JP3887670B2 - タンパク質またはペプチド間の結合を測定するための蛍光強度法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、蛍光強度に基づいて、リガンドとレセプター、特に、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体から成るリガンドとレセプターとの結合を測定する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
検出法では、通常、特異的標的高分子種に結合して検出可能なシグナルを生成する少なくとも１種の分析試薬を用いる。そのような分析試薬は、通常、２種の成分：（１）高い特異性と高い親和性で標的高分子に結合し得るプローブ高分子、例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドと、（２）放射性同位体または共有結合蛍光染料分子などの検出可能な標識とを有する。一般に、プローブ高分子の結合特性によって検出法の特異性が決まり、会合している標識の検出可能性によって検出法の感度が決まる。検出感度は、用いられる標識の種類および標識の検出に利用し得る装置の品質やタイプに相関する。
【０００３】
例えば、生体高分子の検出および定量には、ラジオイムノアッセイが最も高感度かつ特異的な分析法として用いられている。ラジオイムノアッセイ法は、生物試料中のポリペプチド、薬剤、ステロイドホルモン、ポリヌクレオチド、代謝物および腫瘍マーカーなどの微量の特異的分析物の検出および測定に用いられている。ラジオイムノアッセイ法は、分析試薬として、１種以上の放射性同位体で標識した免疫グロブリンを用いる。会合している放射性同位体標識の崩壊によって生成された（α、βまたはγ）放射線は、種々の放射分析法によって検出、定量し得るシグナルとしての役割を果たす。
【０００４】
ペプチド−タンパク質、リガンド−レセプターまたは薬剤−レセプターの相互作用の測定に用いられる放射性同位体に基づく測定法では、通常、検出および定量のために、１つの成分（通常、ペプチド、リガンドまたは薬剤）を¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、³²Ｐまたは³Ｈで放射性標識することが必要である。放射性標識は、多くの労力と時間を要し、合成、精製、貯蔵、使用および廃棄段階で健康や環境に有害であり、かつ比較的高価である。放射性リガンドまたは放射性標識ペプチドは¹²⁵Ｉで標識するのが最も一般的であり、¹²⁵Ｉは、主としてγ放射線、一部β放射線を放射し、その半減期は６０日である。¹²⁵Ｉは、揮発性が高くかつ甲状腺に集中するという事実によって、上記の他の放射性同位体より危険であると考えられており、そのために、取扱時により多くの注意と費用を必要とする。
【０００５】
従来、相互作用複合体は、濾過ステップと念入りな洗浄ステップによるか、または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後のゲル乾燥によって、結合しなかった放射性プローブから分離することが必要であった。親和性の低い結合相互作用は、念入りな洗浄ステップ中またはゲル内を移動している最中に解離してしまって、検出されないことがある。乾燥ゲルは、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージングで分析するが、これは、特に³⁵Ｓまたは³Ｈ同位体を用いる場合には、非常に時間がかかる。濾過した¹²⁵Ｉ結合複合体は、特殊なγ放射線シンチレーションカウンターで閃光を計測して分析する。
【０００６】
さらに、ラジオイムノアッセイなどの慣用的な検出法の感度は低過ぎて、特に少量または希薄試料の検出ができない。
Ｅｆｔｉｎｋ，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｓｕｅｌｔｅｒ編，１９９１）、ｐｐ．１２７−２０５，およびＳｈｅａｒｅｒら，“Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｖｏｌ．２（Ｃｈｅｎ ら編，１９７６），ｐｐ８１１−８４３は、タンパク質研究のための蛍光に基づく技術の概説である。
【０００７】
