク質キナーゼ、S2はアデノシン３′,
5′−サイクリック一燐酸依存性タンパク質キナーゼの
触媒性サブユニットであり、ＤとＡは、異なる種類のフ
ルオロクロムであり、Ｄのフルオロクロムの発光波長
は、Ａの励起波長と重なっており、ＤとＡの距離は、こ
れらのフルオロクロム間でのエネルギーの転移を可能と
するのに十分に密接に近づいており、そしてn1とn2は、
組成物の前記サブユニットの化学量数を表わす（S1.A）
n1と（S2.D）n2を含んで成る組成物。 - 【請求項２】サンプル中のアデノシン３′,5′−サイク
リック一燐酸の濃度を決定する方法であって、 （ａ）S1はアデノシン３′,5′−サイクリック一燐酸依
存性タンパク質キナーゼ、S2はアデノシン３′,5′−サ
イクリック一燐酸依存性タンパク質キナーゼの触媒性サ
ブユニットであり、ＤとＡは、異なる種類のフルオロク
ロムであり、Ｄのフルオロクロムの発光波長は、Ａの励
起波長と重なっており、ＤとＡの距離は、これらのフル
オロクロム間でのエネルギーの転移を可能とするのに十
分に密接に近づいており、そしてn1とn2とは、組成物の
前記サブユニットの化学量数を表わす式（S1.A）n1と
（S2.D）n2により表される複合体を成形せしめ、 （ｂ）該複合体を前記サンプルと接触させ、 （ｃ）Ｄの励起波長付近の放射エネルギーに前記サンプ
ルを曝し、そして （ｄ）ＤとＡの少なくとも一方の発光波長にて発せられ
る蛍光を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３】ＡとＤの両方の発光波長にて発せられる蛍
光を測定し、ＤからＡへのエネルギー転移の程度がＡの
発光増幅に対するＤの発光増幅の比により決定されるこ
とを含んで成ることを特徴とする請求項２に記載の方
法。 - 【請求項４】Ｄの発光波長にて発せられる蛍光を測定
し、Ｄの蛍光半減期又はＤの光漂白速度によりＤからＡ
へのエネルギー転移の程度を決定することを含んで成る
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】サンプルが完全細胞を含んで成り、前記接
触させるステップが前記細胞内への前記複合体の組み込
みを含んで成ることを特徴とする請求項２乃至４のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項６】前記接触ステップが、マイクロインジェク
ション、エレクトロポレーション、そしてリポフェクシ
ョンより成る群から選ばれることを特徴とする請求項５
に記載の方法。 - 【請求項７】Ｄ及びＡが、 フルオロセインとテトラメチルローダミン、 ７アミノクマリンとジピロメテン−ボレート、 インドカルボシアニンとローダミンＸ、及びフィコエリ
トリンとアロフィコシアュン、又はそれらの誘導体より
成る群から選ばれ、 この選ばれたペアーが蛍光エネルギー転移を示すことを
特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項８】Ｄの発光波長及びＡの励起波長が約510〜5
50nmであることを特徴とする請求項２乃至７のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項９】n1が２であり、そしてn2が２であることを
特徴とする請求項２乃至８のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１０】S1及びS2が組換タンパク質であることを
特徴とする請求項２乃至８のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１１】（S1.A）と（S2.D）を含んで成る標識さ
れた複合体を調製する方法であって、S1はアデノシン
３′,5′−サイクリック一燐酸依存性タンパク質キナー
ゼ、S2はアデノシン３′,5′−サイクリック一燐酸依存
性タンパク質キナーゼの触媒性サブユニットであり、Ｄ
とＡは、異なる種類のフルオロクロムであり、Ｄのフル
オロクロムの発光波長は、Ａの励起波長と重なってお
り、前記複合体におけるＤとＡの距離は、これらのフル
オロクロム間でのエネルギーの転移を可能とするのに十
分に密接に近づいており、前記方法は、 （ａ）｛（S1.A）n1と（S2.D）n2｝を含んで成る複合体
形成のための所定の条件下で標識されたサブユニット
S1.AとS2.Dを混ぜ、このとき、n1とn2とは、前記複合体
の前記標識されたサブユニットの化学量数を表わし、そ
して前記フルオロクロムは、これらのフルオロクロム間
でのエネルギーの転移を可能とするのに十分に密接に近
づており、 （ｂ）前記複合体を回収することを含んで成ることを特
徴とする方法。 - 【請求項１２】（S1.A）と（S2.D）を含む標識された複
合体を調製する方法であって、S1はアデノシン３′,5′
−サイクリック一燐酸依存性タンパク質キナーゼ、S2は
アデノシン３′,5′−サイクリック一燐酸依存性タンパ
ク質キナーゼの触媒性サブユニットであり、ＤとＡは、
異なる種類のフルオロクロムであり、Ｄのフルオロクロ
ムの発光波長は、Ａの励起波長と重なっており、前記複
合体におけるＤとＡの距離は、これらのフルオロクロム
間でのエネルギーの転移を可能とするのに十分に密接に
近づいており、S1とS2を含む第１の複合体は、フルオロ
クロムＡに結合され、S1とS2を含む第２の複合体は、フ
ルオロクロムＤに結合され、前記第１と第２の複合体の
サブユニットは、標識されたサブユニットS1.D、S2.D、
S1.A、そしてS2.Aを得るために分離され、前記方法は、
結果として標識された複合体｛（S1.D）n1と（S2.
A）n2｝又は｛（S1.A）n1と（S2.D）n2｝の形成を起こ
すのに、これらのフルオロクロム間でのエネルギーの転
移を可能とするのに十分に密接に前記フルオロクロムが
近づけるための条件下で前記標識されたサブユニットを
混ぜることを含み、このとき、n1とn2とは、前記複合体
の前記標識されたサブユニットの化学量数を表わすこと
を特徴とする方法。 - 【請求項１３】前記フルオロクロムがフルオロセイン、
テトラメチルローダミン又はそれらの誘導体であること
を特徴とする請求項11または12に記載の方法。 - 【請求項１４】S1及びS2が組換タンパク質であることを
特徴とする請求項11または12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54799090A | 1990-07-02 | 1990-07-02 | |
| US547,990 | 1990-07-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05508772A JPH05508772A (ja) | 1993-12-09 |
| JP3208486B2 true JP3208486B2 (ja) | 2001-09-10 |
Family
ID=24186980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51265291A Expired - Fee Related JP3208486B2 (ja) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | 蛍光エネルギー転移を利用する分析物の検出 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5439797A (ja) |
| EP (1) | EP0537270B1 (ja) |
| JP (1) | JP3208486B2 (ja) |
| AT (1) | ATE170980T1 (ja) |
| DE (1) | DE69130171T2 (ja) |
| DK (1) | DK0537270T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992000388A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5814449A (en) * | 1996-05-28 | 1998-09-29 | University Of Pittsburgh | Homogenous affinity assay for quantitative drug and metabolite determination |
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| US6458547B1 (en) | 1996-12-12 | 2002-10-01 | Prolume, Ltd. | Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents |
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