したがって、当該技術分野においては、リガンドとレセプター、特にアミノ酸および／またはアミノ酸類似体から成るリガンドとレセプターとの相互作用を分析するための、簡単、高感度、有効かつ高速の方法が求められている。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも１つの標的と少なくとも１つのプローブとの結合を測定する方法であって、
ペプチド配列またはペプチド類似体配列を含む少なくとも１つの標的を用意するステップと、
アミノ酸または第２アミノ酸類似体と少なくとも１種のフルオロフォアとを含む少なくとも１つのプローブを用意するステップと、
少なくとも１つの標的と少なくとも１つのプローブとを含むテスト媒質を用意するステップと、
少なくとも１種のフルオロフォアに蛍光を放出させるのに有効な放射線でテスト媒質を照射するステップと、
結合に起因する少なくとも１種のフルオロフォアによって放出された蛍光に対する消光作用を検出するステップとから成り、
結合は特異的であり、かつ、該方法は、消光作用検出ステップの前に少なくとも１つの標的と少なくとも１つのプローブとの複合体を、遊離型標的および遊離型プローブから分離するステップを実施することなく、かつ放出された蛍光を消光するためにシグナル消光剤を供給するステップを実施することなく行なわれる方法を提供する。
本発明を以下の図面と関連して説明するが、図面中、同じ参照番号は同じ要素を示す。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的とプローブとの結合を測定するための、高速、高感度、環境に優しく、かつ安全な方法を提供する。この方法において、標的はペプチド配列またはペプチド類似体配列から成り、プローブはアミノ酸含有化合物またはアミノ酸類似体含有化合物から成る。プローブは蛍光標識を有するのが好ましいが、代替実施態様では、プローブではなく標的をそのように標識してもよい。本発明の好ましい方法は、標的とプローブとの特異的結合に起因する蛍光標識に対する蛍光強度消光作用を検出するステップを含む。
【００１０】
本発明の方法で検出される消光作用は、特異的結合率を蛍光プローブの対数濃度の関数としてプロットすると古典的Ｓ字形用量反応曲線が作成されるような、標的とプローブとの特異的結合率の直接指標である蛍光強度の減弱である。本発明の方法は、蛍光異方性法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）とは異なり、蛍光偏光の測定を必要としない。
【００１１】
標的は、例えば、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、タンパク質または多タンパク質複合体などのペプチド配列またはペプチド様類似体配列から成るのが好ましい。標的がプローブに対する少なくとも１つのレセプター部位を有するタンパク質であればなお好ましい。
【００１２】
プローブは、アミノ酸またはアミノ酸類似体から成るのが好ましい。例えば、適当なプローブは、単一アミノ酸、単一アミノ酸類似体、ペプチド様類似体、ペプチドイド（ｐｅｐｔｉｄｏｉｄ）、ペプチドミメティック、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、タンパク質または多タンパク質複合体から成り得る。
【００１３】
本発明の方法を用いて、多様な結合複合体を測定することができる。本発明は、実施態様において、（結合の存在または不在や結合親和性を含めた）タンパク質と他のアミノ酸基化合物またはアミノ酸類似体基化合物との結合特性の分析に用い得る。分析に適したタンパク質には、例えば、野生型タンパク質、突然変異型タンパク質、単離タンパク質、インビトロ翻訳タンパク質、かつ／または合成タンパク質が含まれる。本発明は、リガンドとタンパク質レセプターとの結合の分析に特に適している。テスト試料は、１００％純粋である必要はなく、むしろ、例えば、精製試料、合成試料、半精製タンパク質抽出物、粗タンパク質抽出物、インビトロ翻訳試料、膜試料、全細胞または組織であり得る。
【００１４】
本発明では、第１非標識化合物（例えば、標的）と第２非標識化合物との結合を、第１非標識化合物と標識化合物（例えば、プローブ）との（蛍光強度の変化で示されるような）結合特性の変化を検出することによって検出し得る。そのような検出は、本発明の趣旨では、「二次結合」検出、または広義には、「間接結合」検出を指す。各追加レベルの結合により、標識化合物と第１非標識化合物との結合に有意な変化が生じるか、または標識化合物に結合した非標識化合物の総質量が十分に変わるならば、理論的には、本発明によって、三次結合検出、四次結合検出などが可能である。
【００１５】
同様に、本発明によって、非標識化合物と複数の複合体形成化合物のうちの少なくとも一つの複合体メンバーとの結合を検出することも可能であり、その場合、蛍光強度を測定するために複数の複合体形成化合物のうちの少なくとも一つを標識する。検出できるように標識化合物と非標識化合物とを直接相互作用させる必要さえない。極めて重要な点は、本発明によって、標識プローブと標的との結合特性に対して間接的または直接的に影響を及ぼす条件を検出し得ることである。
【００１６】
したがって、本発明により、抗体（すなわち、「第２非標識化合物」）と、抗体が指向する特異的タンパク質（すなわち、「第１非標識化合物」）との結合を検出することが可能であり、ここで、特異的タンパク質は、標識タンパク質プローブに直接結合しているか、または多タンパク質複合体中に存在して、複合体中の１つ以上の他のタンパク質とは相互作用するが、標識プローブとは必ずしも直接には相互作用しないかのいずれかである。
【００１７】
さらに、本発明により、標識プローブと、ペプチド、ペプチドミメティック、複合糖質または他のオリゴマーなどの他の配列特異的結合分子との直接結合および間接結合を検出することができる（タンパク質−ＤＮＡ結合の検出は、本発明者らの同時係属米国特許出願第０９／２２４，５０５号に開示されている）。さらに、本発明により、ペプチド、ペプチド様類似体、ペプチドミメティック、複合糖質または他のオリゴマーなどの標識配列特異的結合分子と、少なくとも１つの非標識タンパク質との直接結合および間接結合を検出することができる。
【００１８】
本発明は、部位特異的に所定の標的に結合するか、または他の分子と標的との結合を変える分子の設計および／または選択を始めとする極めて多くの用途に有用である。従って、本発明は、特異的結合活性を有するか、または他の結合ペア／複合体の結合特性を予測可能に変える新規な物質または薬剤を同定、評価する方法を提供する。
【００１９】
本発明の方法は、蛍光強度検出ステップの前にプローブ−標的複合体を非結合プローブおよび標的から分離するステップや、プローブまたは標的にシグナル消光剤を供給するステップを実施することなく行い得る。
【００２０】
本発明の方法は、使用するのに、有害で、骨が折れ、多くの時間がかかると共に、常に新しくする必要がある放射性プローブを用いる必要がない。本発明のプローブは、好ましくは使用に安全であり、かつ数年間安定である。したがって、プローブは、大量生産または注文が可能であり、かつ貯蔵もできる。
【００２１】
本発明の方法は、ゲル分離ステップが不要であり、それによって、倍の量のテスト試料を半日で分析し得る。定量分析は簡単かつ正確である。
本発明の方法は均質溶液中で好ましく実施され、濾過ステップと念入りな洗浄ステップによってまたはゲル電気泳動によって、結合した複合体を結合していないプローブから分離する必要がない。したがって、本発明の結合測定法は、多くの時間と費用の節約となり、かつ容易に自動化し得る。さらに、本発明の結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間および補因子要件などの結合変数を迅速に決定し得る。解離を招来し得る追加ステップによって平衡相互作用が乱されることがないので、結合部位に対する結合分子の平衡解離定数Ｋ_dをより正確に測定することができる。さらに、従来の方法ではどうしても検出できなかった低親和性結合相互作用の分析も今や実現可能である。
【００２２】
本発明の方法は、従来の測定法の感度より感度が有意に改良されている。本発明の方法は、１．５×１０^-11Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０^-11Ｍ以下の濃度の結合標的を検出するのに十分なほど高感度である。本発明の方法は、実施態様において、３．０×１０^-14Ｍ〜１．０×１０^-11Ｍの濃度の結合標的を検出するのに十分な感度を有している。上記値が本発明の方法ではそれ以上の濃度を検出し得ないことを示唆するものでないことは言うまでもない。
【００２３】
さらに、結合相互作用の特異性は、本発明の方法を用いて飽和結合実験または競合的結合実験により迅速に評価し得る。飽和レベルの結合は特異的結合が生じたときに達成されるのに対し、精製レセプター試料、膜試料、細胞全体または組織に対するリガンドの「接着性」（ｓｔｉｃｋｉｎｅｓｓ）によって生じる非特異的結合は、特定数のレセプター部位が関与していないので非飽和性である。種々の濃度の非標識リガンドを、レセプターまたはタンパク質と結合するために固定濃度の蛍光標識リガンドと競合するそれらの能力についてテストする競合的結合実験によって、結合分子の特異性と共に結合部位の質が確認される。
【００２４】
本発明によって、特定タンパク質試料中の結合部位数および種々の薬剤に対するそれらの親和性および接近容易性を解明することができる。飽和結合実験により、平衡状態でレセプターの半分を占有するリガンドの濃度と定義される平衡解離定数（Ｋ_d）を決定し得る。例えば：
【００２５】
【表１】

を参照されたい。小さいＫ_dは、レセプターがリガンドに対して高親和性を有することを示している。逆に、大きいＫ_dは、低親和性相互作用を示している。実験に用いられるリガンドの濃度および任意の所与のレセプター試料に対するそのＫ_dが分れば、占有分率、すなわち、リガンドに結合しているすべてのレセプターの分数を計算することができる。非標識リガンドと標識リガンドが同一化合物である同種競合的結合実験を用いて、リガンドのレセプターに対する親和力およびレセプター数を測定することもできる。
【００２６】
本発明の方法は、非標識リガンドと標識リガンドが異なる化合物である異種競合的結合実験には特に有利である。この測定法によって、実際に数千もの潜在的薬剤を、特異的レセプターに結合するそれらの能力について、迅速、効率的かつ安価にスクリーニングすることができる。この場合、推定薬剤は標識されない。さらに、薬剤を、アゴニスト、競合的アンタゴニストまたは非競合的アンタゴニストとして同定し得る。この測定法は、低親和性薬剤とレセプターとの相互作用の研究に特に有用である。
【００２７】
競合的結合測定法によって、標識リガンドとレセプターの特異的結合の５０％を阻害するのに必要な非標識リガンドの濃度ＩＣ₅₀を定量することができる。標識リガンドのＫ_dおよび濃度ならびに非標識化合物のＩＣ₅₀が分れば、非標識リガンドまたは薬剤とレセプターとの結合の平衡解離定数Ｋ_iを計算し、その結合親和力を評価することができる。
【００２８】
さらに、本発明により、所与のレセプター試料中の２クラス以上の結合部位の存在を検出することができる。例えば、組織由来のタンパク質膜試料は、所与のリガンドに対して異なる結合親和力を有する２つのレセプターサブタイプを含み得る。そのようなレセプター試料を用いた競合的結合実験により、レセプター試料に結合した標識リガンドの置換に必要な非標識リガンドの濃度範囲が拡大されるであろう。２つのレセプターが極めて異なる結合親和力を示す珍しいケースでは、標識リガンドとレセプターとの特異的結合率を、加えた非標識リガンド濃度の対数スケールに対してプロットすると、二相競合的結合曲線が観察されるであろう。
以下の実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことを理解されたい。
【００２９】
実施例
実施例１および２は、蛍光標識したペプチドと単一タンパク質または多タンパク質複合体との特異的結合を例示している。
【００３０】
実施例１
アンギオテンシン系は、ヒトの血圧、血漿量、水分および電解質の平衡ならびに神経機能の主要調節物質である。オクタペプチドアンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）ホルモンは、血管平滑筋細胞および副腎細胞などの種々の細胞の細胞質膜に見出される２種のＧタンパク質共役レセプターであるアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１およびＡＴ２レセプターに結合して、それらを活性化する。ＡＴ１レセプターは、ほとんどのＡＩＩの生理作用に関与する。
【００３１】
ＡＴ１レセプターもＡＴ２レセプターも、Ｇタンパク質共役レセプターに関する古典的な７個の疎水性膜貫通ドメイン構造を有している。８アミノ酸ＡＩＩリガンドによる結合には、数個の膜貫通ドメインの一番上に位置するアミノ酸残基と、レセプターの細胞外ループ中のアミノ酸残基とが関与する。ＡＩＩ結合は、その後でＧタンパク質を活性化させるための初期事象として、膜貫通へリックスを回転させることによってレセプターコンホメーションに変化を誘発させると仮定されている。
【００３２】
ＡＩＩがＡＴ１レセプターに結合すると、ＡＩＩは、種々の細胞内ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）、すなわち、Ｇｑ／１１タンパク質と結合する。Ｇｑ／１１タンパク質と結合することにより、細胞のいくつかのシグナル経路が活性化される。実施例に用いた〔ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ所在（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から得た〕クローン化ヒトＡＴ１レセプターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の精製膜試料である。このレセプター試料は、高親和性と低親和性のＡＩＩ結合部位を共に有している。高親和性結合部位はＣＨＯ細胞中に天然に存在するＧｑタンパク質に結合するが、低親和性結合部位はＧタンパク質には結合しない。ヒトＡＴ１レセプターのサイズは、３５９アミノ酸すなわち４１ＫＤａである。ＣＨＯ細胞中のＧｐタンパク質は、αＧｐ（４２ＤＫａ）、βＧｐ（４０ＫＤａ）およびγＧｐ（８ＤＫａ）から成る。
【００３３】
アミノ末端がフルオレセインで標識された野生型ＡＩＩ（Ｆｌｕ−ＡＩＩ）を、アドバンスト・バイオコンセプト社（カナダ、モントリオール所在）〔Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）によって合成し、ＨＰＬＣにより＞９５％均質性になるまで精製し、質量分光検査法によって確認した。２．０ｎｍｏｌのＦｌｕ−ＡＩＩを１０μｌのＤＭＳＯ中で再構成し、ｄｄＨ₂Ｏに２０μＭの最終濃度で再懸濁した。野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩの配列は以下の通りである（配列番号１）。
Ｆｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
【００３４】
ＡＴ１の生理的結合およびフェニル化に要求されるＡＩＩの最小レセプタードメインを決定する突然変異誘発研究により、６アミノ酸が最小必要量であることが明らかにされた。レセプターを活性化するためのＣ末端での極めて重大なフェニル化を除いて、結合に関しては、ＡＩＩフラグメントのアミノ酸残基の正確な性質よりも鎖長の方が重要な要素である。野生型ＡＩＩの最初の５アミノ酸残基を含み、そのアミノ末端がフルオレセインで標識された突然変異ＡＩＩフラグメント［Ｆｌｕ−ＡＩＩ（１−５）］を、アナスペック社（カリフォルニア州サンホゼ所在）〔ＡｎａＳｐｅｃ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）〕によって合成し、ＨＰＬＣにより＞９５％まで精製し、質量分光検査法により確認した。４．９μｍｏｌのＦｌｕ−ＡＩＩ（１−５）をＤＭＳＯに溶かし、ｄｄＨ₂Ｏに２００μＭの最終濃度で再懸濁した。突然変異Ｆｌｕ−ＡＩＩ（１−５）の配列は以下の通りである（配列番号２）。
Ｆｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ
【００３５】
Ｆｌｕ−ＡＩＩ：ＡＴ１結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含んでいた：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ ＰＭＳＥ、０．０００５〜０．１単位のヒトＡＴ１レセプターおよび１０ｎＭ 野生型または突然変異Ｆｌｕ−ＡＩＩ。反応混合物を３７℃下に１時間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザービームを照射し、蛍光の放出についてモニターした。
【００３６】
０．００５単位〜０．０５単位のＡＴ１レセプターと１０ｎＭの野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩまたは１０ｎＭの突然変異Ｆｌｕ−ＡＩＩ（１−５）との結合に関して得られた蛍光スペクトルを、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。最大蛍光強度は、用いたフルオロフォアがフルオレセインであったために、５２８ｎｍで発生した。１０ｎＭの野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩと反応させた０．００５単位、０．０１単位、０．０２単位および０．０５単位のＡＴ１レセプターの蛍光強度は、Ｆｌｕ−ＡＩＩ単独で放出された強度に比べて、それぞれ４２％、５４％、６９％および８３％減弱し、これは結合を示している（図１Ａ）。ＡＴ１濃度を増大させるにつれ、Ｆｌｕ−ＡＩＩに対する結合の漸進的な増大が観察されたが、これは、蛍光標識ペプチドとタンパク質との結合測定法の性質の定量性を示している。０．０５単位のＡＴ１レセプターとの飽和レベル結合の達成によって証明されるように結合は特異的であった。非特異的結合は、特定数のレセプター部位が関与しないので、非飽和性であることは自明である。
【００３７】
さらに、リガンドとレセプターとの結合測定法は高感度であり、０．００５単位と０．０５単位のＡＴ１レセプターを１０ｎＭの野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩに結合させただけで、蛍光強度が４２％および８３％減弱した（図１Ａ）。０．０００５単位程度の低いレベルのＡＴ１レセプターとの結合さえ検出され、１０ｎＭ Ｆｌｕ−ＡＩＩと反応させると、蛍光強度が１８％減弱した（データは示さず）。それに反し、¹²⁵Ｉ標識ＡＩＩを用い、ガラス繊維フィルターで濾過する従来の結合測定法では、このＡＴ１レセプター膜試料を１単位使用する必要がある。したがって、本発明の測定法は、従来の¹²⁵Ｉリガンド−レセプター結合測定法に比べて感度が２０００倍以上も高い。
【００３８】
図１Ｂは、０．００５単位、０．０１単位、０．０２単位および０．０５単位のＡＴ１レセプターが１０ｎＭの突然変異Ｆｌｕ−ＡＩＩ（１−５）と結合せず、その結果、突然変異Ｆｌｕ−ＡＩＩ単独の場合に観察された上記蛍光強度よりわずかに増大しただけであることを示しており、これは、本発明の測定法の特異性を立証している。
【００３９】
実施例２
競合結合実験により本発明の測定法の特異性をさらに検証したが、この実験では、特異的および非特異的競合物質を、野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩリガンドと（実施例１で用いたような）クローン化ヒトＡＴ１レセプターとの結合を置換するそれらの能力についてテストした。非標識ヒトアンギオテンシンＩＩ（特異的競合物質）および非標識ヒトサブスタンスＰ（非特異的競合物質）は、アドバンスト・バイオコンセプト社（カナダ、モントリオール所在）から得た。サブスタンスＰは、中枢神経および末梢神経を興奮させ、それによって疼痛の伝達および知覚を調節することを含めた多くの生理活性を有する１１アミノ酸から成る神経ペプチドである。サブスタンスＰは、Ｇタンパク質共役レセプター、ニューロキニン１と、またそれより弱い程度にニューロキニン２と特異的に結合するが、アンギオテンシンＩＩレセプターには結合し得ない。
【００４０】
５μｌのＤＭＳＯ中で１００ｎｍｏｌのＡＩＩおよび１００ｎｍｏｌのサブスタンスＰを再構成し、ｄｄＨ₂Ｏにそれぞれ１ｍＭの最終濃度で再懸濁した。野生型ＡＩＩの配列は、フルオレセイン標識と共に上記に示されている（配列番号１）。
【００４１】
野生型サブスタンスＰの配列は以下の通りである（配列番号３）。
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｆｌｕ−ＡＩＩ結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含んでいた：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０２単位のヒトＡＴ１レセプターおよび１０ｎＭの野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩ。３７℃で１５分間インキュベートした後、反応混合物に、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭおよび３００μＭの非標識ＡＩＩまたは非標識サブスタンスＰを加え、３７℃下にさらに１時間インキュベートした。次いで、試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオンビームを照射して、蛍光の放出をモニターした。
【００４２】
非標識リガンドの不在下、０．０２単位のＡＴ１レセプターを１０ｎＭ 野生型Ｆｌｕ−ＡＩＩと結合させると、蛍光強度が、Ｆｌｕ−ＡＩＩ単独で達成されたレベルに比べて６９％減弱したことが観察された（図２Ａ）。０．０２単位のＡＴ１レセプターに結合した１０ｎＭ Ｆｌｕ−ＡＩＩに、１ｎＭ、１０ｎＭ、３００ｎＭ、３μＭおよび１００μＭの非標識ＡＩＩを加えると、蛍光強度が、Ｆｌｕ−ＡＩＩ単独で放出された強度に比べて、それぞれ、６５％、５８％、４３％、３５％および１４％減弱した（図２Ａ）。非標識ＡＩＩの量を増大させるにつれ、非標識ＡＩＩはＡＴ１に結合したＦｌｕ−ＡＩＩと競合して、Ｆｌｕ−ＡＩＩと置き換わり、その結果、Ｆｌｕ−ＡＩＩの平衡解離定数（ｋ_d）に応じた速度で、蛍光強度の消光が漸進的に減少した。（Ｆｌｕ−ＡＩＩの量に比べて３×１０⁴倍過剰の）３００μＭの非標識ＡＩＩを加えると、非標識ＡＩＩは、ＡＴ１レセプターに結合するためにＦｌｕ−ＡＩＩと十分に競合することができ、その結果、蛍光強度は減弱しなかった（図２Ａ）。この競合結合実験により、Ｆｌｕ−ＡＩＩは、ＡＴ１レセプターに特異的に結合し、ただ単に膜試料に結合するのではないことが確認された。
【００４３】
上記実験から得られた蛍光強度データを、ＡＴ１レセプターに結合したＦｌｕ−ＡＩＩの特異的結合率対競合物質として加えた非標識ＡＩＩの対数濃度としてプロットすると、古典的競合的結合曲線が観察された。これらのデータを、慣例に従って、（非標識ＡＩＩを加えないときの）１００％特異的結合から（ＡＴ１レセプター不在下の）０％結合までに正規化した。これで、Ｆｌｕ−ＡＩＩとＡＴ１レセプターとの結合を５０％ブロックするのに要する非標識ＡＩＩの濃度ＩＣ₅₀を測定することができる。レセプターに対するＦｌｕ−ペプチドの親和力（Ｋ_d）と非標識リガンドのＩＣ₅₀とが分れば、以下の式に従って、レセプターに対する非標識リガンドの結合に関する平衡解離定数Ｋ_iを計算することができる。
【００４４】
【数１】

９０％特異的結合から１０％特異的結合まで競合させるためには、非標識ＡＩＩの濃度の１００倍を超える変化が必要であったという観察結果は、２つ以上のレセプター結合親和性部位の存在を示唆しているが、これは予想されていたたことである。というのは、この測定法に用いたヒトクローン化ＡＴ１レセプター試料は、高親和性と低親和性のＡＩＩ結合部位を共に有しているからである。したがって、本発明の測定法は、リガンドと単一レセプター部位モデルまたは多重レセプター部位モデルとの結合を識別することも可能である。
【００４５】
比較すると、（１ｎＭから３００μＭまでの）全１２種の濃度のサブスタンスＰは、１０ｎＭ Ｆｌｕ−ＡＩＩと０．０２単位のＡＴ１レセプターとの結合を置換することはできず、その結果、任意のサブスタンスＰの不在下に観察されたものと類似の蛍光強度の減弱が観察された（データは示さず）が、これは、本発明の測定法の特異性をさらに立証している。
【００４６】
本発明を詳細かつ特定の実施例を参照して説明したが、当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更および改良をなし得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 蛍光スペクトルの図。
【図１Ｂ】 蛍光スペクトルの図。
【図２Ａ】 蛍光スペクトルの図。
【図２Ｂ】 ＡＴ１レセプターに結合したＦｌｕ−ＡＩＩの特異的結合率対競合物質として加えた非標識ＡＩＩの対数濃度のグラフ。
【配列表】

Claims (18)

1. 少なくとも１つの標的と少なくとも１つのプローブとの結合を測定する方法であって、
   ペプチド配列またはペプチド類似体配列を含む少なくとも１つの標的を用意するステップと、
   アミノ酸またはアミノ酸類似体および少なくとも１種のフルオロフォアを含む少なくとも１つのプローブを用意するステップと、
   前記少なくとも１つの標的と前記少なくとも１つのプローブとを含むテスト媒質を用意するステップと、
   前記少なくとも１種のフルオロフォアに蛍光を放出させるのに有効な放射線で前記テスト媒質を照射するステップと、
   前記結合に起因する前記少なくとも１種のフルオロフォアによって放出された蛍光に対する消光作用を検出するステップと
   から成り、
   前記結合が特異的であり、１．５×１０^-11Ｍ未満の濃度で結合型標的を検出するのに十分なほど高感度であり、かつ、該方法が、前記消光作用検出ステップの前に前記少なくとも１つの標的と前記少なくとも１つのプローブとの複合体を遊離型標的および遊離型プローブから分離するステップと、前記放出された蛍光を消光するためにシグナル消光剤を供給するステップとを実施することなく行われる、方法。
2. 前記ペプチド配列がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 前記アミノ酸がタンパク質またはペプチド配列に含まれている、請求項１に記載の方法。
4. １．０×１０^-11Ｍ以下の濃度の結合型標的を検出するのに十分なほど高感度である、請求項１に記載の方法。
5. ３．０×１０^-14Ｍ〜１．０×１０^-11Ｍの濃度の結合型標的を検出するのに十分なほど高感度である、請求項１に記載の方法。
6. 前記複合体の濃度が３．０×１０^-14〜１．０×１０^-11Ｍである、請求項１に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つの標的が少なくとも１つのレセプターを含み、前記少なくとも１つのプローブがリガンドを含む、請求項１に記載の方法。
8. 平衡解離定数を決定するために飽和結合実験を実施するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記少なくとも１つのプローブを前記少なくとも１つの標的に対して滴定するステップと、前記少なくとも１つの標的に結合するプローブのレセプター飽和量を、前記消光作用を最大にする前記少なくとも１つのプローブの量として測定するステップとをさらに含む、請求項７に記載の方法。
10. 平衡解離定数を決定する、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つのプローブによって占有された前記少なくとも１つの標的上のすべてのレセプターの分数を示す占有分率を決定する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記媒質に、フルオロフォア標識を欠いた少なくとも１つの追加リガンドを加える、請求項９に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの追加リガンドが、アゴニスト、競合的アンタゴニストまたは非競合的アンタゴニストであるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記少なくとも１つの追加リガンドが前記少なくとも１つのレセプターに対して前記少なくとも１つのプローブと競合し、前記方法が、前記少なくとも１つのレセプターに対する前記少なくとも１つの追加リガンドの結合親和力を測定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つの追加リガンドが前記少なくとも１種のフルオロフォアを欠いた前記少なくとも１つのプローブと同一である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つの追加リガンドが前記少なくとも１つのプローブとは異なる、請求項１２に記載の方法。
17. 望ましい結合特性を有するリガンドをスクリーニングするために、前記少なくとも１つの追加リガンドである異なる複数の追加リガンドを、前記少なくとも１つの標的および前記少なくとも１つのプローブに対して測定する、請求項１６に記載の方法。
18. 少なくとも１つの標的と少なくとも１つのプローブとの結合を測定する方法であって、
    ペプチド配列またはペプチド類似体配列と少なくとも１種のフルオロフォアとを含む少なくとも１つの標的を用意するステップと、
    第２アミノ酸または第２アミノ酸類似体を含む少なくとも１つのプローブを用意するステップと、
    前記少なくとも１つの標的と前記少なくとも１つのプローブとを含むテスト媒質を用意するステップと、
    前記少なくとも１種のフルオロフォアに蛍光を放出させるのに有効な放射線で前記テスト媒質を照射するステップと、
    前記結合に起因する前記少なくとも１種のフルオロフォアによって放出された蛍光に対する消光作用を検出するステップと
    から成り、
    前記結合が特異的であり、１．５×１０^-11Ｍ未満の濃度の結合型標的を検出
    するのに十分なほど高感度であり、かつ、該方法が、前記消光作用検出ステップの前に前記少なくとも１つの標的と前記少なくとも１つのプローブとの複合体を
    遊離型標的および遊離型プローブから分離するステップと、前記放出された蛍光を消光するためにシグナル消光剤を供給するステップとを実施することなく行われる、方法。

Images